WO2011011971A1

WO2011011971A1 - Orf7缺陷型水痘病毒、含有该病毒的疫苗及应用

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Publication number: WO2011011971A1
Application number: PCT/CN2010/001139
Authority: WO
Inventors: 朱桦; 李益民; 夏宁邵; 程通; 叶祥忠
Original assignee: 新泽西医学院; 北京万泰生物药业股份有限公司; 厦门大学
Priority date: 2009-07-28
Filing date: 2010-07-27
Publication date: 2011-02-03
Also published as: EP2460878A9; JP2013500024A; EP2460878B1; CN105770886B; US20200277577A1; CA2768887C; JP5767635B2; CN101967466A; EP2460878A1; EP2460878A4; CN105770886A; US20130295124A1; CN102666842B; US10752885B2; CA2768887A1; CN102666842A; US11220673B2; US9885020B2; US20180208905A1; AU2010278594B2

Description

0RF7缺陷型水痘病毒、含有该病毒的疫苗及应用技术领域

本发明属于病毒学和生物药学领域。具体而言，本发明提供了 0RF7缺陷型水痘病毒、含有该病毒的疫苗及其应用，为水痘- 带状疱疹病毒等的预防提供良好的候选疫苗药物。技术背景

7j痘-带状渗病毒 ( Var icel la zos ter virus: VZV, 简称 "水痘病毒" 或 "VZV" ；)是严格种属特异性的病毒，是导致人患水痘或带状疱疹的致病因子。其中， P-0ka株是由 Takahashi等于 1971年在日本 Oka姓氏的 3岁男孩的水痘嚢泡液中分离出来的，并经人胚肺细胞培养获得的，被认为具有引发水痘和带状疱疹功能 ( Takahashi M, Otsuka T， Okuno Y, et al. Live vaccine used to prevent the spread of var icel la in chi ldren in hospi tal. Lancet 1974; 2: 1288 - 90. ) 。

美国专利 3985615 中公开了 P- Oka 株通过豚鼠胚胎组织 ( GPEC )和人胚肺细胞多次传代，产生减毒的 V-0ka病毒，制备预防水痘的 V-0ka活疫苗。美国专利 4000256中叙述了用人胚成纤维细胞 WI-38株传代培养 VZV病毒 10-80次生产 VZV减毒疫苗。但迄今为止，只有 Ρ-Oka株经细胞传代获得的 "水痘病毒减毒冈株" （特公昭 53- 41202号公报； Lancet 2： 1288-1290, 1974 ) 为 WHO批准的唯一用于预防水痘或带状疱疹疫苗制备的毒株，该毒株制备的疫苗在全球得到了广泛使用 [Requirement for Var icel la Vaccine (Live) Adopted 1984: WHO Technica l Report Ser ies, No. 725, pp. 102-104, 1985]。但是，尽管水痘疫苗接种的人群比水痘自然感染人群的带状疱疹发生率低，且大多为免疫功能低下儿童，但是，带状疱疹发生是不争的事实，且从患者的疱疹中分离到 V-Oka株 ( Schmid D. S， et al. Impact of Var icel la Vaccine on Varicel la-Zoster Virus Dynamics ， CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, Jan. 2010， p. 202 - 217 ) 。

专利 CN1163604C涉及水痘病毒减毒岡株的鉴定，并且从分子水平上揭示该毒株是由多个不同序列组成的混合株。野毒株可能存在于其中，源于 V-0ka疫苗接种者产生 V-0ka株的带状疱疹已有报道。故该减毒林的潜在危害性还是存在的，但是，现在还没有其它预防 VZV的疫苗株上市。该病毒具有严格种属特异性，人是其唯一的自然宿主，没有合适的动物模型研究 VZV基因功能；再者该病毒对宿主细胞具有强结合性，游离的病毒极易失活，获得可供转化的 VZV病毒 DNA非常困难，故很长时间以来该病毒基因功能研究的进展极为緩慢。

但是，随着细菌人工染色体（BAC)在研究中的应用，组织培养技术的进步，异种生物间器官移植屏障的突破（联合免疫缺陷型小鼠的开发），拓宽了种属特异的 VZV基因功能研究的空间，可以在体外或移植到动物体内进行 VZV 基因功能研究。 2004 年 Kazuhiro N.等在 " Cloning of the var icel la-zos ter virus genome as an infect ious bacter ia l art if ic ia l chromosome in Escher ichia col i" —文中揭示被克隆到 BAC载体上的 VZV Oka 株全基因组，可以在大肠杆菌和人胚肺细胞中增殖， BAC 可被一同转化到人胚肺细胞中的 Cre酶精确切除，产生的重组 VZV病毒具有 p-0ka 同样结构，完全具有亲本病毒的特性。 BAC的应用为 VZV的功能研究带来了极大便利，可以对 VZV每个基因进行功能研究，加速了 VZV基因功能研究的进程。水痘-带状疱疹病毒（ VZV ) 的 0RF7 位于病毒基因组的 8607-9386bp之间，编码一个 29kDa的蛋白，可能位于皮层结构中，它的功能目前仍不清楚。

本发明人经过不懈的研究，惊奇地发现， 0RF7决定着 VZV感染人皮肤和感觉神经节的功能。当 0RF7缺陷即发生如下情况之一：全部或部分缺失、被插入终止密码子，以及被一个或多个碱基取代，特别是删除了 0RF7或者 0RF7产生翻转反向移码突变时， 0RF7的功能丧失，即 VZV不感染皮肤和感觉神经节，故不存在产生水痘或再活化产生带状疱疹的潜在危害（我们在本发明中称之为 0RF7缺陷引起的功能丧失，所述功能是指能够感染人的皮肤和感觉神经节）。 0RF7删除的水痘病毒株（VZV-7D BAC或 VZV-7DRM BAC )可以在大肠杆菌中进一步经抗生素筛选或半乳糖筛选（麦糠基氏培养机上产生亮红色斑）得到单一克隆株，不存于混合型 V-Oka株的潜在危害，这为开发更加安全有效的疫苗带来了希望。发明内容

本发明的一个方面涉及一种水痘病毒（例如 P-0ka株），其基因组 0RF7全部或部分缺失、或者被一个或多个碱基取代或插入，并且所述的水痘病毒不能够感染人的皮肤和感觉神经节。

