WO2011020596A2 - Cyclosporinderivate - Google Patents

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WO2011020596A2
WO2011020596A2 PCT/EP2010/005053 EP2010005053W WO2011020596A2 WO 2011020596 A2 WO2011020596 A2 WO 2011020596A2 EP 2010005053 W EP2010005053 W EP 2010005053W WO 2011020596 A2 WO2011020596 A2 WO 2011020596A2
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amino acid
radical
carbon atom
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Gunter Fischer
Miroslav Malesevic
Frank Erdmann
Jan KÜHLING
Michael Bukrinsky
Stephanie Constant
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    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to cyclosporin derivatives, a process for enriching a cyclosporin derivative in an extracellular space of a multicellular object, which
  • composition comprising an inventive
  • Biologically active molecules which are usually pharmaceutical active ingredients, usually exert their effect both inside and outside of biological cells.
  • the main problem that has hitherto arisen is that active substances which are intended to exert their effect only within the cell have undesired changes in the extracellular space even before they pass through the cell membrane
  • the actual effect thus includes two components - the desired intracellular and the undesirable extracellular. If the intracellular effect had to be achieved. since transport to the cell usually involves traversing one Extracellular space - necessarily also often the extracellular (side) effect can be accepted.
  • Active ingredients that are supposed to exert their effect solely outside the cell. Especially in medicine, a number of drugs is known that not only do not develop the intended effect in the cell, but even act toxic or cause otherwise damaging effect. In addition, to achieve a particular, extracellular effect, a far higher dose must be administered than is actually needed to compensate for the "loss" of the agents migrating into the cell interior.
  • Active ingredients can act extracellularly on molecules or structures.
  • biological molecules of the extracellular space can be, for example, enzymes, inhibitors, activators or receptors.
  • structures is meant, for example, the extracellular matrix formed from all the macromolecules located outside the plasma membrane of cells in tissues and organs.
  • Active substances are effectors, which inflammatory processes in biological objects, preferably in the animal and
  • PPIases peptidyl prolyl cis / trans isomerases
  • Biopharmaceutics. 22 (5): 327-65, 1994) are detected in blood cells at about 8x higher concentration than in the surrounding plasma.
  • Cyclosporin (also cyclosporin) is a cyclic oligopeptide with immunosuppressive and calcineurin-inhibiting activity. It is characterized by a selective and reversible
  • Interleukin-2 thereby simultaneously inhibiting the proliferation of cytotoxic T lymphocytes, e.g. are responsible for the rejection of foreign tissue is suppressed.
  • Cyclosporin acts intracellularly by binding to the so-called cyclophilins or immunophilins belonging to the family of cyclosporin-binding proteins.
  • Inhibitors of cyclophilins have a very wide therapeutic spectrum, such as the treatment of respiratory diseases, such as asthma, COPD,
  • Pancreas Pancreas 32 (2006), 145-151
  • the brain Annais of Vascular Surgery 20 (2006), 243-249, Neurological Research 27 (2005), 827-834
  • renal diseases e.g.
  • cyclosporin inhibits the synthesis and release of additional lymphokines that are more mature for proliferation
  • cytotoxic T lymphocytes and are responsible for other functions of lymphocytes. Cyclosporin's ability to block interleukin-2 is clinical
  • the object of the present invention was to provide new,
  • A is an amino acid residue of the formula (II),
  • R x is a radical of the formula VIII
  • B is an amino acid residue selected from the group consisting of:
  • D is an amino acid residue selected from the group consisting of:
  • E is an amino acid residue selected from the group consisting of:
  • F is an amino acid residue selected from the group consisting of:
  • G is an alpha-amino butanoic acid residue or an alanine residue
  • H is a D-alanine residue
  • I and J are radicals independently of one another from the group consisting of:
  • K is N-methylvaline residue or valine residue, where in formulas II to IX R 0 is H or CH 3 ,
  • Aryloxycarbonyl, arylalkyloxycarbonyl group or a silyl protecting group is derivatized
  • R 3 from the group consisting of:
  • R 4 is the group R 2 as defined above, where R 4 and R 2 may be the same or different from each other,
  • Amino acid type or a combination of different amino acid types selected from Gly, D-Glu, D-Asp, D- and L-CyS (SO 3 H), an alkyl, alkenyl, aryl,
  • Yi is the group Y as defined above, where Y and Yi may be the same or different from each other,
  • Y 2 is H, F, Cl, Br or I
  • R 5 from the group consisting of:
  • alkyl alkenyl, aryl, alkylaminocarbonyl, arylaminocarbonyl, arylalkylaminocarbonyl,
  • R 7 from the group consisting of:
  • alkyl an alkyl, alkenyl, aryl, alkylaminocarbonyl,
  • Amino acid residue containing one of an amino acid species or a combination of different amino acid species selected from Gly, D-Glu, D-Asp, D- and L-CyS (SO 3 H), and R 8 corresponds to the group R 5 as defined above, wherein R s and R 5 may be the same or different from each other.
  • the cyclosporin derivatives according to the invention have a
  • the cyclosporin derivatives according to the invention can have a negative net charge at pH 6, which is why they can not migrate through a cell membrane under appropriate conditions.
  • the determination of the net charge of a peptide sequence may be approximated by calculation, e.g. in WO
  • cyclosporin derivative should not comprise a segment of peptide capable of traversing the membrane of a cell.
  • a "peptide segment” is any segment with more than one positive
  • the cyclosporin derivatives of the invention are therefore preferably free of a peptide segment capable of attaching the membrane to a biological cell
  • a peptide segment or a peptide, as it may not be part of the cyclosporin derivative according to the invention, can be, for example, one or more amino acids selected from the group consisting of arginine, lysine,
  • Peptides which are particularly well able to migrate through the membrane of biological cells are in particular peptides from 5 to 20 of the abovementioned amino acids.
  • Ri corresponds to a radical of formula IV
  • Cyclosporinderivats invention corresponds to a radical of formula V Ri
  • Ri corresponds to a radical of the formula VI
  • Ri corresponds to a radical of the formula VII
  • Cyclosporinderivats invention corresponds to a radical of the formula VIII Ri
  • Cyclosporinderivats invention corresponds to a radical of formula IX Ri
  • the cyclosporin derivative of the formula (I) is selected from:
  • the present invention further provides a method for
  • extracellular space is to be understood as meaning all areas which are outside the cytosol and the membrane enclosing the cytosol, including those present in cell suspensions, for example
  • the multicellular object can be any object that consists of at least two of them
  • biological cell encompasses both human,
  • multicellular object becomes a
  • multicellular object is a separated body part, such as a graft, in particular an organ, a cell, a limb or a tissue graft, blood or a blood fraction, such as
  • human and / or animal cells such as a two-dimensional tissue culture or a spheroid culture of the cells. Is it the biological Cells around plant cells, so is under the term
  • Multicellular object part of a plant, like
  • the multicellular object is a separated organ or body part, blood or a blood fraction, a cell culture or a plant.
  • the present invention further provides the use of a cyclosporin derivative of the invention as a medicament.
  • Areas of application of the medicament according to the invention can be therapy and diagnosis of diseases but also of cosmetic nature, whereby under therapy in the broadest sense also the control of pests in the animal and plant kingdom or the support of healing processes in the animal and plant kingdom but also the influence of biological processes in
  • the present invention further provides the use of a cyclosporin derivative of the invention for the manufacture of a medicament for the treatment of a chronic inflammatory disease.
  • the chronic inflammatory disease is asthma, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, psoriasis or ulcerative colitis.
  • the present invention further provides a pharmaceutical composition comprising a cyclosporin derivative of the invention.
  • the pharmaceutical composition according to the invention may be any pharmaceutical composition which is known to the person skilled in the art.
  • cyclosporin derivative of the invention may be in a form selected from the group consisting of
  • Injections infusions, tablets, creams, sprays, capsules, syrups, emulsions, powders, powders, suppositories or the like.
  • the pharmaceutical composition is sprays or tablets.
  • Cyclosporinderivat provided with other properties that are desirable to those skilled in the respective application.
  • the cyclosporin derivative according to the invention can be combined with one or more groups, which can be either the same, the same or different.
  • cyclosporin derivative can serve to reinforce already existing properties, but on the other hand it is also possible to provide the cyclosporin derivative with new, further properties. It is conceivable, for example, that the cyclosporin derivative is provided with an indicator in order to control its accumulation in the desired tissue or to be able to classify the desired tissue by means of indicator distribution. It is also conceivable that the
  • Cyclosporin derivative is provided with a group that allows its accumulation in specific tissues.
  • the group that allows its accumulation in specific tissues.
  • Cyclosporin derivative therefore an indicator that may be particularly covalently bonded to the cyclosporin derivative.
  • the indicator may in principle be linked to the cyclosporin derivative in any manner known to those skilled in the art as being suitable for the purpose of the invention.
  • the term "indicator” includes substances such as, for example, dyes, stress-sensitive indicators, pH-sensitive indicators, calcium-sensitive indicators, radioactive elements, NMR labels or else
  • the term “indicator” includes dyes, stress-sensitive
  • Indicators pH-sensitive indicators, radioactive
  • Dyes in the context of the invention are substances that can be detected optically by detecting the emitted by them or not absorbed by them electromagnetic radiation. These include e.g. Dyes like
  • Fluorescein isocyanate FAC
  • fluorescein isothiocyanate FITC
  • DANSC dimethylaminonaphthalene-S-sulfonyl chloride
  • Tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC), lissamine rhodamine B200-sulfonyl chloride (RB 200 SC), etc.
  • TRITC Tetramethylrhodamine isothiocyanate
  • RB 200 SC lissamine rhodamine B200-sulfonyl chloride
  • Voltage-sensitive indicators in the context of the invention are substances which are dependent on an applied electrical potential difference or the present electrical
  • Indicators such as e.g. DIBAC known (Japanese Journal of
  • pH-sensitive indicators within the meaning of the invention are substances which, depending on the pH value, are such
  • Such indicator dyes such as e.g. phenol,
  • Bromothymol blue, bromophenol blue, etc. are known to those skilled in the art.
  • Calcium-sensitive indicators within the meaning of the invention are substances which in the presence of calcium are theirs
  • Calcium-sensitive indicators known to those skilled in the art are e.g.
  • Aequorin and other calcium-sensitive dyes such as e.g. Fura-2.
  • Radioactive elements in the context of the invention produce eg gamma radiation, such as the following isotopes 124 J, 125 J, 128 J, 131 J, 132 J or 51 Cr, with 125 J being particularly preferred. Others, such as 11 C, 18 F, 15 O or 13 N, can by means of their
  • Positron radiation and corresponding detectors positron Emission tomography
  • others such as 111 In
  • NMR labels in the sense of the invention are substances in which atoms with an odd number of nucleons (sum of the protons and neutrons) are contained Such atomic nuclei, such as 13 C, 15 N or 19 F, have a nuclear spin and thus a
  • Microwave absorption of a sample measured in an external magnetic field This makes it possible to detect molecules which have a permanent magnetic moment (unpaired electrons) (Physics in Medicine & Biology 43 (1998), U 3 -U 4, Clinical Chemistry & Laboratory Medicine 46 (2008), 1203-1210).
  • the cyclosporin derivative according to the invention may contain one or more indicator (s), which may be of the same or different nature.
  • a diagnostic procedure e.g., history taking, physical examination
  • the cyclosporin derivative according to the invention also contains one or more indicator (s), the distribution space of the cyclosporin derivative can be recognized on the basis of these indicators.
