WO2010119161A2 - Compuesto neuroprotector, hipocolesterolémico y antiepiléptico - Google Patents

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WO2010119161A2
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Maria del Carmen Ramos Martín
Saleta SIERRA ÁVILA
Juan María Alfaro Sánchez
Carlos Ramírez Moreno
Sonia Campoy García
Javier Velasco Alvarez
Ángel Rumbero Sánchez
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Definitions

  • the present invention relates to the prevention and / or treatment of neurodegenerative diseases or diseases associated with unwanted oxidation or pathological processes associated with age, as well as with the prevention and / or treatment of epilepsy. , of epileptic seizures or seizures, with the decrease in LDL-cholesterol levels and with the inhibition of the enzyme 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase for the prevention of dyslipidemia and cardiovascular diseases.
  • AD Alzheimer's disease
  • acetylcholinesterase drugs such as donepezil, galantamine or rivastigmine, or in the ability of memantine to antagonize a glutamate receptor, NMDA (N-methyl-D-aspartic acid).
  • HMGR 3-hydroxy-3-methylglutahl-coenzyme A reductase
  • statins 3-hydroxy-3-methylglutahl-coenzyme A reductase enzyme inhibitors
  • AD ⁇ 4 isoform of apolipoprotein E
  • Atherosclerosis which has hypercholesterolemia as the main risk factor, also seems to be associated with AD.
  • epidemiological studies indicate that high serum cholesterol levels increase the risk of AD, and it has been proposed that homeostatic regulation of cholesterol metabolism may be altered in the Alzheimer's.
  • a significant reduction in Alzheimer's risk has been described in patients treated with statins. Together, all these studies suggest that the reduction of cholesterol levels can inhibit the pathogenesis of Alzheimer's disease (CoIe &Vassar; Neurobiol Dis 2006; 22 [2]: 209-22).
  • LDLs low density (LDL) and high density (HDL) lipoproteins.
  • LDLs are specialized lipoproteins in the transport of cholesterol and triglycerides from the liver to peripheral tissues, where they are captured by cells through the LDL (R-LDL) receptors in cell membrane. LDL also regulates cholesterol synthesis, and high levels of LDL cholesterol have been associated with the risk of cardiovascular disease (CVD).
  • CVD cardiovascular disease
  • HDLs are lipoproteins that transport cholesterol from different tissues to the liver. Because HDL can remove cholesterol from the arteries and transport it back to the liver for excretion, they are given a protective role against cardiovascular disease.
  • HMGR inhibitors are the most successful lipid lowering agents in history, being able to reduce total cholesterol levels by lowering LDL cholesterol levels without altering those of HDL cholesterol.
  • statins have been described, especially at the level of brain damage caused by trauma or in dementias, with new antioxidant and anti-inflammatory activities being proposed (Pahan, CeII Mol Life Sci. 2006; 63 [10]: 1165-78), and it has been shown that certain statins (eg, simvastatin) intensify memory and learning capacity in mice (Ling et al., Ann Neurol. 2006; 60 [6]: 729-39) or protect against seizures associated with phenomena epileptics (Lee et al., Neurosci Lett. 2008; 440: 260-4).
  • statins eg, simvastatin
  • statins have also demonstrated their efficacy in phase II clinical trials that suggest positive results against the treatment of cerebral vasospasm (Fandino et al., Neurosurgery. 2007; 18: 16-27), as well as against induced neuronal death for ischemic damage in the retina (Honjo et al., Arch. Ophthalmol. 2002; 120: 1707-13).
  • statins eg, atorvastatin, lovastatin, simvastatin, etc.
  • Patent application WO 99/1 1258 describes a compound of similar structure to that of the present invention. However, this document does not specify the configuration of the different chiral centers present in the compound. SUMMARY OF THE INVENTION
  • the neuroprotective activity of said compound has been shown against different aggressions that cause neuronal death in human cell lines of cholinergic origin through different types of aggressions that cause oxidative stress, reticular stress or apoptosis (Example 2, Figures 1 to 4) .
  • Said example shows the potential use of said compound in the prevention and / or treatment of neuronal death associated with neurodegenerative diseases (eg, Alzheimer's, Parkinson's, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, status epilepticus, Huntington, etc.) or diseases associated with unwanted oxidation or pathological processes associated with age.
  • neurodegenerative diseases eg, Alzheimer's, Parkinson's, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, status epilepticus, Huntington, etc.
  • diseases associated with unwanted oxidation or pathological processes associated with age eg, Alzheimer's, Parkinson's, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, status epilepticus, Huntington, etc
  • the neuroprotective activity of said compound has been confirmed in a mouse Alzheimer's disease model, where this compound exerts a neuroprotective effect against neuronal death in the hippocampus caused by an excitotoxic substance (Example 3, Figure 5).
  • said substance recovers the temporal and spatial memory of mice with neurodegeneration (Example 3, Figures 6 and 7), in addition to preventing the death of animals caused by the administration of an excitotoxic substance (Example 3, Figure 8).
  • neurodegenerative diseases eg, Alzheimer's, Parkinson's, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, status epilepticus, Huntington, etc.
  • diseases associated with unwanted oxidation or pathological processes associated with age eg, Alzheimer's, Parkinson's, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, status epilepticus, Huntington, etc.
  • the antiepileptic and anticonvulsant activity of said compound has been demonstrated by determining the protection of seizures and seizures in an epilepsy model in mice (Example 4, Figures 9 and 10). Said example shows the potential use of this compound in the prevention and / or treatment of epilepsy and seizures or convulsions.
  • the lipid lowering activity of said compound has been revealed by determining the inhibition of the GR HM in comparison with two commercial statins, simvastatin and atorvastatin (Example 5, Figure 11).
  • hypolipidemic capacity of said compound has been demonstrated in a model of endogenous hyperlipidemia in mice, with an effect similar to simvastatin being observed in the decrease in total plasma cholesterol levels, LDL-associated cholesterol, VLDL-associated cholesterol and The fraction of esterified cholesterol. On the contrary, and like simvastatin, it does not alter the levels of cholesterol associated with HDL or those of the fraction of free cholesterol, which gives it a protective role against cardiovascular diseases (CVD) (Example 5, Figures 12 a 1 7).
  • CVD cardiovascular diseases
  • Said examples show the potential use of said compound in the prevention and / or treatment of hypercholesterolemia associated with cardiovascular diseases (eg, myocardial infarction, atherosclerosis, congenital heart disease, acquired heart disease, ischemic heart disease, hypertensive heart disease, valvular heart disease, cardiomyopathies , blood disorders, etc.).
  • cardiovascular diseases eg, myocardial infarction, atherosclerosis, congenital heart disease, acquired heart disease, ischemic heart disease, hypertensive heart disease, valvular heart disease, cardiomyopathies , blood disorders, etc.
  • the lipid-lowering activity of said compound has been confirmed in a mouse-induced hyperlipidemia model (Example 6, Figures 1-8-23), with a greater effect than simvastatin being observed in the decrease of total plasma cholesterol levels, of cholesterol associated with LDL and Ia free and esterified cholesterol fraction.
  • this compound does not alter the levels of cholesterol associated with HDL nor those of cholesterol associated with VLDL, which gives it a protective role against cardiovascular diseases (CVD).
  • CVD cardiovascular diseases
  • Said examples show the potential use of said compound in the prevention and / or treatment of hypercholesterolemia associated with cardiovascular diseases (eg, myocardial infarction, atherosclerosis, congenital heart disease, acquired heart disease, ischemic heart disease, hypertensive heart disease, valvular heart disease, cardiomyopathies, blood disorders, etc.)
  • the biosecurity of said compound has been revealed by assessing its toxicity in a zebrafish embryo model, compared to a commercial statin, simvastatin, observing that it is less toxic than simvastatin at different concentrations since it produces a lower mortality (Example 7, Figures 24 and 25).
  • lethal dose 50 is higher in the case of compound NST0037 than in that of simvastatin at all time points evaluated, which indicates a greater biosecurity of said compound (Example 7, Figures 26) . Additionally, it has been shown that this compound produces a higher percentage of healthy larvae at the end of the experiment, as well as a lower percentage of larvae with deformities or abnormal appearance (Example 7, Figures 27 and 28). Additionally, this compound does not produce a significant variation in the percentage of heartbeats at high concentrations, unlike simvastatin that produces a significant decrease in heart rate at high concentrations (Example 7, Figures 29).
  • one aspect of the present invention refers to a compound of formula (I) [also sometimes identified in this patent application as NST0037]:
  • Another aspect of the present invention is a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a compound of formula (I) and / or its hydroxy acid form and / or a pharmaceutically acceptable salt of said hydroxy acid and / or a pharmaceutically acceptable prodrug or solvate of the compound or its hydroxy acid form, and at least one pharmaceutically acceptable adjuvant, carrier and / or vehicle.
  • Another aspect of the present invention relates to a compound of formula (I), its hydroxy acid form or a pharmaceutically acceptable salt of said hydroxy acid and / or a pharmaceutically acceptable prodrug or solvate of the compound or of its hydroxy acid form for use as a medicine.
  • the present invention refers to a compound of formula (I), its hydroxy acid form or a pharmaceutically acceptable salt of said hydroxy acid and / or a pharmaceutically acceptable prodrug or solvate of the compound or of its idroxy acid form for use as neuroprotective agent, in particular in the prevention and / or treatment of: a. neurodegenerative diseases (eg, Alzheimer's, Parkinson's, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, status epilepticus, Huntington, etc.), more specifically, as a neuroprotector against apoptosis, oxidative stress or endoplasmic reticulum stresses associated with such chronic neurodegenerative diseases, b. cognitive impairment, c. diseases associated with unwanted oxidation, d.
  • neurodegenerative diseases eg, Alzheimer's, Parkinson's, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, status epilepticus, Huntington, etc.
  • cardiovascular diseases such as atherosclerosis, atrial fibrillation, dyslipidemia, hypercholesterolemia, hyperlipidemia, and hypertriglyceridemia, or g. fungal or viral infections
  • the medicament is for use as a neuroprotective agent, in particular in the prevention and / or treatment of: a. neurodegenerative diseases (e.g., Alzheimer's, Parkinson's, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, status epilepticus,
  • a neurodegenerative diseases e.g., Alzheimer's, Parkinson's, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, status epilepticus
  • Huntington, etc. more specifically, as a neuroprotector against processes of apoptosis, oxidative stress or endoplasmic reticulum stress associated with such chronic neurodegenerative diseases, b. cognitive impairment, c. diseases associated with unwanted oxidation, d. pathological processes associated with age and progeria, e. epilepsy, seizures and seizures, f. cardiovascular diseases such as atherosclerosis, atrial fibrillation, dyslipidemia, hypercholesterolemia, hyperlipidemia, and hypertriglyceridemia, or g. fungal or viral infections
  • Another aspect of the present invention is a compound of formula (I), its hydroxy acid form or a pharmaceutically acceptable salt of said hydroxy acid and / or a pharmaceutically acceptable prodrug or solvate of the compound or of its hydroxy acid form for use in increasing the expression of the seladin-1 / DHCR24 gene.
  • Another aspect of the present invention is a compound of formula (I), its hydroxy acid form or a pharmaceutically acceptable salt of said hydroxy acid and / or a pharmaceutically acceptable prodrug or solvate of the compound or of its hydroxy acid form for use in the prevention and / or treatment of diseases related to the seladin-1 / DHCR24 gene.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of a compound of formula (I), of its hydroxy acid form, of a pharmaceutically acceptable salt of said hydroxy acid and / or of a pharmaceutically acceptable prodrug or solvate of the compound or of its hydroxy acid form in The preparation of a medicament characterized by increasing the expression of the seladin-1 / DHCR24 gene.
  • the invention relates to a method for the prevention and / or treatment of neurodegenerative diseases, cognitive impairment, diseases associated with unwanted oxidation, pathological processes associated with age and progeria, epilepsy, epileptic seizures and seizures, cardiovascular diseases as atherosclerosis, atrial fibrillation, dyslipidemia, hypercholesterolemia, hyperlipidemia and hypertriglyceridemia, or fungal or viral infections in a subject in need of treatment, which comprises administering to said subject a therapeutically efficient amount of a compound of formula (I), its form hydroxy acid or a pharmaceutically acceptable salt of said hydroxy acid and / or a pharmaceutically acceptable prodrug or solvate of the compound or of its hydroxy acid form.
  • a compound of formula (I) its form hydroxy acid or a pharmaceutically acceptable salt of said hydroxy acid and / or a pharmaceutically acceptable prodrug or solvate of the compound or of its hydroxy acid form.
  • Figure 1 is an XY scatter plot that represents the protective effect of compound NST0037 from death caused by xanthine / xanthine oxidase (XXO).
  • the figure shows the percentage of cell death (taking 100% Ia produced by XXO) of the cultures treated with 10 ⁇ M xanthine (X) 60 mU / mL xanthine oxidase (XO) and NST0037 at different concentrations, representing the means + SD of 3 independent experiments in triplicate.
  • * Significant difference with respect to treatments with XXO alone, according to the Student test (p ⁇ 0.05).
  • Figure 2 is an XY scatter plot that represents the protective effect of compound NST0037 from death caused by tunicamycin (Tm).
  • the figure shows the percentage of cell death (taking 100% Ia produced by Tm) of the cultures treated with 24 ⁇ M Tm and NST0037 a different concentrations, representing the means + SD of 3 independent experiments in triplicate. * Significant difference with respect to treatments with Tm alone, according to the Student test (p ⁇ 0.05).
  • Figure 3 is an XY scatter plot that represents the protective effect of compound NST0037 from death caused by camptothecin (CPT).
  • CPT camptothecin
  • the figure shows the percentage of cell death (taking 100% Ia produced by CPT) of the cultures treated with 20 nM CPT and NST0037 at different concentrations, representing the means + SD of 3 independent experiments in triplicate. * Significant difference with respect to treatments with CPT alone, according to the Student test (p ⁇ 0.05).
  • Figure 4 are two bar graphs that represent the protective effect of compound NST0037 of camptothecin (CPT) apoptosis determined by flow cytometry.
  • Figure 4A shows the percentage of inhibition of apoptosis produced by 50 ⁇ M CPT and NST0037 at 10, 40 and 100 ⁇ M compared to the inhibition control Z-VAD-fmk at 50 ⁇ M, representing the means + SD of 3 experiments independent. * Significant difference with respect to treatment with CPT alone, according to the Student test (p ⁇ 0.05).
  • Figure 4B shows that pretreatment with NST0037 enhances the antiapoptotic effect of the compound (40 ⁇ M NST0037 and 24 h treatment with 50 ⁇ M CPT as inducer of apoptosis), this protection being partially inhibited by the addition of mevalonate (MEV), a precursor of the route of cholesterol biosynthesis and product of the enzymatic reaction that catalyzes the enzyme HMG-CoA Reductase.
  • MEV mevalonate
  • Figure 4B shows the percentage of inhibition of apoptosis produced by 50 ⁇ M CPT with a 24 h pretreatment with 40 ⁇ M NST0037 alone or together with 100 ⁇ M mevalonate (MEV), and the effect of the inhibitor Z-VAD-fm ka 50 ⁇ M as a control, representing the means + SD of 3 independent experiments.
  • Figure 5 is a micrograph composition showing the CA1 and CA2 regions of the hippocampus of mice where the samples have been stained with hematoxylin & eosin.
  • the figure represents the histopathological analysis of the cellular structure of these regions according to the pretreatment (-24 and -0.5 hours of the inoculation of the excitotoxic substance [kainic acid or kainate or KA]), the inoculation of the excitotoxic substance (0 days post-inoculation [dpi]) and the subsequent treatment (up to 7 dpi) .
  • Figure 6 is a bar graph where the state of temporal memory is analyzed according to the protocol of Dere et al. (Dere, E., Huston, JP & De Souza Silva, MA Neurobiol Learn Mem 2005; 84: 214-21) .
  • the bars represent the means ⁇ SEM of the temporal memory expressed in arbitrary units (Y axis), depending on the pretreatment (-24 and -0.5 hours of the inoculation of the excitotoxic substance [kainic acid or kainate or KA]), the inoculation of the excitotoxic substance (0 days post-inoculation [dpi]) and the subsequent treatment (up to 7 dpi).
  • Figure 7 is a bar graph where the state of the spatial memory is analyzed according to the protocol of Dere et al. (Dere, E., Huston, JP & De Souza Silva, MA Neurobiol Learn Mem 2005; 84: 214-21) .
  • the bars represent the means ⁇ SEM of the spatial memory expressed in arbitrary units (Y axis), depending on the pretreatment (-24 and -0.5 hours of the inoculation of the excitotoxic substance [kainic acid or kainate or KA]), the inoculation of the excitotoxic substance (0 days post-inoculation [dpi]) and the subsequent treatment (up to 7 dpi).
  • Figure 8 is a graph of Kaplan-Meier representing the survival rate of the mice as a function of pretreatment (-24 and -0.5 hours of inoculation of the excitotoxic substance [kainic acid or kainate or KA]), the inoculation of The excitotoxic substance (0 days post-inoculation [dpi]) and the subsequent treatment (up to 7 dpi).
  • Figure 9 is a bar graph showing the mean ⁇ SEM of the time in minutes after the inoculation of KA in which the first seizure (Y axis) appears depending on the pretreatment received (X axis).
  • the pretreatment group with PBS is represented in black and the treatment group with NST0037 at 50 mg / kg of weight is represented in gray.
  • Figure 10 is an XY scatter plot that represents the level of severity of the status epilepticus observed according to the Racine scale (Racine, Electroencephalogr Clin Neurophysiol 1972; 32 [3]: 281-94), versus the post-inoculation time of Ia epileptogenic substance (kainic acid or kainate or KA).
  • the graph shows the evolution of the epileptogenic state of the animals according to the treatment received: PBS is represented with black circles and lines and the treatment group with NST0037 at 50 mg / kg of weight is represented with gray squares and lines.
  • Figure 1 1 is an XY scatter plot representing the dose-response curves of compound NST0037 in comparison with two commercial statins (simvastatin and atorvastatin) on the enzymatic activity of the HMGR in vitro.
  • the graph shows the percentage of enzymatic activity of the HMGR with respect to the control of the compounds in different doses, representing the mean ⁇ SD of at least four independent tests.
  • Figure 12 is a bar chart representing the levels of total plasma cholesterol of male ApoB100 mice after 12h of being treated with 50 mg / kg of NST0037 or simvastatin, representing the mean ⁇ SD of each of the groups. * Significant difference with respect to time Oh, according to the Student test (p ⁇ 0.05).
  • Figure 13 is a bar chart representing the levels of plasma LDL cholesterol (c-LDL) of male ApoB100 mice after 12 hours of being treated with 50 mg / kg of NST0037 or simvastatin, representing the mean ⁇ SD of each of the groups * Significant difference with respect to time Oh, according to the Student test (p ⁇ 0.05).
  • Figure 14 is a bar chart representing the levels of plasma HDL cholesterol (c-HDL) of ApoB100 male mice after 12 hours of being treated with 50 mg / kg of NST0037 or simvastatin, representing the mean ⁇ SD of each of the groups * Significant difference with respect to time Oh, according to the Student test (p ⁇ 0.05).
  • Figure 15 is a bar chart depicting the levels of plasma VLDL cholesterol (c-VLDL) of ApoB100 male mice after 12 hours of being treated with 50 mg / kg of NST0037 or simvastatin, representing the mean ⁇ SD of each of the groups * Significant difference with respect to time Oh, according to the Student test (p ⁇ 0.05).
  • Figure 16 is a bar chart depicting the levels of plasma esterified cholesterol (EC) of ApoB100 male mice after 12h of being treated with 50 mg / kg of NST0037 or simvastatin, representing Ia mean ⁇ SD of each of the groups. * Significant difference with respect to time Oh, according to the Student test (p ⁇ 0.05).
  • Figure 17 is a bar chart depicting plasma free cholesterol (CL) levels of male ApoBl OO mice after 12h of being treated with 50 mg / kg of NST0037 or simvastatin, representing the mean ⁇ SD of each of the groups . * Significant difference with respect to time Oh, according to the Student test (p ⁇ 0.05).
  • Figure 18 is a bar chart depicting the number of times that total cholesterol (CT) increases in male C57BL6 mice after 24 hours of being treated ip with 500 mg / kg of Triton 1339 (Tyloxapol) and 50 mg / kg of NST0037 or simvastatin, representing the mean ⁇ SD of each of the groups. * Significant difference with respect to the control group, according to the Student test (p ⁇ 0.05).
  • Figure 19 is a bar chart depicting the number of times LDL cholesterol (c-LDL) increases in male C57BL6 mice after 24 hours of being treated ip with 500 mg / kg Triton 1339 (Tyloxapol) and 50 mg / kg NST0037 or simvastatin, representing the mean ⁇ SD of each of the groups. * Significant difference with respect to the control group, according to the Student test (p ⁇ 0.05).
  • Figure 20 is a bar chart depicting the number of times that HDL (c-HDL) cholesterol increases in male C57BL6 mice after 24 hours of being treated ip with 500 mg / kg of Triton 1339 (Tyloxapol) and 50 mg / kg NST0037 or simvastatin, representing the mean ⁇ SD of each of the groups.
  • Figure 21 is a bar chart depicting VLDL (c-VLDL) cholesterol levels in C57BL6 male mice after 24h of being treated ip with 500 mg / kg of Triton 1339 (Tyloxapol) and 50 mg / kg of NST0037 or simvastatin , representing the mean ⁇ SD of each of the groups. * Significant difference with respect to the control group, according to the Student test (p ⁇ 0.05).
  • Figure 22 is a bar chart depicting the number of times that esterified cholesterol (EC) increases in male C57BL6 mice after 24 hours of being treated ip with 500 mg / kg of Triton 1339 (Tiloxapol) and 50 mg / kg of NST0037 or simvastatin, representing the mean ⁇ SD of each of the groups.
  • EC esterified cholesterol
  • Figure 23 is a bar chart depicting the number of times that free cholesterol (CL) increases in male C57BL6 mice after
  • NST0037 or simvastatin representing the mean ⁇ SD of each of the groups.
  • Figure 24 is a Kaplan-Meier plot depicting the survival rate of embryo-larvae as a function of the treatment received: control, NST0037 (at a dose of 2 mg / L) or simvastatin (at a dose of 2 mg / L). * Significant difference with respect to the control, according to the ⁇ 2 test
  • Figure 25 is a Kaplan-Meier plot depicting the survival rate of embryo-larvae as a function of the treatment received: control, NST0037 (at a dose of 0.2 mg / L) or simvastatin (at a dose of 2 mg / L). * Significant difference with respect to the control, according to the ⁇ 2 test
  • Figure 26 is an XY scatter plot representing the lethal dose 50 (LD50) of the two compounds (NST0037 or simvastatin) versus the treatment time.
  • Figure 27 is a bar graph that represents the percentage of healthy larvae that are obtained at the end of the experiment according to the treatment received (NST0037 or simvastatin) and the dose used (0.02, 0.06 or 0.2 mg / L), and where represents the means ⁇ SD.
  • Figure 28 is an XY scatter plot representing the percentage of embryo-larvae with deformities or abnormal appearance depending on the treatment received (NST0037 or simvastatin). * Significant difference between the two treatments, according to the Student test (p ⁇ 0.05).
  • Figure 29 is a bar graph depicting the percentage of heart rate of embryo-larvae treated with increasing doses of the NST0037 or simvastatin compounds, at 72 hours post-treatment, representing the means ⁇ SD. The horizontal dotted black line represents the average heart rate value corresponding to the controls. * Significant difference of the treatments with respect to the control, according to the Student test (p ⁇ 0.05).
  • Figure 30 is a graph showing the antifungal activity of compound NST0037 and simvastatin. It represents the logarithm of the concentrations tested (mM) versus the diameter of the inhibition halos (cm).
  • Figure 31 is a bar graph showing the increase in the expression of the seladin-1 / DHCR24 gene by treatment with NST0037 in SK-N-MC cells.
  • Figure 32 is an XY scatter plot that represents the protective effect of compound NST0037 from death caused by okadaic acid (OA).
  • the figure shows the percentage of cell death (taking 100% Ia produced by OA) of the cultures treated with 20 nM OA and NST0037 at different concentrations, representing the means + SD of 3 independent experiments in triplicate. * Significant difference with respect to the treatments with OA alone, according to the Student test (p ⁇ 0.05).
  • Figure 33 is an XY scatter plot that represents the protective effect of compound NST0037 from death caused by 3- nitropropionic acid (3-NP).
  • the figure shows the percentage of cell death (taking 100% Ia produced by 3-NP) of the cultures treated with 30 ⁇ M 3-NP and NST0037 at different concentrations, representing the means + SD of 3 independent experiments in triplicate. * Significant difference with respect to treatments with 3-NP alone, according to the Student test (p ⁇ 0.05).
  • Figure 34 is a bar graph depicting the inhibitory effect of pretreatment of compound NST0037 on the activation of caspase 3/7, induced by camptothecin (CPT).
  • the figure shows the percentage of active caspase 3/7 referred to the control cells, without treatment, produced by 50 ⁇ M CPT and pretreatment with NST0037 at 10 and 40 ⁇ M, mevalonate at 100 ⁇ M and the combination of both compounds, in addition, uses the Z-VAD-fmk inhibitor at 50 ⁇ M as an inhibition control, representing the means + SD of 3 independent experiments.
  • Figure 35 are two bar graphs showing the percentage of A ⁇ (1-40) (A) and A ⁇ (1-42) (B) secreted and quantified by
  • Figure 36 is a bar graph that represents the effect of the mevalonate on the protection by NST0037 of the cell death produced by XXO.
  • the figure shows the percentage of cell death (taking 100% Ia produced by XXO) of the cultures treated with 10 ⁇ M xanthine (X) 60 mU / mL xanthine oxidase (XO) and 40 ⁇ M NST0037 and mevalonate at 10, 40 and 100 ⁇ M, representing the means + SD of 3 independent experiments in triplicate.
  • Figure 37 is a micrograph composition showing the imm ish istochemical of MAP2 in the hippocampus of mice with a magnification of 12.5X and in more detail of the areas CA1 and CA2-CA3 with a magnification of 200X.
  • the figure represents the histopathological analysis of the neuritic dystrophy as a function of pretreatment (-24 and -0.5 hours of the inoculation of the excitotoxic substance [kainic acid or kainate or KA]), the inoculation of the excitotoxic substance (0 days post-inoculation [dpi]) and subsequent treatment (up to 7 dpi).