0RF7 ( 8607-9386bp ) 的序列如下：

ATGCAGACGGTGTGTGCCAGCTTATGTGGATATGCTCGAATACCAAGTGAAGAGCCATCTTATGAAG AGGTGCGTGTAAACACGCACCCCCAAGGAGCCGCCCTGCTCCGCCTCCAAGAGGCTTTAACCGCTGTGAAT GGATTATTGCCTGCACCTCTAACGTTAGAAGACGTAGTCGCTTCTGCAGATAATACCCGTCGTTTGGTCCG CGCCCAGGCTTTGGCGCGAACTTACGCTGCATGTTCTCGTAACATTGAATGTTTAAAACAGCACCATTTTA CTGAAGATAACCCCGGTCTTAACGCCGTGGTCCGTTCACACATGGAAAACTCAAAACGGCTTGCTGATATG TGTTTAGCTGCAATTACCCATTTGTATTTATCGGTTGGCGCGGTGGATGTTACTACGGATGATATTGTCGA TCAAACCCTGAGAATGACCGCTGAAAGTGAAGTGGTCATGTCTGATGTTGTTCTTTTGGAGAAAACTCTTG GGGTCGTTGCTAAACCTCAGGCATCGTTTGATGTTTCCCACAACCATGAATTATCTATAGCTAAAGGGGAA AATGTGGGTTTAAAAACATCACCTATTAAATCGGAGGCGACACAATTATCTGAAATTAAACCCCCACTTAT AGAAGTATCGGATAATAACACATCTAACCTAACAAAAAAAACGTATCCGACAGAAACTCTTCAGCCCGTGT TGACCCCAAAACAGACGCAAGATGTACAACGCACAACCCCCGCGATCAAGAAATCCCATGTTATGCTTGTA TAA ( SEQ ID NO: 1 )

在本发明的一个实施方案中，0RF7全部或部分被抗生素抗性基因和 /或者无功能的核酸序列所取代。所述无功能的核酸序列是指该核酸序列不使 0RF7功能恢复，即水痘病毒仍不能感染皮肤和感觉神经节，该无功能的核酸序列可以是不编码融合蛋白的，也可以是编码蛋白的核^^列，只要所编码的蛋白不会使 0RF7功能的恢复。在本发明的一个实施方案中，所述无功能的核酸序列是翻转反向移码突变的 0RF7片段。

术语 "0RF7片段" 是指 0RF7的全部或部分核酸序列。

在本发明的一个实施方案中，所述翻转反向移码突变的 0RF7 片段的序列如 SEQ ID NO: 13所示。

在本发明的一个实施方案中，所述抗生素抗性基因选自：青霉素、链霉素、以及卡那霉素的抗性基因。

在一个具体的实施方式中，发明人以来自斯坦福大学医学院 Dr. Ann Arvin实验室的 P-Oka临床分离株为材料，以 VZV-BAC ( P-Oka ) 为框架，应用细菌同源重组原理产生重组克隆。全长 0RF7被 Kan 基因取代而产生 VZV-7D BAC株或被翻转反向移码突变的 0RF7部分片段取代而产生 VZV-7DRM BAC株。其中， Kan^r基因的序列如下：

ATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATT TATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAG CCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGT CAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCGGTACTCCTGATGATG CGTGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGAAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGT GAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTT TAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTTGTTGATGCGAGTG ATTTTGATGACGAGCATAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAACTTTTGCCATTC TCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAAT AGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCC TCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAAT AAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAA ( SEQ ID NO: 2 )

具体地，本发明提供一种水痘病毒，其保藏编号为 CGMCC No. 3207，保藏日期 2009年 7月 28 日，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

体内外实验证实该病毒株不感染人皮肤和感觉神经节，故极可能不存在引发水痘或再活化产生带状疱疹的潜在危害；该毒株可在 MRC-5、 Mewo、或 ARPE细胞上生长，且同 P- Oka株生长特性一致，并且也没有改变病毒在胸腺组织的生长增殖特性；该毒株保留了 Ρ-Oka株的所有糖蛋白，其免疫原性理应同 Ρ-Oka株的免疫力相同；该毒林是通过 Kan 筛选或半乳糖筛选单一克隆株，不存于混合型 V-0ka株的潜在危害；由于整个 0RF7删除，或以翻转反向移码突变， VZV-7D BAC 或 VZV- 7DRM BAC株不可能产生回复突变，因而，以 VZV-7D BAC或 VZV-7DRM BAC株制备减毒活疫苗更为安全和有效。本发明的另一方面涉及上述的水痘病毒的制备方法，包括如下步驟：

1 )将野生型水痘病毒的基因组克隆到 BAC载体上，然后通过细菌内重组，使得水痘病毒的基因组 0RF7全部或部分缺失、或者被一个或多个碱基取代或插入，导致得到的水痘病毒不能够感染人的皮肤和感觉神经节；

2 )分离 1 ) 中得到的水痘病毒的 DNA，并与含 Cre酶的重组质粒共转染 Mewo细胞或 MRC-5细胞或 ARPE细胞；

3 )通过 Cre酶的作用在 Mewo细胞或 MRC-5细胞或 ARPE细胞中删除 BAC。在本发明的一个实施方案中，所述野生型水痘病毒是 P- Oka株，并且步骤 1 ) 中所述的 0RF7被 Kan^f取代，或者翻转反向移码突变的 0RF7 片段所取代。在一个具体的实施方式中，所述翻转反向移码突变的 0RF7片段是 SEQ ID NO: 13。本发明的还一方面涉及一种组合物，其含有上述的任一种水痘病毒 ₀

本发明的还一方面涉及一种预防水痘和 /或带状疱疹的疫苗，其含有上所述的任一种水痘病毒，以及疫苗用赋形剂或载体。

在本发明中，术语 "预防水痘和 /或带状疱疹的疫苗" 是指水痘疫苗、带状疱疹疫苗、以及预防水痘和带状疱疹的疫苗。

本发明的还一方面涉及上述的任一种水痘病毒在制备预防水痘和 /或带状疱疹的疫苗中的用途。

本发明的还一方面涉及上述的任一种水痘病毒的 DNA在制备表达载体中的用途。

发明的还一方面涉及一种表达载体，其由 BAC和插入到 BAC中的上述的任一种水痘病毒的 DNA组成。一种表达载体，其为上述的任一种水痘病毒的 DNA。上述的表达载体至少可以插入 10kb的外源基因而不影响其本身生长和增殖，可用于 ^Ji外源基因，并且所述表达载体由于 0RF7功能缺失而变得安全。也可以将该表达载体用荧光素酶基因标记（ Zhang et a l. Journa l of Virology, Sept, 2007 P9024-9033 ) ，用于体内外 VZV-7DRM功能研究的监测。

