ES2428920T3 - Procedimiento de citometría de flujo para la determinación del número total de leucocitos y del número de trombocitos, así como para la diferenciación de leucocitos en muestras de sangre de aves - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la determinación del número total de leucocitos en la sangre de aves o gallináceas, que comprende las etapas: (a) habilitación de una muestra de sangre no coagulada, (b) eventualmente, fijación de la muestra, (c) dilución de la muestra, (d) puesta en contacto de la muestra diluida con un marcador de pan-leucocitos y un marcador de trombocitos, (e) medición de la muestra en un citómetro de flujo sin etapas de lavado ni purificación previas y (f) determinación cuantitativa de la población de leucocitos así como de la población de trombocitos en la muestra.

Description

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Procedimiento de citometria de flujo para la determinacion del numero total de leucocitos y del numero de trombocitos, asi como para la diferenciacion de leucocitos en muestras de sangre de aves La presente invencion se refiere a un procedimiento para la determinacion del numero total de leucocitos y del numero de trombocitos, asi como para la diferenciacion de leucocitos en la sangre de aves, utilizando marcadores de pan-leucocitos y trombocitos marcados por fluorescencia y/u otros marcadores de leucocitos, sin una previa separacion de eritrocitos. El hemograma de globulos rojos y de globulos blancos se establece rutinariamente en la medicina humana y de mamiferos con el fin de examinar el estado de salud de individuos y poblaciones. Variaciones en la hemostasis de los leucocitos se representan en el hemograma de globulos blanco (leucograma). Este contiene la determinacion del numero total de leucocitos, el hemograma diferencial, el calculo de los numeros absolutos de las diferentes fracciones de leucocitos por 1l de sangre y la valoracion morfologica de los leucocitos en el frotis de sangre tefido. El leucograma proporciona al clinico una idea sobre el estado actual del sistema inmunologico de pacientes. Dado que los numeros de leucocitos en el caso de individuos sanos son relativamente constantes, pero varian probablemente de manera intensa en el caso de la presencia de una enfermedad, el hemograma de globulos blancos tiene una funcion indicadora. Las respuestas de leucocitos no son, por norma general, ciertamente patognomicas (consideradas por si solas, ya suficientes para un seguro establecimiento de diagnostico). Sin embargo, pueden proporcionar valiosas informaciones que ayudan a establecer un diagnostico de sospecha, confirmar un diagnostico diferencial, vigilar el exito de una terapia o emitir un pronostico. Variaciones del hemograma de globulos blanco arrastran tras de si en el dia a dia clinico, en ocasiones, consecuencias terapeuticas directas, p. ej. en forma de un tratamiento antibiotico. Finalmente, la mayoria de las veces son uno de los primeros indicios de diagnostico del laboratorio sobre la presencia de infecciones que amenazan la vida. La determinacion del numero total de leucocitos y del hemograma diferencial pertenece a los ensayos de laboratorio llevados a cabo con mayor frecuencia en la medicina humana. En virtud de la elevada precision, exactitud y rapidez de los aparatos de analisis de hematologia automaticos, estos ensayos se llevan a cabo entretanto de manera predominante de forma automatizada en la medicina humana. Solamente las muestras, en cuyo analisis fracase el aparato o en las que este, en virtud de particularidades, requiera una verificacion, se valoran al microscopio. En contraposicion a la hematologia en mamiferos, la hematologia de aves se sigue encontrando todavia en sus comienzos. Se describio la morfologia de las celulas de la sangre de las aves y se desarrollaron tecnicas manuales para el recuento de leucocitos. Sin embargo, se impidieron avances decisivos en la hematologia de las aves, dado que faltan procesos de ensayo automatizados. Ninguno de los procedimientos automatizados establecidos en la hematologia de mamiferos es adecuado para el ensayo de la sangre de aves. Los motivos de ello se encuentran en la particular constitucion de las celulas de la sangre de las aves. En el caso del recuento de leucocitos en aparatos de analisis de hematologia, los eritrocitos perturbadores son lisados habitualmente mediante la adicion de cloruro de amonio o disoluciones hipotonicas. Sin embargo, los eritrocitos de las aves, al igual que los de todos los vertebrados no pertenecientes a los mamiferos (reptiles, anfibios, peces, etc.) contienen un nucleo, pero solo se pueden lisar dificilmente y durante la medicion no se pueden diferenciar de manera fiable de leucocitos. Ademas, en el caso de los trombocitos de las aves, a diferencia de las plaquetas sanguineas de los mamiferos, se trata de celulas nucleadas del tamafo de los linfocitos, las cuales los aparatos de analisis de hematologia no permiten tampoco diferenciar de manera fiable de los leucocitos. En la bibliografia se sefala, ademas, que junto a eritrocitos y trombocitos intactos, los nucleos que se liberan durante una lisis de los eritrocitos conducen tambien a interferencias. Los procedimientos de recuento de particulas electronicos habituales y los procedimientos habituales de recuento en camaras no pueden con ello emplearse para determinar el numero total de leucocitos en la sangre de las aves. Por lo tanto, se desarrollaron numerosos procedimientos manuales para la determinacion del numero total de leucocitos en la sangre de las aves. Sin embargo, todas estas tecnicas requieren mucho tiempo y son imprecisas. El bajo numero de celulas contadas en el caso de los procedimientos de microscopia resulta en un error estadistico elevado. Las dificultades adicionales durante la diferenciacion de leucocitos en la sangre de aves conducen a confusiones y hacen que los procedimientos de microscopia sean todavia menos fiables y mas propensos a errores. Ensayos de adaptar los aparatos disponibles para el recuento y la diferenciacion de leucocitos de sangre de aves

discurrieron predominantemente sin exito. Ciertamente, se informo de resultados satisfactorios en el caso del empleo del aparato de analisis de hematologia Cell-Dyn 3500 de la razon social Abbott Laboratories para examinar la sangre de papagayos, gorriones, aves acuaticas y aves corredoras (Fudge, Abstract in Main Conference Proceedings de la Association of Avian Veterinarians 1995). El compendio finaliza con la nota de que los datos de precision preliminares dados en la presentacion, que deben ser publicados, serian discutidos. Hasta el momento presente, no se ha podido encontrar, no obstante, publicacion del autor alguna que contuviera informaciones sobre este tema. En un libro editado por el mismo, cinco afos mas tarde, escribe que la tecnologia de la citometria de flujo requeriria todavia de mejoras. Abordando los problemas, declara que para las distintas especies de aves, en virtud de su diferente morfologia de los leucocitos, serian necesarios distintos ajustes de los aparatos. Ademas, se reconocen dificultades en la diferenciacion entre trombocitos y linfocitos.

Otra autora informa incluso que con el aparato Cell-Dyn-3500 no era posible una buena diferenciacion de los leucocitos en linfocitos y granulocitos (Comparacion de metodos de ensayo hematologicos en aves, Diss, Vet. Med. Univ. Viena Reauz, E. 1996). Unicamente, en la medicion del hematocrito y del numero total de leucocitos se habria alcanzado un resultado satisfactorio. En su trabajo, Reauz ha examinado sangre de aves con todavia otro aparato automatico de hematologia (MS9, Melet Schloesing. Francia). En este caso, para los parametros hematocrito, numero de eritrocitos, numero total de leucocitos, linfocitos, monocitos y granulocitos se habrian alcanzado valores que coincidirian bien con los resultados determinados con los metodos convencionales. No pudieron, sin embargo, encontrarse publicaciones que fueran mas alla sobre el empleo de este aparato para el examen de sangre de aves.