  • indicators can be used to
  • Cyclosporinderivat invention also free from a
  • Protease interface such as a linker of amino acids, which can serve, for example, the compound of the individual groups. If individual groups are not connected directly, but via a cleavable linker, then it could possibly - for example, an unintended side effect in the
  • Administration of multiple medications - may result in unintentional cleavage and thus loss of the group linked via the linker.
  • Fig. 1 shows the influence of Cs-103 on the number of CD4-positive T cells which migrated into the bronchial mucosa by ovalbumin sensitization
  • Fig. 3 shows the influence of 250 micrograms Cs-103 on the number of
  • Eosinophilic granulocytes which are caused by the Ovalbuminsensibilmaschine immigrated into the bronchial mucous membranes and can be detected in the lung lavage (lavage);
  • Fig. 4 shows the number of leukocytes in the blood before and after
  • Fig. 5 shows the number of leukocytes in the spleen before and after administration of a three-time dose (1st, 3rd and 5th day) of 250 ⁇ g Cs-103 per animal (determination on the 6th day).
  • O-acetyl CsA was prepared according to a protocol of R. Traber et al. Synthesized (HeIv Chim, Acta 1982, 65, 1655-1677). 50 mg of O-acetyl-CsA were dissolved in 20 ml of CCl 4 . Subsequently, a catalytic amount of AIBN and 1 equivalent of NBS were added. Thereafter, the mixture was refluxed for two hours. Then the solvent was evaporated and the residue taken up with 100 ml of AcOEt.
  • Butylbromazetat and 5 mg Benzyltriethylammoniumchlorid added in 1 ml of dichloromethane, treated with 2 ml of 30% NaOH solution and stirred for two hours at room temperature. After dilution with 10 ml of water, the product was extracted twice with ether. After drying the organic phase using MgSO 4 and filtering, the mixture was evaporated in vacuo and the residue was combined with 5 ml of 0.1 M LiOH in 50% methanol and stirred for three hours at room temperature. After acidification to pH 2.5 with HCl, the product Cs-1AO2 was isolated by preparative HPLC.
  • Cyclosporin A (CsA) was treated with 0.1 equivalents of Hoveyda Grubbs catalyst (2nd generation) and 20 equivalents of diethyl maleate refluxed in toluene for 45 hours. After removal of the toluene in vacuo, the residue was dissolved in DCM / MeOH (10: 0.5) and filtered through silica gel. After removal of the organic solvent in vacuo, the residue was dissolved in 5 ml of THF and treated with a 0.2 M LiOH solution. After stirring overnight and neutralizing the solution with HCl, the product was separated by preparative HPLC.
  • Cyclosporin A (CsA) was refluxed with 0.1 equivalents of Hoveyda Grubbs II catalyst and 20 equivalents of diethyl maleate in toluene for 45 hours. After removal of the toluene in vacuo, the residue was dissolved in DCM / MeOH (10: 0.5) and filtered through silica gel. After removal of the organic solvent in vacuo, the residue was dissolved in 5 ml of methanol and palladium-activated carbon catalyst was added under H 2 . After the end of the hydrogenation was filtered and 2 ml of THF and 2 ml of 0.2 M LiOH solution were added. After stirring overnight, it was neutralized with HCl and the product was separated by preparative HPLC.
  • Example 11 Preparation of Cs-IEl
  • O-acetyl CsA was prepared according to a protocol of R. Traber et al. (HeIv. Chim. Acta 1982, 65, 1655-1677) and then dissolved in dichloromethane (DCM). After adding 1.1 equivalents of m-chloroperbenzoic acid, it was stirred for two hours at room temperature. Then the DCM was removed in vacuo and the residue was taken up with 10 equivalents of H-Ala-Ot-Bu and DMF and stirred at 50 ° C. for 5 hours. In vacuo, the DMF was then removed and the residue taken up with AcOEt. The AcOEt extract was taken twice
  • [M + H] + (theoretical m / z cal. 1104.5) can be determined by means of MALDI mass spectrometry.
  • Cells are shown on a cell line by confocal laser scanning microscopy.
  • 10 5 Heia cells were seeded in Petri dishes from Ibidi® ( ⁇ -Dish, 35 mm, high) and incubated for 1-2 days in DME medium (high glucose) at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the examination was carried out on an inverted microscope (Nikon ECLIPSE C1TE2000-E) equipped with a focusing aid, the T-PFS, for a so-called focus drift
  • the fluorophore 5- (6) carboxytetramethylrhodamine was excited by a 561nm laser from Melles & Griot.
  • the cells were first washed twice with 2ml PBS pH 7, 4
  • mice A surgically removed spleen of mice (BALB / c line) was squeezed between slides to make appropriate
  • lymphocyte separation medium Mediatech
  • Microtiter plates (8 ⁇ 12 wells) at a cell density of 6 ⁇ 10 5 cells per cavity in EHAA medium / 5% FCS (Clicks Medium) in the presence of 10 ⁇ g / ml Concanavalin A (ConA), with 2 ⁇ M of Cs-103 , incubated with unmodified cyclosporin A (Sigma) or with 1% ethanol (diluent). After a
  • ovalbumin By administering ovalbumin together with aluminum hydroxide, an immune response to ovalbumin is provoked.
  • the immune response can be determined by the T-cell population (CD4 +) and the immigrated into the bronchial mucosa
  • eosinophilic granulocytes are tracked.
  • mice Female mice (BALB / c line) were resolved by intraperitoneal (ip) administration of 50 ⁇ g ovalbumin in phosphate buffer (PBS) (OVA) plus 100 ⁇ L aluminum hydroxide (alum) at one Total volume of 200 ⁇ L per mouse on day 0 sensitized. The OVA / alum-sensitized mice then became mild
  • Effector / memory CD4 + T cells were distinguished as CD4 + / CD62L " lymphocytes and eosinophilic cells by their scattered light properties (FSC / SSC) The results are summarized in Figures 1-3.
  • Fig. 1 shows the influence of Cs-1033 on the number of CD4-positive T-cells, which by the
  • FIG. 2 shows the influence of 250 ⁇ g Cs-103 on the number of eosinophilic granulocytes (eosinophils) which are produced by ovalbumin sensitization into the bronchial mucous membranes
  • the number of eosinophilic granulocytes in the lung lavage was determined (see Fig. 3). As can be seen from FIG. 3, the administration of 250 ⁇ g Cs-103 reduced the number of eosinophils here as well
  • the selected compound Cs-103 (after three doses of 250 ⁇ g Cs-103 on the 1st, 3rd and 5th day and the cell count on the 6th day) is safe in this assay.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Cyclosporinderivat mit der allgemeinen Formel (I) oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, wobei in der Formel (I) A ein Aminosäurerest der allgemeinen Formel (II) Ist und die Reste R0, R1, B, C, D, E, F, G, H, I, J und K gemäß Anspruch 1 definiert sind.

Description

Cyclosporinderivate
Die vorliegende Erfindung betrifft Cyclosporinderivate, ein Verfahren zur Anreicherung eines Cyclosporinderivats in einem extrazellulären Raum eines multizellularen Objekts, die
Verwendung der erfindungsgemäßen Cyclosporinderivate zur
Herstellung eines Medikaments und eine pharmazeutische
Zusammensetzung, umfassend ein erfindungsgemäßes
Cyclosporinderivat .
Biologisch wirksame Moleküle, bei denen es sich in der Regel um pharmazeutische Wirkstoffe handelt, entfalten ihre Wirkung meist sowohl innerhalb wie auch außerhalb von biologischen Zellen. Dabei ist bisher vornehmlich das Problem aufgetreten, dass Wirkstoffe, die ihre Wirkung nur innerhalb der Zelle entfalten sollen, bereits vor Durchtritt durch die Zellmembran unerwünschte Veränderungen im extrazellulären Raum
verursachen. Hierbei tritt zusätzlich das Problem auf, dass ein und derselbe Wirkstoff innerhalb und außerhalb der Zelle eine unterschiedliche Wirkung entfalten kann. Die eigentliche Wirkung umfasst somit zwei Komponenten - die erwünschte intrazelluläre und die nicht erwünschte extrazelluläre. Soll die intrazelluläre Wirkung erreicht werden, musste. - da der Transport zur Zelle in der Regel die Durchquerung eines extrazellulären Raumes beinhaltet - notwendigerweise oft auch die extrazelluläre (Neben) Wirkung in Kauf genommen werden.
Ein ebenso wichtiges Problem, das im Stand der Technik bisher jedoch nicht beschrieben wurde, ist die Verabreichung von
Wirkstoffen, die ihre Wirkung allein außerhalb der Zelle entfalten sollen bzw. dürfen. Vor allem in der Medizin ist eine Reihe von Wirkstoffen bekannt, die in der Zelle nicht nur nicht die beabsichtigte Wirkung entfalten, sondern sogar toxisch wirken bzw. eine anderweitig schädigende Wirkung verursachen. Hinzu kommt, dass zur Erzielung einer bestimmten, extrazellulären Wirkung eine weit höhere Dosis verabreicht werden muss als eigentlich benötigt, um den „Verlust" der in das Zellinnere abgewanderten Wirkstoffe zu kompensieren.
Wirkstoffe können extrazellulär auf Moleküle oder Strukturen wirken. Solche biologischen Moleküle des Extrazellularraumes können beispielsweise Enzyme, Inhibitoren, Aktivatoren oder Rezeptoren sein. Unter „Strukturen" ist beispielsweise die extrazelluläre Matrix zu verstehen, die aus der Gesamtheit der Makromoleküle, die sich außerhalb der Plasmamembran von Zellen in Geweben und Organen befinden, gebildet ist.
In der gegenwärtigen medizinischen Forschung wichtige
Wirkstoffe sind Effektoren, welche entzündliche Prozesse in biologischen Objekten, vorzugsweise in der Tier- und
Humanmedizin hemmen können. Effektoren von Peptidyl-Prolyl- cis/trans-Isomerasen (PPIasen) , d.h. PPIase-Inhibitoren, sind dabei von besonderer Bedeutung.
Diese Effektoren können zwar zwischen den einzelnen PPIase- Familien (Nature Chemical Biology. 3 (10) : 619-29 , 2007;
Cellular & Molecular Life Sciences. 63 (24) : 2889-900, 2006;
Current Topics in Medicinal Chemistry. 3 (12) : 1315-47 , 2003; Advances in Protein Chemistry. 59:243-82, 2001) unterscheiden, haben aber oft ähnliche Hemmkraft gegenüber Sequenz-ähnlichen Familienmitgliedern. Da PPIasen innerhalb einer Familie unterschiedlichste biochemische Reaktionen beeinflussen können, hängt die diagnostische oder pharmakologische Wirkung verabreichter Wirkstoffe unmittelbar von der erreichten
Konzentration in unterschiedlichsten Verteilungsräumen ab. So sind z.B. einige dieser PPlase-Inhibitoren (z.B. Biopolymers 84(2006)125-146; Chemical & Pharmaceutical Bulletin.
54(3) :372-376, 2006; Chemistry & Biology. 10(l):15-24, 2003; Nucleic Acids Research. 29 (3 ): 767-773 , 2001), wie z.B. das therapeutisch verwendete Cyclosporin in Wasser nur schwer löslich. (DE 19859910). Trotzdem werden nach gewöhnlicher medikamentöser Applikation weitaus höhere Konzentrationen innerhalb von Zellen gefunden. Es wird vermutet, dass die Wirkstoffe durch die Zellmembran wandern und sich dann an intrazellulär vorhandene PPIasen binden. Für ein
Cyclosporinderivat (SDZ IMM 125) konnten so (Anti-Cancer
Drugs. 8 (4) :400-404, 1997; Journal of Pharmacokinetics &
Biopharmaceutics . 22 (5 ): 327-65 , 1994) in Blutzellen etwa 8x höhere Konzentration als im umgebenden Plasma nachgewiesen werden .