发明的还一方面涉及一种重组载体，其含有上述的表达载体以及插入的外源基因。

发明的还一方面涉及一种重组细胞，其含有上述的表达载体或重组载体。本发明的一个实施方案中，所述重组细胞所用的宿主细胞选自如下细胞：

MRC-5、 Mewo、 ARPE、 2BS、 WI-38、以及 KMB17。

本发明的还一方面涉及一种预防水痘和 /或带状疱疹的方法，包括给予患者接种有效量的上述疫苗的步骤。

在本发明中，术语 "DPI" 是 "days pos t infect ion" 的缩写，是指病毒感染后的天数。附图说明

Fig. 1： p-0ka BAC ( VZV BAC )载体构建。

Fig. 2: 0RF7缺失 BAC株 ( VZV-7D BAC ) 的制备。

Fig. 3: 0RF7缺失的 VZV病毒的电泳鉴定。

Fig. 4： VZV-7D病毒的背根神经节培养。 A. 野生型（WT )、回复突变型（7R ) 、缺陷型（7D )在 MeMo细胞中的生长曲线。 B. 野生型（WT )、回复突变型（7R )、缺陷型 D )在背根神经节（DRG ) 中的生长曲线。

Fig. 5： 0RF-7回复突变（ VZV-7R )水痘病毒的制备。

Fig. 6: 带有荧光标记的（ luc ) VZV-7DRM病毒在人体 MeWo细胞中生长曲线。

Fig. 7: 带有荧光标记的（ luc ) VZV- 7DRM病毒在人胸腺组织培养（T0C )物中的生长曲线。

Fig. 8: 带有荧光标记的（ luc ) VZV-7DRM病毒在人皮肤组织培养（S0C )物中的生长曲线。

Fig. 9: A. 用 WT、 VZV- 7DRM和 VZV-7R的 DNA转染 MeWo细胞和神经细胞瘤（SH-SY5Y ) 细胞。 VZV-7DRM不能在神经细胞瘤细胞中生长。 B. 背根神经节（DRG )从人胚胎的脊髓中分离所得。 C. DRG 被移植到重症联合免疫缺陷（SCID-hu ) 小鼠的肾嚢里， WT 或 VZV-7DRM病毒感染 DRG, 用 IVIS仪器测试病毒生长， VZV-7DRM不能在 SCID-hu鼠（植入人组织的重症联合免疫缺陷鼠）中生长。 D. 感染后 GFP强度增加显示，野生型（WT ) VZV能够在 DRG培养物中生长。具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件（例如参考 J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社）或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例 1 : p-Oka BAC ( VZV BAC )载体构建

1 ) BAC载体（pUSF-6 ) ，含有原核复制起始序列（Or i ) 、复制和分区基因 (repE, parA and parB)，氯霉素抗性基因 ( camR ) 、绿色荧光蛋白（gfp ) ，两个 500bpVZV片段 a和 b (灰色）、两个 ΙοχΡ位点（白色）。 pUSF-6用 BamHl消化成线性结构，通过同源重组将 pUSF-6插入含 VZV的科斯质粒 pvSpe23中；

2 ) p-0ka基因结构模式图显示 VZV由 125kb核苷酸组成，包括一个长片段（UL )和一个短片段（US ) 。完整基因组被消化成 4个含重叠区的 VZV基因片段，克隆到科斯质粒中，产生 4个重组克隆 pvFsp73、 pvSpel4、 pvPmel9 和 pvSpe23， pUSF-6通过同源重组插在 VZV科斯质粒 pvSpe23的 ORF60和 0RF61之间； 3 )含 BAC载体（ pUSF-6 ) 的 pvSpe23与其它三个 VZV科斯质粒共转染 MeWo细胞，重组病毒（ VZVBAC )能在 MeWo细胞中复制并产生绿色荧光斑。

另外，操作过程也可以参见 Fig. 1。

比较 VZV BAC病毒和野生型 pOka病毒的生长曲线。病毒感染后每天记录蚀斑形成单位数（PFU ) 。结果显示 VZV BAC病毒（绿色）没有出现生长缺陷，与亲本病毒体外生长一致。实施例 2: 0RF7缺失的 BAC林（VZV-7D BAC )的制备以及检验 0RF7删除的 VZV突变体的构建可以参照 luc VZV BAC (Zhang et a l. Journa l of Virology, Sept, 2007， p9024-9033) _β 操作过程也可以参见 Fig. 2以及下面的步骤：

1. 设计的两条引物各包含 20bp的卡那霉素抗性基因同源核苷酸序列和 0RF7删除区起始或终止密码子相连的 40bp同源序列。所用引物 Fl、 R1如下：

Fl : GAT TTA TCC ATA GTT CAA TAC GTT GGA AAG CCA GTC AAT CGC TCT TGT TGG CTA GTG CGT A (SEQ ID NO: 3) ,

Rl: AAA CAT ACA CCA GAA ACG TTT TTA GTT TTT ATT TCA ATA TTC TGC CAG TGT TAC AAC CAA (SEQ ID NO: 4)。

卡那霉素抗性基因从质粒 pGEM- or iV/kanl 上扩增 (Net terwa ld, Yang et a l. 2005) , PCR产物用 Dpnl酶进行消化，用 Qiagen凝胶提取试剂盒进行回收。

2. 以 1. 6kv, 250 F的 BioRad Gene Pul ser I I电转仪将大约 200ng的 PCR产^转进载有 VZVLuc BAC 的 DY380菌体中。

3. 采用大肠杆菌 DY380株作为高效同源重组系统，所需同源序列短至 40bp。利用重组酶 42 t!激活 /32 抑制的特性，完成 Kan^f 基因与 0RF7的同源重组， 0RF7被 Kan^f基因取代，在 32 TC下从含有 30 g/ml卡那霉素的琼脂板上选择单克隆的重组子，从大肠杆菌中分离水痘病毒突变株 ( 0RF7缺失） VZV- BAC的 DNA。

4. 所得病毒基因组完整性由 Hindl l l酶切检验，重组 DNA经 PCR检验。证明得到了 0RF7缺失的 BAC株 ( VZV-7D BAC )，其 0RF7 被 Kan^f基因取代。实施例 3: 0RF7翻转反向移码突变 BAC株（ VZV-7DRM BAC )的制备以及检验