Un examen ulterior de sangre de gallinas con el aparato Cell-Dyn 3500 informa de valores de granulocitos que presentan una exactitud quot;aceptablequot;. A pesar del empleo del software especial VET 2.3 ofrecido por el fabricante, con ajustes especiales para el examen de la sangre de aves, los numeros de linfocitos habrian sido, sin embargo, totalmente imprecisos, toda vez que en el caso de mediciones multiples de las mismas muestras habria que registrar diferencias, en parte considerables, entre los resultados de la medicion. Por lo tanto, el autor tiene pocas esperanzas de que el examen automatizado de sangre de aves pudiera funcionar de manera similarmente bien como en el caso de los mamiferos.

La tecnologia de Capa Leucocitaria Cuantitativa, empleada primeramente en la medicina humana, posibilita tambien en el caso de diferentes animales domesticos una determinacion aproximada rapida del numero total de leucocitos, asi como el establecimiento de un hemograma diferencial. Seidl sometio a ensayo el procedimiento en muestras de sangre de psitacidas. El unico parametro que pudo determinarse de manera fiable en la sangre de aves era, sin embargo, el hematocrito. Como causa de los resultados no satisfactorios en el caso de los otros parametros, no se indica la separacion exacta de las bandas de celulas individuales.

A la vista de las dificultades, hasta ahora no resueltas, en el examen automatizado de la sangre de aves, se continua recurriendo hasta ahora en la medicina de aves, por lo tanto, ampliamente a procedimientos microscopicos laboriosos y no fiables, o se renuncia por completo a estos importantes ensayos hematologicos.

Por lo tanto, existe una demanda adicional de investigacion de desarrollar un procedimiento automatizado que supere estos problemas. Un procedimiento de este tipo daria alas para la investigacion de la hematologia de aves.

Desde hace tiempo, existe una necesidad de examinar numeros mayores de muestras de sangre de aves de corral la cual, en virtud de la ausencia de un metodo automatizado para establecer un hemograma de globulos blancos en las aves, no ha podido ser hasta ahora satisfecha.

En ensayos cientificos, la determinacion de la relacion entre granulocitos heterofilos y linfocitos se aprovecha muchas veces como medida de la carga por estres de gallinas. Ademas, la determinacion de la relacion granulocitos heterofilos/linfocitos encuentra ya aplicacion en la crianza de razas de gallinas resistentes al estres o bien a las enfermedades. Tambien en el marco del desarrollo y del examen de vacunas para aves de corral existe la necesidad de establecer hemogramas de globulos blancos. Asi, en el caso de aves de corral se presentan diferentes enfermedades viricas inmunosupresoras que provocan enormes perjuicios economicos. En el marco de estudios para la seguridad de vacunas vivas contra enfermedades de este tipo ya se sefalizo un interes por parte de diferentes fabricantes de vacunas frente a instalaciones de investigacion universitarias de establecer mayores numeros de hemogramas de globulos blancos en el caso de gallinas. Finalmente, la directriz UE 2001/82/EG (parrafo C 5) para los procesos de admision de vacunas para animales en los Estados miembros exige: quot;en la medida en que el medicamento inmunologico para animales pudiera tener un efecto negativo sobre la reaccion inmune del animal vacunado o de sus descendientes, se han de llevar a cabo ensayos adecuados sobre las funciones inmunologicasquot;. La importancia que se otorga en toda Europa al complejo de las enfermedades inmunosupresoras en el caso de aves de corral lo demuestra tambien la Accion COST 839 financiada por la UE quot;Immunosuppressive Viral Diseases in Poultryquot;.

En la investigacion biologica celular se ha establecido con la citometria de flujo una tecnica extremadamente productiva para la diferenciacion y el recuento de las mas diversas celulas presentes en suspension.

La tecnica se emplea ya en el diagnostico rutinario en medicina humana. Un ejemplo clasico de ello es el recuento de celulas T CD4-positivas en el marco del diagnostico del SIDA y para controles de seguimiento en pacientes de VIH. Aplicaciones similares a la citometria de flujo son el recuento de monocitos y de celulas hematopoyeticas.

A pesar de que desde hace afos se conoce el problema y existia la necesidad, no esta documentado el que con ayuda de la citometria de flujo pudiera desarrollarse un procedimiento automatizado adecuado en la practica, que permitiera una determinacion del numero total de leucocitos asi como el establecimiento de un hemograma diferencial en el caso de gallinas u otras aves.

Ciertamente, ya se publico un procedimiento de citometria de flujo para la determinacion del numero de linfocitos en la sangre de codornices, el cual se basa en el uso de los colorantes yoduro de 3,3'-dipentiloxacarbocianina (DiOC5(3)) o yoduro de 3,3'-dihexiloxacarbocianina (DiOC6(3)) (Moritomo et al., J. Vet. Med. Sci. 64 (2002), 11491151; Uchiyama et al., J. Vet. Med. Sci. 67 (2005), 441-444). Sin embargo, esta tecnica no se ha impuesto hasta el momento actual ni en la investigacion ni en el diagnostico rutinario. Algunas investigaciones demuestran que con esta tecnica a menudo no se consigue, en el analisis de la sangre de gallinas, una diferenciacion fiable de las diferentes poblaciones de celulas.

Otras tecnicas de citometria de flujo son empleadas tambien en la ciencia por diferentes grupos de trabajo que investigan el sistema inmunologico de la gallina, para la identificacion y el recuento de diferentes fracciones de leucocitos.

En trabajos de investigacion con respecto a la inmunologia de gallinas, se antepone por norma general el aislamiento de los leucocitos con ayuda de tecnicas de centrifugacion especiales con el fin de separarlas de eritrocitos no lisables perturbadores (vease, p. ej., Bohls et al., Dev. Comp. Immunol.). Muestras preparadas de esta manera no permiten, sin embargo, una cuantificacion absoluta de las celulas en cuestion, referida al volumen de la sangre. Ademas, preparados de celulas de este tipo, producidos habitualmente con ayuda de la centrifugacion de quot;baja velocidadquot; o por el quot;gradiente de densidad de Ficollquot; no contienen o solo contienen muy pocos granulocitos, dado que estos son separados junto con los eritrocitos.

En la bibliografia se describe un metodo para el recuento por citometria de flujo de sub-poblaciones de leucocitos en muestras de sangre entera de gallinas (Burgess y Davison, J. Immunol. Meth. 227 (1999), 169-176). La tecnica se basa esencialmente en el procedimiento empleado por ejemplo en medicina humana en el diagnostico del SIDA y la vigilancia de la terapia del SIDA de forma rutinaria para la cuantificacion de celulas T colaboradoras CD4positivas. En este caso, se emplean anticuerpos monoclonales directamente acoplados con colorantes de fluorescencia. Con el fin de obtener una concentracion de celulas que pueda ser todavia elaborada por el citometro de flujo, la muestra de sangre se diluye intensamente antes de la medicion. En consecuencia, debe aumentarse en un multiplo el tiempo de medicion con el fin de poder determinar, a pesar de ello, un numero suficiente de leucocitos, ya que en el caso de la mayoria predominante de las celulas presentes en la muestra se trata de eritrocitos. Adicionalmente, se afaden particulas fluorescentes en una concentracion conocida, con el fin de poder determinar numeros absolutos de celulas.