  • Figure 38 is a composition of micrographs showing: (A) the CA2 and CA3 region of the hippocampus of mice where the samples have been performed the immunohistochemistry of HN E, the technique of T. U. N. EL and Ia immunohistochemistry of GFAP, all images have a magnification of 100X.
  • the figure represents the histopathological analysis of oxidative damage, apoptosis and astrogliosis in the hippocampus depending on pretreatment (-24 and - 0.5 hours of inoculation of the excitotoxic substance [kainic acid or kainate or KA]), the inoculation of the substance excitotoxic (0 days post-inoculation [dpi]) and subsequent treatment (up to 7 dpi).
  • Figure 39 is a Kaplan-Meier plot that represents the survival rate of the mice as a function of the treatment (-24 and -0.5 hours of the inoculation of the neurotoxic substance [MPTP]), the inoculation of the neurotoxic substance (0 post-inoculation days [dpi]) and subsequent treatment (up to 7 dpi).
  • Figure 40 is a bar graph where the resistance of the animal is analyzed.
  • the bars represent the means ⁇ SEM of the ratio between the residence time in the animals' cylinder at 7 d.p.i. regarding the basal state (Y axis), depending on the treatment (-24 and -0.5 hours of the inoculation of the neurotoxic substance [MPTP]), the inoculation of the neurotoxic substance (0 days post-inoculation [dpi]) and the subsequent treatment (up to 7 dpi).
  • Figure 41 is a bar graph where the force in the front limbs of the animal is analyzed.
  • the bars represent the means ⁇ SEM of the ratio Ia strength of the animals in grams per quintuplicate at 7 d.p.i. regarding the basal state (Y axis), depending on the treatment (-24 and -0.5 hours of the inoculation of the neurotoxic substance [MPTP]), the inoculation of the neurotoxic substance (0 days post-inoculation [dpi]) and the subsequent treatment (up to 7 dpi).
  • Figure 42 is a micrograph composition showing the regions of the nigra substance and the striatum of mice where the samples have been stained with Fluoro Jade B with a magnification of 100X.
  • the figure represents the histopathological analysis of neurodegeneration as a function of treatment (-24 and -0.5 hours of the inoculation of the neurotoxic substance [MPTP]), the inoculation of the neurotoxic substance (0 days post-inoculation [dpi]) and the subsequent treatment (up to 7 dpi).
  • Figure 43 is a micrograph composition showing the regions of the nigra substance and the striatum of mice where the samples have been immunohistochemical against tyrosine hydroxylase with a magnification of 100X.
  • the figure represents the histopathological analysis of the death of dopaminergic neurons of the nigra substance and of the disappearance of the nerve extensions of the striatum depending on the treatment (-24 and -0.5 hours of the inoculation of the neurotoxic substance [MPTP]), Ia inoculation of
  • the neurotoxic substance (0 days post-inoculation [d.p.i.]) and the subsequent treatment (up to 7 d.p.i.).
  • Figure 44 is an XY scatter plot where the resistance of the animal is analyzed.
  • the bars represent the means ⁇ SEM of the ratio between the residence time in the animals' cylinder at 7, 14 and 21 d.p.i. regarding the basal state (Y axis) depending on the treatment (-24 and -0.5 hours of the inoculation of the neurotoxic substance [MPTP]), the inoculation of the neurotoxic substance (0 days post-inoculation [dpi]) and the subsequent treatment (up to 21 dpi).
  • Figure 45 is a micrograph composition showing the region of the nigra substance of mice where the samples have been performed immunohistochemistry against tyrosine hydroxylase and HNE with a magnification of 100X.
  • the figure represents the histopathological analysis of death and lipid peroxidation in dopaminergic neurons of the nigra substance depending on the treatment (-24 and -0.5 hours of inoculation of the neurotoxic substance [MPTP]), the inoculation of the neurotoxic substance ( 0 days post-inoculation [dpi]) and subsequent treatment (up to 21 dpi).
  • Figure 46 is an XY scatter plot that represents the effective permeability expressed as P e (cm / s) versus the BHE pass (%) of atorvastatin, simvastatin and NST0037 by in vitro determination by the PAMPA method. As positive and negative controls, verapamil and theophylline were used respectively.
  • Figure 47 is a bar chart that represents the effect of simvastatin and NST0037 on cholesterol levels in human HepG2 and SK-N-MC cell lines. The results are expressed as the percentage of cholesterol reduction with respect to the control in each line after the incubation of the acidic compounds during 2Oh in the absence of FBS. The determinations were carried out by enzymatic and fluorometric means and the results are the mean ⁇ SD. * Significant difference from untreated cells, according to the Student test (p ⁇ 0.05). In the case of HepG2, 2 independent tests were performed in triplicate and in the case of the SK-N-MC three independent tests in triplicate.
  • Figure 48 is a set of XY scatter plots that represent the plasma cholesterol concentration and its various fractions in addition to the apoB concentration in apoB100 female mice 12 weeks of age after 7, 21 and 28 days of oral treatment with 50 mg / kg of NST0037 or simvastatin, representing the mean ⁇ SEM of each of the groups and times. * Significant difference with respect to the control, according to the Student test (p ⁇ 0.05). + Significant difference with respect to the initial time of that same group.
  • Figure 49 is a bar chart depicting the number of times that free and esterified cholesterol increases in female apoB100 mice 12 weeks of age after 7, 21 and 28 days of treatment with 50 mg / kg of NST0037 or simvastatin, representing The mean ⁇ SEM of each of the groups. * Significant difference with respect to the control group, according to the Student test (p ⁇ 0.05).
  • Figure 50 is a bar chart representing the number of times that the oxidation state in the plasma of female apoB100 mice 12 weeks of age after 7, 21 and 28 days of treatment with 50 mg / kg of NST0037 or simvastatin increases , representing the mean ⁇ SEM of each of the groups. * Significant difference with respect to the control group, according to the Student test (p ⁇ 0.05).
  • Figure 51 is a set of XY scatter plots representing the plasma cholesterol concentration and its various fractions in female apoB100 mice 6 months of age after one, two and three months of oral treatment with 50 mg / kg of NST0037 or simvastatin , representing the mean ⁇ SEM of each of the groups. * Significant difference with respect to the control, according to the Student test (p ⁇ 0.05). + Significant difference with respect to the initial time of that same group.
  • Figure 52 is a bar chart depicting the number of times that free and esterified cholesterol increases in female apoB100 mice 6 months of age after one, two or three months of oral treatment with 50 mg / kg of NST0037 or simvastatin, representing the mean ⁇ SEM of each of the groups. * Significant difference with respect to the control group, according to the Student test (p ⁇ 0.05).
  • Figure 53 is a bar chart that represents the number of times cholesterol increases and its various fractions in male zucker rats of 11 weeks of age after 7 days of oral treatment with 30 mg / kg of NST0037 or simvastatin, representing the mean ⁇ SEM of each of the groups. * Significant difference with respect to the control group, according to the Student test (p ⁇ 0.05).
  • Figure 54 is a bar chart that represents the number of times plasma triglycerides increase in 11-week-old male zucker rats after 7 days of oral treatment with 30 mg / kg of NST0037 or simvastatin, representing the mean ⁇ SEM of Each of the groups. * Significant difference with respect to the control group, according to the Student test (p ⁇ 0.05).
  • Figure 55 is a bar chart that represents the number of times that plasma redox status increases in 11-week-old male zucker rats after 7 days of oral treatment with 30 mg / kg of NST0037 or simvastatin, representing the mean ⁇ SEM of each of the groups. * Significant difference with respect to the control group, according to the Student test (p ⁇ 0.05).
  • Figure 56 is a bar chart that represents the number of times that increases the expression of the seladin-1 / DHCR24 gene in the brain of C57BL6 wild mice at 4h of the oral administration at 50 mg / kg of NST0037 or simvastatin, representing the mean ⁇ SEM of each of the groups. * Significant difference with respect to the control group, according to the Student test (p ⁇ 0.05).
  • Figure 57 is a bar chart representing the percentage of healthy larvae (without toxicological problems) after exposure of compound NST0037 compared to simvastatin, representing the mean of the percentage ⁇ SEM of healthy animals after treatment with different doses of NST0037 or of simvastatin.
  • the Y axis determines the percentage of healthy larvae and the X axis, the concentrations used of both compounds.
  • the gray bars represent the group of animals treated with NST0037 and the black bars represent the animals treated with simvastatin.
  • Figure 58 is a bar chart that represents the percentage of larvae with anomalous appearance (symptomatology) after exposure of compound NST0037 compared to simvastatin, representing the mean of the percentage ⁇ SEM of larvae with deformations or anomalous appearance after treatment with different dose of NST0037 or simvastatin.
  • the axis of the Y determines the percentage of larvae with anomalous appearance and the axis of the X the different alterations of the symptomatology.
  • the gray bars represent the group of animals treated with NST0037 and the black bars represent the animals treated with simvastatin.
  • Figure 59 is a bar chart depicting the variation of the weight of adult zebrafish in a single dose toxicity test (24 hours) by exposure in the water of compound NST0037 in comparison with simvastatin.
  • the data are presented as the average weight of the animals ⁇ SD according to the study time and the treatment group.
  • the white bars indicate the weight of the animals depending on the treatment, referring to the baseline study (0 dpt).
  • the gray graphs indicate the weight of the animals depending on the treatment, referring to the study at 7 dpt.
  • the black graphs indicate the weight of the animals depending on the treatment, referring to the study at 14 dpt.
  • Figure 60 is a micrograph composition showing the histopathological study in different organs of adult zebra fish after a single dose toxicity test (24 hours) by exposure in the water of compound NST0037 in comparison with simvastatin.
  • the animals were treated with a dose of 2000 mg / kg, sacrificed at 14 days post-treatment, performed representative histological sections of the different study groups and stained with hematoxylin-eosin.
  • the organs studied are: brain, kidney, pancreas, intestine, eye, gills, ovary, testicle, muscle and liver.
  • Figure 61 is a micrograph composition showing the histopathological study in the ovary of adult zebrafish after a lethality test by constant exposure in water (4 days) of the compound NST0037 compared to simvastatin.
  • the animals were treated with two doses of 32 and 100 mg / Kg, sacrificed at 4 days post-treatment, made representative histological sections of the different study groups and stained with hematoxylin-eosin.
  • the ovary was the only organ studied that underwent pathological alterations. It shows a histological section of the ovary of a female of the control group, and female ovaries of the treatment groups with NST0037 and simvastatin depending on the dose.
  • neuroprotector refers to any substance capable of producing the attenuation or disappearance of the effects of neuronal degeneration or death by any known mechanism or by knowing, for example, necrosis, apoptosis, autophagy, oxidative damage, excitotoxicity, endoplasmic reticulum damage, deposition of by-products, loss of cellular architecture, etc., or the decrease or disappearance of its side effects.
  • statin refers to an inhibitor of the enzyme 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase (HMGR), an enzyme that catalyzes the limiting step of cholesterol biosynthesis, and includes any both natural and synthetic or semi-synthetic statin.
  • HMGR 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase
  • statins can occur in a closed form (lactone) or in an open form (hydroxy acid).
  • lactone lactone
  • hydroxy acid hydroxy acids
  • open form can be prepared from the corresponding lactones by conventional hydrolysis, for example, with sodium hydroxide in methanol, sodium hydroxide in tetrahydro-water-borne tetra and the like.
  • statins react to form salts with pharmaceutically acceptable cations of metals and amines, formed from organic or inorganic bases.
  • Pharmaceutically acceptable salts of statins may differ from the corresponding free acids in some physical characteristics such as solubility and melting point, but are considered equivalent to the free acid form for the purposes of this invention.
  • the open (hydroxy acid) free form of the statins can be regenerated from the salt form, if desired, by contacting the salt with a dilute aqueous solution of an acid such as hydrochloric acid and the like.
  • the closed form (lactone) of the statins can be regenerated by dissolving the open form (hydroxy acid) in an inert solvent such as, for example, toluene, benzene, ethyl acetate and the like, at temperatures between about 0 0 C and about the boiling point of the solvent, typically (but not necessarily) with simultaneous separation of the resulting water and catalysis with strong acids, eg, hydrochloric acid and the like.
  • statins may exist in solvated or non-solvated form and such forms are equivalent to the non-solvated form for the purposes of this invention.
  • cardioprotective refers to any substance capable of producing attenuation or disappearance of the underlying effects of cardiovascular disease or heart disease or of cardiac damage by any known or known mechanism, for example , necrosis, apoptosis, ischemia, arrhythmia, byproduct deposition, loss of the cellular architecture, etc., or the decrease or disappearance of its side effects.
  • lipid-lowering refers to any pharmacologically active substance that has the property of lowering lipid levels in blood or other tissues. The importance of these substances is given because the excess of some types of lipids (cholesterol or triglycerides) or lipoproteins, is one of the main risk factors for cardiovascular diseases.
  • hypocholesterolemic refers to any pharmacologically active substance that has the property of lowering cholesterol levels in blood or other tissues.
  • hypotriglyceridemic refers to any pharmacologically active substance that has the property of lowering triglyceride levels in blood or other tissues.
  • antiepileptic or anticonvulsant refers to the attenuation of seizures or seizures, for example, in duration and / or intensity, or the disappearance of seizures or seizures, or Ia decrease or disappearance of its side effects.
  • biosafety refers to the absence of toxic effects, tumor generation, embryonic development disorders (teratogenesis) or other adverse effects.
  • neurodegenerative disease includes diseases that result from the degeneration or deterioration of nerve tissue, in particular neurons, which leads, over time, to dysfunction or disability;
  • degeneration includes loss of cell viability, loss of cell function and / or loss of cell numbers (neurons or others).
  • Illustrative, non-limiting examples of neurodegenerative diseases include Alzheimer's disease, Huntington's disease, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis (ALS), multiple sclerosis, etc.
  • said neurodegenerative disease is a disease related to neuronal death caused by a substance that, for example, causes oxidative stress or endoplasmic reticulum stress or apoptosis or excitotoxicity or neuronal death in general.
  • disease associated with an unwanted oxidation refers to a disease caused by an unwanted (e.g., excessive) oxidation or in which said unwanted oxidation is a symptom.
  • Said unwanted oxidation may be the consequence of the damage caused by free radicals to proteins, DNA and / or lipids independently of the specific free radical involved or the target.
  • Unwanted oxidation implies an excessive generation of free radicals that can cause dysfunction in cells, tissues or organs and can therefore constitute a potential mechanism of a disease.
  • said unwanted oxidation can be caused by age (aging) or by a neurodegenerative process and can cause on its own or in combination with other factors the onset of various diseases.
  • said unwanted oxidation is related to the oxidative damage caused by a substance that causes oxidative stress.
  • pathological process associated with age refers to any event or combination of events related to aging that produces / n loss of cellular viability of nerve tissue or cellular sensitization of nerve tissue, loss of cell function and / or loss of cell number (neurons or others), including metabolic cell dysfunction, stress processes, pathogen infections, genetic alterations, genetic susceptibility, trauma, ischemia, epilepsy, etc.
  • cardiovascular disease refers to any disease or dysfunction or alteration of the heart or of the rest of the cardiovascular system or of the blood.
  • epilepsy refers to a chronic cerebral syndrome of various causes, characterized by recurrent crises due to excessive hypersynchronous discharges of nerve impulses by brain neurons, eventually associated with various clinical manifestations and Stopping. Crises can be convulsive or non-convulsive.
  • Epilepsy can have many causes; in some cases it can be due to brain lesions of different types (eg, head injuries, sequelae of meningitis, tumors, etc.); in other cases there is no injury but a predisposition of genetic origin to suffer the crisis; In other cases, the etiology of epilepsy may be environmental, due to pharmacological treatments, excitotoxicity, trauma, stress processes, aging, developmental problems, neurological diseases, psychological crises, problems in pregnancy, problems in childbirth, etc.
  • epileptic or convulsive refers to any epileptic seizure or seizure of any etiology, for example, genetic, environmental, pharmacological treatments, excitotoxicity, trauma, stress processes, aging , for developmental problems, for neurological diseases, for psychological crises, for problems in pregnancy, for problems in childbirth, etc.
  • An epileptic crisis occurs when an abnormal electrical activity in the brain causes an involuntary change of movement or function of the body, of sensation, in the ability to be alert or of behavior, and can be partial or generalized (convulsive or non-convulsive).
  • cogntive impairment refers to the loss or alteration of mental functions, such as memory, orientation, language, visual recognition or behavior that interfere with the activity and social interaction of the person affected by persistent over time
  • fungal or viral infections refers to any colonization of a microscopic virus or fungus that is detrimental to normal functioning or to the survival of the colonized or host organism.
  • subject refers to a member of a mammalian species, and includes, but is not limited to, pets, primates and humans; preferably, the subject is a human being, male or female, of any age or race. In a particular embodiment, said subject is a mammal that suffers, or is susceptible to, pathological processes associated with age, such as aging, or a neurodegenerative disease, such as a chronic neurodegenerative disease.
  • pharmaceutically acceptable refers to the fact that the compound is physiologically tolerable and does not produce, in general, an allergic reaction or a similar unfavorable reaction, such as a gastric disorder, dizziness or the like, when administers a subject; preferably, said term “pharmaceutically acceptable” means approved by a government regulatory agency or collected in the US pharmacopoeia or another pharmacopoeia generally recognized for use in animals (eg, European pharmacopoeia, etc.).
  • pharmaceutically acceptable salt includes “pharmaceutically acceptable metal salts” as well as “salts of amine to the pharmaceutical industry while accepting”.
  • pharmaceutically acceptable pharmaceuticals includes salts formed with sodium, potassium, calcium, magnesium, aluminum, iron or zinc ions.
  • pharmaceutically acceptable amine salt contemplates salts with ammonia and organic nitrogen bases strong enough to form salts with carboxylic acids. Said pharmaceutically acceptable salts can be obtained by conventional methods known to those skilled in the art.
  • the 2-ethyl butyrate compound of (1 S, 2S, 6R, 8S, 8aR) -1, 2,6,7,8,8a-hexahydro-aj-dimethyl- ⁇ -p- ⁇ R ⁇ R ⁇ -tetrahydro ⁇ -hydroxy-e-oxo ⁇ H-piran ⁇ -illethyl] -1-naphthalenyl can be obtained by semisynthesis methods, as described for other compounds of the same family in US patent US 4866090.
  • the inventors analyzed in more detail the neurodegenerative process by analyzing the neuronal death caused by the action of a substance causing endoplasmic reticulum stress (tunicamycin), determining that the compound NST0037 It is capable of quantitatively and significantly reducing neuronal death caused by endoplasmic reticulum stress, which demonstrates the neuroprotective capacity of said compound (Figure 2).
  • the inventors analyzed in more detail the neurodegenerative process by analyzing the neuronal death caused by the action of a substance causing apoptosis (camptothecin), determining that the NST0037 compound is capable of Quantitatively and significantly reduce the neuronal death caused by apoptosis, which demonstrates the neuroprotective capacity of said compound ( Figure 3).
  • the inventors analyzed in more detail the neurodegenerative process by means of flow cytometry analysis of neuronal death caused by apoptosis and its inhibition by said compound, in comparison with an inhibitor.
  • the inventors analyzed in more detail the neurodegenerative process by analyzing the neuronal death caused by an excitotoxic substance (kainate) in neurons of the hippocampus of mice, as described in Example 3.
  • compound NST0037 is capable of quantitatively and significantly reducing Ia Neural death caused by an excitotoxic substance, which demonstrates the neuroprotective capacity of said compound ( Figure 5).
  • the treatment with NST0037 administered before and after, or only after, of the administration of the kainate produces the protection of the neurons of the hippocampus by inhibiting the neuronal death in the areas CA1 and CA2.
  • the compound NST0037 exerts an inhibitory effect of said enzyme very similar to the statin with greater demonstrated activity (atorvastatin), and inhibits 7.5 times more the HMGR enzyme than the safest statin (simvastatin).
  • the inventors analyzed the hypocholesterolemic activity in more detail by analyzing the variations of the cholesterol fractions in the plasma of mice with endogenous hypercholesterolemia, as described In Example 5. For this, the effect of compound NST0037 and simvastatin in two groups of mice was compared, determining the levels of total cholesterol after the administration of the compounds ( Figure 12), where it was observed, surprisingly, that both compounds produced a similar hypocholesterolemic effect.
  • the cholesterol levels in the LDL, HDL and VLDL fractions were analyzed, determining that both compounds similarly lower the cholesterol levels in the LDL and VLDL fractions, but not in the HDL ( Figure 13 to 15) , which demonstrates a hypocholesterolemic and cardioprotective effect.
  • the levels of free and esterified cholesterol were analyzed, determining that both compounds similarly decrease the levels of esterified, but not free, cholesterol ( Figure 16 to 17), which demonstrates a hypocholesterolemic and cardioprotective effect.
  • hypocholesterolemic effect of the compound the inventors analyzed hypocholesterolemic activity in more detail by analyzing the variations of cholesterol fractions in the plasma of mice with induced hypercholesterolemia, as described in Example 6. For this, the effect of compound NST0037 and simvastatin in two groups of mice was compared, determining the levels of total cholesterol after the administration of the compounds ( Figure 18), where it was observed, surprisingly, that the compound NST0037 had a greater hypocholesterolemic effect than simvastatin.
  • the cholesterol levels in the LDL, HDL and VLDL fractions were analyzed, determining that the NST0037 compound decreases cholesterol levels more efficiently in the LDL fraction than the simvastatin, not altering cholesterol levels neither in the HDL fractions (as with simvastatin) or in the VLDL (unlike in simvastatin) ( Figures 19 to 21), which demonstrates a hypocholesterolemic and cardioprotective effect.
  • the inventors analyzed the biosecurity of compound NST0037 in a model Widely used toxicological agent, the zebrafish embryo, following the methodology described in protocol C15 of the OECD, as described in Example 7.
  • the inventors compared the effect of the compound in comparison with simvastatin in higher concentrations at the doses used in the clinic, with the aim of causing obvious damage to the embryos in order to better define the adverse effects of said compound.
  • lethal doses 50 were studied at different time points with NST0037 or simvastatin treatments in a semi-static method, observing that at all times the LD 5 O of simvastatin they were smaller than those of NST0037, which indicates a greater biosecurity of the latter compound ( Figure 26).
  • the percentage of healthy larvae was studied at the end of the experiment compared to simvastatin, with a greater number of healthy larvae being observed in treatments with NST0037 compared to simvastatin (Figure 27).
  • the percentage of larvae with deformities or anomalous appearance was studied over time compared to simvastatin, observing a smaller number of larvae with deformities or anomalous appearance in treatments with NST0037 in comparison with simvastatin ( Figure 28).
  • the percentage of heartbeats was studied according to the dose used comparing NST0037 with simvastatin, observing a greater decrease in heart rate in the highest evaluated dose of simvastatin than in that of NST0037, while at lower doses only simvastatin produced a statistically significant decrease in heart rate (Figure 29), which indicates a greater biosecurity of the NST0037 compound.
  • NST0037 The antifungal activity of compound NST0037 was also studied by bioassay against statins (lovastatin, atorvastatin and simvastatin). The results obtained showed that the NST0037 compound was the only one capable of producing inhibition halos in the entire range of concentrations tested, even at the lowest ( Figure 30), which indicates a greater antifungal activity.
  • the compound NST0037 is capable of quantitatively, significantly and dose-dependently increasing the expression of the seladin-1 / DHCR24 gene, which is demonstrated by the analysis of the relative expression using quantitative real-time PCR.
  • These results show the neuroprotective capacity of compound NST0037 ( Figure 31).
  • the increase in the expression of the seladin-1 / DHCR24 gene and the increase in the amount of the protein encoded by this gene have been corroborated in a parallel study using simvastatin.
  • This statin is also capable of increasing the expression of this gene, thus explaining its n Euro protective capacity, and indicating that it is a general mechanism of the family of statins that are capable of increasing the expression of the gene.
  • seladin-1 / DHCR24 is capable of quantitatively, significantly and dose-dependently increasing the expression of the seladin-1 / DHCR24 gene, which is demonstrated by the analysis of the relative expression using quantitative real-time PCR.
  • the neuroprotective effect in human neuronal cultures of compound NST0037 was studied against aggressions that mimic some of the neurodegenerative diseases, such as AD through the inhibition of protein phosphatase 1 ( Figure 32) or Huntington's disease through the inhibition of Ia succinate dehydrogenase (Figure 33).
  • the effect on the modulation of effector caspases 3/7 was studied, determining that the NST0037 compound prevents their activation, and that this effect is related to the cholesterol biosynthesis pathway (Figure 34).
  • the compound NST0037 is capable of reducing the levels of A ⁇ (1-40) and A ⁇ (1-42) in a human neuronal cellular model that overexpresses the APP protein (Figure 35).
  • the inventors analyzed in more detail the neurodegenerative process by analyzing the histopathological traces associated with neuronal death caused by an excitotoxic substance (kainate) in neurons of the hippocampus of mice, as described in Example 15.
  • the compound NST0037 is able to prevent or improve the neuritic dystrophy (Figure 37), as well as oxidative damage, apoptosis and astrogliosis ( Figure 38) caused by the administration of an excitotoxic substance.
  • the inventors analyzed the potential therapeutic effect of treatment with NST0037 in an acute model of Parkinson's disease in mice as described in Example 16. To do this, and after the acute administration of a Parkinsonian neurotoxin specific to dopaminergic neurons (MPTP), it was observed that NST0037 was able to modify the deleterious effects caused by the neurotoxin such as mortality ( Figure 39), the locomotor deficit in relation to the parameters of resistance ( Figure 40) and strength (Figure 41), neurodegeneration (Figure 42) in addition to the loss of dopaminergic neurons ( Figure 43) in regions involved in Parkinson's disease such as nigra or striatum.
  • MPTP Parkinsonian neurotoxin specific to dopaminergic neurons
  • the inventors analyzed the potential therapeutic effect of treatment with NST0037 in a subchronic model of Parkinson's disease in mice as described in Example 17. To do this, and after subchronic administration of a parkinsonian neurotoxin specific to dopaminergic neurons (MPTP), it was observed that the NST0037 was able to modify the deleterious effects caused by neurotoxin as the locomotor deficit in relation to motor resistance ( Figure 44), neuronal death or damage oxidative associated with lipid peroxidation ( Figure 45) in the nigra substance.
  • the inventors analyzed different parameters such as theoretical lipophilicity, the percentage of passage and the effective permeability (Figure 46, Table I) as described in Example 18.
