WO2010133071A1

WO2010133071A1 - 一种高纯度尿促卵泡刺激素及其制备方法

Info

Publication number: WO2010133071A1
Application number: PCT/CN2009/075278
Authority: WO
Inventors: 季晓铭; 高霄梁; 季斌; 郭照晔; 洪云海
Original assignee: 上海天伟生物制药有限公司
Priority date: 2009-05-19
Filing date: 2009-12-03
Publication date: 2010-11-25
Also published as: CN101555279B; CN101555279A

Description

一种高纯度尿促卵泡刺激素及其制备方法技术领域

本发明涉及蛋白质纯化和生物医药领域。具体而言，本发明涉及高纯度的卵泡剌激素（FSH)及其制备方法，以及含有它的药物组合物。背景技术

卵泡剌激素（Follicle- stimulating hormone, 简称 FSH)是由垂体产生的激素，它由 α链和 β链两个亚基组成。 FSH 的 a亚基与黄体生成激素 (leuteinizing hormone ，简称 LH) 禾口绒毛膜促性腺素 (chorionic gonadotropin, 简称 CG)的 α亚基完全相同，具有 92个氨基酸，分子量约为 14500 D，第 52和 78位置上的天冬酰胺是发生 -糖基化的氨基酸。

FSH的 β亚基由 111个氨基酸组成，分子量约为 18000 D，其中第 7和 24位置上的天冬酰胺是发生 -糖基化的氨基酸。而 LH的 β亚基由 121个氨基酸组成，分子量约为 14800 D; CG 的 β亚基则有 145 个氨基酸，分子量 22000-39000 D。

临床上 FSH主要用于治疗不育症以及体外的辅助生殖。 FSH可以从绝经期妇女的尿液中提取出来，也可通过 DNA重组技术而制备。

含有 FSH的第一代产品是尿促性素（HMG)，如 Serono公司的 Pergonal, 它是 FSH与 LH比例约为 1 的混合物。但是，对于体内有较多量的 LH而不需加用外源性 LH的患者， LH水平过高会影响卵泡的正常发育，不合时机的抑制减数分裂抑制因子会导致卵子的老化，从而降低受精和着床的机会。因此对这部分患者而言，更适合于使用纯 FSH制剂。另一方面，过多的 LH容易导致多囊卵巢综合症（Polycystic Ovarian Syndrome, P00S)，研究表明， LH过多对生殖功能有不利的作用，如引起月经稀发、无排卵、不孕及流产。因此对 P00S患者用纯 FSH治疗比 HMG更为安全，可减少卵巢过度剌激综合 ¾E (Ovarian Hypers timulat ion Syndrome , 0HSS)危险。 Serono 公司推出的 Metrodin就是一种含有极少量 LH的 FSH制剂，适合 P00S患者的治疗。

但是， Metrodin仅仅是去除了 LH，但还是保留了很多尿源的杂蛋白（杂蛋白约占 80— 90%) ，这些杂蛋白的存在可能会导致一定的副作用，如过敏反应。因此近年来市场上正倾向于开发和使用高纯度的 FSH，它是将低纯度的 FSH进行进一步的纯化，去除绝大部分杂蛋白，获得高比活的 FSH，它可以克服普通产品中因大量杂蛋白而造成的对人体的过敏反应，并且由于这些优点使得它可以采用皮下注射，方便患者的使用，减轻痛苦。

目前的尿源 FSH的制备方法主要是以低纯度尿促卵泡剌激素或绝经期促性腺素（HMG ) 为起始原料，通过疏水色谱，或单克隆抗体免疫层析法以及反相 HPLC法来纯化，但获得的 FSH 的比活和纯度还不是十分理想，偶有产生副反应的报到。

因此，本领域迫切需要开发出一种高纯度的 FSH，以及相应的制备方法，并由此获得含高纯度 FSH的制剂，可以使用于皮下注射，减少副反应的发生几率，方便患者的使用、减轻痛苦。发明内容