Burgess et al. reconocieron ciertamente que con la tecnica por ellos descrita se podian identificar y cuantificar poblaciones especificas de PBLs (linfocitos de la sangre periferica - siglas en aleman). Sin embargo, no encuentra indicio alguno de que el procedimiento pudiera aprovecharse para la determinacion del numero total de leucocitos ni para establecer un hemograma diferencial completo.

Conforme a la presente invencion, mediante el empleo combinado de un marcador de pan-leucocitos y de un marcador de trombocitos se posibilita, tambien en el caso de la tincion directa de sangre entera, una delimitacion segura de las poblaciones de eritrocitos, trombocitos y leucocitos.

Un objeto de la invencion es, por consiguiente, un procedimiento para la determinacion del numero total de leucocitos en la sangre de aves o gallinaceas, que comprende las etapas:

(a)

habilitacion de una muestra de sangre no coagulada;

(b)

eventualmente, fijacion de la muestra,

(c)

dilucion de la muestra,

(d)

puesta en contacto de la muestra diluida con un marcador de pan-leucocitos y un marcador de trombocitos,

(e)

medicion de la muestra en un citometro de flujo sin etapas de lavado ni purificacion previas y

(f)

determinacion cuantitativa de la poblacion de leucocitos asi como de la poblacion de trombocitos en la muestra

conforme a la reivindicacion 1.

En las reivindicaciones 2-6 se describen realizaciones preferidas. Realizaciones en la parte descriptiva que no se refieren a la determinacion del numero total de leucocitos en la sangre de aves o gallinaceas, unicamente se mencionan como ejemplos de referencia.

El procedimiento permite la determinacion del numero total de leucocitos y del numero de trombocitos asi como el establecimiento de hemogramas diferenciales (diferenciacion de leucocitos) en la gallina. La tecnica es transferible, en el caso de la disponibilidad de las sustancias marcadoras correspondientes (anticuerpos monoclonales), a todas las otras especies de aves cuya sangre no pueda ser tampoco analizada, en virtud de eritrocitos nucleados asi como de grandes trombocitos, con los procedimientos habituales, difundidos en medicina humana y de mamiferos.

El procedimiento descrito en esta memoria descriptiva ofrece, tambien en el examen de la sangre de especies, cuyos eritrocitos anucleados se pueden lisar bien, p. ej. en el caso del hombre y de otros mamiferos, ventajas frente a los metodos habituales en estos sectores. Ciertamente, ya se publicaron procedimientos de citometria de flujo para el establecimiento de un hemograma diferencial en el caso del hombre y del raton. Sin embargo estos incluyen, a diferencia del metodo descrito en esta memoria, por norma general, una lisis de los eritrocitos. En el caso de los procesos de lisis establecidos se destruye tambien una parte de los leucocitos, de manera que los resultados del recuento de celulas llevado a cabo a continuacion, ya no se corresponden con la realidad. Ademas, en el caso de la sangre de mamiferos sucede tambien que eritrocitos nucleados o precursores de eritrocitos nucleados no pueden ser desprendidos por los procesos de lisis empleados de manera rutinaria, y perturban a continuacion el recuento. Ciertamente, se describio la tecnica sin-lisis sin-lavado para el recuento de celulas T CD4+ y de celulas CD34+. Sin embargo, hasta ahora, para ninguna de las especies se ha publicado un procedimiento que contenga una determinacion del numero total de leucocitos, numero de trombocitos o bien el establecimiento de homogramas diferenciales con un marcador de pan-leucocitos y/o un marcador de trombocitos sin etapas de lavado ni purificacion, en particular sin la lisis de eritrocitos.

En virtud de las ventajas descritas, la tecnica descrita alberga el potencial de ser empleada como proceso de referencia para las mas diversas especies.

En una forma de realizacion particularmente preferida, el procedimiento comprende una combinacion de las siguientes etapas: a) realizacion en un unico recipiente de reaccion (tubo unico), b) realizacion del proceso sin lisis de poblaciones de celulas, p. ej. eritrocitos (sin lisis), c) realizacion del proceso sin etapas de lavado en la muestra (sin lavado) d) determinacion del numero total de leucocitos y e) diferenciacion de leucocitos y f) determinacion del numero de trombocitos.

La variante descrita aqui con detalle del nuevo procedimiento para el establecimiento del hemograma en gallinaceas, en particular en el caso de la gallina, posibilita el establecimiento de un hemograma diferencial con un citometro de flujo con solo un laser y 3 canales de fluorescencia tal como, p. ej., el aparato FACScan de Becton Dickinson. Este aparato permite, por consiguiente, el aprovechamiento de aparatos mas antiguos o bien mas economicos.

La etapa (a) del procedimiento de acuerdo con la invencion comprende la habilitacion de una muestra de sangre no coagulada, en particular de una muestra de sangre entera. La muestra puede obtenerse de manera habitual a partir del organismo a examinar. En caso necesario, la muestra es tratada con un reactivo de anticoagulacion adecuado. Un reactivo preferido es EDTA o una sal del mismo. En este caso, se encontro que, en particular en el caso de aves adultas hembras tales como, por ejemplo, la gallina madura, son necesarias concentraciones de EDTA superiores para un efecto de anticoagulacion suficiente. Por lo tanto, preferiblemente se utilizan � 4 mg/ml de EDTA, de manera particularmente preferida 4-7 mg/ml de EDTA para la anticoagulacion.

La etapa (b) del procedimiento de acuerdo con la invencion comprende la fijacion de la muestra. Esta etapa es solo facultativa y puede suprimirse en el caso de un tratamiento y medicion proximos en el tiempo de la muestra. La fijacion de la muestra puede tener lugar con reactivos habituales, p. ej. paraformaldehido, formaldehido o agentes de fijacion adquiribles en el comercio.

La etapa (c) del procedimiento comprende la dilucion de la muestra, la cual se lleva a cabo favorablemente en esencia sin lisis de los eritrocitos. Para la dilucion se utiliza habitualmente un tampon adecuado. La dilucion puede tener lugar, por ejemplo, en una relacion de 1:1 (una parte en volumen de muestra a una parte en volumen de tampon) hasta 1:1000, de manera particularmente preferida de 1:10 a 1:100, por ejemplo de aproximadamente

1:50.

Conforme a la etapa (d), la muestra diluida se pone en contacto con un marcador de pan-leucocitos y un marcador de trombocitos. En este caso, se trata habitualmente de anticuerpos marcados directamente, p. ej. marcados con colorantes de fluorescencia que estan dirigidos contra antigenos de las superficies de las celulas que son caracteristicos para los leucocitos o bien trombocitos. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos policlonales o monoclonales. Se prefieren anticuerpos monoclonales.

Ejemplos de anticuerpos que son adecuados como marcadores de pan-leucocitos son los anticuerpos anti-CD45 (clon 16-6, clon LT40) y K55. Ejemplos de anticuerpos que son adecuados como marcadores de trombocitos son K1, anti-CD41/D61 y anti-CD51/CD61.