  • the inventors analyzed in more detail the hypocholesterolemic activity by analyzing the cholesterol reductions in two human cell lines of hepatic and neuronal origin (Figure 47), as described in the Example 19.
  • the 28-day treatment of compound NST0037 orally in mice with familial hyperlipidemia resulted in a decrease in total cholesterol levels, ApoB, c-LDL, c-VLDL, c-HDL ( Figure 48), cholesterol free and esterified (Figure 49) and plasma oxidation status (Figure 50), as described in Example 20.
  • the inventors analyzed in more detail the hypocholesterolemic activity by means of reductions in cholesterol and associated fractions (Figure 53), triglycerides (Figure 54), and plasma redox status in Zucker rats with endogenous hyperlipidemia (Figure 55), as described in Example 22.
  • the inventors analyzed their regulation in the brain of mice treated orally with NST0037 ( Figure 56) as described in Example 18, demonstrating that at 4h of the administration of NST0037 there is an increase in the expression of this neuroprotective gene.
  • Example 24 the inventors decided to analyze the biosecurity of the NST0037 compound in larvae as described in Example 24.
  • the inventors compared the effect of the compound in comparison with the simvastatin performing increasing concentration curves, which revealed a high safety of the compound since no mortality occurred with either of the two treatments (Table II), and where the simvastatin produced a lower percentage of healthy larvae than the NST0037 ( Figure 57) and a higher percentage of anomalous-looking larvae ( Figure 58).
  • Table II the simvastatin performed a lower percentage of healthy larvae than the NST0037
  • Figure 58 a higher percentage of anomalous-looking larvae
  • the inventors decided to analyze the biosecurity of the NST0037 after treatment in adult fish compared to simvastatin, as described in Example 26 The results indicated that while simvastatin produced a significant mortality at 4 days of treatment, the mortality associated with the NST0037 was residual (Table III). In addition, while simvastatin produced clear histopathological variations in the ovary of animals treated with 100 mg / kg, the NST0037 did not produce any deleterious effects at this dose ( Figure 63).
  • the pharmaceutical composition provided by this invention may contain the compound NST0037, and / or its hydroxy acid form and / or a pharmaceutically acceptable salt of said hydroxy acid and / or a pharmaceutically acceptable prodrug or solvate of the compound or its hydroxy acid form together with or not more pharmaceutically acceptable adjuvants, vehicles or excipients.
  • pharmaceutically acceptable salt, prodrug or solvate refers to any pharmaceutically acceptable salt, solvate or any other compound which, in its administration to the recipient, is capable of providing (directly or indirectly) a compound as it has been described in the present invention.
  • pharmaceutically unacceptable salts also fall within the scope of the invention, since these may be useful for the preparation of pharmaceutically acceptable salts.
  • the preparation of salts and prodrugs can be carried out by methods known in the state of the art.
  • prodrug is used in its broadest meaning and encompasses those derivatives that are converted in vivo to the compounds of the invention. Such derivatives would be evident to a person skilled in the art and include the following derivatives of the present compounds: esters, amino acid esters, phosphate esters, esters of metal sulphonate salts, carbamates and amides.
  • the compounds according to the invention may be in crystalline form, either as free compounds or as solvates (for example, hydrates) and it is intended that both forms are within the scope of the present invention. Solvation methods in general are known in the state of the art. In a particular embodiment the solvate is a hydrate.
  • NST0037 or a hydroxy acid form thereof or a pharmaceutically acceptable salt of said hydroxy acid
  • the pharmaceutical compositions provided by this invention may be formulated in a solid pharmaceutical form for oral administration (eg, granules, tablets, capsules, etc.), in a liquid pharmaceutical form for oral administration. (eg, solutions, suspensions, emulsions, etc.), in a pharmaceutical form for parenteral administration (eg, solutions, suspensions, emulsions, etc.).
  • the pharmaceutically acceptable vehicles and excipients appropriate for the pharmaceutical form of administration and route of administration chosen will be chosen, for example, binders, diluents, disintegrants, lubricants, humectants, etc., for the formulation of pharmaceutical forms solid administration, and buffers, surfactants, etc., for the formulation of liquid pharmaceutical dosage forms.
  • Said vehicles and excipients must be pharmaceutically acceptable and pharmacologically tolerable and must be able to be combined with other components of the formulation without exerting any adverse effect on the treated subject.
  • Information on said vehicles and excipients, as well as on said pharmaceutical forms of administration of said active ingredient can be found in galenic pharmacy treaties.
  • the pharmaceutical composition provided by this invention comprises, the compound NST0037, or a hydroxy acid form thereof or a pharmaceutically acceptable salt of said hydroxy acid, in a therapeutically efficient amount.
  • therapeutically efficient amount refers to the amount of compound calculated to produce the desired effect.
  • the dose of compound NST0037, or a hydroxy acid form thereof or a pharmaceutically acceptable salt of said hydroxy acid, to be administered to a subject may vary within a wide range depending on numerous factors, including the characteristics of the compound used, eg , its activity and biological life, the concentration of the compound in the pharmaceutical composition, the clinical situation of the subject, the severity of the pathology, the pharmaceutical form of administration chosen, etc.
  • the pharmaceutical composition provided by this invention may be administered one or more times a day for preventive or therapeutic purposes or, alternatively, other administration guidelines may be followed, not necessarily daily but also on a timely, weekly basis, etc.
  • the pharmaceutical composition provided by this invention can be used together with other drugs, for example, drugs useful in the treatment of neurodegenerative diseases, cognitive impairment, diseases associated with unwanted oxidation, pathological processes associated with age and progeria, epilepsy, epileptic seizures, seizures, cardiovascular diseases, or fungal or viral infections in order to increase the efficiency of the pharmaceutical composition provided by this invention, thereby generating a combination therapy.
  • Said additional drugs may be part of the same pharmaceutical composition or, alternatively, may be provided as a separate pharmaceutical composition for administration at the same time (simultaneous administration) as the pharmaceutical composition provided by this invention or at different times (sequential administration) with respect to to the administration of the pharmaceutical composition provided by this invention.
  • the following examples serve to illustrate the invention and should not be considered in a limiting sense thereof.
  • NST0037 was prepared following the methodology described in Hoffman, et al. ⁇ J. Med. Chem., 1986, 29, 849-852) for similar compounds.
  • lovastatin was purified by column chromatography using as eluent a gradient of hexane and ethyl acetate.
  • 0.368g of the derivative obtained previously is dissolved in 2 ml of THF. Next, a solution of 0.16 ml of acetic acid and 2.16 ml of 1 M tetrabutylammonium fluoride is added to the reaction medium. The reaction is stirred at room temperature for 16 hours. The reaction is followed by TLC using dichloromethane-acetone as eluent (6: 1). 75% yield.
  • NST0037 Protection by NST0037 of neuronal death induced by different aggressions: oxidative stress, endoplasmic reticulum stress and apoptosis
  • the test was performed on cells in SK-N-MC human neuroblastoma culture from the "American Type Culture Collection (ATCC)", in all cases strict sterility standards were followed and the manipulation was carried out in booths of Class II biological safety following the European standard EN 12469.
  • the cells were maintained in the following culture medium: "Minimun Essential Méd ium Eagle” (MEM) supplemented with 1 mM sodium pyruvate, 2 mM L-glutamine, non-amino acids 0.1 mM essentials, 0.05 mg / ml gentamicin and 10% fetal bovine serum.
  • MEM Minimum Essential Méd ium Eagle
  • XXO - Xanthine / xanthine oxidase
  • NST0037 at 1, 4, 10, 20, 40 or 100 ⁇ M.
  • the cells were incubated (at 37 0 C and 5% CO 2 ) with these treatments for 22 h, after which reagent WST-1 (Roche) was added.
  • the WST-1 Test is based on the measurement of the metabolic activity.
  • the cellular damage causes the loss of the ability of the cells to obtain the energy necessary to maintain their metabolic functions and cell growth, so that the metabolically active (living) cells reduce the tetrazolium salt to formazan through the succinate system -tetrazolium reductase (from the mitochondhal respiratory chain).
  • the formazan formed can be detected colorimetrically, since it has an absorbance of 440nm.
  • the reading was carried out on a plate reader at 440 nm.
  • the test was carried out on cells in SK-N-MC human neuroblastoma culture from "American Type Culture Collection (ATCC)", in all cases strict sterility standards were followed and manipulation was carried out in biological safety cabins class II following the European standard EN 12469.
  • the cells were maintained in the following culture medium: "Minimun Essential Méd ium Eagle” (MEM) supplemented with 1 mM sodium pyruvate, 2 mM L-glutamine, 0.1 nonessential amino acids mM, gentamicin 0.05 mg / ml and 10% fetal bovine serum.
  • MEM Minimum Essential Méd ium Eagle
  • Tunicamycin is an inhibitor of protein N-glycosylation, which produces the abnormal folding of proteins in the endoplasmic reticulum, with which said proteins accumulate and produce stress that leads to cell death.
  • Tm Tunicamycin
  • the cells were incubated (at 37 0 C and 5% CO 2 ) with these treatments for 22 h, after which reagent WST-1 (Roche) was added.
  • the WST-1 Test is based on the measurement of the metabolic activity.
  • the cellular damage causes the loss of the ability of the cells to obtain the energy necessary to maintain their metabolic functions and cell growth, so that metabolically active (living) cells reduce the salt of tetrazolium to formazan by means of the succinate-tetrazolium system reductase (from the mitochondrial respiratory chain).
  • the formazan formed can be detected colorimetrically, since it has an absorbance of 440nm.
  • the reading was carried out on a plate reader at 440 nm.
  • the cells were maintained in the following culture medium: "Minimun Essential Medium Eagle” (MEM) supplemented with 1 mM sodium pyruvate, 2 mM L-glutamine, 0 nonessential amino acids, 1 mM, gentamicin 0.05 mg / ml and 10% fetal bovine serum.
  • MEM Minimum Essential Medium Eagle
  • Camptothecin which is a Topoisomerase I inhibitor, therefore prevents DNA duplication and triggers cell cycle arrest and apoptosis death.
  • CPT Camptothecin
  • the test was performed on cells in SK-N-MC human neuroblastoma culture from the "American Type Culture Collection (ATCC)", in all cases strict sterility standards were followed and the manipulation was carried out in booths of Class II biological safety following the European standard EN 12469.
  • the cells were maintained in the following culture medium: "Minimun Essential Méd ium Eagle” (MEM) supplemented with 1 mM sodium pyruvate, 2 mM L-glutamine, non-amino acids 0.1 mM essentials, 0.05 mg / ml gentamicin and 10% fetal bovine serum.
  • MEM Minimum Essential Méd ium Eagle
  • Camptotecina medium plus 50 ⁇ M camptothecin.
  • Camptothecin plus Z-VAD-fmk medium plus 50 ⁇ M camptothecin plus 50 ⁇ M Z-VAD-fmk, as a positive inhibition control.
  • Camptothecin plus NST0037 medium plus 50 ⁇ M more camptothecin
  • the cells were previously treated with 40 ⁇ M of NST0037, 100 ⁇ M of mevalonate or both together for 24 h and then treated with 50 ⁇ M camptothecin, the rest of the procedure was similar to the trial without pretreatment.
  • NST0037 is partially inhibited by the addition of mevalonate to the medium, which indicates that the neuroprotective effect of NST0037 is related to the biosynthesis of cholesterol or to any of the precursors of the route.
  • Example 2 Based on the results of Example 2, the inventors decided to find out if the neuroprotective effect of NST0037 demonstrated in human cholinergic neurons was corroborated in a mouse sporadic Alzheimer's disease model by administration of kainate (KA). All animals included during the experimental process were 12-week-old males and of the FVB / NHan strain. The experiments were carried out strictly following the Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). The animals had their respective quarantine period and were treated with the utmost caution to minimize possible contamination during inoculations and manipulations.
  • KA kainate
  • PBS with a daily dose for 2 days on the second day the animals were inoculated with a new dose of PBS and for the next 7 days with a daily dose of PBS.
  • PBS + KA + PBS guideline 6 animals were initially treated with PBS with a daily dose for 2 days, on the second day the animals were inoculated with a dose of 25 mg / kg kainate and for the next 7 days with a daily dose of PBS.
  • PBS + KA + NST0037 guideline 7 animals were initially treated with PBS with a daily dose for 2 days, on the second day the animals were inoculated with a dose of kainate at 25 mg / kg and for the next 7 days with a daily dose of NST0037 at 50 mg / kg.
  • Guideline NST0037 + KA + NST0037 6 animals were initially treated with a daily dose for 2 days with NST0037 a
  • the animals were sacrificed and the brains dissected.
  • the brain samples were processed and included in paraffin.
  • hematoxylin and eosin staining was used in 5 ⁇ m thick sections.
  • NST0037 which indicates its neuroprotective effect.
  • the samples of the NST0037 + PBS + NST0037 group showed a pattern similar to that observed in the animals of the PBS + PBS + PBS group.
  • the excitotoxicity produced by KA induces, within a few days after inoculation in mice, the deterioration of episodic memory, affecting temporal memory and producing a severe deficit in spatial memory. Due to this, the inventors decided to find out if the neuroprotective effect of NST0037 was accompanied by a protection of the memory that deteriorates due to the effect of an excitotoxic substance.
  • PBS + PBS + PBS guideline 4 animals were initially treated with PBS with a daily dose for 2 days, on the second day the animals were inoculated with a new dose of PBS and for the next 3 days with a daily dose of PBS.
  • PBS + KA + PBS guideline 6 animals were initially treated with PBS with a daily dose for 2 days, on the second day the animals were inoculated with a dose of kainate at 25 mg / kg and for the next 3 days with a daily dose of PBS.
  • PBS + KA + NST0037 guideline 7 animals were initially treated with PBS with a daily dose for 2 days, on the second day the animals were inoculated with a dose of kainate at 25 mg / kg and for the next 3 days with a daily dose of NST0037 at 50 mg / kg.
  • Guideline NST0037 + KA + NST0037 6 animals were initially treated with a daily dose for 2 days with NST0037 at 50 mg / kg, on the second day the animals were inoculated with a dose of kainate at 25 mg / kg and during following 3 days with a daily dose of NST0037 at 50 mg / kg.
  • Figure 6 shows the results of the relationship in the time of exploration of the old objects against the recent objects (temporary memory). It was observed that the group with the treatment regimen NST0037 + KA + NST0037 avoided
  • PBS + KA + NST0037 also presented an improvement in the state of temporal memory with respect to the treaties of the PBS + KA + PBS group.
  • the data also showed that the group of mice with the NST0037 + PBS + NST0037 pattern also presented an improvement in the temporal memory with respect to the group
  • Figure 7 shows the results of the relationship in the exploration time of the displaced old object against the old object without displacing
  • NST0037 + KA + NST0037 or NST0037 + PBS + NST0037 showed an object scan ratio that demonstrates that the spatial memory is intact since no differences are observed with respect to the PBS + PBS + PBS group.
  • the mice of the PBS + KA + PBS group presented a serious deterioration of the spatial memory.
  • the PBS + KA + NST0037 treatment group showed an improvement in this type of memory compared to those treated in the PBS + KA + PBS group.
  • PBS + PBS + PBS guideline 4 animals were initially treated with PBS with a daily dose for 2 days, on the second day the animals were inoculated with a new dose of PBS and for the next 3 days with a daily dose of PBS.
  • PBS + KA + PBS guideline 6 animals were initially treated with PBS with a daily dose for 2 days, on the second day the animals were inoculated with a dose of kainate at 25 mg / kg and for the next 3 days with a daily dose of PBS.
  • PBS + KA + NST0037 guideline 7 animals were initially treated with PBS with a daily dose for 2 days, on the second day the animals were inoculated with a dose of kainate at 25 mg / kg and for the next 3 days with a daily dose of NST0037 at 50 mg / kg.
  • Guideline NST0037 + KA + NST0037 6 animals were initially treated with a daily dose for 2 days with NST0037 at 50 mg / kg, on the second day the animals were inoculated with a dose of kainate at 25 mg / kg and during the following 3 days with a daily dose of NST0037 at 50 mg / kg.
  • PBS + KA + NST0037 increases the survival of the animals against those of the group with the PBS + KA + PBS guideline.
  • the inventors decided to find out if the antiepileptic and anticonvulsant effect was confirmed with epilepsy levels and by the severity of the symptoms, observing that the animals of the group with the PBS + KA pattern reached a level of epilepsy 4 in Ia Racine scale, while guideline NST0037 + KA did not produce at any time a level of epilepsy 3 in said scale, indicating that compound NST0037 is antiepileptic and anticonvulsant.
  • guideline NST0037 + KA did not produce at any time a level of epilepsy 3 in said scale, indicating that compound NST0037 is antiepileptic and anticonvulsant.
  • the PBS + KA pattern showed severe spasms and convulsions.
  • the degree of inhibition of the HMGR enzyme by the compound NST0037 was determined, since this enzyme is key in the synthesis of cellular cholesterol and in the physiological regulation of said synthesis.
  • the effect of this compound was compared with that of two known statins, atorvastatin and simvastatin, compounds for which a potent inhibitory effect on HMGR is already described.
  • the HMGR uses NADPH as a reducing agent and as a substrate 3-hydroxy-3- methylglutaryl coenzyme A (HMGCoA), producing mevalonic acid, CoASH and NADP +.
  • HMGCoA 3-hydroxy-3- methylglutaryl coenzyme A
  • the decrease in absorbance at which NADPH absorbs (340 nm) is a direct measure of the catalytic activity of the HMGR and serves to calculate the inhibition percentages of different compounds.
  • the assay was carried out in 96-well plate, with a total reaction volume of 200 ⁇ l.
  • a control Contains all the components of the reaction but lacks a problem compound.
  • Problem compounds NST0037, Atorvastatin and Simvastatin at various concentrations. In all cases the acid form of the compounds was used.
  • the inventors decided to find out if the inhibitory activity of the HMGR enzyme by the compound NST0037 corresponded to a variation of total cholesterol and its fractions in a mouse endogenous hyperlipidemia model.
  • the animals were fasted with blood by ocular puncture. From this blood the plasma was obtained in which the levels of total cholesterol and its fractions were determined prior to the administration of the substances under study. Immediately afterwards, the animals were inoculated intraperitoneally with 50 mg / kg of each of the test compounds. Four animals were treated only with the vehicle and were considered the control group. A second group of five mice received 50 mg / kg of simvastatin. Finally, a third group of five mice received 50 mg / kg of NST0037. After twelve hours of the treatments, blood was drawn back to the fasting animals and the plasma was obtained from that blood.
  • FIG 12 shows the plasma levels of cholesterol at initial time (tO) and twelve hours after the administration of vehicle, simvastatin or NST0037 in the different groups of mice (t12), demonstrating that both compounds have a significant hypocholesterolemic effect.
  • both compounds significantly decreased levels of cholesterol bound to low density lipoproteins (c-LDL) and very low density (c-VLDL), without altering cholesterol levels linked to high lipoproteins density (c-HDL), as shown in Figures 13 to 15.
  • c-LDL low density lipoproteins
  • c-VLDL very low density
  • c-HDL cholesterol levels linked to high lipoproteins density
  • both compounds similarly decreased EC levels without altering the of CL, as shown in Figures 16 and 17.
  • NST0037 shows an effect surprisingly similar to simvastatin, reducing the levels of CT, c-LDL, c-VLDL and CE significantly without altering those of c-HDL or CL.
  • the inventors decided to find out if the compound NST0037 also showed a hypocholesterolemic effect in a model of acute induced hyperlipidemia.
  • mice were fasted with blood by ocular puncture. From this blood the plasma was obtained in which the levels of total cholesterol and its fractions were determined, prior to the administration of the substances under study. Immediately afterwards, the animals were inoculated intraperitoneally with 500 mg / kg of Triton 1339 also known as tyloxapol. At thirty minutes, the animals were inoculated intraperitoneally with 50 mg / kg of each of the test compounds. Seven animals were treated only with the vehicle and were considered the control group. A second group of six mice received 50 mg / kg of simvastatin. Finally, a third group of seven mice received 50 mg / kg of NST0037.
  • Figure 18 shows the number of times that the total cholesterol increases after twenty-four hours of the administration of Triton 1339 followed by the administration of vehicle, simvastatin or NST0037 in the different groups of mice, demonstrating that both problem compounds have a hypocholesterolemic effect, being Statistically significant only in the case of treatment with NST0037.
  • both compounds decreased cholesterol levels linked to low density lipoproteins (c-LDL), said reduction being statistically significant only in the case of NST0037.
  • simvastatin decreased cholesterol levels linked to very low density lipoproteins (c-VLDL), with cholesterol levels bound to high density lipoproteins (c-HDL) not being altered with either compound. in Figures 19 to 21.
  • NST0037 decreased levels of esterified cholesterol (EC), as shown in Figure 22.
  • EC esterified cholesterol
  • CL free cholesterol
  • the fertilized eggs were obtained by natural mating of the zebrafish (Danio rerio, strain AB). A total of 8-10 couples were used for each crossing and a total of 200-250 eggs were generated on average per couple.
  • the eggs were collected immediately after spawning and washed with dilution water (CaCI 2 » 2H 2 O 2 0.29 g / L, MgSO 4 » 7H 2 O 2 0.12 g / L, NaHCO 3 0.065 g / L, KCI 0.006 g / L) adjusting to pH 7.8 ⁇ 0.2, in accordance with EC Regulation No. 440/2008 method C.1 and deposited in a petri dish.
  • the eggs were quickly transferred (a minimum of 50 per condition) to another petri dish with the solutions to be tested for the compounds. Subsequently, only fertilized eggs (10 per experimental condition) were transferred from the petri dishes to the exposure chambers (M24 microtiter plates) by means of pipettes and exposed to the substances to be tested (NST0037 or simvastatin), with dilution water ( controls) or with different concentrations of the treatments. The embryos were incubated without additional aeration, at the appropriate temperature (25 ⁇ 1 0 C) and under a regime of 12 h light / 12 h darkness. Each experiment was performed in triplicate.
  • the treatments carried out followed the following guideline:> 10 control animals, treated with dilution water and with daily replacement during the 9 days of the trial.
  • the inventors decided to find out if the greater biosecurity of compound NST0037 compared to simvastatin was corroborated by analyzing the lethal doses 50 (LD 5 o) over time.
  • the fertilized eggs were obtained by natural mating of the zebrafish (Danio rerio, strain AB). A total of 8-10 couples were used for each crossing and a total of 200-250 eggs were generated on average per couple.
  • the eggs were collected immediately after spawning and washed with dilution water (CaCI 2 » 2H 2 O 2 0.29 g / L, MgSO 4 » 7H 2 O 2 0.12 g / L, NaHCO 3 0.065 g / L, KCI 0.006 g / L) adjusting to pH 7.8 ⁇ 0.2, in accordance with EC Regulation No. 440/2008 method C.1 and deposited in a petri dish. To ensure exposure in the earliest stages of development, the eggs were quickly transferred (a minimum of 50 per condition) to another petri dish with the solutions to be tested for the compounds.
  • the treatments carried out followed the following guideline:> 10 control animals, treated with dilution water and with daily replacement during the 9 days of the trial.
  • LD 50 of both compounds is above the maximum dose evaluated. However, from the third day until the end of the experiment, simvastatin had an LD 50 lower than that of compound NST0037, which indicates its highest toxicity. From day 2 of treatment the
  • the fertilized eggs were obtained by natural mating of the zebrafish (Danio rerio, strain AB). A total of 8-10 couples were used for each crossing and a total of 200-250 eggs were generated on average per couple.
  • the eggs were collected immediately after spawning and washed with dilution water (CaCI 2 » 2H 2 O 2 0.29 g / L, MgSO 4 » 7H 2 O 2 0.12 g / L, NaHCO 3 0.065 g / L, KCI 0.006 g / L) adjusting to pH 7.8 ⁇ 0.2, in accordance with EC Regulation No. 440/2008 method C.1 and deposited in a petri dish.
  • the eggs were quickly transferred (a minimum of 50 per condition) to another petri dish with the solutions to be tested for the compounds. Subsequently, only fertilized eggs (10 per experimental condition) were transferred from the petri dishes to the exposure chambers (M24 microtiter plates) by means of pipettes and exposed to the substances to be tested (NST0037 or simvastatin), with dilution water ( controls) or with different concentrations of the treatments. The embryos were incubated without additional aeration, at the appropriate temperature (25 ⁇ 1 0 C) and under a regime of 12 h light / 12 h darkness. Each experiment was performed in triplicate.
  • the treatments carried out followed the following guideline:> 10 control animals, treated with dilution water and with daily replacement during the 9 days of the trial. > 30 animals treated with compound NST0037 (10 embryos in triplicate) diluted in dilution water and with daily replacement during the 9 days of the test.
  • Intracranial thrombosis it is a clot inside a blood vessel, in this case of any cerebral vessel.
  • Cardiac thrombosis occurs in a cardiac vessel.
  • Cardiac edema is the accumulation of fluid in the intercellular or interstitial tissue space and also in the cavities of the organism. In the case of the heart, accumulation of fluid occurs in the pericardial bag.
  • Malformation it is a notable difference in the shape of the body or body part, or body organ (internal or external) compared to the average shape of the part in question. Normally the malformations observed in our study are from the yolk sac
  • the fertilized eggs were obtained by natural mating of the zebrafish (Danio rerio, strain AB). A total of 8-10 couples were used for each crossing and a total of 200-250 eggs were generated on average per couple.
  • the eggs were collected immediately after spawning and washed with dilution water (CaCI 2 ⁇ H 2 O 2 0.29 g / L, MgSOWH 2 O 2 0.12 g / L, NaHCO 3 0.065 g / L, KCI 0.006 g / L) adjusting to pH 7.8 ⁇ 0.2, in accordance with EC Regulation No. 440/2008 method C.1 and deposited in a petri dish.
  • the eggs were quickly transferred (a minimum of 50 per condition) to another petri dish with the solutions to be tested for the compounds. Subsequently, only fertilized eggs (10 per experimental condition) were transferred from the petri dishes to the exposure chambers (M24 microtiter plates) by means of pipettes and exposed to the substances to be tested (NST0037 or simvastatin), with dilution water ( controls) or with different concentrations of the treatments.
