WO2010139820A1 - Método y kit de reconocimiento de cepas de microcystis aeruginosa (cyanobacteria) productoras y no productoras de microcistinas. - Google Patents

Método y kit de reconocimiento de cepas de microcystis aeruginosa (cyanobacteria) productoras y no productoras de microcistinas. Download PDF

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Definitions

  • the invention is part of the biotechnology sector for environmental health, and more specifically, in relation to methods and devices (kits) for recognition of microorganisms producing toxins in water.
  • Toxic cyanobacteria encompass a wide range of microalgae capable of proliferating in inland waters around the world, especially when they have a high degree of eutrophy, constituting a major international concern.
  • About 40 species of cyanobacteria are capable of producing toxins (microcystins). These toxins are able to remain unchanged for long periods of time in the aquatic environment being a potential danger to human health as well as to domestic and wild fauna.
  • microcystin caused the death of 50 people in Brazil; Similar cases have been described in other countries such as China, where blooms or blooms of toxic cyanobacteria are already a major public health problem (Zhang et al., 2009. Sci. Total Environ. 407: 2191-9).
  • Recently in Europe the presence of microcystin in drinking water has been associated with an increase in the prevalence of colon and liver cancer (Mart ⁇ nez et al., 2009. Med. Hypotheses 72: 539-40).
  • M. aeruginosa Kützing
  • M. aeruginosa producer of microcystin-LR (hepatotoxin).
  • M. aeruginosa not all M. aeruginosa blooms are toxic blooms.
  • Sivonen and Jones (1999. In Chorus, I. & Bartram, J. [Eds.] Toxic cyanobacteria in water. A guide to their public health consequences, monitoring and management. Pp. 41-111. Routledge. London.
  • One of the fundamental factors responsible for the variation of toxin concentration in the environment, above the environmental conditions, is the presence of a mixture of strains capable of generating a high production of toxin together with non-toxic strains.
  • Lectins are proteins or glycoproteins capable of binding by means of non-covalent bonds to the monosaccharide or oligosaccharide residues present in the cell surface. Lectins have been widely used in the classification of bacteria, protozoa and other microorganisms.
  • aeruginosa appears to be implicated in most toxic episodes of cyanobacterial proliferations worldwide, and that it is characterized by great genetic variability with respect to the production of Microcystin is especially necessary and interesting to obtain a lectin that allows unambiguously recognizing and distinguishing between toxic strains of M. aeruginosa producing microcystin and strains of M. aeruginosa not producing microcystin.
  • the present invention has as its main object to provide a kit based on a lectin that allows to recognize and unequivocally distinguish between toxic strains of M. aeruginosa producing microcystin and strains of M. aeruginosa not producing microcystin.
  • the method based on said kit is also claimed by which it is possible to recognize and unequivocally distinguish between toxic strains of M. aeruginosa producing microcystin and strains of M. aeruginosa not producing microcystin. It is a reliable, fast and simple development procedure, suitable for implementation in early warning network systems in urban supply reservoirs and control systems for livestock supply waters and wildlife refuge waters.
  • the present invention is based on the unexpected finding that the Aglutinin 1 lectin of Ulex europaeus (UEA-I) is able to recognize and unequivocally discriminate between microcystis aeruginosa strains producing non-producing microcystin.
  • UEA-I lectin binds to the cell surface of the investigated non-microcystin-producing strains of M. aeruginosa, and does not bind to the microcistin-producing strains of M. aeruginosa. Without wishing to be bound by any theory, it is thought that there is a link between the genes that encode the transmembrane target glycoproteins of the UEA-I lectin and the genes that encode microcystins in M. aeruginosa, which guarantees that the presence of the target glycoprotein of the UEA-I lectin on the cell surface of M.
  • aeruginosa and therefore, its recognition and binding by UEA-I, is incompatible with the production of microcystin in M. aeruginosa.
  • UEA-I lectin and the necessary means to detect the union of said lectin with its target glycoprotein of the cell surface of M. aeruginosa, it is possible to unequivocally discern between the presence or absence of M strains aeruginosa microcistina producers in a given sample.
  • the method for unequivocally discerning between the presence or absence of strains of M is possible.
  • aeruginosa producing microcystin in a given sample comprises the exposure of said sample to the UEA-I lectin in the presence of the necessary means to detect the binding of said lectin with its target glycoprotein of the cell surface of M. aeruginosa, and subsequent signal detection.
  • a method of these characteristics results in a procedure of total reliability for the detection of toxic strains of M. aeruginosa in the environment, which is a great technical advance in relation to the methods based on recognition of the cell surface of known toxic strains, which for their simplicity and speed, are more interesting than other methods based on DNA sequencing, of high reliability but of greater complexity, duration, economic cost and technical requirement.
  • lectins proteins or glycoproteins capable of binding by means of non-covalent bonds to the monosaccharide or oligosaccharide residues present in the cell surface.
