ES2352882T3 - Procedimiento para la preparación de muestras de control de partículas tales como microorganismos y células. - Google Patents

Procedimiento para la preparación de muestras de control de partículas tales como microorganismos y células. Download PDF

Info

Publication number
ES2352882T3
ES2352882T3 ES01911266T ES01911266T ES2352882T3 ES 2352882 T3 ES2352882 T3 ES 2352882T3 ES 01911266 T ES01911266 T ES 01911266T ES 01911266 T ES01911266 T ES 01911266T ES 2352882 T3 ES2352882 T3 ES 2352882T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
cells
microorganisms
flow cytometer
particle separator
receptacle
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES01911266T
Other languages
English (en)
Inventor
Graham Unit 6 VESEY
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BTF Pty Ltd
Original Assignee
BTF Pty Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BTF Pty Ltd filed Critical BTF Pty Ltd
Application granted granted Critical
Publication of ES2352882T3 publication Critical patent/ES2352882T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/149—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry specially adapted for sorting particles, e.g. by their size or optical properties
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N2001/2893—Preparing calibration standards
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/11—Automated chemical analysis
    • Y10T436/115831—Condition or time responsive
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/12—Condition responsive control
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Sampling And Sample Adjustment (AREA)

Abstract

Procedimiento para la preparación automática de muestras que contienen un número predeterminado de células o microorganismos deseados que comprende: proporcionar un separador de partículas bajo control de software; proporcionar un aparato de recolección que presenta un receptáculo o superficie que retiene las células o los microorganismos, en el que el separador de partículas y el aparato de recolección se encuentran en comunicación electrónica mediante un circuito de ratón de ordenador modificado que presenta un interruptor de botón puenteado mediante un optoacoplador; separar un número predeterminado de las células o microorganismos deseados mediante el separador de partículas; y distribuir el número predeterminado de células o microorganismos mediante el separador de partículas en el receptáculo o en la superficie del aparato de recolección de acuerdo con una señal del aparato de recolección; en el que la señal se envía desde el aparto de recolección al separador de partículas mediante el circuito de ratón de ordenador modificado que activa el software que controla el separador de partículas a través de un botón de función de adquisición del software de control del separador de partículas de manera que cuando se ha recibido una señal el número predeterminado de células o microorganismos se administra dentro del receptáculo o sobre la superficie que está colocado durante el tiempo suficiente para recoger las células o los microorganismos mediante el aparato recolector, y en el que a continuación de la recolección de las células o los microorganismos el aparato de recolección avanza y coloca un receptáculo o superficie posterior para recibir las células o los microorganismos posteriores, señalando el aparato recolector a continuación el separador de partículas mediante el circuido de ratón de ordenador modificado para iniciar la distribución de otro número predeterminado de células o microorganismos, en el que el separador de partículas es un citómetro de flujo.

