WO2011037415A2 - 부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물 및 이를 이용한 부탄올의 제조방법 - Google Patents

부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물 및 이를 이용한 부탄올의 제조방법 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a recombinant microorganism having increased butanol producing ability and a method for producing butanol using the same, and more particularly, to a recombinant microorganism having increased butanol producing ability through a metabolic circuit and a method for producing butanol using the same.
  • Microorganisms in the genus Clostridium are Gram-positive, fully anaerobic and endogenous spores, most of which are known to produce acetate and butyric acid as fermentation products. Some of these strains cause acetone-butanol-ethanol fermentation (hereinafter referred to as ABE fermentation) to produce acetone, butanol, and ethanol in addition to the organic acid.
  • ABE fermentation acetone-butanol-ethanol fermentation
  • acetone, butanol and ethanol have a mass ratio of about 3: 6: 1 after fermentation, and a small amount of acetate, butyrate, and acetoin are produced.
  • glucose used as a substrate
  • the mass yield of butanol is about 20-25%
  • the final concentration is known to be about 10 g / L (Lee et al., Biotechnol. Bioeng ., 101 (2): 209-228, 2008).
  • the wild-type strain is used for the production of butanol, there is a problem that low yield, productivity, and difficult to separate from other metabolites increase the production cost.
  • Acetone is formed by acetoacetyl CoA (CoA transferase) and CoA transferase (CoA transferase) and acetoacetate decarboxylase (acetoacetate decarboxylase). They are expressed by genes ctfAB and adc , respectively. Thus, by deleting one or more of these genes, the proportion of acetone in the solvent can be lowered. Recent reports have shown that the deletion of adc can actually lower the specific weight of acetone (Jiang et al., Metab. Eng ., 11 (4-5): 284-291, 2009).
  • WO2008 / 052973 reported strains 'butyrate production pathway blocking + acetate production pathway blocking' and strains 'butyrate production pathway blocking + acetone production pathway blocking + acetate production pathway blocking' and the like. Since it is essential, it could not be confirmed whether butanol production ability was improved by deleting only the acetate production route alone.
  • WO2008 / 052973 claims for various combinations of gene deletions based on buk or ptb deletions the examples only show the results of the deletion of known buk genes, and there are no examples of gene deletions of various combinations thereafter. There is no problem.
  • the present inventors confirmed that when the gene encoding the enzyme for converting acetyl CoA to acetate in Clostridium microorganism is deleted, butanol production ability is improved by increasing the selectivity and yield of butanol.
  • the present invention has been completed.
  • the present inventors further produce a butanol producing microorganism having high concentration, high yield, and high selectivity by deleting buk gene and amplifying aldehyde / alcohol dehydrogenase in addition to pta deletion mutant with improved butanol selectivity and yield.
  • the high yield, high selectivity of butanol formation ability was confirmed, and the present invention was completed.
  • the present inventors additionally delete the bukII gene encoding another butyrate kinase in a mutant strain in which the pta and buk are deleted at the same time and amplified aldehyde / alcohol dehydrogenase, thereby producing a high concentration of almost no organic acid.
  • a high yield, high selective butanol producing strain was prepared, the butanol producing ability was confirmed, and the present invention was completed.
  • the inventors further deleted the ctfB gene encoding coeitransferase (CoAT) in a mutant strain in which the pta, buk, and bukII were simultaneously deleted and amplified aldehyde / alcohol dehydrogenase, thereby producing little organic acid.
  • CoAT coeitransferase
  • An object of the present invention is to provide a recombinant microorganism and a method for producing the same, which selectively produces butanol with high efficiency by reducing the production of other by-products.
  • Another object of the present invention to provide a method for producing butanol using the recombinant microorganism.
  • the present invention is a host microorganism having an acetyl CoA and butyryl CoA biosynthesis pathway, encoding an enzyme for converting acetyl CoA to acetate It provides a method for producing a recombinant microorganism having increased butanol production ability, characterized in that the gene is deleted.
  • the present invention also provides for the deletion of a gene encoding an enzyme that converts acetyl CoA to acetate in a host microorganism having a biosynthetic pathway to acetyl CoA and butyryl CoA.
  • a recombinant microorganism having increased butanol producing ability which is characterized by the above-mentioned.
  • the present invention also relates to a gene encoding phosphotrans-acetylase ( eutD or pta ) or a gene encoding acetate kinase ( askA or ackA ) in a microorganism of the genus Clostridium .
  • the present invention provides a recombinant microorganism having increased butanol production ability, which is characterized in that the deletion of.
  • the invention also, the butanol productivity increased recombinant microorganism Clostridium acetobutylicum ATCC 824 ⁇ eutD, Clostridium acetobutylicum ATCC 824 ⁇ eutD ⁇ buk PptbAdh, Clostridium acetobutylicum ATCC 824 ⁇ eutD ⁇ buk PthlAdh *, C. actobutylicum ATCC 824 ⁇ eutD ⁇ buk ⁇ bukII PthlAdh * and C. ATCC actobutylicum 824 ⁇ eutD ⁇ buk ⁇ bukII ⁇ ctfB PthlAdh *.
  • the present invention also comprises the steps of culturing the recombinant microorganism to produce butanol; And it provides a method for producing butanol comprising the step of recovering butanol from the culture.
  • Figure 2 is a genetic map of the gene deletion vector (pCACKO) prepared according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a genetic map of the plasmid pIMP1PbAdhE1 prepared according to one embodiment of the present invention.
  • a gene encoding phosphotransacetylase, which is involved in converting acetyl CoA to acetate from the gene of Clostridium acetobutylicum ATCC 824, ( eutD )
  • eutD Clostridium acetobutylicum ATCC 824
  • the present invention provides a gene encoding an enzyme that converts acetyl CoA to acetate in a host microorganism having an acetyl CoA and butyryl CoA biosynthetic pathway.
  • the present invention relates to a method for producing a recombinant microorganism having increased butanol producing ability, and a recombinant microorganism having increased butanol producing ability prepared therefrom.
  • the "biosynthetic pathway” is not limited to a pathway for synthesizing a target compound from carbon provided through glycolysis, and a concept encompassing pathways for synthesizing a target compound from specific metabolites in cells.
  • “deleted” means that by changing, replacing or deleting some bases of the gene, introducing some bases, or introducing a gene, enzyme or chemical that inhibits the expression or activity of the enzyme,
  • the concept encompasses the inhibition of enzyme activity. Therefore, for the method of deleting a specific gene, expression inhibition using antisense RNA known previously, homologous recombination, homologous recombination through expression of various recombinases (rambda recombinase, etc.), specificity using reverse transcriptase and RNA As long as the activity of the specific gene of interest and the enzyme which the gene encodes is inhibited by the method of sequence insertion etc., it is not limited to any specific method.
  • acetyl CoA and butyryl CoA biosynthesis pathways not only has inherent in the strain itself but also techniques such as recombination and genome shuffling. It includes all the things which introduced foreign gene.
  • the host microorganism having the acetyl CoA and butyryl CoA biosynthesis pathway produces at least one selected from the group consisting of acetone, ethanol, butanol, isopropanol It is done.
  • the host microorganism may be derived from the genus Clostridium, but has a gene encoding enzymes involved in the biosynthetic pathway to acetyl CoA and butyryl CoA. It is not limited to one.
  • Clostridium acetobutylicum Clostridium beijerinckii , Clostridium saccharobutylicum , Clostridium saccharopfer Clostridium saccharoperbutylacetonicum , Clostridium perfringens , Clostridium tetani , Clostridium difficile , Clostridium butyricum , Clostridium butyricum Examples include Clostridium butylicum , Clostridium kluyveri , Clostridium tyrobutylicum, Clostridium tyrobutyricum, and the like. .
  • Clostridium acetobutylicum ATCC824 is illustrated as a host microorganism of the genus Clostridium, but in addition to Clostridium acetobutylicum M5, 1NYG, 4NYG, 5NYG and DG1 (Stim-Herndon, KP et al., Biotechnol / Food Microbiol ., 2:11, 1996) and Clostridium acetobutylicum ATCC 824 Type IV, M3, M5, 2-BB R, 2-BB D, Rif B12, Rif D10, Rif F7, and Claw Stridial acetobutylicum ATCC 860 (Clark, SW et al., Appl. Environ. Microbiol. , 55: 970, 1989) can also be used.
  • the enzyme for converting acetyl CoA to acetate is phosphotrans-acetylase or acetate kinase, and the phosphotrans-acetylase
  • the gene encoding acetylase) is eutD or pta
  • the gene encoding acetate kinase is characterized as askA or ackA .
  • the gene deletion method is not particularly limited as long as the activity of the enzyme encoded by the gene of interest is suppressed.
  • the homologous recombination method by double crossing inserts an antibiotic resistance gene into a gene fragment having a nucleotide sequence of the target gene to inactivate the action of the target gene fragment, and then inactivates the target gene fragment into the strain.
  • the target gene in the chromosome of the microorganism can be inactivated.
  • a specific sequence insertion method using reverse transcriptase and RNA finds a reverse transcriptase binding site in a target gene, and then, by RNA and reverse transcriptase complex expressed at an RNA transcription site substituted by a partial sequence adjacent to the binding site. Part of the RNA can be inserted into the gene of interest to inhibit the activity of the enzyme of interest so that the gene of interest.
  • a recombinant microorganism having a gene ( eutD ) encoding a phospho trans acetylase was prepared , and the produced recombinant microorganism had an improved butanol generating ability.
  • (C) a recombinant microorganism additionally deleted the ctf A or ctfB gene coding for CoA transferase (CoAT) was produced, and the high concentration, high yield, high selective butanol in which the produced recombinant microorganism produces little organic acid. The production capacity was confirmed.
  • the method for producing a recombinant microorganism having increased butanol producing ability is eutD ( pta ) and ackA encoding phospho -acetylase and acetate kinase, which convert acetyl-CoA to acetic acid.
  • eutD pta
  • ackA encoding phospho -acetylase and acetate kinase
  • a gene encoding an enzyme to make and (b) a gene encoding phosphotrans-butyrylase that converts butyryl-CoA to butyrate; And (c) at least one gene selected from the group consisting of genes encoding butyrate kinase, and amplifying aldehyde / alcohol dehydrogenase (aldehyde / alcohol dehydrogenase). It is characterized by.
  • the enzyme that converts acetate and butyrate to acetyl CoA and butyryl CoA, and converts acetoacetylCoA to acetoacetate is CoA transferase.
  • the gene encoding CoA transferase is ctfAB or atoDA .
  • the gene encoding phosphotrans-butyrylase that converts the butyryl-CoA to butyrate is ptb.
  • the gene encoding the butyrate kinase is characterized in that at least one gene selected from the group consisting of buk and buk II .
  • the gene encoding the aldehyde / alcohol dehydrogenase is adhE1 or adhE2 and includes variants thereof.
  • the variant is more preferably one or more of the 450 to 650th amino acid of the protein encoded by adhE1 (SEQ ID NO: 51).
  • a gene encoding a enzyme for converting butyryl CoA to butyrate in a recombinant microorganism that has deleted a gene encoding phosphotransacetylase ( eutD ) ( buk or / and bukII ) to prepare a recombinant microorganism additionally deleted, and further deletes ctfA or ctfB encoding a CoA transferase (CoA transferase) to produce a recombinant microorganism, alcohol / aldehyde dehydro Recombinant microorganisms were further prepared by introducing genes encoding genease ( adhE1 ) and confirmed that these microorganisms had improved butanol production and reduced acetone production.