本发明旨在提供一种高纯度尿促卵泡剌激素。

本发明的另一个目的是提供所述高纯度尿促卵泡剌激素的制备方法。本发明的再一个目的是提供所述高纯度尿促卵泡剌激素的用途。在本发明的第一方面，提供了一种高纯度尿促卵泡剌激素（PFSH ) ，所述的高纯度尿促卵泡剌激素的纯度不低于 95w/w%，其杂质含量不超过 5w/w% ; 较佳地，其纯度不低于 98. 0w/w%,其杂质含量不超过 2. 0w/w%。

在另一优选例中，卵泡剌激素是人来源的卵泡剌激素或其变体；更佳地，卵泡剌激素是人尿来源的卵泡剌激素或其变体。在本发明的第二方面，提供了一种如上所述的本发明提供的高纯度尿促卵泡剌激素的制备方法，所述的方法包括步骤：

将低纯度尿促卵泡剌激素经过色谱纯化，得到高纯度尿促卵泡剌激素；所述的色谱是染料亲和色谱。

在另一优选例中，所述的色谱还包括阳离子交换色谱。

在另一优选例中，所述的方法包括步骤：

( a )将含有低纯度尿促卵泡剌激素的溶液 1经过阳离子交换色谱纯化，得到馏出物 1 ; 和

( b )将含有馏出物 1的溶液 2经过染料亲和色谱纯化，得到高纯度尿促卵泡剌激素。

在另一优选例中，步骤 (a)中的阳离子交换色谱包括步骤：

(i)用 pH4 7含有低纯度尿促卵泡剌激素的第一上样液进行上样，所述第一上样液中低纯度尿促卵泡剌激素的浓度为 0.1— 10w/v% (g/ml) ；

(ii)用 pH4 6的第一洗涤液进行洗涤；和

(iii)用 pH4 6的第一洗涤液和 pH4 6的第一洗脱液进行洗脱，得到馏出物 1。

在另一优选例中，步骤 (b)中的染料亲和色谱包括步骤：

(i')用 pH5— 7含有馏出物 1的第二上样液进行上样；所述第二上样液中馏出物 1的浓度为 0.05-5w/v% (g/ml)

(ii')用 pH6— 11的第二洗涤液进行洗涤；和

(iii 用 PH6— 11的第二洗脱液进行洗脱，得到高纯度尿促卵泡剌激素。在另一优选例中，所述阳离子交换色谱的树脂骨架介质包括琼脂糖，葡聚糖，纤维素，苯乙烯和二乙烯基苯的交联物，丙烯酸和 /或其衍生物的交联物。

在另一优选例中，所述的阳离子交换色谱的树脂活性基团选自磺酸丙基

(- S0₃H)、次甲基磺酸基（- C S0₃H)、羧基（- C00H)、羧甲基（- 0C C00H)、或苯酚基 (-C₆H₅0H) 。

在另一优选例中，所述的阳离子交换色谱的色谱柱的活性基团选自磺酸丙基、或次甲基磺酸基。

在另一优选例中，所述的阳离子交换色谱的树脂是 SP Sepharose 或 CM

Sepharose。

在另一优选例中，所述染料亲和色谱的树脂的染料配基选自 Ciba_Cr。nBl_Ue、 Orange Red、 Greer

在另一优选例中，所述染料亲和色谱的树脂的固相载体选自皂土、玻璃微球、石英微球、羟磷酸钙、氧化铝、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素、或琼脂糖。

在另一优选例中，所述染料亲和色谱的树脂是 Blue Sepharose 6B或 Blue Sepharose FF。

在另一优选例中，步骤（a) 或（b) 进行 1 3次。在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，所述的组合物中含有治疗有效量的如上所述的本发明提供的高纯度尿促卵泡剌激素、和药学上可接受的载体。在本发明的第四方面，提供了一种如上所述的本发明提供的高纯度尿促卵泡剌激素在制备治疗不育综合症的药物中的用途。据此，本发明提供了一种高纯度的 FSH，以及相应的制备方法，并由此获得含高纯度 FSH的制剂，可以使用于皮下注射，减少副反应的发生几率，方便患者的使用、减轻痛苦。附图说明

