CN105154465A

CN105154465A - 一种敲除乙酸激酶基因的重组质粒及其应用

Info

Publication number: CN105154465A
Application number: CN201510434162.0A
Authority: CN
Inventors: 伊日布斯; 申冬玲; 尚淑梅; 李卫娜
Original assignee: Kunming University of Science and Technology
Current assignee: Kunming University of Science and Technology
Priority date: 2015-07-23
Filing date: 2015-07-23
Publication date: 2015-12-16

Abstract

本发明公开了一种敲除嗜热厌氧芽孢杆菌Thermoanaerobacterium？calidifontis？Rx1乙酸激酶基因的重组质粒，并通过构建重组载体pBSkpa，并把该载体导入上述菌株T.？calidifontis？Rx1中，利用同源重组原理将卡那霉素抗性基因（kan^r）片段插入其pta/ack中间使其失活，以kan^r作为正筛选标记获得突变菌株；利用该突变菌株提高乙醇产量，以木糖和纤维二糖为底物，乙醇的产量分别增加了0.6、1.1倍，为研究ack基因敲除后其生长和发酵的特性以及为进一步的代谢工程改造提供新的途径。

Description

一种敲除乙酸激酶基因的重组质粒及其应用

技术领域

本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种用于敲除嗜热厌氧芽孢杆菌（ThermoanaerobacteriumcalidifontisRx1)的乙酸激酶基因ack的重组质粒pBSkpa，以及重组载体pBSkpa在构建高温厌氧菌T.calidifontisRx1乙酸合成途径的阻断重组菌株中获得的突变菌株T.calidifontisRx1△ack。

背景技术

木质纤维素是地球上最丰富的可再生生物资源，世界各国争相开发以木质纤维素为原料的生物乙醇生产技术。但是Saccharomycescerevisiae，Zymomonasmobilis等乙醇生产菌种不能合成纤维素和半纤维素降解酶，而且也不能利用来源于半纤维素组分的木糖等戊糖。与这些传统乙醇菌株相比，高温厌氧菌的底物利用范围广，不仅可以代谢来源于木质纤维素的五碳糖和六碳糖，也能有效利用纤维素和半纤维素的水解产物，还可以利用多聚糖，甚至可以直接利用木质纤维素中的纤维素和半纤维素；而且高温厌氧菌对pH、温度和环境的耐受范围较宽，这些特征都有利于商业化生产，利用高温厌氧菌发酵还能避免酵母菌发酵易被微生物污染的问题。但是高温厌氧菌的底物利用率低和乙醇产量低是阻碍其工业化的主要因素。

T.calidifontisRx1是一株革兰氏阳性严格厌氧菌株，其生长温度范围为38–68℃，最适生长温度是50–55℃；pH范围为4.5–8.0（pH≤4.3或≥8.2不生长），最适pH值是7.0；在最优的生长条件下，Rx1发酵木糖和葡萄糖，乙醇的产率达到了理论产值的81%和58%。其乙醇产量（<40g/L）还远达不到传统发酵菌的水平，必须进一步提高乙醇产量，才有可能达到商业化生产的要求。

对于乙醇生产来讲，乳酸和乙酸是副产物，其生成途径可称作旁路代谢途径，它们不仅会与乙醇生成途径争夺碳源和还原力(NADH)，而且有机酸的积累对细菌的生长具有很强的抑制作用。目前提高高温厌氧菌乙醇产量的主要策略是采用基因敲除的手段敲除旁路代谢的关键酶基因乳酸脱氢酶基因（ldh）和磷酸乙酰转移酶(pta)基因。Desai等于2004年首次成功敲除了嗜热厌氧解糖杆菌（T.saccharolyticum）的乳酸脱氢酶基因（ldh），又在2008年完成了T.saccharolyticum菌株ldh基因和磷酸乙酰转移酶基因（pta）连续敲除的工作，成功阻断了乳酸和乙酸的生成途径，获得突变菌株ALK2在7%木糖培养基（55°C）中连续培养，最高乙醇浓度达33g/L，乙醇得率为0.46g/g木糖。最近该研究团队针对C.thermocellum开发了一种基于尿嘧啶营养缺陷性的转化子筛选方法，并敲除了ldh和pta基因，将所获突变株与上述工程菌株ALK2进行共培养，发酵微结晶纤维素（92g/L），146h时乙醇浓度为38g/L。Deng等在C.thermocellum中异源表达丙酮酸激酶，并敲除ldh和mdh（苹果酸脱氢酶基因）基因得到突变菌株YD02，发酵纤维二糖的乙醇产量是野生菌株的3倍。英国Taylor等以一种高乙醇耐受性的兼性厌氧高温菌热葡糖苷酶地芽孢杆菌（Geobacillusthermoglucosidasius）为出发菌株，敲除ldh基因的同时上调表达丙酮酸脱氢酶基因（pdh），加快了丙酮酸代谢速率，获得了乙醇得率为0.42g/g葡萄糖的突变株。