  • Ulex europaeus Aglutinin 1 lectin is a protein or glycoprotein produced by Ulex europaeus with specific affinity for L-fucose residues.
  • probe is meant a marking element that interacts with a target molecule, and is capable of producing a detectable signal when a change in state occurs in said target molecule, for example, due to the recognition of another molecule, or of its union with another molecule.
  • a “fluorescent probe” or “fluorophore” is a tidal element capable of emit fluorescent light when there is a change of state of the target molecule with which it interacts.
  • Fluorescein isothiocyanate (FITC) is a fluorescent probe that is used commercially attached to the UEA-I lectin to detect a non-covalent binding of said lectin to a target molecule that can be a glycoprotein, a glycolipid or a carbohydrate.
  • the epifluorescence is the technique that allows to detect the fluorescence emitted by the fluorescent probe or fluorophore. It can be applied to a microcospium adapted for epifluorescence.
  • strain is meant a genotypic variant of a given species that is characterized by a biochemical, physiological, morphological, or other property.
  • Said capacity is defined by the functionality of genes that encode hepatopeptides of hepatotoxic effect known as microcystins.
  • a PBS solution consists essentially of a solution of 0.02 M phosphate and 0.15 M NaCI in water at pH 7.5.
  • One aspect of the present invention relates to a kit for the recognition and discrimination of toxic strains of M. aeruginosa producing microcystin and strains of M. aeruginosa not producing microcystin comprising:
  • the probe that allows to detect the union of the UEA-I lectin with its target glycoprotein of the cell surface of M. aeruginosa is a fluorescent probe.
  • said probe is Fluorescein Isothiocyanate (FITC).
  • the means for contacting a sample with the UEA-I lectin comprises a container and a PBS solution. Said vessel it can be a test tube, a microtube, an Eppendorf type microtube, or one, or several wells of a multiwell plate.
  • the kit for the discrimination of toxic strains of M. aeruginosa producing microcystin and strains of M. aeruginosa not producing microcystin comprises UEA-I lectin in a concentration between 1 and 1000 micrograms of lectin per milliliter of sample. In an even more particular embodiment of the present invention, the kit comprises said lectin in a concentration between 50 and 500 micrograms of probe-conjugated lectin per milliliter of solution containing the sample.
  • the kit comprises UEA-I lectin in a concentration between 95 and 105 micrograms of probe-conjugated lectin per milliliter of solution containing the sample.
  • object of the present invention is the method for the recognition and discrimination of toxic strains of M. aeruginosa producing microcystin and strains of M. aeruginosa not producing microcystin comprising: a) contacting a sample with UEA-I lectin and with a specific probe of said UEA-I lectin, b) detecting the signal emitted by said probe, or the absence of signal.
  • the method for the discrimination of toxic strains of M. aeruginosa producing microcystin and strains of M. aeruginosa not producing microcystin comprises UEA-I lectin at a concentration between 1 and 1000 micrograms of lectin per milliliter sample.
  • said method comprises said lectin in a concentration between 50 and 500 micrograms of probe-conjugated lectin per milliliter of solution containing the sample.
  • said method comprises UEA-I lectin in a concentration between 95 and 105 micrograms of probe-conjugated lectin per milliliter of solution containing the sample.
  • the probe that allows to detect the union of said UEA-I lectin with its target glycoprotein of the cell surface of M. aeruginosa is fluorescent.
  • said fluorescent probe is FITC
  • the means for contacting a sample with the UEA-I lectin comprise a microtube and a PBS solution, and the detection of the signal emitted by the FITC probe, or Ia absence of signal, is performed by epifluorescence using a microscope with filter for FITC.
  • a homogenization and conditioning stage of the sample is included, prior to contacting said sample with the UEA-I lectin and with a specific probe of said UEA-I lectin, said homogenization step comprising and conditioning the centrifugation of the sample and its resuspension in a PBS solution.
  • the present invention provides a kit that allows to recognize and distinguish between toxic strains of M. aeruginosa producing microcystin and strains of M. aeruginosa not producing microcystin with total guarantee and reliability. The use of this kit, and of the method for the discrimination between toxic strains of M. aeruginosa producing microcystin and strains of M.
  • aeruginosa not producing microcystin based on said kit represents a definite advance in the development of effective techniques to prevent and prevent control the presence of toxin-producing microorganisms in water such as M. aeruginosa. It is a fast and simple development procedure, suitable for implementation in the early warning network systems in urban supply reservoirs and control systems for livestock supply waters and wildlife refuge waters.
  • the reliability and guarantee provided by said kit and its use, together with the advantages in terms of speed and technical simplicity of recognition methods compared to other known methods, represents the necessary and definitive advance for routine use by companies and companies. institutions responsible for guaranteeing the health of the waters.