Cyclosporin (auch Ciclosporin) ist ein zyklisches Oligopeptid mit immunosuppressiver und calcineurin-hemmender Wirkung. Es zeichnet sich durch einen selektiven und reversiblen
Mechanismus der Immunosuppression aus. Es blockiert selektiv die Aktivierung von T-Lymphozyten über die Produktion von bestimmten Zytokinen, die an der Regulierung dieser T-Zellen beteiligt sind. Dabei wird vor allem die Synthese von
Interleukin-2 gehemmt, wodurch gleichzeitig die Proliferation von zytotoxischen T-Lymphozyten, die z.B. für die Abstoßung von fremdem Gewebe verantwortlich sind, supprimiert wird.
Cyclosporin wirkt intrazellulär durch Bindung an die so genannten Cyclophiline oder Immunophiline, die zur Familie der Cyclosporin-bindenden Proteine gehören. Inhibitoren von Cyclophilinen weisen ein sehr großes therapeutisches Spektrum auf, wie z.B. die Behandlung von Erkrankungen des Atmungstraktes , wie z.B. Asthma, COPD,
Lungenentzündung oder Emphysem (Expert Opinion on
Investigational Drugs 12 (2003), 647-653, Biodrugs 8 (1997) 205-215, American Journal of Respiratory Cell & Molecular Biology 20 (1999), 481-492), StoffWechselerkrankungen wie Diabetes (Transplantation Proceedings 37 (2005), 1857-1860, Molecular Pharmacology 60 (2001), 873-879), entzündliche
Erkrankungen des Verdauungstraktes (Bone Marrow
Transplantation 26 (2000), 545-551, Pharmaceutical Research 20 (2003), 910-917), Störungen des Immunsystems (Immunology
Letters 84 (2002), 137-143, Acta Biochimica Polonica 49
(2002), 233-247, Entzündungen (Journal of Periodontal Research 42 (2007), 580-588, Journal of Neurology, Neurosurgery &
Psychiatry 76 (2005), 1115-1120, Transplant Immunology 12 (2004) , 151-157) , kardiovaskuläre Erkrankungen (Journal of Hypertension 17 (1999), 1707-1713, Drug & Chemical Toxicology 21 (1998), 27-34), neurologische Erkrankungen (Annais of
Vascular Surgery 20 (2006), 243-249), Erkrankungen, die mit einer Störung der Angiogenese einhergehen (Blood Purification 25 (2007), 466-472, International Angiology 24 (2005), 372- 379, Nefrologia 23 (2003), 44-48), zur Unterdrückung der
Immunantwort bei Organtransplantation (Bone Marrow
Transplantation 38 (2006), 169-174), Biodrugs 14 (2000), 185- 193, Clinical Immunotherapeutics 5(1996), 351-373) und von Autoimmunerkrankungen (Immunology & Immunopathology 82(3), 197-202, 1997), Erkrankungen des arthritischen Formenkreises (British Journal of Rheumatology 36 (1997), 808-811, Biodrugs 7 (1997), 376-385), Dermatididen (Veterinary Dermatology 17 (2006), 3-16), Psoriasis (Journal of Dermatological Treatment 16 (2005), 258-277, Hautarzt 44 (1993), 353-360), bei
Allergien (Cornea 27 (2008), 625, Journal of Small Animal Practice 47 (2006), 434-438, Clinical & Experimental Ophthalmology 34 (2006), 347-353), bei multipler Sklerose (Immunopharmacology & Immunotoxicology 21 (1999), 527-549, Journal of Neuroimaging 7 (1997), 1-7), Erkrankungen, die durch eine Ischämie verursacht werden, wie z.B. Infarkte des Herzens (Annais of Thoracic Surgery 86 (2008), 1286-1292, Acta Anaesthesiologica Scandinavica 51 (2007), 909-913), des
Pankreas (Pancreas 32 (2006), 145-151) oder des Hirns (Annais of Vascular Surgery 20 (2006), 243-249, Neurological Research 27 (2005), 827-834), Nierenerkrankungen, wie z.B.
Glomerulonephritis (Nephrology Dialysis Transplantation 19 (2004), 3207, Nephron 91 (2002), 509-511), Geschwulste
(Journal of Investigative Dermatology 128 (2008), 2467-2473, Endocrinology 148 (2007), 4716-4726), bei multiplen Myelomen (Leukemia 12 (1998), 505-509, Leukemia & Lymphoma 16 (1994), 167-170), bei akuter oder chronischer Leukämie (Cancer
Chemotherapy & Pharmacology 52 (2003), 449-452, Cancer 97 (2003), 1481-1487), Muskeldegeneration (Neuroscience Research Communications 31 (2002), 85-92 , Kachexie (International Journal of Cardiology 85 (2002), 173-183, Drugs 58 (1999), 953-963, 1999), Reiter's Syndrom (Rheumatology 40 (2001), 945- 947) , Knochenabbauerkrankungen (European Journal of
Pharmacology 564 (2007), 226-231, Biochemical & Biophysical Research Communications 254 (1999), 248-252), bei der
Alzheimer ' sehen Erkrankung (Biochemical & Biophysical Research Communications 248 (1998), 168-173, Chinese Medical Journal 115 (2002), 884-887), Malaria (Molecular & Biochemical
Parasitology 99 (1999), 167-181), dem septischen und toxischen Schock-Syndrom (Journal of Pharmacology & Experimental
Therapeutics 311 (2004), 1256-1263), Myalgie (British Journal of Dermatology 147 (2002), 606-607), bei einer Infektion mit Viren (Expert Opinion on Emerging Drugs 13 (2008), 393-416), wie z.B. HIV-I, HIV-2, HIV-3 (Journal of Infectious Diseases 194 (2006), 1677-1685, Molecular Medicine Today 1 (1995), 287- 291, 1995), Cytomegaloviren (Journal of Virology 81 (2007), 9013-9023) oder Adenoviren (Ophthalmologe 105 (2008), 592-594, Ophthalmologe 97 (2000), 764-768) und zur Förderung des
Haarwachstums (Archives of Dermatological Research 296(6),
265-269, 2004, Annales de Dermatologie et de Venereologie 127 (2000) , 769) .
Der Komplex aus Cyclosporin und Cyclophilin blockiert
anschliessend die Serin-Threonin-Phosphatase Calcineurin.
Deren Aktivitätszustand steuert wiederum die Aktivierung von Transkriptionsfaktoren wie etwa NF-KappaB oder NFATp/c, welche bei der Aktivierung verschiedener Zytokin-Gene, darunter auch dasjenige für lnterleukin-2 , eine entscheidende Rolle spielen. Hierdurch werden die immunkompetenten Lymphozyten während der GO- oder Gl-Phase des Zellzyklus arretiert, da die für die Zellteilung essentiellen Proteine wie Interleukin-2 nicht mehr produziert werden können. T-HeIfer-Zellen, welche die
Aktivität der für die Abstoßung verantwortlichen zytotoxischen T-Zellen erhöhen, sind der bevorzugte Angriffspunkt für
Cyclosporin.
Daneben inhibiert Cyclosporin die Synthese und Freisetzung weiterer Lymphokine, die für die Proliferation reifer
zytotoxischer T-Lymphozyten und für weitere Funktionen der Lymphozyten zuständig sind. Die Fähigkeit von Cyclosporin, Interleukin-2 zu blockieren, ist für seine klinische
Wirksamkeit maßgeblich: Transplantatempfänger, die ihre
Transplantate gut tolerieren, zeichnen sich durch eine
niedrige Produktion von Interleukin-2 aus. Dagegen ist bei Patienten mit manifester Abstoßungsreaktion keine Hemmung der Interleukin-2-Produktion feststellbar.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, neue,
pharmazeutisch aktive Cyclosporinderivate aufzufinden.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wurde gelöst durch ein Cyclosporinderivat der allgemeinen Formel (I) 10 11
Formel I
Figure imgf000009_0001
7 6 oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, wobei in der Formel (I)
A ein Aminosäurerest der Formel (II) ist,
Formel II
Figure imgf000009_0002
bei dem Ri einem Rest der Formel III
Formel III
Figure imgf000009_0003
entspricht und über das Kohlenstoffatom a kovalent verknüpft ist, oder bei dem Ri einem Rest der Formel IV
R6-Z-R7
Formel IV
Figure imgf000009_0004
entspricht und über das Kohlenstoffatom a kovalent verknüpft ist, oder bei dem Ri einem Rest der Formel V \
F Formel V
entspricht und über das Kohlenstoffatom a kovalent verknüpft ist, oder bei dem Ri einem Rest der Formel VI
\
Formel VI
Figure imgf000010_0001
entspricht und über das Kohlenstoffatom a kovalent verknüpft ist, oder bei dem Ri einem Rest der Formel VII
Formel VII
Figure imgf000010_0002
entspricht und über das Kohlenstoffatom a kovalent verknüpft ist, oder bei dem Rx einem Rest der Formel VIII
Formel VIII
Figure imgf000010_0003
entspricht und über das Kohlenstoffatom a kovalent verknüpft ist, oder bei dem Ri einem Rest der Formel IX entspricht
Figure imgf000011_0001
und über das Kohlenstoffatom a kovalent verknüpft ist, wobei die Gruppe C=O in der Formel II über eine Amidbindung kovalent an einer alpha-Aminogruppe von B gebunden ist und die Gruppe N-R0 in der Formel II über eine Amidbindung kovalent an einer Carboxylgruppe von K gebunden ist,
B ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe bestehend aus:
alpha-Aminobuttersäure,
Alanin,
Threonin,
VaIin,
Norvalin und
in der Seitenkette mit einer Hydroxylgruppe modifizierter alpha-Aminobuttersäure, Alanin, Threonin, Valin oder Norvalin
ausgewählt ist,
C ein Sarkosinrest ist,
D ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe bestehend aus:
Leucin,
N-Methylleucin,
Valin,
gamma-Hydroxy-N-methylleucin und
gamma-Hydroxyleucin
ausgewählt ist,
E ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe bestehend aus:
Valin, Norvalin und
einem modifizierten Valin oder Norvalin, bei dem ein Kohlenstoffatom der Seitenkette mit einer Hydroxylgruppe substituiert ist,
ausgewählt ist,
F ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe bestehend aus:
Leucin,
N-Methylleucin,
gamma-Hydroxy-N-methylleucin und
gamma-Hydroxyleucin
ausgewählt ist,
G ein alpha-Aminobuttersäurerest oder ein Alaninrest ist, H ein D-Alaninrest ist,
I und J Reste sind, die unabhängig voneinander aus der Gruppe, bestehend aus :
Leucin,
N-Methylleucin,
gamma-Hydroxy-N-methylleucin und
gamma-Hydroxyleucin
ausgewählt sind, und
K N-Methylvalinrest oder Valinrest ist, wobei in den Formeln II bis IX R0 für H oder CH3 steht,
X für H oder
Hydroxyl oder
eine Hydroxylgruppe steht, die mit einer Alkanoyl-,
Aryloyl-, Alkylaminocarbonyl- , Arylaminocarbonyl- , Arylalkylaminocarbonyl- , Alkoxycarbonyl- ,
Aryloxycarbonyl- , Arylalkyloxycarbonylgruppe oder einer Silylschutzgruppe derivatisiert ist,
R2 für H oder
einen substituierten oder unsubstituierten
monozyklischen, bizyklischen oder trizyklischen Aryl- oder Heteroarylring, der gegebenenfalls mit R3 substituiert ist, steht,
R3 aus der Gruppe bestehend aus:
-Z-NY-Yi,
-Z-CO-Y,
-Z-S-Y,
-Y2,
-NY-Yi,
-CO-Y,
-S-Y,
-Z-O-Y und
-0-Y
ausgewählt ist,
R4 der Gruppe R2 wie vorstehend definiert entspricht, wobei R4 und R2 gleich oder verschieden voneinander sein können,
Z aus der Gruppe bestehend aus :
einer unverzweigten, verzweigten oder zyklischen Alkylgruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen,