本发明利用的高温菌是实验室筛选的革兰氏阳性严格厌氧高温芽孢杆菌。在发明中首先构建重组载体pBSkpa，通过高压电穿孔转化法把pBSkpa导入T.calidiforntisRx1细胞中，通过同源重组插入失活的方式，成功敲除了合成乙酸的基因（ack），获得乙酸产量大幅度减少、乙醇产量增加的T.calidifontisRx1△ack突变菌株，并对该菌株进行了生长特点和发酵特性的研究，为进一步的代谢工程改造提供新的理论依据。

发明内容

本发明的目的在于提供一种敲除乙酸激酶基因的重组质粒，该载体包括卡那霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因上游的pta-up片段、卡那霉素抗性基因下游的ack-down片段，卡那霉素抗性基因序列包含其启动子；

其中所述pta-up片段核苷酸序列如序列表1所示，ack-down片段核苷酸序列如序列表2所示。

本发明另一目的是采用上述敲除乙酸激酶基因的重组质粒构建一株敲除乙酸激酶基因的突变菌株，该菌株的的乙酸激酶基因的开放阅读框（ORF）因为插入了卡那霉素抗性基因而破坏了其完整性，不能编码乙酸激酶，从而阻断了乙酸的生成途径，使碳通量流向乙醇来提高其产量；该突变株T.calidifontisRx1△ack在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为：CCTCCM2015279，中国典型培养物保藏中心地址：中国武汉，武汉大学，保藏日期为2015年5月7日。

本发明所使用的原始菌株T.calidiforntisRx1已保藏在“中国典型培养物保藏中心”，保藏号分别为CCTCCM2011109。

本发明的另一目的是将T.calidifontisRx1△ack应用到乙醇的发酵生产中。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

1、构建重组载体pBSkpa

（1）以pUC18-HTK质粒为模板PCR扩增卡那霉素抗性基因（kan ^r），扩增产物与PMD19-T载体连接，再用XbaI和PstI限制性内切酶双酶切TA克隆载体和pBluescriptIISK(-)载体，分别纯化回收后用T₄连接酶进行连接，并转化至大肠杆菌JM109，获得pBS-Kan^r中间载体。

（2）以T.calidiforntisRx1基因组DNA为模板，扩增ack上游片段，获得0.5Kb的ack-down基因片段，将其连接到PMD19-T载体上，采利用HindIII和XhoI限制性内切酶进行双酶切载体PMD19-ack-down和pBS-Kan^r，酶切产物纯化回收后连接得到载体pBS-Kan^r-ack-down。

（3）以T.calidiforntisRx1基因组DNA为模板，扩增pta下游片段，获得1.2Kb的pta-up基因片段，并将其连接到PMD19-T载体上，利用SacI和XbaI限制性内切酶进行双酶切载体PMD19-pta-up和pBS-ack-down-Kanr，酶切产物纯化回收后连接得到载体pBS-pta-up-Kanr-ack-down，即基因敲除重组载体pBSkpa。

2、T.calidiforntisRx1感受态细胞的制备

在T.calidiforntisRx1的生长初期加入异烟肼，使终浓度达到5-20μg/mL，继续55℃培养至A ₆₀₀=0.4-1.0，收集细胞并用电转缓冲溶液洗涤1-5次，最后悬浮在100-200μL电转缓冲溶液中。

3、重组载体pBSkpa转入T.calidiforntisRx1细胞

高压电穿孔转化法转入重组载体pBSkpa，摇床中48℃培养4h回复细胞，然后在含有50-250μg/mL卡那霉素的平板上涂布，厌氧罐中培养。

4、突变菌株的筛选

待平板上长出单菌落，挑菌到含有50-100μg/mL的液体培养基中40-48℃培养，对24-36h生长的菌液进行PCR检测，并测序验证；对确定的菌株进行生长特性和发酵特性的研究。