La puesta en contacto de la muestra con los marcadores tiene lugar bajo condiciones en las que los marcadores se pueden unir a las celulas respectivas.

A continuacion, la muestra se mide, conforme a la etapa (e), en un citometro de flujo. El procedimiento de acuerdo con la invencion se distingue porque la muestra se examina por citometria de flujo sin previas etapas de lavado ni de purificacion, p. ej. separacion de eritrocitos o bien lisis de eritrocitos. En este caso, conforme a la etapa (f) tiene lugar una determinacion cuantitativa de la poblacion de leucocitos, es decir, la determinacion del numero total de leucocitos asi como, eventualmente, de la poblacion de trombocitos en la muestra. Una determinacion cuantitativa de las celulas puede conseguirse mediante el empleo de perlas de cuantificacion que se afaden a la muestra en un numero predeterminado, y/o a traves de calibracion del caudal y/o a traves del uso de un citometro de flujo con la posibilidad de un recuento volumetrico real. Los datos se evaluan por medio de un software adecuado y se determinan las diferentes poblaciones de celulas, determinandose los numeros de celulas absolutos y los relativos.

Preferiblemente, la determinacion comprende el uso de un marcador de pan-leucocitos y de un marcador de leucocitos con diferentes marcajes de fluorescencia, con lo cual se hace posible una diferenciacion de trombocitos y leucocitos en presencia de eritrocitos. Ademas, se lleva a cabo favorablemente un analisis de dispersion/difraccion frontal (FCS -siglas en ingles) y lateral (SSC -siglas en ingles) de las celulas, pudiendo identificarse los monocitos y tambien los granulocitos heterofilos como poblaciones inequivocamente delimitables en la representacion de todos los leucocitos.

Mediante el procedimiento de acuerdo con la invencion se hace posible, en el caso de una tincion directa de muestras de sangre entera, una delimitacion segura de las poblaciones de leucocitos, trombocitos y eritrocitos.

La diferenciacion ulterior de las diferentes fracciones de leucocitos puede tener lugar tan pronto como estos se diferencian entre si en al menos un parametro determinado por citometria de flujo.

Con el procedimiento se pueden identificar y cuantificar basicamente todas las celulas para las cuales este disponible un marcador especifico o una combinacion de marcadores especifica. Si solo esta presente un marcador no especifico, la poblacion de celulas respectiva se puede representar eventualmente en combinacion con las otras propiedades, tamafo de las celulas (FSC-H) y granularidad (SSC-H). Asi, p. ej., los granulocitos asi como todos los leucocitos son positivos para el marcador aCD45. Debido a su fuerte granularidad (SSC-H) se pueden diferenciar, sin embargo, de estos.

Ya la combinacion de un marcador de trombocitos y de un marcador de pan-leucocitos permite una diferenciacion mas amplia en eritrocitos, trombocitos, leucocitos, linfocitos, monocitos y granulocitos heterofilos.

La constitucion modular de la tecnica permite, sin embargo, una diferenciacion ulterior y mas fiable mediante el empleo de marcadores de leucocitos adicionales.

Ejemplos de sub-poblaciones de leucocitos que pueden ser determinadas mediante el procedimiento de acuerdo con la invencion son celulas T colaboradoras, celulas T citotoxicas, celulas T yo, celulas NK, granulocitos basofilos, granulocitos eosinofilos, granulocitos heterofilos, celulas B o combinaciones de dos o mas de las poblaciones mencionadas.

Como extraordinariamente adecuada para el establecimiento del hematograma en el caso de la gallina se ha manifestado la combinacion de los siguientes anticuerpos recogida en la Tabla 1:

Tabla 1

Aneigeno�adsn�

Cion Fiuorocromo Ceiuisg�eeidas�

CD45

16-6 comercialmente adquirible de Serotec (Division de MorphoSys) PerCP leucocitos, trombocitos

K1

RPE trombocitos, monocitos

KUL01

RPE monocitos

CD4

CT4 FITC celulas T colaboradoras

CD8a

CT8 FITC celulas T citotoxicas

TCRyo

TCR1 FITC linfocitos T yo

BU1

AV20 FITC l.Linfocitos B

El procedimiento de acuerdo con la invencion es adecuado para aplicaciones en medicina humana y veterinaria. En particular, el procedimiento se adecua para la determinacion de un hemograma de globulos blancos en el caso de 5 aves, preferiblemente en gallinaceas y, de manera particularmente preferida, en gallinas.

Ademas, el procedimiento de acuerdo con la invencion debe explicarse mediante los siguientes Ejemplos.

Ejempio�:��bteencdon�ae�muegersg�ae�gsngr�

10 Con el fin de hacer incoagulables a las muestras de sangre pueden emplearse diferentes anticoagulantes. El uso de anticoagulantes liquidos posibilita una mezcladura a fondo mas rapida con la sangre, pero conduce a una dilucion de la muestra.

15 EDTA, p. ej. en forma de K2EDTA o Na2EDTA, se considera tambien como el anticoagulante de eleccion para el examen hematologico de aves. Permite una tincion irreprochable de las celulas y no conduce a ningun apelmazamiento de leucocitos. En el caso de utilizar tubitos que contienen EDTA en forma liofilizada, no se produce dilucion alguna de la muestra y, como consecuencia, tampoco falsificacion alguna de los numeros de celulas absolutos. Concentraciones de EDTA entre 1,0 y 2,0 mg de EDTA/ml de sangre se consideran aconsejables en el

20 caso de mamiferos y aves. No se aconsejan concentraciones mayores, dado que estas pueden conducir a una contraccion de los eritrocitos. En el caso de concentraciones de EDTA superiores a 3,75 mg/ml se observo una fuerte tincion de color azul del frotis de sangre y variaciones de los leucocitos.

En algunos ensayos se comprobo que la sangre de gallinas ponedoras adultas, la cual es tomada en vasos

25 preparados con EDTA y producidos para la medicina humana, coagula a menudo. Preferiblemente, por lo tanto, se utilizan concentraciones mayores de EDTA entre 4 y 7 mg/ml.

Para ello se ofrece el siguiente modo de proceder: 1,5 ml de sangre se toman a traves de una canula con una jeringa de 2,0 ml. Despues, la sangre se transfiere

30 inmediatamente a un tubito de extraccion de sangre en el que se ha hecho el vacio (p. ej. Vacutainerr 7,2 mg de K2EDTA vacio 4,0 ml). Para ello, la cubierta de caucho vulcanizado del tubito se perfora con la canula que se encuentra todavia sobre la jeringa. De este modo, la sangre es aspirada en el tubito por el propio vacio.

Alternativamente, se ofrece la modificacion de tubitos en la medicina humana adquiribles en el comercio. Para ello,

35 en un tubito de 4,0 ml se incorporan, p. ej. con una jeringa sobre la cual esta dispuesta una canula, 2,5 ml de aire. Durante la extraccion de sangre debe entonces tenerse en cuenta unicamente que deben tomarse al menos 1,5 ml de sangre. Durante la transferencia de la muestra de sangre al tubito de vacio, el volumen reducido procura entonces el llenado correcto del tubito.

40 Mediante inversion, la sangre es mezclada con el anticoagulante con el fin de evitar la formacion de coagulos. A continuacion, las muestras se disponen en un mezclador de rodillo oscilante, a ser posible hasta el posterior tratamiento a temperatura ambiente, con el fin de garantizar una mezcladura a fondo continua y moderada.