Description

La presente invención se refiere a un procedimiento destinado a la preparación de muestras que comprenden números predeterminados de células o microorganismos tales como bacterias, protozoos, levaduras, hongos, esporas, polen y virus. 5
Nota: La bibliografía se recoge al final de la descripción.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Existen múltiples situaciones en las que se miden microorganismos en sólidos o líquidos. Muestras tales como las de agua, aire, alimentos, bebidas y muestras clínicas se ensayan rutinariamente con múltiples procedimientos microbiológicos. Es esencial que dichos ensayos se realicen con precisión de modo fiable y que los resultados sean 10 comparables entre muestras y entre laboratorios.
Los procedimientos de ensayo utilizados oscilan ampliamente pero implican en su totalidad algunas manipulaciones de la muestra. Los ejemplos comprenden flotación, pipeteo, centrifugación, filtración u homogenización. Se pueden producir pérdidas de la muestra y las pérdidas de las células o microorganismos durante tales manipulaciones. Estas pérdidas oscilarán entre diferentes tipos de muestras. Algunos de los procedimientos pueden también implicar múltiples 15 pretratamientos tales como calentamiento, congelación, agitación, mezclado o ajustes del pH. Estos tratamientos también pueden causar pérdidas de células o microorganismos. Todos los procedimientos de ensayo implican un procedimiento de detección y también pueden implicar la enumeración de las partículas recobradas. Esto puede ser un procedimiento sencillo tal como el contado de colonias en una placa de agar o puede ser un procedimiento analítico complejo tal como la citometría de flujo o la separación inmunomagnética. Todos estos procedimientos de detección y 20 enumeración tendrán imprecisiones que afectarán a los resultados del ensayo.
El control de calidad (QC) se realiza de modo rutinario con el fin de comprobar la precisión del procedimiento de ensayo y para determinar las pérdidas de células o microorganismos que ocurren durante el procedimiento de ensayo. El procedimiento de QC generalmente implica el análisis de una muestra que ha sido sembrada con células o microorganismos específicos. El número de células o microorganismos que se sembró en la muestra se compara a 25 continuación con el número detectado.
El procedimiento de QC depende de la disponibilidad de muestras de control que comprenden números conocidos de células o microorganismos. Estas muestras de control deben ser fiables y los números en cada muestra deben ser precisos. Tales muestras de control son difíciles de preparar, frecuentemente no son estables y no están ampliamente disponibles. 30
El agua se ensaya rutinariamente para determinar la presencia de Cryptosporidium y Giardia. El procedimiento de ensayo implica numerosos procedimientos en los que los microorganismos se pueden perder (Vesey et al., 1994a). Es, por consiguiente, importante realizar un control de calidad riguroso con el fin de seguir el comportamiento de la metodología. El control de calidad puede implicar el análisis de un estándar que comprende un número conocido de quistes y oocistos. La preparación de los estándares utilizando procedimientos convencionales tales como el pipeteo 35 producen preparaciones imprecisas (Reynolds et al., 1999). Además, las preparaciones no son estables. Con el tiempo se produce el deterioro y la agregación de los microorganismos.
La citometría de flujo ha demostrado ser de utilidad en la preparación precisa de material de control (Reynolds et al., 1999), sin embargo, el procedimiento es tedioso y largo y por consiguiente, no es adecuado para la producción a gran escala. 40
Los sistemas de enfriamiento del agua y de distribución de agua se ensayan continuamente para determinar la presencia de Legionella. El procedimiento de ensayo implica la concentración de bacterias en la muestra de agua mediante centrifugación o filtración y la detección de la bacteria Legionella mediante un procedimiento de cultivo, procedimientos inmunológicos o procedimientos moleculares. La utilización del procedimiento de cultivo es limitada debido a que se requieren entre 5 y 10 días para obtener resultados. 45
Es esencial que la calidad de los procedimientos inmunológicos y moleculares sea estrictamente controlada. Debido los dos procedimientos son susceptibles de producir resultados negativos falsos. El control de calidad implica el análisis de un estándar que comprende un número conocido de células de Legionella. Sin embargo, los estándares precisos son difíciles de preparar y no son estables. Las preparaciones se pueden realizar utilizando citometría de flujo con el fin de analizar la dispersión de luz por las células y clasificar las células. Si se han de clasificar células vivas de Legionella se 50 necesita un procedimiento para producir alícuotas que no produzca aerosoles, tal como un dispersor piezo capilar, con el fin de evitar los riesgos biológicos.
Por consiguiente existe una necesidad de un procedimiento automático, preciso, conveniente y coste-efectivo para producir muestra que comprenden números de células o microorganismos predeterminados.
La presente invención permite la preparación automática de muestras que comprenden números predeterminados de células o microorganismos. Estas muestras que comprenden los números conocidos de células o microorganismos se pueden irradiar con rayos gamma o tratar de otro modo con el fin de prolongar la estabilidad y la vida de almacenamiento de la muestra. Un porcentaje de las muestras se puede ensayar con el fin de determinar el número de células o microorganismos en cada muestra. 5