本发明首先构建了用于敲除乙酸激酶的重组载体pBSkpa，并成功筛选到突变菌株。T.calidiforntisRx1的生长环境限制了重组效率高的基因敲除方法，如线性Red同源重组系统，而且需要合适的耐热稳定的筛选标记，重组载体pBSkpa的卡那霉素抗性基因具有耐热稳定性。乙酸是其生产乙醇中的主要副产物之一，不仅与乙醇生成途径争夺碳源和还原力，而且有机酸的积累对细胞的生长具有很强的抑制作用。本发明敲除ack基因后，菌株仍能快速生长，在10h后就进入稳定期，而且突变菌株的乙酸产量大幅度降低，乙醇产量高于野生菌株；本发明建立了高温厌氧菌T.calidiforntisRx1的遗传转化体系，为进一步的代谢工程改造提供新的理论依据。

附图说明

图1是本发明高温厌氧菌T.calidiforntisRx1基因组DNA的检测，图中：1是DNAmarker；2、3、4是基因组DNA；

图2是本发明重组质粒pBSkpa的构建琼脂凝胶电泳示意图，图中1:Maker；2:ack-down(0.5Kb)；3:pta-up(1.2Kb)；4:kan^r(1081bp)；5:BluescriptIISK(-)质粒(2961bp)；6:pBS-kan^r载体(4.0Kb)；7:pBS-kan^r载体XbaI酶切验证(4.0Kb)；8:pBS-kan^r–ack载体(4.5Kb)；9:pBS-pta-kan^r-ack载体SacI酶切验证(4.5Kb)；10:pBS-pta-kan^r-ack质粒(5.8Kb)；11:pBS-ack-kan^r-pta载体ScaI、XhoI双酶切验证(2.9Kb)；12：Marker；

图3是本发明重组质粒pBSkpa结构示意图；

图4是本发明Δack突变菌株单菌落（A图）和补丁（B图）示意图；

图5是本发明Δack突变转化子的PCR鉴定电泳图，图A中M是Marker；1、2、3分别是以pupF-adnR为引物，去离子水、野生菌株和突变菌株为模板的PCR电泳图；B图中4、5是以kmF-kmR为引物，野生菌株和突变菌株为模板的PCR电泳图；

图6是本发明突变菌株以葡萄糖和木糖为底物的生长曲线图；

图7是本发明野生菌株以木糖为底物的发酵特性分析图；

图8是本发明突变菌株以木糖为底物的发酵特性分析图；

图9是本发明野生菌株以纤维二糖为底物的发酵特性分析图；

图10是本发明突变菌株以纤维二糖为底物的发酵特性分析图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的实际如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配置的试剂。

试剂与仪器：

本实施例中试剂主要分为分子生物学实验试剂。各种限制性内切酶、pfuDNA聚合酶、dNTP等为美国Fermentas公司和北京全式金生物技术有限公司，质粒提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司，其余试剂均为国产分析纯。

仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。高效液相色谱仪为日本岛津AT-20仪器。所有引物序列均在上海生工合成。本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1： T.calidiforntisRx1基因组DNA的制备与检测

本发明所用的高温厌氧菌T.calidiforntisRx1为本实验室筛选菌株，Rx1基因组DNA的制备采用普通细菌基因组提取方法。取2mL过夜培养菌液于4℃4000rpm离心2min，弃尽上清液，收集菌体；加入576μLTE缓冲夜悬菌；再加入30μL10%SDS和3μL20mg/ml蛋白酶K，混匀，37℃孵育1h；加入100μL15mol/LNaCl，混匀；加入20μLCTAB/NaCl溶液（CTAB10%，NaCl0.7mol/L），混匀，65℃，10min；加入等体积酚/氯仿/异戊（25:24:1）混匀；12000rpm离心5min；取上清，加入2倍体积无水乙醇，0.1倍体积3mol/LNaAC，-20℃放置30min；12000rpm离心10min；沉淀加入70%乙醇洗涤；沉淀干燥后，溶于20μLTE，-20℃保存。取3μL基因组DNA用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，结果（图1）说明提取到的基因组DNA质量符合要求。