思路如下：用 ga 1 k基因取代野生型病毒中的 0RF7序列，含 ga 1 k 基因的 VZV在以半乳糖为唯一碳源的麦糠基氏琼脂培养物上产生亮红色斑，用这种方法筛选出单克隆；再用翻转反向移码突变序列取代 galk，在完全培养基和基础培养基上筛选单克隆，获得 VZV-7DRM BAC

步骤如下：

1. 设计正反向引物 5 '端各含有 6 Obp 0RF7基因两端侧翼同源序列的 galk基因表达框的扩增引物 F2和 R2。从 pgalk上扩增 galk 基因序列（l-82bp为启动子， 83-1231bp为 galk的 0RF )，序列如下（SEQ ID NO: 5 ) ：

CCTGTTGACAATTAATCATCGGCATAGTATATCGGCATAGTATAATACGACAAGGTGAGGAACTAAA CCCAGGAGGCAGATCATGAGTCTGAAAGAAAAAACACAATCTCTGTTTGCCAACGCATTTGGCTACCCTGC CACTCACACCATTCAGGCGCCTGGCCGCGTGAATTTGATTGGTGAACACACGGACTACAACGACGGTTTCG TTCTGCCCTGCGCGATTGATTATCAAACCGTGATCAGTTGTGCACCACGCGATGACCGTAAAGTTCGCGTG ATGGCAGCCGATTATGAAAATCAGCTCGACGAGTTTTCCCTCGATGCGCCCATTGTCGCACATGAAAACTA TCAATGGGCTAACTACGTTCGTGGCGTGGTGAAACATCTGCAACTGCGTAACAACAGCTTCGGCGGCGTGG ACATGGTGATCAGCGGCAATGTGCCGCAGGGTGCCGGGTTAAGTTCTTCCGCTTCACTGGAAGTCGCGGTC GGAACCGTATTGCAGCAGCTTTATCATCTGCCGCTGGACGGCGCACAAATCGCGCTTAACGGTCAGGAAGC AGAAAACCAGTTTGTAGGCTGTAACTGCGGGATCATGGATCAGCTAATTTCCGCGCTCGGCAAGAAAGATC ATGCCTTGCTGATCGATTGCCGCTCACTGGGGACCAAAGCAGTTTCCATGCCCAAAGGTGTGGCTGTCGTC ATCATCAACAGTAACTTCAAACGTACCCTGGTTGGCAGCGAATACAACACCCGTCGTGAACAGTGCGAAAC CGGTGCGCGTTTCTTCCAGCAGCCAGCCCTGCGTGATGTCACCATTGAAGAGTTCAACGCTGTTGCGCATG AACTGGACCCGATCGTGGCAAAACGCGTGCGTCATATACTGACTGAAAACGCCCGCACCGTTGAAGCTGCC AGCGCGeTGGAGCAAGGCGACCTGAAACGTATGGGCGAGTTGATGGCGGAGTCTCATGCCTCTATGCGCGA TGATTTCGAAATCACCGTGCCGCAAATTGACACTCTGGTAGAAATCGTCAAAGCTGTGATTGGCGACAAAG GTGGCGTACGCATGACCGGCGGCGGATTTGGCGGCTGTATCGTCGCGCTGATCCCGGAAGAGCTGGTGCCT GCCGTACAGCAAGCTGTCGCTGAACAATATGAAGCAAAAACAGGTATTAAAGAGACTTTTTACGTTTGTAA ACCATCACAAGGAGCAGGACAGTGCTGA ( SEQ ID NO: 5 )

F2和 R2序列如下：

F2 ： ACCGAATCGTCGGTTTGGAGGATTTATCCATAGTTCAATACGTTGGAAAGCCAG TCAATCATGCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA (SEQ ID NO: 6)；

R2 ：

TAATTTTATATACAAAATAAAAACATACACCAGAAACGTTTTTAGTTTTTATTT CAATATTCAGCACTGTCCTGCTCCTT (SEQ ID NO: 7)；

2. 用此引物扩增 galk基因表达框，用 Dpnl消化过夜后纯化；

3. 用 VZV BAC转化大肠杆菌 SW102;

4. 挑取单克隆接种到 5ml LB-CM (含氯霉素 LB ) 的培养基，在 32 °C培养过夜；

5. 用过夜培养菌接种到 250ml LB-CM培养液中， 32 振荡培养到 0D值达到 0. 4-0. 6;

6. 制备电转细胞（VZVBAC转化的大肠杆菌 SW102 ) ；

7. 取 1-2μ1 (约 200ng )步骤 2纯化的 PCR产物按实施例 2中的电转参数电转到步骤 6中制备的 VZVBAC大肠杆菌 SW102感受态细胞中；

8. 向转化细胞中加 lml LB并于 32Ό培养 1小时； 9. 恢复后，用 l x M9盐如下洗涤细菌 3次： 13200 RPM离心沉淀培养物 15秒，吸取离心上清，用 1 χ Μ9盐重悬沉淀，如上离心，重复洗涤一次。经 3次洗涤后，弃除上清液，沉淀用 l x M9盐 lml 重悬。重悬物、 10倍稀释物、 100倍稀释物加到含半乳糖、亮氨酸、生物素和氯霉素的 M63基础培养基上。

10. 32 Ό培养 3天；

11. 挑取几个克隆到含有半乳糖、氯霉素指示剂的麦糠基氏琼脂培养板上培养，获得单克隆。培养 3天出现的克隆应该是 Ga l+，但是，为了排除 Ga卜污染，获得单一亮红色克隆对进行下一步试验是非常重要的；

12. 挑取单一亮红色（半乳糖为唯一碳源的麦糠基氏培养基上培养， Ga l+)克隆，接种到 5 ml LB-CM培养液中， 32。C过夜培养；用过夜培养物制备 BAC DNA, 并用 PCR确证含有 ga lk基因，所用引物如下：

F3: CCTGTTGACAATTAATCATCGGCA (SEQ ID NO: 8)；

R3: TCA GCACTGTCCTGCTCCTT (SEQ ID NO: 9)；

13.以 F4 (SEQ ID NO: 10)和 R4 (SEQ ID NO: 11)为引物的 0RF7 近 3'端 457bp的 PCR扩增（ 457bp读码框序列（SEQ ID NO: 12) ) 。由于 F4、 R4引物设计引入了 1位碱基移码, 故扩增产物产生移码突变。

F4和 R4引物序列如下：

F4 ： CGAATCGTCGGTTTGGAGGATTTATCCATAGTTCAATACGTTGGAAAGCCAGTC AATTTAATGGGATTTCTTGATCGCGGGG (SEQ ID NO: 10)