  • Figure 1 Microscopic image of the recognition of different strains of M. aeruginosa by the described method, using 100 micrograms of UEA lectin -I conjugated with Fluorescein Isothiocyanate (FITC). The signal emitted by the FITC probe, or the absence of a signal, is detected by epifluorescence by means of a microscope with filter for FITC. a) Image of a strain of M. aeruginosa that does not produce microcystin. b) Image of a toxic strain of M. aeruginosa producing microcystin.
  • FITC Fluorescein Isothiocyanate
  • Example 1 The method of use of the kit object of the present invention to detect the presence of strains of M. aeruginosa producing microcystin in water samples taken in a fresh water reservoir for the supply of human population is described below.
  • the samples were homogenized by manual agitation. With the help of a micropipette, an aliquot of 1 milliliter of sample volume was deposited in an Eppendorf-type microtube (Eppendorf Ibérica SA). The microtube with the sample was centrifuged for 5 minutes at 13,000 revolutions per minute and the supernatant was removed with a plastic pipette. The pelleted pellet was resuspended in 500 microliters of PBS solution (0.02M phosphate solution, 0.15M NaCI, pH 7.5) homogenizing by gentle agitation.
  • PBS solution 0.2M phosphate solution, 0.15M NaCI, pH 7.5
  • the preparation with the sample arranged on the slide was examined by observation in a microscope of the Zeiss Axiovert brand equipped with a filter for excitation FITC in a wavelength range of 450-490 nanometers and emission in a range of 520-560 nanometers
  • the samples in which a fluorescent green light was observed were recorded as negative samples to the presence of M. aeruginosa strains producing microcystin. Samples in which no fluorescent light was detected were recorded as positive for the presence of M. aeruginosa strains producing microcystin.
  • positive controls cells stained with acridine orange
  • negative controls cells incubated with lectins not conjugated with FITC were used.
  • Example 2 The following describes an example of certification of the reliability of the kit for recognition of microcistin-producing strains based on the UEA-I lectin conjugated with the FITC probe.
  • the 29 strains had been isolated in water reservoirs for drinking water supply or lakes located in Andalusia (southern Spain).
  • the clones were obtained from a single vegetative cell isolated from the samples by a commercial micromanipulator-microinjector of those available on the market (Zeiss-Eppendorf).
  • the strains grew in culture bottles (Greiner, Bio-One Inc. Longwood, NJ, USA) containing 30 milliliters of BG-11 solution as described by Rippka et al. (1979. Gen. Microbiol. 111: 1-61), at 20 degrees Celsius and 120 micromoles of photons per square meter and Second produced by white light tubes operating in continuous cycles.
  • the clones were maintained in exponential growth phase by transfer to fresh medium each
  • microcystin production of the different strains was measured by a specific ELISA test of commercially available ones following the manufacturer's instructions (Enviro Gard Microcystin Quantitube Test Kit; Strategic Diagnostic, Newark, NJ., USA). Additional results certification measures were carried out using a commercial test (Microcystest) based on phosphatase inhibition according to the manufacturer's indications (ZEU-lmmunotech, Zaragoza, Spain). From samples of the clones that were in exponential growth phase, aliquots containing 100,000 ⁇ 1000 cells were taken, which were incubated with the fluorescent UEA-I lectins for 1 hour at 20 degrees Celsius in the dark, and examined as It has been described in Example 1 of this report.

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Abstract

Método y kit de reconocimiento de cepas de Microcystis aeruginosa (Cyanobacteria) productoras y no productoras de microcistinas. La presente invención se refiere a un método para detectar cepas productoras de microcistina y cepas no productoras de esta toxina dentro de poblaciones de Microcystis aeruginosa (Cyanobacteria), mediante Ia utilización de Ia lectina Aglutinina 1 de Ulex europaeus (UEA-1), de una sonda de marcaje de Ia lectina y de los medios necesarios para detectar Ia sonda. Así mismo Ia invención proporciona un kit para el reconocimiento de cepas productoras y no productoras de microcistina basado en el método descrito.

Description

TÍTULO DE LA INVENCIÓN
Método y kit de reconocimiento de cepas de Microcystis aeruginosa (Cyanobacteria) productoras y no productoras de microcistinas.
SECTOR DE LA INVENCIÓN
La invención se encuadra en el sector de Ia biotecnología para Ia sanidad ambiental, y más en concreto, en el relativo a métodos y dispositivos (kits) de reconocimiento de microorganismos productores de toxinas en agua.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las cianobacterias tóxicas engloban un amplio rango de microalgas capaces de proliferar en aguas continentales de todo el mundo, en especial cuando éstas tienen un alto grado de eutrofia, constituyendo una importante preocupación a nivel internacional. Unas 40 especies de cianobacterias son capaces de producir toxinas (microcistinas). Estas toxinas son capaces de permanecer inalteradas durante largos periodos de tiempo en el medio acuático siendo un peligro potencial para Ia salud humana así como para Ia fauna doméstica y silvestre. Varios estudios científicos han demostrado que Ia microcistina produjo Ia muerte de 50 personas en Brasil; casos similares han sido descritos en otros países como China, donde los blooms o floraciones de cianobacterias tóxicas son ya un importante problema de salud pública (Zhang et al., 2009. Sci. Total Environ. 407: 2191-9). Recientemente en Europa se ha asociado Ia presencia de microcistina en el agua de consumo con un incremento en Ia prevalencia de cáncer de colon e hígado (Martínez et al., 2009. Med. Hypotheses 72: 539- 40).