  • the embryos were incubated without additional aeration, at the appropriate temperature (25 ⁇ 1 0 C) and under a regime of 12 h light / 12 h darkness. Each experiment was performed in triplicate. The studies were carried out in a total of 9 days post-fertilization, where the frequency of treatment renewal was carried out every day, thus carrying out a semi-static test. The treatments carried out followed the following guidelines:
  • the inventors decided to find out if the greater biosecurity of compound NST0037 compared to simvastatin was corroborated by analyzing cardiotoxicity after treatment with the different compounds and at various doses.
  • the study of this parameter (cardiotoxicity) not only determines the heart rate of the animals but also allows us to observe alterations in the heartbeat (tachycardia, bradycardia, etc.) or abnormalities in the development of the heart (pericarditis, atrophy, hypertrophy , etc.).
  • the fertilized eggs were obtained by natural mating of the zebrafish (Danio rerio, strain AB). A total of 8-10 couples were used for each crossing and a total of 200-250 eggs were generated on average per couple.
  • the eggs were collected immediately after spawning and washed with dilution water (CaCl 2 ⁇ H 2 O 2 0.29 g / L, MgSOWH 2 O 2 0.12 g / L, NaHCO 3 0.065 g / L, KCI 0.006 g / L) adjusting to pH 7.8 ⁇ 0.2, in accordance with EC Regulation No. 440/2008 method C.1 and deposited on a peth plate.
  • the eggs were quickly transferred (a minimum of 50 per condition) to another peth plate with the solutions to be tested for the compounds. Subsequently, only fertilized eggs (10 per experimental condition) were transferred from the peth plates to the exposure chambers (M24 microtiter plates) by means of pipettes and exposed to the substances to be tested (NST0037 or simvastatin), with dilution water ( controls) or with different concentrations of the treatments. The embryos were incubated without additional aeration, at the appropriate temperature (25 ⁇ 1 0 C) and under a regime of 12 h light / 12 h darkness. Each experiment was performed in triplicate.
  • NST0037 The fungicidal activity of NST0037 was analyzed by bioassay against Candida albicans. For this, solutions of the ⁇ -hydroxy acid form of NST0037, lovastatin, atorvastatin and simvastatin were prepared. The concentrations tested were as follows: 2, 1 .5, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.06, 0.025 and 0.01 mM. MA medium plates were prepared (containing per liter: 20 g of malt extract, 20 g of glucose, 1 g of mycopeptone and 10 g of agar) previously inoculated with a culture of Candida albicans CECT 1002.
  • the test was performed on cells in SK-N-MC human neuroblastoma culture from the "American Type Culture Collection (ATCC)", in all cases strict sterility standards were followed and the manipulation was carried out in booths of Class II biological safety following the European standard EN 12469.
  • the cells were maintained in the following culture medium: "Minimun Essential Medium Eagle” (MEM) supplemented with 1 mM sodium pyruvate, 2 mM L-glutamine, 0 nonessential amino acids, 1 mM, gentamicin 0.05 mg / ml and 10% fetal bovine serum.
  • MEM Minimum Essential Medium Eagle
  • the RT-PCR was carried out in two steps, first, the m RNA was transferred to cDNA using the RNA to cDNA kit (Applied Biosystem) and then the gene expression was analyzed by TaqMan probes using the Hs00207388_m 1 val seda probes for seladin- 1 / DHCR24 and Hs99999901_s1 for 18S (used to normalize the results) in the 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystem). Two independent trials were performed in triplicate. The relative amount of the gene expression was determined using the ⁇ Ct method with the SDS v2.1.1 software (Applied Biosystem); The 18S expression was used to normalize the measurement.
  • the test was carried out on cells in SK-N-MC human neuroblastoma culture from "American Type Culture Collection (ATCC)", in all cases strict sterility standards were followed and manipulation was carried out in biological safety cabins class II following the European standard EN 12469.
  • the cells were maintained in the following culture medium: "Minimun Essential Méd ium Eagle” (MEM) supplemented with 1 mM sodium pyruvate, 2 mM L-glutamine, 0.1 nonessential amino acids mM, gentamicin 0.05 mg / ml and 10% fetal bovine serum.
  • MEM Minimum Essential Méd ium Eagle
  • OA protein phosphatase 1
  • PP1 protein phosphatase 1
  • OA - Okadaic acid
  • - OA plus NST0037 medium plus OA (20 nM) plus NST0037 at 1, 4, 10, 40 or 100 ⁇ M.
  • the cells were incubated (at 37 0 C and 5% CO 2 ) with these treatments for 22 h, after which reagent WST-1 (Roche) was added.
  • the WST-1 Test is based on the measurement of the metabolic activity.
  • the cellular damage causes the loss of the ability of the cells to obtain the energy necessary to maintain their metabolic functions and cell growth, so that metabolically active (living) cells reduce the salt of tetrazolium to formazan by means of the succinate-tetrazolium system reductase (from the mitochondrial respiratory chain).
  • the formazan formed can be detected colorimetrically, since it has an absorbance of 440nm.
  • the reading was carried out on a plate reader at 440 nm.
  • the test was performed on cells in SK-N-MC human neuroblastoma culture from the "American Type Culture Collection (ATCC)", in all cases strict sterility standards were followed and the manipulation was carried out in booths of Class II biological safety following the European standard EN 12469.
  • the cells were maintained in the following culture medium: "Minimun Essential Méd ium Eagle” (MEM) supplemented with 1 mM sodium pyruvate, 2 mM L-glutamine, non-amino acids 0.1 mM essentials, 0.05 mg / ml gentamicin and 10% fetal bovine serum.
  • MEM Minimum Essential Méd ium Eagle
  • the inhibition produced by compound NST0037 of cell death caused by treatment with 3-Nitropropionic acid (3-NP) was analyzed.
  • 3-NP is an irreversible inhibitor of the enzyme succinate dehydrogenase that in animal models produces oxidative stress and apoptotic cell death in the striatum, which mimics neurochemical and anatomical changes associated with Huntington's disease (HD).
  • HD Huntington's disease
  • Control culture medium (medium) - 3-Nitropropionic (3-NP): medium plus 3-NP 30 ⁇ M, which causes the death of 50% of the cells.
  • NST0037 medium plus 3-NP (30 ⁇ M) plus NST0037 at 0.1, 1, 4, 10, 40, 100 or 200 ⁇ M.
  • the cells were incubated (at 37 0 C and 5% CO2) with these treatments for 22 h, after which reagent WST-1 (Roche) was added.
  • the WST-1 test is based on the measurement of metabolic activity.
  • the cellular damage causes the loss of the ability of the cells to obtain the energy necessary to maintain their metabolic functions and cell growth, so that metabolically active (living) cells reduce the salt of tetrazolium to formazan by means of the succinate system.
  • tetrazolium reductase from the mitochondrial respiratory chain.
  • the formazan formed can be detected colorimetrically, since it has an absorbance of 440nm. At 2 hours after the reagent was added, the reading was carried out on a plate reader at 440 nm.
  • the test was carried out on cells in SK-N-MC human neuroblastoma culture from "American Type Culture Collection (ATCC)", in all cases strict sterility standards were followed and manipulation was carried out in biological safety cabins Class II following the European standard EN 12469.
  • the cells were maintained in the following culture medium: "Minimun Essential Medium Eagle” (MEM) supplemented with 1 mM sodium pyruvate, 2 mM L-glutamine, 0.1 mM non-essential amino acid , gentamicin 0.05 mg / ml and 10% fetal bovine serum.
  • MEM Minimum Essential Medium Eagle
  • CPT camptothecin
  • Apoptosis was determined by means of the measurement of the activation of effector caspases, caspase 3 or caspase 7, for which an active caspase 3/7 fluorimetric detection kit was used (Apo-ONE®
  • Control culture medium (medium) Camptotecina (CPT): medium with CPT at 50 ⁇ M
  • CPT Camptotecina
  • CPT medium with CPT at 50 ⁇ M
  • different pretreatments with NST0037 (10 or 40 ⁇ M) and / or mevalonate (MEV; at 100 ⁇ M) or Z-VAD-fmk (50 ⁇ M).
  • Figure 34 shows the percentage of activation of caspase 3/7 with respect to the control cells of the different treatments.
  • Caspase 3/7 inhibition was observed with respect to camptothecin of 26 and 33% at 10 and 40 ⁇ M of NST0037, respectively, which demonstrates a functional anti-apoptotic effect of this compound.
  • the mevalonate reversed this inhibition, so it is shown that the effect of NST0037 on caspase 3/7 is related to the biosynthesis of cholesterol or any of the precursors of the biosynthesis pathway of this.
  • Z-VAD-fmk as a caspase inhibitor, totally inhibited the activation of caspase 3/7.
  • the compound NST0037 reduces the production of the ⁇ -amyloid peptide in a cellular model.
  • the test was carried out on cells in culture of human neuroblastoma SK-N-MC from "American Type Culture Collection (ATCC)" stably transfected with a construction that carries the APP gene (beta amyloid precursor protein, Gen ID: 351) in isoform 695, which is the most frequent variant expressed in neurons, with which overexpression of the APP protein is achieved. In all cases, strict sterility standards were followed and the manipulation was carried out in class II biological safety cabins that follow the European standard EN 12469.
  • ATCC American Type Culture Collection
  • the cells were kept in the following culture medium: "Minimun Essential Medium Eagle” ( MEM) supplemented with 1 mM sodium pyruvate, 2 mM L-glutamine, 0.1 mM non-essential amino acids, 0.05 mg / ml gentamicin and 10% fetal bovine serum, the expression of APP is selected by the addition of the antibiotic hygromycin B at 0.16 mg / mL.
  • MEM Minimum Essential Medium Eagle
  • These cells in pass not exceeding 15, were seeded on 6 well plates treated for adherent cells with a cell concentration of 8x10 5 cells / well, for each test condition 2 wells of the plate were seeded. After 24 h of incubation of the cells at 37 0 C and 5% CO2, cell treatments were carried out with 2 ml of total volume for the following conditions:
  • NST0037 medium plus NST0037 at 1, 4, 10 or 40 ⁇ M.
  • the cells were incubated (at 37 0 C and 5% CO 2 ) with these treatments for 48 h, then collecting 500 ⁇ l of conditioned medium to perform the measurements. From the conditioned medium the cell debris was removed by centrifugation at 300xg and then protease inhibitors (Mini EDTA-free, Roche) were added. The two most frequent species of A ⁇ were measured: 1-40 and 1-42. For A ⁇ (1-42) it was necessary to concentrate the medium 5 times to perform the measurements, using the Amicon Ultra (Millipore) filtration system.
  • the amount of A ⁇ (1-40) and A ⁇ (1-42) of the conditioned medium for each treatment was analyzed by ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay), using the kit “beta amyloid 40 ELISA” and “beta amyloid 42 ELISA "(Biosource), following the manufacturer's recommendations. The results were quantified using a curve of increasing concentrations with synthetic peptides.
  • the baseline values of A ⁇ secreted in these cells are 1340 + 141 pg / ml for A ⁇ (1-40) and of 20 + 3 pg / mL for A ⁇ (1-42).
  • NST0037 reduces the secretion of A ⁇ in human neuroblastoma cells that overexpress APP.
  • a ⁇ production has been linked to cell death both in vitro and in vitro. alive and, in addition, it is associated with the senile plaques that are found in Alzheimer's patients.
  • EXAMPLE 14 Effect of mevalonate on the protection by NST0037 of neuronal death induced by oxidative stress.
  • the test was performed on cells in SK-N-MC human neuroblastoma culture from the "American Type Culture Collection (ATCC)", in all cases strict sterility standards were followed and the manipulation was carried out in booths of Class II biological safety following the European standard EN 12469.
  • the cells were maintained in the following culture medium: "Minimun Essential Medium Eagle” (MEM) supplemented with 1 mM sodium pyruvate, 2 mM L-glutamine, 0.1 mM non-essential amino acids , gentamicin 0.05 mg / ml and 10% fetal bovine serum.
  • MEM Minimum Essential Medium Eagle
  • XXO - Xanthine / xanthine oxidase
  • - XXO plus NST0037 medium plus XXO (10 ⁇ M / 60 mU / mL) plus NST0037 at 40 ⁇ M.
  • - XXO plus mevalonate medium plus XXO (10 ⁇ M / 60 mU / mL) plus mevalonate at 10, 40 or 100 ⁇ M.
  • the inventors decided to find out if the neuroprotective effect of NST0037 in the hippocampus demonstrated in a model of sporadic Alzheimer's disease in mice by administration of kainate (KA) was accompanied by the protection of another sign of neuronal damage as is the neuritic dystrophy.
  • KA kainate
  • NST0037 + KA + NST0037 7 animals were initially treated with a daily dose for 2 days with NST0037 at 50 mg / kg, on the second day the animals were inoculated with a dose of kainate at 25 mg / kg and during following 7 days with a daily dose of NST0037 at 50 mg / kg.
  • PBS + KA + PBS guideline 7 animals were initially treated with PBS with a daily dose for 2 days, on the second day the animals were inoculated with a dose of 25 mg / kg kainate and for the next 7 days with a daily dose of PBS.
  • PBS + KA + NST0037 guideline 7 animals were initially treated with PBS with a daily dose for 2 days, on the second day the animals were inoculated with a dose of 25 mg / kg kainate and for the next 7 days with a daily dose of NST0037 at 50 mg / kg. Once the 7-day treatment period was over, the animals were sacrificed and the brains dissected. The brain samples were processed and included in paraffin. For the analysis of the neuritic dystrophy in the hippocampus, the clear field immunohistochemistry was performed against the protein associated with microtubules type 2 (MAP2) in coronal cuts of 5 ⁇ m thick.
  • MAP2 microtubules type 2
  • the PBS + KA + PBS administration regimen produces a decrease in MAP2 mapping especially in areas of CA1, CA3 and dentate gyrus of the hippocampus, with respect to the PBS + PBS + PBS administration schedule that shows a uniform tidal
  • the samples of the NST0037 + KA + NST0037 group showed a staining pattern equal to the controls (PBS + PBS + PBS group) with no evidence of neuritic dystrophy in these regions of the hippocampus.
  • the treatment with NST0037 after pretreatment with PBS and the inoculation of KA clearly decreases the loss of MAP2 dizziness in the hippocampus.
  • the treatment with NST0037 both before and after the inoculation of KA, protects from the neuritic dystrophy produced by it in the hippocampus.
  • NST0037 + KA + NST0037 7 animals were initially treated with a daily dose for 2 days with NST0037 at 50 mg / kg, on the second day the animals were inoculated with a dose of kainate at 25 mg / kg and during following 7 days with a daily dose of NST0037 at 50 mg / kg.
  • PBS + KA + PBS guideline 7 animals were initially treated with PBS with a daily dose for 2 days, on the second day the animals were inoculated with a dose of kainate at 25 mg / kg and for the next 7 days with a daily dose of PBS.
  • PBS + KA + NST0037 guideline 7 animals were initially treated with PBS with a daily dose for 2 days, on the second day the animals were inoculated with a dose of kainate at 25 mg / kg and for the next 7 days with a daily dose of NST0037 at 50 mg / kg.
  • HNE 4-hydroxynonenal
  • the PBS + KA + PBS administration pattern produces an increase in the HNE signal in the CA3 region of the hippocampus with respect to the PBS + PBS + PBS administration pattern that does not show this lipid peroxidation mapping.
  • the samples of the NST0037 + KA + NST0037 group showed a staining pattern equal to the controls (PBS + PBS + PBS group) without HNE-labeled neurons in these regions of the hippocampus.
  • treatment with NST0037 after pretreatment with PBS and the inoculation of KA reduces the number of neurons with HNE marking in the hippocampus.
  • treatment with NST0037, both before and after the inoculation of KA protects against oxidative damage induced by it in the hippocampus.
  • the inventors decided to find out if the antioxidant effect of NST0037 in the hippocampus demonstrated in a model of sporadic Alzheimer's disease in mice by administration of kainate (KA) was accompanied by protection against death by apoptosis, mechanism that is associated with the disease.
  • KA kainate
  • NST0037 + KA + NST0037 7 animals were initially treated with a daily dose for 2 days with NST0037 at 50 mg / kg, on the second day the animals were inoculated with a dose of kainate at 25 mg / kg and during following 7 days with a daily dose of NST0037 at 50 mg / kg.
  • PBS + KA + PBS guideline 7 animals were initially treated with PBS with a daily dose for 2 days, on the second day the animals were inoculated with a dose of kainate at 25 mg / kg and for the next 7 days with a daily dose of PBS.
  • PBS + KA + NST0037 guideline 7 animals were initially treated with PBS with a daily dose for 2 days, on the second day the animals were inoculated with a dose of 25 mg / kg kainate and for the next 7 days with a daily dose of NST0037 at 50 mg / kg.
  • the PBS + KA + PBS administration regimen produces neuronal death by apoptosis in the hippocampus and especially in the CA1, CA3 ( Figure 38) and dentate gyrus regions.
  • the samples of the NST0037 + KA + NST0037 group did not show positive neurons for T.U.N.E.L. showing a pattern equal to the controls (group PBS + PBS + PBS).
  • treatment with NST0037 after pretreatment with PBS and inoculation of KA reduces the number of neurons in apoptosis to a few isolated cells in
  • the CA3 region of the hippocampus The CA3 region of the hippocampus.
  • the inventors decided to find out if the antioxidant and antiapoptotic effect shown by the NST0037 in the hippocampus demonstrated in a model of sporadic Alzheimer's disease in mice by administration of kainate (KA) was accompanied by Ia reduction of reactive astrogliosis, which is another histopathological footprint that is detected in the brains of patients with Alzheimer's disease.
  • KA kainate
  • NST0037 + KA + NST0037 7 animals were initially treated with a daily dose for 2 days with NST0037 at 50 mg / kg, on the second day the animals were inoculated with a dose of kainate at 25 mg / kg and during following 7 days with a daily dose of NST0037 at 50 mg / kg.
  • PBS + KA + PBS guideline 7 animals were initially treated with PBS with a daily dose for 2 days, on the second day the animals were inoculated with a dose of kainate at 25 mg / kg and for the next 7 days with a daily dose of PBS.
  • PBS + KA + NST0037 guideline 7 animals were initially treated with PBS with a daily dose for 2 days, on the second day the animals were inoculated with a dose of 25 mg / kg kainate and for the next 7 days with a daily dose of NST0037 at 50 mg / kg.
  • the animals were sacrificed and the brains dissected.
  • the brain samples were processed and included in paraffin.
  • the astrogliosis analysis The reactive was carried out by means of the clear-field immunohistochemistry against the glial acid fibrillary protein (GFAP) in coronal cuts 5 ⁇ m thick, which is present in the astrocytes.
  • GFAP glial acid fibrillary protein
  • the PBS + KA + PBS administration regimen produces a significant increase in the activation and propagation of astrocytes in the hippocampal neuropil ( Figure 38). On the contrary, the group's samples
  • NST0037 + KA + NST0037 presented an astrocytic pattern very similar to that of the controls (PBS + PBS + PBS group). Surprisingly, we also observe that the treatment with NST0037 after pretreatment with PBS and the inoculation of KA reduces the number of astrocytes and the intensity of the GFAP marking in the hippocampus.
  • the treatment with NST0037 both before and after the inoculation of KA, protects against oxidative damage, apoptosis and prevents reactive astrogliosis induced by it in the hippocampus region.
  • NST0037 Protection by NST0037 of clinical symptoms, locomotor deficits, neurodeqeneration and neuronal death caused by a parkinsonian neuortoxin administered in a manner based on the results of neuroprotection demonstrated by compound NST0037 in a sporadic Alzheimer's disease model
  • the researchers decided to evaluate the neuroprotective capacity of the compound in a model of Parkinson's disease based on the death of dopaminergic neurons induced by a neurotoxic substance such as 1-methyl-4-phenyl-1, 2,3,6 -tetrahydropyridine (MPTP).
  • MPTP 1-methyl-4-phenyl-1, 2,3,6 -tetrahydropyridine
  • MPTP in mouse induces a massive death of dopaminergic neurons of
  • the nigra substance which reduces the concentration of dopamine in this region and in others such as the striatum that are closely linked to the locomotive activity in humans. Due to these phenomena, this model has been widely used for the study of Parkinson's disease since it reproduces one of the central events in said disease such as motor impairment.
  • the results of the analysis of the effect of NST0037 are presented against neurodegeneration and the symptoms that MPTP induces in acute administration.
  • PBS + PBS + PBS guideline 10 animals were initially treated with PBS with a daily dose for 2 days per route subcutaneous (sc), on the second day the animals were inoculated with 4 doses of PBS, at intervals of 2 hours intraperitoneally (ip). During the next 7 days they were administered a daily dose of PBS by s.c.
  • PBS + MPTP + PBS guideline 10 animals were initially treated with a daily dose for 2 days of PBS sc, on the second day the animals were inoculated with 4 doses of MPTP at 20 mg / kg, at intervals of 2 hours via ip During the next 7 days they were administered a daily dose of PBS by s.c.
  • the PBS + MPTP + PBS administration regimen produces a statistically significant increase (p ⁇ 0.05) in the mortality in mice.
  • the treatment with NST0037 promotes the survival of the animals after the acute administration of MPTP since no significant differences were observed between the NST0037 + MPTP + NST0037 group and the PBS + PBS + PBS group (p> 0.05). 16.2.
  • the PBS + MPTP + PBS administration regimen produces a statistically significant decrease in motor resistance in mice from baseline until 7 days after the acute administration of MPTP (p ⁇ 0.05).
  • the treatment with NST0037 prevents the motor deterioration of the animals keeping the resistance of the mice at the level they showed before the administration of the MPTP (p> 0.05), a pattern that is equal to that of the mice not injected with MPTP and treated with PBS (p> 0.05).
  • the treatment with NST0037 protects against the loss of resistance induced by the acute administration of MPTP.
  • PBS + PBS + PBS guideline 10 animals were initially treated with PBS with a daily dose for 2 days per route subcutaneous (sc), on the second day the animals were inoculated with 4 doses of PBS, at intervals of 2 hours intraperitoneally (ip) - During the next 7 days they were administered a daily dose of PBS via sc ii) PBS + MPTP + PBS guideline: 10 animals were initially treated with a daily dose for 2 days of PBS sc, on the second day the animals were inoculated with 4 doses of MPTP at 20 mg / kg, at intervals of 2 hours via ip During the next 7 days they were administered a daily dose of PBS by s.c.
  • Figure 41 shows the ratio between the force shown by the animals at the end of the test with respect to the baseline state.
  • the PBS + MPTP + PBS administration regimen produces a statistically significant decrease in the force that the mice exert when gripping with the front legs from their basal state until 7 days after Ia acute administration of MPTP (p ⁇ 0.05).
  • treatment with NST0037 prevents the loss of strength induced by the MPTP and after 7 days of treatment the mice of the NST0037 + MPTP + NST0037 group show equal levels of strength to those before the administration of the MPTP (p> 0.05) , a pattern that is very similar to that of mice not injected with MPTP and treated with PBS (p> 0.05).
  • the treatment with NST0037 protects against the loss of resistance and strength induced by the acute administration of MPTP.
  • the inventors wanted to determine if the protection that the compound NST0037 showed against the deterioration of the psychomotor state produced by the MPTP, was accompanied by neurodegeneration in regions of the brain involved in the locomotive activity, and related to the disease Parkinson's as are the substance nigra and striatum.
  • FJB Fluoro Jade B
  • Figure 42 shows a representative photograph of each group and in both areas under study.
  • the PBS + MPTP + PBS administration regimen produces a clear increase in FJB positive cells both in the nigra substance and in the striatum with respect to the samples of the PBS + PBS + PBS group.
  • the samples from the NST0037 + MPTP + NST0037 group showed a number of degenerating and FJB positive cells significantly lower than those of the PBS + MPTP + PBS group.
  • the treatment with NST0037 protects against psychomotor deterioration and neurodegeneration, induced by the acute administration of MPTP, in the dopaminergic neurons of the nigra substance, as well as the nerve endings that innervate the striatum. 16.4. Protective effect of NST0037 against the loss of dopaminergic neurons due to the acute administration of a neurotoxic substance
  • the inventors wanted to determine if the protection shown by the compound NST0037 against the neurodegeneration produced by the MPTP, was accompanied by the protection of dopaminergic neurons in regions of the brain deteriorated in Parkinson's disease such as the substance Nigra and the striatum.
  • PBS + MPTP + PBS guideline 10 animals were initially treated with a daily dose for 2 days of PBS sc, on the second day the animals were inoculated with 4 doses of MPTP at 20 mg / kg, at intervals of 2 hours via ip During the next 7 days they were administered a daily dose of PBS by s.c.
  • the samples of the NST0037 + MPTP + NST0037 group presented a greater number of TH-positive cells in the nigra substance, as well as a greater intensity of striated dizziness than those of the PBS + MPTP + PBS group.
  • the treatment with NST0037 protects from the psychomotor deterioration of mice, in addition to neurodegeneration and neuronal death induced by the acute administration of MPTP, in the nigra and striatum.
  • EXAMPLE 17 Protection by NST0037 of locomotor deficits, from neuronal death and from oxidative damage caused by a parkinsonian neurotoxin administered subchronously
  • Example 16 Due to the results obtained and presented in Example 16, the inventors decided to analyze the effect of NST0037 on clinical symptoms and on the neuropathology induced in the substance nigra by the subchronic administration of MPTP in mice. 17.1. Protective effect of NST0037 against the decline in motor resistance caused by the subchronic administration of a neurotoxic substance that induces the death of dopaminergic neurons
  • PBS + MPTP + PBS guideline 10 animals were initially treated with a dose daily for 2 days of PBS, from the second day the animals were inoculated with 1 daily dose of MPTP at 30 mg / kg for 5 days, at intervals of 2 hours by ip route During the next 21 days they were administered 3 weekly doses of PBS.
  • NST0037 + MPTP + NST0037 10 animals were initially treated with a daily dose for 2 days of NST0037 at 50 mg / kg, from the second day the animals were inoculated with 1 daily dose of MPTP at 30 mg / kg for 5 days, at 2-hour intervals via ip During the next 21 days they were given 3 weekly doses of NST0037 at 50 mg / kg.
  • the PBS + MPTP + PBS administration regimen produces a statistically significant decrease in the motor resistance in the mice from their baseline state after 14 days after the subchronic administration of the MPTP (p ⁇ 0.05).
  • the treatment with NST0037 prevents the motor deterioration of the animals keeping the resistance of the mice at the level they showed before the administration of the MPTP (p> 0.05).
  • the treatment with NST0037 protects against the loss of resistance induced by the sub-chronic administration of MPTP.