R4 ： AATTTTATATACAAAATAAAAACATACACCAGAAACGTTTTTAGTTTTTATTTC AATATGTGGTCCGTTCACACATGGAAAAC (SEQ ID NO: 11)

457bp读码框序列如下：

GTCCGTTCACACATGGAAAACTCAAAACGGCTTGCTGATATGTGTTTAGCTGCAATTACCCATTTGT ATTTATCGGTTGGCGCGGTGGATGTTACTACGGATGATATTGTCGATCAAACCCTGAGAATGACCGCTGAA AGTGAAGTGGTCATGTCTGATGTTGTTCTTTTGGAGAAAACTCTTGGGGTCGTTGCTAAACCTCAGGCATC GTTTGATGTTTCCCACAACCATGAATTATCTATAGCTAAAGGGGAAAATGTGGGTTTAAAAACATCACCTA TTAAATCGGAGGCGACACAATTATCTGAAATTAAACCCCCACTTATAGAAGTATCGGATAATAACACATCT AACCTAACAAAAAAAACGTATCCGACAGAAACTCTTCAGCCCGTGTTGACCCCAAAACAGACGCAAGATGT ACAACGCACAACCCCCGCGATCAAGAAATCCCATG (SEQ ID NO: 12)。

然后参照本实施例的步骤 4-10制备电转感受态 SW102细胞。

14. 200ng含与步骤 2 ga lk基因侧翼同源的 PCR产物经热激转化 50μ1步骤 13的感受态细菌。转化产物加到含 l OmlLB培养液的 50ml锥形瓶中， 32 'C水浴振荡培养 4. 5小时进行恢复。这种长时间恢复旨在获得只含目标序列的重组 VZV BAC (舍弃含 ga 1 k表达框的 VZV BAC ) 。因为 F4由 60bp 0FR7 5'端侧翼同源序列和 0RF7 近 3' 端 457bp反向序列组成， R4由 60bp 0FR7 3'端侧翼同源序列和 0RF7 近 3'端 457bp正向序列组成，所^扩增产物与 0FR7位点上的 ga lk 基因同源重组时， 3'端 457bp序列产生翻转反向连接，产生翻转反向移码突变突变（SEQ ID NO: 13) , 不具^ 功能。翻转反向移码突变序列如下：

CATGGGATTTCTTGATCGCGGGGGTTGTGCGTTGTACATCTTGCGTCTGTTTTGGGGTCAACACGGG CTGAAGAGTTTCTGTCGGATACGTTTTTTTTGTTAGGTTAGATGTGTTATTATCCGATACTTCTATAAGTG GGGGTTTAATTTCAGATAATTGTGTCGCCTCCGATTTAATAGGTGATGTTTTTAAACCCACATTTTCCCCT TTAGCTATAGATAATTCATGGTTGTGGGAAACATCAAACGATGCCTGAGGTTTAGCAACGACCCCAAGAGT TTTCTCCAAAAGAACAACATCAGACATGACCACTTCACTTTCAGCGGTCATTCTCAGGGTTTGATCGACAA TATCATCCGTAGTAACATCCACCGCGCCAACCGATAAATACAAATGGGTAATTGCAGCTAAACACATATCA GCAAGCCGTTTTGAGTTTTCCATGTGTGAACGGAC (SEQ ID N0: 13)。

15. 如步骤 9操作，沉淀 lml培养物，用 1 χ Μ9盐洗涤细菌 3 次，沉淀用 1 χ Μ9盐 lml重悬。重悬物和 10倍稀释物各 Ι ΟΟμΙ加到含甘油、亮氨酸、生物素、 2-脱氧 -半乳糖和氯霉素的 M63培养板上。

16. 32Ό培养 3-4天；

17. 挑选并移种单克隆转到 LB-CM和 Galk-M63 CM基础培养基的平板上。在 LB- CM生长而在基础培养板上不生长的单克隆，提取病毒基因组用 Hindl l l酶切检猃完整性，重组 DNA经 PCR检验。证明得到了 0RF7翻转反向移码突变的 BAC株（VZV-7DRM BAC ) 。

上述步骤所用试剂的配制如下面的表 1所示：

表 1: 本实施例所用试剂及其配制

实施例 4: VZV-7D 和 VZV-7DRM病毒的制备

1. 从实施例 2制得的 VZV-7D BAC 中提取 DNA, 转入 DY380 菌中培养、增殖、提取、纯化。 2. 将提取纯化的 DNA单独电转染至（Marchini, Liu et a l. 2001 ) M C-5细胞，（BAC上带的 GFP可以用于病毒在细胞中生长增殖研究）或与 Cre表达载体一同电转染至（Marchini, Liu et a l. 2001 ) MRC-5细胞， BAC被 Cre酶从其两端的 ΙοχΡ酶切位点完全切除，产生 VZV-7D病毒。

类似地，可以得到翻转反向移码突变取代 0RF7的 VZV-7DRM病毒，由于 VZV- 7DRM的 0RF7只有部分且为翻转反向序列，所以，此片段不能表达，更无 0RF7功能。因此， VZV-7DRM与 VZV- 7D具有相同的功能。实施例 5: VZV-7D病毒的鉴定

用实施例 4中制得的 VZV- 7D病毒感染长成单层的 MRC- 5细胞，用含 2%牛血清的 MEM培养基培养，约 80%细胞病变发生时，弃培养基，收获病变细胞，提取 DNA, 以 P-Oka为对照进行试验。 PCR扩增 ORF-10和 0RF-7基因，用 Hindl l l消化 VZV-7D和 Ρ-Oka株的 DNA。 PCR产物和 Hindl l l消化产物用 0. 5%的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳产物见 Fig. 3。 VZV-7D在 ORF-10的 PCR产物同 P-Oka的一致，但在 0RF-7上没有条带，证实 0RF-7缺失。 Hindl l l对病毒的酶切图谱上， VZV-7D和 P-Oka之间看不出差别。实施例 6: VZV-7D病毒的背根神经节培养

