KR101444968B1 - 높은 수율로 ｎ-부탄올을 생물학적으로 생산하는 방법 - Google Patents
높은 수율로 ｎ-부탄올을 생물학적으로 생산하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 발효가능한 탄소 공급원으로부터 높은 수율로 n-부탄올을 생물학적으로 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명의 한 측면에서, 글루코스에서 n-부탄올로의 전환은 i) 부티레이트 경로를 제거하도록, ii) 아세톤 경로를 제거하도록, iii) 락테이트 경로를 제거하도록, iv) 아세테이트 경로를 제거하도록 형질전환된 씨. 아세토부틸리쿰 숙주를 포함하는 재조합 유기체에 의해 달성된다. 본 발명의 또다른 측면에서, 히드로게나제 유전자의 발현을 감쇠시킴으로써, 수소 흐름이 감소되어 환원력이 n-부탄올 생산쪽으로 다시 지정된다. 임의로, 생산된 n-부탄올은 발효 동안 가스 스트립핑에 의해 회수되고, 추가로 증류에 의해 정제될 수 있다.
발효가능한 탄소 공급원, n-부탄올, 클로스트리디움 균주, 용매 생성
Description
본 발명은 대사적으로 유전자 조작된 미생물에 의해 높은 수율로 발효가능한 탄소 공급원으로부터 n-부탄올로 생물학적 전환시키는 방법에 관한 것이다.
n-부탄올은 중간 정도의 휘발성을 갖는 무색의 천연 액체로서, 물에 대해서는 제한된 혼화성 (약 7 내지 8％)을 갖지만, 글리콜, 케톤, 알코올, 알데히드, 에테르, 및 방향족 및 지환족 탄화수소와 같은 모든 일반적인 용매에 대해서는 자유롭게 혼화성이다. n-부탄올은 i) 다른 화학물질의 제조를 위해, ii) 용매로서, 그리고 iii) 화장품과 같이 제형화된 제품 중의 성분으로서 사용된다. 공급 원료로서 n-부탄올의 주요 용도는 아크릴레이트/메타크릴레이트 에스테르, 글리콜 에테르, n-부틸 아세테이트, 아미노 수지 및 n-부틸아민의 합성이다. 현재 전세계적으로 매년 9백만톤이 넘는 n-부탄올이 소비되고 있다.
보다 최근에는, n-부탄올이 에탄올에 비해 증기압이 낮고, 에너지 함량이 높으며 (가솔린의 에너지 함량에 가까움), 물 존재시 분리에 대한 민감성이 적기 때문에 에탄올보다 더 양호한 바이오연료인 것으로 밝혀졌다. 또한, n-부탄올은 표준 자동차 엔진에 사용시에 에탄올보다 더 높은 농도로 배합될 수 있고, 자동차 제 조사들이 환경적인 규제를 충족시키기 위해 성능을 절충시킬 필요가 없으며, 도관을 이용한 수송에도 적합하여, 가솔린에 신속히 주입되어 추가의 대규모 공급 기간 시설이 필요없게 되는 잠재성을 갖는다.
n-부탄올은 용매 생성 클로스트리디아(Clostridia)에 의한 탄수화물 발효에 의해 아세톤/n-부탄올/에탄올 (ABE) 혼합물로서 제조될 수 있다. ABE 발효는 2-상성이다. 제1 산 생성 상에서는, 아세트산 및 부티르산이 빠른 성장 속도로 생성된다. 제2 용매 생성 상에서는, 성장 속도가 저하되고, 제1 상에서 생성된 유기산의 소모와 동시에 용매 (ABE)가 생성된다. 상기 발효에 의해 이산화탄소 및 수소가 생성된다.
도 1에 제시된 n-부탄올의 생물학적 생산은 중간체로서 부티릴-CoA의 형성을 요하며, 이는 생리학적 조건에 따라 adhE1 및 adhE2에 의해 코딩되는 두개의 상이한 2-기능성 알데히드-알코올 데히드로게나제에 의해 환원될 수 있다. 부티릴-CoA는 또한 각각 ptb 및 buk 유전자에 의해 코딩되는 포스포-트랜스부티릴라제 및 부티레이트 키나제에 의해 부티르산으로 전환될 수 있다. 각각 ctfAB 및 adc 유전자에 의해 코딩되는 CoA-트랜스퍼라제 및 아세토아세테이트 데카르복실라제에 의해 아세토-아세틸-CoA (부티릴-CoA 생산에 있어서의 중간체)로부터 아세톤이 생성될 수 있다. hydA 유전자에 의해 코딩되는 철-단독 히드로게나제에 의해 수소가 생성된다. 히드로게나제 억제제인 일산화탄소의 존재하에 배양하는 경우에는, n-부탄올, 에탄올 및 락테이트가 주요 발효 생성물이다. ldh 유전자에 의해 코딩되는 락테이트 데히드로게나제에 의해 피루베이트로부터 락테이트가 생성된다.
불활성화된 buk 유전자를 가진 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum) 균주 (비-복제성 플라스미드를 이용한 단일 교차에 의해 수득됨)는 이미 그린(Green) 등의 1996년도 문헌에 기재되어 있다. 0.8 kb의 내부 buk 단편을 가진 비-복제성 벡터 pJC4BK를 염색체의 buk 유전자에 일체화시키고, 내인성 유전자의 불활성화를 유도하였다. 수득된 균주는 플라스미드의 명칭을 따서 "돌연변이체 PJC4BK"로 명명하였다. 상기 문헌으로부터 확실한 바와 같이, 이러한 유형의 유전자 불활성화는 불안정하여 플라스미드 절제에 의해 야생형으로 복귀할 수 있기 때문에, 상기 유전자 일체화에 의해서는 효소 활성도 부티레이트 형성도 완전히 제거되지 않았다. 이 돌연변이체 균주는 여러 연구에 이용되었다 (그린(Green) 및 베네트(Bennett)의 1998년도 문헌; 데사이(Desai) 및 해리스(Harris)의 1999년도 문헌; 해리스(Harris) 등의 2000년도 문헌).
전통적으로, 상업적인 ABE 발효는 생산 클로스트리디아의 연속식 배양 불안정성으로 인해 회분식으로만 수행되었다. 여러 용매를 생성하는 발효 공정이 기재되었다. 이러한 공정에 의해 n-부탄올, 아세톤 및 에탄올이 6:3:1의 비율로 수득되었다. 발효가능한 탄소 공급원으로부터 29 내지 34％ (n-부탄올 단독의 경우 18 내지 25％)의 용매 수율이 문헌에서 보고되었다. 일반적으로, 생성된 n-부탄올의 독성으로 인해 16 내지 24 g/ℓ의 전체 용매 농도 및 10 내지 14 g/ℓ의 n-부탄올 농도가 한계치이다. 그러나, 최근 "저비용" 가스 스트립핑 기술의 이용에 의해 발효 동안 용매를 회수할 수 있음이 입증되었기 때문에, 이러한 낮은 적가의 용매는 더이상 경제적인 한계치가 아닌 것으로 여겨진다.