  • PBS + MPTP + PBS guideline 10 animals were initially treated with a dose daily for 2 days of PBS, from the second day the animals were inoculated with 1 daily dose of MPTP at 30 mg / kg for 5 days, at 2-hour intervals via ip During the next 21 days they were administered 3 weekly doses of PBS.
  • Guideline NST0037 + MPTP + NST0037 10 animals were initially treated with a daily dose for 2 days of NST0037 at 50 mg / kg, from the second day the animals were inoculated with 1 daily dose of
  • MPTP at 30 mg / kg for 5 days, at intervals of 2 hours via i.p. During the next 21 days they were administered 3 weekly doses of NST0037 at 50 mg / kg.
  • the PBS + MPTP + PBS administration regimen produces an evident loss of dopaminergic neurons since we observe a clear absence of TH tightening in some regions of the nigra substance.
  • the samples of the NST0037 + MPTP + NST0037 group presented a greater number of TH-positive cells in the same region of the nigra substance.
  • the treatment with NST0037 protects from the psychomotor deterioration of the mice, in addition to the neuronal death induced in the substance nigra by the subchronic administration of MPTP.
  • the neurodegeneration produced by the MPTP in the nigra substance was accompanied by the reduction of another histopathological trace of neuronal damage such as oxidative damage.
  • All animals included during the experimental process were 12-week-old males and of the CD1 strain. The experiments were carried out strictly following the Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). The animals had their respective quarantine period and were treated with the utmost caution to minimize possible contamination during inoculations and manipulations.
  • PBS + MPTP + PBS guideline 10 animals were initially treated with a dose daily for 2 days of PBS, from the second day the animals were inoculated with 1 daily dose of MPTP at 30 mg / kg for 5 days, at intervals of 2 hours via ip During the next 21 days they were administered 3 weekly doses of PBS.
  • NST0037 + MPTP + NST0037 10 animals were initially treated with a daily dose for 2 days of NST0037 at 50 mg / kg, from the second day the animals were inoculated with 1 daily dose of MPTP at 30 mg / kg for 5 days, at intervals of 2 hours via ip During the next 21 days they were administered 3 weekly doses of NST0037 at 50 mg / kg.
  • the PBS + MPTP + PBS administration pattern induces the presence of HNE dizziness in numerous neurons of the nigra substance.
  • the samples from the NST0037 + MPTP + NST0037 group show a discrete number of isolated neurons with HNE-positive marking in the nigra substance.
  • the treatment with NST0037 protects from the psychomotor deterioration of the mice, in addition to the neuronal death and the oxidative damage caused by lipid peroxidation induced in the nigra substance by the sub-chronic administration of MPTP.
  • the purpose of the test was to predict whether the compound NST0037, in comparison with simvastatin and atorvastatin, in its active forms, were able to cross the blood-brain barrier (BHE) for which, said barrier was mimicked in an in vitro system that allowed Ia evaluation of the compound without the use of cells.
  • BHE blood-brain barrier
  • PAMPA Parallel Artificial Membrane Permeation Assay
  • lipid phosphol composition very similar to that which constitutes the barrier, and which is called PBL (Porcine Polar Brain Lipid).
  • Verapamil, theophylline and atorvastatin were prepared at 10 mM in DMSO, while NST0037 and simvastatin were prepared in water and activated with 0.1 N NaOH at 4 0 C for 12 h.
  • This plate was considered the acceptor plate and was placed in the upper part of the sandwich.
  • 300 ⁇ l of the compounds were added at 100 ⁇ M and in triplicate.
  • a blank was included that included only 1% DMSO in the phosphate buffer used.
  • This plate was called a donor plate.
  • the acceptor plate was carefully placed on the donor plate forming the sandwich system.
  • the compounds under study disseminated from the wells of the donor plate to the corresponding wells of the acceptor plate during 18h in which the system remained intact.
  • the remaining compound prepared was kept in the same conditions of humidity, temperature and darkness as the sandwich system constituted by the plates.
  • the theoretical calculation of the lipophilicity of a compound can be obtained by calculating the logarithm of the octanol / water partition coefficient, which is given by cLogP.
  • cLogP was theoretically calculated using the CLOGP (OSIRIS Property Explorer) program by introducing chemical structures into the software. The n for each compound is indicated in the table together with the numerical results of the mean ⁇ SD of the values obtained in the test.
  • both simvastatin and NST0037 had a very similar BHE step index.
  • These BHE step data are confirmed by the range of lipophilicity, showing by both compounds, and which have a very similar cLogP.
  • atorvastatin despite presenting a high cLogP, barely crosses BHE, doing so in the same range as the negative control does, theophylline.
  • the objective of the trial was to determine to what extent the compound NST0037 compared to simvastatin, was able to modify the levels of total cholesterol in cell lines of neuronal and hepatic origin.
  • the compounds were activated with NaOH until complete opening of the lactone form.
  • Hep G2 line human hepatocarcinoma
  • SK-N-MC line human neuroblastoma
  • the quantification of total cholesterol was carried out by enzymatic and fluorometric techniques. 25 ⁇ L of each lysate were transferred to a 96-well plate along with a standard cholesterol curve that ranged from 10 ⁇ g / mL to 0.08 ⁇ g / mL. On the samples, 75 ⁇ L of the reactive mixture prepared based on 0.05 M MES (pH 6.5) containing cholesterol oxidase (0.5 U / mL), cholesterol esterase (0.8 U / mL), radish peroxidase (4 U / mL) were added and ampliflu network (20 ⁇ g / mL) and incubated 15 minutes at 37 0 C. The fluorescence intensity was determined at 530 nm excitation and 580 nm emission by means of a fluorimeter. The results were normalized by protein Ia which was determined by the BCA technique.
  • Figure 47 shows how the NST0037 had a hypocholesterolemic effect in both cell types, although it was in the neuronal cells where cholesterol reductions were more drastic.
  • NST0037 proved to be more potent than simvastatin, while in S KN-MC, cholesterol reductions with both compounds were similar.
  • Plasma was obtained from this blood where the levels of total cholesterol (CT), free cholesterol (CL), cholesterol (CE), c-HDL, c-LDL, c-VLDL and apoB100 were evaluated by enzymatic and spectrophotometric techniques. To check if the effect at the level of lipids involved an alteration of oxidative stress, the redox state was also evaluated in the plasmas obtained by means of the TEAC technique ("Trolox Antioxidant Capacity Assay").
  • treatment with NST0037 for 28 days by oral administration to mice with congenital hyperlipidemia causes a decrease in the levels of total, esterified, free cholesterol of all lipoprotein fractions associated with cholesterol, ApoB levels and the state redox of animals.
  • Plasma was obtained from said blood where the levels of total cholesterol, free cholesterol (CL), cholesterol (EC), c-HDL, c-LDL and, c-VLDL were evaluated by enzymatic and spectrophotometric techniques.
  • CL free cholesterol
  • EC cholesterol
  • c-HDL c-LDL
  • c-LDL c-LDL
  • c-VLDL c-VLDL
  • treatment with NST0037 for 3 months by oral administration to mice with congenital hyperlipidemia causes a decrease in levels of total, esterified, free cholesterol, as well as a decrease in c-LDL levels and an increase in c-HDL , which demonstrates its cardioprotective power.
  • control group 7
  • simvastatin group 7
  • group NST0037 7
  • control group 7
  • simvastatin group 7
  • group NST0037 7
  • the rats were administered orally and at the same time (15.00 to 18.0Oh) for 7 consecutive days 30 mg / kg of NST0021 or NST0037, using in both cases as a 0.5% carboxymethyl cellulose vehicle in water.
  • the control group received this same vehicle.
  • Plasma was obtained from said blood where the levels of total cholesterol, c-HDL, c-LDL, c-VLDL, and triglycerides (TG) were evaluated by enzymatic and spectrophotometric techniques.
  • TG triglycerides
  • the redox state was also evaluated in the plasmas obtained by means of the TEAC technique ("Trolox Antioxidant Capacity Assay"). This technique determines the antioxidant capacity in vitro giving an idea of the redox state of the sample analyzed by means of the absorbance capacity by electron transfer.
  • Example 9 Based on the results presented in Example 9 on the induction of the seladin-1 / DHCR24 gene in human neural lines, the researchers decided to analyze whether the NST0037 modulated said gene in brains of mice treated with this compound.
  • a control group received only the vehicle, which consisted of 0.25% carboxymethylcellulose in physiological saline. 4h after oral administrations, the animals were sacrificed under gaseous anesthesia with isofluorane and the brains, previously perfused with PBS, were extracted and immediately after frozen in liquid nitrogen.
  • RNA of the brain was extracted using the High Puré kit RNA Isolation (Roche) and the quantity and quality of RNA were analyzed by spectrophotometry (Infinite 200 with NanoQuant, Tecan) and visualization of the 18S and 28S bands by electrophoresis.
  • the RT-PCR was carried out in two steps, first the mRNA was transferred to cDNA using the RNA to cDNA kit (Applied Biosystem) and subsequently the gene expression was analyzed by TaqMan probes using the validated probes Mn00519071_m1 for seladin-1 / DHCR24 and Hs99999901_s1 for 1 8S (used to normalize the results) on the 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystem). The relative amount of the gene expression was determined using the ⁇ Ct method with the SDS v2.1.1 software (Applied Biosystem); The 18S expression was used to normalize the measurement.
  • oral treatment with NST0037 in wild mice produces an increase in the seladin-1 / DHCR24 neuroprotective gene, which further confirms that the compound crosses the blood-brain barrier.
  • the fertilized eggs were obtained by natural mating of the zebrafish (Danio rerio, strain AB). A total of 8-10 couples were used for each crossing and a total of 200-250 eggs on average per couple were generated.
  • the eggs were collected immediately after spawning and washed with dilution water (CaCI 2 ⁇ H 2 O 2 0.29 g / L, MgSOWH 2 O 2 0.12 g / L, NaHCO 3 0.065 g / L, KCI 0.006 g / L) adjusting to pH 7.8 ⁇ 0.2, in accordance with EC Regulation No. 440/2008 method C.1 and deposited in a petri dish.
  • Table Il shows the analysis of the survival rate of compound NST0037 compared to simvastatin in zebrafish larvae. The table shows the number of larvae used for the experimentation, the dose in mg / Kg (weight of the animal), the treatment time and the number of dead larvae with respect to the total.
  • Il table Group (NST0037) Larvae Dose (mg / Kg) Time (Days) Mortality
  • the inventors wanted to determine if the absence of mortality recorded by the compound NST0037 was associated with a percentage of healthy larvae equal to or less than that of simvastatin treatment.
  • the percentage of healthy larvae was defined as the number of live larvae and without symptoms of external pathophysiological abnormalities (morphological and / or behavioral), this being a parameter that determines the biosecurity of a substance under study and is complementary to the indices Survival and LD 5 O-
  • differences were observed in the percentages of healthy larvae between the two treatments evaluated at the highest study dose (1000 mg / Kg), reaching 67.9 ⁇ 3.3 for compound NST0037, being 53.3 ⁇ 8.8 for simvastatin, which surprisingly indicates a greater biosecurity of compound NST0037 in the zebrafish larva model.
  • Thrombosis in the yolk yolk sac it is a clot inside a blood vessel, in this case of any vessel that irrigates the yolk.
  • Cardiac thrombosis occurs in a cardiac vessel.
  • Cardiac edema is the accumulation of fluid in the intercellular or interstitial tissue space and also in the body's cavities. In the case of the heart, accumulation of fluid occurs in the pericardial bag.
  • treatment with NST0037 to zebrafish larvae in a wide range of concentrations does not produce any mortality, in addition to presenting a higher percentage of healthy larvae and a lesser number of larvae with deformities or anomalous appearance than simvastatin.
  • EXAMPLE 25 25.1. Study of the variation of the weight of adult zebra fish in a single dose toxicity test (24 hours) by exposure in the water of compound NST0037 compared to simvastatin
  • EMEA Agency European Medicines
  • S Test vessels fish tanks with a capacity of 9 liters, filling them with a volume of 5 liters with filtered recirculation water from the racks.
  • S Animal load average fish weight, between 0.54-0.60 gr.
  • S Test concentration 2000 mg / kg.
  • S Light 12/12 hour light / dark photoperiods.
  • S Temperature 25 ⁇ 1 0 C.
  • S Food the animals are not fed 24 hours before the treatment and not during the 24 hours of the test. Subsequently, they fed like the rest of the animals.
  • • / Weight of animals weighed at time 0 (before treatment), at 7 and 14 days after treatment. In this case, the weight of the animals of the different study groups was used as a toxicity parameter at three established times: before the start of the treatments (0 dpt), on day 7 post-treatment and on day 14 post-treatment.
  • Figure 59 shows the average of the weights of the animals according to the treatment and the post-exposure time of the substances. The results indicated that while untreated fish gained weight throughout the study, while those treated with simvastatin significantly reduced weight. On the other hand, the treatment with NST0037, surprisingly, did not change the weight during the duration of the trial, which indicates that it presents a better safety profile of simvastatin.
  • the inventors decided to find out if there were differences in the histopathological study of the different treatment groups by staining the samples with hematoxylin-eosin, which allows to discern pathological marks in the organs or tissues of The animals to study.
  • the fish were sacrificed after 14 days post-treatment (previously anesthetized) and the samples (whole fish) were included in paraffin. Subsequently, hematoxylin-eosin staining was performed for histopathological studies, obtaining a minimum of 6 longitudinal cuts per animal, with the aim of collecting different study areas of the same organ.
  • the organs studied were the following: brain, kidney, pancreas, intestine, eye, gills, ovary, testicle, muscle and liver.
  • Figure 60 representative images of the histopathological study performed in animals treated with the dose of 2000 mg / kg are shown.
  • the only ones that presented discernible pathological features were the intestine and the ovary. Traces of atrophy in the intestinal villi were detected in the intestine, being more pronounced in animals treated with simvastatin than in those treated with NST0037.
  • the ovary of females treated with simvastatin atrophy was detected in tertiary oocytes.
  • the liver of animals treated with both compounds showed discrete areas of inflammation.
  • the inventors decided to find out if the greater biosecurity of compound NST0037 compared to simvastatin was corroborated by analyzing the lethality by constant exposure in water for 4 days according to the acute toxicity test for fish of the OECD (Draft Revised Guideline 203).
  • the purpose of this test is to determine the acute lethal toxicity of a substance in freshwater fish.
  • Acute toxicity is the adverse effect, discernible, induced in an organism as a result of exposure to a given substance for a short period of time (days).
  • the acute toxicity is expressed as the mean lethal dose (LD 50 ), that is, the dose that in the water causes the death of 50% of the fish in a batch under test during a period of continuous exposure .
  • LD 50 mean lethal dose
  • S A control (or control) is carried out, without test substance in addition to the test concentrations themselves.
  • S Duration 4 days.
  • S Number of animals 7 per concentration.
  • S Containers 9 liter buckets, filling them with a volume of 5 liters, with filtered recirculation of the racks.
  • S Load average fish weight: 0.46 gr ⁇ 0.03, leaving the load in
  • Table III shows the analysis of the survival index of compound NST0037 compared to simvastatin in adult zebrafish treated for 4 days with the compounds in the water.
  • the table shows the number of animals used for experimentation, the dose in mg / Kg (weight of the animal), the treatment time and the number of dead animals with respect to the total.
  • the mortality produced by both compounds in this acute toxicity test surprisingly demonstrates that simvastatin was significantly more toxic than compound NST0037 ( ⁇ 2 , p-value ⁇ 0.001), since at day 4 post-treatment, 14% (1/7) of the animals treated with NST0037 died, being 86% (6/7) the percentage of mortality observed for the simvastatin treatment group.
  • the LD 5 O of the compound NST0037 was higher than 100 mg / kg after 4 days of continuous treatment with the compound.
  • Simvastatin had an LD 50 of 60.55 mg / kg after 4 dpt; Again and surprisingly, it was more toxic than compound NST0037, since simvastatin reached LD 50 with less dose than NST0037 and at the same time. 26. 2. Histopathological study in adult zebrafish after a lethality test by constant exposure in water (4 days) of NST0037 compared to simvastatin in adult zebrafish
  • the inventors decided to find out if there were differences in the histopathological study of the different treatment groups by staining the samples with hematoxylin-eosin, which allows to discern pathological marks in the organs or tissues of The animals to study.
  • the fish The fish that survived the treatment were sacrificed 4 days post-treatment (previously anesthetized) and the samples (whole fish) were included in paraffin.
  • hematoxylin-eosin staining was performed for histopathological studies, obtaining a minimum of 6 longitudinal cuts per animal, with the aim of collecting different study areas of the same organ.
  • the organs studied were the following: brain, kidney, pancreas, intestine, eye, gills, ovary, testicle, muscle and liver.
  • FIG 61 representative images of the histopathological study performed in the treated animals are shown. It shows representative images of the histopathological study performed. The only doses that induced toxicological problems were those of 32 and 100 mg / Kg, restricting pathological alterations to the ovaries. While the control females showed normal ovarian follicles at different stages of maturation, females treated with 100 mg / Kg of both compounds showed ovarian damage, observing a massive degeneration of the secondary and tertiary oocytes, in addition to stromal alteration.
  • the group of females treated with 30 mg / kg of simvastatin also presented histopathological damage to the ovary, not surprisingly being observed in the group of females treated with the same dose of compound NST0037, which indicates that compound NST0037 is safer than simvastatin in this experimental model.

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Abstract

Se describe un compuesto de fórmula (I); su forma hidroxiácida, las sales farmacéuticamente aceptables de dicho hidroxiácido y prodrogas y solvatos farmacéuticamente aceptables del compuesto y de su forma hidroxiácida y, en particular, dicho compuesto, su forma hidroxiácida, sales, etc. para su uso en la prevención de: enfermedades neurodegenerativas, deterioro cognitivo, enfermedades asociadas con una oxidación indeseada, procesos patológicos asociados a la edad y progeria, epilepsia, crisis epilépticas y convulsiones, enfermedades cardiovasculares como aterosclerosis, fibrilación auricular, dislipemia, hipercolesterolemia, hiperlipidemia, e hipertrigliceridemia, o infecciones fúngicas o víricas.

Description

COMPUESTO NEUROPROTECTOR, HIPOCOLESTEROLÉMICO Y
ANTIEPILÉPTICO
CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con Ia prevención y/o el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas o de enfermedades asociadas con una oxidación indeseada o de procesos patológicos asociados a Ia edad, así como con Ia prevención y/o el tratamiento de Ia epilepsia, de las crisis epilépticas o de las convulsiones, con Ia disminución de los niveles de colesterol-LDL y con Ia inhibición de Ia enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A reductasa para Ia prevención de Ia dislipemia y de las enfermedades cardiovasculares.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La gran incidencia de las enfermedades neurodegenerativas y de las enfermedades asociadas al envejecimiento es un problema de primer orden en todo el mundo. Por ello es necesaria Ia búsqueda de compuestos neuroprotectores que eviten o palien dichas enfermedades. De todas ellas, Ia enfermedad de Alzheimer (EA) es Ia más prevalente, estimándose que en el año 2040, 81 millones de personas sufrirán esa enfermedad (Blennow et al., Lancet 2006; 368: 387-403). Sólo en España se estima que más de medio millón de personas sufren actualmente EA. Los costes asociados a esta enfermedad son proporcionalmente altos, y se calcula que el coste total derivado del cuidado de los enfermos de Alzheimer es de 81.000 y 22.000 millones de € en Estados Unidos y en el Reino Unido, respectivamente. Actualmente no existen fármacos eficientes que prevengan o impidan esta enfermedad, con Io que Ia búsqueda y validación de nuevos compuestos neuroprotectores que eviten el daño neuronal es una necesidad.
En Ia actualidad, se están siguiendo diferentes estrategias para Ia obtención de nuevos compuestos, una vez que se ha visto que los actuales fármacos ofrecen pocos beneficios a los pacientes. Estos fármacos retrasan temporalmente (en el mejor de los casos un año), algunos síntomas de Ia dolencia, pero no evitan su evolución. Las opciones terapéuticas actuales se basan en Ia inhibición de Ia acetilcolinesterasa con fármacos como el donepezilo, Ia galantamina o Ia rivastigmina, o en Ia capacidad de Ia memantina en antagonizar un receptor de glutamato, el NMDA (ácido N-metil- D-aspártico).
Debido al poco éxito de estos fármacos se han abierto nuevas líneas de investigación, y, entre ellas, destaca en los últimos tiempos Ia investigación de los inhibidores de Ia enzima 3-hidroxi-3-metilglutahl-coenzima A reductasa (HMGR) (más conocidos como estatinas) como agentes terapéuticos. La HMGR es Ia enzima que cataliza el paso limitante en Ia biosíntesis del colesterol, por Io que su inh ibición por las estatinas es una estrategia terapéutica habitual para disminuir los altos niveles de colesterol asociados a las lipoproteínas de baja densidad (LDL). Estos fármacos reducen el riesgo de infarto de miocardio y de muerte coronaria, y son considerados seguros. Además, Ia hipercolesterolemia (definida como un alto nivel de colesterol en sangre) es el principal factor de riesgo para Ia enfermedad cardiovascular isquémica, como Ia ateroesclerosis.
Diversos factores genéticos y ambientales que afectan al metabolismo del colesterol están asociados con Ia EA. Por ejemplo, Ia isoforma ε4 de Ia apolipoproteína E (apoE4) es un factor de riesgo para Ia EA y está ligado a un incremento de los niveles de colesterol . La aterosclerosis, que tiene a Ia hipercolesterolemia como principal factor de riesgo, parece estar asociada también a Ia EA. Además, estudios epidemiológicos indican que altos niveles de colesterol en suero incrementan el riesgo de EA, y se ha propuesto que Ia regulación homeostática del metabolismo del colesterol puede estar alterada en el alzhéimer. Por otra parte, se ha descrito una reducción significativa del riesgo de Alzhéimer en pacientes tratados con estatinas. En conjunto, todos estos estudios sugieren que Ia reducción de los niveles de colesterol puede inhibir Ia patogénesis de Ia enfermedad de Alzhéimer (CoIe & Vassar; Neurobiol Dis 2006; 22[2]:209-22).
El colesterol es transportado por Ia sangre mediante diferentes tipos de lipoproteínas, donde los mayores portadores de colesterol son las lipoproteínas de baja densidad (LDL) y de alta densidad (HDL). Las LDL son lipoproteínas especializadas en el transporte del colesterol y de los triglicéridos desde el hígado a tejidos periféricos, donde son captados por las células a través de los receptores LDL (R-LDL) en membrana celular. Las LDL también regulan Ia síntesis de colesterol, y se han asociado los altos niveles de colesterol-LDL al riesgo de padecer enfermedades cardiovasculares (ECV). Por su parte, las HDL son lipoproteínas que transportan el colesterol desde los diferentes tejidos hasta el hígado. Debido a que las HDL pueden retirar el colesterol de las arterias y transportarlo de vuelta al hígado para su excreción, se les otorga un papel protector frente a las enfermedades cardiovasculares. Los inhibidores de Ia HMGR son los agentes hipolipemiantes de más éxito en Ia historia, siendo capaces de reducir los niveles de colesterol total a base de disminuir los niveles de colesterol-LDL sin alterar los de colesterol-HDL.
Recientemente se han descrito nuevas propiedades de las estatinas, especialmente a nivel de daño cerebral causado por trauma o en demencias, proponiéndose nuevas actividades antioxidantes y antiinflamatorias (Pahan, CeII Mol Life Sci. 2006; 63[10]:1165-78), y se ha demostrado que ciertas estatinas (e.g ., simvastatina) intensifican Ia capacidad de memoria y aprendizaje en ratones (Ling et al., Ann Neurol. 2006; 60[6]:729-39) o protegen de las crisis convulsivas asociadas a fenómenos epilépticos (Lee et al., Neurosci Lett. 2008; 440: 260-4). Además, las estatinas también han demostrado su eficacia en ensayos clínicos en fase Il que sugieren resultados positivos frente al tratamiento del vasoespasmo cerebral (Fandino et al., Neurocirugía. 2007; 18: 16-27), así como frente a Ia muerte neuronal inducida por daño isquémico en Ia retina (Honjo et al., Arch. Ophthalmol. 2002; 120: 1707-13). No obstante, actualmente se encuentra en discusión si los efectos neuroprotectores de las diferentes estatinas comerciales (e.g., atorvastatina, lovastatina, simvastatina, etc.) son debidos a un efecto directo sobre el metabolismo lipídico, o si por el contrario es consecuencia de rutas alternativas.
La solicitud de patente WO 99/1 1258 describe un compuesto de estructura similar al de Ia presente invención. No obstante, este documento no especifica Ia configuración de los distintos centros quirales presentes en el compuesto. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
Aunque existe literatura sobre el potencial efecto neuroprotector de las estatinas, los autores de esta invención han encontrado que un derivado de monacolina J no comercial, en concreto el 2-etil-butirato de (1 S,2S,6R,8S,8aR)- 1 >2>6>7>8>8a-hexahidro-3>7-dimetil-8-[2-[(2R>4R;-tetrahidro-4-hidroxi-6-oxo-2H- piran-2-il]etil]-1-naftalenilo (también identificado en ocasiones en esta solicitud de patente como NST0037) es un agente con un potencial neuroprotector sorprendente, además de tener una alta capacidad de disminuir los niveles de lípidos (colesterol y triglicéridos) de Ia sangre, inhibiendo de forma muy eficiente Ia HMGR, y protegiendo de Ia epilepsia, de las crisis epilépticas y de las convulsiones. Además, y de forma sorprendente, este compuesto es más seguro que las estatinas comerciales, mostrando niveles de toxicidad por debajo de Ia estatina más biosegura, Ia simvastatina. Adicionalmente, se trata de un compuesto que resulta más barato de sintetizar debido al bajo coste de Ia cadena lateral a añadir a Ia molécula de monacolina J.
La actividad neuroprotectora de dicho compuesto se ha puesto de manifiesto frente a diferentes agresiones que causan Ia muerte neuronal en líneas celulares humanas de origen colinérgico mediante diferentes tipos de agresiones que causan estrés oxidativo, estrés reticular o apoptosis (Ejemplo 2, Figuras 1 a 4). Dicho ejemplo pone de manifiesto el potencial empleo de dicho compuesto en Ia prevención y/o tratamiento de Ia muerte neuronal asociada a enfermedades neurodegenerativas (e.g., Alzheimer, Parkinson, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, status epilepticus, Huntington, etc.) o de enfermedades asociadas con una oxidación indeseada o de procesos patológicos asociados a Ia edad.