  • adhE1 phosphotransacetylase
  • a gene encoding butyryl coA and an enzyme that converts acetyl CoA to acetate After deletion of a gene encoding an enzyme that converts CoA) to butyrate, 1) alcoholol dehydrogenase; 2) aldehyde dehydrogenase; And 3) a method for producing a recombinant microorganism having increased butanol producing ability, characterized by further introducing or amplifying one or more genes selected from the group consisting of genes encoding alcohol / aldehyde dehydrogenase, It relates to a recombinant microorganism with increased butanol production capacity.
  • the gene encoding the enzyme for converting the butyryl CoA (butyryl CoA) to butyrate may be a gene encoding phosphotrans-butyrylase ( ptb ) or a gene encoding a butyrate kinase ( buk, bukII ) Can be.
  • the present invention also relates to the deletion of a gene encoding an enzyme that converts acetyl CoA to acetate in a host microorganism having an acetyl CoA and butyryl CoA biosynthetic pathway. And further deleting a gene encoding an enzyme for converting butyryl CoA to butyrate, and further deleting a gene encoding CoA transferase, and removing alcohol / aldehyde dehydrogenase.
  • the present invention relates to a method for producing a recombinant microorganism having increased butanol producing ability, characterized by amplifying a gene for encoding, and a recombinant microorganism having increased butanol producing ability prepared therefrom.
  • the gene encoding the alcoholol dehydrogenase is adh
  • the gene encoding the aldehyde dehydrogenase is ald
  • the gene encoding the alcohol / aldehyde dehydrogenase may be adhE1 .
  • the adhE1 may increase butanol generating ability by amplifying in various forms.
  • the various forms include the use of a circular promoter (pmoter) to control the expression time and expression amount, such as the ptb promoter or buk promoter thl promoter, including the mutation adhE1 .
  • the present invention provides a gene encoding epoD- or pta or an acetate kinase, which encodes a phosphotrans-acetylase in a Clostridium spp.
  • the present invention relates to a recombinant microorganism having increased butanol producing ability, which is characterized by the deletion of askA or ackA ).
  • Clostridium acetobutylicum ⁇ eutD may be exemplified.
  • the present invention provides a gene encoding epoD- or pta or an acetate kinase, which encodes a phosphotrans-acetylase in a Clostridium spp. askA or ackA ) is deleted, 1) a gene encoding butyrate transacetylase ( ptb ) or a gene encoding butyrate kinase ( buk or / and bukII ); 2)
  • the present invention relates to a recombinant microorganism having increased butanol producing ability, characterized in that a gene selected from the group consisting of a gene encoding CoA transferase (CoA transferase) ( ctfAB or atoDA ) is further deleted.
  • Clostridium acetonitrile unit Tilly glutamicum ATCC 824 ⁇ eutD ⁇ buk ⁇ bukII (Clostridium acetobutylicum ATCC 824 ⁇ eutD ⁇ buk)
  • Clostridium acetonitrile unit Tilly glutamicum ATCC 824 ⁇ eutD ⁇ buk ⁇ ctfB (Clostridium acetobutylicum ATCC 824 ⁇ eutD ⁇ buk ⁇ ctfB ) can be illustrated.
  • the present invention provides a gene encoding epoD- or pta or an acetate kinase, which encodes a phosphotrans-acetylase in a Clostridium spp. askA or ackA ) is deleted, 1) a gene encoding butyrate transacetylase ( ptb ) or a gene encoding butyrate kinase ( buk or / and bukII ); 2) a gene selected from the group consisting of genes ( ctfAB or atoDA ) encoding coate transferase (CoA transferase) is further deleted, aldehyde / alcohol dehydrogenase (aldehyde / alcohol dehydrogenase) It relates to a recombinant microorganism having increased butanol generating ability, characterized in that for amplifying.
  • Clostridium acetonitrile unit Tilly glutamicum ATCC 824 ⁇ eutD ⁇ buk ⁇ buk PptbAdh (Clostridium acetobutylicum ATCC 824 ⁇ eutD ⁇ buk PptbAdh)
  • Clostridium acetonitrile unit Tilly glutamicum ATCC 824 ⁇ eutD ⁇ buk ⁇ bukII PthlAdh * (Clostridium acetobutylicum ATCC 824 ⁇ eutD ⁇ buk PthlAdh *)
  • the present invention comprises the steps of culturing the recombinant microorganism to produce butanol; And it relates to a method for producing butanol comprising the step of recovering butanol from the culture.
  • the culturing of the recombinant microorganism and the recovery of ethanol and butanol may be performed using a culture method commonly known in the conventional fermentation industry and a separation and purification method of ethanol / butanol.
  • the recovery of the butanol and ethanol is generally carried out after the completion of the culture, but in order to increase the productivity using a gas-stripping method (Thaddeus et al., Bioprocess Biosyst. Eng., 27: 207, 2005)
  • Ethanol and butanol may be recovered during the culture. That is, it is also within the scope of the present invention to continue culturing while recovering ethanol and butanol produced during the cultivation.
  • Example 1 Construction of a vector comprising a mutant loxP site and an antibiotic resistance label
  • erythromycin resistance gene (EmR) is mainly used as an antibiotic resistance marker of the vector.
  • EmR erythromycin resistance gene
  • pSOS95-Cm which expresses chloramphenicol / thiamphenicol resistance label (hereinafter Thr) was used as a template for PCR using the thiolase promoter of Clostridium acetobutylicum.
  • Thr chloramphenicol / thiamphenicol resistance label
  • pSOS95-Cm can be produced by cloning the thioloase promoter of ATCC 824 strain to pSOS95 (Nair and Papoutsakis, J. Bacteriol., 176: 5843-5846, 1994) and cloning the chloramphenicol / thiamphenicol resistance gene in its downstream. .
  • the inserted antibiotic resistance label must be removed for deletion of another gene.
  • a mutant loxP sequence was added to a primer used to amplify Thr by PCR.
  • the sequences GCATGC and TCTAGA of the restriction enzymes SphI and XbaI were added to the primers, respectively, to conjugate to the vector.
  • the final primer sequence is shown in SEQ ID NOs: 1, 2.
  • PCR amplification was performed using the template and the primer to obtain a product including both a mutant loxP site and Th r .
  • the PCR product and the pUC18 plasmid thus obtained were cleaved with SphI / XbaI , and then conjugated to complete the vector pMBKOT2.
  • pMBKOT2 is used to construct KO cassettes containing the loxP-Thr-loxP portion and homologous arm of pMBKOT2.
  • gene deletion using homologous recombination uses plasmids that are not replicated in cells, but Clostridium acetobutylicum has a lower rate of transformation than E. coli and less homologous recombination. It is known that a replicable plasmid is used. Therefore, using the shuttle vector pIMP1 (Nair and Papoutsakis, J. Bacteriol. , 176: 5843-5846, 1994) that can be cloned from pMBKOT2 and Clostridium acetobutylicum prepared in Example 1, it is possible to delete specific genes. Vectors were produced.
  • restriction enzyme sequences in pIMP1 are not suitable because they cut the inside of loxP-Th r -loxP sequences of pMBKOT2 except Xma I. Therefore, the sequence of NcoI, a restriction enzyme sequence not present in both pMBKOT2 and pIMP1, was added to pIMP1. About 300 base pairs (1155..1468 of L08752.1) located at pUC18 (GenBank ID: L08752.1) were used as templates, and PCR amplification was performed using the following SEQ ID NOs: 3 and 4 as primers. The NcoI base sequence was included in the primer of SEQ ID NO.
  • the obtained PCR product was digested with pIMP1 with Nco I / Xma I and conjugated to prepare a pCACKO vector, and a gene deletion vector was prepared based on this vector.
  • the desired gene (eutD or ctfB or buk or bukII) was amplified and conjugated with a thiamphenicol marker to the pCACKO vector prepared in Example 2, and then subjected to methylation, followed by C. actobutylicum ATCC 824 strain. Were transformed by electroporation (Mermelstein and Papoutsakis, Appl. Environ. Microbiol., 59 (4): 1077-1081, 1993).
  • Transformed strains were passaged in 2x YTGS medium (16 g / L Bacto Tryptone, 10 g / L Bacto Yeast Extract, 4 g / L NaCl, 2 g / L Glucose, 15 g / L Soluble starch, pH 6.8) Plated in 2x YTG agar (16 g / L Bacto Tryptone, 10 g / L Bacto Yeast Extract, 4 g / L NaCl, 5 g / L Glucose, 15 g / L Agar, pH 5.8) containing thiophenicol .
  • a vector expressing Cre recombinase was prepared in order to remove the thiophenicol resistance gene, which is an antibiotic resistance marker inserted into the gene after deletion of a specific gene through Experimental Example 1.
  • pSOS95 GenBank ID: AY187686.1
  • a promoter of thiolase gene of C. acetobutylicum was used as a parent vector.
  • acetobutylicum and the strands containing the ribosome binding site and the XbaI site are amplified using the primers of SEQ ID NOs: It was.
  • the amplified product and pSOS95 were cleaved with BamHI / NarI, and then conjugated using T4 ligase to prepare pSOS95-X vector.
  • pJW168 (Palmeros et al., Gene , 247: 255-264, 2000) was used as a template to amplify the cre gene, and amplified by PCR using the following SEQ ID NOs: 7 and 8 as primers.
  • the amplified product and pSOS95-X were cleaved with XbaI / NarI , and then conjugated using T4 ligase to prepare pSOS95del-cre vector.
  • PSOS95del-cre prepared in Experimental Example 2 was transformed by electroporation to the C. actobutylicum ATCC 824 recombinant strain in which the target gene was deleted in the same manner as in Experimental Example 1.
  • the transformed strain was passaged 3 to 5 times in 2x YTGS medium, and then plated in 2x YTG agar. When colony grows, it is replicated to 2x YTG agar containing Th to identify colony that lost Th r, and then Th r marker is displayed due to the difference in the length of gene amplified by colony PCR using primers inside and outside the deleted gene. Confirm that it was removed.
  • the selected colony was selected as a colony in which pSOL1 was not lost through the degeneration test as in Experimental Example 1.
  • the colony finally confirmed was selected as the colony in which pSOL1 was not lost and pSOS95del-Cre was lost through passage in the same manner as in Experimental Example 1. Since the strain obtained by the above method does not have any antibiotic resistance markers, the existing vector can be used without altering the markers in the subsequent deletion of other genes.
  • each strand containing the ORF of eutD using primers SEQ ID NOs: 9 and 10, SEQ ID NOs: 11 and 12, respectively (NCBI RefSeq ID: 1890304 of NC_003030.1. 1890770, 1890831..1891380) were amplified by PCR.
  • the template was selected so that the sequence to be amplified does not have Nco I and Xma I sequences. It was found that the two parts of the ORF contained in each amplified product did not overlap each other and matched in directionality.
  • a portion of pMBKOT2 including loxP-Th r -loxP was amplified using primers of SEQ ID NOs: 13 and 14 to insert a label between the two strands.
  • the final product thus prepared was cleaved with NcoI / XmaI with the KO vector pCACKO prepared in Example 2 and conjugated to prepare a pCACKO-eutD vector, which was subjected to methylation and electroporated to the strain C. actobutylicum ATCC 824. Transformation.
  • the transformed strain was plated on 2x YTG agar containing thiamphenicol while subcultured in 2x YTGS medium. Colony obtained from the plate was confirmed by the successful insertion of the Th r marker in the eutD ORF by colony PCR with SEQ ID NO: 15 and 16, 17 and 18, respectively.
  • SEQ ID NO: 16 5'-TTGCCGTCCTAAACTCTGAA-3 '
  • pSOS95del-cre was transformed into the final selected strain in the same manner as in Experimental Example 3 to remove the cyamphenicol resistance gene inserted into the gene, and pSOS95del-cre was removed through passage to remove cyamphenicol and
  • the final strain Clostridium acetobutylicum ATCC 824 ⁇ eutD ), which is sensitive to an antibiotic such as erythromycin and wild-type strain and lacks the eutD gene, was prepared.