본 발명에서 해결하고자 하는 문제점은, 야생형 유전자로의 복귀 가능성 없이 여러 세대에 대해 배양될 수 있는, 부티레이트 키나제 활성이 없는 안정한 돌연변이체 균주를 수득하는 것이다. 이 균주는 클로스트리디아의 유전적으로 안정한 배양에 의해 글루코스 또는 다른 당류와 같은 저렴한 탄소 기질로부터 높은 수율로 n-부탄올을 생물학적으로 생산하는데 유용할 것이다. 불활성화를 위한 생화학적 단계의 수 및 대사 조절의 복잡성 때문에, 산업적으로 가능한 n-부탄올의 생산 공정을 위해서는 대사적으로 유전자 조작된 전세포 촉매의 사용이 요구된다.
<발명의 개요>
본 출원인은 상기 언급한 문제점을 해결하였으며, 본 발명은 클로스트리디아의 유전적으로 안정한 배양에 의해 발효가능한 탄소 공급원을 주 생성물로서 n-부탄올로 생물학적 전환시키는 방법을 제공한다. 모델 기질로서 글루코스가 사용되고, 모델 숙주로서 재조합 클로스트리디움 아세토부틸리쿰이 사용된다. 본 발명의 한 측면에서, 부티릴-CoA를 부티레이트로 대사시킬 수 없는 안정한 재조합 씨. 아세토부틸리쿰은 부티레이트 키나제를 코딩하는 유전자 (buk)를 결실시킴으로써 제조한다. 본 발명의 또다른 측면에서, 아세톤을 생산하지 못하는 재조합 씨. 아세토부틸리쿰은 CoA-트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자 (ctfAB)를 결실시킴으로써 제조한다. 본 발명의 추가의 측면에서, 락테이트를 생산하지 못하는 재조합 균주는 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자 (ldh)를 결실시킴으로써 제조한다. 또한, 아세테이트를 생산하지 못하는 재조합 씨. 아세토부틸리쿰은 포스포트랜스아세틸라제 및/또는 아세테이트 키나제를 코딩하는 유전자 (pta 및 ack)를 결실시킴으 로써 제조한다. 본 발명의 마지막 측면으로, 히드로게나제를 코딩하는 유전자 (hydA)를 감쇠시킴으로써, 수소 생산의 흐름이 감소되어, 환원 당량의 흐름이 n-부탄올 생산쪽으로 다시 지정된다.
본 발명은 일반적으로 아세틸-coA로 용이하게 전환되는 임의의 탄소 기질을 포함하도록 적용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 (a) 부티릴-CoA에서 부티레이트로의 전환과 연관된 2개의 유전자 중 적어도 하나의 결실, 및 (b) CoA-트랜스퍼라제 활성을 코딩하는 2개의 유전자 중 적어도 하나의 결실을 포함하는, n-부탄올의 생산에 유용한 재조합 유기체를 제공하는 것이다. 임의로, 재조합 유기체는 i) (a) 락테이트 데히드로게나제 활성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 및 (b) 포스포-트랜스아세틸라제 또는 아세테이트 키나제 활성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 내인성 유전자에서 불활성화 돌연변이, 및 ii) 히드로게나제 활성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 감쇠를 포함할 수 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 본 발명의 재조합 유기체를 단당류, 올리고당류, 다당류, 및 단일 탄소 기질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 탄소 공급원과 접촉시켜 n-부탄올을 생산하고, 임의로 (b) 상기 생산 동안 가스 스트립핑 단계를 통해 n-부탄올을 회수하고, (c) 증류에 의해 응축물로부터 n-부탄올을 정제하는 것을 포함하는, 재조합 유기체로부터 n-부탄올을 높은 수율로 생산하는 안정한 방법을 제공한다.
본 명세서의 일부를 구성하는 첨부 도면은 본 발명을 예시하며, 발명의 상세한 설명과 함께 본 발명의 원리를 설명하는 역할을 한다.
도 1은 탄수화물로부터 부탄올 생산의 단계에 있어서 주요 대사의 유전자 조작을 도시한다.
1 : 피루베이트-페러독신 옥시도리덕타제; 2 : 티올라제; 3 : β-히드록시부티릴-CoA 데히드로게나제; 4 : 크로토나제; 5 : 부티릴-CoA 데히드로게나제; 6 : 락테이트 데히드로게나제; 7 : 포스포-트랜스아세틸라제; 8 : 아세테이트 키나제; 9 : 아세트알데히드 데스히드로게나제; 10 : 에탄올 데히드로게나제; 11 : CoA 트랜스퍼라제 (아세토아세틸-CoA : 아세테이트/부티레이트 : CoA 트랜스퍼라제); 12 : 아세토아세테이트 데카르복실라제; 13 : 포스포-트랜스부티릴라제; 14 : 부티레이트 키나제; 15 : 부티르알데히드-부탄올 데히드로게나제; 16 : 히드로게나제.
본원에 사용된 하기 용어들은 청구항 및 명세서의 설명을 위해 이용될 수 있다.
용어 "미생물"은 모든 종류의 단세포 유기체, 예컨대 박테리아와 같은 원핵세포 유기체 및 효모와 같은 진핵세포 유기체를 나타낸다.
용어 "적절한 배양 배지"는 당업자에게 널리 공지된 바와 같이 사용된 미생물에 대해 적합화된 배양 배지를 나타낸다.
용어 "탄소 기질" 또는 "탄소 공급원"은 미생물에 의해 대사될 수 있는 임의의 탄소 공급원을 의미하며, 상기 기질은 하나 이상의 탄소 원자를 함유한다. 본 발명자는 특히 재생가능하고 저렴하며 발효가능한 탄소 공급원, 예컨대 단당류, 올리고당류, 다당류, 단일 탄소 기질, 및 폴리올, 예컨대 글리세롤을 지칭한다. 단일 탄소 기질은 메탄올과 같이 하나의 탄소 원자만을 함유하는 탄소 분자로서 정의된다.
화학식 (CH2O)n의 단당류는 또한 오즈(ose) 또는 "단순 당류"로 불리며, 단당류로는 사카로즈, 프럭토즈, 글루코스, 갈락토즈 및 만노즈가 있다.