用无菌的外科剪刀和镊子分离妊娠 20周胚胎的宫颈段和胸段脊骨的背根神经节（DRG )，分离的背根神经节用含 1%青霉素 /链霉素的冰浴 1 XPBS瞬时洗涤，然后转到水浴的培养基（DEM，含 15% 热灭活的胎牛血清和 1%青霉素 /链霉素），将每个背根神经节单独放到六孔板中胶原覆盖的盖玻片上，加 0. 5 ml培养基，培养 5天，其间换培养基一次。六孔细胞板中制备 50% Mewo细胞培养物，用于滴度检测和生长曲线分析（ Fig. 4A )。第 6天收获 P-0ka， VZV-7D 和 VZV-7R新近感染的 Mewo细胞，于培养基悬浮至 lml。每个背根神经节单独饲养在六孔板中胶原包被的盖玻片上。 10 μ ΐ悬液用于病毒滴度检测， 2 μ 1用于 Mewo细胞感染的生长曲线。其余细胞悬液用力通过 27号针 20次，细胞碎片通过 4000rpm离心 l Omin沉淀。上清均分，用于感染背根神经节，约 120 μ ΐ/样品，另外， 2滴（20 μ ΐ ) 细胞悬液用于感染另一个背根神经节， 371C 5%C0₂下培养 3 小时后，背根神经节用 1 X PBS洗涤，再补加新鲜培养基。每 24小时检测一次荧光素酶活性。样品用含 150 y g/ml 的 D-lucifer in 培养 10分钟后，用 IVIS仪器和软件分析光子数。检测结果见 Fig. 4B。

结果表明， VZV- 7D在 Mewo上生长正常，而在背根神经节中几乎不生长。 VZV-7D不感染背根神经节细胞，这为开发安全的减毒活疫苗奠定了坚实基础。实施例 7: VZV-7D病毒的回复突变体（VZV-7R )制备以及臉证 0RF7缺失正确与否不仅可以用 Hindi n酶切鉴定，而且可以通过基因的同源重组获得完整的 VZV加以脸证。即应用细菌同源重组机理拯救出完整的 VZV，见 Fig. 5。可以利用 Invi trogen的高保真 Taq DNA 聚合酶试剂盒 PCR扩增 0RF7 片段，并将其克隆到质粒 pGEM-lox-zeo的 Not l和 Bg l l l位点之间，从而形成 pGEM-zeo-0RF7 质粒。该克隆片段通过测序分析鉴定正确，且通过 PCR扩增没有错误密码子被引入 0RF7编码框中。之后以 pGEM-zeo-0RF7质粒为模板用下述引物 PCR扩增 zeoR-0RF7编码框。

F5: GAT TTA TCC ATA GTT CAA TAC GTT GGA AAG CCA GTC AAT CAT GCA GAC GGT GTG TGC CAG ( SEQ ID NO: 14 )；

R5: AAA CAT ACA CCA GAA ACG TTT TTA GTT TTT ATT TCA ATA TGG ATG GAT CCA TAA CTT CGT ( SEQ IDNO: 15 ) ，

得到的 PCR产物是两端各含一段 40bp的 VZV基因序列，与 kanR 编码框序列相连的，位于删除的 0RF7位点上。将得到的这段嵌合 PCR产物按上文提到的方法电转化到携带有 0RF7D BAC的 DY380菌体中。重组体要通过含有 50 g/ml的 zeocin (Invi trogen)和 12. 5 g/ml的氯霉素的琼脂平板 32 培养筛选。正确的 VZV克隆通过它们对抗生素的敏感状况而筛选获得。正确的克隆应该是氯霉素抗性、潮霉素抗性、 zeoc in抗性、卡那霉素敏感性以及氨苄霉素敏感性的。这些克隆进一步被酶切消化和 PCR分析确证正确。

将鉴定正确的克隆（即携带有 0RF7缺失或者 luc VZV BAC拯救子的大肠杆菌 DY380 )接种于含 12. 5 g/ml的氯霉素的 500mlLB 培养基中 321C培养 20小时。 VZVBAC的 DNA通过 BAC DNA大量提取试剂盒（BD Biosc iences, Pa lo Al to, CA )分离得到，并且利用转染试剂 FuGene6 ( Roche, Indianapol i s, IN )按照使用说明转染到 MRC-5细胞。 6孔板中的一孔（35-腿)在转染时 DNA与转染试剂的使用比例为 1. 5 μ g ： 6 μ 1。一般情况转染后 3天可见水痘病毒病斑。为从水痘病毒基因组中去除 BAC载体（两侧有 ΙοχΡ酶切位点），可将 Cre表达载体与 VZV BAC DNA—起共转染（Marchini, Liu et a l. 2001 ) MRC-5细胞，利用 Cre酶的特性而精确切除 BAC，产生完整的 VZV。

水痘 0RF-7回复突变的病毒具有同 Ρ-Oka病毒相同的生长和增殖特性。说明 0RF- 7的功能可以通过回复突变手段得到恢复。实施例 8: VZV-7DRM病毒的 Mewo细胞培养六孔板中长成单层的 Mewo 细胞分别用含 Luc 的 VZV- 7DRM、 VZV-7R和 P-0ka株感染，以未感染的 Mewo细胞作对照， Mewo细胞在 37 Ό下用含 2%牛血清的 MEM培养基培养。感染 24 小时后， D-luc ifer in加到培养的细胞孔中，终浓度为 150 μ g/ml， 37 培养 10分钟，不同孔的生物荧光用体内成像系统 IVIS ( 50 Ser ies; Xenogen Corporat ion, Alameda, CA)同时测量光子数，每天测量 3孔感染细胞，测量后，细胞用病毒培养液取代 D-lucifer in物质继续培养。病毒荧光量每 24小时测量一次，连续测量 7天。用 3 孔测量的数据均值对时间绘制生长曲线。结果见 Fig. 6。

人 MeWo 细胞不被感染或者被水痘-带状疱疹病毒野生株 ( lucVZV )或者 VZV-7DRM突变株或者 VZV-7D回复株 ( luc7R )感染、培养 7天。感染后每天用 IVIS系统测量光子数，用 3孔测量的均值对时间绘制生长曲线，图中标出 3孔测量数据的误差线。本试验表明 VZV-7DRM病毒和 VZV-7R病毒和野生株一样都可以在 MeWo 细胞中正常生长。同时，试验结果表明将 BAC插入 VZV-7DRM中， 7DRM能正常增殖， BAC上的基因也能正常表达，即 VZV- 7DRM可以用作外源基因表达的载体。实施例 9: VZV-7DRM病毒在人胸腺组织的培养