  • Clostridium acetobutylicum ATCC 824 ⁇ eutD strain in order to delete one or more genes selected from buk, bukII, ctfB , Clostridium acetobutylicum ATCC 824 ⁇ eutD as a host microorganism in the same manner as in Example 3 Further deletion made recombinant microorganisms. And it was introduced into the alcohol / aldehyde dehydrogenase gene of a gene adhE1 of C. acetobutylicum ATCC 824 expressing the corresponding strain.
  • SEQ ID NOs: 19 to 36 were used.
  • SEQ ID NOS: 19-24 we used the SEQ ID NO: 25 and 30 in order to bukII gene deletion was used to SEQ ID NO: 31 ⁇ 36 to the ctfB gene deletions, respectively.
  • the adhE1 gene of C. acetobutylicum ATCC 824 was amplified by PCR using primers SEQ ID NO: 37 and 38. PCR products were cloned between the promoter of the ptb gene of the pIMP1exter vector and the ctfB transcription terminator. The PCR product and the pIMP1exter vector were respectively digested with SalI / EcoRI restriction enzymes and conjugated. The pIMP1exter vector was cloned into the PstI and SalI restriction sites of the pIMP1 (Nair and Papoutsakis, J. Bacteriol.
  • pTHL-Adh * is a pTHL1-Cm vector and the fragment amplified using SEQ ID NO: 43 and SEQ ID NO: 44 and the fragment amplified by SEQ ID NO: 45 and SEQ ID NO 46 by overlap PCR, and then placed in the PstI and AvaI restriction enzyme site It was produced by cloning.
  • the mutant Adh * is a protein produced by cloning the adhE1 fragment amplified by SEQ ID NO: 43 and SEQ ID NO: 46 in the pTHL1-Cm vector, and artificially recombinant from the results of mutation screening using NTG.
  • Adh * used in this example is reproduced artificially using SEQ ID NOs: 43-46 at the position where the frequency of change is highest in these libraries.
  • Clostridium acetonitrile unit Tilly glutamicum ATCC 824 ⁇ eutD ⁇ buk ⁇ bukII (Clostridium acetobutylicum ATCC 824 ⁇ eutD ⁇ buk)
  • Clostridium acetonitrile unit Tilly glutamicum ATCC 824 ⁇ eutD ⁇ buk ⁇ ctfB (Clostridium acetobutylicum ATCC 824 ⁇ eutD ⁇ buk ⁇ ctfB)
  • Clostridium acetonitrile unit Tilicum ATCC 824 ⁇ eutD ⁇ buk ⁇ buk PptbAdh ( Clostridium acetobutylicum ATCC 824 ⁇ eutD ⁇ buk PptbAdh)
  • the method of preparing the pTHL1-Cm vector is as follows.
  • a shuttle vector for exogenous protein expression comprising a thiolase promoter and a ribosomal binding site (RBS) of Clostridium acetobutylicum was prepared as follows.
  • Thiolase is known to be able to express genes continuously and stably without being strongly influenced by the cell growth cycle (Tummala et al., Appl. Environ. Microbiol., 65: 3793-3799, 1999). Therefore, in this example, the promoter located on the top of the thiolase (NCBI GeneID: 1119056) was cloned and inserted into pIMP-H1del.
  • pIMP-H1del is a shuttle vector that uses pIMP1 as a template by removing one HindIII site in the 3408th base from the pIMP1 having two HindIII restriction sites and leaving only the restriction site located in the 743th base sequence.
  • the primers of SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, and total DNA of Clostridium acetobutylicum (ATCC 824) strain were PCR-templated to amplify the thiolase promoter. After amplified thiolase promoter fragments were purified and recovered, treated with HindIII and PstI restriction enzymes, and then conjugated with the same enzyme-treated pIMP-H1del shuttle vector to complete pTHL1 vector production.
  • PCR of the primers of SEQ ID NO: 49 and SEQ ID NO: 50, pSOS95-Cm was used to amplify the chloramphenicol resistance genes, and after purification and recovery of the amplified chloramphenicol resistance gene fragments, treatment with HindIII restriction enzymes was performed.
  • PTHL1-Cm vector construction was completed by ligation with the enzyme-treated pTHL1 shuttle vector.
  • pSOS95-Cm can be produced by cloning the thioloase promoter of ATCC 824 strain to pSOS95 (Nair and Papoutsakis, J. Bacteriol., 176: 5843-5846, 1994) and cloning the chloramphenicol / thiamphenicol resistance gene in its downstream. .
  • the glucose in the medium was measured by a glucose analyzer (model 2700 STAT, Yellow Springs Instrument, Yellow Springs, Ohio, USA), and the medium was collected over time, and the acetone, ethanol and butanol concentrations produced therefrom were packed column (Supelco a Carbopack TM BAW / 6.6% PEG20M, 2m ⁇ 2 mm ID, Bellefonte, PA, USA) is Agillent 6890N GC System, Agilent Technologies (equipped with gas chromatography) to measure the organic solvent, the yield shown in Table 2 and Table 3 .
  • the recombinant microorganism Clostridium acetobutylicum ATCC824 ⁇ eutD prepared in Example 3 was produced in terms of butanol concentration and butanol yield in comparison to that in the control wild-type Clostridium acetobutylicum ATCC 824 produced less than 10 g / L butanol. It was confirmed that the production capacity was improved. In addition, it was confirmed that the production yield as well as the final production concentration of ethanol and butanol were improved.
  • the recombinant strain C. actobutylicum ATCC 824 ⁇ eutD ⁇ buk strain can be seen that in terms of yield (yield) similar to the C. actobutylicum ATCC 824 ⁇ eutD deletion strain. This is because acetic acid and butyrate are still produced when the gene in the butyrate production pathway and the gene in the acetic acid pathway are deleted simultaneously. In the present invention, it was possible to develop the excellent butanol-producing strains shown above.
  • the present invention was able to complete the present invention by revealing a new fact using eutD, buk (or / and bukII ), ctfB deletion strain of the present invention that acetic acid production can also be produced by the role of coate transferase. Most of the strains shown above are characterized by little butyrate and acetic acid at the end of fermentation.
  • the present invention has the effect of providing a recombinant microorganism having a high production capacity of butanol selectively through the deletion or inactivation of specific genes.
  • Recombinant microorganism according to the present invention is useful for the industrial production of butanol, as well as the production of organic acids such as acetate, butyrate, and by-products such as acetone by metabolic flow manipulation, and can improve the hourly productivity of butanol.

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Abstract

본 발명은 부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물 및 이를 이용한 부탄올의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 대사회로의 조작을 통하여 부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물 및 이를 이용한 부탄올의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물은 아세틸코에이(acetyl CoA) 및 부티릴코에이(butyryl CoA)로의 생합성 경로에 관여하는 효소들을 코딩하는 유전자를 가지는 숙주 미생물에서, 아세틸코에이(acetyl CoA)를 아세테이트로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자가 결실되어 있는 것을 특징으로 한다. 미생물의 대사흐름 조작에 의해 수득된 본 발명에 따른 재조합 미생물은 부탄올을 선택적으로 고효율로 생성할 수 있어, 산업 용제 및 수송 연료 생성 미생물로 유용하다.

Description

부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물 및 이를 이용한 부탄올의 제조방법
본 발명은 부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물 및 이를 이용한 부탄올의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 대사회로의 조작을 통하여 부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물 및 이를 이용한 부탄올의 제조방법에 관한 것이다.
최근 유가의 상승으로 인하여 바이오연료와 같은 대체 에너지에 대한 관심이 증가하며, 에탄올보다 가솔린 대체재로서의 물성이 더 뛰어난 부탄올에 대한 관심이 증가하고 있으며, 이에 따라 부탄올 등 용매를 대사산물로서 생성하는 클로스트리듐(Clostridium)속 균주에 대한 관심도 증가하고 있다.
클로스트리듐 속의 미생물은 그람 양성(Gram-positive), 완전 혐기성이며 내생포자를 형성하는 간균으로서, 대부분이 발효 산물로 아세테이트(acetic acid)과 부티레이트(butyric acid)을 생산하는 것으로 잘 알려져 있다. 이 중의 일부 균주는 상기 유기산 외에도 아세톤, 부탄올, 에탄올을 생산하는 아세톤-부탄올-에탄올 발효(Acetone-Butanol-Ethanol fermentation, 이하 ABE 발효)를 일으킨다.
실제로 20세기 초에 이러한 균주 중 하나인 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridiumacetobutylicum)을 이용하여 아세톤 및 부탄올을 대량으로 생산하였으며, 이러한 대량 생산은 1960~70년대까지 지속되었으나, 화학 공정의 발달로 원유를 원료로 한 아세톤과 부탄올의 화학적 합성 원가가 저렴해지고, 기질 수급의 어려움 등으로 인하여 일부 국가를 제외하고는 사장되었다.
현재까지 클로스트리듐 속 균주를 이용한 바이오 부탄올의 생산은 다음과 같은 문제점들을 내포하고 있다. 첫째로, 효모를 기반으로 하는 바이오에탄올에 비하여 수율 및 생산성이 모두 현저하게 떨어진다는 문제점이 있다. 둘째로, 클로스트리듐 속 균주는 바이오 연료로서의 가치가 높은 부탄올 외에도 아세톤, 초산, 낙산 등의 부산물을 생산하게 되고, 이는 분리 비용을 증가시키는 단점이 있다.
용매를 생성하는 클로스트리듐 속 균주의 경우, 지수 성장기(exponential growth phase)에서는 일반적인 미생물의 발효와 같이 유기산의 생성이 일어난다. 이를 산 생성기(acidogenic phase)라 한다. 안정기에 접어들면서 세포의 대사는 유기산의 재흡수가 일어나고 아세톤(또는 이소프로판올), 부탄올, 에탄올의 용매를 생성하는 용매 생성기(solventogenic phase)로 전환된다. 이는 다음과 같이 해석이 가능하다. 안정기에 접어들면서 pH가 낮아지고 이에 따라 해리되지 않은 유기산의 농도가 증가한다. 그 중에서 특히 해리되지 않은 낙산은 세포에 큰 독성을 나타내며, 이러한 유기산의 재흡수 및 용매로의 전환을 통하여 세포는 가혹한 환경에서 오랫동안 생존할 수 있는 내생포자(endospore)를 형성할 시간을 벌게 되는 것이다.
야생형 균주의 경우 발효 후 아세톤, 부탄올, 에탄올의 질량비율이 약 3:6:1로 생성되며, 미량의 아세테이트, 부티레이트, 아세토인(acetoin)이 생성된다. 포도당을 기질로 하는 경우 부탄올의 질량수율은 20~25% 가량이며, 최종 농도는 10 g/L 내외 정도임이 알려져 있다(Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 101(2):209-228, 2008). 이러한 야생형 균주를 부탄올 생산에 이용할 경우, 낮은 수율과 생산성, 그리고 다른 대사 산물과의 분리가 어려워 생산 단가가 높아지는 문제가 있다.
따라서 최근에는 유전 공학적인 지식과 도구를 바탕으로 대사 경로를 인간이 원하는 대로 조작하는 대사 공학적 접근 방법을 이용하여 개량된 균주를 만들고자 하는 노력이 지속되고 있다. 클로스트리듐 아세토부틸리쿰의 경우, 대사 산물을 생산하는 경로는 오래 전부터 알려져 있었고, 게놈 서열이 해독되면서 이에 해당하는 유전자들도 모두 밝혀진 바 있다(Nolling et al., J. Bacteriol. 2001 ).