1개가 넘는 단당류를 포함하는 다른 탄소 공급원은 이당류, 삼당류, 올리고당류 및 다당류로 불린다. 이당류로는 사카로즈 (슈크로즈), 락토즈 및 말토즈가 있다. 전분 및 헤미셀룰로즈는 다당류이며, "복합 당류"로도 공지되어 있다.
따라서, 용어 "탄소 공급원"은 상기 언급한 임의의 물질 및 이들의 혼합물을 의미한다.
용어 "감쇠"는 유전자 발현의 감소, 또는 상기 유전자의 생성물인 단백질 활성의 감소를 나타낸다. 당업자는 이러한 결과를 얻는 수많은 수단을 알고 있으며, 예를 들어 다음과 같다:
- 유전자에 돌연변이를 도입하여, 이 유전자의 발현 수준, 또는 코딩된 단백질의 활성 수준을 감소시킨다.
- 유전자의 천연 프로모터를 덜 강력한 프로모터로 교체하여, 발현을 저하시킨다.
- 상응하는 메신저 RNA 또는 단백질을 불안정화시키는 요소를 사용한다.
- 발현시킬 필요가 없는 경우 유전자를 결실시킨다.
용어 "결실된 유전자"는 상기 유전자의 코딩 서열의 실질적인 부분이 제거된 것을 의미한다. 바람직하게는, 코딩 서열의 50％ 이상, 더욱 바람직하게는 80％ 이상이 제거된다.
본 발명의 설명에서, 효소는 그의 특이적인 활성에 의해 확인된다. 따라서, 이 정의에는 다른 유기체, 보다 특별하게는 다른 미생물에도 존재하는 정의된 특이적 활성을 갖는 모든 폴리펩티드가 포함된다. 종종, 유사한 활성을 갖는 효소들은 PFAM 또는 COG로 정의되는 특정 부류로 분류함으로써 확인될 수 있다.
PFAM (정렬 및 은닉 마코프(Markov) 모델을 이용한 단백질 부류 데이타베이스; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)은 단백질 서열 정렬을 다량 모아 놓은 것이다. 각 PFAM은 다중 정렬의 가시화, 단백질 도메인의 도시, 유기체 중에서 분포의 평가, 다른 데이타베이스로의 접근, 및 공지된 단백질 구조의 가시화를 가능하게 한다.
COG (단백질의 오솔로그(orthologous) 그룹의 클러스터; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)는 30종의 주요 계통발생주를 대표하는 43가지 전체 서열 게놈으로부터의 단백질 서열을 비교함으로써 얻어진다. 각 COG는 3종 이상의 계통으로부터 정의되며, 이는 이전의 보존된 도메인의 확인을 가능하게 한다.
상동성 서열 및 그들의 상동성％를 확인하는 수단은 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 특히 BLAST 프로그램이 있는데, 이는 디폴트 변수들이 지정되어 있는 웹사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/로부터 이용할 수 있다. 그 후, 수득한 서열을 예를 들어 CLUSTALW 프로그램 (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) 또는 MULTALIN (http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl) (디폴트 변수들이 이들 사이트에 지정되어 있음)을 이용하여 추적 (예를 들어 정렬)할 수 있다.
당업자라면 공지된 유전자에 대해 젠뱅크(GenBank)에 제공된 참고자료들을 이용하여 다른 유기체, 박테리아 균주, 효모, 진균, 포유동물, 식물 등에서 대등한 유전자를 결정할 수 있다. 이러한 일반적인 작업은, 다른 미생물로부터 유래된 유전자를 이용하여 서열 정렬을 수행하고, 축퇴 프로브를 고안하여 또다른 유기체에서 상응하는 유전자를 클로닝함으로써 결정될 수 있는 콘센서스 서열을 이용하여 유리하게 수행한다. 이러한 일반적인 분자 생물학적 작업은 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York, 1989]에 기재되어 있다.
본 발명은 탄소 공급원을 포함하는 적절한 배양 배지에서 부티레이트 형성과 연관된 하나 이상의 유전자가 결실되어 있는 미생물을 배양시키고, 동시에 상기 배양 배지로부터 n-부탄올을 회수함으로써, 회분식 또는 연속식 발효에 의해 n-부탄올을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시양태는, 상기 미생물이 포스포-트랜스부티릴라제 또는 부티레이트 키나제를 코딩하는 하나 이상의 유전자 (ptb 또는 buk)가 결실되어 부티릴-CoA를 부티레이트로 전환시키지 못하도록 변형된 것인 방법을 제공한다. 클로스트리디아에서 유전자의 결실은 특허 출원 PCT/EP2006/066997에 최근 기재된 방법을 이용하여 수행할 수 있으며, 상기 출원에서는 i) 결실시키고자 하는 유전자를 에리트로마이신 내성 유전자로 교체하고, ii) 재조합효소를 이용하여 에리트로마이신 내성 유전자를 제거한다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 상기 미생물은 CoA-트랜스퍼라제 또는 아세토아세테이트 데카르복실라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자 (ctfAB 또는 adc)가 감쇠 또는 결실되어 아세톤을 생산하지 못한다. 이들 유전자 중 하나의 결실은 특허 출원 PCT/EP2006/066997에 최근에 기재된 방법을 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 추가의 실시양태에서, 본 발명의 방법에 사용된 미생물은 락테이트를 생산하지 못한다. 특히, 이는 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자 ldh가 결실되었기 때문이다. ldh의 결실은 특허 출원 PCT/EP2006/066997에 최근에 기재된 방법을 이용하여 수행할 수 있다.
또다른 실시양태에서, 상기 미생물은 아세테이트를 생산하지 못하도록 변형된다. 이러한 결과는 포스포-트랜스아세틸라제 또는 아세테이트 키나제를 코딩하는 하나 이상의 유전자 (pta 또는 ack)를 결실시킴으로써 달성될 수 있다. 이들 유전자 중 하나의 결실은 특허 출원 PCT/EP2006/066997에 최근에 기재된 방법을 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 실시양태는 또한 수소 생산의 흐름이 감소되어, 환원 당량의 흐름이 n-부탄올 생산쪽을 다시 지정된 미생물을 제공하며, 이는 수소 생산 형태에서 환원 당량을 수용하는 효소인 히드로게나제를 코딩하는 유전자 (hydA)를 감쇠시킴으로써 수행될 수 있다. hydA의 감쇠는 천연 프로모터를 덜 강력한 프로모터로 교체하거나, 상응하는 메신저 RNA 또는 단백질을 불안정화시키는 요소를 사용함으로써 수행된다. 필요에 따라, 유전자의 완전한 감쇠는 또한 상응하는 DNA 서열을 결실시킴으로써 달성될 수 있다.