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento destinado a la preparación automática de muestras que comprenden números predeterminados de las células o microorganismos, procedimiento que comprende proporcionar una muestra de células o microorganismos y separar un número predeterminado de las células o microorganismos deseados mediante un procedimiento de separación de partículas, distribuyendo el número 10 predeterminado de células o microorganismos en un receptáculo o en una superficie de acuerdo con una instrucción de separación, estando el receptáculo o la superficie colocado en posición por los medios de recolección para recibir las células o microorganismos dispensados, que se caracteriza por que la instrucción de clasificación de los medios que distribuyen partículas activas los medios de clasificación de tal modo que cuando se ha accionado una instrucción de separación para administrar un número predeterminado de células o microorganismos en un receptáculo o en una 15 superficie que está situada con precisión durante el tiempo suficiente para recolectar todas las células o microorganismos clasificados, los medios de recolección avanzan y colocan una siguiente superficie o receptáculo para recibir células o microorganismos, señalando dichos medios de recolección señalando por consiguiente a los medios de separación de partículas para que comience la siguiente instrucción de clasificación.
Las células o microorganismos son partículas pequeñas, en particular las utilizadas para el control de calidad y 20 comprenden células animales o vegetales, bacterias, protozoos, levaduras, hongos, esporas, polen y virus.
Los medios de separación de partículas son preferentemente medios de separación automáticos que manejan líquidos tales como un citómetro de flujo, un aparato de separación de partículas Coulter, o cualquier otros medios que separan células o microorganismos basados en las propiedades químicas, físicas, biológicas , fluorescentes u otras.
Un ejemplo particular de medios de separación de partículas que se pueden utilizar para dispensar y analizar células o 25 microorganismos es la citometría de flujo. La citometría de flujo se puede utilizar con el fin de definir las propiedades de dispersión de luz de las células o microorganismos (Shapiro, 1996; Vesey et al., 1994b). La citometría de flujo permite preparar una población predeterminada de células o microorganismos. Un citómetro de flujo se puede ajustar para clasificar un número definido de células o microorganismos utilizando las propiedades de dispersión de luz con el fin de distinguir las células o microorganismos de las partículas contaminantes. Las células o microorganismos clasificados se 30 pueden a continuación recoger en un receptáculo, tal como un tubo de ensayo o una bandeja o una superficie tal como un portaobjetos mediante los medios de recolección tales como un colector de fracciones. Una vez se ha completado la recolección, un nuevo receptáculo se coloca automáticamente en posición y se señala electrónicamente al citómetro de flujo para que inicie otra vez la clasificación.
Otros medios de separación de partículas para dispensar o clasificar células o microorganismos comprenden sensores 35 Coulter, o medios que separan células o microorganismos mediante la medición de la impedancia, magnetismo, masa o peso específico. También se pueden utilizar medios de separación de partículas por detección óptica que utilizan microscopía Raman, dispersión de la luz, producción de imágenes, fluorescencia, absorción y luminescencia.
Otros ejemplos adicionales de medios de separación de partículas comprenden la distribución piezoeléctrica capilar, tubo recolector piezo actuado, deflección de gota cargada, manipulación acústica (Onda Estacionaria, Onda de 40 Choque), manipulación electrostática y pinzas ópticas.
Los medios de recolección pueden ser un colector de fracciones u otro mecanismo que permita la recolección de una multiplicidad de muestras de un material deseado.
Los medios de separación de partículas y los medios de recolección se comunican electrónicamente de modo que una señal de separación de los medios de separación acciona el movimiento de un receptáculo, superficie u otros medios 45 para recibir las células o microorganismos, a una zona para la recepción de las partículas separadas. Por ejemplo, se puede conectar una salida eléctrica de un citómetro de flujo a una entrada de un colector de fracciones.
Un receptáculo puede ser un recipiente, tal como un tubo de ensayo, un vial, un plato, una membrana, un portaobjetos o un pocillo de una placa o plato de múltiples pocillos, que preferentemente se pueda cerrar después de recibir una muestra de células o microorganismos. La referencia a una superficie comprende un portaobjetos u otra superficie 50 cualquiera.
Después de la preparación, la muestra puede ser irradiada, tal como con rayos gamma o UV o de otro modo inactivada/preservada o esterilizada de un modo que no afecte la integridad estructural de las células o microorganismos o afecte el análisis o la detección.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación automática de muestras que comprenden números conocidos de células o microorganismos, comprendiendo dicho procedimiento:
(a) Analizar una muestra de células o microorganismos. La muestra puede estar teñida con un anticuerpo fluorescente (o cualquier otra cosa que ayude a diferenciar las células diana o microorganismos de las partículas contaminantes comprendidas en la muestra). 5
(b) Distribuir números conocidos de células o microorganismos en un receptáculo o sobre una superficie que se coloca con precisión durante un tiempo suficiente para recoger todas las células o microorganismos clasificados.
(c) Mover automáticamente el receptáculo o superficie fuera de la zona de recolección y colocar otro en la zona de recolección.
(d) Señalar automáticamente al dispensador que distribuya las células o microorganismos. 10
(e) Repetir automáticamente el ciclo hasta que se ha preparado el número de muestras requerido.
(f) Irradiar las muestras con rayos gamma.
(g) Realizar un análisis sobre un porcentaje de muestras con el fin de confirmar el número de células o microorganismos en las muestras.
(h) Como un procedimiento adicional de control de calidad se pesa cada una de la muestras. 15
(i) Las muestras se utilizan con el fin de determinar la eficacia de un procedimiento de ensayo.
EJEMPLO 1
Cryptosporidium y Giardia
Se purificaron oocistos de Cryptosporidium parvum a partir de heces acumuladas recogidas de terneros neonatos infectados en Sydney. Las muestras fecales se centrifugaron (2.000 g, 10 minutos) y se resuspendieron en agua dos 20 veces y a continuación se resuspendieron en 5 volúmenes de 1% (peso/peso) NaHCO3. Las sustancias grasas se extrajeron a continuación dos veces con 1 volumen de éter, seguido de centrifugación (2000 g, durante 10 minutos). Los precipitados se resuspendieron en agua y se filtraron a través de una capa de lana no absorbente premojada. El eluido se colocó sobre 10 volúmenes de 55% (peso/volumen) de una disolución de sacarosa y se centrifugó (2000 g durante 20 minutos). Los oocistos se recogieron de la interfase con la sacarosa y se repitió la etapa de flotación en sacarosa 25 hasta que no se pudo detectar material contaminante visible. Los oocistos purificados se esterilizaron en la superficie con 70% (v/v) etanol enfriado en hielo durante 30 minutos, se lavaron una vez con tampón de fosfato disolución salina (150 mM-1 NaCl, 15 mM-1 KH2PO4, 20 mM-1 Na2HPO4, 27 mM-1 KCl, pH 7,4) (PBS) y se diluyeron en PBS a una concentración de aproximadamente 1 x 107 oocistos/ml-1 y se almacenaron a 4ºC.
Los quistes de Giardia lamblia se adquirieron de Waterborne Inc. (New Orleans, USA). 30
Inactivación de los reservorios de Cryptosporidium y Giardia
Las suspensiones de quistes y oocistos se diluyeron por separado en disolución salina tamponada con fosfato 0,1 M a una concentración de aproximadamente 2 x 105 organismos/ml (tal como se determinó mediante enumeración por citometría de flujo). Se colocaron alícuotas (2 ml) de cada una de las suspensiones por separado en tubos Falcon de 12 x 75 mm. Los tubos se cerraron y a continuación se expusieron a > 200.000 rads. de radiación gamma con el fin de 35 asegurar la inactivación de los microorganismos. Los tubos se etiquetaron como reservorio inactivado y se almacenaron a 4ºC (+/- 4ºC) hasta su utilización.
Instrumentación
Se utilizó un citómetro de flujo Becton Dickinson FACSCalibur para el análisis y separación de células. Anteriormente al encendido del instrumento se adaptó un aparato diseñado específicamente para la recolección de células o 40 microorganismos clasificados por un citómetro FACSCalibur de Beton Dickinson al citómetro de flujo.
El aparato comprende un colector de fracciones FRAC100 (Pharmacia Ltd), un tubo de silicona de una longitud de aproximadamente 25 cm, un ratón modificado para ordenador Macintosh modificado y cables eléctricos.
Cada vez que el colector de fracciones coloca un nuevo tubo en la zona de recolección se envía un pulso electrónico a enchufe de salida en la parte posterior del colector. Este pulso utilizó para señalar al citómetro de flujo que inicie la 45 clasificación de células.
Normalmente, el citómetro de flujo se dispara para clasificar el número de células o microorganismos especificado mediante el movimiento del ícono del ratón sobre el botón de la función adquirir en el software de control del citómetro y a continuación presionando el botón del ratón. En el circuito modificado del ratón se realizó un puente y se reemplazó el interruptor por un optoacoplador. El lado del transistor del optoacoplador realiza el encendido cuando la señal (5 v. lógico) del colector de fracciones llega a la entrada. Se utilizó una batería de 9 voltios con el fin de mantener el voltaje a través del lado del transistor del optoacoplador a un nivel justo por debajo del voltaje de encendido. Se insertó un diodo entre la batería y el transistor para reducir el voltaje aplicado al transistor por la batería de 9 voltios. El ratón modificado se conectó al citómetro insertando el cable del ratón en el puerto del ratón normal. Se conectó un cable eléctrico entre el 5 enchufe de salida de la señal del colector de fracciones y la entrada del circuito modificado del ratón.
Con el fin de conectar el aparato al sistema fluídico del citómetro se realizó la siguiente secuencia:
1) Se abrió la cubierta del citómetro.
2) Se extrajo la protección óptica de la célula de flujo
3) Se extrajo el tubo-clasificador preexistente 10
4) Se conectó el aparato dispensador a la base del citómetro
5) El tubo de clasificador del aparato distribuidor se conectó al cabezal de clasificación del citómetro
6) Se reemplazó el protector óptico de la célula de flujo.