人胸腺-肝脏联合移植体异体移植到雄性的 CB- 17SCID/beige 鼠内。人胸腺-肝脏联合移植体构建和使用按 Jennifer F. M( Journa l of Virology, Sept. 1995, p. 5236 5242 )描述的方法进行。移植 3月后，人胸腺 -肝脏移植体经外科手术暴露后，直接注射 2 χ 10³ 至 4 χ 10³ PFU的 Mewo培养的含有荧光素酶的 VZV-7DRM和 P-0ka, 10 - 20 μ 1细胞悬液，每种病毒感染 3只小鼠，以未感染鼠为对照，感染后每天测量荧光量。腹腔注射 250 μ ΐ荧光素酶底物，即 D-lucifer inl O分钟后，用生物荧光体内成像系统 IVIS在移植区按实施例 8的方法测量荧光量，每种病毒测量 3只小鼠。结果见 Fig. 7。

培养的人胸腺组织不受病毒感染或者受 VZV 野生株或者 VZV-7DRM株感染，培养 7天。感染后每天用 IVIS系统测量光子数。用 3只鼠测量的光子数均值对时间绘制生长曲线。图中显示 3只测量数据的误差线。本试臉表明 VZV-7DRM缺陷株像野生株一样能在胸腺组织（T-细胞）中生长。

类似的实脸证明， VZV-7D缺陷株也像野生株一样能在胸腺组织 ( T-细胞）中生长。实施例 10: VZV-7DRM病毒的皮肤培养

人胚胎皮肤完整结构按 Jennifer F. M ( Journal of Virology, Sept. 1995, p. 5236 5242 )描述的方法，异体移植到重症联合免疫缺陷（ SCID )小鼠皮下。移植 4周后，三种含荧光素酶的 VZV- 7DRM、 VZV-7R和 P-0ka株感染皮肤，每种病毒感染 3只小鼠，以未感染鼠为对照，感染后每天测量荧光量。腹腔注射 250 μ 1荧光素酶底物，即 D-lucifer inlO分钟后，用生物荧光体内成像系统 IVIS在移植区按实施例 8的方法测量荧光量，每种病毒测量 3只小鼠。结果见 Fig. 8。

培养的人皮肤组织被病毒野生株（P-0ka )或者 0RF7 缺失株 ( VZV-7DRM )或者 0RF7回复突变株（VZV- 7R )感染、以不被感染的鼠为对照，培养 7天。感染后每天用 IVIS系统测量光子数，用 3 只测量的光子均值对时间绘制生长曲线。图中标出 3只测量数据的误差线。实驗证实 VZV-7DRM在皮肤中有严重生长缺陷，这种功能缺陷在 VZV-7DRM株回复突变后可以被恢复。

类似的实验显示， VZV-7D在皮肤中也有严重生长缺陷，并且这种功能缺陷在 VZV-7D株回复突变后可以被恢复。

实施例 11: 0RF7对 VZV感染神经细胞为必需的验证实猃

1. 神经细胞瘤细胞感染实验

用野生型（WT ) 、 0RF7删除型（VZV-7DRM )和 0RF7回复突变型 ( VZV-7R ) 的 BAC DNA转染 MeWo细胞和神经细胞瘤 ( SH-SY5Y ) 细胞。研究发现， WT、 VZV-7R在 MeWo细胞和神经细胞瘤细胞上生长正常，但 VZV-7DRM不能在神经细胞瘤细胞上生长（Fig. 9A ) 。研究结果显示 0RF 7很可能是 VZV感染神经细胞所必需的。

2. DRG移植体感染实验

为了进一步验证本实施例中实验 1的结果，使用植入人胎儿背根神经节（DRG )移植体的重症联合免疫缺陷鼠（SCID-hu )模型进行试猃。结果发现，野生型在 DRG移植体中经历一个短暂的复制循环（有荧光现象）后，很可能一直潜伏着。但是， VZV-7D 不能在 DRG移植体中复制。这些结果表明， 0RF7很可能是 VZV的嗜神经因子（Fig. 9B - D ) 。

以上两个实验证明， 0RF7是 VZV感染神经元所必需的。实施例 12: 疫苗的制备以及 VZV-7DRM病毒的免疫原性检定

VZV-7DRM按 MOI=0. 1感染长成单层的 ARPE或 MRC-5细胞，病毒在细胞上吸附 40分钟后，向培养瓶中加病毒培养液后于 35 - 下培养。细胞病变达到 80%左右（通常为 3天）时，用 0. 1% EDTA消化收获，收获物经离心、加保护剂破碎和澄清后冻干制成疫苗。

疫苗复溶后经皮下接种体重约 250g豚鼠， 5只 /苗， 5000 PFU/0. 5ml/剂，初免 4周后，加强免疫 1剂，以 P-Oka和 V-0ka为对照进行试验。

加强免疫后 2周经心脏采血，用 gp-ELISA检测免疫血清抗体滴度。用免疫抑制法检测免疫血清对病毒的中和能力。免疫血清或免前血清 10倍稀释后与病毒 1: 1混合， 37 培养 60分钟，培养混合液感染 MRC-5细胞，于 37Ό 5%二氧化碳培养箱中培养 7天后，弃去培养液，用考马斯蓝染色，计蚀斑数再换算病毒滴度，用 lOO x (被免前血清中和的病毒滴度 -被免后血清中和的病毒滴度 ) /被免后血清中和的病毒滴度。检定结果见表 2。

表 2: 水痘病毒的豚鼠免疫血清抗体滴度和中和水平

实验结果表明 VZV-7DRM有良好的免疫原性，抗体水平和 V-0ka 的相当，且 VZV-7DRM免疫血清对三株病毒都有良好的中和作用，初步显示有疫苗开发前景。