einer unverzweigten, verzweigten oder zyklischen Alkenylgruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen,
einer unverzweigten, verzweigten oder zyklischen Alkinylgruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, einem substituierten oder unsubstituierten
monozyklischen, bizyklischen oder trizyklischen Aryl- oder Heteroarylring und
einer Gruppe der allgemeinen Formel
- [CH2) m-O- (CH2) nl o/ wobei m, n und o unabhängig voneinander ganze Zahlen von 1 bis 20 sind,
ausgewählt ist,
Y aus der Gruppe, bestehend aus:
H,
den geschützten oder ungeschützten Aminosäureresten GIy, D-GIu, D-Asp, D- und L-CyS(SO3H),
ungeschützten Peptidresten mit einer Kettenlänge von 2 bis 200 Aminosäureresten, enthaltend eine
Aminosäureart oder eine Kombination von verschiedenen Aminosäurearten ausgewählt aus GIy, D-GIu, D-Asp, D- und L-CyS(SO3H), einer Alkyl-, Alkenyl-, Aryl-,
Alkylaminocarbonyl- , Arylaminocarbonyl- ,
Arylalkylaminocarbonyl- , Alkylcarboxyl- ,
Alkoxycarbonyl- , Aryloxycarbonyl- und
Arylalkyloxycarbonylgruppe
ausgewählt ist,
Yi der Gruppe Y wie vorstehend definiert entspricht, wobei Y und Yi gleich oder verschieden voneinander sein können,
Y2 für H, F, Cl, Br oder I steht,
R5 aus der Gruppe bestehend aus:
einer Alkyl-, Alkenyl-, Aryl-, Alkylaminocarbonyl-, Arylaminocarbonyl- , Arylalkylaminocarbonyl- ,
Alkylcarbonyl-, Alkoxycarbonyl-, Aryloxycarbonyl-, Arylalkyloxycarbonylgruppe, den Aminosäureresten GIy, D-GIu, D-Asp, D- und L- Cys (SO3H) ,
Peptidresten mit einer Kettenlänge von 2 bis 200 Aminosäureresten, enthaltend eine Aminosäureart oder eine Kombination von verschiedenen Aminosäurarten ausgewählt aus GIy, D-GIu, D-Asp, D- und L-CyS(SO3H), F, Cl, Br und I
ausgewählt ist,
Re aus der Gruppe bestehend aus:
O, N und S,
den geschützten oder ungeschützten Aminosäureresten GIy, D-GIu, D-Asp, D- und L-CyS(SO3H), und
Peptidresten mit einer Kettenlänge von 2 bis 200 Aminosäureresten, enthaltend eine Aminosäureart oder eine Kombination von verschiedenen Aminosäurearten ausgewählt aus GIy, D-GIu, D-Asp, D- und L-CyS(SO3H), ausgewählt ist,
R7 aus der Gruppe bestehend aus:
einer Carboxyl-, Amino-, Thiol-, Hydroxylgruppe,
F, Cl, Br, I,
den geschützten oder ungeschützten Aminosäureresten
GIy, D-GIu, D-Asp, D- und L-CyS(SO3H),
einer Alkyl-, Alkenyl-, Aryl-, Alkylaminocarbonyl- ,
Arylaminocarbonyl- , Arylalkylaminocarbonyl- ,
Alkoxycarbonyl-, Aryloxycarbonyl- und
Arylalkyloxycarbonylgruppe,
Peptidresten mit einer Kettenlänge von 2 bis 200
Aminosäureresten, enthaltend eine Aminosäureart oder eine Kombination von verschiedenen Aminosäurearten ausgewählt aus GIy, D-GIu, D-Asp, D- und L-CyS(SO3H), ausgewählt ist, und R8 der Gruppe R5 wie vorstehend definiert entspricht, wobei Rs und R5 gleich oder verschieden voneinander sein können .
Die erfindungsgemäßen Cyclosporinderivate weisen eine
pharmazeutische Wirksamkeit auf, beispielsweise bei chronisch entzündlichen Erkrankungen.
Die erfindungsgemäßen Cyclosporinderivate können bei pH 6 eine negative Nettoladung aufweisen, weshalb sie bei entsprechenden Bedingungen eine Zellmembran nicht durchwandern können.
Die Bestimmung der Nettoladung einer Peptidsequenz kann in erster Näherung mittels Berechnung, wie dies z.B. in WO
2003/097706 aufgeführt ist, oder genauer durch entsprechende biochemische Experimente wie z.B. mittels isoelektrischer Fokussierung (vgl. Lexikon der Biochemie, 1. Auflage, 2005, Spektrum Akademischer Verlag) oder durch Titration (vgl. z.B. Fresenius' Journal of Analytical Chemistry 274 (1975), 359- 361), Helvetica Chimica Acta 91 (2008), 468-482) ermittelt werden .
Es ist dem Fachmann bekannt, dass sich die Nettoladung eines Moleküls aus der Summe der Teilladungen der einzelnen
funktionellen Gruppen ergibt.
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben gefunden, dass - um das Verbleiben eines erfindungsgemäßen Cyclosporinderivats im extrazellulären Raum sicher zu gewährleisten - das
Cyclosporinderivat ferner keinen Peptidabschnitt umfassen sollte, der in der Lage ist, die Membran einer Zelle zu durchwandern. Unter einem „Peptidabschnitt" wird im Rahmen der Erfindung jeder Abschnitt mit mehr als einer positiv
geladenen, d.h. basischen, Aminosäure verstanden, der in der Lage ist, die Membran einer biologischen Zelle zu durchwandern. Die erfindungsgemäßen Cyclosporinderivate sind daher vorzugsweise frei von einem Peptidabschnitt , der in der Lage ist, die Membran einer biologischen Zelle zu
durchwandern. Ein Peptidabschnitt bzw. ein Peptid, wie er/es nicht Bestandteil des erfindungsgemäßen Cyclosporinderivats sein darf, kann beispielsweise eine oder mehrere Aminosäuren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Arginin, Lysin,
Histidin oder Kombinationen davon, umfassen. Peptide, die besonders gut in der Lage sind die Membran biologischer Zellen zu durchwandern sind insbesondere Peptide aus 5 bis 20 der vorstehend angeführten Aminosäuren.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Cyclosporinderivats entspricht Ri einem Rest der Formel III
Formel III
Figure imgf000017_0001
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des
erfindungsgemäßen Cyclosporinderivats entspricht Ri einem Rest der Formel IV
R6-Z-R7
Formel IV
Figure imgf000017_0002
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des
erfindungsgemäßen Cyclosporinderivats entspricht Ri einem Rest der Formel V
Formel V
Figure imgf000017_0003
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des
erfindungsgemäßen Cyclosporinderivats entspricht Ri einem Rest der Formel VI
\ /R'
Formel VI
Figure imgf000018_0001
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des
erfindungsgemäßen Cyclosporinderivats entspricht Ri einem Rest der Formel VII
Formel VII
Figure imgf000018_0002
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des
erfindungsgemäßen Cyclosporinderivats entspricht Ri einem Rest der Formel VIII
Formel VIII
Figure imgf000018_0003
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des
erfindungsgemäßen Cyclosporinderivats entspricht Ri einem Rest der Formel IX
Figure imgf000018_0004
Formel IX
Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Cyclosporinderivat der Formel (I) ausgewählt aus:
Figure imgf000019_0001
Figure imgf000019_0002
Figure imgf000020_0001
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000022_0001
Figure imgf000023_0001
Figure imgf000023_0002
CS-1E3
Figure imgf000023_0003
Cs-1S2
Figure imgf000024_0001
Cs-109
Figure imgf000024_0002
CS-1WZ3
Figure imgf000025_0001
CS-1O3
Figure imgf000025_0002
Figure imgf000026_0001
CS-1OM4
Figure imgf000026_0002
Figure imgf000027_0001
Cs-3E6
Figure imgf000027_0002
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur
Anreicherung eines Cyclosporinderivats in einem
extrazellulären Raum eines multizellulären Objekts bereit, umfassend die Schritte:
- Bereitstellen eines erfindungsgemäßen Cyclosporinderivats;
- Inkontaktbringen des Cyclosporinderivats mit einem
multizellulären Objekt.
Unter einem „extrazellulären Raum" sollen alle die Bereiche verstanden werden, welche sich außerhalb des Zytosols und der das Zytosol umschließenden Membran befinden. Dazu gehört auch die beispielsweise in Zellsuspensionen vorhandene
Kulturlösung.
Bei dem multizellulären Objekt kann es sich um jedes Objekt handeln, dass aus mindestens zwei gleichen oder
unterschiedlichen biologischen Zellen besteht. Der Begriff „biologische Zelle" umfasst dabei sowohl menschliche,
tierische als auch pflanzliche und bakterielle Zellen sowie einzellige Lebewesen. Handelt es sich bei den biologischen Zellen um bakterielle Zellen oder einzellige Lebewesen, so wird unter dem Begriff „multizelluläres Objekt" eine
Ansammlung mehrerer Zellen, wie beispielsweise eine
Zellkolonie einer Bakterienkultur, verstanden. Handelt es sich bei den biologischen Zellen um menschliche oder tierische
Zellen, so wird unter dem Begriff „multizelluläres Objekt" ein separiertes Körperteil, wie beispielsweise ein Transplantat, insbesondere ein Organ-, ein Zell-, ein Gliedmaßen- oder ein Gewebetransplantat, Blut oder eine Blutfraktion, wie
beispielsweise Blutplasma oder eine in-vitro Kultur
menschlicher und/oder tierischer Zellen, wie beispielsweise eine zweidimensionale Gewebekultur oder eine Spheroidkultur der Zellen, verstanden. Handelt es sich bei den biologischen Zellen um Pflanzenzellen, so wird unter dem Begriff
„multizelluläres Objekt" ein Teil einer Pflanze, wie
beispielsweise Blätter, Wurzel oder Stengel oder auch eine ganze Pflanze verstanden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das multizelluläre Objekt ein separiertes Organ oder Körperteil, Blut oder eine Blutfraktion, eine Zellkultur oder eine Pflanze.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner die Verwendung eines erfindungsgemäßen Cyclosporinderivats als Medikament bereit.
Anwendungsbereiche des erfindungsgemäßen Medikaments können Therapie und Diagnose von Krankheiten aber auch kosmetischer Art sein, wobei unter Therapie im weitesten Sinn auch die Bekämpfung von Schädlingen im Tier- und Pflanzenreich bzw. die Unterstützung von Heilungsprozessen im Tier- und Pflanzenreich aber auch die Beeinflussung biologischer Prozesse in
gewünschter Weise verstanden werden soll. Besondere Vorteile liegen dabei in der Tier- und Humanmedizin, insbesondere bei der Applikation von Stoffen auf oder in Zellsuspensionen, Gewebekulturen, Transplantaten oder dem gesamten Säugetiere.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner die Verwendung eines erfindungsgemäßen Cyclosporinderivats zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer chronischen entzündlichen Erkrankung bereit.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung ist die chronische entzündliche Erkrankung Asthma, rheumatoide Arthritis, Multiple Sklerose, Psoriasis oder ulzerative Kolitis. Die vorliegende Erfindung stellt schließlich ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die ein erfindungsgemäßes Cyclosporinderivat umfasst.