Para iniciar el carrusel se realizó la secuencia siguiente:
1) Se encendió la fuente de energía del carrusel 15
2) Se introdujo un valor de 0,10 como tamaño de fracción
3) Se llenó el carrusel con tubos de plástico de 6 ml.
4) Se colocó el brazo dispensador sobre el primer tubo.
Con el fin de configurar el citómetro se realizó la secuencia siguiente:
1) Se inició el citómetro siguiendo el manual del usuario (Becton Dickinson, San Jose, USA) 20
2) Se llenó el tanque SHEATH con Isoton (Coulter Pty Ltd, Brookvale) y se desgaseó colocando una campana y aplicando el vacío a la campana durante 30 minutos.
3) Se conectó el tanque SHEATH al citómetro y se realizaron dos ciclos de cebado
4) Se desplegó una gráfica de puntos del FSC contra SSC
5) Se seleccionó un amplificador logarítmico para todos los detectores. 25
Dispensación de Cryptosporidium
1) Se cargó una muestra de reservorio de Cryptosporidium inactivado y se actuó en la condición de flujo bajo.
2) Se ajustó el voltaje de los detectores FSC y SSC hasta que la población de oocistos apareció en el centro de la gráfica de puntos.
3) Se ajustó la velocidad umbral hasta que el nivel del umbral fue ligeramente inferior a la población de oocistos. 30
4) Se dibujó una región circular (R1) alrededor de la población de oocistos.
5) Se ajustó el citómetro para clasificar 100 células o microorganismos que aparezcan en la región R1 en modo célula única.
6) Se colocó el cursor de la pantalla del ordenador en el botón AQUIRE (ADQUIRIR).
7) Se deprimió RUN (iniciar) en el colector de fracciones. 35
Cuando se completó la clasificación en los 96 tubos se extrajo la muestra de reservorio inactivado de Cryptosporidium del citómetro y se limpió el citómetro haciendo pasara una muestra de 10% hipoclorito sódico durante 5 minutos.
Dispensación de Giardia
1) Se cargó una muestra del reservorio de Giardia inactivada y se actuó en la condición de flujo bajo.
2) La velocidad umbral se ajustó hasta que el nivel de umbral estuvo ligeramente por debajo de la población de quistes. 40
3) Se colocó la región (R1) sobre la población oocistos.
4) Se ajustó el citómetro para clasificar 100 células o microorganismos que aparezcan en la región R1 en modo CÉLULA ÚNICA.
5) Se colocó el cursor de la pantalla del ordenador sobre el botón AQUIRE (adquirir).
6) Se colocó el brazo dispensador del colector de fracciones sobre el primer tubo de ensayo. 5
7) Se deprimió el botón RUN (iniciar) en el colector de fracciones.
Cuando se completó la clasificación en los 96 tubos se taparon los tubos, se colocaron en gradillas a 4ºC y se sometieron a radiación gamma durante 8 horas.
Esterilización de los tubos
Los tubos de ensayo con los oocistos de Cryptosporidium y Giardia clasificados se expusieron a > 200.000 rads de 10 radiación gamma y a continuación se almacenaron a 4ºC.
Control de calidad
Se analizaron cinco por ciento de los tubos de ensayo producidos (uniformemente espaciados en la carrera de producción) para verificar que existía el número correcto de Giardia y Cryptosporidium en cada uno de los tubos.
Se filtraron (0,22 μm) anticuerpos monoclonales marcados con fluoresceína isotiocianato (FITC), específicos a 15 Cryptosporidium y Giardia y a continuación se añadió 100 μl a cada uno de los tubos de ensayo. Después de una incubación a temperatura ambiente durante 15 minutos se analizaron las muestras utilizando citometría de flujo y se registró el número de quistes y oocistos en cada uno de los tubos.
Se determinó la media y la desviación estándar para el número de quistes y oocistos en los tubos ensayados y se registró. 20
Se pesaron todos los tubos que se produjeron y se descartaron los tubos que pesaron más o menos de 0,1 g sobre el peso medio de todos los tubos.
Utilización de las muestras
Las muestras de oocistos de Cryptosporidium y quistes de Giardia se utilizaron para realizar el control de calidad de un procedimiento de separación inmunomagnética y un procedimiento de citometría de flujo utilizado por un laboratorio 25 comercial para ensayar la presencia de Cryptosporidium y Giardia en muestras de agua.
Se añadieron cincuenta tubos de ensayo de las muestras a agua con grado de reactivo y se analizaron utilizando los procedimientos de separación inmunomagnética y citometría de flujo. Los resultados se expresaron como porcentajes de recuperación utilizando la fórmula siguiente:
(número detectado / media del material control) x 100 30
La recuperación promedio de oocistos de Cryptosporidium y quistes de Giardia de las 50 muestras de agua con grado de reactivo analizadas fue de 82% + 18 y 72% + 16 respectivamente.
BIBLIOGRAFÍA
Reynolds, D. D., Slade, R.B., Sykes, N.J., Jonas, A. y Fricker, C.R. 1999. Isolation of Cryptosporidium Oocysts from Water: How can precise recovery data be generated? J. Appl. Microbiol. in press. 35
Shapiro, H. M., 1995. A practical guide to flow cytometry, Third Edition. A.R. Liss, New York.
Vesey, G., Hutton, P.E., Champion, A.C., Ashbolt, N.J., Williams, K.L, Warton, A., y Veal, D.A., 1994a. Application of flow cytometric methods for the routine detection of Cryptosporidium and Giardia in water. Cytometry, 16:1-6.
Vesey, G., Narai, J; Ashbolt, N.; Williams, K.L. y Veal, D.A. 1994b. Detection of specific microorganisms in environmental samples using flow cytometry. En: Methods in Cell Biology, Volume 42 - Flow Cytometry Second Edition. ed. 40 Darzynkiewicz, Z., Robinson, J.P. y Crissman, H.A., pp.489-522, Academic Press Inc., New York.