바람직하게는, 사용되는 미생물은 씨. 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum), 씨. 베이제린키이(C. beijerinckii), 씨. 사카로퍼부틸아세토니쿰(C. saccharoperbutylacetonicum) 또는 씨. 사카로부틸리쿰(C. saccharobutylicum)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 연속식으로 안정하게 배양한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은
a) 글루코스, 크실로즈, 아라비노즈, 슈크로즈, 단당류, 올리고당류, 다당류, 셀룰로즈, 크실란, 전분 또는 그의 유도체, 및 글리세롤로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 탄소 공급원과 미생물을 접촉시켜 n-부탄올을 생산하는 단계,
b) 발효하는 동안 가스 스트립핑에 의해 n-부탄올을 회수하는 단계, 및
c) 증류에 의해 응축물로부터 n-부탄올을 단리하는 단계를 포함한다.
당업자는 본 발명에 따른 미생물을 위한 배양 조건을 규정할 수 있다. 특히, 클로스트리디아는 20℃ 내지 55℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃, 더욱 구체적으로 씨. 아세토부틸리쿰의 경우에는 약 35℃에서 발효시킨다.
일반적으로, 발효는 하나 이상의 단순 탄소 공급원을 함유하며, 필요에 따라 대사산물의 생산에 필요한 공동-기질을 함유하는, 사용된 박테리아에 대해 적합화된 공지된 규정 조성물의 무기 배양 배지를 이용하여 발효기에서 수행한다.
본 발명은 또한 상기 기재된 미생물에 관한 것이다. 바람직하게는, 이 미생물은 씨. 아세토부틸리쿰, 씨. 베이제린키이, 씨. 사카로퍼부틸아세토니쿰 또는 씨. 사카로부틸리쿰으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시예 1
부티레이트를 생산하지 못하는 균주의 제조: 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 Δcac1515 Δupp Δbuk
buk 유전자를 결실시키기 위해, 크룩스(Croux) 및 수까이유(Soucaille)의 2006년도 특허 출원 PCT/EP2006/066997에 기재된 상동성 재조합 전략을 이용하였다. 이 전략은 에리트로마이신 내성 카세트의 삽입을 가능하게 하며, 대부분의 해당 유전자를 결실시킨다. pCons::upp에서 buk 결실 카세트는 다음과 같이 제조하였다.
씨. 아세토부틸리쿰의 전체 DNA를 주형으로 하고 2개의 특이적 올리고뉴클레오티드 쌍을 이용하며 Pwo 폴리머라제를 사용하여, buk 주변의 2개의 DNA 단편을 PCR에 의해 증폭시켰다. 프라이머 BUK 1-BUK 2 및 BUK 3-BUK 4 쌍을 이용하여, 2개의 DNA 단편을 각각 수득하였다. 프라이머 BUK 1 및 BUK 4 둘 다 BamHI 부위를 도입하며, 프라이머 BUK 2 및 BUK 3은 NruI 부위가 도입된 상보적인 영역을 갖는다. DNA 단편 BUK 1-BUK 2 및 BUK 3-BUK 4를 PCR 융합 실험에서 프라이머 BUK 1 및 BUK 4에 연결하고, 생성된 단편을 pCR4-TOPO-Blunt에 클로닝하여, pTOPO :buk를 수득하였다. pTOPO :buk의 유일한 StuI 부위에서, pUC18-FRT-MLS2의 StuI 단편으로부터 양측에 FRT 서열을 갖는 항생제 내성 MLS 유전자를 도입시켰다. 생성된 플라스미드의 BamHI 절단 이후 수득한 BUK 결실 카세트를 BamHI 부위에서 pCons::upp에 클로닝하여, pREPΔBUK::upp 플라스미드를 수득하였다.
씨. 아세토부틸리쿰 MGCΔcac15Δupp 균주에 전기충격을 가함으로써 pREPΔBUK::upp 플라스미드로 형질전환시켰다. 페트리 플레이트 상에서 에리트로마이신 (40 ㎍/ml)에 내성인 클론을 선별한 후, 한 콜로니를 에리트로마이신 40 ㎍/ml을 함유한 액체 합성 배지에서 24시간 동안 배양하고, 희석하지 않은 배양물 100 ㎕를 에리트로마이신 40 ㎍/ml 및 5-FU 400 μM을 함유한 RCA 상에 플레이팅하였다. 에리트로마이신 및 5-FU 둘 다에 내성인 콜로니를 에리트로마이신 40 ㎍/ml를 함유한 RCA 및 티암페니콜 50 ㎍/ml를 함유한 RCA 둘 다에 반복 플레이팅하여, 5-FU 내성이 티암페니콜 민감성과도 관련이 있는 클론을 선별하였다. 에리트로마이신에 내성이며 티암페니콜에 민감성인 클론의 유전자형은 PCR 분석에 의해 (buk 결실 카세트의 외부에 위치한 프라이머 BUK 0 및 BUK 5를 이용하여) 체크하였다. pREPΔbuk::upp가 제거된 Δcac15ΔuppΔbuk::mls R 균주를 단리하였다.
Δcac15ΔuppΔbuk::mls R 균주를 에스. 세레비지애(S. cerevisiae)로부터의 Flp 재조합효소를 코딩하는 Flp1 유전자를 발현하는 pCLF1.1 벡터를 이용하여 형질전환시켰다. 형질전환시키고, 페트리 플레이트 상에서 티암페니콜 (50 ㎍/ml)에 대해 내성인 것을 선별한 후, 한 콜로니를 티암페니콜 50 ㎍/ml를 함유한 합성 액체 배지에서 배양하고, 적절한 희석액을 티암페니콜 50 ㎍/ml를 함유한 RCA 상에 플레이팅하였다. 티암페니콜 내성 클론을 에리트로마이신 40 ㎍/ml를 함유한 RCA 및 티암페니콜 50 ㎍/ml를 함유한 RCA 둘 다에 반복 플레이팅하였다. 에리트로마이신에 민감성이고 티암페니콜에 내성인 클론의 유전자형은 PCR 분석에 의해 프라이머 BUK 0 및 BUK 5를 이용하여 체크하였다. 에리트로마이신에 민감성이고 티암페니콜에 내성인 Δcac15ΔuppΔbuk 균주를 연속 24시간 동안 2회 배양하여, pCLF1.1을 제거하였다. pCLF1.1이 제거된 Δcac15ΔuppΔbuk 균주를 에리트로마이신 및 티암페니콜 둘 다에 대한 민감성에 따라 단리하였다.