El procedimiento por citometria de flujo aqui descrito es compatible con la fijacion previa de la sangre de gallina. Se

45 pueden emplear sustancias fijadoras tales como paraformaldehido, formaldehido o agentes de fijacion adquiribles en el comercio para la conservacion de muestras de sangre para ensayos de citometria de flujo tales como TransFix (UKNEQAS), Cyto-Chex BCT (Streck Laboratories). Streck Cell Preservative (Streck Laboratories), Cellsave (Immunocon) o ThromboFix (Beckmann Coulter). En algunos estudios se pudieron analizar todavia de manera fiable al cabo de 3 dias muestras de sangre de gallinas despues de fijacion con TransFix (UKNEQAS). Por

50 consiguiente, el procedimiento permite un examen central o bien el envio de muestras a un laboratorio de examen.

En el caso de la fijacion con TransFixr (UKNEQAS) se puede proceder de la siguiente manera: se invierte el tubito para la extraccion de sangre con la muestra de sangre contenida en el mismo, con el fin de re-suspender por completo a las celulas. Despues se transfieren 400 1l de sangre EDTA del tubito de extraccion de sangre a un recipiente de reaccion de 0,5 ml. Despues de ello, se afaden 80 1l de TransFixr a la sangre en el recipiente de reaccion de 0,5 ml. Finalmente, el recipiente de reaccion se cierra cuidadosamente, y la muestra se mezcla con cuidado. El almacenamiento hasta la medicion tiene lugar a la temperatura ambiente.

La Figura 20 muestra una representacion esquematica de una forma de realizacion para la fijacion de acuerdo con la invencion de muestras de sangre de gallinas.

Ejempio�:�Ddiucdon���edncdon�ae�muegersg

Para cada uno de los anticuerpos empleados se determina la concentracion optima en un experimento de titulacion. De esta manera, se reduce el zumbido de fondo inespecifico, de modo que se puede renunciar por completo a etapas de lavado.

Habitualmente, para una tincion se emplea 1 1l de sangre. Para ello, la sangre se diluye primero en la relacion 1/50 en un tampon adecuado y luego se disponen 50 1l de esta mezcla previa. Las concentraciones de las disoluciones de anticuerpos empleadas se eligen de manera que la concentracion optima se alcance solo en un volumen total a base de disolucion de anticuerpo y muestra previamente diluida. Los anticuerpos directamente conjugados se pueden afadir a la muestra de sangre diluida en forma de una mezcla previa (metodo Instant). Alternativamente -en particular en el caso de emplear diferentes tinciones -los anticuerpos pueden afadirse, sin embargo, tambien individualmente a la muestra. Con el fin de reducir las perdidas por adherencia de celulas (entre otros, trombocitos, monocitos, granulocitos) la tincion de muestras no fijadas se lleva a cabo preferiblemente en tubitos de polipropileno.

Con el fin de separar albumina de suero bovino (BSA -siglas en aleman) que perturba las mediciones a largo plazo por citometria de flujo, esta se filtra previamente en el caso de utilizar un tampon con contenido en BSA.

Antes del comienzo de la tincion se puede preparar de manera reciente una disolucion que contenga los distintos anticuerpos monoclonales directamente conjugados. Con el fin de poder emplear cada uno de los anticuerpos en la concentracion optima y, al mismo tiempo, derrochar la menor cantidad posible de reactivos, se prepara primeramente de cada uno de los anticuerpos una disolucion patron previamente diluida. A base de partes iguales de todas las disoluciones patron se mezcla entonces la disolucion empleada para la tincion. Las concentraciones de anticuerpo de las disoluciones patron y de la disolucion mixta se calculan de modo durante la posterior tincion en la mezcla a base de muestra y disolucion mixta, las concentraciones de anticuerpos corresponden a las concentraciones optimas determinadas en los experimentos de titulacion. Alternativamente a la adicion por mezcladura inmediatamente antes del experimento, la mezcla de anticuerpos puede ser preparada con antelacion y puede ser provista de un agente conservante (p. ej. azida de sodio, pentaclorofenol) y luego ser almacenada de forma refrigerada a lo largo de espacios de tiempo prolongados.

Despues de la resuspension, 20 1l de sangre EDTA fijada se transfieren a un recipiente de reaccion de 1,5 ml. Para la preparacion de una dilucion al 1/50, 980 1l de tampon filtrado en condiciones esteriles (temperatura ambiente) se afaden a la sangre en el recipiente de reaccion de 1,5 ml. Mediante inversion, la sangre y el tampon se mezclan

con cuidado.

Tsmpon�Fiuo

5 g

de albumina de suero bovino (BSA)

50 mg

de azida de sodio (NaN3)

hasta 500 ml

de PBS

almacenamiento: 4°C

Con el fin de posibilitar la cuantificacion absoluta de las poblaciones de celulas identificadas, se procede preferiblemente segun el principio de quot;add-onlyquot; (solo afadir). En la medida de lo posible solo se afaden al tubito de muestra, tampon y disoluciones, y hasta la medicion ya no se retira nada mas de los tubitos o bien se transfiere a otros recipientes.

En la medida en que para la cuantificacion absoluta se empleen tubos TruCOUNT y el citometro FACScan (Becton Dickinson), se aconseja el siguiente modo de proceder: la cantidad requerida de tubos TruCOUNT se recoge inmediatamente antes de la tincion de la bolsa almacenada a la temperatura ambiente. Despues se pipetean 20 1l de la mezcla previa de anticuerpos un poco por encima de la plaquita metalica junto a la pared lateral del tubo TruCOUNT, sin tocar a la perlita. Como paso siguiente, el tubo TruCOUNT se gira aproximadamente 180° en torno a su eje longitudinal. Mediante pipeteado inverso se pipetean 50 1l de la muestra de sangre diluida en el tampon Fluo, asimismo por encima de la plaquita metalica junto a la pared lateral enfrentada del tubo TruCOUNT, sin tocar a la perlita o a la gota ya afadida de la disolucion de anticuerpos. A continuacion, el tubo TruCOUNT se somete a vortice cuidadosamente tres veces durante un segundo. La incubacion tiene lugar durante un tiempo de aprox. 45 minutos en la oscuridad y a la temperatura ambiente. Despues se afaden 300 1l de tampon, y el tubo TruCOUNT se introduce en hielo. El recipiente de hielo se tapa con el fin de proteger hasta la medicion a las muestras frente a la incidencia de la luz.

Alternativamente a los tubos TruCOUNT pueden emplearse para la cuantificacion absoluta otras perlas (CALTAG Counting Beadsvon Molecular Probes, Flow-Count Fluospheres de Beckman Coulter, CytoCount de DakoCytomation, CountBright de Molecular Probes, entre otras). La tincion ha de adaptarse entonces en base a los datos del fabricante del producto respectivo. En base a la concentracion conocida de las perlas empleadas tiene lugar, durante la evaluacion de la medicion, la determinacion de los numeros absolutos de celulas.

El uso de un citometro de flujo con la posibilidad del recuento volumetrico real (Partec) permite renunciar a las perlas.

Con el fin ahorrar costes, tambien puede pasar a emplearse, alternativamente, en otros citometros de flujo la calibracion del caudal.