图 1显示了 FSH纯度图谱。具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，惊奇地发现通过阳离子交换树脂色谱和染料亲和树脂色谱可以获得目前已知的最高纯度的 FSH。

具体而言，本发明是以尿或 HMG或低纯度尿促卵泡剌激素为起始原料，通过创新的阳离子交换树脂色谱和染料亲和树脂色谱，得到高纯度的 FSH，纯化方法简单有效，获得的 FSH纯度高、杂质少。如本发明所用，术语 "卵泡剌激素" 和 " FSH " 可互换使用，指一类用于促进精子或卵泡产生、促进卵巢发育的激素或其变体，其可在天然情况下由垂体前叶分泌。

如本文所用， "尿促卵泡剌激素" 和 "尿源性 FSH " 可互换使用，是指从尿液中提取得到的卵泡剌激素，所述尿液来自于哺乳动物，优选来自于人，更佳地是绝经期妇女的尿液。

本发明中所用的原料低纯度尿源性 FSH 可采用本领域常用的任何方式获得，例如可以用传统方法从绝经期妇女尿液中通过高岭土吸附、洗脱，丙酮沉淀，乙醇溶液抽提，离子交换层析色谱（包括阳离子、阴离子色谱），甚至疏水色谱得到 HMG，再将 HMG通过疏水层析、或者通过抗 LH抗体和 / 或抗 CG 抗体的亲和层析等常规手段来获得低纯度尿源性 FSH，如 CN 101307103A 所描述的方法。。低纯度尿源性 FSH 的比活一般低于 2000IU/mg蛋白，优选 200— 500IU/mg蛋白。

可用于本发明中的低纯度尿源性 FSH原料可为：将 HMG经过预纯化步骤去除 LH的原料，或按传统提取方法从绝经期妇女尿液中通过高岭土吸附、洗脱，丙酮沉淀，乙醇溶液抽提，离子交换层析色谱（包括阳离子、阴离子色谱），然后再通过疏水层析、或者通过抗 LH抗体和 /或抗 CG抗体的亲和层析等常规方法来获得的基本上只含 FSH和其它非 LH的杂蛋白的原料。

优选在采用本发明的方法纯化低纯度尿源性 FSH前，采用本领域常规方法对原料低纯度尿源性 FSH进行初步纯化，以分离除 LH以外的其它杂质。

HMG 可以按传统的方法获得，如从绝经期妇女尿液中通过高岭土吸附、洗脱，丙酮沉淀，乙醇溶液抽提，离子交换层析色谱（包括阳离子、阴离子色谱），甚至疏水色谱。然后将 HMG进行后续的纯化，可以用疏水色谱或去除其中的 LH，然后按本专利公开的方法进行制备从而获得高活性的 FSH。

作为起始原料的低纯度尿源性 FSH原料的比活在 2000IU/mg蛋白以下，优选 200— 500IU/mg蛋白。

如本文所用，术语 "黄体生成激素" 和 " LH " 可互换使用，指在含有

FSH的原料制备或获取过程中掺杂于其中的与天然 LH具有相同或相似结构和功能的激素。本发明提供的高纯度尿促卵泡剌激素的纯度 95%，杂质 5%。本发明提供的高纯度尿源性 FSH中 LH的生物效价小于 1 LH IU/100 FSH IU。