실시예 2
부티레이트 및 아세톤을 생산하지 못하는 균주의 제조: 씨. 아세토부틸리쿰 Δcac1515 Δupp Δbuk ΔctfAB
ctfAB 유전자를 결실시키기 위해, 크룩스 및 수까이유의 2006년도 특허 출원 PCT/EP2006/066997에 기재된 상동성 재조합 전략을 이용하였다. 이 전략은 에리트로마이신 내성 카세트의 삽입을 가능하게 하며, 대부분의 해당 유전자를 결실시킨다. pCons::upp에서 ctfAB 결실 카세트는 다음과 같이 제조하였다.
씨. 아세토부틸리쿰의 전체 DNA를 주형으로 하고 2개의 특이적 올리고뉴클레오티드 쌍을 이용하며 Pwo 폴리머라제를 사용하여, ctfAB 주변의 2개의 DNA 단편을 PCR에 의해 증폭시켰다. 프라이머 CTF 1-CTF 2 및 CTF 3-CTF 4 쌍을 이용하여, 2개의 DNA 단편을 각각 수득하였다. 프라이머 CTF 1 및 CTF 4 둘 다 BamHI 부위를 도입하며, 프라이머 CTF 2 및 CTF 3은 StuI 부위가 도입된 상보적인 영역을 갖는다. DNA 단편 CTF 1-CTF 2 및 CTF 3-CTF 4를 PCR 융합 실험에서 프라이머 CTF 1 및 CTF 4에 연결하고, 생성된 단편을 pCR4-TOPO-Blunt에 클로닝하여, pTOPO :CTF를 수득하였다. pTOPO :CTF의 유일한 StuI 부위에서, pUC18-FRT-MLS2의 StuI 단편으로부터 양측에 FRT 서열을 갖는 항생제 내성 MLS 유전자를 도입시켰다. 생성된 플라스미드의 BamHI 절단 이후 수득한 UPP 결실 카세트를 BamHI 부위에서 pCons::upp에 클로닝하여, pREPΔCTF::upp 플라스미드를 수득하였다.
씨. 아세토부틸리쿰 MGCΔcac15ΔuppΔbuk 균주에 전기충격을 가함으로써 pREPΔCTF::upp 플라스미드로 형질전환시켰다. 페트리 플레이트 상에서 에리트로마이신 (40 ㎍/ml)에 내성인 클론을 선별한 후, 한 콜로니를 에리트로마이신 40 ㎍/ml을 함유한 액체 합성 배지에서 24시간 동안 배양하고, 희석하지 않은 배양물 100 ㎕를 에리트로마이신 40 ㎍/ml 및 5-FU 400 μM을 함유한 RCA 상에 플레이팅하였다. 에리트로마이신 및 5-FU 둘 다에 내성인 콜로니를 에리트로마이신 40 ㎍/ml를 함유한 RCA 및 티암페니콜 50 ㎍/ml를 함유한 RCA 둘 다에 반복 플레이팅하여, 5-FU 내성이 티암페니콜 민감성과도 관련이 있는 클론을 선별하였다. 에리트로마이신에 내성이며 티암페니콜에 민감성인 클론의 유전자형은 PCR 분석에 의해 (ctfAB 결실 카세트의 외부에 위치한 프라이머 CTF 0 및 CTF 5를 이용하여) 체크하였다. pREPΔCTF::upp가 제거된 Δcac15ΔuppΔbukΔctfAB::mls R 균주를 단리하였다.
Δcac15ΔuppΔbukΔctfAB::mls R 균주를 에스. 세레비지애로부터의 Flp 재조합효소를 코딩하는 Flp1 유전자를 발현하는 pCLF1.1 벡터를 이용하여 형질전환시켰다. 형질전환시키고, 페트리 플레이트 상에서 티암페니콜 (50 ㎍/ml)에 대해 내성인 것을 선별한 후, 한 콜로니를 티암페니콜 50 ㎍/ml를 함유한 합성 액체 배지에서 배양하고, 적절한 희석액을 티암페니콜 50 ㎍/ml를 함유한 RCA 상에 플레이팅하였다. 티암페니콜 내성 클론을 에리트로마이신 40 ㎍/ml를 함유한 RCA 및 티암페니콜 50 ㎍/ml를 함유한 RCA 둘 다에 반복 플레이팅하였다. 에리트로마이신에 민감성이고 티암페니콜에 내성인 클론의 유전자형은 PCR 분석에 의해 프라이머 CTF 0 및 CTF 5를 이용하여 체크하였다. 에리트로마이신에 민감성이고 티암페니콜에 내성인 Δcac15ΔuppΔbukΔctfAB 균주를 연속 24시간 동안 2회 배양하여, pCLF1.1을 제거하였다. pCLF1.1이 제거된 Δcac15ΔuppΔbukΔctfAB 균주를 에리트로마이신 및 티암페니콜 둘 다에 대한 민감성에 따라 단리하였다.
실시예 3
부티레이트, 아세톤 및 락테이트를 생산하지 못하는 균주의 제조: 씨. 아세토부틸리쿰 Δcac1515 Δupp Δbuk ΔctfAB Δldh
ldh 유전자를 결실시키기 위해, 크룩스 및 수까이유의 2006년도 특허 출원 PCT/EP2006/066997에 기재된 상동성 재조합 전략을 이용하였다. 이 전략은 에리트로마이신 내성 카세트의 삽입을 가능하게 하며, 대부분의 해당 유전자를 결실시킨다. pCons::upp에서 ldh 결실 카세트는 다음과 같이 제조하였다.
씨. 아세토부틸리쿰의 전체 DNA를 주형으로 하고 2개의 특이적 올리고뉴클레오티드 쌍을 이용하며 Pwo 폴리머라제를 사용하여, ldh (CAC267) 주변의 2개의 DNA 단편을 PCR에 의해 증폭시켰다. 프라이머 LDH 1-LDH 2 및 LDH 3-LDH 4 쌍을 이용하여, 1135 bp 및 1177 bp DNA 단편을 각각 수득하였다. 프라이머 LDH 1 및 LDH 4 둘 다 BamHI 부위를 도입하며, 프라이머 LDH 2 및 LDH 3은 StuI 부위가 도입된 상보적인 영역을 갖는다. DNA 단편 LDH 1-LDH 2 및 LDH 3-LDH 4를 PCR 융합 실험에서 프라이머 LDH 1 및 LDH 4에 연결하고, 생성된 단편을 pCR4-TOPO-Blunt에 클로닝하여, pTOPO :LDH를 수득하였다. pTOPO :LDH의 유일한 StuI 부위에서, pUC18-FRT-MLS2의 1372 bp StuI 단편으로부터 양측에 FRT 서열을 갖는 항생제 내성 MLS 유전자를 도입시켰다. 생성된 플라스미드의 BamHI 절단 이후 수득한 UPP 결실 카세트를 BamHI 부위에서 pCons::upp에 클로닝하여, pREPΔLDH::upp 플라스미드를 수득하였다.