Bei der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung kann es sich dabei um jedwede pharmazeutische Zusammensetzung handeln, die dem Fachmann als geeignet bekannt ist.
Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Cyclosporinderivat in einer Form, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
Injektionen, Infusionen, Tabletten, Cremes, Sprays, Kapseln, Sirupen, Emulsionen, Pudern, Pulvern, Zäpfchen oder Ähnlichen eingesetzt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der pharmazeutischen Zusammensetzung um Sprays oder Tabletten.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann das
Cyclosporinderivat ferner Gruppen umfassen, die das
Cyclosporinderivat mit weiteren Eigenschaften versehen, die für den Fachmann für den jeweiligen Einsatzzweck wünschenswert sind. Dabei kann das erfindungsgemäße Cyclosporinderivat mit einer, aber auch mit mehreren Gruppen verbunden werden, die entweder gleich, gleichartig oder unterschiedlich sein können. Die Aufnahme zusätzlicher Gruppen in das erfindungsgemäße
Cyclosporinderivat kann dabei zum Einen dazu dienen, bereits vorhandene Eigenschaften zu verstärken, zum Anderen ist es aber auch möglich das Cyclosporinderivat mit neuen, weiteren Eigenschaften zu versehen. Es ist beispielsweise denkbar, dass das Cyclosporinderivat mit einem Indikator versehen wird, um dessen Anreicherung im gewünschten Gewebe zu kontrollieren oder um das gewünschte Gewebe mittels Indikatorverteilung klassifizieren zu können. Weiter ist es denkbar, dass das
Cyclosporinderivat mit einer Gruppe versehen wird, die seine Anreicherung in ganz bestimmten Geweben ermöglicht. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das
Cyclosporinderivat daher einen Indikator, der insbesondere kovalent an das Cyclosporinderivat gebunden sein kann. Der Indikator kann jedoch grundsätzlich mit dem Cyclosporinderivat auf jedwede Art verbunden werden, die dem Fachmann als für den erfindungsgemäßen Zweck geeignet bekannt ist.
Unter dem Begriff „Indikator" sind im Sinne der Erfindung Stoffe wie z.B. Farbstoffe, spannungssensitive Indikatoren, pH-Wert-sensitive Indikatoren, Calcium-sensitive Indikatoren, radioaktive Elemente, NMR-Label oder aber auch
Elektronenspinlabel zusammengefasst und in der
wissenschaftlichen Literatur mehrfach beschrieben
(WO/2005/022158, EP 0649022, US 6,596,499, US 7,090,995, US 4,672,044). Der Begriff Indikator umfasst im Sinne der
Erfindung einzelne Atome oder Moleküle, welche kovalent mit dem Cyclosporinderivat verbunden sind. Dabei kann ein
Indikator oder auch mehrere Indikatoren direkt an das
Cyclosporinderivat kovalent gebunden sein. Bevorzugt umfasst der Begriff „Indikator" Farbstoffe, spannungssensitive
Indikatoren, pH-Wert-sensitive Indikatoren, radioaktive
Elemente, Calcium-sensitive Indikatoren, NMR-Label und
Elektrospinlabel .
"Farbstoffe" im Sinne der Erfindung sind Stoffe, die optisch durch Detektion der von ihnen ausgesandten oder der durch sie nicht absorbierten elektromagnetischen Strahlung nachgewiesen werden können. Dazu gehören z.B. Farbstoffe wie
Fluoresceinisocyanat (FIC) , Fluoresceinisothiocyanat (FITC) , Dimethylaminonaphthalin-S-sulfonylchlorid (DANSC) ,
Tetramethylrhodaminisothiocyanat (TRITC) , Lissaminrhodamin- B200-sulfonylchlorid (RB 200 SC) , usw. Eine Beschreibung zahlreicher geeigneter Moleküle ist z.B. bei DeLuca,
"Immunofluorescence Analysis", in „Antibody As A Tool", Marchalonis et al . , Hrsg., John Wiley & Sons, Ltd., Seiten 189-231, (1985) zu finden.
"Spannungssensitive Indikatoren" im Sinne der Erfindung sind Stoffe, die in Abhängigkeit einer anliegenden elektrischen Potentialdifferenz oder des vorliegenden elektrischen
Potentials ihre physikalischen, optischen oder katalytischen Eigenschaften derart ändern, dass diese ein detektierbares Signal hervorrufen. Dem Fachmann sind spannungssensitive
Indikatoren wie z.B. DIBAC bekannt (Japanese Journal of
Pharmacology 86 (2001) , 342-350, American Journal of
Physiology - Heart & Circulatory Physiology 287 (2004) , H985- H993) .
"pH-Wert-sensitive Indikatoren" im Sinne der Erfindung sind Stoffe, die in Abhängigkeit des pH-Wertes derart ihre
physikalischen, optischen oder katalytischen Eigenschaften ändern, dass diese ein detektierbares Signal hervorrufen.
Solche Indikatorfarbstoffe, wie z.B. Phenolrot,
Bromthymolblau, Bromphenolblau, usw. , sind dem Fachmann bekannt .
"Calcium-sensitive Indikatoren" im Sinne der Erfindung sind Stoffe, die in Anwesenheit von Calcium derart ihre
physikalischen, optischen oder katalytischen Eigenschaften ändern, dass diese ein detektierbares Signal hervorrufen. Dem Fachmann bekannte Calcium-sensitive Indikatoren sind z.B.
Aequorin und andere Calcium-sensitive Farbstoffe, wie z.B. FURA-2.
"Radioaktive Elemente" im Sinne der Erfindung erzeugen z.B. Gammastrahlung, wie z.B. folgende Isotope 124J, 125J, 128J, 131J, 132J oder 51Cr, wobei 125J besonders bevorzugt ist. Andere, wie z.B. 11C, 18F, 15O oder 13N, können mittels ihrer
Positronenstrahlung und entsprechender Detektoren (Positronen- Emissions-Tomographie) nachgewiesen werden, und andere, wie z.B. 111In, lassen sich mittels Elektroneneinfang („electron capture" ) nachweisen.
„NMR-Label" im Sinne der Erfindung sind Substanzen, in denen Atome mit ungerader Nukleonenanzahl (Summe der Protonen und Neutronen) enthalten sind. Solche Atomkerne, wie z.B. 13C, 15N oder 19F, besitzen einen Kernspin und damit ein
kernmagnetisches Moment.
„Elektronenspinlabel" dienen im Sinne der Erfindung zur
Messung der „Electron Paramagnetic Resonance" mittels
Elektronenspinresonanz . Dabei wird die resonante
Mikrowellenabsorption einer Probe in einem äußeren Magnetfeld gemessen. Damit lassen sich Moleküle nachweisen, die über ein permanentes magnetisches Moment (ungepaarte Elektronen) verfügen (Physics in Medicine & Biology 43 (1998) , U 3-U 4, Clinical Chemistry & Laboratory Medicine 46 (2008), 1203- 1210) .
Das erfindungsgemäße Cyclosporinderivat kann dabei einen oder auch mehrere Indikator (en) enthalten, die gleicher oder aber auch unterschiedlicher Natur sein können.
Die Verwendung von Indikatoren ist besonders vorteilhaft, wenn das erfindungsgemäße Cyclosporinderivat zur Herstellung eines Medikaments zur Anwendung in einem therapeutischen Verfahren, wie beispielsweise einem Diagnoseverfahren, eingesetzt werden soll (z.B. Anamneseerhebung, körperliche Untersuchung,
Anwendung bildgebender Verfahren wie Röntgen/MRT oder Analytik mit Laborwerten des Bluts und anderen Körperflüssigkeiten) . Wenn das erfindungsgemäße Cyclosporinderivat noch einen oder mehrere Indikator (en) enthält, kann der Verteilungsraum des Cyclosporinderivats anhand dieser Indikatoren erkannt werden. Indikatoren können überdies genutzt werden um das
Cyclosporinderivat zu quantifizieren.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das
erfindungsgemäße Cyclosporinderivat zudem frei von einer
Protease-Schnittstelle, wie einem Linker aus Aminosäuren, der beispielsweise der Verbindung der einzelnen Gruppen dienen kann. Werden einzelne Gruppen nicht direkt, sondern über einen spaltbaren Linker verbunden, so könnte es unter Umständen - beispielsweise eine unbeabsichtigte Nebenwirkung bei der
Verabreichung mehrerer Medikamente - zu einer unbeabsichtigten Spaltung und somit zum Verlust der jeweils über den Linker verknüpften Gruppe kommen.
Beispiele und Figuren
Die vorliegende Erfindung soll nun anhand der folgenden
Beispiele und Figuren näher beschrieben werden. Die Beispiele und Figuren haben dabei rein veranschaulichenden Charakter und sollen den Rahmen der vorliegenden Erfindung keinesfalls einschränken .
Es zeigen
Fig. 1 den Einfluss von Cs-103 auf die Anzahl der CD4- positiven T-Zellen, welche durch die Ovalbuminsensibilisierung in die Bronchialschleimhäute einwanderten;
Fig. 2 den Einfluss von 250 μg Cs-103 auf die Anzahl der eosinophilen Granulozyten (Eosinophile) , welche durch die Ovalbuminsensibilisierung in die Bronchialschleimhäute
einwanderten;
Fig. 3 den Einfluss von 250 μg Cs-103 auf die Anzahl der
Eosinophilen Granulozyten (Eosinophile) , welche durch die Ovalbuminsensibilisierung in die Bronchialschleimhäute einwanderten und sich in der Lungenspülflüssigkeit (Lavage) nachweisen lassen;
Fig. 4 die Anzahl der Leukozyten im Blut vor und nach
Verabreichung einer dreimaligen Dosis (1., 3. und 5. Tag) von 250 μg Cs-103 je Tier (Bestimmung am 6. Tag); und
Fig. 5 die Anzahl der Leukozyten in der Milz vor und nach Verabreichung einer dreimaligen Dosis (1., 3. und 5. Tag) von 250 μg Cs-103 je Tier (Bestimmung am 6. Tag).
Beispiele
Beispiel 1; Synthese von Cs-IHl
Figure imgf000035_0001
100 mg CsA (0,075 mmol) wurden in 11 ml einer Mischung von DMF/H2O/Et3N im Verhältnis von 8:1:1 unter Schutzgas (Argon) gelöst. Dann wurden jeweils 0,4 Äquivalente Pd(OAc)2, PPh3 und Bu4NCl und 20 Äquivalente p-Bromanilin zugesetzt. Nach Erhitzen der Mischung bei 1030C für 5 Stunden wurde die Mischung auf Raumtemperatur abgekühlt und 0,5 Äquivalente AcOEt wurden zugesetzt. Anschließend wurde dreimal mit Kochsalzlösung gewaschen. Danach wurde die AcOEt-Fraktion über MgSO4 filtriert und im Vakuum eingedampft. Das Produkt wurde mittels präparativer HPLC von Verunreinigungen abgetrennt.
Beispiel 2; Synthese von CS-1WZ2
Figure imgf000036_0001
O-Azetyl-CsA wurde entsprechend einer Vorschrift von R. Traber et al. synthetisiert (HeIv. Chim, Acta 1982, 65, 1655-1677) . 50 mg O-Azetyl-CsA wurden in 20 ml CCl4 gelöst. Anschließend wurden eine katalytische Menge von AIBN und 1 Äquivalent NBS zugesetzt. Danach wurde die Mischung für zwei Stunden unter Rückfluss gehalten. Anschließend wurde das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand mit 100 ml AcOEt aufgenommen.