本发明提供的高纯度尿源性 FSH的制备方法包括步骤：

将低纯度尿源性卵泡剌激素或绝经期促性腺素（HMG) 经过色谱纯化，得到高纯度尿源性 FSH; 所述的色谱是阳离子交换色谱和染料亲和色谱。

优选地，所述的方法包括步骤：

( 1 )将含有低纯度 FSH的溶液 1经过阳离子交换色谱纯化，得到馏出物 1 ; 禾口

( 2 )将含有馏出物 1的溶液 2经过染料亲和色谱纯化，得到高纯度尿促卵泡剌激素 ( pFSH ) 。

本发明制备方法中使用的阳离子交换色谱的色谱柱的骨架介质包括琼脂糖、葡聚糖、纤维素、苯乙烯、丙烯酸和 /或衍生物的交联物；所述的阳离子交换色谱的色谱柱的活性基团选自磺酸丙基（-S0₃H)、次甲基磺酸基 (- CH₂S0₃H)、羧基（- C00H)、羧甲基（- 0C C00H)、或苯酚基 (- C₆¾0H) ，较佳地选自磺酸丙基、或次甲基磺酸基；所述的阳离子交换色谱的色谱柱是 SP Sepharose或 CM Sepharose。

本发明制备方法中使用的阳离子交换色谱的洗脱溶液 pH2-8，离子浓度 0— 2M; 所述离子选自钠离子、钾离子。

本发明制备方法中使用的染料亲和色谱的色谱柱的染料配基选自 Cibacron Blue, Orange, Red, Green; 所述染料亲和色谱的色谱柱的固相载体选自皂土、玻璃微球、石英微球、羟磷酸钙、氧化铝、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素、或琼脂糖；所述染料亲和色谱的色谱柱是 Blue Sepharose₀ 本发明制备方法中使用的染料亲和色谱的洗脱溶液 pH6-12，离子浓度 0—

4M; 所述离子选自钠离子、钾离子。

在本发明的一个优选例中，所述阳离子交换色谱纯化步骤包括：

(i)用 pH4— 7 含有低纯度尿促卵泡剌激素的第一上样液进行上样，所述第一上样液中低纯度尿促卵泡剌激素的浓度为 0.1— 10w/v% (g/ml) ，优选 2.0-4.0w/v% (g/ml) ；

(ii)用 pH4— 6的第一洗涤液进行洗涤；和

(iii)用 pH4— 6 的第一洗涤液和 pH4— 6 的第一洗脱液进行洗脱，得到馏出物 1。

更佳地，步骤（iii)中进行梯度洗脱，在 0.5 至 5 小时内，第一洗脱液的浓度（v/v) 从 0至 100%。

所述的第一上样液的盐浓度为 0— 0.5M，所述的盐选自盐酸盐、磷酸盐、和 /或醋酸盐；所述的第一洗涤液或第一洗脱液的盐浓度为 0.05— 3M，所述的盐选自盐酸盐、磷酸盐、和 /或醋酸盐。所述盐的金属离子选自钠离子或钾离子。

在本发明的一个优选例中，所述染料亲和色谱纯化步骤包括：

(i')用 pH5— 7含有馏出物 1 的第二上样液进行上样；所述第二上样液中馏出物 1 的浓度为 0.05— 5w/v% (g/ml)

(ii')用 pH8— 11 的第二洗涤液进行洗涤；和

(iii')用 pH8— 11 的第二洗脱液进行洗脱，得到高比活尿促卵泡剌激素。所述的第二上样液的盐浓度为 0— 0.05M，所述的盐选自盐酸盐、磷酸盐、和 /或醋酸盐；所述的第二洗涤液或第二洗脱液的盐浓度为 0.01— 5M，所述的盐选自盐酸盐、磷酸盐、和 /或醋酸盐、和 /或甘氨酸盐。所述盐的金属离子选自钠离子或钾离子。本发明还提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有治疗有效量的用本发明方法制备的高纯度尿源性 FSH，以及药学上可接受的载体。

如本文所用，术语 "含有"或 "包括"包括了 "包含" 、 "基本上由…… 构成" 、和 "由……构成" 。如本文所用，术语 "治疗有效量" 是指可对人和 /或动物产生功能或活性的且可被人和 /或动物所接受的量。

如本文所用，术语 "药学上可接受的" 或 "食品学上可接受的" 的成分是适用于人和 /或动物而无过度不良副反应 (；如毒性、剌激和变态反应;)的，即有合理的效益 /风险比的物质。