Claims (13)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Procedimiento para la preparación automática de muestras que contienen un número predeterminado de células o microorganismos deseados que comprende:
    proporcionar un separador de partículas bajo control de software; 5
    proporcionar un aparato de recolección que presenta un receptáculo o superficie que retiene las células o los microorganismos, en el que el separador de partículas y el aparato de recolección se encuentran en comunicación electrónica mediante un circuito de ratón de ordenador modificado que presenta un interruptor de botón puenteado mediante un optoacoplador;
    separar un número predeterminado de las células o microorganismos deseados mediante el separador de partículas; y 10
    distribuir el número predeterminado de células o microorganismos mediante el separador de partículas en el receptáculo o en la superficie del aparato de recolección de acuerdo con una señal del aparato de recolección;
    en el que la señal se envía desde el aparto de recolección al separador de partículas mediante el circuito de ratón de ordenador modificado que activa el software que controla el separador de partículas a través de un botón de función de adquisición del software de control del separador de partículas de manera que cuando se ha recibido una señal el 15 número predeterminado de células o microorganismos se administra dentro del receptáculo o sobre la superficie que está colocado durante el tiempo suficiente para recoger las células o los microorganismos mediante el aparato recolector, y en el que a continuación de la recolección de las células o los microorganismos el aparato de recolección avanza y coloca un receptáculo o superficie posterior para recibir las células o los microorganismos posteriores, señalando el aparato recolector a continuación el separador de partículas mediante el circuido de ratón de ordenador 20 modificado para iniciar la distribución de otro número predeterminado de células o microorganismos,
    en el que el separador de partículas es un citómetro de flujo.
  2. 2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que las células o los microorganismos se seleccionan de entre células, bacterias, protozoos, levaduras, hongos, esporas, polen o virus.
  3. 3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que las células son animales o vegetales. 25
  4. 4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el separador de partículas es un separador de líquidos automático seleccionado de entre el grupo constituido por citómetro de flujo, aparato Coulter para la separación de partículas, y un separador óptico de partículas.
  5. 5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el aparato recolector es un colector de fracciones. 30
  6. 6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que las células o los microorganismos se irradian con radiación gamma o radiación U.V.
  7. 7. Procedimiento para la preparación automática de muestras que contienen números predeterminados de los microorganismos o las células deseados que comprende:
    separar los microorganismos o las células utilizando un citómetro de flujo bajo el control de software; 35
    distribuir mediante el citómetro de flujo números predeterminados de microorganismos o células separados dentro de un receptáculo o sobre una superficie que puede retener los microorganismos o células colocados en una zona de recolección mediante un colector de fracciones durante el tiempo suficiente para recoger los microorganismos o las células;
    mover automáticamente el receptáculo o la superficie fuera de la zona de recolección y colocar otro receptáculo o 40 superficie en la zona de recolección;
    señalar automáticamente el citómetro de flujo para dispensar los microorganismos o las células; y
    repetir automáticamente la distribución de los microorganismos o las células hasta que se ha preparado el número de muestras requerido, en el que la señalación automática al citómetro de flujo para distribuir los microorganismos o las células es realizada por el colector de fracciones cada vez que el colector de fracciones coloca un nuevo tubo en la zona 45 de recolección mediante el envío de una señal a través del circuito de ratón de ordenador modificado en el que un interruptor de botón de ratón está puenteado y reemplazado por un optoacoplador que activa el software que controla el citómetro de flujo mediante un botón para la función de adquisición del software de control del citómetro de flujo.
  8. 8. Procedimiento según la reivindicación 7, que comprende además:
    realizar un análisis en un porcentaje de las muestras con el fin de confirmar el número de microorganismos o células en las muestras.
  9. 9. Procedimiento según la reivindicación 7 u 8, que comprende además:
    pesar una muestra como procedimiento adicional de control de calidad.
  10. 10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que la muestra se tiñe con un marcador para 5 diferenciar los microorganismos o células diana de las partículas contaminantes contenidas en la muestra.
  11. 11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que la muestra se tiñe con un marcador de anticuerpos fluorescente.
  12. 12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en el que los microorganismos o las células clasificados que forman la muestra de control se irradian mediante radiación gamma o radiación UV.
  13. 13. Sistema para la preparación automática de muestras de control que contienen números deseados de 10 microorganismos o células que comprende:
    un citómetro de flujo bajo el control de software; y
    un colector de fracciones que presenta una zona de recolección que aloja una pluralidad de receptáculos o superficies para la retención de microorganismos o células, en el que el citómetro de flujo y el colector de fracciones se encuentran en comunicación electrónica mediante un circuito de ratón de ordenador modificado que presenta un interruptor de 15 botón de ratón puenteado mediante un optoacoplador; el circuito de ratón de ordenador modificado está adaptado para pasar una señal desde el colector de fracciones al citómetro de flujo que activa el software que controla una instrucción de clasificación para el citómetro de flujo a través de un botón para la función de adquisición del software de control del citómetro de flujo;
    en el que la instrucción de clasificación enviada desde el colector de fracciones al citómetro de flujo mediante el circuito 20 del ratón modificado activa el software que controla el citómetro de flujo mediante un botón de función de adquisición en el software de control del citómetro de manera que cuando se ha enviado una instrucción el número predeterminado de microorganismos o células se administra en el receptáculo o sobre la superficie que se coloca durante el tiempo suficiente para recoger los microorganismos o células por el colector de fracciones,
    a continuación de la recolección el colector de fracciones avanza y coloca un receptáculo o superficie posterior con el fin 25 de recibir los microorganismos o células posteriores, señalando el colector de fracciones a continuación al citómetro de flujo a través del circuito de ratón modificado para que inicie otra instrucción de clasificación.
ES01911266T 2000-03-16 2001-03-12 Procedimiento para la preparación de muestras de control de partículas tales como microorganismos y células. Expired - Lifetime ES2352882T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AUPQ6291A AUPQ629100A0 (en) 2000-03-16 2000-03-16 Process for preparing controlled samples of particles such as microorganisms and cells
AUPQ6291 2000-03-16