부탄올 생산에 있어서 가장 문제가 되는 대사 산물은 아세톤이다. 용매 분리를 위해 기체 탈리(gas stripping)를 이용하는 경우, 유기산과 달리 아세톤과 부탄올 모두 기화가 잘 되는 물질이므로 혼합물의 형태로 분리되게 되며, 추가적인 분리 과정이 요구된다. 아세톤은 아세토아세틸 CoA (acetoacetyl-CoA)가 CoA 전달 효소(CoA transferase)와 아세토아세테이트 탈탄산 효소(acetoacetate decarboxylase)에 의하여 형성된다. 이들은 각각 ctfAB와 adc라는 유전자에 의해 발현된다. 따라서 이들 중 하나 이상의 유전자를 결실시킴으로써 용매 중 아세톤의 비율을 낮출 수 있다. 최근 보고에 의하면, adc의 결실이 실제로 아세톤의 비중을 낮출 수 있는 것으로 확인되었다(Jiang et al., Metab. Eng., 11(4-5):284-291, 2009).
또한, 클로스트리듐의 경우 아세테이트 생성 경로 중 하나의 효소인 인산-아세테이트 전달 효소(phosphotransacetylase)를 발현하는 유전자인 pta와 부티레이트 인산화효소(butyrate kinase)를 발현하는 유전자인 buk를 단일교차(single crossover)를 이용한 플라스미드의 삽입으로 결실시킨 사례가 있다(Green et al., Microbiology. 142:2079-2086, 1996). 하지만, 부티레이트 인산화효소를 코딩하는 buk 유전자를 결실시킨 경우에는 부탄올의 농도가 약 16 g/l까지 증가되었으나, 인산-아세테이트 전달 효소를 코딩하는 pta 유전자를 결실시킨 경우에는 부탄올의 농도가 9.9 g/l로써, 부탄올의 농도 및 선택성이 거의 증가하지 않은 것으로 보고되었다.
WO2008/052973에서는 '부티레이트 생산경로 차단 + 아세테이트 생산경로 차단'된 균주 및 '부티레이트 생산경로 차단 + 아세톤 생산 경로 차단 + 아세테이트 생산경로 차단'된 균주 등을 보고한 바 있으나, 이는 부티레이트 생산경로를 차단시킨 것을 필수적으로 하고 있기에, 아세테이트 생산 경로만을 단독으로 결실시킬 경우 부탄올 생성능이 향상되었는지 여부는 확인할 수 없었다. 또한, WO2008/052973에서는 buk 또는 ptb 결실에 기반한 다양한 조합의 유전자 결실에 대하여 청구하고 있으나, 실시예에는 단지 이미 알려진 buk 유전자가 결실된 결과만을 보여 줄뿐, 이후 다양한 조합의 유전자 결실에 대한 실시예가 전혀 없는 문제점이 있다. 다시 말해서, 단지 buk 또는 ptb 결실에 기반한 다양한 추가 결실 가능한 조합에 대해서 과학적인 실험적 근거 없이 포괄적으로 제안할 뿐 실제 부탄올 생산에 있어서 농도, 수율, 선택도 등의 향상에 기여했는지에 대해서 알 수 없는 심각한 문제점이 있다.
따라서, 지금까지 보고된 바에 의하면, pta 결실이 부탄올의 농도향상 및 수율 향상에 도움이 된다는 증거는 없다. 또한, pta 결실에 대한 정보가 없었기 때문에, pta 결실 변이주에 buk를 추가로 결실시킨 변이주에 대해서도 어떤 결과가 나올지 명확히 알려진 바 없다. 또한, 일반적으로 부티레이트 생산에 관여하는 buk와 아세트산 생산에 관여하는 pta 유전자를 동시에 결실시킬 경우, 부티레이트이나 아세트산이 생산되지 않아 부탄올 수율이 증가 할 것으로 예측될 수 있으나 (WO2008/052973), 이는 잘못된 예측일 뿐이다 (이후 상세설명 참조).
이에 본 발명자들은 클로스트리듐 속 미생물에서 아세틸코에이(acetyl CoA)를 아세테이트로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자를 결실시킬 경우, 부탄올의 선택성과 수율을 높임으로써, 부탄올 생성능이 향상된다는 사실을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
또한, 본 발명자들은 부탄올 선택도와 수율이 향상된 pta 결실 변이주에 추가로 buk 유전자를 결실시키고 알데히드/알코올 디하이드로게나제를 증폭시킴으로써 고농도, 고수율, 고선택도를 가지는 부탄올 생산 미생물을 제작하고, 고농도, 고수율, 고선택도의 부탄올 생성능을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
또한, 본 발명자들은 상기 pta와 buk가 동시에 결실되고 알데히드/알코올 디하이드로게나제를 증폭시킨 변이주에 또다른 부티레이트 키나제(butyrate kinase)를 코딩하는 bukII 유전자를 추가 결실시켜 유기산을 거의 생산하지 않는 고농도, 고수율, 고선택적 부탄올 생산균주를 제작하고, 그 부탄올 생성능을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
또한, 본 발명자들은 상기 pta, buk 및 bukII가 동시에 결실되고 알데히드/알코올 디하이드로게나제를 증폭시킨 변이주에 코에이 트란스퍼라제(CoAT)를 코딩하는 ctfB 유전자를 추가 결실시켜 유기산을 거의 생산하지 않는 고농도, 고수율, 고선택적 부탄올 생산균주를 제작하고, 그 부탄올 생성능을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 다른 부산물의 생산을 줄여 부탄올을 선택적으로 고효율로 생산하는 재조합 미생물 및 그 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 이용한 부탄올의 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아세틸코에이(acetyl CoA) 및 부티릴코에이(butyryl CoA) 생합성 경로를 가지고 있는 숙주 미생물에서, 아세틸코에이(acetyl CoA)를 아세테이트로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자를 결실시키는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 아세틸코에이(acetyl CoA) 및 부티릴코에이(butyryl CoA)로의 생합성 경로를 가지는 숙주 미생물에서, 아세틸코에이(acetyl CoA)를 아세테이트로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자가 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 클로스트리듐(Clostridium) 속 미생물에서, 포스포트랜스-아세틸라제(phosphotrans-acetylase)를 코딩하는 유전자(eutD 또는 pta) 또는 아세테이트 키나제(acetate kinase)를 코딩하는 유전자(askA 또는 ackA)가 결실되어 있는것을 특징으로 하는 부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물 Clostridium acetobutylicum ATCC 824 ΔeutD, Clostridium acetobutylicum ATCC 824 ΔeutD Δbuk PptbAdh, Clostridium acetobutylicum ATCC 824 ΔeutD Δbuk PthlAdh＊, C. actobutylicum ATCC 824 ΔeutD Δbuk ΔbukII PthlAdh＊ 및 C. actobutylicum ATCC 824 ΔeutD Δbuk ΔbukII ΔctfB PthlAdh＊를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물을 배양하여 부탄올을 생성하는 단계; 및 상기 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 단계를 포함하는 부탄올의 제조방법을 제공한다.
도 1은 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 균주의 대사회로이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 유전자 결실 벡터(pCACKO)의 유전자 지도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 플라스미드 pIMP1PbAdhE1의 유전자 지도이다.
발명의 상세한 설명 및 구체적인 구현예
본 발명에서는 도 1의 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 균주의 대사회로에서 아세테이트 합성 경로를 결실시킬 경우, 재조합 균주의 부탄올 생성능이 향상되는지를 확인하고자 하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 (Clostridium acetobutylicum) ATCC 824의 유전자로부터 아세틸코에이(acetyl CoA)를 아세테이트로 전환하는 데 관여하는 포스포 트랜스 아세틸라제를 코딩하는 유전자(eutD)를 결실시킨 재조합 미생물을 결실시킨 재조합 미생물을 제작하고, 재조합 미생물의 부탄올 생성능이 향상된 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 아세틸코에이(acetyl CoA) 및 부티릴코에이(butyryl CoA) 생합성 경로를 가지고 있는 숙주 미생물에서, 아세틸코에이(acetyl CoA)를 아세테이트로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자를 결실시키는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물의 제조방법 및 이로부터 제조된 부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명에서 "생합성 경로"란 해당과정(glycolysis)을 거쳐서 제공된 탄소로부터 목적 화합물이 합성되는 경로만으로 국한하지 않고, 세포내의 특정 대사산물로부터 목적 화합물이 합성되는 경로들을 포괄하는 개념이다.
본 발명에서 "결실"이란 해당 유전자의 일부 염기를 변이, 치환, 또는 삭제시키거나, 일부 염기를 도입시키거나, 또는 해당 효소의 발현 또는 활성을 억제시키는 유전자, 효소 또는 화학물질을 도입시켜 대응하는 효소의 활성을 억제시키는 것을 포괄하는 개념이다. 따라서, 특정 유전자를 결실시키는 방법에 대해서는 기존에 알려진 antisense RNA를 이용한 발현억제, 상동성 재조합 (homologous recombination), 다양한 재조합효소 (rambda recombinase 등) 발현을 통한 상동성 재조합, 역전사효소와 RNA를 이용한 특정서열 삽입 등의 방법으로 목적하는 특정 유전자 및 그 유전자가 코딩하는 효소의 활성이 억제되는 한 어떤 특정한 방법에 국한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 아세틸코에이(acetyl CoA) 및 부티릴코에이(butyryl CoA) 생합성 경로를 가지고 있다라고 하는 것은 균주 자체에서 원래부터 가지고 있는 것 뿐만 아니라 재조합, 지놈셔플링(genome shuffling) 등의 기법으로 외래의 유전자를 도입한 것까지 모두 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 아세틸코에이(acetyl CoA) 및 부티릴코에이(butyryl CoA) 생합성 경로를 가지고 있는 숙주 미생물은 아세톤, 에탄올, 부탄올, 이소프로판올로 구성된 군에서 선택되는 1가지 이상을 생산하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 숙주 미생물은 클로스트리듐 속 유래인 것을 특징으로 할 수 있으나, 아세틸코에이(acetyl CoA) 및 부티릴코에이(butyryl CoA)로의 생합성 경로에 관여하는 효소들을 코딩하는 유전자를 가지는 한 이에 국한되는 것은 아니다.
상기 클로스트리듐 속 미생물로는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 클로스트리듐 바이예링키아이(Clostridium beijerinckii), 클로스트리듐 사카로부틸리쿰(Clostridium saccharobutylicum), 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰(Clostridium saccharoperbutylacetonicum), 클로스트리듐 퍼프린겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 클로스트리듐 디피실리(Clostridium difficile), 클로스트리듐 부티리쿰(Clostridium butyricum), 클로스트리듐 부틸리쿰(Clostridium butylicum), 클로스트리듐 클루이베리(Clostridium kluyveri), 클로스트리듐 타이로부틸리쿰(Clostridium tyrobutylicum), 클로스트리듐 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum) 등 을 예시할 수 있다.
본 발명에서는 클로스트리듐 속 숙주 미생물로 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC824만을 예시하였으나, 이외에도 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 M5, 1NYG, 4NYG, 5NYG 및 DG1 (Stim-Herndon, K.P. et al., Biotechnol./Food Microbiol., 2:11, 1996)과 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC 824 Type IV, M3, M5, 2-BB R, 2-BB D, Rif B12, Rif D10, Rif F7, 및 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC 860 (Clark, S.W. et al., Appl. Environ. Microbiol., 55:970, 1989)을 사용할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 아세틸코에이(acetyl CoA)를 아세테이트로 전환하는 효소는 포스포트랜스-아세틸라제(phosphotrans-acetylase) 또는 아세테이트 키나제(acetate kinase)이며, 상기 포스포트랜스-아세틸라제(phosphotrans-acetylase)를 코딩하는 유전자는 eutD 또는 pta이고, 상기 아세테이트 키나제(acetate kinase)를 코딩하는 유전자는 askA 또는 ackA인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 유전자의 결실 방법은 목적하는 유전자가 코딩하는 효소의 활성이 억제되는 한 특별히 제한되는 것은 없다.