En funcion del caudal del citometo de flujo utilizado, asi como del contenido en leucocitos presentes en la muestra puede adaptarse el tiempo de medicion a la precision en cada caso requerida del examen. Los ajustes en el citometro de flujo pueden elegirse en este caso, p. ej., de manera que siempre se mida durante el tiempo necesario hasta que se detecte un numero determinado de perlas o de leucocitos en sucesos de una poblacion de leucocitos especial. En el caso de utilizar la calibracion del caudal se define preferiblemente un tiempo de medicion determinado.

Ejempio�:� �Deeermdnscdon�ae�gsngre�ae�gsiidnsg

En lo que sigue se describe la realizacion de una determinacion del hemograma en el caso de gallinas utilizando un marcador de pan-leucocitos, un marcador de trombocitos asi como marcadores para sub-poblaciones especificas de leucocitos.

En particular, en el caso de PBLs purificados durante la tincion, mediante la combinacion de un aCD45 primario y de un aIgG acoplado a fluorocromo, secundario, pueden diferenciarse las tres poblaciones de eritrocitos, trombocitos y leucocitos. En el caso de la tincion de sangre entera y del uso de conjugados directos puede producirse, sin embargo, en el caso del empleo unico de un marcador de pan-leucocitos, solapamientos de la poblacion de trombocitos con los leucocitos y de los eritrocitos con los trombocitos, de modo que las distintas poblaciones no pueden ser delimitadas o bien cuantificadas con seguridad.

Mediante la tincion con CD45-FITC/K1 RPE (Figura 1) se consigue una representacion segura de trombocitos (A) y leucocitos (B). En la grafica de puntos FSC-H/SSC-H ya es posible una diferenciacion parcial de los leucocitos (B). En este caso, los granulocitos heterofilos se muestran como una poblacion (D) inequivocamente delimitable. Dado que los monocitos pueden ser tefidos debilmente mediante K1, estos ya se pueden reconocer en la representacion FL1-H/FL2-H como poblacion (C). Aun mejor se distinguen los monocitos como poblacion (E) en la representacion de todos los leucocitos (B) en la grafica de FSC-H/SSC-H.

Utilizando marcadores adicionales para sub-poblaciones de leucocitos, p. ej. anticuerpos contra CD4 para la deteccion de celulas T colaboradoras, anticuerpos contra CD8a para la deteccion de celulas T citotoxicas, anticuerpos contra el receptor de celulas T yo (TCRyo) para la determinacion de celulas T yo o anticuerpos contra BU1 para la determinacion de celulas B, pueden diferenciarse inequivocamente mediante el procedimiento de acuerdo con la invencion sub-poblaciones de leucocitos.

La Figura 2 muestra la evaluacion de una muestra de sangre de gallinas tefida con aCD45PerCP, K1RPE, KUL01RPE, aCD4FITC, aCD8aFITC, BU1FITC y aTCRyoFITC. En la representacion FL3-H/FL2-H (a) la poblacion de trombocitos (A) esta inequivocamente delimitada. Los monocitos (L) CD45PerCP altamente positivos pasan a situarse mediante la tincion con KUL01RPE extremadamente distantes en la zona FL2-H-positiva. En esta representacion se distinguen ya las otras sub-poblaciones de los leucocitos (B). La diferenciacion se consigue mejor mediante una transferencia a una grafica FL3-H/FL1-H (b). Los linfocitos B (D) y linfocitos T (E) se pueden determinar por separado. Con el fin de continuar clasificando a los restantes leucocitos CD45PerCP mediopositivos, se ofrece la representacion FSC-H/SSC-H (c). Aqui se pueden reconocer de nuevo tres sub-poblaciones (H), (I) y (K). En virtud de la comparacion con hemogramas establecidos al microscopio, asi como de la elevada granularidad de las celulas, la poblacion (H) pudo identificarse como los granulocitos heterofilos. En el caso de las poblaciones (I) y (K) se trata presumiblemente de los granulocitos eosinofilos y basofilos. La subsiguiente identificacion de estas poblaciones de celulas se efectua experimentalmente con un clasificador de celulas.

Un resultado similarmente bueno se puede tambien conseguir renunciando al empleo del KUL01 para la identificacion de los monocitos. La Figura 3 muestra la evaluacion de la muestra tefida con los anticuerpos aCD45PerCP, K1RPE, aCD4 FITC, aCD8aFITC, BU1FITC y aTCRyoFITC. Los resultados coinciden esencialmente con los resultados de la tincion llevada a cabo en la misma muestra de sangre y que incluye al anticuerpo KUL01 (Figura 2). La unica diferencia esencial consiste en la identificacion de los monocitos. Estos se encuentran en la tincion exenta de KUL01 en la puerta F. Los ajustes de FSC-H/SSC-H mas optimos con respecto a la medicion de la Figura 2, permiten ademas, la identificacion de los monocitos (en azul) en virtud de sus caracteristicas FSC-H/SSC-H (Figura 4).

Para la documentacion mas completa de las caracteristicas de las distintas poblaciones de celulas identificables se establecio una tabla (Figura 5). En ella, estan contenidas todas las posibles variantes de graficas de puntos por permutacion de los parametros FSC-H, SSC-H, FL1-H, FL2-H y FL3-H de la medicion ya conocida por la Figura 2. El hecho de que todas las poblaciones hechas reconocibles por diferentes colores aparezcan en cualquier representacion posible como nubes de puntos que actuan de forma natural, demuestra que la tecnica de tincion aplicada, identifica poblaciones de celulas realmente existentes que, por una parte, son homogeneas en todos los parametros y que, por otra parte, se diferencian entre si al mismo tiempo en uno o varios parametros.

En el caso de la combinacion de anticuerpos representada en este caso, pasan a emplearse diferentes anticuerpos caracterizados con el mismo colorante.

Sin embargo, dado que, p. ej., los linfocitos B se tifen con mayor intensidad con BU1FITC que lo que lo hacen las celulas T citotoxicas con aCD8a FITC, las celulas T colaboradoras con aCD4 FITC y los linfocitos T yo con aTCRyo FITC, pueden diferenciarse a pesar de ello de los otros linfocitos (Figura 2, poblacion (D), Figura 3, poblacion (D)). Esto se facilita, ademas, debido a que los linfocitos B se tifen con menor intensidad con aCD45 FITC que los otros tipos de celulas mencionados.

Por otra parte, con el procedimiento pueden representarse como un grupo tambien varias poblaciones de celulas con diferentes marcadores, los cuales, sin embargo, estan acoplados con el mismo colorante. En el caso de la combinacion de anticuerpos aqui mostrada, esto tiene lugar para la suma de los linfocitos T, cuyas sub-poblaciones son marcadas mediante los anticuerpos aCD4, aCD8, aTCRyo (Figura 2, poblacion (E), Figura 3, poblacion (E)).

La identificacion de las diferentes poblaciones de celulas en la evaluacion grafica de los datos de medicion requiere la aplicacion de quot;estrategias de marcacionquot;. La marcacion puede realizarse manualmente en la evaluacion de los datos de medicion con ayuda de un software para el tratamiento de datos de citometria de flujo. Sin embargo, alternativamente, esto tambien puede tener lugar en forma de un analisis de datos automatizado.