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2352882T3 true ES2352882T3 (es) 2011-02-23

Family

ID=3820388

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES01911266T Expired - Lifetime ES2352882T3 (es) 2000-03-16 2001-03-12 Procedimiento para la preparación de muestras de control de partículas tales como microorganismos y células.

Country Status (10)

Country Link
US (1) US7186502B2 (es)
EP (1) EP1263983B1 (es)
JP (1) JP4892157B2 (es)
AT (1) ATE485388T1 (es)
AU (1) AUPQ629100A0 (es)
BR (1) BR0108804A (es)
CA (1) CA2402538C (es)
DE (1) DE60143289D1 (es)
ES (1) ES2352882T3 (es)
WO (1) WO2001068902A1 (es)

Families Citing this family (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6780581B2 (en) 2001-09-12 2004-08-24 Btf Pty Ltd Products comprising quantum of bioparticles and method for production thereof
JP2007232501A (ja) * 2006-02-28 2007-09-13 Fuji Electric Systems Co Ltd 環境試料中の検出対象物の調整方法及び検出方法
EP2157599A1 (en) * 2008-08-21 2010-02-24 Nederlandse Organisatie voor toegepast- natuurwetenschappelijk onderzoek TNO Method and apparatus for identification of biological material
US8691145B2 (en) 2009-11-16 2014-04-08 Flodesign Sonics, Inc. Ultrasound and acoustophoresis for water purification
WO2011159957A2 (en) 2010-06-16 2011-12-22 Flodesign Sonics, Inc. Phononic crystal desalination system and method of use
US9421553B2 (en) 2010-08-23 2016-08-23 Flodesign Sonics, Inc. High-volume fast separation of multi-phase components in fluid suspensions
US8679338B2 (en) 2010-08-23 2014-03-25 Flodesign Sonics, Inc. Combined acoustic micro filtration and phononic crystal membrane particle separation
US9340435B2 (en) 2012-03-15 2016-05-17 Flodesign Sonics, Inc. Separation of multi-component fluid through ultrasonic acoustophoresis
US10370635B2 (en) 2012-03-15 2019-08-06 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic separation of T cells
US9950282B2 (en) 2012-03-15 2018-04-24 Flodesign Sonics, Inc. Electronic configuration and control for acoustic standing wave generation
US9752113B2 (en) 2012-03-15 2017-09-05 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic perfusion devices
US10967298B2 (en) 2012-03-15 2021-04-06 Flodesign Sonics, Inc. Driver and control for variable impedence load
US9623348B2 (en) 2012-03-15 2017-04-18 Flodesign Sonics, Inc. Reflector for an acoustophoretic device
US10322949B2 (en) 2012-03-15 2019-06-18 Flodesign Sonics, Inc. Transducer and reflector configurations for an acoustophoretic device
US9822333B2 (en) 2012-03-15 2017-11-21 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic perfusion devices
US9272234B2 (en) 2012-03-15 2016-03-01 Flodesign Sonics, Inc. Separation of multi-component fluid through ultrasonic acoustophoresis
US9567559B2 (en) 2012-03-15 2017-02-14 Flodesign Sonics, Inc. Bioreactor using acoustic standing waves
US9745548B2 (en) 2012-03-15 2017-08-29 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic perfusion devices
US9688958B2 (en) 2012-03-15 2017-06-27 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic bioreactor processes
US10689609B2 (en) 2012-03-15 2020-06-23 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic bioreactor processes
US9752114B2 (en) 2012-03-15 2017-09-05 Flodesign Sonics, Inc Bioreactor using acoustic standing waves
US9422328B2 (en) 2012-03-15 2016-08-23 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic bioreactor processes
US10953436B2 (en) 2012-03-15 2021-03-23 Flodesign Sonics, Inc. Acoustophoretic device with piezoelectric transducer array
US10040011B2 (en) 2012-03-15 2018-08-07 Flodesign Sonics, Inc. Acoustophoretic multi-component separation technology platform
US9458450B2 (en) 2012-03-15 2016-10-04 Flodesign Sonics, Inc. Acoustophoretic separation technology using multi-dimensional standing waves
US9416344B2 (en) 2012-03-15 2016-08-16 Flodesign Sonics, Inc. Bioreactor using acoustic standing waves
US9783775B2 (en) 2012-03-15 2017-10-10 Flodesign Sonics, Inc. Bioreactor using acoustic standing waves
US9796956B2 (en) 2013-11-06 2017-10-24 Flodesign Sonics, Inc. Multi-stage acoustophoresis device
US10704021B2 (en) 2012-03-15 2020-07-07 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic perfusion devices
US10737953B2 (en) 2012-04-20 2020-08-11 Flodesign Sonics, Inc. Acoustophoretic method for use in bioreactors
US11324873B2 (en) 2012-04-20 2022-05-10 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic blood separation processes and devices
US9725690B2 (en) 2013-06-24 2017-08-08 Flodesign Sonics, Inc. Fluid dynamic sonic separator
US9745569B2 (en) 2013-09-13 2017-08-29 Flodesign Sonics, Inc. System for generating high concentration factors for low cell density suspensions
US9725710B2 (en) 2014-01-08 2017-08-08 Flodesign Sonics, Inc. Acoustophoresis device with dual acoustophoretic chamber
US10697719B2 (en) * 2018-08-09 2020-06-30 International Business Machines Corporation Monitoring a recirculating cooling system for bacterial growth
KR102450509B1 (ko) 2014-05-08 2022-10-04 프로디자인 소닉스, 인크. 압전 트랜듀서 어레이를 구비한 음파영동 장치
US9744483B2 (en) 2014-07-02 2017-08-29 Flodesign Sonics, Inc. Large scale acoustic separation device
US9827511B2 (en) 2014-07-02 2017-11-28 Flodesign Sonics, Inc. Acoustophoretic device with uniform fluid flow
WO2016054192A1 (en) 2014-09-30 2016-04-07 Flodesign Sonics, Inc. Acoustophoretic clarification of particle-laden non-flowing fluids
RU2689582C2 (ru) 2014-10-24 2019-05-28 Лайф Текнолоджиз Корпорейшн Система жидкостно-жидкостной очистки образца с акустическим осаждением
US10106770B2 (en) 2015-03-24 2018-10-23 Flodesign Sonics, Inc. Methods and apparatus for particle aggregation using acoustic standing waves
US11021699B2 (en) 2015-04-29 2021-06-01 FioDesign Sonics, Inc. Separation using angled acoustic waves
CA2984492A1 (en) 2015-04-29 2016-11-03 Flodesign Sonics, Inc. Acoustophoretic device for angled wave particle deflection
US11420136B2 (en) 2016-10-19 2022-08-23 Flodesign Sonics, Inc. Affinity cell extraction by acoustics
US11708572B2 (en) 2015-04-29 2023-07-25 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic cell separation techniques and processes
US11377651B2 (en) 2016-10-19 2022-07-05 Flodesign Sonics, Inc. Cell therapy processes utilizing acoustophoresis
US9550134B2 (en) 2015-05-20 2017-01-24 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic manipulation of particles in standing wave fields
WO2016201385A2 (en) 2015-06-11 2016-12-15 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic methods for separation cells and pathogens
US9663756B1 (en) 2016-02-25 2017-05-30 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic separation of cellular supporting materials from cultured cells
CA2995043C (en) 2015-07-09 2023-11-21 Bart Lipkens Non-planar and non-symmetrical piezoelectric crystals and reflectors
US11474085B2 (en) 2015-07-28 2022-10-18 Flodesign Sonics, Inc. Expanded bed affinity selection
US11459540B2 (en) 2015-07-28 2022-10-04 Flodesign Sonics, Inc. Expanded bed affinity selection
AU2017212067A1 (en) * 2016-01-26 2018-08-02 Ricoh Company, Ltd. Droplet forming device and dispensing device
US10710006B2 (en) 2016-04-25 2020-07-14 Flodesign Sonics, Inc. Piezoelectric transducer for generation of an acoustic standing wave
US11214789B2 (en) 2016-05-03 2022-01-04 Flodesign Sonics, Inc. Concentration and washing of particles with acoustics
CN114891635A (zh) 2016-05-03 2022-08-12 弗洛设计声能学公司 利用声泳的治疗细胞洗涤、浓缩和分离
US11085035B2 (en) 2016-05-03 2021-08-10 Flodesign Sonics, Inc. Therapeutic cell washing, concentration, and separation utilizing acoustophoresis
KR102439221B1 (ko) 2017-12-14 2022-09-01 프로디자인 소닉스, 인크. 음향 트랜스듀서 구동기 및 제어기
JP7374124B2 (ja) * 2018-04-27 2023-11-06 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー フローサイトメトリで選別された試料のための収集システムおよびそれを使用する方法
WO2022020260A1 (en) 2020-07-20 2022-01-27 Stratix Labs Corporation Methods and articles for testing disinfectant and sanitizer efficacy