한 예로 이중교차에 의한 상동성 재조합방법은, 항생제 저항성 유전자를 목적 유전자의 염기서열을 갖는 유전자 절편 중에 삽입하여 목적 유전자절편의 작용을 불활성화 시킨 후, 다시 이 불활성화된 목적 유전자 절편을 균주 내에 도입시켜 염색체 내의 목적 유전자와 상기 불활성화된 목적 유전자 절편 사이에 이중 교차 재조합(double crossover recombination)이 일어나도록 함으로써, 미생물의 염색체 내 목적 유전자가 불활성화 되도록 할 수 있다.
또 다른 한 예로 역전사효소와 RNA를 이용한 특정서열 삽입 방법은, 목적 유전자에서 역전사 효소 결합부위를 찾은 뒤, 그 결합부위에 인접한 일부서열로 치환된 RNA 전사부위에서 발현된 RNA와 역전사효소 복합체에 의해서 RNA의 일부가 목적유전자에 삽입되어 목적하는 효소의 활성을 억제시켜 목적 유전자가 불활성화 되도록 할 수 있다.
그리고, 본 발명의 일 실시예에서는 포스포 트랜스 아세틸라제를 코딩하는 유전자(eutD)를 결실시킨 재조합 미생물을 제작하고, 제작된 재조합 미생물이 향상된 부탄올 생성능을 가지는 것을 확인하였다.
그리고, 본 발명의 일 실시예에서는 포스포 트랜스 아세틸라제를 코딩하는 유전자(eutD)를 결실시킨 재조합 미생물에서, (A) 부티릴코에이를 부티레이트로 전환하는 포스포트랜스-부티릴라제(phosphotrans-butyrylase) 또는 부티레이트 키나제 (butyrate kinase)를 코딩하는 유전자(ptb 또는 buk/bukII)를 더욱 결실시키고, (B) 알데히드/알코올 디하이드로게나제 (aldehyde/alcohol dehydrogenase)를 증폭시킨 재조합 미생물을 제작하고, 제작된 재조합 미생물이 향상된 부탄올 생성능 및 감소된 아세톤, 부티레이트, 아세트산의 생성능을 가지는 것을 확인하였다. 또한, (C) 코에이 트란스퍼라제(CoAT)를 코딩하는 ctfA 또는 ctfB 유전자를 추가 결실시킨 재조합 미생물을 제작하고, 제작된 재조합 미생물이 유기산을 거의 생산하지 않는 고농도, 고수율, 고선택적 부탄올 생성능을 확인하였다.
따라서, 본 발명에 있어서, 상기 부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물의 제조방법은 아세틸코에이(acetyl-CoA)를 아세트산으로 전환하는 포스포트랜스-아세틸라제 및 아세테이트 키나제를 코딩하는 eutD(pta) 및 ackA 유전자가 중 하나 이상이 결실된 균주에, (a) 아세테이트 및 부티레이트를 각각 아세틸코에이(acetyl CoA) 및 부티릴코에이(butyryl CoA)로 전환하고, 아세토아세틸코에이(acetoacetylCoA)를 아세토아세테이트로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자; 및 (b) 부티릴코에이(butyryl-CoA)를 부티레이트로 전환하는 포스포트랜스-부티릴라제를 코딩하는 유전자; 및 (c) 부티레이트 키나제(butyrate kinase)를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택되는 유전자를 1개 이상 추가로 결실시키는 것을 특징으로 하고, 알데히드/알코올 디하이드로게나제 (aldehyde/alcohol dehydrogenase)를 증폭 시키는 것을 특징으로 한다.
상기 아세테이트 및 부티레이트를 아세틸코에이(acetyl CoA) 및 부티릴코에이(butyryl CoA)로 전환하고, 아세토아세틸코에이(acetoacetylCoA)를 아세토아세테이트로 전환하는 효소는 코에이트랜스퍼라제(CoA transferase)이며, 상기 코에이트랜스퍼라제(CoA transferase)를 코딩하는 유전자는 ctfAB 또는 atoDA이다.
상기 부티릴코에이(butyryl-CoA)를 부티레이트로 전환하는 포스포트랜스-부티릴라제를 코딩하는 유전자는 ptb이다.
상기 부티레이트 키나제(butyrate kinase)를 코딩하는 유전자는 buk 및 bukⅡ로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자인 것을 특징으로 한다.
상기 알데히드/알코올 디하이드로게나제 (aldehyde/alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자는 adhE1 또는 adhE2이며, 이들의 변이체도 포함한다. 특히, 변이체는 adhE1이 코딩하는 단백질(서열번호 51)의 450~650번째 아미노산중 1개 이상 변이가 있는 것이 더욱 바람직하다.
그리고, 본 발명의 일 실시예에서는 포스포 트랜스 아세틸라제를 코딩하는 유전자(eutD)를 결실시킨 재조합 미생물에서, 부티릴코에이(butyryl CoA)를 부티레이트로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자(buk 또는/그리고 bukII)를 추가로 결실시킨 재조합 미생물을 제작하고, 추가로 코에이트랜스퍼라제(CoA transferase)를 코딩하는 ctfA 또는 ctfB를 추가로 결실시켜 재조합 미생물을 제작하고, 제작된 재조합 미생물에 알코올/알데히드 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자(adhE1)를 추가로 도입시킨 재조합 미생물을 제작하고 이들 미생물이 향상된 부탄올 생성능 및 감소된 아세톤의 생성능을 가지는 것을 확인하였다.
따라서, 상기 아세틸코에이(acetyl CoA) 및 부티릴코에이(butyryl CoA) 생합성 경로를 가지고 있는 숙주 미생물에서, 아세틸코에이(acetyl CoA)를 아세테이트로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자 및 부티릴코에이(butyryl CoA)를 부티레이트로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자를 결실시킨 후, 1) 알콜올 디하이드로게나제; 2) 알데히드 디하이드로게나제; 및 3) 알코올/알데히드 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택되는 유전자 1개 이상을 추가로 도입 또는 증폭 시키는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물의 제조방법 및 이로부터 제조된 부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물에 관한 것이다.
상기 부티릴코에이(butyryl CoA)를 부티레이트로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자는 포스포트랜스-부티릴라제를 코딩하는 유전자(ptb) 또는 부티레이트 키나제를 코딩하는 유전자(buk, bukⅡ)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 아세틸코에이(acetyl CoA) 및 부티릴코에이(butyryl CoA) 생합성 경로를 가지고 있는 숙주 미생물에서, 아세틸코에이(acetyl CoA)를 아세테이트로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자를 결실시킨 후, 부티릴코에이(butyryl CoA)를 부티레이트로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자를 추가로 결실시키고, 코에이트랜스퍼라제(CoA transferase)를 코딩하는 유전자를 추가로 결실시고, 알코올/알데히드 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자를 증폭하는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물의 제조방법 및 이로부터 제조된 부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물에 관한 것이다.
상기 알콜올 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자는 adh이고, 상기 알데히드 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자는 ald이며, 상기 알코올/알데히드 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자는 adhE1인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 adhE1은 다양한 형태로 증폭함으로써 부탄올 생성능을 증가시킬 수 있다. 상기 다양한 형태라함은 원형의 프로모터(promoter)를 이용하는 것을 포함하여 ptb 프로모터나 buk 프로모터 thl 프로모터 등으로 발현 시점 및 발현량을 조절 할 수 있으며, 돌연변이 adhE1까지도 포함한다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 클로스트리듐(Clostridium) 속 미생물에서, 포스포트랜스-아세틸라제(phosphotrans-acetylase)를 코딩하는 유전자(eutD 또는 pta) 또는 아세테이트 키나제(acetate kinase)를 코딩하는 유전자(askA 또는 ackA)가 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물에 관한 것이다.
상기 부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물로는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC 824ΔeutD (Clostridium acetobutylicum ΔeutD)을 예시할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 클로스트리듐(Clostridium) 속 미생물에서, 포스포트랜스-아세틸라제(phosphotrans-acetylase)를 코딩하는 유전자(eutD 또는 pta) 또는 아세테이트 키나제(acetate kinase)를 코딩하는 유전자(askA 또는 ackA)가 결실되어 있고, 1) 부티레이트 트랜스아세틸라제(butyrate transacetylase)를 코딩하는 유전자(ptb) 또는 부티레이트 키나제(butyrate kinase)를 코딩하는 유전자 (buk 또는/그리고 bukII); 2) 코에이트랜스퍼라제(CoA transferase)를 코딩하는 유전자(ctfAB 또는 atoDA)로 구성된 군에서 선택되는 유전자가 추가로 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물에 관한 것이다.
상기 부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물로는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC 824 ΔeutD Δbuk ΔbukII (Clostridium acetobutylicum ATCC 824 ΔeutD Δbuk), 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC 824 ΔeutD Δbuk ΔctfB (Clostridium acetobutylicum ATCC 824 ΔeutD Δbuk ΔctfB)을 예시할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 클로스트리듐(Clostridium) 속 미생물에서, 포스포트랜스-아세틸라제(phosphotrans-acetylase)를 코딩하는 유전자(eutD 또는 pta) 또는 아세테이트 키나제(acetate kinase)를 코딩하는 유전자(askA 또는 ackA)가 결실되어 있고, 1) 부티레이트 트랜스아세틸라제(butyrate transacetylase)를 코딩하는 유전자(ptb) 또는 부티레이트 키나제(butyrate kinase)를 코딩하는 유전자 (buk 또는/그리고 bukII); 2) 코에이트랜스퍼라제(CoA transferase)를 코딩하는 유전자(ctfAB 또는 atoDA)로 구성된 군에서 선택되는 유전자가 추가로 결실되어 있는 것을 특징으로 하고, 알데히드/알코올 디하이드로게나제 (aldehyde/alcohol dehydrogenase)를 증폭 시키는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물에 관한 것이다.
상기 부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물로는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC 824 ΔeutD Δbuk Δbuk PptbAdh (Clostridium acetobutylicum ATCC 824 ΔeutD Δbuk PptbAdh), 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC 824 ΔeutD Δbuk ΔbukII PthlAdh* (Clostridium acetobutylicum ATCC 824 ΔeutD Δbuk PthlAdh*), 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC 824 ΔeutD Δbuk ΔctfB PthlAdh* (Clostridium acetobutylicum ATCC 824 ΔeutD Δbuk ΔbukII ΔctfB PthlAdh*)을 예시할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 재조합 미생물을 배양하여 부탄올을 생성하는 단계; 및 상기 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 단계를 포함하는 부탄올의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 재조합 미생물의 배양 및 에탄올 및 부탄올의 회수 과정은 종래 발효 공업에서 통상적으로 알려진 배양방법 및 에탄올/부탄올의 분리 정제 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 아울러, 상기 부탄올 및 에탄올의 회수는 배양이 완료된 이후에 수행하는 것이 일반적이나, 생산성을 높이기 위하여 gas-stripping 방법(Thaddeus et al., Bioprocess Biosyst. Eng., 27:207, 2005)등을 이용하여 배양도중에 에탄올 및 부탄올을 회수할 수도 있다. 즉, 배양중에 생성된 에탄올 및 부탄올을 회수하면서 계속 배양하는 것도 본 발명의 범위에 속한다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
특히, 하기 실시예에서는 본 발명에 따른 유전자를 결실시키기 위하여 숙주균주로 특정 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC 824만을 예시하였으나, 다른 클로스트리듐 속이나 다른 속의 미생물을 사용하더라도, 아세틸코에이(acetyl CoA)에서 부티릴코에이(butyryl CoA)로의 생합성 경로를 가지고 있는 숙주균주에 동일 유전자를 결실하고, 이를 이용하여 에탄올 및 부탄올을 제조하는 것 역시 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: mutant loxP site와 항생제 내성 표지를 포함하는 벡터의 제작
클로스트리듐 아세토부틸리쿰의 경우, 주로 erythromycin 내성 유전자(이하 Emr)가 vector의 항생제 내성 표지로 이용된다. 이중 교차를 이용한 유전자 결실을 위해서는 이중 교차가 일어난 균주를 선택하기 위해 항생제 내성 표지가 하나 더 필요하다. 따라서 클로스트리듐 아세토부틸리쿰의 thiolase promoter를 이용하여 chloramphenicol/thiamphenicol 내성 표지(이하 Thr)를 발현하는 pSOS95-Cm을 PCR의 주형으로 이용하였다. pSOS95-Cm은 pSOS95 (Nair and Papoutsakis, J. Bacteriol., 176:5843-5846, 1994)에 ATCC 824균주의 thioloase promoter를 cloning하고, 그 down-stream에 chloramphenicol/thiamphenicol 내성 유전자를 cloning함으로써 제작 가능하다.