La actividad neuroprotectora de dicho compuesto se ha confirmado en un modelo de enfermedad de Alzheimer en ratón, donde este compuesto ejerce un efecto neuroprotector frente a Ia muerte neuronal en el hipocampo causada por una sustancia excitotóxica (Ejemplo 3, Figura 5). Además, se ha comprobado que dicha sustancia recupera Ia memoria temporal y espacial de los ratones con neurodegeneración (Ejemplo 3, Figuras 6 y 7), además de evitar Ia muerte de los animales causada por Ia administración de una sustancia excitotóxica (Ejemplo 3, Figura 8). Dichos ejemplos ponen de manifiesto el potencial empleo de este compuesto en Ia prevención y/o tratamiento de Ia muerte neuronal y del déficit cognitivo asociados a enfermedades neurodegenerativas (e.g., Alzheimer, Parkinson, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, status epilepticus, Huntington, etc.) o de enfermedades asociadas con una oxidación indeseada o de procesos patológicos asociados a Ia edad.
La actividad antiepiléptica y anticonvulsivante de dicho compuesto se ha puesto de manifiesto mediante Ia determinación de Ia protección de las crisis epilépticas y de las convulsiones en un modelo de epilepsia en ratones (Ejemplo 4, Figuras 9 y 10). Dicho ejemplo pone de manifiesto el potencial empleo de este compuesto en Ia prevención y/o tratamiento de Ia epilepsia y de las crisis convulsivas o convulsiones.
La actividad hipolipemiante de dicho compuesto se ha puesto de manifiesto mediante Ia determinación de Ia inh ibición de Ia HM GR en comparación con dos estatinas comerciales, Ia simvastatina y Ia atorvastatina (Ejemplo 5, Figura 11 ).
Adicionalmente se ha demostrado Ia capacidad hipolipemiante de dicho compuesto en un modelo de hiperlipidemia endógena en ratón, observándose un efecto similar a Ia simvastatina en Ia disminución de los niveles de colesterol plasmático total, del colesterol asociado a LDL, del colesterol asociado a VLDL y de Ia fracción de colesterol esterificado. Por el contrario, y al igual que Ia simvastatina, no altera los niveles de colesterol asociado a HDL ni los de Ia fracción de colesterol libre, Io que Ie otorga un papel protector frente a enfermedades cardiovasculares (ECV) (Ejemplo 5, Figuras 12 a 1 7). Dichos ejemplos ponen de manifiesto el potencial empleo de dicho compuesto en Ia prevención y/o tratamiento de Ia hipercolesterolemia asociada a enfermedades cardiovasculares (e.g., infarto de miocardio, ateroesclerosis, cardiopatía congénita, cardiopatía adqu irida, cardiopatía isquémica, cardiopatía hipertensiva, valvulopatías, miocardiopatías, trastornos sanguíneos, etc.). La actividad hipolipemiante de dicho compuesto se ha confirmado en un modelo de hiperlipidemia inducida en ratón (Ejemplo 6, Figuras 1 8 a 23), observándose un efecto mayor a Ia simvastatina en Ia disminución de los niveles de colesterol plasmático total, del colesterol asociado a LDL y de Ia fracción de colesterol libre y esterificado. Por el contrario, este compuesto no altera los niveles de colesterol asociado a HDL ni los de colesterol asociado a VLDL, Io que Ie otorga un papel protector frente a enfermedades cardiovasculares (ECV). Dichos ejemplos ponen de manifiesto el potencial empleo de dicho compuesto en Ia prevención y/o tratamiento de Ia hipercolesterolemia asociada a enfermedades cardiovasculares (e.g., infarto de miocardio, ateroesclerosis, cardiopatía congénita, cardiopatía adquirida, cardiopatía isquémica, cardiopatía hipertensiva, valvulopatías, miocardiopatías, trastornos sanguíneos, etc.). La bioseguridad de dicho compuesto se ha puesto de manifiesto mediante Ia evaluación de su toxicidad en un modelo de embrión de pez cebra, en comparación con una estatina comercial, Ia simvastatina, observándose que es menos tóxica que Ia simvastatina a diferentes concentraciones ya que produce una menor mortalidad (Ejemplo 7, Figuras 24 y 25). Adicionalmente, se ha demostrado que Ia dosis letal 50 (LD50) es mayor en el caso del compuesto NST0037 que en el de Ia simvastatina en todos los puntos temporales evaluados, Io que indica una mayor bioseguridad de dicho compuesto (Ejemplo 7, Figuras 26). Adicionalmente, se ha demostrado que este compuesto produce un mayor porcentaje de larvas sanas al final del experimento, así como un menor porcentaje de larvas con deformidades o aspecto anómalo (Ejemplo 7, Figuras 27 y 28). Adicionalmente, este compuesto no produce una variación significativa del porcentaje de latidos cardíacos a altas concentraciones, a diferencia de Ia simvastatina que produce una disminución significativa del ritmo cardíaco a altas concentraciones (Ejemplo 7, Figuras 29).
Por tanto, un aspecto de Ia presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (I) [también identificado en ocasiones en esta solicitud de patente como NST0037]:
Figure imgf000009_0001
(I) su forma hidroxiácida, las sales farmacéuticamente aceptables de dicho hidroxiácido y prodrogas y solvatos farmacéuticamente aceptables del compuesto y de su forma hidroxiácida.
Otro aspecto de Ia presente invención, es una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (I) y/o su forma hidroxiácida y/o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho hidroxiácido y/o una prodroga o solvato farmacéuticamente aceptable del compuesto o de su forma hidroxiácida, y al menos un adyuvante, portador y/o vehículo farmacéuticamente aceptable.
Otro aspecto de Ia presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (I), su forma hidroxiácida o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho hidroxiácido y/o una prodroga o solvato farmacéuticamente aceptable del compuesto o de su forma hidroxiácida para su uso como medicamento.
Según otro aspecto, Ia presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (I), su forma hidroxiácida o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho hidroxiácido y/o una prodroga o solvato farmacéuticamente aceptable del compuesto o de su forma h idroxiácida para su uso como agente neuroprotector, en particular en Ia prevención y/o el tratamiento de: a. enfermedades neurodegenerativas (e.g., Alzheimer, Parkinson, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, status epilepticus, Huntington, etc.), más concretamente, como neuroprotector frente a procesos de apoptosis, estrés oxidativo o estrés de retículo endoplásmico asociados a dichas enfermedades neurodegenerativas crónicas, b. deterioro cognitivo, c. enfermedades asociadas con una oxidación indeseada, d. procesos patológicos asociados a Ia edad y progeria, e. epilepsia, crisis epilépticas y convulsiones, f. enfermedades cardiovasculares como aterosclerosis, fibrilación auricular, dislipemia, hipercolesterolemia, hiperlipidemia, e hipertrigliceridemia, o g. infecciones fúngicas o víricas
Un aspecto de Ia presente invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula (I), de su forma hidroxiácida, de u na sal farmacéuticamente aceptable de d icho h idroxiácido y/o d e u n a p rod rog a o so l vato farmacéuticamente aceptable del compuesto o de su forma hidroxiácida en Ia elaboración de un medicamento. Según una real ización particular, el medicamento es para su uso como agente neuroprotector, en particular en Ia prevención y/o el tratamiento de: a. enfermedades neurodegenerativas (e.g . , Alzheimer, Parkinson , esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, status epilepticus,
Huntington, etc.), más concretamente, como neuroprotector frente a procesos de apoptosis, estrés oxidativo o estrés de retículo endoplásmico asociados a dichas enfermedades neurodegenerativas crónicas, b. deterioro cognitivo, c. enfermedades asociadas con una oxidación indeseada, d. procesos patológicos asociados a Ia edad y progeria, e. epilepsia, crisis epilépticas y convulsiones, f. enfermedades cardiovasculares como aterosclerosis, fibrilación auricular, dislipemia, hipercolesterolemia, hiperlipidemia, e hipertrigliceridemia, o g. infecciones fúngicas o víricas
Otro aspecto de Ia presente invención es un compuesto de fórmula (I), su forma hidroxiácida o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho hidroxiácido y/o una prodroga o solvato farmacéuticamente aceptable del compuesto o de su forma hidroxiácida para su uso en el aumento de Ia expresión del gen seladin-1/DHCR24.
Otro aspecto de Ia presente invención es un compuesto de fórmula (I), su forma hidroxiácida o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho hidroxiácido y/o una prodroga o solvato farmacéuticamente aceptable del compuesto o de su forma hidroxiácida para su uso en Ia prevención y/o tratamiento de enfermedades relacionadas con el gen seladin-1/DHCR24.
Otro aspecto de Ia presente invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula (I), de su forma hidroxiácida, de una sal farmacéuticamente aceptable de dicho hidroxiácido y/o de una prodroga o solvato farmacéuticamente aceptable del compuesto o de su forma hidroxiácida en Ia elaboración de un medicamento caracterizado por incrementar Ia expresión del gen seladin-1/DHCR24.
En otro aspecto, Ia invención se relaciona con un método para Ia prevención y/o tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, deterioro cognitivo, enfermedades asociadas con una oxidación indeseada, procesos patológicos asociados a Ia edad y progeria, epilepsia, crisis epilépticas y convulsiones, enfermedades cardiovasculares como aterosclerosis, fibrilación auricular, dislipemia, hipercolesterolemia, hiperlipidemia e hipertrigliceridemia, o infecciones fúngicas o víricas en un sujeto con necesidad de tratamiento, que comprende Ia administración a dicho sujeto de una cantidad terapéuticamente eficiente de un compuesto de fórmula (I), su forma hidroxiácida o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho hidroxiácido y/o una prodroga o solvato farmacéuticamente aceptable del compuesto o de su forma hidroxiácida.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 es una gráfica de dispersión XY que representa el efecto protector del compuesto NST0037 de Ia muerte causada por xantina/xantina oxidasa (XXO). La figura muestra el porcentaje de Ia muerte celular (tomando el 100% Ia producida por XXO) de los cultivos tratados con 10 μM xantina (X) 60 mU/mL xantina oxidasa (XO) y NST0037 a diferentes concentraciones, representando las medias+SD de 3 experimentos independientes por triplicado. * Diferencia significativa respecto a los tratamientos con XXO sola, de acuerdo al test de Student (p<0.05). La Figura 2 es una gráfica de dispersión XY que representa el efecto protector del compuesto NST0037 de Ia muerte causada por tunicamicina (Tm). La figura muestra el porcentaje de Ia muerte celular (tomando el 100% Ia producida por Tm) de los cultivos tratados con 24 μM Tm y NST0037 a diferentes concentraciones, representando las medias+SD de 3 experimentos independientes por triplicado. * Diferencia significativa respecto a los tratamientos con Tm sola, de acuerdo al test de Student (p<0.05).
La Figura 3 es una gráfica de dispersión XY que representa el efecto protector del compuesto NST0037 de Ia muerte causada por camptotecina (CPT). La figura muestra el porcentaje de Ia muerte celular (tomando el 100% Ia producida por CPT) de los cultivos tratados con 20 nM CPT y NST0037 a diferentes concentraciones, representando las medias+SD de 3 experimentos independientes por triplicado. * Diferencia significativa respecto a los tratamientos con CPT sola, de acuerdo al test de Student (p<0.05).
La Figura 4 son dos gráficas de barras que representan el efecto protector del compuesto NST0037 de Ia apoptosis producida por camptotecina (CPT) determinada por citometría de flujo. La Figura 4A muestra el porcentaje de inhibición de Ia apoptosis producida por 50 μM CPT y NST0037 a 10, 40 y 100 μM en comparación con el control de inhibición el Z-VAD-fmk a 50 μM, representando las medias+SD de 3 experimentos independientes. * Diferencia significativa respecto al tratamiento con CPT sola, de acuerdo al test de Student (p<0.05). La Figura 4B muestra que el pretratamiento con NST0037 potencia el efecto antiapoptótico del compuesto (40 μM NST0037 y tratamiento 24 h con 50 μM de CPT como inductor de Ia apoptosis), siendo esta protección inhibida parcialmente por Ia adición de mevalonato (MEV), precursor de Ia ruta de biosíntesis del colesterol y producto de Ia reacción enzimática que cataliza Ia enzima HMG-CoA Reductasa. La Figura 4B muestra el porcentaje de inhibición de Ia apoptosis producida por 50 μM CPT con un pretratamiento de 24 h con 40 μM NST0037 solo o junto con 100 μM mevalonato (MEV), y el efecto del inhibidor Z-VAD-fm k a 50 μ M como control, representando las medias+SD de 3 experimentos independientes. * Diferencia significativa respecto al tratamiento con CPT sola, # diferencia significativa respecto al tratamiento con CPT y NST0037, de acuerdo al test de Student (p<0.05). La Figura 5 es una composición de micrografías que muestra las regiones CA1 y CA2 del hipocampo de ratones donde las muestras han sido teñidas con hematoxilina&eosina. La figura representa el análisis histopatológico de Ia estructura celular de estas regiones en función del pretratamiento (-24 y -0.5 horas de Ia inoculación de Ia sustancia excitotóxica [ácido kaínico o kainato o KA]), Ia inoculación de Ia sustancia excitotóxica (0 días post-inoculación [d.p.i.]) y el posterior tratamiento (hasta 7 d.p.i.).
La Figura 6 es una gráfica de barras donde se analiza el estado de Ia memoria temporal según el protocolo de Dere y colaboradores (Dere, E., Huston, J. P. & De Souza Silva, M. A. Neurobiol Learn Mem 2005; 84: 214-21 ). Las barras representan las medias±SEM de Ia memoria temporal expresada en unidades arbitrarias (eje Y), en función del pretratamiento (-24 y -0.5 horas de Ia inoculación de Ia sustancia excitotóxica [ácido kaínico o kainato o KA]), Ia inoculación de Ia sustancia excitotóxica (0 días post-inoculación [d.p.i.]) y el posterior tratamiento (hasta 7 d.p.i.).
La Figura 7 es una gráfica de barras donde se analiza el estado de Ia memoria espacial según el protocolo de Dere y colaboradores (Dere, E., Huston, J. P. & De Souza Silva, M. A. Neurobiol Learn Mem 2005; 84: 214-21 ). Las barras representan las medias±SEM de Ia memoria espacial expresada en unidades arbitrarias (eje Y), en función del pretratamiento (-24 y -0.5 horas de Ia inoculación de Ia sustancia excitotóxica [ácido kaínico o kainato o KA]), Ia inoculación de Ia sustancia excitotóxica (0 días post-inoculación [d.p.i.]) y el posterior tratamiento (hasta 7 d.p.i.). La Figura 8 es una gráfica de Kaplan-Meier que representa el índice de supervivencia de los ratones en función del pretratamiento (-24 y -0.5 horas de Ia inoculación de Ia sustancia excitotóxica [ácido kaínico o kainato o KA]), Ia inoculación de Ia sustancia excitotóxica (0 días post-inoculación [d.p.i.]) y el posterior tratamiento (hasta 7 d.p.i.). La Figura 9 es una gráfica de barras donde se representa Ia media±SEM del tiempo en minutos tras Ia inoculación de KA en el que aparece Ia primera convulsión (eje Y) en función del pretratamiento recibido (eje X). El grupo de pretratamiento con PBS se representa en negro y el grupo de tratamiento con NST0037 a 50 mg/Kg de peso se representa en gris. La Figura 10 es una gráfica de dispersión XY que representa el nivel de severidad del status epilepticus observado según Ia escala de Racine (Racine, Electroencephalogr Clin Neurophysiol 1972; 32[3]:281 -94), frente al tiempo post-inoculación de Ia sustancia epileptogénica (ácido kaínico o kainato o KA). La gráfica muestra Ia evolución del estado epileptogénico de los animales según el tratamiento recibido: PBS se representa con círculos y línea negros y el grupo de tratamiento con NST0037 a 50 mg/Kg de peso se representa con cuadrados y línea grises. La Figura 1 1 es una gráfica de dispersión XY que representa las curvas de dosis-respuesta del compuesto NST0037 en comparación con dos estatinas comerciales (simvastatina y atorvastatina) sobre Ia actividad enzimática de Ia HMGR in vitro. La gráfica muestra el porcentaje de actividad enzimática de Ia HMGR con respecto al control de los compuestos en diferentes dosis, representando Ia media±SD de al menos cuatro ensayos independientes.
La Figura 12 es un diagrama de barras que representa los niveles de colesterol total plasmático de ratones macho ApoB100 tras 12h de ser tratados con 50 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando Ia media±SD de cada uno de los grupos. * Diferencia significativa respecto al tiempo Oh, de acuerdo al test de Student (p<0.05).
La Figura 13 es un diagrama de barras que representa los niveles de colesterol LDL plasmático (c-LDL) de ratones macho ApoB100 tras 12h de ser tratados con 50 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando Ia media±SD de cada uno de los grupos. * Diferencia significativa respecto al tiempo Oh, de acuerdo al test de Student (p<0.05).
La Figura 14 es un diagrama de barras que representa los niveles de colesterol HDL plasmático (c-HDL) de ratones macho ApoB100 tras 12h de ser tratados con 50 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando Ia media±SD de cada uno de los grupos. * Diferencia significativa respecto al tiempo Oh, de acuerdo al test de Student (p<0.05).
La Figura 15 es un diagrama de barras que representa los niveles de colesterol VLDL plasmático (c-VLDL) de ratones macho ApoB100 tras 12h de ser tratados con 50 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando Ia media±SD de cada uno de los grupos. * Diferencia significativa respecto al tiempo Oh, de acuerdo al test de Student (p<0.05).
La Figura 16 es un diagrama de barras que representa los niveles de colesterol esterificado (CE) plasmático de ratones macho ApoB100 tras 12h de ser tratados con 50 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando Ia media±SD de cada uno de los grupos. * Diferencia significativa respecto al tiempo Oh, de acuerdo al test de Student (p<0.05).
La Figura 17 es un diagrama de barras que representa los niveles de colesterol libre (CL) plasmático de ratones macho ApoBl OO tras 12h de ser tratados con 50 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando Ia media±SD de cada uno de los grupos. * Diferencia significativa respecto al tiempo Oh, de acuerdo al test de Student (p<0.05).
La Figura 18 es un diagrama de barras que representa el número de veces que incrementa el colesterol total (CT) en ratones macho C57BL6 tras 24h de ser tratados i.p. con 500 mg/kg de Tritón 1339 (Tiloxapol) y 50 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando Ia media±SD de cada uno de los grupos. * Diferencia significativa respecto al grupo control, de acuerdo al test de Student (p<0.05).
La Figura 19 es un diagrama de barras que representa el número de veces que incrementa el colesterol LDL (c-LDL) en ratones macho C57BL6 tras 24h de ser tratados i.p. con 500 mg/kg de Tritón 1339 (Tiloxapol) y 50 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando Ia media±SD de cada uno de los grupos. * Diferencia significativa respecto al grupo control, de acuerdo al test de Student (p<0.05). La Figura 20 es un diagrama de barras que representa el número de veces que incrementa el colesterol HDL (c-HDL) en ratones macho C57BL6 tras 24h de ser tratados i.p. con 500 mg/kg de Tritón 1339 (Tiloxapol) y 50 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando Ia media±SD de cada uno de los grupos. La Figura 21 es un diagrama de barras que representa los niveles de colesterol VLDL (c-VLDL) en ratones macho C57BL6 tras 24h de ser tratados i.p. con 500 mg/kg de Tritón 1339 (Tiloxapol) y 50 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando Ia media±SD de cada u no de los gru pos. * Diferencia significativa respecto al grupo control, de acuerdo al test de Student (p<0.05).
La Figura 22 es un diagrama de barras que representa el número de veces que incrementa el colesterol esterificado (CE) en ratones macho C57BL6 tras 24h de ser tratados i.p. con 500 mg/kg de Tritón 1339 (Tiloxapol) y 50 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando Ia media±SD de cada uno de los grupos.
La Figura 23 es un diagrama de barras que representa el número de veces que incrementa el colesterol libre (CL) en ratones macho C57BL6 tras
24h de ser tratados i.p. con 500 mg/kg de Tritón 1339 (Tiloxapol) y 50 mg/kg de
NST0037 o simvastatina, representando Ia media±SD de cada uno de los grupos.
La Figura 24 es una gráfica de Kaplan-Meier que representa el índice de supervivencia de los embriones-larvas en función del tratamiento recibido: control, NST0037 (a una dosis de 2 mg/L) o simvastatina (a una dosis de 2 mg/L). * Diferencia significativa respecto al control, de acuerdo al test de χ2
(p<0.01 ).
La Figura 25 es una gráfica de Kaplan-Meier que representa el índice de supervivencia de los embriones-larvas en función del tratamiento recibido: control, NST0037 (a una dosis de 0.2 mg/L) o simvastatina (a una dosis de 2 mg/L). * Diferencia significativa respecto al control, de acuerdo al test de χ2
(p<0.01 ).
La Figura 26 es una gráfica de dispersión XY que representa Ia dosis letal 50 (LD50) de los dos compuestos (NST0037 o simvastatina) frente al tiempo de tratamiento.
La Figura 27 es una gráfica de barras que representa el porcentaje de larvas sanas que se obtienen al final de experimento en función del tratamiento recibido (NST0037 o simvastatina) y Ia dosis usada (0.02, 0.06 ó 0.2 mg/L), y donde se representa las medias ± SD.
La Figura 28 es una gráfica de dispersión XY que representa el porcentaje de embriones-larvas con deformidades o aspecto anómalo en función del tratamiento recibido (NST0037 o simvastatina). * Diferencia significativa entre los dos tratamientos, de acuerdo al test de Student (p<0.05). La Figura 29 es un gráfica de barras que representa el porcentaje del ritmo cardiaco de los embriones-larvas tratados con dosis crecientes de los compuestos NST0037 o simvastatina, a las 72 horas post-tratamiento, representando las medias ± SD. La línea negra punteada horizontal representa el valor medio del ritmo cardiaco correspondiente a los controles. * Diferencia significativa de los tratamientos respecto al control, de acuerdo al test de Student (p<0.05). La Figura 30 es una gráfica que muestra Ia actividad antifúngica del compuesto NST0037 y de Ia simvastatina. En ella se representa el logaritmo de las concentraciones ensayadas (mM) frente al diámetro de los halos de inhibición (cm).
La Figura 31 es una gráfica de barras que muestra el aumento de Ia expresión del gen seladin-1/DHCR24 por el tratamiento con NST0037 en las células SK-N-MC. Se muestra Ia cuantificación relativa (RQ) de Ia expresión del gen seladin-1/DHCR24, normalizada por el 18S, y referida al valor de las células sin tratamiento (control), para los tratamientos durante 24 h con NST0037 a 1 , 4, 10 y 40 μM. Se muestran los resultados de dos ensayos independientes por triplicado. * Diferencia significativa respecto al control de acuerdo al test de Student (p<0.05).
La Figura 32 es una gráfica de dispersión XY que representa el efecto protector del compuesto NST0037 de Ia muerte causada por ácido okadaico (OA). La figura muestra el porcentaje de Ia muerte celular (tomando el 100% Ia producida por OA) de los cultivos tratados con 20 nM OA y NST0037 a diferentes concentraciones, representando las medias+SD de 3 experimentos independientes por triplicado. * Diferencia significativa respecto a l os tratamientos con OA sola, de acuerdo al test de Student (p<0.05).
La Figura 33 es una gráfica de dispersión XY que representa el efecto protector del compuesto NST0037 de Ia muerte causada por ácido 3- nitropropiónico (3-NP). La figura muestra el porcentaje de Ia muerte celular (tomando el 100% Ia producida por 3-NP) de los cultivos tratados con 30 μM 3-NP y NST0037 a diferentes concentraciones, representando las medias+SD de 3 experimentos independientes por triplicado. * Diferencia significativa respecto a los tratamientos con 3-NP sola, de acuerdo al test de Student (p<0.05).
La Figura 34 es una gráfica de barras que representa el efecto inhibidor del pretratamiento del compuesto NST0037 sobre Ia activación de Ia caspasa 3/7, inducida por camptotecina (CPT). La figura muestra el porcentaje de Ia caspasa 3/7 activa referida a las células control, sin tratamiento, producido por 50 μM CPT y pretratamiento con NST0037 a 10 y 40 μM, mevalonato a 100 μM y Ia combinación de ambos compuestos, además, se utiliza el inhibidor Z-VAD- fmk a 50 μM como control de inhibición, representando las medias+SD de 3 experimentos independientes. * Diferencia significativa respecto al tratamiento con CPT sola, * diferencia significativa respecto al tratamiento con CPT y NST0037, de acuerdo al test de Student (p<0.05).
La Figura 35 son dos gráficas de barras en las que se muestra el porcentaje de Aβ(1-40) (A) y Aβ(1-42) (B) secretado y cuantificado mediante
ELISA y referido a las células control a 48 h. Se muestran los resultados de un ensayo representativo por duplicado (media+SD). * Diferencia significativa respecto al control de acuerdo al test de Student (p<0.05).
La Figura 36 es una gráfica de barras que representa el efecto del mevalonato sobre Ia protección por NST0037 de Ia muerte celular producida por XXO. La figura muestra el porcentaje de Ia muerte celular (tomando el 100% Ia producida por XXO) de los cultivos tratados con 10 μM xantina (X) 60 mU/mL xantina oxidasa (XO) y 40 μM NST0037 y mevalonato a 10, 40 y 100 μM, representando las medias+SD de 3 experimentos independientes por triplicado. * Diferencia significativa respecto al tratamiento con XXO sola; * diferencia significativa respecto al tratamiento con XXO y NST0037, de acuerdo al test de Student (p<0.05).
La Figura 37 es una composición de micrografías que muestra Ia inm unoh istoqu ím ica de MAP2 en el h ipocampo de ratones con u na magnificación de 12.5X y en más detalle de las áreas CA1 y CA2-CA3 con una magnificación de 200X. La figura representa el análisis histopatológico de Ia distrofia neurítica en función del pretratamiento (-24 y -0.5 horas de Ia inoculación de Ia sustancia excitotóxica [ácido kaínico o kainato o KA]), Ia inoculación de Ia sustancia excitotóxica (0 días post-inoculación [d.p.i.]) y el posterior tratamiento (hasta 7 d.p.i.). La Figura 38 es una composición de micrografías que muestra: (A) Ia región CA2 y CA3 del hipocampo de ratones donde a las muestras se les ha realizado Ia inmunohistoqu ímica de HN E, Ia técnica de T. U . N . E. L. y Ia inmunohistoquímica de GFAP, todas las imágenes tienen una magnificación de 100X. La figura representa el análisis histopatológico del daño oxidativo, Ia apoptosis y astrogliosis en el hipocampo en función del pretratamiento (-24 y - 0.5 horas de Ia inoculación de Ia sustancia excitotóxica [ácido kaínico o kainato o KA]), Ia inoculación de Ia sustancia excitotóxica (0 días post-inoculación [d.p.i.]) y el posterior tratamiento (hasta 7 d.p.i.).