Los blooms de cianobacterias tóxicas también han sido responsables de mortandades masivas de fauna silvestre en reservas naturales protegidas como el caso del Espacio Natural de Doñana descrito por López-Rodas et al. (2008. Vet. Rec. 162: 317-8).
La cianobacteria tóxica que aparece implicada en Ia mayoría de episodios tóxicos es M. aeruginosa (Kützing), productora de microcistina-LR (hepatotoxina). Sin embargo, no todos los blooms de M. aeruginosa son blooms tóxicos. De hecho, generalmente durante el periodo de máxima proliferación de éstas microalgas y en una misma masa de agua, existen variaciones en Ia concentración de microcistina. Sivonen y Jones (1999. En Chorus, I. & Bartram, J. [Eds.] Toxic cyanobacteria in water. A guide to their public health consequences, monitoring and management. pp. 41-111. Routledge. London.) indican que uno de los factores fundamentales responsables de Ia variación de concentración de toxina en el medio, por encima de las condiciones medioambientales, es Ia presencia de una mezcla de cepas capaces de generar una alta producción de toxina junto con cepas no tóxicas.
En este sentido, diversos estudios han demostrado que existe una gran variabilidad genética respecto a Ia producción de microcistina en diferentes cepas de M. aeruginosa, concluyendo que existen cepas de M. aeruginosa altamente tóxicas, cepas muy poco tóxicas y cepas no tóxicas (Martín et al., 2004. Limnetica 23 1-2: 153-8)
Ante Ia toxicidad de M. aeruginosa se han implantado sistemas de control y redes de alerta temprana de Ia presencia de cepas tóxicas de M. aeruginosa en los embalses destinados a Ia red abastecimiento urbano así como en aquellas masas de agua de las que se abastecen ganado, y fauna silvestre de interés en conservación (p.e en el Espacio Natural de Doñana).
Para cumplir este objetivo es necesario contar con métodos de detección rápidos que permitan discriminar de manera inequívoca entre cepas tóxicas y no tóxicas de M. aeruginosa. Por el momento no hay un procedimiento eficaz y rápido. Se puede hacer mediante Ia secuenciación del DNA buscando los genes de Ia microcistina, pero es un procedimiento complejo y lento. En este sentido el uso de lectinas conjugadas con Isotiocianato de Fluoresceína (FITC) es una alternativa mucho más sencilla y rápida. Las lectinas son proteínas o glicoproteínas capaces de unirse mediante enlaces no covalentes a los residuos de monosacáridos u oligosacáridos presentes en Ia superficie celular. Las lectinas han sido ampliamente utilizadas en Ia clasificación de bacterias, protozoos y otros microorganismos. La aplicación de lectinas conjugadas con FITC junto con técnicas de epifluorescencia microscópica han permitido diferenciar entre especies de dinoflagelados morfológicamente similares. También se ha empleado lectinas conjugadas con FITC para discernir entre diferentes cepas de microorganismos productores de toxinas. Se han empleado diferentes lectinas para reconocer cepas tóxicas de M. aeruginosa (Alvarez et al., 1998. En Reguera, B., Blanco, J., Fernández, M. L. y Wyatt, T. [Eds.] Harmful algae. pp. 291-5. Xunta de Galicia and Intergovernmental Oceanographic Commission of UNESCO, París.), de Alexandrium tamarense (Cho et al., 2001. J. Plankton Res. 23: 89-95), o para reconocer cepas de Pseudonitzchia multiseries Hasle productoras de ácido domóico (Cho et al., 2002. Bot. Mar. 45: 346-72; y Cho, 2003. J. Plankton Res. 25: 309-15.). Recientemente, Hou y colaboradores (2008. J. Appl. Phycol. 20: 35-46) han empleado lectinas para reconocer 23 cepas productoras de toxinas de 13 especies diferentes y típicamente problemáticas en aguas de China, incluyendo Alexandrium tamarense, A. catenella, A. minutum, Karenia mikimotoi, Takayama pulchellum, Akashiwo sanguínea, Gyrodinium instríatum, Gymnodinium sp, Prorocentrum donghaiense, y P. mínimum.