La Figura 6 muestra una estrategia de marcacion para muestras de sangre no fijadas antes de la tincion. Esta estrategia fue optimizada de manera que tambien pudieran analizarse con ella muestras recientemente fijadas (Figura 7). En la representacion FL3-H/FL2-H se determinan eritrocitos (A), trombocitos (B), perlas (C) y leucocitos

(D) como poblaciones. En caso necesario, los trombocitos (B) se transfieren a una grafica de puntos FSC-H/FL2-H con el fin de examinar la muestra en cuanto a un contenido incrementado de agregados de trombocitos (poblacion G). Este contenido puede apuntar a una extraccion defectuosa de sangre. Los leucocitos (D) se transfieren a dos representaciones diferentes. En la grafica de puntos FSC-H/SSC-H se determinan los granulocitos heterofilos como poblacion (H). En la grafica de puntos FSC-H/FL1-H se separan entre si las poblaciones (I) y (K). La representacion de (I) en la grafica FL3-H/FL1-H permite la diferenciacion de linfocitos B (L) y linfocitos T (M). En la grafica FL3-H/FL2-H pueden determinarse a partir de la poblacion (I) tambien los agregados de linfocitos-monocitos. A partir de la poblacion (K) se retiran en la grafica FSC-H/SSC-H los granulocitos. Las celulas remanentes (N) se pueden subdividir en la grafica FL3-H/FL2-H en monocitos (O) y leucocitos restantes (P) (granulocitos basofilos, granulocitos eosinofilos). Las perlas (C) se examinan en el histograma de FL3-H en cuanto al porcentaje de agregados (F).

En esencia, muestras recientemente fijadas y medidas en el espacio de una pocas horas pueden evaluarse segun el esquema recien descrito. Unicamente la marca N deberia disponerse de una manera algo distinta.

Si las muestras se miden al tercer dia despues de la fijacion, el protocolo de marcacion deberia adaptarse (Figura 8). Dado que los granulocitos heterofilos han desarrollado en este instante una fluorescencia FL1-H, estos son identificados entonces a partir de la poblacion (I) en la grafica FSC-H/SSC-H como poblacion (H). A partir de la poblacion (R) remanente pueden determinarse en la grafica FL3-H/FL1-H linfocitos B (L) y linfocitos T (M). La poblacion (K) se puede dividir, en la grafica FSC-H/FL2-H, en leucocitos restantes y monocitos. Despues de la transferencia de la poblacion (H) a una grafica FL3-H/FL1-H pueden representarse agregados (Q) a base de granulocitos heterofilos y linfocitos. En la grafica FL3-H/FL1-H se pueden diferenciar en este caso agregados con linfocitos T (T) y linfocitos B (S).

Alternativamente a la tincion recogida en la Tabla 1, pueden emplearse otros anticuerpos.

Los anticuerpos monoclonales ya mencionados se pueden reemplazar por marcadores equivalentes que esten dirigidos contra los mismos antigenos o que tifan al menos a las mismas poblaciones.

P.ej. Clon CT4 por clon 3-298, K1 por aCD41/CD61 (clon 11C3) o aCD51/61 (clon 23C6). KUL01 por clones agalectina-8.

Otros anticuerpos pueden ser reemplazados incluso por marcadores que representan otras poblaciones:

p. ej., la combinacion aTCRyo, aCD8 y aCD4 puede ser reemplazada por aCD3 con el fin de marcar la suma de los linfocitos T. Como otra alternativa, puede pasar a emplearse una combinacion a base TCRyo, TCRa�(V�1) y TCRa�(V�2). No obstante, ambas alternativas conducen a una tincion algo mas debil. Alternativamente, tambien podria pasar a emplearse la combinacion a base de aCD28 (clones 2-4) y TCRyo. Otros marcadores de linfocitos aprovechables para el procedimiento son clones aCD5 tales como 2-191 asi como clones aCD6 tal como S3 y clones aCD11a tal como HUH73A (adquirible de �SU Monoclonal Antibody Center).

En el caso de utilizar un citometro de flujo con 2 o mas laseres, se puede ampliar la tincion. Asi, p. ej. en el caso de utilizar un conjugado detectado en el cuarto canal de fluorescencia, puede determinarse por separado una poblacion de celulas adicional. Mediante el empleo de los mas modernos citometros de flujo pueden emplearse hasta 18 colorantes de fluorescencia diferentes y, con ello, representarse una pluralidad de las mas diversas poblaciones de celulas. En el caso de emplear un aparato de este tipo podrian caracterizarse y cuantificarse con mayor precision, p. ej., las diferentes poblaciones de linfocitos.

Para algunos de los marcadores disponibles se conoce que estos reaccionan de manera cruzada con los correspondientes antigenos de otras especies de aves:

Reactividad cruzada con celulas de pollos de la pradera o bien pavos fue descrita para los clones de aCD8 3-292, 3-298 y EP72, asi como para los clones de aCD4 2-35, 7-125 y CT4, asi como para K1 y K55. K1 reacciona tambien con celulas de anades y 23C6 detecta incluso celulas humanas. El clon de aCD11a HUH73A mostro reactividad cruzada con muchas especies diferentes. Con algunos de los anticuerpos ya mencionados deberia poder elaborarse, al menos en el caso del pavo, un hemograma de globulos blancos. Una determinacion del numero total de leucocitos y del numero total de trombocitos con una diferenciacion parcial de leucocitos deberia ser posible con ayuda de los clones K1 y 23C6 tambien en el caso de especies mas lejanamente emparentadas, en la medida en que uno de los marcadores de pan-leucocitos conocidos reaccione de manera cruzada o sea preparado de nuevo.

Mediante el empleo combinado de un marcador de pan-leucocitos (p. ej. 16-6, LT40 o K55) y de un marcador de trombocitos (K1, aCD41/CD61, aCD51/61) se posibilita, sin embargo, tambien en el caso de la tincion directa de sangre entera, una delimitacion segura de las poblaciones de eritrocitos, trombocitos y leucocitos.

En comparacion con la microscopia (proceso estimativo modificado segun Campbell, evaluacion de 20 campos de vision en lugar de 5) pudo demostrarse experimentalmente ya la precision considerablemente elevada del nuevo procedimiento de citometria de flujo. Para ello, de una muestra de sangre de gallina, por el mismo investigador se hizo un recuento microscopico de 10 frotis.

Otra muestra de sangre se dividio en partes alicuotas y se preparo y midio 10 veces segun la nueva tecnica de citometria de flujo. Los coeficientes de variacion (CV) de la nueva tecnica se encontraban, como era de esperar, bastante por debajo de los de la microscopia (Tablas 2 y 3). Dado que el ensayo no fue llevado a cabo todavia bajo condiciones optimas, se ha de partir del hecho de que la precision del procedimiento puede ser incluso aumentada todavia de manera clara. La Figura 21 muestra una comparacion de la precision de la microscopia y la citometria de flujo.