또한 이중 교차가 일어나 유전자가 결실된 후, 다른 유전자의 결실을 위하여 삽입된 항생제 내성 표지가 제거되어야 한다. 이를 위해 Thr을 PCR로 증폭할 때 사용하는 프라이머(primer)에 mutant loxP sequence를 추가하였다. 또한, 벡터에 접합시키기 위해 제한 효소 SphI과 XbaI의 서열 GCATGC와 TCTAGA를 프라이머에 각각 추가하였다. 최종 프라이머 서열은 서열번호 1, 2와 같다.
서열번호 1: 5’-AATTGCATGCTACCGTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGT TATCACACGGTTTAA CGACTTAATTACG-3’
서열번호 2: 5’-ATATTCTAGAACCGTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTT ATCCATGATTACGAA TTCTATGAGTCGAC-3’
상기 주형과 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 수행하여 mutant loxP site와 Thr을 모두 포함하는 산물을 얻었다. 이렇게 얻은 PCR 산물과 pUC18 플라스미드를 SphI/XbaI으로 절단한 후, 접합하여 벡터 pMBKOT2를 완성하였다. pMBKOT2는 pMBKOT2의 loxP-Thr-loxP 부분과 homologous arm을 포함하는 KO cassette 제작에 이용된다.
실시예 2: pCACKO 벡터의 제작
일반적으로 homologous recombination을 이용한 유전자 결실은 세포 내에서 복제되지 않는 플라스미드를 이용하지만, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰의 경우 DNA 양에 비해 형질전환되는 비율이 대장균보다 극히 낮으며, homologous recombination도 잘 일어나지 않는 것으로 알려져 있으므로 복제 가능한 플라스미드를 사용하는 것이 바람직하다. 따라서 실시예 1에서 제작된 pMBKOT2와 클로스트리듐 아세토부틸리쿰에서 복제 가능한 shuttle vector pIMP1 (Nair and Papoutsakis, J. Bacteriol., 176:5843-5846, 1994)을 이용하여 특정유전자를 결실시킬 수 있는 벡터를 제작하였다.
먼저 pIMP1에 있는 제한 효소 서열은 XmaI 외에는 pMBKOT2의 loxP-Thr-loxP서열의 내부를 자르므로 적합하지 않다. 따라서 pMBKOT2와 pIMP1에 모두 존재하지 않는 제한 효소 서열인 NcoI의 서열을 pIMP1에 추가하였다. pUC18(GenBank ID: L08752.1)에 위치하는 300여개의 염기쌍(L08752.1의 1155..1468)을 주형으로 하고, 하기 서열번호 3과 4를 프라이머로 하여 PCR 증폭을 수행하였다. NcoI염기 서열은 서열번호 3의 프라이머에 포함하였다.
서열번호 3: 5’-AAAACTGCAGCCATGGTCGCCAGTTAATAGTTTGCG-3’
서열번호 4: 5’-AAAACCCGGGCGCCGCATACACTATTCTCA-3’
얻어진 PCR 산물을 pIMP1과 함께 NcoI/XmaI으로 절단한 후 접합하여 pCACKO 벡터를 제작하고, 이 벡터를 기반으로 하여 유전자 결실 벡터를 제작하였다.
실험예 1: pCACKO 벡터를 이용한 목적 유전자의 결실 방법
실시예 2에서 제작된 pCACKO 벡터에 원하는 목적 유전자(eutD 또는 ctfB 또는 buk 또는 bukII)를 싸이암페니콜(thiamphenicol) 마커와 함께 유전자를 증폭하여 접합하고, 이를 methylation 처리한 후 C. actobutylicum ATCC 824 균주에 전기천공법으로 형질 전환하였다(Mermelstein and Papoutsakis, Appl. Environ. Microbiol., 59(4):1077-1081, 1993). 형질 전환된 균주는 2x YTGS 배지(16 g/L Bacto Tryptone, 10 g/L Bacto Yeast Extract, 4 g/L NaCl, 2 g/L Glucose, 15 g/L Soluble starch, pH 6.8)에서 계대 배양하면서 싸이암페니콜이 포함된 2x YTG agar(16 g/L Bacto Tryptone, 10 g/L Bacto Yeast Extract, 4 g/L NaCl, 5 g/L Glucose, 15 g/L Agar, pH 5.8)에 plating하였다.
Plate에서 얻어진 colony는 각각 colony PCR을 통하여 목적 유전자 ORF 내에 Thr 마커가 성공적으로 삽입되었는지 확인하였다. 양쪽으로의 재조합이 확실하게 일어난 경우, colony를 배양하여 plating한 후, degeneration test를 통하여 용매 생성에 관여하는 pSOL1이 유실되지 않았음을 확인하였다(Scotcher and Bennett, J. Bacteriol., 187(6):1930-1936, 2005). 최종 확인된 균주는 상기 사용된 pCACKO 벡터를 제거하기 위하여 2x YTGS 배지에서 30번 이상 계대 배양시킨 후, Th가 포함된 2x YTG agar에 plating 하고, 에리트로마이신(Em, erythromycin)이 포함된 2x YTG agar에 replication하여 Emr을 나타내지 않는 colony를 여러 개 선택한 후 상기 방법과 마찬가지로 degeneration test를 거쳐서 pSOL1이 유실되지 않은 colony를 최종적으로 선택하였다.
실험예 2: Cre recombinase를 발현하는 벡터의 제작
실험예 1를 통한 특정 유전자의 결실 후 유전자에 삽입된 항생제 내성 마커인 싸이암페니콜 내성 유전자를 제거하기 위하여 Cre recombinase를 발현하는 벡터를 제조하였다. Cre recombinase를 발현하는 벡터를 만들기 위해, C. acetobutylicum의 thiolase 유전자의 promoter를 포함하는 pSOS95(GenBank ID:AY187686.1)를 모(母) 벡터로 하여 작업을 진행하였다. 먼저 cre 유전자의 ORF 서열 내에 BamHI site가 존재하여 사용이 어려우므로 C. acetobutylicum의 chromosomal DNA를 주형으로 하고, 하기 서열번호 5와 6의 프라이머를 이용하여 Ribosome binding site와 XbaI site가 포함된 가닥을 증폭하였다. 다음으로 증폭된 산물과 pSOS95를 BamHI/NarI으로 절단한 후, T4 ligase를 이용하여 접합하여 pSOS95-X 벡터를 제작하였다.
서열번호 5: 5’-GCATGGATCCAGAATTTAAAAGGAGGGATTAAATCTAGAA TGATAAGAAGCATGACGGGATTTG-3’
서열번호 6: 5’-GCATGGCGCCTCACTCTATATTTTGAATTTGTTCTC-3’
cre 유전자를 증폭하기 위하여 pJW168(Palmeros et al., Gene, 247:255~264, 2000))을 주형으로 하고, 하기 서열번호 7과 8을 프라이머로 이용하여 PCR로 증폭하였다. 다음으로 증폭된 산물과 pSOS95-X를 XbaI/NarI으로 절단한 후, T4 ligase를 이용하여 접합하여 pSOS95del-cre 벡터를 제작하였다.
서열번호 7: 5’-GCAATCTAGAATGTCCAATTTACTGACCGTACA-3’
서열번호 8: 5’-GCATGGCGCCCTAATCGCCATCTTCCAGCAGG-3’
실험예 3: pSOS95del-cre를 이용한 유전자에 삽입된 항생제 내성 마커의 제거
실험예 2에서 제작된 pSOS95del-cre를 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 목적 유전자가 결실된 C. actobutylicum ATCC 824 재조합 균주에 전기천공법으로 형질 전환하였다. 형질 전환된 균주는 2x YTGS 배지에서 3~5회 계대 배양한 후, 2x YTG agar에 도말하였다. colony가 생장하면 이를 Th가 포함된 2x YTG agar에 replication하여 Thr을 잃은 colony를 확인한 후, 결실된 유전자 내/외부의 프라이머를 이용한 colony PCR을 통하여 증폭된 유전자의 길이의 차이로 Thr 마커가 제거되었는지를 확인하였다.
이렇게 선택된 colony는 상기 실험예 1과 같이 degeneration test를 통하여 pSOL1이 유실되지 않은 colony를 선택하였다. 최종 확인된 colony는 상기 실험예 1과 같은 방법으로 계대배양을 통해 pSOL1은 유실되지 않고, pSOS95del-Cre가 유실된 colony를 선택하였다. 상기 방법으로 얻어진 균주는 항생제 내성 마커를 전혀 가지고 있지 않으므로 추후 다른 유전자의 결실 작업을 함에 있어서 기존의 벡터를 마커의 변경 없이 사용할 수 있다.
실시예 3: 아세테이트 생산경로 차단 균주의 제작
아세테이트 생산 경로에 관여하는 eutD 유전자를 결실시키기 위하여, 각각 서열번호 9와 10, 서열번호 11과 12의 프라이머를 이용하여 eutD의 ORF를 포함하는 각 가닥(NCBI RefSeq ID: NC_003030.1의 1890304..1890770, 1890831..1891380)을 PCR로 증폭하였다. 이 때, 증폭할 서열은 NcoI과 XmaI 서열을 가지지 않도록 주형을 선택하였다. 증폭된 각각의 산물에 포함된 ORF의 두 부분은 서로 중첩되지 않고 방향성이 일치하는 것으로 확인되었다. 또한, 두 가닥 사이에 표지를 삽입하기 위해 loxP-Thr-loxP를 포함하는 pMBKOT2의 일부를 하기 서열번호 13과 14의 프라이머를 이용하여 증폭하였다.
서열번호 9: 5’-CTAGCCATGGAGCATATGGGAGTGTGCTAAG-3’
서열번호 10: 5’-CGGCCAACGCTCGCAGTCAGGTATTATCAT-3’
서열번호 11: 5’-GCGAATGGCGAGATGAACTAGCTGATATTGCTATAA-3’
서열번호 12: 5’-ACGTCCCGGGCGAGTACAGTTTCATCCTTCATATC-3’
서열번호 13: 5’-CTGACTGCGAGCGTTGGCCGATTCAT-3’
서열번호 14: 5’-TAGTTCATCTCGCCATTCGCCATTCA-3’
증폭된 3개의 가닥을 주형으로 하고, 서열번호 9과 12의 프라이머를 이용하여, overlapping PCR을 수행하여 하나의 가닥으로 만들었다. 이렇게 만들어진 최종 산물을 실시예 2에서 제작한 KO 벡터인 pCACKO와 함께 NcoI/XmaI으로 절단한 후 접합하여 pCACKO-eutD 벡터를 제작하고, 이를 methylation 처리한 후 C. actobutylicum ATCC 824 균주에 전기천공법으로 형질 전환하였다. 형질 전환된 균주는 2x YTGS 배지에서 계대 배양하면서 싸이암페니콜(thiamphenicol)이 포함된 2x YTG agar에 plating하였다. plate에서 얻어진 colony는 각각 하기 서열번호 15와 16, 17과 18로 각각 colony PCR을 통하여 eutD ORF 내에 Thr 마커가 성공적으로 삽입되었는지 확인하였다.