类似的实猃显示， VZV-7D也具有良好的免疫原性，具有疫苗开发前景。实施例 13: VZV-7DRM为载体的生物活性原料制备

用含 0RF7侧翼区同源序列的 EV71-VP1引物从 pT- VP1质粒上 PCR 扩增 EV71-VP1阅读框。

阅读框序列如下：

TGGGAGATAGGGTAGCAGATGTAATTGAAAGCTCCATAGGAGATAGCGTGAGCAGAGCCCTCACTCA CGCTCTACCAGCACCCACAGGCCAGAACACACAGGTGAGCAGTCATCAACTGGATACAGGCAAGGTTCCAG CACTCCAAGCTGCTGAAATTGGAGCATCATCAAATGCTAGTGACGAGAGCATGATTGAGACACGCTGTGTT CTTAACTCGCACAGCACAGCTGAGACCACTCTTGATAGTTTCTTCAGCAGAGCGGGATTAGTTGGAGAGAT AGATCTCCCTCTTAAAGGCACAACTAACCCAAATGGTTATGCCAACTGGGACATAGATATAACAGGTTACG CGCAAATGCGTAGAAAGGTGGAGCTATTCACCTACATGCGCTTTGATGCAGAGTTCACTTTTGTTGCGTGC ACACCCACCGGGGAAGTTGTCCCACAATTGCTCCAATATATGTTTGTGCCACCTGGAGCCCCTAAGCCAGA TTCCAGGGAATCCCTCGCATGGCAAACCGCCACCAACCCCTCGGTTTTTGTCAAGCTGTCAGACCCTCCAG CGCAGGTTTCAGTGCCATTCATGTCACCTGCGAGCGCTTACCAATGGTTTTATGACGGATATCCCACATTC GGAGAACACAAACAGGAGAAAGATCTTGAATATGGGGCATGTCCTAATAACATGATGGGCACGTTCTCAGT GCGGACTGTAGGGACCTCCAAGTCCAAGTACCCTTTAGTGGTTAGGATTTACATGAGAATGAAGCACGTTA GGGCGTGGATACCTCGCCCGATGCGTAACCAGAACTACCTATTCAAAGCCAACCCAAATTATGCTGGCAAC TCCATTAAGCCAACTGGTACCAGTCGTACAGCGATCACTACTCTTTAA (SEQ ID NO: 16)

PCR引物序列：

F6 ( 0RF7 5 '端侧翼区同源序列，起始密码子和 EV71-VP1同源序列）：

CGAATCGTCGGTTTGGAGGATTTATCCATAGTTCAATACGTTGGAAAGCCAGT CAATCATGGGAGATAGGGTAGGAGATGTAA (SEQ ID NO: 17)

R6 ( 0RF7 3'端侧翼区同源序列和 EV71-VP1同源序列）：

AATTTTATATACAAAATAAAAACATACACCAGAAACGTTTTTAGTTTTTATTT CAATATTTAAAGAGTAGTGATCGCTGTACGACTGGTA (SEQ ID NO: 18)

PCR产物采用电转手段转入含 VZV-7DRM BAC的 SW102细菌中，按照实施例 2筛选重组菌，经鉴定正确后，适量培养，提取

VZV-7DRM-VP1 BAC, 与 Cre表达载体一同电转染至 ARPE细胞， BAC 被 Cre酶从其两端的 loxP酶切位点完全切除，产生 VZV-7DRM- VP1重组病毒。重组病毒感染长成单层的 ARPE细胞， 35 培养 3- 4天，细胞出现病变。收集的病毒培养上清、细胞悬液经反复冻融或超声裂解后的离心上清原倍上样，采用 E V71特异的双抗体夹心法检测 VP 1 活性，用 EV71和 VZV-7DRM作对照。结果（见表 3 )在 VZV- 7DRM-VP1 病毒感染的 ARPE细胞中检测到 VP1活性，表明 VP1重组到 VZV-7DRM 中。此例表明 VZV-7DRM能用作外源基因的表达载体表达目标蛋白。

表 3: VZV-7DRM-VP1重组病毒的 VP1活性检测（双抗体夹心法）双抗体夹心 EV71活性（ 0D值）类别

培养上清超声破碎

VZV-7DRM 0. 049 0. 025

VZV-7DRM-P1 0. 048 0. 692

EV71 2. 774 2. 537 类似的实验证明， VZV-7D也可以用于制备表达外源蛋白的载体。尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims

权利要求

1. 一种水痘病毒，其基因组 0RF7全部或部分缺失、或者被一个或多个碱基取代或插入，并且所述水痘病毒不能够感染人的皮肤和感觉神经节。

2. 根据权利要求 1所述的水痘病毒，其中， 0RF7全部或部分被抗生素抗性基因和 /或者无功能的核酸序列所取代。

3. 根据权利要求 2所述的水痘病毒，其中，所述抗生素抗性基因选自：青霉素、链霉素、以及卡那霉素的抗性基因。

4. 根据权利要求 2所述的水痘病毒，其中，所述无功能的核酸序列是翻转反向移码突变的 0RF7片段。

5. 根据权利要求 4所述的水痘病毒，其中，所述翻转反向移码突变的 0RF7片段的序列如 SEQ ID NO: 13所示。

6. 一种水痘病毒，其保藏编号为 CGMCC No. 3207 , 保藏日期 2009年 7月 28 日，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

7. 权利要求 1所述的水痘病毒的制备方法，包括如下步骤：

2 )分离 1 ) 中得到的水痘病毒的 DNA，并与含 Cre酶的重组质粒共转染 Mewo细胞或 MRC-5细胞或 ARPE细胞或 2BS细胞或 WI-38 细胞或 KMB17细胞等；

3 )通过 Cre酶的作用在 Mewo细胞或 MRC-5细胞或 ARPE细胞或 2BS细胞或 WI-38细胞或 KMB17细胞等中删除 BAC。

8. 根据权利要求 7所述的方法，其中，所述野生型水痘病毒是 P Oka株，并且步骤 1 )中所述的 0RF7被 Kan^f取代，或者翻转反向移码突变的 0RF片段 SEQ ID NO: 13所取代。

9. 一种组合物，其含有权利要求 1 - 6 中任一项所述的水痘病毒。

10. 一种预防水痘和 /或带状疱疹的疫苗，其含有权利要求 1 - 6 中任一项所述的水痘病毒，以及疫苗用赋形剂或载体。

11. 权利要求 1 - 6中任一项所述的水痘病毒在制备预防水痘和 /或带状疱疹的疫苗中的用途。

12. 权利要求 1 - 6中任一项所述的水痘病毒的 DNA在制备表达载体中的用途。

13. 一种表达载体，其由 BAC和插入到 BAC中的权利要求 1 - 6 中任一项所述的水痘病毒的 DNA组成。

14. 一种表达载体，其为权利要求 1 - 6中任一项所述的水痘病毒的 DM。

15. 一种重组载体，其含有权利要求 13或 14所述的表达载体以及插入的外源基因。

16. 一种重组细胞，其含有权利要求 13或 14所述的表达载体、或者权利要求 15所述的重组载体。

17. 根据权利要求 16所述的重组细胞，其中，所用的宿主细胞选自如下细胞： MRC-5、 Mewo、 ARPE、 2BS、 WI-38 > 以及 KMB17。

18. 一种预防水痘和 /或带状疱疹的方法，包括给予患者接种有效量的权利要求 10所述的疫苗的步骤。