Cabe destacar que una de las conclusiones más importantes de los trabajos citados es que, aunque el reconocimiento de dinoflagelados tóxicos mediante lectinas es un método sencillo y rápido, Ia variabilidad genética de las distintas especies puede provocar problemas de falso reconocimiento y discriminación (ver, por ejemplo, Hou et al., 2008. J. Appl. Phycol. 20: 35-46). Por este motivo es necesario obtener lectinas que permitan superar el problema y discernir con total garantía y fiabilidad entre cepas productoras de toxinas y cepas no productoras, de forma que pueda implantarse su empleo rutinario en los sistemas de control y alerta temprana de calidad de agua. Teniendo en cuenta que M. aeruginosa aparece implicada en Ia mayoría de episodios tóxicos de proliferaciones de cianobacterias a escala mundial, y que se caracteriza por una gran variabilidad genética respecto a Ia producción de microcistina, resulta especialmente necesario e interesante Ia obtención de una lectina que permita reconocer y discernir inequívocamente entre cepas tóxicas de M. aeruginosa productoras de microcistina y cepas de M. aeruginosa no productoras de microcistina. La presente invención tiene por objeto principal proporcionar un kit basado en una lectina que permite reconocer y discernir inequívocamente entre cepas tóxicas de M. aeruginosa productoras de microcistina y cepas de M. aeruginosa no productoras de microcistina. También se reivindica el método basado en dicho kit por el que se puede reconocer y discernir inequívocamente entre cepas tóxicas de M. aeruginosa productoras de microcistina y cepas de M. aeruginosa no productoras de microcistina. Se trata de un procedimiento fiable, rápido y de sencillo desarrollo, de implantación idónea en los sistemas de red de alerta temprana en embalses de abastecimiento urbano y sistemas de control de aguas de abastecimiento de ganado y aguas refugio de fauna silvestre.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se basa en el hallazgo inesperado de que Ia lectina Aglutinina 1 de Ulex europaeus (UEA-I) es capaz de reconocer y discriminar inequívocamente entre cepas de Microcystis aeruginosa productoras de microcistina de las no productoras.
Los inventores han observado que Ia lectina UEA-I se une a Ia superficie celular de las cepas de M. aeruginosa no productoras de microcistina investigadas, y no se une a las cepas de M. aeruginosa productoras de microcistina. Sin querer estar vinculado por ninguna teoría, se piensa que hay un ligamiento entre los genes que codifican las glicoproteínas transmembrana diana de Ia lectina UEA-I y los genes que codifican microcistinas en M. aeruginosa, Io que garantiza que Ia presencia de Ia glicoproteína diana de Ia lectina UEA-I en Ia superficie celular de M. aeruginosa, y por tanto, su reconocimiento y unión por UEA-I, es incompatible con Ia producción de microcistina en M. aeruginosa. De esta forma, mediante un kit que contenga lectina UEA-I y los medios necesarios para detectar Ia unión de dicha lectina con su glicoproteína diana de Ia superficie celular de M. aeruginosa, es posible discernir inequívocamente entre Ia presencia o ausencia de cepas de M. aeruginosa productoras de microcistina en una muestra dada. El método para discernir inequívocamente entre Ia presencia o ausencia de cepas de M. aeruginosa productoras de microcistina en una muestra dada comprende Ia exposición de dicha muestra a Ia lectina UEA-I en presencia de los medios necesarios para detectar Ia unión de dicha lectina con su glicoproteína diana de Ia superficie celular de M. aeruginosa, y Ia posterior detección de señal.
Un método de estas características, basado en el empleo de Ia lectina UEA-I, resulta en un procedimiento de total fiabilidad para Ia detección de cepas tóxicas de M. aeruginosa en el medio, Io que supone un gran avance técnico en relación con los métodos basados en reconocimiento de Ia superficie celular de cepas tóxicas conocidos, que por su sencillez y rapidez, son más interesantes que otros métodos basados en secuenciación de DNA, de alta fiabilidad pero de mayor complejidad, duración, coste económico y requerimiento técnico.
Descripción detallada de Ia invención
En el contexto de Ia presente invención, se entiende por "lectinas", proteínas o glicoproteínas capaces de unirse mediante enlaces no covalentes a los residuos de monosacáridos u oligosacáridos presentes en Ia superficie celular. En concreto, Ia lectina Aglutinina 1 de Ulex europaeus (UEA-I), es una proteína o glicoproteína producida por Ulex europaeus con afinidad específica por residuos de L-fucosa.