씨. 아세토부틸리쿰 MGCΔcac15ΔuppΔbukΔctfAB 균주에 전기충격을 가함으로써 pREPΔLDH::upp 플라스미드로 형질전환시켰다. 페트리 플레이트 상에서 에리트로마이신 (40 ㎍/ml)에 내성인 클론을 선별한 후, 한 콜로니를 에리트로마이신 40 ㎍/ml을 함유한 액체 합성 배지에서 24시간 동안 배양하고, 희석하지 않은 배양물 100 ㎕를 에리트로마이신 40 ㎍/ml 및 5-FU 400 μM을 함유한 RCA 상에 플레이팅하였다. 에리트로마이신 및 5-FU 둘 다에 내성인 콜로니를 에리트로마이신 40 ㎍/ml를 함유한 RCA 및 티암페니콜 50 ㎍/ml를 함유한 RCA 둘 다에 반복 플레이팅하여, 5-FU 내성이 티암페니콜 민감성과도 관련이 있는 클론을 선별하였다. 에리트로마이신에 내성이며 티암페니콜에 민감성인 클론의 유전자형은 PCR 분석에 의해 (ldh 결실 카세트의 외부에 위치한 프라이머 LDH 0 및 LDH 5를 이용하여) 체크하였다. pREPΔLDH::upp가 제거된 Δcac15ΔuppΔbukΔctfABΔldh::mls R 균주를 단리하였다.
Δcac15ΔuppΔbukΔctfABΔldh::mls R 균주를 에스. 세레비지애로부터의 Flp 재조합효소를 코딩하는 Flp1 유전자를 발현하는 pCLF1.1 벡터를 이용하여 형질전환시켰다. 형질전환시키고, 페트리 플레이트 상에서 티암페니콜 (50 ㎍/ml)에 대해 내성인 것을 선별한 후, 한 콜로니를 티암페니콜 50 ㎍/ml를 함유한 합성 액체 배지에서 배양하고, 적절한 희석액을 티암페니콜 50 ㎍/ml를 함유한 RCA 상에 플레이팅하였다. 티암페니콜 내성 클론을 에리트로마이신 40 ㎍/ml를 함유한 RCA 및 티암페니콜 50 ㎍/ml를 함유한 RCA 둘 다에 반복 플레이팅하였다. 에리트로마이신에 민감성이고 티암페니콜에 내성인 클론의 유전자형은 PCR 분석에 의해 프라이머 LDH 0 및 LDH 5를 이용하여 체크하였다. 에리트로마이신에 민감성이고 티암페니콜에 내성인 Δcac15ΔuppΔbukΔctfABΔldh 균주를 연속 24시간 동안 2회 배양하여, pCLF1.1을 제거하였다. pCLF1.1이 제거된 Δcac15ΔuppΔbukΔctfABΔldh 균주를 에리트로마이신 및 티암페니콜 둘 다에 대한 민감성에 따라 단리하였다.
실시예 4
부티레이트, 아세톤, 락테이트 및 아세테이트를 생산하지 못하는 균주의 제조: 씨. 아세토부틸리쿰 Δcac1515 Δupp Δbuk ΔctfAB Δldh Δpta-ack
pta 및 ack 유전자를 결실시키기 위해, 크룩스 및 수까이유의 2006년도 특허 출원 PCT/EP2006/066997에 기재된 상동성 재조합 전략을 이용하였다. 이 전략은 에리트로마이신 내성 카세트의 삽입을 가능하게 하며, 대부분의 해당 유전자를 결실시킨다. pCons::upp에서 pta-ack 결실 카세트는 다음과 같이 제조하였다.
씨. 아세토부틸리쿰의 전체 DNA를 주형으로 하고 2개의 특이적 올리고뉴클레오티드 쌍을 이용하며 Pwo 폴리머라제를 사용하여, pta-ack 주변의 2개의 DNA 단편을 PCR에 의해 증폭시켰다. 프라이머 PA 1-PA 2 및 PA 3-PA 4 쌍을 이용하여, 2개의 DNA 단편을 각각 수득하였다. 프라이머 PA 1 및 PA 4 둘 다 BamHI 부위를 도입하며, 프라이머 PA 2 및 PA 3은 StuI 부위가 도입된 상보적인 영역을 갖는다. DNA 단편 PA 1-PA 2 및 PA 3-PA 4를 PCR 융합 실험에서 프라이머 PA 1 및 PA 4에 연결하고, 생성된 단편을 pCR4-TOPO-Blunt에 클로닝하여, pTOPO :PA를 수득하였다. pTOPO :PA의 유일한 StuI 부위에서, pUC18-FRT-MLS2의 StuI 단편으로부터 양측에 FRT 서열을 갖는 항생제 내성 MLS 유전자를 도입시켰다. 생성된 플라스미드의 BamHI 절단 이후 수득한 UPP 결실 카세트를 BamHI 부위에서 pCons::upp에 클로닝하여, pREPΔPA::upp 플라스미드를 수득하였다.
씨. 아세토부틸리쿰 MGCΔcac15ΔuppΔbukΔctfABΔldh 균주에 전기충격을 가함으로써 pREPΔPA::upp 플라스미드로 형질전환시켰다. 페트리 플레이트 상에서 에리트로마이신 (40 ㎍/ml)에 내성인 클론을 선별한 후, 한 콜로니를 에리트로마이신 40 ㎍/ml을 함유한 액체 합성 배지에서 24시간 동안 배양하고, 희석하지 않은 배양물 100 ㎕를 에리트로마이신 40 ㎍/ml 및 5-FU 400 μM을 함유한 RCA 상에 플레이팅하였다. 에리트로마이신 및 5-FU 둘 다에 내성인 콜로니를 에리트로마이신 40 ㎍/ml를 함유한 RCA 및 티암페니콜 50 ㎍/ml를 함유한 RCA 둘 다에 반복 플레이팅하여, 5-FU 내성이 티암페니콜 민감성과도 관련이 있는 클론을 선별하였다. 에리트로마이신에 내성이며 티암페니콜에 민감성인 클론의 유전자형은 PCR 분석에 의해 (pta-ack 결실 카세트의 외부에 위치한 프라이머 PA 0 및 PA 5를 이용하여) 체크하였다. pREPΔPA::upp가 제거된 Δcac15ΔuppΔbukΔctfABΔldhΔpta-ack::mls R 균주를 단리하였다.