如本文所用，术语 "药学上可接受的载体" 指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在《雷明顿药物科学》（Remington ' s Pharmaceutical Sciences , Mack Pub. Co. , N.J. 1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。

所述的 "药学上可接受的载体"可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、润湿剂或乳化剂、矫味剂、 pH缓冲物质等。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中 pH 通常约为 5-8，较佳地， pH约为 6-8。

在本发明的优选实施方式中，所述药物组合物中的高纯度尿源性 FSH占组合物总重量的 0.001— 99.9wt%；优选为组合物总重量的 0.01— 99wt%，较优选为 0.02— 95wt%，更优选 0.05— 90wt%。余量为药学上可接受的载体以及其它添加剂等物质。

如本文所用，术语 "单位剂型" 是指为了服用方便，将本发明的组合物制备成单次施用所需的剂型，包括但不限于各种固体剂 (如片剂；)、液体剂、胶囊剂、缓释剂、粉针剂。在本发明的另一优选实施方式中，所述组合物为单位剂型或多剂型，且其中 FSH 的含量为 0.001-2000mg/剂，优选 0.003-500mg/剂，更优选 0.005-50mg/剂。在本发明的另一个优选例中，每天施用 1一 6剂本发明的组合物，优选施用 1一 3剂；最优选的，每天施用的剂量为 1剂。

应理解，所用 FSH的有效剂量可随待施用或治疗的对象的严重程度而变化。具体情况根据对象的个体情况 (例如对象体重、年龄、身体状况、所需达到的效果;)来决定，这在熟练医师或营养师可以判断的范围内。

本发明的药物组合物，可以为固态 (如颗粒剂、片剂、冻干粉、栓剂、胶囊、舌下含片)或液态 (如口服液、水针剂;)或其它合适的形状。本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。本发明的主要优点在于：

1、提供了一种高纯度的尿源性 FSH，可应用于皮下注射；

2、提供了一种高纯度的尿源性 FSH 的纯化方法，方法简单有效，适合产业化。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。

本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在 100毫升的溶液中溶质的重量。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。本发明涉及的生物效价和纯度的测定方法：

生物效价

FSH、 LH的生物效价测定方法按中国药典 2005版附录 XI I M、 XI I N的方法检验。纯度

色谱柱： Superdex75 10/300 GL

流动相：乙腈： 0. 2M磷酸钠溶液 pH7. 0 = 200 : 1000

样品配制：取样品用流动相溶解至 500 IU/mL

进样量： 100 μ L

检测波长： 215 nm

运行时间： 60 min 实施例 1

制备高纯度尿促卵泡刺激素 I

将低纯度尿促卵泡剌激素（购自上海天伟生物制药有限公司）用作起始原料，其中 FSH的生物效价为 315 IU/mg， LH的生物效价为 3 IU/mg。

将 10g上述低纯度尿促卵泡剌激素用 300mL平衡液（0. 03M磷酸二氢钠， pH5 ) 溶解，然后上至 250mL CM-Sepharose层析柱（Amersham提供），此柱事先已用相同的平衡液平衡好。上样结束后用洗涤液（0. 1M 醋酸钠， pH5 ) 洗涤 10倍柱体积，然后用洗涤液和洗脱液（0. 1M醋酸钠 + lM NaCl， pH5 ) 进行 0— 100%线性梯度洗脱，用紫外检测器监测 280nm处，分布收集各馏出峰，检测其 FSH免疫效价，合并有效成份约 0. 4 L，加入预冷的无水乙醇沉淀过夜，次日离心收集沉淀，用无水乙醇脱水，真空干燥得到 1. 8克干品。