Por "sonda", se entiende un elemento de mareaje que interacciona con una molécula diana, y es capaz de producir una señal detectable cuando en dicha molécula diana se produce un cambio de estado, por ejemplo, por efecto del reconocimiento de otra molécula, o de su unión con otra molécula. Una "sonda fluorescente" o "fluoróforo", es un elemento de mareaje capaz de emitir luz fluorescente cuando se produce un cambio de estado de Ia molécula diana con Ia que interacciona. Isotiocianato de Fluoresceína (FITC) es una sonda fluorescente que se emplea comercialmente unida a Ia lectina UEA-I para detectar una unión no covalente de dicha lectina a una molécula diana que puede ser una glicoproteína, un glicolípido o un glúcido. La epifluorescencia es Ia técnica que permite detectar Ia fluorescencia emitida por Ia sonda fluorescente o fluoróforo. Puede aplicarse a un microcospio adaptado para Ia epifluorescencia. Por "cepa" se entiende una variante genotípica de una especie dada que se caracteriza por una propiedad bioquímica, fisiológica, morfológica, o de otra naturaleza. Así, por ejemplo, en el caso de M. aeruginosa, se pueden definir cepas distintas por su capacidad de producción de microcistina. Dicha capacidad viene definida por Ia funcionalidad de unos genes que codifican para heptapéptidos de efecto hepatotóxico conocidos como microcistinas. Una solución PBS consiste esencialmente en una disolución de 0.02 M fosfato y 0.15 M NaCI en agua a pH 7.5.
Un aspecto de Ia presente invención se refiere a un kit para el reconocimiento y discriminación de cepas tóxicas de M. aeruginosa productoras de microcistina y cepas de M. aeruginosa no productoras de microcistina que comprende:
- lectina UEA-I,
- una sonda que permite detectar Ia unión de dicha lectina UEA-I con su glicoproteína diana de Ia superficie celular de M. aeruginosa,
- medios para poner en contacto una muestra con dicha lectina UEA-I. En una realización preferente de Ia presente invención, Ia sonda que permite detectar Ia unión de Ia lectina UEA-I con su glicoproteína diana de Ia superficie celular de M. aeruginosa es una sonda fluorescente. En una realización aun más preferente de Ia presente invención, dicha sonda es Isotiocianato de Fluoresceína (FITC). En una realización particular de Ia presente invención, el medio para poner en contacto una muestra con Ia lectina UEA-I, comprende un recipiente y una solución PBS. Dicho recipiente puede ser un tubo de ensayo, un microtubo, un microtubo de tipo Eppendorf, o uno, o varios pocilios de una placa multipocillos.
En una realización más particular de Ia presente invención, el kit para Ia discriminación de cepas tóxicas de M. aeruginosa productoras de microcistina y cepas de M. aeruginosa no productoras de microcistina comprende lectina UEA-I en una concentración entre 1 y 1000 microgramos de lectina por mililitro de muestra. En una realización aun más particular de Ia presente invención, el kit comprende dicha lectina en una concentración entre 50 y 500 microgramos de lectina conjugada con sonda por mililitro de solución que contiene Ia muestra. En una realización aun más particular de Ia presente invención, el kit comprende lectina UEA-I en una concentración entre 95 y 105 microgramos de lectina conjugada con sonda por mililitro de solución que contiene Ia muestra. También es objeto de Ia presente invención el método para el reconocimiento y discriminación de cepas tóxicas de M. aeruginosa productoras de microcistina y cepas de M. aeruginosa no productoras de microcistina que comprende: a) poner en contacto una muestra con Ia lectina UEA-I y con una sonda específica de dicha lectina UEA-I, b) detectar Ia señal emitida por dicha sonda, o Ia ausencia de señal.
En una realización particular de Ia presente invención, el método para Ia discriminación de cepas tóxicas de M. aeruginosa productoras de microcistina y cepas de M. aeruginosa no productoras de microcistina comprende lectina UEA-I en una concentración entre 1 y 1000 microgramos de lectina por mililitro de muestra. En una realización aun más particular de Ia presente invención, dicho método comprende dicha lectina en una concentración entre 50 y 500 microgramos de lectina conjugada con sonda por mililitro de solución que contiene Ia muestra. En una realización aun más particular de Ia presente invención, dicho método comprende lectina UEA-I en una concentración entre 95 y 105 microgramos de lectina conjugada con sonda por mililitro de solución que contiene Ia muestra. En una realización preferente de dicho método, Ia sonda que permite detectar Ia unión de dicha lectina UEA-I con su glicoproteína diana de Ia superficie celular de M. aeruginosa es fluorescente. En una realización preferente de dicho método, dicha sonda fluorescente es FITC, los medios para poner en contacto una muestra con Ia lectina UEA-I comprenden un microtubo y una solución PBS, y Ia detección de Ia señal emitida por Ia sonda FITC, o Ia ausencia de señal, se realiza por epifluorescencia mediante un microscopio con filtro para FITC. En una realización particular de dicho método, se incluye una etapa de homogeneización y acondicionamiento de Ia muestra, previa a poner en contacto dicha muestra con Ia lectina UEA-I y con una sonda específica de dicha lectina UEA-I, comprendiendo dicha etapa de homogeneización y acondicionamiento Ia centrifugación de Ia muestra y su resuspensión en una solución PBS. La presente invención proporciona un kit que permite reconocer y discernir entre