Δcac15ΔuppΔbukΔctfABΔldhΔpta-ack::mls R 균주를 에스. 세레비지애로부터의 Flp 재조합효소를 코딩하는 Flp1 유전자를 발현하는 pCLF1.1 벡터를 이용하여 형질전환시켰다. 형질전환시키고, 페트리 플레이트 상에서 티암페니콜 (50 ㎍/ml)에 대해 내성인 것을 선별한 후, 한 콜로니를 티암페니콜 50 ㎍/ml를 함유한 합성 액체 배지에서 배양하고, 적절한 희석액을 티암페니콜 50 ㎍/ml를 함유한 RCA 상에 플레이팅하였다. 티암페니콜 내성 클론을 에리트로마이신 40 ㎍/ml를 함유한 RCA 및 티암페니콜 50 ㎍/ml를 함유한 RCA 둘 다에 반복 플레이팅하였다. 에리트로마이신에 민감성이고 티암페니콜에 내성인 클론의 유전자형은 PCR 분석에 의해 프라이머 PA 0 및 PA 5를 이용하여 체크하였다. 에리트로마이신에 민감성이고 티암페니콜에 내성인 Δcac15ΔuppΔbukΔctfABΔldhΔpta-ack 균주를 연속 24시간 동안 2회 배양하여, pCLF1.1을 제거하였다. pCLF1.1이 제거된 Δcac15ΔuppΔbukΔctfABΔldhΔpta-ack 균주를 에리트로마이신 및 티암페니콜 둘 다에 대한 민감성에 따라 단리하였다.
실시예 5
수소 생산이 저하된 균주의 제조: 씨. 아세토부틸리쿰 Δcac1515 Δupp Δbuk ΔctfAB Δldh ΔhydA
hydA 유전자를 결실시키기 위해, 크룩스 및 수까이유의 2006년도 특허 출원 PCT/EP2006/066997에 기재된 상동성 재조합 전략을 이용하였다. 이 전략은 에리트로마이신 내성 카세트의 삽입을 가능하게 하며, 대부분의 해당 유전자를 결실시킨다. pCons::upp에서 hydA 결실 카세트는 다음과 같이 제조하였다.
씨. 아세토부틸리쿰의 전체 DNA를 주형으로 하고 2개의 특이적 올리고뉴클레오티드 쌍을 이용하며 Pwo 폴리머라제를 사용하여, hydA (CAC028) 주변의 2개의 DNA 단편을 PCR에 의해 증폭시켰다. 프라이머 HYD 1-HYD 2 및 HYD 3-HYD 4 쌍을 이용하여, 1269 bp 및 1317 bp DNA 단편을 각각 수득하였다. 프라이머 HYD 1 및 HYD 4 둘 다 BamHI 부위를 도입하며, 프라이머 HYD 2 및 HYD 3은 StuI 부위가 도입된 상보적인 영역을 갖는다. DNA 단편 HYD 1-HYD 2 및 HYD 3-HYD 4를 PCR 융합 실험에서 프라이머 HYD 1 및 HYD 4에 연결하고, 생성된 단편을 pCR4-TOPO-Blunt에 클로닝하여, pTOPO :HYD를 수득하였다. pTOPO :HYD의 유일한 StuI 부위에서, pUC18-FRT-MLS2의 1372 bp StuI 단편으로부터 양측에 FRT 서열을 갖는 항생제 내성 MLS 유전자를 도입시켰다. 생성된 플라스미드의 BamHI 절단 이후 수득한 UPP 결실 카세트를 BamHI 부위에서 pCons::upp에 클로닝하여, pREPΔHYD::upp 플라스미드를 수득하였다.
씨. 아세토부틸리쿰 MGCΔcac15ΔuppΔbukΔctfABΔldh 균주에 전기충격을 가함으로써 pREPΔHYD::upp 플라스미드로 형질전환시켰다. 페트리 플레이트 상에서 에리트로마이신 (40 ㎍/ml)에 내성인 클론을 선별한 후, 한 콜로니를 에리트로마이신 40 ㎍/ml을 함유한 액체 합성 배지에서 24시간 동안 배양하고, 희석하지 않은 배양물 100 ㎕를 에리트로마이신 40 ㎍/ml 및 5-FU 400 μM을 함유한 RCA 상에 플레이팅하였다. 에리트로마이신 및 5-FU 둘 다에 내성인 콜로니를 에리트로마이신 40 ㎍/ml를 함유한 RCA 및 티암페니콜 50 ㎍/ml를 함유한 RCA 둘 다에 반복 플레이팅하여, 5-FU 내성이 티암페니콜 민감성과도 관련이 있는 클론을 선별하였다. 에리트로마이신에 내성이며 티암페니콜에 민감성인 클론의 유전자형은 PCR 분석에 의해 (hydA 결실 카세트의 외부에 위치한 프라이머 HYD 0 및 HYD 5를 이용하여) 체크하였다. pREPΔHYD::upp가 제거된 Δcac15ΔuppΔbukΔctfABΔldhΔhydA::mls R 균주를 단리하였다.
Δcac15ΔuppΔbukΔctfABΔldhΔhydA::mls R 균주를 에스. 세레비지애로부터의 Flp 재조합효소를 코딩하는 Flp1 유전자를 발현하는 pCLF1.1 벡터를 이용하여 형질전환시켰다. 형질전환시키고, 페트리 플레이트 상에서 티암페니콜 (50 ㎍/ml)에 대해 내성인 것을 선별한 후, 한 콜로니를 티암페니콜 50 ㎍/ml를 함유한 합성 액체 배지에서 배양하고, 적절한 희석액을 티암페니콜 50 ㎍/ml를 함유한 RCA 상에 플레이팅하였다. 티암페니콜 내성 클론을 에리트로마이신 40 ㎍/ml를 함유한 RCA 및 티암페니콜 50 ㎍/ml를 함유한 RCA 둘 다에 반복 플레이팅하였다. 에리트로마이신에 민감성이고 티암페니콜에 내성인 클론의 유전자형은 PCR 분석에 의해 프라이머 HYD 0 및 HYD 5를 이용하여 체크하였다. 에리트로마이신에 민감성이고 티암페니콜에 내성인 Δcac15ΔuppΔbukΔctfABΔldhΔhydA 균주를 연속 24시간 동안 2회 배양하여, pCLF1.1을 제거하였다. pCLF1.1이 제거된 Δcac15ΔuppΔbukΔctfABΔldhΔhydA 균주를 에리트로마이신 및 티암페니콜 둘 다에 대한 민감성에 따라 단리하였다.