Danach wurde die AcOEt-Lösung nacheinander mit 5%-iger KHSO4- Lösung, gesättigter NaHCθ3-Lösung und Kochsalzlösung gewaschen und anschließend über MgSO4 getrocknet. Nach Abfiltrieren und Eindampfen im Vakuum wurde der Rückstand in einer Lösung von 3 Äqivalenten Methyl-3-mercaptopropionat und 5 Äquivalenten Diisopropylethamin aufgenommen, worauf 5 ml DMF zugegeben wurden. Danach wurde für drei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde DMF im Vakuum entfernt und dem Rückstand wurden 5 ml 0,1 M LiOH in 50%-igem Methanol
zugesetzt. Nach drei Stunden wurde die Reaktion mittels HCl auf pH 2,5 gebracht und anschließend mittels präparativer HPLC das Produkt isoliert. Beispiel 3: Synthese von CS-1AO2
Figure imgf000037_0001
60 mg der Vorstufe Cs-IAOl wurden entsprechend der Vorschrift von Eberle et al . (J. Org. Chem. 1992 , 57, 2689) hergestellt. Danach wurde das Produkt mit einer Lösung aus 20 mg
Butylbromazetat und 5 mg Benzyltriethylammoniumchlorid in 1 ml Dichlormethan aufgenommen, mit 2 ml 30%-iger NaOH-Lösung versetzt und zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Verdünnen mit 10 ml Wasser wurde das Produkt zweimal mit Ether extrahiert. Nach Trocknen der organischen Phase mittels MgSO4 und Filtrieren wurde im Vakuum eingedampft und der Rückstand mit 5 ml 0,1 M LiOH in 50%-igem Methanol versetzt und für drei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Ansäuern mittels HCl auf pH 2 , 5 wurde das Produkt Cs-1AO2 mittels präparativer HPLC isoliert.
Beispiel 4; Herstellung von Cs-IOl
Figure imgf000038_0001
150 mg des Ausgangsproduktes O-Acetyl-CsA-Aldehyd wurde
entsprechend J. Liu et al . (Anal. Biochem 2006, 356, 100-107) hergestellt und anschließend mit 250 mg H-ß-Ala-OH in 30 ml Methanol versetzt. Nach Mischen für 10 Minuten wurden 8 , 5 mg NaBH3CN, gelöst in 500 μl Methanol zugegeben und über Nacht gerührt. Nach Absenken des pH mit HCl auf etwa 1,5 wurde das Methanol im Vakuum abgedampft und der Rückstand in
Kochsalzlösung aufgenommen und das erhaltene Gemisch dreimal mit AcOEt extrahiert. Anschließend wurde mit 5%-iger KHSO4- Lösung, gesättigter NaHCO3-Lösung und Kochsalzlösung gewaschen. Nach Trockenen über MgSO4 und Filtrieren wurde im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde anschließend in einer
Mischung, bestehend aus 15,4 μl AcOH, 104 mg HATU und 145 μl DIPEA, und 1 ml DMF, aufgenommen. Nach Mischen für zwei
Stunden bei Raumtemperatur wurde AcOEt zugegeben und
nacheinander zweimal mit gesättigter NaHCO3, 5%-iger KHSO4 und Kochsalzlösung gewaschen. Nach Trocknen mit MgSO4 und
Filtrieren wurde das Lösungsmittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde in 3 ml THF, gemischt mit 3 ml 0,2 M LiOH, aufgenommen und 4 Stunden gerührt. Nach Ansäuern mit HCl auf einen pH von etwa 1,5 konnte das Produkt mittels präparativer HPLC isoliert werden.
Beispiel 5; Herstellung von Cs-106
Figure imgf000039_0001
40 mg des Ausgangsproduktes O-Acetyl-CsA-Aldehyd wurden entsprechend der Vorschrift von J. Liu et al . (Anal. Biochem. 2006, 356, 100-107) hergestellt und anschließend in 10 ml Methanol gelöst. Zur Lösung wurden anschließend 22 mg 4- Aminobenzoesäure und 3 mg NaBH3CN zugegeben. Nach Rühren über Nacht bei Raumtemperatur wurde die Lösung mittels HCl auf einen pH von 1,5 eingestellt. Anschließend wurde das Methanol verdampft und der Rückstand mit Kochsalzlösung aufgenommen. Danach wurde dreimal mit AcOEt extrahiert und die vereinigten Extrakte nacheinander mit 5%-iger KHSO4, gesättigter NaHCO3 und Kochsalzlösung gewaschen. Nach Trocknen über MgSO4 und
Filtrieren wurde im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde in einer Mischung aus 3 ml THF und 3 ml 0,2 M LiOH aufgenommen und 4 Stunden gerührt. Nach Ansäuern mittels HCl auf einen pH von etwa 1,5 wurde das Produkt mittels präparativer HPLC isoliert . Beispiel 6: Herstellung von Cs-1011
Figure imgf000040_0001
40 mg des Ausgangsproduktes O-Acetyl-CsA-Aldehyd wurden
entsprechend der Vorschrift von J. Liu et al . (Anal. Biochem. 2006, 356, 100-107) hergestellt und anschließend in 10 ml
Methanol gelöst. Zur Lösung wurden danach 3 Äquivalente H-(D- GIu)6-GIy-OH (synthetisiert mittels Festphasen-Peptid-Synthese, ausgehend von D-GIu (Ot-Bu) -OH) und 3 mg NaBH3CN gegeben und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde die Lösung mittels HCl auf einen pH von 1,5 eingestellt. Anschließend wurde das Methanol verdampft und der Rückstand in einer
Mischung von 3 ml THF und 3 ml 0,2 M LiOH aufgenommen. Danach wurde 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Ansäuern mittels HCl auf einen pH von etwa 1,5 wurde das Produkt
mittels präparativer HPLC isoliert. Beispiel 7 ; Herstellung von Cs-ISl
Figure imgf000041_0001
50 mg des Ausgangsproduktes O-Acetyl-CsA-Aldehyd wurden entsprechend der Vorschrift von J. Liu et al . (Anal. Biochem. 2006, 356, 100-107) hergestellt und anschließend in 2 ml
Methanol gelöst. Zur Lösung wurde anschließend bei 5 0C langsam eine Lösung von 3 mg NH4Cl und 3 mg KCN, gelöst in 25%- igem NH3, gegeben. Nach 4 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wurde im Vakuum eingedampft und das Produkt mittels
präparativer HPLC isoliert.
Beispiel 8; Herstellung von Cs-lAdl
Figure imgf000041_0002
60 mg des Ausgangsproduktes O-Acetyl-CsA-Aldehyd wurden entsprechend der Vorschrift von J. Liu et al . (Anal. Biochem. 2006, 356, 100-107) hergestellt und anschließend in THF gelöst und auf -78 0C abgekühlt. Separat wurde eine Mischung aus Diisopropylamin in THF und N-Butyllithium 30 min bei - 78 0C gerührt. Beide Mischungen wurden bei -78 0C vereinigt und bis zum Erreichen von Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde der THF-Überstand im Vakuum entfernt und der Rückstand in AcOEt aufgenommen. Der AcOEt-Extrakt wurde zweimal
nacheinander mit 5%-iger KHSO4-Lösung, gesättigter NaHCO3- Lösung und Kochsalzlösung gewaschen. Nach Trocknen über MgSO4 und Filtrieren wurde im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde in einer Mischung aus 3 ml THF und 3 ml 0,2 M LiOH aufgenommen und 4 Stunden gerührt. Nach Ansäuern mittels HCl auf einen pH von etwa 1,5 wurde das Produkt mittels
präparativer HPLC isoliert.
Beispiel 9; Herstellung von CsM4
Figure imgf000042_0001
Cyclosporin A (CsA) wurde mit 0,1 Äquivalenten Hoveyda-Grubbs- Katalysator (II. Generation) und 20 Äquivalenten Diethylmaleat in Toluol 45 Stunden unter Rückfluß gehalten. Nach Entfernen des Toluols im Vakuum wurde der Rückstand in DCM/MeOH (10:0.5) gelöst und durch Silicagel filtriert. Nach Entfernen des organischen Lösungsmittels im Vakuum wurde der Rückstand in 5 ml THF gelöst und mit einer 0,2 M LiOH-Lösung versetzt. Nach Rühren über Nacht und Neutralisieren der Lösung mit HCl konnte das Produkt mittels präparativer HPLC abgetrennt werden.
Beispiel 10: Herstellung von Cs-1OM3
Figure imgf000043_0001
Cyclosporin A (CsA) wurde mit 0,1 Äquivalenten Hoveyda-Grubbs- Katalysator (II. Generation) und 20 Äquivalenten Diethylmaleat in Toluol 45 Stunden unter Rückfluß gehalten. Nach Entfernen des Toluols im Vakuum wurde der Rückstand in DCM/MeOH (10:0.5) gelöst und durch Silicagel filtriert. Nach Entfernen des organischen Lösungsmittels im Vakuum wurde der Rückstand in 5 ml Methanol gelöst und Palladium-Aktivkohle-Katalysator unter H2 zugegeben. Nach Hydrierungsende wurde filtriert und 2 ml THF sowie 2 ml 0,2 M LiOH-Lösung wurden zugegeben. Nach Rühren über Nacht wurde mit HCl neutralisiert und das Produkt mittels präparativer HPLC abgetrennt . Beispiel 11; Herstellung von Cs-IEl
Figure imgf000044_0001
O-Azetyl-CsA wurde entsprechend einer Vorschrift von R. Traber et al. (HeIv. Chim. Acta 1982, 65, 1655-1677) synthetisiert und anschließend in Dichlormethan (DCM) gelöst. Nach Zugabe von 1,1 Äquivalenten m-Chloroperbenzoesäure wurde zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde das DCM im Vakuum entfernt und der Rückstand mit 10 Äquivalenten H-Ala- Ot-Bu und DMF aufgenommen und bei 50 0C 5 Stunden gerührt. Im Vakuum wurde anschließend das DMF entfernt und der Rückstand mit AcOEt aufgenommen. Der AcOEt-Extrakt wurde zweimal
nacheinander mit 5%-iger KHSO4-Lösung, gesättigter NaHCO3- Lösung und Kochsalzlösung gewaschen. Nach Trocknen über MgSO4 und Filtrieren wurde im Vakuum eingedampft und im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde danach mit voraktivierter Essigsäure (drei Äquivalente Essigsäure, drei Äquivalente HATU, 6 Äquivalente DIPEA in DMF; insgesamt 5 Minuten
aktiviert) versetzt und für zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde DMF im Vakuum entfernt und der Rückstand mit AcOEt aufgenommen. Anschließend wurde der AcOEt- Extrakt nacheinander mit 5%-iger KHSO4-Lösung, gesättigter NaHCO3-Lösung und Kochsalzlösung gewaschen. Nach Trocknen über MgSO4 und Filtrieren wurde im Vakuum eingedampft und im Hochvakuum getrocknet. Dann wurde der Rückstand mit 0,1 M LiOH bis zum Ende der Hydrolyse gerührt. Das Produkt wurde
anschließend mittels präparativer HPLC isoliert.
Beispiel 12; Herstellung von CS-1H2
Figure imgf000045_0001
Zu einer Lösung von 8 mg Cs-IHl (Beispiel 1) in 1 ml DMF wurden 80 mg Bernsteinsäureanhydrid und 223 μl Triethylamin gegeben. Diese Mischung wurde bei Raumtemperatur zwei Tage gerührt. Das Produkt Cs-1H2 konnte direkt aus dem Ansatz mittels präparativer HPLC isoliert werden.