cepas tóxicas de M. aeruginosa productoras de microcistina y cepas de M. aeruginosa no productoras de microcistina con total garantía y fiabilidad. El uso de este kit, y del método para Ia discriminación entre cepas tóxicas de M. aeruginosa productoras de microcistina y cepas de M. aeruginosa no productoras de microcistina basado en dicho kit, supone un avance definitivo en el desarrollo de técnicas eficaces para prevenir y controlar Ia presencia de microorganismos productores de toxinas en aguas como es el caso de M. aeruginosa. Se trata de un procedimiento rápido y de sencillo desarrollo, de implantación idónea en los sistemas de red de alerta temprana en embalses de abastecimiento urbano y sistemas de control de aguas de abastecimiento de ganado y aguas refugio de fauna silvestre. La fiabilidad y garantía que proporciona dicho kit y su empleo, sumados a las ventajas en cuanto a rapidez y sencillez técnica propias de los métodos de reconocimiento frente a otros métodos conocidos, supone el avance necesario y definitivo para su empleo rutinario por parte de empresas e instituciones encargadas de garantizar Ia salubridad de las aguas.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Para facilitar Ia comprensión de las características de Ia invención y formando parte de Ia memoria descriptiva, se incluye Ia siguiente figura: Figura 1 : Imagen al microscopio del reconocimiento de distintas cepas de M. aeruginosa mediante el método descrito, empleando 100 microgramos de lectina UEA-I conjugada con Isotiocianato de Fluoresceína (FITC). La señal emitida por Ia sonda FITC, o Ia ausencia de señal, se detecta por epifluorescencia mediante un microscopio con filtro para FITC. a) Imagen de una cepa de M. aeruginosa no productora de microcistina. b) Imagen de una cepa tóxica de M. aeruginosa productora de microcistina.
EJEMPLO DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se ¡lustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, los cuales no pretenden ser limitativos de su alcance.
Ejemplo 1 A continuación se describe el método de empleo del kit objeto de Ia presente invención para detectar Ia presencia de cepas de M. aeruginosa productoras de microcistina en muestras de agua tomadas en un embalse de agua dulce para abastecimiento de población humana.
Las muestras, tal y como llegaron al laboratorio, se homogeneizaron mediante agitación manual. Con ayuda de una micropipeta se depositó una alícuota de 1 mililitro de volumen de muestra en un microtubo tipo Eppendorf (Eppendorf Ibérica S.A.). El microtubo con Ia muestra se centrifugó durante 5 minutos a 13.000 revoluciones por minuto y se retiró el sobrenadante con una pipeta de plástico. La pastilla sedimentada se resuspendió en 500 microlitros de solución PBS (disolución de 0.02M fosfato, 0.15M NaCI, pH 7.5) homogeneizándose mediante agitación suave. Se añadieron 50 microgramos de lectina UEA-I conjugada con Ia sonda fluorescente Isotiocianato de Fluoresceína (FITC) de Ia disponible comercialmente (Sigma-Aldrich S.A.), para dar una concentración final de 100 microgramos de lectina conjugada por mililitro de muestra. El microtubo con Ia muestra se incubó en agitación durante 10 minutos a 20 grados centígrados y en oscuridad. Transcurrido ese tiempo, con ayuda de una micropipeta, se depositaron 20 microlitros de Ia muestra incubada en un portaobjetos para microscopía como los disponibles comercialmente en el mercado. La preparación con Ia muestra dispuesta en el portaobjetos se examinó por observación en un microscopio de Ia marca Zeiss Axiovert dotado con un filtro para FITC de excitación en un rango de longitud de onda de 450-490 nanómetros y emisión en un rango de 520-560 nanómetros. Las muestras en las que se observó una luz verde fluorescente se registraron como muestras negativas a Ia presencia de cepas M. aeruginosa productoras de microcistina. Las muestras en las que no se detectó luz fluorescente se registraron como positivas a Ia presencia de cepas M. aeruginosa productoras de microcistina. En todos los casos se emplearon controles positivos (células teñidas con naranja de acridina) y negativos (células incubadas con lectinas no conjugadas con FITC). Ejemplo 2 A continuación se describe un ejemplo de certificación de Ia fiabilidad del kit de reconocimiento de cepas productoras de microcistina basado en Ia lectina UEA-I conjugada con Ia sonda FITC.
Se tomaron 29 muestras de clones de cepas de M. aeruginosa disponibles en Ia colección de Cultivo de Algas Tóxicas de Ia Universidad Complutense de
Madrid (Madrid, España). Las 29 cepas habían sido aisladas en embalses de agua para suministro de agua potable o lagos localizados en Andalucía (sur de España). Los clones se obtuvieron a partir de una única célula vegetativa aislada de las muestras mediante un micromanipulador-microinyector comercial de los disponibles en el mercado (Zeiss-Eppendorf). Las cepas crecieron en frascos de cultivo (Greiner, Bio-One Inc. Longwood, NJ, USA) que contenían 30 mililitros de solución BG-11 como Ia descrita por Rippka et al. (1979. Gen. Microbiol. 111 : 1-61), a 20 grados centígrados y 120 micromoles de fotones por metro cuadrado y Segundo producidos por tubos de luz blanca funcionando en ciclos continuos. Los clones se mantuvieron en fase de crecimiento exponencial mediante transferencia a medio fresco cada
15 días. La ausencia de bacterias se monitorizó periódicamente mediante epifluorescencia y tinción con naranja de acridina, y observación al microscopio.