Tabla 2: Precision de la estimacion de leucocitos al microscopioFactor HKL 0,87

Trombocitos

� leucocitos Linfocitos Monocitos Heterofilos Basofilos Eosinofilos Blastocitos

51333

35883 26047 4377 3487 996 676 0

67083

37333 25200 6048 2725 2464 709 261

64167

42583 28190 8048 3705 1916 724 0

70000

38500 23370 8047 4620 1309 886 270

70000

47250 29626 9970 3922 2552 756 425

74083

29167 19658 4579 2654 1254 875 117

65917

39083 24075 9067 2345 2462 860 274

54833

27417 17245 6196 2440 1042 494 55

54250

30917 18117 6709 3401 1268 1329 93

53667

37333 22027 8699 3845 1568 1120 75

Trombocitos � leucocitos Linfocitos Monocitos Heterofilos Basofilos Eosinofilos Blastocitos

VM 62533 36517 23356 7174 3314 1683 843 157

VE 7821 5770 3925 1796 709 585 225 135

VC 12,5� 15,8� 16,8� 25,0� 21,4� 34,7� 26,7� 85,9� Tabla 3: Precision del recuento de leucocitos por citometria de flujoTrombocitos � leucocitos Linfocitos Linfocitos T Heterofilos Monocitos Celulas B Basofilos

Trombocitos

� leucocitos Linfocitos Linfocitos T Heterofilos Monocitos Celulas B Basofilos

34741

18916 16291 15724 1482 1017 552 140

35271

18938 16003 15519 1637 1181 470 131

38684

20618 17611 17132 1617 1215 470 184

37164

19746 16667 16163 1598 1327 484 174

36465

19802 16809 16296 1501 1327 513 165

36120

20138 17198 16728 1560 1259 460 131

35423

19867 16830 16370 1477 1458 455 107

37227

20453 17103 16628 1816 1395 455 160

37599

20465 17129 16644 1642 1550 470 160

36278

19819 16551 16037 1569 1598 499 116

VM 36497 19876 16819 16324 1590 1333 483 147

VE 1136 559 446 461 95 167 29 24

VC 3,1� 2,8� 2,7� 2,8� 6,0� 12,5� 6,1� 16,5�

En otro experimento se obtuvieron muestras de sangre de 10 gallinas y se examinaron en una tanda triple. Una parte alicuota de cada una de las muestras se tifo y analizo ya pocas horas despues de la extraccion. Otra parte de la muestra se fijo con Transfix. Algunas horas despues de la fijacion, se tifo una parte alicuota de la muestra fijada y se analizo por citometria de flujo. Otra tincion con una subsiguiente medicion tuvo lugar entonces al tercer dia despues de la extraccion/fijacion. Adicionalmente, de cada una de las 10 muestras de sangre se preparo un frotis de sangre y, despues de la tincion, se examino con el procedimiento de estimacion segun Campbell. En todas las muestras se manifesto en el experimento para todas las poblaciones de celulas una coincidencia muy buena entre las distintas mediciones por citometria de flujo (no fijada/fijada dia 0/fijada dia 3) (Figuras 13-19 y 22). Las mayores desviaciones con respecto a los valores determinados con el procedimiento microscopico apuntan a su peor precision.

Ejempio��� �Ampidscdoneg�aei�proceadmdeneo

Mediante el empleo de marcadores contra otras celulas (granulocitos eosinofilos, celulas NK, etc.) puede ampliarse la diferenciacion de leucocitos. La base de ello lo crea el procedimiento mediante la extensa diferenciacion de los leucocitos en la forma aqui ya descrita. En el caso de utilizar un clasificador de celulas y de aprovechar la tincion arriba descrita pueden aislarse poblaciones de celulas y aprovecharse para el examen ulterior (p. ej. analisis de expresion de genes), para la aplicacion de cultivos de celulas o para la generacion de anticuerpos monoclonales especificos. Dado que, en particular PerCP en el caso de los distintos clasificadores solo puede ser empleado bajo determinadas condiciones en virtud de la propension al quot;fotoblanqueoquot;, se aconseja en este caso reemplazar el conjugado aCD45-PerCP por un anticuerpo acoplado con otro colorante. Si en el caso de la clasificacion de celulas no es necesaria cuantificacion absoluta alguna, se ofrece utilizar un aCD45 marcado con biotina. En union con este, puede pasar a emplearse como conjugado de estreptavidina el colorante mas adecuado. En virtud de la mayor intensidad de color por parte de la tincion indirecta, es de esperar en este caso una diferenciacion de CD45 muy clara que, de nuevo, posibilita un buen resultado de la separacion de celulas.

La tecnica descrita en esta memoria puede combinarse tambien con otros colorantes, p. ej. para la discriminacion de vivos/muertos (yoduro de propidio, 7AAD, etc.) o, p. ej., con colorantes afines a la membrana DiOC5(3). En particular, en el caso de la ausencia de marcadores de pan-leucocitos correspondientes para diferentes especies, podria manifestarse valiosa la combinacion de un marcador de trombocitos con DiOC5(3) para la representacion de leucocitos.

En el caso de utilizar un citometro de flujo moderno tal como el CyAn ADP 7/9 Color (Beckman Coulter) con caudales de hasta 50.000 ev/s se puede acortar considerablemente el tiempo de medicion en comparacion con el FACScan (3.500 ev/s). Esto mejora la rentabilidad del procedimiento o bien aumenta, al alcanzar mayores numeros de celulas por medicion, la precision de la medicion individual. Mediante el empleo de un autocargador (en forma de carrusel para tubitos o en el formato de placas de 96 pocillos) se puede mejorar asimismo la rentabilidad del procedimiento. Esto mismo es valido para la renuncia a perlas para la cuantificacion absoluta en el caso de utilizar un citometro de flujo con capacidad de un recuento volumetrico real o bien la aplicacion de una calibracion del caudal.

Claims (6)

1. REIVINDICACIONES

   1.- Procedimiento para la determinacion del numero total de leucocitos en la sangre de aves o gallinaceas, que comprende las etapas:

   (a)

   habilitacion de una muestra de sangre no coagulada,

   (b)

   eventualmente, fijacion de la muestra,

   (c)

   dilucion de la muestra,

   (d)

   puesta en contacto de la muestra diluida con un marcador de pan-leucocitos y un marcador de trombocitos,

   (e)

   medicion de la muestra en un citometro de flujo sin etapas de lavado ni purificacion previas y

   (f)

   determinacion cuantitativa de la poblacion de leucocitos asi como de la poblacion de trombocitos en la muestra.

2. 2.- Procedimiento segun la reivindicacion 1, caracterizado por que se determinan muestras de sangre entera tratadas con 4 mg/ml de EDTA.
3. 3.- Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado por que el marcador de pan-leucocitos se elige de los anticuerpos anti-CD45, 16-6, LT40 y K55, y por que el marcador de trombocitos se elige de los anticuerpos K1, anti-CD41/CD61 y anti-CD51/CD61.
4. 4.- Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que en la etapa (e) se lleva a cabo, ademas, un analisis de dispersion/difraccion frontal y lateral de las celulas.
5. 5.- Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que en la etapa (e) se lleva a cabo, ademas, una determinacion de sub-poblaciones de leucocitos.
6. 6.- Procedimiento segun la reivindicacion 5, caracterizado por que las sub-poblaciones de leucocitos se eligen de

   -

   monocitos

   -

   celulas T colaboradoras

   -

   celulas T citotoxicas

   -

   celulas T yo

   -

   celulas B

   -

   celulas NK

   -

   granulocitos basofilos

   -

   granulocitos eosinofilos

   -

   granulocitos heterofilos/neutrofilos

   -

   celulas madre y combinaciones de los mismos.