Beispiel 13; Herstellung von CS-1H2-2
2
Figure imgf000046_0001
100 mg Ac- (D-GIu(OMe) ) 6-Glγ-OH (synthetisiert mittels
Festphasen-Peptidsynthese) wurden in 5 ml DMF gelöst und mit 1,1 Äquivalenten HATU und 3 Äquivalenten DIPEA 5 Minuten aktiviert. Anschließend wurde Cs-IHl (Beispiel 1) zugegeben. Nach Rühren des Ansatzes für zwei Stunden bei Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Zum Rest wurden 0,1 M LiOH, gelöst in 50%-igem Methnaol zugegeben und gemischt bis der Methylester vollständig hydrolysiert war. Das
Endprodukt (CS-1H2-2) konnte mittels präparativer HPLC
erhalten werden.
Beispiel 14
Mit dem Verfahren von Beispiel 13, wobei entsprechend andere Edukte eingesetzt wurden, wurden auch die nachstehend gezeigten Cyclosporinderivate Cs-1E3, Cs-lS2 und Cs-109 erhalten:
Figure imgf000047_0001
Cs-1E3
Figure imgf000047_0002
Cs-1S2
Figure imgf000048_0001
CS-1 O9
Beispiel 15
Figure imgf000048_0002
50 mg Cs-1H2 (Beispiel 12), ein Äquivalent HATU und drei
Äquivalente DIPEA in 3 ml DMF wurden 20 min bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde 1 Äquivalent H- (D-GIu) 6-Gly-OH (synthetisiert mittels Festphasen-Peptidsynthese) gelöst in 2 ml DMF zugegeben und die Lösung über Nacht gerührt. Nach dem Filtrieren konnte das Produkt mittels präparativer HPLC isoliert werden. Mit dem Verfahren von Beispiel 13, wobei entsprechend andere Edukte eingesetzt wurden, wurden auch die nachstehend gezeigten Cyclosporinderivate Cs-lWZ3, Cs-1AO3, Cs-103, Cs- 107, Cs-M5, CS-1OM4, Cs-lE2, Cs-3E2, CS-3E6 und Cs-lAd2 erhalten werden:
Figure imgf000049_0001
CS-1WZ3
Figure imgf000049_0002
CS-1AO3
Figure imgf000050_0001
Cs-103
Figure imgf000050_0002
Figure imgf000051_0001
Figure imgf000051_0002
CS-10M4
Figure imgf000052_0001
Figure imgf000052_0002
CS-3E2
Figure imgf000053_0001
CS-3E6
Figure imgf000053_0002
Cs-1 Ad2
Beispiel 16
Herstellung von TAMRA-markiertem Cs-IOl
16a
TAMRA markierter trifunktionaler Linker MM-50
Zu einer Lösung von 5 ( 6 ) -Carboxytamra (130 mg) in 5 ml DMF wurden 114 mg HATU, 154 μl DIPEA und 82 mg HOAt zugegeben. Anschließend wurde die Lösung für 20 Minuten bei Raumtemperatur gemischt und zu einer Lösung von 200 mg des trifunktionalen Linkers MM-50 (Malesevic M, Lücke C, Jahreis G
(2005) Simple and efficient synthesis of new trifunctional templates) . Peptides 2004, Proceedings of the Third
International and Twenty-Eighth European Peptide Symposium, Kenes International, Israel, 391-392) in 5 ml DMF zugegeben. Nach Mischen der Lösung für zwei Stunden bei Raumtemperatur und Filterung wurde DMF im Vakuum entfernt. Nach Abtrennung des Produktes mittels RP HPLC konnte eine Masse von 1105.2
[M+H]+ (theoretisch m/z cal . 1104.5) mittels MALDI- Massenspektrometrie bestimmt werden.
16b
Kupplung des TAMRA markierten trifunktionellen Linkers an Cs-
101
50 mg Cs-101 (Beispiel 4) , ein Äquivalent HATU und drei
Äquivalente DIPEA in 3 ml DMF wurden 20 min bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde 1 Äquivalent des trifunktionellen Linkers gelöst in 2 ml DMF zugegeben und die Lösung über Nacht gerührt. Nach dem Filtrieren konnte das Produkt mittels präparativer HPLC isoliert werden.
Figure imgf000055_0001
Beispiel 17
Aufnahme von chemisch modifizierten CsA-Verbindungen durch Heia Zellen
Der Vorteil vorliegender Entdeckung wird bei der Untersuchung des Transportverhaltens des Cyclosporin-Derivates TAMRA-CS-1S2 deutlich. Die Aufnahme von chemisch modifizierten,
fluoreszierenden CsA-Derivaten in lebende eukaryontische
Zellen wird an einer Zelllinie mittels Konfokaler-Laserscan- Mikroskopie gezeigt. Für denVersuch wurden 105 Heia-Zellen in Petrischalen der Firma Ibidi® (μ-Dish, 35mm, high) eingesät und 1-2 Tage in DME-Medium (high Glucose) bei 370C und 5% CO2 inkubiert .
Die Untersuchung erfolgte an einem inversen Mikroskop (Nikon ECLIPSE C1TE2000-E) , das mit einer Fokussierhilfe, dem T-PFS, ausgestattet ist, um einen sogenannten Focus-Drift zu
verhindern. Für die Aufnahmen wurde ein Objektiv mit
Phasenkontrast (40,Ox Plan Fluor Oilimmersion NA 1,30)
verwendet sowie die Mikroskop eigene Software EZ-Cl 3.7. Die Anregung des Fluorophor 5- (6) Carboxytetramethylrhodamin erfolgte durch einen 561nm Laser von Melles & Griot.
Die Zellen wurden zunächst zweimal mit 2ml PBS pH 7 , 4
(Dulbecco) gewaschen und anschließend in 2ml MIK-Medium aufgenommen (Phenolrot-freies DME-Medium, FCS-frei, mit 2OmM HEPES pH 7,2 und 0,01% Carbencilin) und für 20min bei 370C und 5% CO2 inkubiert. Während der Aufnahmen waren die Zellen in einem Inkubator für Mikroskope (Stage Top Incubator INU series von Tokai Hit®) bei 37°C und 5% CO2. Die Untersuchung wurde durch die Zugabe von in DMSO gelöstem und in MIK-Medium verdünntem 25OnM Csl-Derivat gestartet. Im Fluoreszenzlicht sind die Heia Zellen als fluoreszierende Zellen sichtbar. Das mit einem sauren Peptid versehene Cyclosporinderivat reichert sich nicht innerhalb der Heia-Zellen an. Beispiel 18 a) Präparation und Herstellung mononuklearer Zellen von Mäusen
Eine operativ entfernte Milz von Mäusen (BALB/c-Linie) wurde zwischen Objektgläsern gequetscht, um geeignete
Zellsuspensionen herzustellen. Anschließend wurde die so erhaltene Suspension durch ein Nylonsieb filtriert, um grobe Bestandteile abzutrennen. Die so erhaltenen Zellen wurden zusammen mit einem Lymphozytentrennmedium (Mediatech)
zentrifugiert , um mononukleare Zellen zu erhalten.
Anschließend wurden Zellkulturen dieser Zellen in
Mikrotiterplatten (8 x 12 Kavitäten) bei einer Zelldichte von 6 x 105 Zellen je Kavitat in EHAA Medium/5% FCS (Clicks Medium) in der Gegenwart von 10 μg/ml Concanavalin A (ConA) , mit 2 uM of Cs-103, mit unmodifiziertem Cyclosporin A (Sigma) oder mit 1% Ethanol (Verdünnungsmittel) inkubiert. Nach einer
Kulturzeit von 48 Stunden wurde 1 μCi 3H-Thymidin je Kavität zugegeben und für weitere 6 Stunden inkubiert. Anschließend wurden die Zellen jeder Kavität geerntet (TomTec 96-well
Harvester) und die Radioaktivität der Zellen gemessen (Tri-Lux beta-plate Counter) . b) Asthma-Untersuchungen
Durch Gabe von Ovalbumin zusammen mit Aluminiumhydroxid wird eine Immunantwort gegen Ovalbumin provoziert. Die Immunantwort kann anhand der in die Bronchialschleimhaut eingewanderten T- HeIferzellen-Population (CD4+) und der eingewanderten
eosinophilen Granulozyten verfolgt werden.
Weibliche Mäuse (BALB/c-Linie) wurden durch intraperitoneale (i.p.) Gabe von 50 μg Ovalbumin in Phosphatpuffer (PBS) gelöst (OVA) plus 100 μL Aluminiumhydroxid (alum) bei einem Gesamtvolumen von 200 μL je Maus am Tag 0 sensibilisiert. Den OVA/alum-sensibilisierten Mäusen wurde dann unter milder
Anästhesie (Isofluran) an den Tagen 7 bis 10 intranasal jeweils 100 μg OVA in PBS (50 μL Gesamtvolumen) verabreicht. Aus diesen Tieren wurden Gruppen gebildet, welche zusätzlich an den Tagen 7, 9 und 11 entweder 250 μg CslO3 in PBS (i.p.), nur PBS (Verdünnungsmittel) oder keinen weiteren Zusatz (-) erhielten. Am Tag 12 wurden alle Tiere durch Cθ2-Exposition getötet und Zellen des Bronchialtraktes durch Bronchiallavage (BAL) mittels einer in die Trachea eingeführten Kanüle bei dreimaligem Wasche mit je 1 ml kaltem PBS erhalten. Die erhaltenen Zellen der BAL wurden dann doppelt angefärbt (a) mit Cy-Chrome-konjugierten anti-Maus-CD4-Antikörpern und (b) mit FITC-konjugierten anti-Maus-CD62L-Antikörpern.
Anschliessend wurden die Zellen mittels FACS analysiert.
Effector/Memory-CD4+-T-cells wurden als CD4+/CD62L"-Lymphocyten und eosinophile Zellen anhand ihrer Streulichteigenschaften (FSC/SSC) unterschieden. Die Ergebnisse sind in den Figuren 1 bis 3 zusammengefasst .
Die Fig. 1 zeigt den Einfluss von Cs-lO3 auf die Anzahl der CD4-positiven T-Zellen, welche durch die
Ovalbuminsensibilisierung in die Bronchialschleimhäute
einwanderten. Die mit OVA sensibiliserten Tiere dienten als Kontrolle. Aus der Fig. 1 ist ersichtlich, dass die Gabe von Cs-103 die Anzahl der CD4 positiven T-Zellen sehr signifikant reduzierte .
Die Fig. 2 zeigt den Einfluss von 250 μg Cs-103 auf die Anzahl der eosinophilen Granulozyten (Eosinophile) , welche durch die Ovalbuminsensibilisierung in die Bronchialschleimhäute
einwanderten. Die mit OVA sensibiliserten Tiere dienten als Kontrolle. Aus der Fig. 1 ist ersichtlich, dass die Gabe von Cs-103 die Anzahl der eosinophilen Granulozyten sehr
signifikant reduzierte. Zur Kontrolle wurde die Anzahl der eosinophilen Granulozyten in der Lungenspülflüssigkeit (Lavage) bestimmt (vgl. Fig. 3). Wie es aus der Fig. 3 ersichtlich ist, reduzierte auch hier die Gabe von 250 μg Cs-103 die Anzahl der eosinophilen
Granulozyten sehr signifikant. b) Toxizitätstest
Da bei entzündlichen Erkrankungen die Leukozytenzahl in Blut und Milz ansteigt, wurde die Zahl dieser Zellen als Toxizitätsmarker genutzt. Wie es die Figuren 4 und 5 zeigen, ist die ausgewählte Verbindung Cs-103 (nach dreimaliger Gabe von 250 μg Cs-103 am 1., 3. und 5. Tag und der Zellzahlbestimmung am 6. Tag) in diesem Assay unbedenklich.