La producción de microcistina de las distintas cepas se midió mediante un test específico ELISA de los disponibles comercialmente siguiendo las indicaciones del fabricante (Enviro Gard Microcystin Quantitube Test Kit; Strategic Diagnostic, Newark, NJ. , USA). Se realizaron medidas adicionales de certificación de los resultados utilizando un test comercial (Microcystest) basado en inhibición de fosfatasas según las indicaciones del fabricante (ZEU-lmmunotech, Zaragoza, España). A partir de muestras de los clones que se mantenían en fase de crecimiento exponencial se tomaron alícuotas que contenían 100.000 ± 1000 células, que fueron incubadas con Ia lectinas UEA-I fluorescente durante 1 hora a 20 grados centígrados en oscuridad, y examinadas tal y como se ha descrito en el Ejemplo 1 de Ia presente memoria.
se indican en Ia Tabla 1
Figure imgf000013_0001

Claims

REIVINDICACIONES
1) Kit para el reconocimiento y discriminación de cepas tóxicas de M. aeruginosa productoras de microcistina y cepas de M. aeruginosa no productoras de microcistina que comprende: a) lectina UEA-I, b) una sonda específica de Ia unión de Ia lectina UEA-I a Ia glicoproteína diana de dicha lectina UEA-I, c) medios para poner en contacto una muestra con dicha lectina UEA-I. 2) Kit según Ia reivindicación 1 en el que Ia sonda es fluorescente.
3) Kit según Ia reivindicación 2 en el que Ia sonda es Isotiocianato de Fluoresceína (FITC).
4) Kit según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los medios para poner en contacto Ia muestra con Ia lectina UEA-I comprenden un recipiente y una solución PBS.
5) Kit según Ia reivindicación 4 caracterizado porque el recipiente es un tubo de ensayo, un microtubo, un microtubo del tipo Eppendorf, o uno, o varios pocilios de una placa multipocillos.
6) Kit según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque Ia concentración de lectina UEA-I se encuentra entre 1 y 1000 microgramos de lectina por mililitro de solución que contiene Ia muestra.
7) Kit según Ia reivindicación 6, caracterizado porque Ia concentración de lectina UEA-I se encuentra entre 50 y 500 microgramos de lectina por mililitro de solución que contiene Ia muestra. 8) Kit según Ia reivindicación 7, caracterizado porque Ia concentración de lectina UEA-I se encuentra entre 95 y 105 microgramos de lectina por mililitro de solución que contiene Ia muestra.
9) Método para el reconocimiento y discriminación de cepas tóxicas de M. aeruginosa productoras de microcistina y cepas de M. aeruginosa no productoras de microcistina que comprende: a) poner en contacto una muestra con Ia lectina UEA-I y con una sonda específica de dicha lectina UEA-I b) detectar Ia señal emitida por dicha sonda, o Ia ausencia de señal.
10) Método según Ia reivindicación 9, caracterizado porque Ia concentración de lectina UEA-I se encuentra entre 1 y 1000 microgramos de lectina por mililitro de solución que contiene Ia muestra.
11) Método según Ia reivindicación 10, caracterizado porque Ia concentración de lectina UEA-I se encuentra entre 50 y 500 microgramos de lectina por mililitro de solución que contiene Ia muestra.
12) Método según Ia reivindicación 10 caracterizado porque Ia concentración de lectina UEA-I se encuentra entre 95 y 105 microgramos de lectina por mililitro de solución que contiene Ia muestra.
13) Método según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, caracterizado porque Ia sonda específica de Ia lectina UEA-I es fluorescente.
14) Método según Ia reivindicación 13, caracterizado porque Ia sonda específica de Ia lectina UEA-I es Isotiocianato de Fluoresceína (FITC).
15) Método según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, caracterizado porque los medios para poner en contacto Ia muestra con Ia lectina UEA-I comprenden un recipiente y una solución PBS.
16) Método según Ia reivindicación 15, caracterizado porque el recipiente es un tubo de ensayo, un microtubo, un microtubo del tipo Eppendorf, o uno, o varios pocilios de una placa multipocillos.
17) Método según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 16, que incluye una etapa de homogeneización y acondicionamiento de Ia muestra, previa a poner en contacto dicha muestra con Ia lectina UEA-I y con una sonda específica de dicha lectina UEA-I, comprendiendo dicha etapa de homogeneización y acondicionamiento Ia centrifugación de Ia muestra y su resuspensión en una solución PBS.
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