将 1. 8 g上述干品用 200mL平衡液（0. 01M磷酸二氢钠， pH6. 5 ) 溶解，然后上至 300mL Blue Sepharose FF层析柱（Amersham提供）上，上样结束后用平衡液洗涤 5倍柱体积，然后用 0. 05M甘氨酸缓冲液（pHIO ) 洗涤 5倍柱体积，再用 0. 05M甘氨酸、 0. 4M NaCl缓冲液（pH9 ) 洗涤 8倍柱体积，最后用洗脱液（0. 05M 甘氨酸、 2. 5M NaCl , pH9 ) 洗脱，分布收集各馏出峰，检测其 FSH免疫效价，合并有效成份约 2L，用 1万分子量膜超滤浓缩后，加入预冷的无水乙醇，离心收集沉淀，用无水乙醇脱水，真空干燥得 266mg干燥品 I，即高纯度尿促卵泡剌激素 I。 FSH纯度图谱见附图 1。表 1 所得 F燥品的生物效价及比活测定结果

FSH生物效价 FSH比活（IU/mg LH生物效价

FSH纯度 (IU/mg) 蛋白） (IU/mg)

纯化后的干燥品 <1LH III /100FSH

9209 9352

I III

上述结果表明：采用本发明的方法进行纯化，可以获得很高纯度的 FSH。实施例 2

制备高纯度尿促卵泡刺激素 II

将 5g低纯度尿促卵泡剌激素（起始原料同实施例 1) 用 150mL平衡液 (0.03M磷酸二氢钠， ρΗ4·8) 溶解，然后上至 130mL SP- Sepharose层析柱 (Amersham提供），此柱事先已用相同的平衡液平衡好。上样结束后用洗涤液（0.1M醋酸钠， pH4.8) 洗涤 10倍柱体积，然后用洗涤液和洗脱液（0.1M 醋酸钠 + 1M NaCl, pH5) 进行 0— 100%线性梯度洗脱（洗脱液的体积比浓度，在 2小时内），用紫外检测器监测 280nm处，分布收集各馏出峰，检测其 FSH 免疫效价，合并有效成份约 0.2 L, 加入预冷的无水乙醇沉淀过夜，次日离心收集沉淀，用无水乙醇脱水，真空干燥得到 0.93克干品。

将 0.93g上述干品用 lOOmL平衡液（0.01M磷酸二氢钠， pH6.5) 溶解，然后上至 200mL Blue Sepharose 6B层析柱（Amersham提供）上，上样结束后用平衡液洗涤 5倍柱体积，然后用 0.05M甘氨酸缓冲液（pHIO) 洗涤 5倍柱体积，再用 0.05M甘氨酸、 0.4M NaCl缓冲液（pH9) 洗涤 10倍柱体积，最后用洗脱液（0.05M甘氨酸、 2.5MNaCl， pH9) 洗脱，分布收集各馏出峰，检测其 FSH免疫效价，合并有效成份约 1.5L，用 1万分子量膜超滤浓缩后，加入预冷的无水乙醇，离心收集沉淀，用无水乙醇脱水，真空干燥得 120mg 干燥品 II，即高纯度尿促卵泡剌激素 II。

上述结果表明：采用本发明的方法进行纯化，可以获得很高纯度的 FSH。实施例 3

高纯度尿促卵泡刺激素冻干针剂

用于制造 1000瓶 FSH冻干针剂，且每瓶含 75 IU FSH的生产的典型例子如下：

计算出 FSH的所需量（以生物效价为单位），按此量称取实施例 1 中 FSH 干燥品 I，溶解于 20mL注射用无热原水中，如果需要的话，用 HC1或 NaOH 调节 pH 6. 5 ± 0. 2，然后用 0. 22 μ ηι过滤器进行无菌过滤。

将 10g乳糖溶解于 200mL注射用无热原水中，如果需要的话，用 HC1或

NaOH调节 pH 6. 5 ± 0. 2，用 0. 22 μ m过滤器进行无菌过滤。然后加入到上述 FSH溶液中，用注射用无热原水定容至 750mL，混匀。

将上述溶液分装入安瓿瓶中，每瓶 0. 75mL，进行冷冻干燥。

所得到的安瓿瓶中，每瓶含 75 IU FSH和 10mg乳糖。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