La Figura 39 es una gráfica de Kaplan-Meier que representa el índice de supervivencia de los ratones en función del tratamiento (-24 y -0.5 horas de Ia inoculación de Ia sustancia neurotóxica [MPTP]), Ia inoculación de Ia sustancia neurotóxica (0 días post-inoculación [d.p.i.]) y el posterior tratamiento (hasta 7 d.p.i.).
La Figura 40 es una gráfica de barras donde se analiza Ia resistencia del animal. Las barras representan las medias±SEM del ratio entre el tiempo de permanencia en el cilindro de los animales a los 7 d.p.i. respecto del estado basal (eje Y), en función del tratamiento (-24 y -0.5 horas de Ia inoculación de Ia sustancia neurotóxica [MPTP]), Ia inoculación de Ia sustancia neurotóxica (0 días post-inoculación [d.p.i.]) y el posterior tratamiento (hasta 7 d.p.i.).
La Figura 41 es una gráfica de barras donde se analiza Ia fuerza en las extremidades delanteras del animal. Las barras representan las medias±SEM del ratio Ia fuerza de los animales en gramos por quintuplicado a los 7 d.p.i. respecto del estado basal (eje Y), en función del tratamiento (-24 y -0.5 horas de Ia inoculación de Ia sustancia neurotóxica [MPTP]), Ia inoculación de Ia sustancia neurotóxica (0 días post-inoculación [d.p.i.]) y el posterior tratamiento (hasta 7 d.p.i.).
La Figura 42 es una composición de micrografías que muestra las regiones de Ia sustancia nigra y del estriado de ratones donde las muestras han sido teñidas con Fluoro Jade B con una magnificación de 100X. La figura representa el análisis histopatológico de Ia neurodegeneración en función del tratamiento (-24 y -0.5 horas de Ia inoculación de Ia sustancia neurotóxica [MPTP]), Ia inoculación de Ia sustancia neurotóxica (0 días post-inoculación [d.p.i.]) y el posterior tratamiento (hasta 7 d.p.i.).
La Figura 43 es una composición de micrografías que muestra las regiones de Ia sustancia nigra y el estriado de ratones donde a las muestras se les ha realizado Ia inmunohistoquímica contra tirosina-hidroxilasa con una magnificación de 100X. La figura representa el análisis histopatológico de Ia muerte de neuronas dopaminérgicas de Ia sustancia nigra y de Ia desaparición de Ia extensiones nerviosas del estriado en función del tratamiento (-24 y -0.5 horas de Ia inoculación de Ia sustancia neurotóxica [MPTP]), Ia inoculación de
Ia sustancia neurotóxica (0 días post-inoculación [d.p.i.]) y el posterior tratamiento (hasta 7 d.p.i.).
La Figura 44 es una gráfica de dispersión XY donde se analiza Ia resistencia del animal. Las barras representan las medias±SEM del ratio entre el tiempo de permanencia en el cilindro de los animales a los 7, 14 y 21 d.p.i. respecto del estado basal (eje Y) en función del tratamiento (-24 y -0.5 horas de Ia inoculación de Ia sustancia neurotóxica [MPTP]), Ia inoculación de Ia sustancia neurotóxica (0 días post-inoculación [d.p.i.]) y el posterior tratamiento (hasta 21 d.p.i.).
La Figura 45 es una composición de micrografías que muestra Ia región de Ia sustancia nigra de ratones donde a las muestras se les ha realizado Ia inmunohistoquímica contra tirosina-hidroxilasa y HNE con una magnificación de 100X. La figura representa el análisis histopatológico de Ia muerte y Ia peroxidación lipídica en neuronas dopaminérgicas de Ia sustancia nigra en función del tratamiento (-24 y -0.5 horas de Ia inoculación de Ia sustancia neurotóxica [MPTP]), Ia inoculación de Ia sustancia neurotóxica (0 días postinoculación [d.p.i.]) y el posterior tratamiento (hasta 21 d.p.i.).
La Figura 46 es una gráfica de dispersión XY que representa Ia permeabilidad efectiva expresada como Pe (cm/s) frente al paso de BHE (%) de Ia atorvastatina, Ia simvastatina y el NST0037 mediante determinación in vitro por el método PAMPA. Como controles positivo y negativo se emplearon verapamilo y teofilina respectivamente.
La Figura 47 es un diagrama de barras que representa el efecto de Ia simvastatina y NST0037 sobre los niveles de colesterol en las líneas celulares humanas HepG2 y SK-N-MC. Los resultados se expresan como el porcentaje de reducción de colesterol respecto al control en cada, línea tras Ia incubación de los compuestos ácidos durante 2Oh en ausencia de FBS. Las determinaciones fueron llevadas a cabo por medios enzimáticos y fluorométricos y los resultados son Ia media±SD. * Diferencia significativa respecto a las células sin tratar, de acuerdo al test de Student (p<0.05). En el caso de HepG2 se hicieron 2 ensayos independientes por triplicado y en el caso de las SK-N-MC tres ensayos independientes por triplicado.
La F ig u ra 48 es un conjunto de gráficas de dispersión XY que representan Ia concentración plasmática de colesterol y sus diversas fracciones además de Ia concentración de apoB en ratones hembra apoB100 de 12 semanas de edad tras 7, 21 y 28 días de tratamiento oral con 50 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando Ia media±SEM de cada uno de los grupos y los tiempos. * Diferencia significativa respecto al control, de acuerdo al test de Student (p<0.05). + Diferencia significativa respecto tiempo inicial de ese mismo grupo.
La Figura 49 es un diagrama de barras que representa el número de veces que incrementa el colesterol libre y esterificado en ratones hembra apoB100 de 12 semanas de edad tras 7, 21 y 28 días de tratamiento con 50 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando Ia media±SEM de cada uno de los grupos. * Diferencia significativa respecto al grupo control, de acuerdo al test de Student (p<0.05).
La Figura 50 es un diagrama de barras que representa el número de veces que incrementa el estado de oxidación en el plasma de ratones hembra apoB100 de 12 semanas de edad tras 7, 21 y 28 días de tratamiento con 50 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando Ia media±SEM de cada uno de los grupos. * Diferencia significativa respecto al grupo control, de acuerdo al test de Student (p<0.05). La Figura 51 es un conjunto de gráficas de dispersión XY que representan Ia concentración plasmática de colesterol y sus diversas fracciones en ratones hembra apoB100 de 6 meses de edad tras uno, dos y tres meses de tratamiento oral con 50 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando Ia media±SEM de cada uno de los grupos. * Diferencia significativa respecto al control, de acuerdo al test de Student (p<0.05). + Diferencia significativa respecto tiempo inicial de ese mismo grupo.
La Figura 52 es un diagrama de barras que representa el número de veces que incrementa el colesterol libre y esterificado en ratones hembra apoB100 de 6 meses de edad tras uno, dos o tres meses de tratamiento oral con 50 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando Ia media±SEM de cada uno de los grupos. * Diferencia significativa respecto al grupo control, de acuerdo al test de Student (p<0.05).
La Figura 53 es un diagrama de barras que representa el número de veces que incrementa el colesterol y sus diversas fracciones en ratas zucker macho de 11 semanas de edad tras 7 días de tratamiento oral con 30 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando Ia media±SEM de cada uno de los grupos. * Diferencia significativa respecto al grupo control, de acuerdo al test de Student (p<0.05). La Figura 54 es un diagrama de barras que representa el número de veces que incrementan los triglicéridos plasmáticos en ratas zucker macho de 11 semanas de edad tras 7 días de tratamiento oral con 30 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando Ia media±SEM de cada uno de los grupos. * Diferencia significativa respecto al grupo control, de acuerdo al test de Student (p<0.05).
La Figura 55 es un diagrama de barras que representa el número de veces que incrementa el estado redox plasmático en ratas zucker macho de 11 semanas de edad tras 7 días de tratamiento oral con 30 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando Ia media±SEM de cada uno de los grupos. * Diferencia significativa respecto al grupo control, de acuerdo al test de Student (p<0.05).
La Figura 56 es un diagrama de barras que representa el número de veces que incrementa Ia expresión del gen seladin-1/DHCR24 en el cerebro de ratones salvajes C57BL6 a las 4h de Ia administración oral a 50 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando Ia media±SEM de cada uno de los grupos. * Diferencia significativa respecto al grupo control, de acuerdo al test de Student (p<0.05). La Figura 57 es un diagrama de barras que representa el porcentaje de larvas sanas (sin problemas toxicológicos) tras exposición del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina, representando Ia media del porcentaje±SEM de animales sanos después del tratamiento con diferentes dosis de NST0037 o de simvastatina. El eje de las Y determina el porcentaje de larvas sanas y el eje de las X, las concentraciones usadas de ambos compuestos. Las barras en gris representan el grupo de animales tratados con NST0037 y las barras de color negro representan los animales tratados con simvastatina.
La Figura 58 es un diagrama de barras que representa el porcentaje de larvas con aspecto anómalo (sintomatología) tras exposición del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina, representando Ia media del porcentaje±SEM de larvas con deformaciones o aspecto anómalo después del tratamiento con diferentes dosis de NST0037 o de simvastatina. El eje de las Y determina el porcentaje de larvas con aspecto anómalo y el eje de las X las diferentes alteraciones de Ia sintomatología. Las barras en gris representan el grupo de animales tratados con NST0037 y las barras de color negro representan los animales tratados con simvastatina.
La Figura 59 es un diagrama de barras que representa Ia variación del peso de peces cebra adultos en un ensayo de toxicidad de dosis única (24 horas) por exposición en el agua del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina . Los datos se presentan como el peso med io de los animales±SD en función del tiempo de estudio y del grupo de tratamiento. Las barras en color blanco indican el peso de los animales en función del tratamiento, refiriéndose al estudio basal (0 dpt). Las gráficas de color gris indican el peso de los animales en función del tratamiento, refiriéndose al estudio a 7 dpt. Las gráficas de color negro indican el peso de los animales en función del tratamiento, refiriéndose al estudio a 14 dpt. * Comparación estad ística con el método t-Student, donde se determinan diferencias significativas en el peso de los animales de un mismo grupo respecto al tiempo basal (p < 0.05).
La Figura 60 es una composición de micrografías que muestra el estudio histopatológico en diferentes órganos de peces cebra adultos tras ensayo de toxicidad de dosis única (24 horas) por exposición en el agua del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina. Los animales fueron tratados con una dosis de 2000 mg/Kg, sacrificados a los 14 días post-tratamiento, realizados cortes histológicos representativos de los diferentes grupos de estudio y teñidos con hematoxilina-eosina. Los órganos estudiados que se muestran son: cerebro, riñon, páncreas, intestino, ojo, branquias, ovario, testículo, músculo e hígado.
La Figura 61 es una composición de micrografías que muestra el estudio histopatológico en el ovario de peces cebra adultos tras ensayo de letalidad por exposición constante en el agua (4 d ías) del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina. Los animales fueron tratados con dos dosis de 32 y 100 mg/Kg, sacrificados a los 4 días post-tratamiento, realizados cortes histológicos representativos de los diferentes grupos de estudio y teñidos con hematoxilina-eosina. El ovario fue el único órgano estudiado que sufrió alteraciones patológicas. Se muestra un corte histológico del ovario de una hembra del grupo control, y ovarios de hembras de los grupos de tratamientos con NST0037 y simvastatina en función de Ia dosis.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Definiciones Para facilitar Ia comprensión de Ia invención objeto de esta solicitud de patente, a continuación se expone el significado de algunos términos y expresiones utilizados en el contexto de Ia invención.
El término "neuroprotector", tal como aqu í se util iza, se refiere a cualquier sustancia capaz de producir Ia atenuación o desaparición de los efectos de Ia degeneración o muerte neuronal mediante cualquier mecanismo conocido o por conocer, por ejemplo, necrosis, apoptosis, autofagia, daño oxidativo, excitotoxicidad, daño de retículo endoplásmico, deposición de subproductos, pérdida de Ia arquitectura celular, etc., o a Ia disminución o desaparición de sus efectos secundarios.
El término "estatina", tal como aquí se utiliza, se refiere a un inhibidor de Ia enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A reductasa (HMGR), enzima que cataliza el paso limitante de Ia biosíntesis del colesterol, e incluye cualquier estatina tanto natural como sintética o semisintética. Algunas estatinas pueden presentarse en forma cerrada (lactona) o en forma abierta (hidroxiácido). Los hidroxiácidos (forma abierta) pueden prepararse a partir de las lactonas correspondientes por hidrólisis convencional, por ejemplo, con hidróxido sódico en metanol, hidróxido sódico en tetra h id rofu rano-agua y similares. En Ia forma abierta (hidroxiácido), las estatinas reaccionan para formar sales con cationes de metales y aminas, farmacéuticamente aceptables, formadas a partir de bases orgánicas o inorgánicas. Las sales farmacéuticamente aceptables de las estatinas pueden diferir de los ácidos libres correspondientes en algunas características físicas tales como solubilidad y punto de fusión, pero se consideran equivalentes a Ia forma de ácido libre para los fines de esta invención. La forma abierta (hidroxiácido) libre de las estatinas puede regenerarse a partir de Ia forma de sal, si se desea, poniendo en contacto Ia sal con una solución acuosa diluida de un ácido tal como ácido clorhídrico y similares. La forma cerrada (lactona) de las estatinas puede regenerarse por disolución de Ia forma abierta (hidroxiácido) en un disolvente inerte tal como, por ejemplo, tolueno, benceno, acetato de etilo y similares, a temperaturas comprendidas entre aproximadamente 00C y aproximadamente el punto de ebullición del disolvente, típicamente (aunque no necesariamente) con separación simultánea del agua resultante y catálisis con ácidos fuertes, e.g., ácido clorhídrico y similares. Asimismo, las estatinas pueden existir en forma solvatada o no solvatada y tales formas son equivalentes a Ia forma no solvatada para los fines de esta invención.
El término "cardioprotector", tal como aqu í se util iza, se refiere a cualquier sustancia capaz de producir Ia atenuación o desaparición de los efectos subyacentes a las enfermedades cardiovasculares o cardiopatías o del daño cardíaco mediante cualquier mecanismo conocido o por conocer, por ejemplo, necrosis, apoptosis, isquemia, arritmia, deposición de subproductos, pérdida de Ia arquitectura celular, etc., o a Ia disminución o desaparición de sus efectos secundarios.
El término "hipolipemiante", tal como aqu í se util iza, se refiere a cualquier sustancia farmacológicamente activa que tenga Ia propiedad de disminuir los niveles de lípidos en sangre o en otros tejidos. La importancia de estas sustancias viene dada porque el exceso de algunos tipos de lípidos (colesterol o triglicéridos) o de las lipoproteínas, es uno de los principales factores de riesgo para las enfermedades cardiovasculares.
El término "hipocolesterolémico", tal como aquí se utiliza, se refiere a cualquier sustancia farmacológicamente activa que tenga Ia propiedad de disminuir los niveles de colesterol en sangre o en otros tejidos.
El término "hipotrigliceridémico", tal como aquí se utiliza, se refiere a cualquier sustancia farmacológicamente activa que tenga Ia propiedad de disminuir los niveles de triglicéridos en sangre o en otros tejidos. El término "antiepiléptico o anticonvulsivante", tal como aquí se utiliza, se refiere a Ia atenuación de las crisis epilépticas o convulsivas, por ejemplo, en Ia duración y/o en Ia intensidad, o a Ia desaparición de las crisis epilépticas o convulsivas, o a Ia disminución o desaparición de sus efectos secundarios.
El término "bioseguro" tal como aquí se utiliza, se refiere a ausencia de efectos tóxicos, generación de tumores, alteraciones en el desarrollo embrionario (teratogénesis) u otros efectos adversos.
El término "enfermedad neurodegenerativa", tal como aquí se utiliza, incluye enfermedades que resultan de Ia degeneración o deterioro del tejido nervioso, en particular de las neuronas, que conduce, a Io largo del tiempo, a una disfunción o a una incapacidad; el término degeneración incluye pérdida de Ia viabilidad celular, pérdida de Ia función celular y/o pérdida del número de células (neuronas u otras). Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de enfermedades neurodegenerativas incluyen enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), esclerosis múltiple, etc. En una realización particular, dicha enfermedad neurodegenerativa es una enfermedad relacionada con Ia muerte neuronal causada por una sustancia que, por ejemplo, causa estrés oxidativo o estrés de retículo endoplásmico o apoptosis o excitotoxicidad o muerte neuronal en general.
El término "enfermedad asociada con una oxidación indeseada", tal como aquí se utiliza, se refiere a una enfermedad causada por una oxidación indeseada (e.g., excesiva) o en el que dicha oxidación indeseada es un síntoma. Dicha oxidación indeseada puede ser Ia consecuencia del daño causado por radicales libres a proteínas, DNA y/o lípidos independientemente del radical libre específico implicado o de Ia diana. La oxidación indeseada implica una generación excesiva de radicales libres que puede causar una disfunción en células, tejidos u órganos y puede constituir, por tanto, un mecanismo potencial de una enfermedad. En una realización particular, dicha oxidación indeseada puede ser causada por Ia edad (envejecimiento) o por un proceso neurodegenerativo y puede provocar por sí sola o en combinación con otros factores el comienzo de diversas enfermedades. En una realización concreta, dicha oxidación indeseada se relaciona con el daño oxidativo causado por una sustancia que causa estrés oxidativo.
El término "proceso patológico asociado a Ia edad", tal como aquí se utiliza, se refiere a cualquier evento o combinación de eventos relacionado/s con el envejecimiento que produzca/n pérdida de viabilidad celular del tejido nervioso o sensibilización celular del tejido nervioso, pérdida de Ia función celular y/o pérdida del número de células (neuronas u otras), incluyendo disfunción metabólica de las células, procesos de estrés, infecciones por patógenos, alteraciones genéticas, susceptibilidad genética, trauma, isquemia, epilepsia, etc. El término "enfermedad cardiovascular", tal como aquí se utiliza, se refiere a cualquier enfermedad o disfunción o alteración del corazón o del resto del sistema cardiovascular o de Ia sangre.
El término "epilepsia", tal como aquí se utiliza, se refiere a un síndrome cerebral crónico de causas diversas, caracterizada por crisis recurrentes debidas a unas descargas excesivas hipersincrónicas de impulsos nerviosos por las neuronas cerebrales, asociadas eventual mente con d iversas manifestaciones clínicas y parad ínicas. Las crisis pueden ser convulsivas o no convulsivas. La epilepsia puede tener muchas causas; en unos casos puede ser debida a lesiones cerebrales de distintos tipos (e.g., traumatismos craneales, secuelas de meningitis, tumores, etc.); en otros casos no hay ninguna lesión sino una predisposición de origen genético a padecer Ia crisis; en otros casos, Ia etiología de Ia epilepsia puede ser ambiental, por tratamientos farmacológicos, por excitotoxicidad, trauma, procesos de estrés, envejecimiento, problemas del desarrollo, enfermedades neurológicas, crisis psicológicas, problemas en Ia gestación, problemas en el parto, etc.
El término "epiléptico o convulsivante", tal como aquí se utiliza, se refiere a cualquier crisis epiléptica o convulsión de cualquier etiología, por ejemplo, genética, ambiental, por tratamientos farmacológicos, por excitotoxicidad, por trauma, por procesos de estrés, por envejecimiento, por problemas del desarrollo, por enfermedades neurológicas, por crisis psicológicas, por problemas en Ia gestación, por problemas en el parto, etc. Una crisis epiléptica ocurre cuando una actividad anormal eléctrica en el cerebro causa un cambio involuntario de movimiento o función del cuerpo, de sensación, en Ia capacidad de estar alerta o de comportamiento, y pueden ser parciales o generalizadas (convulsivas o no-convulsivas).
El término "deterioro cognitivo", tal como aquí se utiliza, se refiere a Ia pérdida o alteración de las funciones mentales, tales como memoria, orientación, lenguaje, reconocimiento visual o conducta que interfieren con Ia actividad e interacción social de Ia persona afectada de forma persistente en el tiempo
El término "infecciones fúngicas o víricas", tal como aquí se utiliza, se refiere a cualquier colonización de un virus u hongo microscópico que resulta perjudicial para el funcionamiento normal o para Ia supervivencia del organismo colonizado o huésped.
El término "sujeto", tal como aquí se utiliza, se refiere a un miembro de una especie de mamífero, e incluye, pero no se limita a, animales domésticos, primates y humanos; preferentemente, el sujeto es un ser humano, masculino o femenino, de cualquier edad o raza. En una realización particular, dicho sujeto es un mamífero que padece, o es susceptible de padecer, procesos patológicos asociados a Ia edad, tal como envejecimiento, o una enfermedad neurodegenerativa, tal como una enfermedad neurodegenerativa crónica. El término "farmacéuticamente aceptable", tal como aquí se utiliza, se refiere a que el compuesto es tolerable fisiológicamente y no produce, en general, una reacción alérgica o una reacción desfavorable similar, tal como un trastorno gástrico, mareo o similares, cuando se administra a un sujeto; preferiblemente, dicho término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora de un gobierno o recogido en Ia farmacopea estadounidense o en otra farmacopea reconocida generalmente para uso en animales (e.g., farmacopea europea, etc.).
El término "sal farmacéuticamente aceptable", tal como aquí se utiliza, incluye "sales metálicas farmacéuticamente aceptables" así como "sales de a m i n a fa rm acéutica m ente acepta bl es" . E l térm i no "sa l m etá l ica farmacéuticamente aceptable" contempla sales formadas con iones de sodio, potasio, calcio, magnesio, aluminio, hierro o zinc. El término "sal de amina farmacéuticamente aceptable" contempla sales con amoníaco y bases nitrogenadas orgánicas suficientemente fuertes para formar sales con ácidos carboxílicos. Dichas sales farmacéuticamente aceptables pueden ser obtenidas por métodos convencionales conocidos por los expertos en Ia materia.
El compuesto 2-etil-butirato de (1 S,2S,6R,8S,8aR)-1 ,2,6,7,8,8a- hexahidro-aj-dimetil-β-p-^R^R^-tetrahidro^-hidroxi-e-oxo^H-piran^-illetil]- 1 -naftalenilo puede ser obtenido por métodos de semisíntesis, tal como se describe para otros compuestos de Ia misma familia en Ia patente norteamericana US 4866090.
Numerosos ensayos realizados por los inventores han puesto de manifiesto el efecto neuroprotector del compuesto NST0037 frente a Ia acción de u na sustancia causante de estrés oxidativo, as í como su efecto neuroprotector frente a Ia acción de una sustancia causante de estrés de retículo endoplásmico, y su efecto neuroprotector frente a Ia acción de una sustancia causante de apoptosis en neuronas humanas colinérgicas, así como su efecto neuroprotector frente a una sustancia que causa excitotoxicidad, daño oxidativo, apoptosis, atrofia del hipocampo, muerte neuronal, deterioro cognitivo, pérdida de memoria temporal, pérdida de memoria espacial, etc.
El efecto neuroprotector frente a Ia acción de una sustancia causante de estrés oxidativo, tal como xantina/xantina oxidasa (XXO) se describe en el Ejemplo 2. En dicho ejemplo se observa que el compuesto NST0037, es capaz de reducir cuantitativamente y de forma significativa Ia muerte neuronal causada por estrés oxidativo, Io que pone de man ifiesto Ia capacidad neuroprotectora de este compuesto (Figura 1 ). Con el objetivo de definir mejor el efecto neuroprotector del compuesto, los inventores analizaron con más detalle el proceso neurodegenerativo mediante el análisis de Ia muerte neuronal causada por Ia acción de una sustancia causante de estrés de retículo endoplásmico (tunicamicina), determinando que el compuesto NST0037 es capaz de reducir cuantitativamente y de forma significativa Ia muerte neuronal causada por estrés de retículo endoplásmico, Io que pone de manifiesto Ia capacidad neuroprotectora de dicho compuesto (Figura 2). Con el objetivo de definir mejor el efecto neuroprotector del compuesto, los inventores analizaron con más detalle el proceso neurodegenerativo mediante el análisis de Ia muerte neuronal causada por Ia acción de una sustancia causante de apoptosis (camptotecina), determinando que el compuesto NST0037 es capaz de reducir cuantitativamente y de forma significativa Ia muerte neuronal causada por apoptosis, Io que pone de manifiesto Ia capacidad neuroprotectora de dicho compuesto (Figura 3). Asimismo, con el objetivo de definir mejor el efecto neuroprotector de dicho compuesto, los inventores analizaron con más detalle el proceso neurodegenerativo mediante el análisis por citometría de flujo de Ia muerte neuronal causada por apoptosis y su inhibición por dicho compuesto, en comparación con un inhibidor específico de Ia muerte neuronal por apoptosis, el Z-VAD-fmk, determinando que el compuesto NST0037 es capaz de inhibir cuantitativamente y de forma significativa Ia muerte neuronal causada por apoptosis y que este efecto neuroprotector se potencia con el pretratamiento del compuesto NST0037 y que es parcialmente dependiente de Ia biosíntesis de colesterol (Figura 4).