Claims

Patentansprüche
1. Cyclosporinderivat der allgemeinen Formel (I)
10 11
Formel I
Figure imgf000060_0001
7 6 oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, wobei in Formel (I)
A ein Aminosäurerest der Formel (II) ist,
Formel II
Figure imgf000060_0002
bei dem R1 einem Rest der Formel III
Formel III
Figure imgf000060_0003
entspricht, der über das Kohlenstoffatom a kovalent verknüpft ist, oder bei dem R1 einem Rest der Formel IV
R6-Z-R7
Formel IV
Figure imgf000060_0004
entspricht, der über das Kohlenstoffatom a kovalent verknüpft ist, oder bei dem Ri einem Rest der Formel V
R5
Formel V
Figure imgf000061_0001
entspricht, der über das Kohlenstoffatom a kovalent verknüpft ist, oder bei dem Ri einem Rest der Formel VI
Formel VI
Figure imgf000061_0002
entspricht, der über das Kohlenstoffatom a kovalent verknüpft ist, oder bei dem Ri einem Rest der Formel VII
Formel VII
Figure imgf000061_0003
entspricht, der über das Kohlenstoffatom a kovalent verknüpft ist, oder bei dem Rx einem Rest der Formel VIII
Formel VIII
Figure imgf000061_0004
entspricht, der über das Kohlenstoffatom a kovalent verknüpft ist, oder bei dem Ri einem Rest der Formel IX entspricht
Formel IX
Figure imgf000062_0001
der über das Kohlenstoffatom a kovalent verknüpft ist, wobei die Gruppe C=O in der Formel II über eine Amidbindung kovalent an einer alpha-Aminogruppe von B gebunden ist und die Gruppe N-R0 in der Formel II über eine Amidbindung kovalent an einer Carboxylgruppe von K gebunden ist,
B ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe bestehend aus:
alpha-Aminobuttersäure,
Alanin,
Threonin,
Valin,
Norvalin und
in der Seitenkette mit einer Hydroxylgruppe modifizierter alpha-Aminobuttersäure, Alanin, Threonin, Valin oder Norvalin
ausgewählt ist,
C ein Sarkosinrest ist,
D ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe bestehend aus:
Leucin,
N-Methylleucin,
Valin,
gamma-Hydroxy-N-methylleucin und
gamma-Hydroxyleucin
ausgewählt ist,
E ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe bestehend aus: VaI in ,
Norvalin und
einem modifizierten Valin oder Norvalin, bei dem ein Kohlenstoffatom der Seitenkette mit einer Hydroxylgruppe substituiert ist,
ausgewählt ist,
F ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe bestehend aus:
Leucin,
N-Methylleucin,
gamma-Hydroxy-N-methylleucin und
gamma-Hydroxyleucin
ausgewählt ist,
G ein alpha-Aminobuttersäurerest oder ein Alaninrest ist, H ein D-Alaninrest ist,
I und J Reste sind, die unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus :
Leucin,
N-Methylleucin,
gamma-Hydroxy-N-methylleucin und
gamma-Hydroxyleucin
ausgewählt sind, und
K ein N-Methylvalinrest oder ein Valinrest ist, wobei in den Formeln II bis IX R0 für H oder CH3 steht,
X für H oder
Hydroxyl oder eine Hydroxylgruppe steht, die mit einer Alkanoyl-, Aryloyl-, Alkylaminocarbonyl- , Arylaminocarbonyl- , Arylalkylaminocarbonyl- , Alkoxycarbonyl- ,
Aryloxycarbonyl-, Arylalkyloxycarbonylgruppe oder einer Silylschutzgruppe derivatisiert ist,
R2 für H oder
einen substituierten oder unsubstituierten
monozyklischen, bizyklischen oder trizyklischen Aryl- oder Heteroarylring, der gegebenenfalls mit R3 substituiert ist, steht,
R3 aus der Gruppe bestehend aus:
-Z-NY-Yi,
-Z-CO-Y,
-Z-S-Y,
-Y2,
-NY-Yi,
-CO-Y,
-S-Y,
-Z-O-Y und
-O-Y
ausgewählt ist,
R4 der Gruppe R2 wie vorstehend definiert entspricht, wobei R4 und R2 gleich oder verschieden voneinander sein können,
Z aus der Gruppe bestehend aus:
einer unverzweigten, verzweigten oder zyklischen Alkylgruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen,
einer unverzweigten, verzweigten oder zyklischen Alkenylgruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen,
einer unverzweigten, verzweigten oder zyklischen Alkinylgruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, einem substituierten oder unsubstituierten
monozyklischen, bizyklischen oder trizyklischen Aryl- oder Heteroarylring und
einer Gruppe der allgemeinen Formel
- [CH2) m-O- (CH2) n. o/ wobei m, n und o unabhängig voneinander ganze Zahlen von 1 bis 20 sind,
ausgewählt ist,
Y aus der Gruppe bestehend aus:
H,
den geschützten oder ungeschützten Aminosäureresten GIy, D-GIu, D-Asp, D- und L-CyS(SO3H),
ungeschützten Peptidresten mit einer Kettenlänge von 2 bis 200 Aminosäureresten, enthaltend eine
Aminosäureart oder eine Kombination von verschiedenen Aminosäurearten ausgewählt aus GIy, D-GIu, D-Asp, D- und L-CyS(SO3H), einer Alkyl-, Alkenyl-, Aryl-,
Alkylaminocarbonyl- , Arylaminocarbonyl- ,
Arylalkylaminocarbonyl- , Alkylcarboxyl- ,
Alkoxycarbonyl- , Aryloxycarbonyl- und
Arylalkyloxycarbonylgruppe
ausgewählt ist,
Yi der Gruppe Y wie vorstehend definiert entspricht, wobei Y und Yi gleich oder verschieden voneinander sein können,
Y2 für H, F, Cl, Br oder I steht,
R5 aus der Gruppe bestehend aus:
einer Alkyl-, Alkenyl-, Aryl-, Alkylaminocarbonyl-, Arylaminocarbonyl- , Arylalkylaminocarbonyl- ,
Alkylcarbonyl- , Alkoxycarbonyl-, Aryloxycarbonyl-, Arylalkyloxycarbonylgruppe, den Aminosäureresten GIy, D-GIu, D-Asp, D- und L- Cys (SO3H) ,
Peptidresten mit einer Kettenlänge von 2 bis 200 Aminosäureresten, enthaltend eine Aminosäureart oder eine Kombination von verschiedenen Aminosäurearten, ausgewählt aus GIy, D-GIu, D-Asp, D- und L-CyS(SO3H), F, Cl, Br und I
ausgewählt ist,
R6 aus der Gruppe bestehend aus:
O, N und S,
den geschützten oder ungeschützten Aminosäureresten GIy, D-GIu, D-Asp, D- und L-CyS(SO3H), und
Peptidresten mit einer Kettenlänge von 2 bis 200 Aminosäureresten, enthaltend eine Aminosäureart oder eine Kombination von verschiedenen Aminosäurearten ausgewählt aus GIy, D-GIu, D-Asp, D- und L-CyS(SO3H), ausgewählt ist,
R7 aus der Gruppe bestehend aus:
einer Carboxyl-, Amino-, Thiol-, Hydroxylgruppe,
F, Cl, Br, I,
den geschützten oder ungeschützten Aminosäureresten
GIy, D-GIu, D-Asp, D- und L-CyS(SO3H),
einer Alkyl-, Alkenyl-, Aryl-, Alkylaminocarbonyl- ,
Arylaminocarbonyl- , Arylalkylaminocarbonyl- ,
Alkoxycarbonyl-, Aryloxycarbonyl- und
Arylalkyloxycarbonylgruppe,
Peptidresten mit einer Kettenlänge von 2 bis 200
Aminosäureresten, enthaltend eine Aminosäureart oder eine Kombination von verschiedenen Aminosäurearten ausgewählt aus GIy, D-GIu, D-Asp, D- und L-CyS(SO3H), ausgewählt ist, und Ra der Gruppe R5 wie vorstehend definiert entspricht, wobei Ra und R5 gleich oder verschieden voneinander sein können .
2. Cyclosporinderivat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Ri einem Rest der Formel III
Formel III
Figure imgf000067_0001
entspricht, der über das Kohlenstoffatom a kovalent
verknüpft ist.
3. Cyclosporinderivat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Ri einem Rest der Formel IV
R6-Z-R7
Formel IV
Figure imgf000067_0002
entspricht, der über das Kohlenstoffatom a kovalent
verknüpft ist.
4. Cyclosporinderivat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Ri einem Rest der Formel V
R5
\ ^Z-R
. NM Formel V
entspricht, der über das Kohlenstoffatom a kovalent
verknüpft ist.
5. Cyclosporinderivat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Ri einem Rest der Formel VI Formel VI
Figure imgf000068_0001
entspricht, der über das Kohlenstoffatom a kovalent
verknüpft ist.
6. Cyclosporinderivat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Ri einem Rest der Formel VII
Formel VII
Figure imgf000068_0002
entspricht, der über das Kohlenstoffatom a kovalent
verknüpft ist.
7. Cyclosporinderivat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Ri einem Rest der Formel VIII
Formel VIII
Figure imgf000068_0003
entspricht, der über das Kohlenstoffatom a kovalent
verknüpft ist.
8. Cyclosporinderivat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Ri einem Rest der Formel IX entspricht
Formel IX
Figure imgf000068_0004
der über das Kohlenstoffatom a kovalent verknüpft ist.
9. Cyclosporinderivat nach Anspruch 1, wobei das Cyclosporinderivat ausgewählt ist aus:
Figure imgf000069_0001
Figure imgf000069_0002
Figure imgf000069_0003
Figure imgf000070_0001
Figure imgf000071_0001
Figure imgf000071_0002
Figure imgf000072_0001
Figure imgf000072_0002
Figure imgf000073_0001
Figure imgf000073_0002
Figure imgf000073_0003
CS-1S2
Figure imgf000074_0001
Cs-109
Figure imgf000074_0002
CS-1WZ3
Figure imgf000075_0001
Figure imgf000076_0001
Figure imgf000076_0002
Figure imgf000076_0003
Figure imgf000077_0001
CS-3E2
Figure imgf000077_0002
Cs-3E6 und
Figure imgf000077_0003
10. Verfahren zur Anreicherung eines Cyclosporinderivats in einem extrazellulären Raum eines multizellulären Objekts, umfassend die Schritte:
- Bereitstellen eines Cyclosporinderivats nach einem der Ansprüche 1 bis 9;
- Inkontaktbringen des Cyclosporinderivats mit einem
multizellulären Objekt.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das multizelluläre Objekt ein separiertes Organ oder
Körperteil, Blut oder eine Blutfraktion, eine Zellkultur oder eine Pflanze ist.
12. Verwendung eines Cyclosporinderivats nach einem der
Ansprüche 1 bis 9 als Medikament .
13. Verwendung eines Cyclosporinderivats nach einem der
Ansprüche 1 bis 9 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer chronischen entzündlichen Erkrankung.
14. Verwendung nach Anspruch 13, wobei die chronische
entzündliche Erkrankung Asthma, rheumatoide Arthritis, Multiple Sklerose, Psoriasis oder ulzerative Kolitis ist.
15. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Cyclosporinderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 9.
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