서열번호 15: 5’-GAGGATAAAGAATATACGCAGG-3’
서열번호 16: 5’-TTGCCGTCCTAAACTCTGAA-3’
서열번호 17: 5’-CTTCCTTTGGCAATTCAAGTTC-3’
서열번호 18: 5’-GTGGATTATGAAGCGGTGCA-3’
양쪽으로의 재조합이 확실하게 일어난 경우, colony를 배양하여 plating한 후, degeneration test를 통하여 용매 생성에 관여하는 pSOL1이 유실되지 않았음을 확인하였다. 최종 확인된 균주는 2x YTGS 배지에서 30번 이상 계대 배양시킨 후, Th가 포함된 2x YTG agar에 plating 하고, 에리트로마이신(Em, erythromycin)이 포함된 2x YTG agar에 replication하여 Emr을 나타내지 않는 colony를 여러 개 선택한 후 상기 방법과 마찬가지로 degeneration test를 거쳐서 pSOL1이 유실되지 않은 colony를 최종적으로 선택하였다.
그런 다음, 상기 실험예 3과 동일한 방법으로 pSOS95del-cre를 최종 선택된 균주에 형질전환시켜 유전자 내에 삽입한 싸이암페니콜 내성 유전자를 제거하고 계대배양을 통해 pSOS95del-cre를 제거하여 싸이암페니콜과 에리트로마이신 등의 항생제에 대해 야생형 균주와 마찬가지로 민감하고, eutD 유전자가 결실된 최종 균주(Clostridium acetobutylicum ATCC 824 ΔeutD)를 제조하였다.
실시예 4: 추가 유전자 결실 및 유전자 증폭에 의한 재조합 균주의 개발
Clostridium acetobutylicum ATCC 824 ΔeutD균주에 buk, bukII, ctfB에서 선택되는 1가지 이상의 유전자를 결실시키기 위하여, 실시예 3에서 제조된 균주(Clostridium acetobutylicum ATCC 824 ΔeutD)를 숙주 미생물로 하여 실시예 3과 동일한 방법으로 추가 결실시켜 재조합 미생물들을 제조하였다. 그리고, 해당 균주들에 알코올/알데히드 디하이드로게나제를 발현하는 유전자인 C. acetobutylicum ATCC 824의 adhE1 유전자를 도입하였다.
추가 유전자 결실을 위해서는 아래의 서열번호 19~36을 이용하였다. buk 유전자 결실을 위해서는 서열번호 19~24를 이용하였고, bukII 유전자 결실을 위해서는 서열번호 25~30을 이용하였고, ctfB 유전자 결실을 위해서는 서열번호 31~36을 각각 사용하였다.
서열번호 19: 5’-CTAGCCATGGATGTATAGATTACTAATAATC-3’
서열번호 20: 5’-CGGCCAACGCCTATTTCATTTGCAATAATTC-3’
서열번호 21: 5’-GCGAATGGCGCCAAGAAAAAGTATATTCCATG-3’
서열번호 22: 5’-ACGTCCCGGGCTTCTCCTCTTAAAACTCTAAG-3’
서열번호 23: 5’-ATTGCAAATGAAATAGCGCCATTCGCCATTCA-3’
서열번호 24: 5’-TATACTTTTTCTTGGGCGTTGGCCGATTCAT-3’
서열번호 25: 5’-CTAGCCATGGGGACTTTATTATGAAATTTAAAC-3’
서열번호 26: 5’-CGGCCAACGCCACTATATATGCTGACACTCC-3’
서열번호 27: 5’-GCGAATGGCGCTGGAATACCTGAACTTCCTAG -3’
서열번호 28: 5’-ACGTCCCGGGAACCCTTAAGGTTCCTTCTGC -3’
서열번호 29: 5’-GTCAGCATATATAGTGCGCCATTCGCCATTCA-3’
서열번호 30: 5’-AGTTCAGGTATTCCAGGCGTTGGCCGATTCAT-3’
서열번호 31: 5’-CTAGCCATGGTCCCTATATGGCAATGGCAGC-3’
서열번호 32: 5’-CGGCCAACGCTTAGGACTAGCGCCCATTCC-3’
서열번호 33: 5’-GCGAATGGCGGGAGGAGACTATACAACAGTAC-3’
서열번호 34: 5’-ACGTCCCGGGTTCTTTCTAAACAGCCATGGGTC-3’
서열번호 35: 5’-GGGCGCTAGTCCTAACGCCATTCGCCATTCA-3’
서열번호 36: 5’-TTGTATAGTCTCCTCCGCGTTGGCCGATTCAT-3’
C. acetobutylicum ATCC 824의 adhE1 유전자는 서열번호 37과 38 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. PCR 산물을 pIMP1exter 벡터의 ptb 유전자의 프로모터와 ctfB 전사종결자 사이에 클로닝하였다. PCR 산물과 pIMP1exter 벡터는 각각 SalI/EcoRI 제한효소로 절단한 후 접합하였다. pIMP1exter 벡터는 서열번호 39와 서열번호 40으로 ptb 프로모터를 증폭하여 pIMP1 (Nair and Papoutsakis, J. Bacteriol., 176:5843-5846, 1994) 플라스미드의 PstI과 SalI 제한효소 자리에 클로닝하였다. 터미네이터 서열은 서열번호 41과 서열번호 42를 이용하여 증폭하였으며, 앞서 ptb 프로모터가 클로닝 된 벡터에 EcoRI과 NdeI 제한효소 자리에 추가 클로닝 하여, pIMP1exter를 제조하였다. pTHL-Adh＊는 pTHL1-Cm 벡터에 서열번호 43과 서열번호 44를 이용하여 증폭한 단편과 서열번호 45와 서열번호 46으로 증폭한 단편을 overlap PCR로 연결한 후, PstI과 AvaI 제한효소자리에 클로닝하여 제작하였다. 변이 Adh*은 pTHL1-Cm 벡터에 서열번호 43과 서열번호 46으로 증폭한 adhE1 단편을 클로닝하고, NTG를 이용하여 돌연변이 유도하여 screening한 결과들로부터 인위적으로 재조합하여 만든 단백질이다. NTG를 이용한 변이 Adh screening에서 서열번호 51의 아미노산 서열의 450번째 아미노산에서 650번째 아미노산 중의 1개이상의 아미노산이 변환된 것들이 부탄올 생산성을 향상시켰다. 본 실시예에서 사용한 Adh＊는 이들 library에서 변화 빈도가 가장 높은 위치에 있는 것을 인위적으로 서열번호 43~46을 이용하여 재현한 것이다.
서열번호 37: 5’-ATAGTCGACATGAAAGTCACAACAGTAAAGG-3’
서열번호 38: 5’-CGCGAATTCTTAAGGTTGTTTTTTAAAACA-3’
서열번호 39: 5’-TATCTGCAGTGTGGATGGAGTTAA-3’
서열번호 40: 5’-ATTGTCGACTTTAATCCCTCCTTT-3’
서열번호 41: 5’-CGCGAATTCGGGCCCATATCCAATGAACTTAGACC-3’
서열번호 42: 5’-CACCATATGGCCTAGAGCTGAAGTTAT-3’
서열번호 43: 5’-AAAACTGCAGTTTATGAAAGTCACAACAGTAAAGG-3’
서열번호 44: 5’-TAAATTATAGGGGTCACTACCAGTAACTATAAAGGCTC-3’
서열번호 45: 5’-GAGCCTTTATAGTTACTGGTAGTGACCCCTATAATTTA-3’
서열번호 46: 5’-CCCCCGGGGGGTTGAAATATGAAGGTTTAAGGTTG-3’
이로부터 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC 824 ΔeutD Δbuk ΔbukII (Clostridium acetobutylicum ATCC 824 ΔeutD Δbuk), 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC 824 ΔeutD Δbuk ΔctfB (Clostridium acetobutylicum ATCC 824 ΔeutD Δbuk ΔctfB), 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC 824 ΔeutD Δbuk Δbuk PptbAdh (Clostridium acetobutylicum ATCC 824 ΔeutD Δbuk PptbAdh), 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC 824 ΔeutD Δbuk ΔbukII PthlAdh* (Clostridium acetobutylicum ATCC 824 ΔeutD Δbuk PthlAdh*), 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC 824 ΔeutD Δbuk ΔctfB PthlAdh* (Clostridium acetobutylicum ATCC 824 ΔeutD Δbuk ΔbukII ΔctfB PthlAdh*)를 제조하였다.
참고로, 상기 pTHL1-Cm 벡터의 제조방법은 다음과 같다.
클로스트리듐 아세토부틸리쿰의 싸이올레이즈(thiolase) 프로모터와 라이보좀 결합 부위(ribosome binding site, RBS)를 포함하는 외래 단백질 발현용 셔틀 벡터를 다음과 같이 제작하였다. 싸이올레이즈는 세포 생장주기에 크게 영향받지 않고 계속적이고 안정적으로 유전자를 발현시킬 수 있는 것으로 알려져 있다(Tummala et al., Appl. Environ. Microbiol., 65:3793~3799, 1999). 따라서 본 실시예에서는 싸이올레이즈(NCBI GeneID:1119056) 상단에 위치한 프로모터를 클로닝하여 pIMP-H1del에 삽입하였다. pIMP-H1del은 2개의 HindIII 제한효소 자리를 가지는 pIMP1으로부터 3408번째 염기서열에 존재하는 HindIII site 1개를 제거하고 743번째 염기열에 존재하는 제한효소 자리만 남겨둔 pIMP1을 주형으로 하는 셔틀 벡터이다. 서열번호 47과 서열번호 48의 프라이머, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(ATCC 824) 균주의 total DNA를 주형으로 PCR을 수행하여 싸이올레이즈 프로모터를 증폭하였다. 증폭된 싸이올레이즈 프로모터 단편들을 정제 및 회수 한 후, HindIII와 PstI 제한효소로 처리한 후, 동일 효소로 처리된 pIMP-H1del 셔틀 벡터와 접합(ligation)함으로써 pTHL1 벡터 제작을 완성하였다.
서열번호 47: 5’-GGCCCCAAGCTTAGAATGAAGTTTCTTATGCACAAG-3’
서열번호 48: 5’-AAACTGCAGTCTAACTAACCTCCTAAATTTTGATAC-3’
또한, 서열번호 49와 서열번호 50의 프라이머, pSOS95-Cm을 주형으로 PCR을 수행하여 클로람페니콜 저항성 유전자를 증폭하고, 증폭된 클로람페니콜 저항성 유전자 단편들을 정제 및 회수 한 후, HindIII 제한효소로 처리하고, 동일 효소로 처리된 pTHL1 셔틀 벡터와 접합(ligation)함으로써 pTHL1-Cm 벡터 제작을 완성하였다. pSOS95-Cm은 pSOS95 (Nair and Papoutsakis, J. Bacteriol., 176:5843-5846, 1994)에 ATCC 824균주의 thioloase promoter를 cloning하고, 그 down-stream에 chloramphenicol/thiamphenicol 내성 유전자를 cloning함으로써 제작 가능하다.
서열번호 49: 5’-CCAAGCTTCGACTTTTTAACAAAATATATTG-3’
서열번호 50: 5’-CCAAGCTTGACATTAAAAAAATAAGAGTTACC-3’
실시예 5: 재조합 균주를 이용한 알코올 생산
CGM 배지(표 1) 10㎖을 함유한 30㎖ 시험관을 멸균 후, 질소가스를 채우고 혐기 챔버에서 실온까지 식힌 후, 실시예 3에서 제조된 재조합 미생물(Clostridium acetobutylicum ATCC 824 ΔeutD을 접종하여 37℃에서 흡광도(600 nm)가 1.0이 될 때까지 혐기조건에서 전배양을 수행하였다.