实施例2：重组载体pBSkpa的构建

以pUC18-HTK载体为模板，PCR扩增含有自身启动子的抗性基因kan ^r（图2泳道4），以T.calidiforntisRx1基因组DNA为模板，分别扩增pta、ack片段，获得的pta-up片段和ack-down片段，通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物，回收并纯化片段kan^r（1081bp）、pta-up（1223bp）、ack-down（496bp），然后用宝生物（TaKaRa）的TA克隆试剂盒亚克隆到pMD19-T（大连宝生物公司）载体上，实验操作按试剂盒的说明书进行，反应过夜后用反应混合液转化大肠杆菌感受态JM109（购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司），PCR验证插入片段大小是否与理论值相符，然后采用碱裂解法提取质粒DNA，对质粒PMD-kan^r和pBluescriptIISK(-)用PstI和XbaI酶切胶回收，T₄连接酶过夜连接、转化至大肠杆菌JM109，挑选阳性克隆，获得中间载体pBS-kan^r(图2泳道6)。用PstI酶切验证（图2泳道7），获得预测正确的pBS-kan^r载体。将载体pBS-kan^r和PMD-ack-down用HindIII和XhoI酶双酶切，纯化回收后用T₄连接酶过夜连接、转化至大肠杆菌JM109，挑选阳性克隆，获得载体pBS-kan^r-ack-down（图2泳道8），用SacI酶切验证（图2泳道9），获得预测正确的pBS-kan^r-ack-down载体。将pBS-kan^r-ack-down载体用SacI和XbaI酶双酶切，纯化回收后与pta-up片段用T₄连接酶过夜连接、转化至大肠杆菌JM109，挑选阳性克隆，最终获得载体pBS-pta-up-kan^r-ack-down（图2泳道10），用SacI，XhoI酶切验证（图2泳道11，注：双酶切后载体序列和插入序列的长度都约为2.9Kb，因此电泳条带只有一条），获得预测正确的pBS-pta-up-kanr-ack-down载体。对预测正确载体的进行测序，命名为pBSkpa，用于ack基因敲除。扩增引物序列如下，画线部分分别表示酶切位点。

kmF:5’GCTCTAGA（XbaⅠ）GGTACCCGTTGACGGC3’

kmR:5’CTGCAG（ PstI）CTGCAGCGTAACCAACATG3’

pupF:5’CGAGCTC（ SacI）CGAGGACATTAAAGGCTG3’

pupR:5’GCTCTAGA（XbaⅠ）CTCCTCCATGAACAACTC3’

adnF:5’CCCAAGCTT（ HindIII）GCCAGCAAATTATGCCAA3’

adnR:5’CCGCTCGAG（ XhoI）GCTCTTCCATCTCCAT3’。

实施例3：突变菌株的筛选

（1）质粒试剂盒提取重组质粒pBSkpa（图3），琼脂凝胶电泳检测，质粒浓度为200-250ng/μL；

（2）T.calidiforntisRx1在55℃，用6管充有N₂的10mL厌氧管培养；

（3）细胞培养至对数生长早期OD值为0.2-0.3时，加入浓度为1mg/mL的异烟肼至细胞液中异烟肼浓度为20μg/mL，用以弱化细胞壁；

（4）细胞继续培养2-4h至A ₆₀₀=0.8-1.0，冰浴0.5h，在4℃，3500rmp下离心、弃上清收集细胞；

（5）再用充有N₂、4℃预冷的电转缓冲液（270mmol/L蔗糖和50mmol/LNaH₂PO₄）漂洗菌体，两管菌体合为一管，重复2次；

（6）接着用4℃预冷的200μL电转缓冲液重悬菌体，感受态细胞制备完成，电转备用；在装有25μL打靶质粒载体的1mm电转杯中加入100μL备用的感受态细胞，冰浴15min；

（7）用Bio-Rad电转仪完成电转实验，电转条件为1.25kv，400Ω，25μF，电转完成时间分别为6.2ms和5.7ms；

（8）电转结束后，细胞迅速转入装有2ml液体培养基的厌氧管中，在摇床中48℃，100r/min条件下恢复培养4h；

（9）最后，在卡那霉素浓度为200μg/ml，250μg/ml的固体培养基上涂布200μL恢复培养的细胞，然后在厌氧罐中55℃培养，2-4天后挑取45个单菌落在划有格子的平板上涂补丁（如图4），2-4天后可以看到一块一块的补丁；

（10）刮取部分菌落补丁，接种于充有氮气的装有卡那霉素浓度为50μg/mL的2mL的液体培养基中，为下一步目的菌株的筛选鉴定备用；

（11）24-36h之后对OD₆₀₀>0.8的菌液进行PCR扩增检测和测序验证，PCR结果如图5所示。以pupF-adnR为引物，突变菌株基因组中因插入了卡那霉素抗性基因，所获得的目标片段高野生菌株的1.0kbp左右，如图5A的第2、3泳道。再以kmF-kmR为引物，野生菌株扩增不出任何片段，突变菌株扩增出1.0kbp左右，证明卡那霉素抗性基因确实插入到T.calidiforntisRx1的基因组DNA中。