Claims

权利要求

1.一种高纯度尿促卵泡剌激素（pFSH )，其特征在于，其纯度不低于 95w/w%，其杂质含量不超过 5w/w% ; 优选纯度不低于 98. 0w/w%，其杂质含量不超过 2. 0w/w%。

2.如权利要求 1 所述的高纯度尿促卵泡剌激素，其特征在于，卵泡剌激素是人来源的卵泡剌激素或其变体；更佳地，卵泡剌激素是人尿来源的卵泡剌激素或其变体。

3.一种如权利要求 1 2任一所述的高纯度尿促卵泡剌激素的制备方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

4. 如权利要求 3所述的制备方法，其特征在于，所述的色谱还包括阳离子交换色谱。

5.如权利要求 3或 4所述的制备方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

(b )将含有馏出物 1的溶液 2经过染料亲和色谱纯化，得到高纯度尿促卵泡剌激素。

6. 如权利要求 5所述的方法，其特征在于，步骤 (a)中的阳离子交换色谱包括步骤：

(i)用 pH4 7含有低纯度尿促卵泡剌激素的第一上样液进行上样，所述第一上样液中低纯度尿促卵泡剌激素的浓度为 0. 1— 10w/v% ( g/ml ) ；

(i i)用 pH4 6的第一洗涤液进行洗涤；和

(i i i)用 pH4 6的第一洗涤液和 pH4 6的第一洗脱液进行洗脱，得到馏出物 1。

7. 如权利要求 5所述的方法，其特征在于，步骤 (b)中的染料亲和色谱包括步骤：

(i')用 pH5— 7含有馏出物 1的第二上样液进行上样；所述第二上样液中馏出物 1的浓度为 0. 05 - 5w/v% ( g/ml ) (i i')用 pH6— 11的第二洗涤液进行洗涤；和

(i i i 用 PH6— 11的第二洗脱液进行洗脱，得到高纯度尿促卵泡剌激素。

8.如权利要求 3 7任一项所述的方法，其特征在于，所述阳离子交换色谱的树脂骨架介质包括琼脂糖，葡聚糖，纤维素，苯乙烯和二乙烯基苯的交联物，丙烯酸和 /或其衍生物的交联物。

9.如权利要求 3 7任一项所述的方法，其特征在于，所述的阳离子交换色谱的树脂活性基团选自磺酸丙基（-S0₃H)、次甲基磺酸基（-CH₂S0₃H)、羧基 (- C00H)、羧甲基（- 0C C00H)、或苯酚基 ( -C₆H₅0H) 。

10.如权利要求 9所述的制备方法，其特征在于，所述的阳离子交换色谱的色谱柱的活性基团选自磺酸丙基、或次甲基磺酸基。

11.如权利要求 3— 7任一项所述的方法，其特征在于，所述的阳离子交换色谱的树脂是 SP Sepharose或 CM Sepharose。

12.如权利要求 3— 7任一项所述的方法，其特征在于，所述染料亲和色谱的树脂的染料配基选自 Cibacron Blue, Orange, Red, Green。

13.如权利要求 3— 7任一项所述的方法，其特征在于，所述染料亲和色谱的树脂的固相载体选自皂土、玻璃微球、石英微球、羟磷酸钙、氧化铝、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素、或琼脂糖。

14.如权利要求 3— 7任一项所述的方法，其特征在于，所述染料亲和色谱的树月旨是 Blue Sepharose 6B或 Blue Sepharose FF。

15.如权利要求 5所述的制备方法，其特征在于，步骤（a ) 或（b ) 进行 1

- 3次。

16. 一种药物组合物，其特征在于，所述的组合物中含有治疗有效量的如权利要求 1 2任一所述的高纯度尿促卵泡剌激素、和药学上可接受的载体。

17 . 一种如权利要求 1 2 任一所述的高纯度尿促卵泡剌激素在制备治疗不育综合症的药物中的用途。