표 1
Figure PCTKR2010006511-appb-T000001
CGM 배지를 200 ㎖을 함유한 500 ㎖ 플라스크를 멸균 후 동일한 처리를 한 후, 상기 전배양액 8 ㎖을 접종하여, 흡광도(600nm)가 1.0이 될 때까지 37℃, 혐기조건에서 2차 전배양하였다. 그 후 CGM 배지 2.0 L를 함유한 5.0 L 발효기(LiFlus GX, Biotron Inc., Kyunggi-Do, Korea)를 멸균 후 80℃ 이상에서부터 질소를 0.5 vvm으로 10시간 공급하면서 37℃로 온도를 낮춘 후 상기 2차 전배양액 200 ㎖을 접종하여, 37℃, 200 rpm에서 60시간 배양하였다. pH는 5 N NaOH의 automatic feeding에 의해 5.0으로 유지되었고, 배양 중에는 질소를 0.2 vvm (air volume/working volume/minute)으로 공급하였다.
상기 배지중의 glucose를 glucose analyzer(model2700 STAT, Yellow Springs Instrument, Yellow Springs, Ohio, USA)로 측정하였고, 시간별로 상기 배지를 채취하고, 이로부터 생성되는 아세톤 및 에탄올과 부탄올 농도를 packed column (Supelco CarbopackTM BAW/6.6%PEG20M, 2m × 2 mm ID, Bellefonte, PA, USA)이 장착된 gas chromatography(Agillent 6890N GC System, Agilent Technologies)로 유기용제 생산수율을 측정하여 표 2 및 표 3에 나타내었다.
표 2
Figure PCTKR2010006511-appb-T000002
표 3
Figure PCTKR2010006511-appb-T000003
표 2 및 표 3에 나타난 바와 같이, 대조군 야생형 Clostridium acetobutylicum ATCC 824에서는 부탄올이 10 g/L 이하 생성되는 것과 비교하여, 실시예 3에서 제조된 재조합 미생물 Clostridium acetobutylicum ATCC824 ΔeutD는 부탄올 농도와 부탄올 수율측면에서 생산능이 향상되었음을 확인할 수 있었다. 아울러 에탄올과 부탄올의 최종 생산농도 뿐만 아니라 생산수율도 향상되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 재조합 균주의 부탄올 생성능 비교
실시예 5와 동일한 조건에서 표 4의 C. actobutylicum ATCC 824 및 재조합 균주의 발효를 진행하였다.
표 4
Figure PCTKR2010006511-appb-T000004
그 결과, 표 4에 나타낸 바와 같이 재조합균주 Clostridium acetobutylicum ATCC 824 ΔeutD Δbuk PptbAdh, Clostridium acetobutylicum ATCC 824 ΔeutD Δbuk PthlAdh*, C. actobutylicum ATCC 824 ΔeutD Δbuk ΔbukII PthlAdh*, C. actobutylicum ATCC 824 ΔeutD Δbuk ΔbukII ΔctfB PthlAdh* 들에서 부탄올 농도뿐만 아니라 부탄올 수율 및 부탄올 선택도가 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이들 균주는 공통적으로 약 18 g/L 이상의 높은 부탄올 농도와 동시에 높은 수율(0.28 g/g 포도당 이상)과 높은 부탄올 선택도(0.80 g/g 전체유기용제 이상)를 나타내었다.
한편, 재조합균주 C. actobutylicum ATCC 824 ΔeutDΔbuk 균주는 수율(yield)측면에서, eutD 결실 변이주인 C. actobutylicum ATCC 824 ΔeutD와 유사한 것을 알 수 있다. 이는 부티레이트 생산경로에 있는 유전자와 아세트산 경로에 있는 유전자를 동시에 결실시켜도 아세트산과 부티레이트이 여전히 생성되기 때문이다. 본 발명에서는 이와 같은 내용을 새롭게 밝혀 앞서 보여준 우수한 부탄올 생산 균주를 개발할 수 있었다. 또한, 아세트산 생산은 코에이트랜스퍼라제의 역할에 의해서도 생산 가능함을 본 발명의 eutD, buk (or/and bukII), ctfB 결실 균주를 이용하여 새로운 사실을 밝힘으로써 본 발명을 완성할 수 있었다. 앞서 보여준 균주들은 대부분 발효종료 시점에 부티레이트과 아세트산이 거의 없는 것이 특징이라 할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명은 특정 유전자의 결실 또는 비활성화을 통하여 선택적으로 부탄올의 고생산 능력을 가지는 재조합 미생물을 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 재조합 미생물은 대사흐름 조작에 의해 아세테이트, 부티레이트 등의 유기산과 아세톤 등의 부산물의 생산이 거의 없을 뿐 아니라, 부탄올의 시간당 생산성을 향상시킬 수 있어 부탄올의 산업적 생산에 유용하다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (28)

  1. 아세틸코에이(acetyl CoA) 및 부티릴코에이(butyryl CoA) 생합성 경로를 가지고 있는 숙주 미생물에서, 아세틸코에이(acetyl CoA)를 아세테이트로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자를 결실시키는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, (a) 아세테이트 및 부티레이트를 각각 아세틸코에이(acetyl CoA) 및 부티릴코에이(butyryl CoA)로 전환하고, 아세토아세틸코에이(acetoacetylCoA)를 아세토아세테이트로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자; 및 (b) 부티릴코에이(butyryl-CoA)를 부티레이트로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택되는 유전자를 추가로 결실시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 1) 알콜올 디하이드로게나제; 2) 알데히드 디하이드로게나제; 및 3) 알코올/알데히드 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택되는 유전자를 1개 이상 추가로 증폭시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 알콜올 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자는 adh이고, 상기 알데히드 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자는 ald이며, 상기 알코올/알데히드 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자는 adhE1인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 3항에 있어서, 상기 알코올/알데히드 디하이드로게나제 (alcohol/aldehyd dehydrogeanse)는 서열번호 51의 아미노산 서열 또는 상기 서열중 450번째부터 650번째 아미노산 사이에 1개 이상의 변이가 있는 것임을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 숙주 미생물은 클로스트리듐(Clostridium) 속 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 아세틸코에이(acetyl CoA)를 아세테이트로 전환하는 효소는 포스포트랜스-아세틸라제(phosphotrans-acetylase) 또는 아세테이트 키나제(acetate kinase)인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 포스포트랜스-아세틸라제(phosphotrans-acetylase)를 코딩하는 유전자는 eutD 또는 pta이고, 상기 아세테이트 키나제(acetate kinase)를 코딩하는 유전자는 askA 또는 ackA인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제2항에 있어서, 상기 아세테이트 및 부티레이트를 각각 아세틸코에이(acetyl CoA) 및 부티릴코에이(butyryl CoA)로 전환하고, 아세토아세틸코에이(acetoacetylCoA)를 아세토아세테이트로 전환하는 효소는 코에이트랜스퍼라제(CoA transferase)이고, 부티릴코에이(butyryl-CoA)를 부티레이트로 전환하는 효소는 포스포트랜스-부티릴라제(phosphotrans-butyrylase) 또는 부티레이트 키나제(butyrate kinase)인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 코에이트랜스퍼라제(CoA transferase)를 코딩하는 유전자는 ctfAB 또는 atoDA인 것을 특징으로 하고, 상기 포스포트랜스-부티릴라제(phosphotrans-butyrylase)를 코딩하는 유전자는 ptb이고, 상기 부티레이트 키나제(butyrate kinase)를 코딩하는 유전자는 buk 및 bukII로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 아세틸코에이(acetyl CoA) 및 부티릴코에이(butyryl CoA)로의 생합성 경로를 가지는 숙주 미생물에서, 아세틸코에이(acetyl CoA)를 아세테이트로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자가 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물.
  12. 제11항에 있어서, (a) 아세테이트 및 부티레이트를 각각 아세틸코에이(acetyl CoA) 및 부티릴코에이(butyryl CoA)로 전환하고, 아세토아세틸코에이(acetoacetylCoA)를 아세토아세테이트로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자; 및 (b) 부티릴코에이(butyryl-CoA)를 부티레이트로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택되는 유전자가 추가로 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 1) 알콜올 디하이드로게나제; 2) 알데히드 디하이드로게나제; 및 3) 알코올/알데히드 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택되는 유전자가 1개 이상 추가로 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 알콜올 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자는 adh이고, 상기 알데히드 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자는 ald이며, 상기 알코올/알데히드 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자는 adhE1인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  15. 제13항 또는 14항에 있어서, 상기 알코올/알데히드 디하이드로게나제 (alcohol/aldehyd dehydrogeanse)는 서열번호 51의 아미노산 서열 또는 상기 서열중 450번째부터 650번째 아미노산 사이에 1개 이상의 변이가 있는 것임을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  16. 제11항에 있어서, 상기 숙주 미생물은 클로스트리듐(Clostridium) 속 유래인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  17. 제11항에 있어서, 상기 아세틸코에이(acetyl CoA)를 아세테이트로 전환하는 효소는 포스포트랜스-아세틸라제(phosphotrans-acetylase) 또는 아세테이트 키나제(acetate kinase)인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 포스포트랜스-아세틸라제(phosphotrans-acetylase)를 코딩하는 유전자는 eutD 또는 pta이고, 상기 아세테이트 키나제(acetate kinase)를 코딩하는 유전자는 askA 또는 ackA인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  19. 제12항에 있어서, 상기 아세테이트 및 부티레이트를 각각 아세틸코에이(acetyl CoA) 및 부티릴코에이(butyryl CoA)로 전환하고, 아세토아세틸코에이(acetoacetylCoA)를 아세토아세테이트로 전환하는 효소는 코에이트랜스퍼라제(CoA transferase)이고, 부티릴코에이(butyryl-CoA)를 부티레이트로 전환하는 효소는 포스포트랜스-부티릴라제(phosphotrans-butyrylase) 또는 부티레이트 키나제(butyrate kinase)인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 코에이트랜스퍼라제(CoA transferase)를 코딩하는 유전자는 ctfAB 또는 atoDA인 것을 특징으로 하고, 상기 포스포트랜스-부티릴라제(phosphotrans-butyrylase)를 코딩하는 유전자는 ptb이고, 상기 부티레이트 키나제(butyrate kinase)를 코딩하는 유전자는 buk 및 bukII로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  21. 클로스트리듐(Clostridium) 속 미생물에서, 포스포트랜스-아세틸라제(phosphotrans-acetylase)를 코딩하는 유전자(eutD 또는 pta) 또는 아세테이트 키나제(acetate kinase)를 코딩하는 유전자(askA 또는 ackA)가 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물은 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC 824 ΔeutD (Clostridium acetobutylicum ΔeutD)인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  23. 부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물 Clostridium acetobutylicum ATCC 824 ΔeutD Δbuk PptbAdh.
  24. 부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물 Clostridium acetobutylicum ATCC 824 ΔeutD Δbuk PthlAdh*.
  25. 부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물 C. actobutylicum ATCC 824 ΔeutD Δbuk ΔbukII PthlAdh*.
  26. 부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물 C. actobutylicum ATCC 824 ΔeutD Δbuk ΔbukII ΔctfB PthlAdh*.
  27. 제11항, 제 12항 및 제16항∼제26항중 어느 한 항의 재조합 미생물을 배양하여 부탄올을 생성하는 단계; 및 상기 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 단계를 포함하는 부탄올의 제조방법.
  28. 제 13항의 재조합 미생물을 배양하여 부탄올을 생성하는 단계; 및 상기 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 단계를 포함하는 부탄올의 제조방법.
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