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0720658A1 (en) * 1993-09-23 1996-07-10 E.I. Du Pont De Nemours And Company An electrophoretic method for the isolation and separation of microorganisms
AUPN214095A0 (en) * 1995-04-03 1995-04-27 Australian Water Technologies Pty Ltd Method for detecting microorganisms using flow cytometry
AUPN514695A0 (en) 1995-08-30 1995-09-21 Australian Water Technologies Pty Ltd Method for detection of cryptosporidium oocysts
GB2316081B (en) 1996-08-12 2001-05-09 Bio Dot Ltd Dispensing of particles
US6335156B1 (en) * 1997-12-18 2002-01-01 The Johns Hopkins University School Of Medicine 14-3-3σ arrests the cell cycle
US6071689A (en) * 1997-12-31 2000-06-06 Xy, Inc. System for improving yield of sexed embryos in mammals
US6281018B1 (en) * 1998-02-26 2001-08-28 Coulter International Corp. Selective purification and enrichment sorting of flow cytometer droplets based upon analysis of droplet precursor regions
US6129893A (en) * 1998-05-13 2000-10-10 Calgon Carbon Corporation Method for preventing replication in Cryptosporidium parvum using ultraviolet light
US6074880A (en) 1998-08-28 2000-06-13 Transgenomic, Inc. Sample analyte containing solution fraction collection system, and method of use
AUPQ196199A0 (en) 1999-08-02 1999-08-26 Btf Pty Ltd Internal quality control

Also Published As

Publication number Publication date
US7186502B2 (en) 2007-03-06
BR0108804A (pt) 2002-11-05
EP1263983A4 (en) 2005-02-23
JP4892157B2 (ja) 2012-03-07
EP1263983A1 (en) 2002-12-11
CA2402538C (en) 2011-11-08
DE60143289D1 (de) 2010-12-02
US20030186331A1 (en) 2003-10-02
JP2003526379A (ja) 2003-09-09
EP1263983B1 (en) 2010-10-20
WO2001068902A1 (en) 2001-09-20
CA2402538A1 (en) 2001-09-20
AUPQ629100A0 (en) 2000-04-15
ATE485388T1 (de) 2010-11-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2352882T3 (es) Procedimiento para la preparación de muestras de control de partículas tales como microorganismos y células.
US5092184A (en) Cell staining system for flow cytometry
JP3825501B2 (ja) 微小物質保持担体、その懸濁系、微小物質操作装置及び微小物質位置制御方法
CN101533012A (zh) 应用永久磁铁的用于成像生物样本中靶标组分的方法和设备
JP7366931B2 (ja) 制御されたエアロゾル含有量を有する密閉された液滴ソータを有するフローサイトメータおよびそれを使用する方法
WO2007128737A2 (en) Method and device to fractionate stem cells
Witlin Detection of antibodies by microtitrator techniques
US20230280351A1 (en) High throughput analysis and sorting, and sampling interface and assembly for high throughput analysis and sorting
EP1642139A1 (en) Particle agglutination detection method and device
Dzik Principles of counting low numbers of leukocytes in leukoreduced blood components
WO2022181049A1 (ja) 細胞処理システム、細胞処理方法、学習データ作成方法
EP0608987A1 (en) Method for detecting rare events
Tanke et al. Selection of defined cell types by flow-cytometric cell sorting
AU2001240350B2 (en) Process for preparing controlled samples of particles such as microorganisms and cells
JP7374124B2 (ja) フローサイトメトリで選別された試料のための収集システムおよびそれを使用する方法
JP2018503801A (ja) フローサイトメトリー細胞ソートシステム及びその使用方法
CN117015695A (zh) 封闭系统分选流式细胞仪适配器及其使用方法
JP4683604B2 (ja) 内部精度管理法
AU2001240350A1 (en) Process for preparing controlled samples of particles such as microorganisms and cells
Wulff et al. Guide to flow cytometry
US20040180330A1 (en) Internal quality control
Davies Cell separations by flow cytometry
Channarayappa et al. Immunofluorescent staining of kinetochores in micronucleus for detection of aneuploidy inducing agents
Williams et al. A novel method for counting eimerian oocysts at very low concentrations in aqueous suspensions
Parker Flow Cytometry in Lymphoma/Leukemia Diagnosis