实施例4：突变菌株的生长特点和发酵产物分析

（1）分别以葡萄糖和木糖为底物配制基础培养基；

（2）分别按1%接种量接种突变菌株于上述培养基，55℃培养，每隔2h测定OD₆₀₀，并绘制生长曲线，如图6所示；从图中可以看出突变菌株在12h进入稳定期，虽然与野生菌株相比进入稳定期的时间增加，但其生长速度仍然比较快，有利于乙醇发酵生产；

（3）分别以纤维二糖和木糖为底物配制发酵培养基；

（4）分别按5%接种量接种野生菌株和突变菌株于发酵培养基，55℃培养，每隔4h取发酵液；

（5）发酵液用UV-4802型双光束紫外分光光度计(尤尼柯（上海）仪器有限公司)600nm处测其吸光值。通过校正曲线计算其细胞干重，DCW(g/L)=0.5×A ₆₀₀-0.06(R²=0.9966)，然后离心取上清进行高效液相分析，检测器为RID-10A型示差折光检测器；色谱柱为AminexHPX-87Hcolumn(300×7.8mm)（Bio-RAD)；流动相:5mmol/LH₂SO₄；流速:0.6ml/min；柱温:55℃。所有实验都设三个重复；结果如图7、8、9、10所示；从图中可以看出突变菌株发酵木糖和纤维二糖时乙酸的含量都远低于野生菌株的发酵产量，卡那霉素抗性基因因插入到乙酸激酶基因中从而阻断乙酸的代谢途径，使乙酸的含量受到影响；相反乙醇的产量都高于野生菌株对的产量，分别增加了0.6和1.1倍。

序列表

<110>昆明理工大学

<120>一种敲除乙酸激酶基因的重组质粒及其应用

<160>8

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>1223

<212>DNA

<213>ThermoanaerobacteriumcalidifontisRx1

<400>1

cgaggacattaaaggctgctgagatagtactaaaagagggaatcgcagatttagtgcttc60

tgggaaatgaggacgagataaaaagtgcagcaaaagatttggacatatccaaagcagaaa120

tcattgaccctgtaaagtctgaaatgtttgataggtatgctaatgatttttatgaattaa180

gaaagagcaagggaattactttagaaaaagccagagaaacaatcaaagataatatttatt240

ttggatgtatgatggttaaagaaggttatgctgatggattggtatctggcgctattcatg300

ctactgcagatttattaagaccagcatttcagataattaaaacggctccaggagcaaaga360

tagtatcaagcttttttataatggaagtacctaattgcgaatatggcgaaaatggtgtat420

ttttgtttgctgattgtgcagttaatccatcgcctaatgcagaagaacttgcttctattg480

ctgtacaatctgctaatactgcgaagaatttgttgggctttgaaccaaaagttgcgatgc540

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tgctttggtaaacagcgattatggtgttataaaggatatgtctgagatagatgctgtagg1200

tcatagagttgttcatggaggag1223

<210>2

<211>496

<212>DNA

<213>ThermoanaerobacteriumcalidifontisRx1

<400>2

gccagcaaattatgccaaacgttccaatggtggcagtattcgatacagcttttcatcaga60

caatgcctgattatgcatatctttatccaataccttacgaatactacacaaagtatagaa120

taagaagatatggatttcatggtacgtcgcataaatatgtttcaaatagggctgcagaga180

ttttaaataggcctattgaagatttaaaaattataacatgtcatcttggaaatggttcca240

gtattgctgccgtcaaatatggtaaatcaattgacacaagcatgggatttacgccattag300

aaggtttggctatgggtacacgatctggaaacatagatccatctatcatttcttatctta360

tggagaaagaaaatataagcgctgaagaagtagtaaatatattaaacaaaaaatcaggtg420

tttacggtatttcaggaataagcagcgattttagagatttagaagatgctgcatttaaaa480

atggagatggaagagc496

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

gctctagaggtacccgttgacggc24

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

ctgcagctgcagcgtaaccaacatg25

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

cgagctccgaggacattaaaggctg25

<210>6

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

gctctagactcctccatgaacaactc26

<210>7

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

cccaagcttgccagcaaattatgccaa27

<210>8

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

ccgctcgaggctcttccatctccat25

Claims

1.一种敲除乙酸激酶基因的重组质粒，其特征在于：该载体包括卡那霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因上游的pta-up片段、卡那霉素抗性基因下游的ack-down片段，卡那霉素抗性基因序列包含其启动子；

2.采用权利要求1所述的敲除乙酸激酶基因的重组质粒构建筛选到的突变菌株ThermoanaerobacteriumcalidifontisRx1△ack，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为：CCTCCM2015279。

3.权利要求2所述的突变菌株ThermoanaerobacteriumcalidifontisRx1△ack在乙醇生产中的应用。