실시예 6
n-부탄올 생산 균주의 회분식 발효
먼저, 암모늄 아세테이트 2.5 g/ℓ가 보충된 소니(Soni) 등의 문헌 [Soni et al, 1987, Appl. Microbiol.Biotechnol. 27:1-5]에 기재된 합성 배지 중 혐기성 플라스크 배양물 중에서 균주를 분석하였다. 35℃에서 밤새 배양하여, 30 ml 배양물에 접종하였다 (OD600 = 0.05). 배양물을 35℃에서 3일 동안 인큐베이션한 후, 분리를 위해 바이오라드(Biorad) HPX 97H 컬럼을 이용하고 검출을 위해 굴절계를 이용하여 HPLC에 의해 글루코스, 유기산 및 용매를 분석하였다.
이후, 정확한 표현형을 가진 균주를 혐기성 회분식 프로토콜을 이용하여 300 ml 발효기 (DASGIP)에서 생산 조건하에 시험하였다.
이 목적을 위해, 발효기를 합성 배지 250 ml로 충전하고, 질소를 30분 동안 살포하고, 25 ml 예비 배양물에 접종하였다 (광학 밀도 OD600nm = 0.05 내지 0.1).
배양물의 온도는 35℃로 일정하게 유지하고, pH는 NH4OH 용액을 이용하여 5.5로 영구히 조정하였다. 발효되는 동안 진탕 속도는 300 rpm으로 유지하였다.
실시예 7
n-부탄올 생산 균주의 연속식 발효
소니 등의 문헌 [Soni et al, 1987, Appl. Microbiol.Biotechnol. 27:1-5]에 기재된 합성 배지 중 항화조 배양물 중에서 최상의 n-부탄올 생산 균주를 분석하였다. 35℃에서 밤새 배양하고, 혐기성 항화조 프로토콜을 이용하여 300 ml 발효기 (DASGIP)에 접종하였다.
이 목적을 위해, 발효기를 합성 배지 250 ml로 충전하고, 질소를 30분 동안 살포하고, 25 ml 예비 배양물에 접종하였다 (광학 밀도 OD600nm = 0.05 내지 0.1). 35℃ 및 pH 5.5 (NH4OH 용액을 이용하여 조절)에서 300 rpm의 진탕 속도하에 12시간 동안 회분식 배양한 후, 희석률이 0.05 h-1인 산소 무함유 합성 배지를 발효기에 연속 공급하고, 발효된 배지를 순차적으로 제거하여 부피를 일정하게 유지하였다. 배양물의 안정성은 상기 기재한 HPLC 프로토콜을 이용한 생성물 분석에 의해 확인하였다.
실시예 8
회분식 배양물 중 n-부탄올 생산 균주의 평가
생산 균주를 작은 플라스크에서 평가하였다. 해동한 배양물의 10％ (전형적으로 3 ml)를 사용하여 합성 배지 (MSL4) 30 ml에 접종하였다. 80℃에서 15분 동안 열 충격을 가하여, 성장을 개시하기 전에 임의의 생장가능한 세포를 사멸시켰다. 그 후, 배양물을 37℃에서 6 내지 7일 동안 성장시켰다. 세포외 화합물을 하기 변수들을 이용하여 HPLC에 의해 정량화하였다: 용리액 (H2SO4) 농도: 0.25 mM; 유속: 0.5 ml/min; 온도: 25℃, 시간: 50분.
표 2에서 확인되는 바와 같이, 부티레이트 키나제를 코딩하는 유전자 (buk)가 결실되었을 때, 배지에서 검출된 최대 부티레이트 농도가 씨. 아세토부틸리쿰 Δcac15 Δupp 균주에서 2일 배양 후 3.13 g/ℓ에서, 씨. 아세토부틸리쿰 Δcac15 Δupp Δbuk::MSLr 균주에서 5일 배양 후 0.43 g/ℓ으로 감소하였다. 주목할만하게는, 알코올/글루코스 수율 (Ybu + Yet)이 상당히 증가한 반면, 아세톤/글루코스 수율 (Yac)은 상당히 감소하였다.
SEQUENCE LISTING
<110> METABOLIC EXPLORER
<120> PROCESS FOR THE BIOLOGICAL PRODUCTION OF N BUTANOL WITH HIGH
YIELD
<130> 351965 D24755
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<170> PatentIn version 3.3
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aaaaggatcc gcctcttctg tattatgcaa ggaaagcagc tgc 43
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catgttctat tgttactatg gaagaggtag tag 33
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<400> 30
gcagttatta taaatgctgc tactagagc 29
Claims (15)
- 포스포-트랜스부티릴라제를 코딩하는 ptb 및 부티레이트 키나제를 코딩하는 buk 중에서 선택된 부티레이트 형성과 연관된 하나 이상의 유전자가 결실되어 있는 클로스트리디아(Clostridia) 미생물을 탄소 공급원을 포함하는 배양 배지에서 배양시키고, 상기 배양 배지로부터 n-부탄올을 회수함으로써, n-부탄올을 생산하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 미생물에서 CoA-트랜스퍼라제를 코딩하는 ctfAB 및 아세토-아세테이트 데카르복실라제를 코딩하는 adc 중에서 선택된 아세톤 형성과 연관된 하나 이상의 유전자가 감쇠된 것인 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자가 결실된 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 미생물이 ldh 유전자의 결실에 의해, 락테이트를 생산하지 못하도록 변형된 것인 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 미생물이 포스포-트랜스아세틸라제를 코딩하는 pta 및 아세테이트 키나제를 코딩하는 ack 중에서 선택된 아세테이트 형성과 연관된 하나 이상의 유전자의 결실에 의해, 아세테이트를 생산하지 못하도록 변형된 것인 방법.
- 제4항에 있어서, hydA 유전자의 감쇠에 의해, 수소 흐름이 감소되어, 환원력이 부탄올 생산쪽으로 다시 지정된 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 미생물이 씨. 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum), 씨. 베이제린키이(C. beijerinckii), 씨. 사카로퍼부틸아세토니쿰(C. saccharoperbutylacetonicum) 또는 씨. 사카로부틸리쿰(C. saccharobutylicum)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 연속식으로 안정하게 배양하는 것인 방법.
- 제8항에 있어서,a) n-부탄올을 생산하는 미생물을 발효시키는 단계,b) 발효하는 동안 가스 스트립핑에 의해 n-부탄올을 회수하는 단계, 및c) 증류에 의해 응축물로부터 n-부탄올을 단리하는 단계를 포함하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 따른 클로스트리디아 미생물.
- 제4항에 따른 클로스트리디아 미생물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
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