Con el objetivo de definir mejor el efecto neuroprotector del compuesto, los inventores analizaron con más detalle el proceso neurodegenerativo mediante el análisis de Ia muerte neuronal causada por una sustancia excitotóxica (el kainato) en las neuronas del hipocampo de ratones, tal como se describe en el Ejemplo 3. En dicho ejemplo se observa que el compuesto NST0037 es capaz de reducir cuantitativamente y de forma significativa Ia muerte neuronal causada por una sustancia excitotóxica, Io que pone de manifiesto Ia capacidad neuroprotectora de dicho compuesto (Figura 5). En dicha gráfica se demuestra que el tratamiento con NST0037 administrado antes y después, o solamente después, de Ia administración del kainato produce Ia protección de las neuronas del hipocampo inhibiendo Ia muerte neuronal en las zonas CA1 y CA2. Por el contrario, Ia administración del compuesto NST0037 por sí solo no produce ningún cambio histopatológico destacable, no mostrando diferencias apreciables con el grupo control. Asimismo, como es conocido, Ia muerte de neuronas del hipocampo induce, en algunos casos, el deterioro cognitivo del animal viéndose afectados los procesos de memoria; por este motivo, los inventores analizaron si el efecto neuroprotector del compuesto se veía acompañado de una reducción de Ia pérdida de memoria temporal y espacial producida por una sustancia excitotóxica. En los resultados obtenidos sobre Ia memoria temporal (Figura 6), se demuestra que el tratamiento con NST0037 administrado antes y después, o solamente después, de Ia administración del kainato produce Ia protección de Ia pérdida de este tipo de memoria. En los resultados obtenidos sobre Ia memoria espacial (Figura 7), se demuestra que el tratamiento con NST0037 administrado antes y después, o solamente después, de Ia administración del kainato produce Ia protección de Ia pérdida de este tipo de memoria. Por el contrario, Ia administración del compuesto NST0037 por sí solo no produce ningún cambio destacable sobre el estado cognitivo de los animales, no mostrando diferencias apreciables con el grupo control. Asimismo, como es conocido, Ia administración de una sustancia excitotóxica y Ia muerte neuronal induce, en algunos casos, Ia muerte del animal; por este motivo, los inventores analizaron si el efecto neuroprotector del compuesto NST0037 se veía acompañado de una reducción de Ia mortalidad producida por una sustancia excitotóxica. En los resultados obtenidos (Figura 8), se demuestra que el tratamiento con NST0037 administrado antes y después, o solamente después, de Ia administración del kainato produce un mayor índice de supervivencia, Io que indica que el tratamiento con dicho compuesto protege a los animales de Ia muerte y del resto de efectos orgánicos producidos por una sustancia excitotóxica. Por el contrario, Ia administración del compuesto NST0037 por sí solo no produce ninguna variación destacable sobre el índice de supervivencia de los animales, no mostrando diferencias apreciables con el grupo control.
Asimismo, como es conocido, Ia administración de una sustancia excitotóxica induce, en algunos casos, crisis convulsivas y epilepsia en el animal; por este motivo, los inventores analizaron si el efecto neuroprotector del compuesto NST0037 se veía acompañado de un efecto antiepiléptico y anticonvulsivante producido por una sustancia excitotóxica (Ejemplo 4), observándose que Ia administración de NST0037 retrasaba el tiempo de aparición de Ia primera convulsión (latencia) (Figura 9), produciendo además una disminución en Ia gravedad y Ia duración de los síntomas epilépticos (Figura 10), Io que demuestra el efecto antiepiléptico o anticonvulsivante del compuesto NST0037.
Además, y debido a Ia naturaleza del compuesto NST0037, se estudió Ia capacidad inhibidora de Ia enzima 3-hidroxi-3-metilglutahl coenzima A reductasa (HMGR). Sorprendentemente, y tal como se muestra en el Ejemplo 5 los resultados demuestran que el compuesto NST0037 presenta un efecto hipocolesterolémico evidente. En los resultados obtenidos y tal como muestra Ia Figura 11 , se puede apreciar que Ia actividad inhibitoria de Ia enzima HMGR por parte del compuesto NST0037 está dentro del rango de dos de las estatinas comerciales (atorvastatina y simvastatina) usadas habitualmente para disminuir los niveles de colesterol en Ia población humana. Aquí se demuestra que el compuesto NST0037 ejerce un efecto inhibitorio de dicha enzima muy similar a Ia estatina con mayor actividad demostrada (Ia atorvastatina), e inhibe 7,5 veces más Ia enzima HMGR que Ia estatina más segura (Ia simvastatina). Con el objetivo de definir mejor el efecto hipocolesterolémico del compuesto, los inventores ana l iza ron con más deta l l e I a actividad hipocolesterolémica mediante el análisis de las variaciones de las fracciones de colesterol en el plasma de ratones con hipercolesterolemia endógena, tal como se describe en el Ejemplo 5. Para ello, se comparó el efecto del compuesto NST0037 y de Ia simvastatina en dos grupos de ratones, determinándose los niveles de colesterol total tras Ia administración de los compuestos (Figura 12), donde se observó, de forma sorprendente, que ambos compuestos producían un efecto hipocolesterolémico similar. Con el objetivo de definir mejor el efecto hipocolesterolémico del compuesto, se analizaron los niveles de colesterol en las fracciones de LDL, HDL y VLDL, determinándose que ambos compuestos disminuyen de forma similar los niveles de colesterol en las fracciones LDL y VLDL, pero no en las HDL (Figura 13 a 15), Io que demuestra un efecto hipocolesterolémico y cardioprotector. Con el objetivo de definir mejor el efecto hipocolesterolémico del compuesto, se analizaron los niveles de colesterol libre y esterificado, determinándose que ambos compuestos disminuyen de forma similar los niveles de colesterol esterificado, pero no libre (Figura 16 a 17), Io que demuestra un efecto hipocolesterolémico y cardioprotector. Con el objetivo de definir mejor el efecto hipocolesterolémico del compuesto, los inventores ana l iza ron con más deta l l e I a actividad hipocolesterolémica mediante el análisis de las variaciones de las fracciones de colesterol en el plasma de ratones con hipercolesterolemia inducida, tal como se describe en el Ejemplo 6. Para ello, se comparó el efecto del compuesto NST0037 y de Ia simvastatina en dos grupos de ratones, determinándose los niveles de colesterol total tras Ia administración de los compuestos (Figura 18), donde se observó, de forma sorprendente, que el compuesto NST0037 presentaba un mayor efecto hipocolesterolémico que Ia simvastatina. Con el objetivo de definir mejor el efecto hipocolesterolémico del compuesto, se analizaron los niveles de colesterol en las fracciones de LDL, HDL y VLDL, determinándose que el compuesto NST0037 disminuye más eficientemente los niveles de colesterol en Ia fracción LDL que Ia simvastatina, no alterando los niveles de colesterol ni en las fracciones HDL (al igual que Ia simvastatina) ni en las VLDL (al contrario que Ia simvastatina) (Figuras 19 a 21 ), Io que demuestra un efecto hipocolesterolémico y cardioprotector. Con el objetivo de definir mejor el efecto hipocolesterolémico del compuesto, se analizaron los niveles de colesterol libre y esterificado, determinándose que en ambos casos el NST0037 disminuye de forma más eficiente que Ia simvastatina ambas fracciones de colesterol (Figura 22 y 23), Io que demuestra un efecto hipocolesterolémico y cardioprotector.
Para que un compuesto pueda ser administrado a Ia población humana, es necesario que se demuestre su inocuidad y seguridad. Con este objetivo, los inventores analizaron Ia bioseguridad del compuesto NST0037 en un modelo toxicológico ampliamente utilizado, el embrión de pez cebra, siguiendo Ia metodología descrita en el protocolo C15 de Ia OECD, tal como se describe en el Ejemplo 7. En este modelo, los inventores compararon el efecto del compuesto en comparación con Ia simvastatina en concentraciones superiores a las dosis utilizadas en Ia clínica, con el objetivo de causar daños evidentes en los embriones para poder definir mejor los efectos adversos de dicho compuesto. Así Ia administración de una alta dosis de NST0037 provocó Ia mortalidad de todos los embriones del ensayo, al igual que ocurrió con Ia misma dosis de simvastatina, aunque ésta resultó más tóxica, ya que Ia disminución del índice de supervivencia comenzó antes en el tiempo (Figura 24). Cuando se utilizó una dosis 10 veces menor, Ia simvastatina produjo una disminución significativa del índice de supervivencia en comparación con los controles, mientras el NST0037 no produjo una disminución estadísticamente significativa de Ia supervivencia de los embriones, indicando su mayor seguridad (Figura 25). Con el objetivo de definir mejor Ia bioseguridad del compuesto, se estudiaron las dosis letales 50 (LD50) en diferentes puntos temporales con tratamientos de NST0037 o de simvastatina en método sem iestático, observándose que en todos los tiempos las LD5O de Ia simvastatina eran menores que las de NST0037, Io que indica una mayor bioseguridad de este último compuesto (Figura 26). Con el objetivo de definir mejor Ia bioseguridad del compuesto, se estudió el porcentaje de larvas sanas al final del experimento en comparación con Ia simvastatina, observándose un mayor número de larvas sanas en los tratamientos con NST0037 en comparación con Ia simvastatina (Figura 27). Con el objetivo de definir mejor Ia bioseguridad del compuesto, se estudió el porcentaje de larvas con deformidades o de aspecto anómalo con el tiempo en comparación con Ia simvastatina, observándose un menor número de larvas con deformidades o de aspecto anómalo en los tratamientos con NST0037 en comparación con Ia simvastatina (Figura 28). Con el objetivo de definir mejor Ia bioseguridad del compuesto, se estudió el porcentaje de latidos cardíacos en función de Ia dosis utilizada comparando NST0037 con Ia simvastatina, observándose una mayor disminución del ritmo cardíaco en Ia mayor dosis evaluada de simvastatina que en Ia de NST0037, mientras que a dosis menores solamente Ia simvastatina produjo una disminución estadísticamente significativa del ritmo cardíaco (Figura 29), Io que indica una mayor bioseguridad del compuesto NST0037.
También se estudió Ia actividad antifúngica del compuesto NST0037 mediante bioensayo frente a estatinas (lovastatina, atorvastatina y simvastatina). Los resultados obtenidos mostraron que el compuesto NST0037 fue el único capaz de producir halos de inhibición en todo el rango de concentraciones ensayadas, incluso a las más bajas (Figura 30), Io que indica una mayor actividad antifúngica.
Por otra parte, se estudió Ia capacidad del compuesto NST0037 para incrementar Ia expresión del gen seladin-1/DHCR24, ya que se han demostrado los efectos neuroprotectores del aumento de expresión de este gen frente a Ia enfermedad de Alzheimer (Cechi et al., J. CeII. Mol. Med. 2008; 12: 1990-2002). Se ha descrito (Greeve et al., J. Neurosci. 2000; 20: 7345-52) que el producto del gen seladin-1/DHCR24 ejerce su poder neuroprotector mediante el efecto antiapoptótico por inhibición de Ia caspasa-3, y regulando Ia síntesis de colesterol a partir de desmosterol, Io que determina Ia generación de una barrera contra las agresiones neurotóxicas y previene Ia producción de β-amiloide. Estos mecanismos de acción indican que el aumento de Ia expresión del gen seladin-1/DHCR24 tiene un efecto neuroprotector general, con Io que aquellos fármacos que producen un aumento de Ia expresión de este gen pueden ser potencialmente utilizados en Ia prevención y/o tratamiento de Ia muerte neuronal asociada a enfermedades neurodegenerativas (e.g., Alzheimer, Parkinson, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, status epilepticus, Huntington, etc.) o de enfermedades asociadas con una oxidación indeseada o de procesos patológicos asociados a Ia edad. La capacidad de aumentar Ia expresión del gen seladin-1/DHCR24 mediante Ia administración de NST0037 se describe en el Ejemplo 9, en comparación con Ia memantina (uno de los fármacos utilizados habitualmente para tratar Ia EA). En dicho ejemplo se observa que el compuesto NST0037 es capaz de aumentar cuantitativamente, de forma significativa y dosis-dependiente Ia expresión del gen seladin-1/DHCR24, Io cual se demuestra mediante el análisis de Ia expresión relativa usando PCR cuantitativa a tiempo real. Dichos resultados ponen de manifiesto Ia capacidad neuroprotectora del compuesto NST0037 (Figura 31 ). Adicionalmente, el aumento de Ia expresión del gen seladin- 1/DHCR24 y el incremento en Ia cantidad de Ia proteína codificada por este gen han sido corroborados en un estudio paralelo utilizando Ia simvastatina. Los resultados indican que también esta estatina es capaz de aumentar Ia expresión de este gen, expl icando así su capacidad n euro protectora, e indicando que se trata de un mecanismo general de Ia familia de las estatinas que son capaces de aumentar Ia expresión del gen seladin-1/DHCR24.
Adicionalmente se estudió el efecto neuroprotector en cultivos neuronales humanos del compuesto NST0037 frente a agresiones que mimetizan algunas de las enfermedades neurodegenerativas, como Ia EA mediante Ia inhibición de Ia proteín fosfatasa 1 (Figura 32) o de Ia enfermedad de Huntington mediante Ia inhibición de Ia succinato deshidrogenasa (Figura 33). Además se estudió el efecto sobre Ia modulación de las caspasas efectoras 3/7, determinándose que el compuesto NST0037 previene Ia activación de las mismas, y que este efecto está relacionado con Ia ruta de biosíntesis de colesterol (Figura 34). Además, se determinó que el compuesto NST0037 es capaz de reducir los niveles de Aβ(1 -40) y Aβ(1 -42) en un modelo celular neuronal humano que sobreexpresa Ia proteína APP (Figura 35). Además se determinó que el efecto neuroprotector del NST0037 frente a Ia muerte causada por estrés oxidativo es modulado por el mevalonato, el cual es un precursor de Ia ruta de biosíntesis del colesterol y el producto de Ia reacción enzimática que cataliza Ia enzima HMG-CoA Reductasa (Figura 36).
Con el objetivo de definir mejor el efecto neuroprotector del compuesto, los inventores analizaron con más detalle el proceso neurodegenerativo mediante el análisis de las huellas histopatológicas asociadas a Ia muerte neuronal causada por una sustancia excitotóxica (el kainato) en las neuronas del hipocampo de ratones, tal como se describe en el Ejemplo 15. En dicho ejemplo se observa que el compuesto NST0037 es capaz de prevenir o mejorar Ia distrofia neurítica (Figura 37), así como del daño oxidativo, de Ia apoptosis y de Ia astrogliosis (Figura 38) causada por Ia administración de una sustancia excitotóxica.
Con el objetivo de definir mejor el efecto neuroprotector del compuesto, los inventores analizaron el potencial efecto terapéutico del tratamiento con NST0037 en un modelo agudo de enfermedad de Parkinson en ratón tal como se describe en el Ejemplo 16. Para ello, y tras Ia administración aguda de una neurotoxina parkinsoniana específica de las neuronas dopaminérgicas (MPTP), se observó que el NST0037 era capaz de modificar los efectos deletéreos causados por Ia neurotoxina como Ia mortalidad (Figura 39), el déficit locomotor en relación a los parámetros de resistencia (Figura 40) y fuerza (Figura 41 ), Ia neurodegeneración (Figura 42) además de Ia pérdida de neuronas dopaminérgicas (Figura 43) en regiones implicadas en Ia enfermedad de Parkinson como Ia sustancia nigra o el estriado. Con el objetivo de definir mejor el efecto neuroprotector del compuesto, los inventores analizaron el potencial efecto terapéutico del tratamiento con NST0037 en un modelo subcrónico de enfermedad de Parkinson en ratón tal como se describe en el Ejemplo 17. Para ello, y tras Ia administración subcrónica de una neurotoxina parkinsoniana específica de las neuronas dopaminérgicas (MPTP), se observó que el NST0037 era capaz de modificar los efectos deletéreos causados por Ia neurotoxina como el déficit locomotor en relación a Ia resistencia motora (Figura 44), Ia muerte neuronal o del daño oxidativo asociado a Ia peroxidación lipídica (Figura 45) en Ia sustancia nigra. Con el objetivo de definir mejor el paso de barrera hematoencefálica del compuesto NST0037, los inventores analizaron diferentes parámetros como Ia lipofilicidad teórica, el porcentaje de paso y Ia permeabilidad efectiva (Figura 46, Tabla I) tal como se describe en el Ejemplo 18.
Con el objetivo de definir mejor el efecto hipocolesterolémico del compuesto, los inventores analizaron con más detalle Ia actividad hipocolesterolémica mediante el análisis de las reducciones de colesterol en dos líneas celulares humanas de origen hepático y neuronal (Figura 47), tal como se describe en el Ejemplo 19. Además, el tratamiento durante 28 días del compuesto NST0037 de forma oral en ratones con hiperlipidemia familiar produjo una disminución de los niveles de colesterol total, ApoB, c-LDL, c- VLDL, c-HDL (Figura 48), colesterol libre y esterificado (Figura 49) y del estado de oxidación plasmático (Figura 50), tal como se describe en el Ejemplo 20. Además, el tratamiento durante 3 meses del compuesto NST0037 de forma oral en ratones con hiperlipidemia familiar produjo una disminución de los niveles de colesterol total, c-LDL y de aumento de c-HDL (Figura 51 ), y una disminución de los niveles de colesterol libre y esterificado (Figura 52), tal como se describe en el Ejemplo 21.
Con el objetivo de definir mejor el efecto hipocolesterolémico del compuesto, los inventores analizaron con más detalle Ia actividad hipocolesterolémica mediante reducciones de colesterol y de las fracciones asociadas (Figura 53), de triglicéridos (Figura 54), y del estado redox plasmático en ratas Zucker con hiperlipidemia endógena (Figura 55), tal como se describe en el Ejemplo 22. Con el objetivo de definir mejor Ia modulación del gen seladin-1/DHCR24 por el compuesto NST0037, los inventores analizaron su regulación en el cerebro de ratones tratados oralmente con NST0037 (Figura 56) tal como se describe en el Ejemplo 18, demostrando que a las 4h de Ia administración de NST0037 se produce un aumento de Ia expresión de este gen neuroprotector. Con el objetivo de definir mejor Ia inocuidad y seguridad del compuesto
NST0037 y para corroborar los estudios realizados en el Ejemplo 7 con embriones de pez cebra, los inventores decidieron analizar Ia bioseguridad del compuesto NST0037 en larvas tal como se describe en el Ejemplo 24. En este modelo, los inventores compararon el efecto del compuesto en comparación con Ia simvastatina realizando curvas crecientes de concentraciones, que revelaron una alta seguridad del compuesto ya que no se produjo mortalidad alguna con ninguno de los dos tratamientos (Tabla II), y donde Ia simvastatina produjo un menor porcentaje de larvas sanas que el NST0037 (Figura 57) y un mayor porcentaje de larvas con aspecto anómalo (Figura 58). Con el objetivo de definir mejor Ia inocuidad y seguridad del compuesto
NST0037 y para corroborar los estudios realizados en ejemplos previos, los inventores decidieron analizar Ia bioseguridad del NST0037 tras tratamiento en peces adultos en comparación con Ia simvastatina, tal como se describe en el Ejemplo 25. Los resultados indicaron que mientras Ia simvastatina produce una pérdida significativa de peso en los animales, el NST0037 no varía significativamente dicho parámetro (Figura 59). Además, mientras Ia simvastatina produjo variaciones histopatológicas en los animales tratados, el NST0037 produjo menos efectos deletéreos (Figura 60). Con el objetivo de definir mejor Ia inocuidad y seguridad del compuesto NST0037 y para corroborar los estudios realizados en ejemplos previos, los inventores decidieron analizar Ia bioseguridad del NST0037 tras tratamiento en peces adultos en comparación con Ia simvastatina, tal como se describe en el Ejemplo 26. Los resultados indicaron que mientras Ia simvastatina produce una mortalidad significativa a los 4 días de tratamiento, Ia mortalidad asociada al NST0037 fue residual (Tabla III). Además, mientras Ia simvastatina produjo variaciones histopatológicas claras en el ovario de los animales tratados con 100 mg/Kg, el NST0037 no produjo ningún efecto deletéreo a esta dosis (Figura 63).
La composición farmacéutica proporcionada por esta invención puede contener el compuesto NST0037, y/o su forma hidroxiácida y/o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho hidroxiácido y/o una prodroga o solvato farmacéuticamente aceptable del compuesto o de su forma hidroxiácida junto con u no o más adyuvantes, vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.
El término "sal, prodroga o solvato" farmacéuticamente aceptable se refiere a cualquier sal, solvato farmacéuticamente aceptable o cualquier otro compuesto que, en su administración al receptor, es capaz de proporcionar (de forma directa o indirecta) un compuesto tal y como se ha descrito en Ia presente invención. No obstante, las sales farmacéuticamente inaceptables también caen dentro del alcance de Ia invención, ya que éstas pueden ser útiles para Ia preparación de sales farmacéuticamente aceptables. La preparación de sales y prodrogas puede ser llevada a cabo mediante métodos conocidos en el estado de Ia técnica.
Cualquier compuesto que es una prodroga del compuesto de fórmula (I) o de su forma hidroxiácida está dentro del alcance de Ia invención. El término "prodroga" se utiliza en su significado más amplio y abarca aquellos derivados que son convertidos in vivo a los compuestos de Ia invención. Tales derivados serían evidentes para un experto medio en Ia materia e incluyen los siguientes derivados de los presentes compuestos: esteres, esteres de aminoácidos, esteres de fosfatos, esteres de sales sulfonato de metales, carbamatos y amidas. Los compuestos según Ia invención pueden estar en forma cristalina, bien como compuestos libres o como solvatos (por ejemplo, hidratos) y se pretende que ambas formas estén dentro del alcance de Ia presente invención. Los métodos de solvatación en general son conocidos en el estado de Ia técnica. En una realización particular el solvato es un hidrato. Las composiciones farmacéuticas que contienen el compuesto
NST0037, o una forma hidroxiácido del mismo o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho hidroxiácido, pueden formularse en cualquier forma farmacéutica de administración adecuada para su administración por Ia vía de administración elegida, e.g., oral, parenteral (subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, etc.), tópica, rectal, etc. A modo ilustrativo, no limitativo, las composiciones farmacéuticas proporcionadas por esta invención pueden formularse en una forma farmacéutica sólida de administración por vía oral (e.g., granulos, comprimidos, cápsulas, etc.), en una forma farmacéutica l íquida de administración por vía oral (e.g ., soluciones, suspensiones, emulsiones, etc.), en una forma farmacéutica para su administración por vía parenteral (e.g., soluciones, suspensiones, emulsiones, etc.). Para ello, en cada caso, se elegirán los vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables apropiados para Ia forma farmacéutica de administración y vía de administración elegida, por ejemplo, aglutinantes, diluyentes, desintegrantes, lubrificantes, humectantes, etc., para Ia formulación de formas farmacéuticas de administración sólidas, y tampones, tensioactivos, etc., para Ia formulación de formas farmacéuticas de administración l íquidas. Dichos vehículos y excipientes deben ser farmacéuticamente aceptables y farmacológicamente tolerables y han de poder ser combinados con otros componentes de Ia formulación sin ejercer ningún efecto adverso sobre el sujeto tratado. Información sobre dichos vehículos y excipientes, así como sobre dichas formas farmacéuticas de administración de dicho principio activo puede encontrarse en tratados de farmacia galénica. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de fármacos, en general, y de sus procedimientos de preparación puede encontrarse en el libro "Tratado de Farmacia Galénica", de C. Faulí i Trillo, 1 a Edición, 1993, Luzán 5, S. A. de Ediciones. La composición farmacéutica proporcionada por esta invención comprende, el compuesto NST0037, o una forma hidroxiácido del mismo o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho hidroxiácido, en una cantidad terapéuticamente eficiente. En el sentido utilizado en esta descripción, Ia expresión "cantidad terapéuticamente eficiente" se refiere a Ia cantidad de compuesto calculada para producir el efecto deseado. La dosis del compuesto NST0037, o una forma hidroxiácido del mismo o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho hidroxiácido, a administrar a un sujeto puede variar dentro de un amplio intervalo dependiendo de numerosos factores, entre los que se incluyen las características del compuesto utilizado, e.g., su actividad y vida med ia biológ ica , Ia concentración del compuesto en Ia composición farmacéutica, Ia situación clínica del sujeto, Ia severidad de Ia patología, Ia forma farmacéutica de administración elegida, etc. La composición farmacéutica proporcionada por esta invención se puede administrar una o más veces al día con fines preventivos o terapéuticos o, alternativamente, se pueden seguir otras pautas de administración, no necesariamente diaria sino también de forma puntual, semanal, etc.
La composición farmacéutica proporcionada por esta invención, si se desea, puede usarse junto con otros fármacos, por ejemplo, fármacos útiles en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, deterioro cognitivo, enfermedades asociadas con una oxidación indeseada, procesos patológicos asociados a Ia edad y progeria, epilepsia, crisis epilépticas, convulsiones, enfermedades cardiovasculares, o infecciones fúngicas o víricas con el fin de aumentar Ia eficiencia de Ia composición farmacéutica proporcionada por esta invención, generándose de este modo una terapia de combinación. Dichos fármacos ad icionales pueden formar parte de Ia misma composición farmacéutica o, alternativamente, pueden facilitarse como una composición farmacéutica separada para su administración al mismo tiempo (administración simultánea) que Ia composición farmacéutica proporcionada por esta invención o en momentos diferentes (administración secuencial) respecto a Ia administración de Ia composición farmacéutica proporcionada por esta invención. Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar Ia invención y no deben ser considerados en sentido limitativo de Ia misma.
EJEMPLO 1 Síntesis de 2-etil-butirato de (1S,2S,6R,8S,8aR)-1,2,6J,8,8a-hexahidro-3J- d¡met¡l-8-r2-r(2R,4R)-tetrah¡dro-4-h¡drox¡-6-oxo-2H-piran-2-¡llet¡ll-1- naftalenilo
El compuesto identificado como NST0037 se preparó siguiendo Ia metodología descrita en Hoffman, et al. {J. Med. Chem., 1986, 29, 849-852) para compuestos similares.
1.1. Purificación de lovastatina
Partiendo de un extracto de procedencia natural, Ia lovastatina se purificó por cromatografía en columna utilizando como eluyente un gradiente de hexano y acetato de etilo.
1.2. Obtención de monacolina J
Figure imgf000042_0001
Se prepara una disolución de 0,7 g de hidróxido potásico en 0.5 mi de agua y se añade poco a poco 3 mi de metanol. Posteriormente, se añaden 0.5 g de Lovastatina y se pone Ia disolución a reflujo durante 21 horas. Después del tratamiento de Ia reacción se obtiene una mezcla al 50% de monacolina J y producto de apertura. 1.3. Preparación del derivado protegido
Figure imgf000043_0001
Se prepara una disolución de 0,5 g de Monacolina J en 10 mi de diclorometano. Se añaden 0,4345 g de imidazol y se agita hasta disolución. A continuación se añade 0,4835 g de cloruro de terc-butil-dimetilsilano disueltos en 5 mi de diclorometano, y se continúa Ia agitación durante 24 horas. Se sigue Ia reacción por TLC utilizando como eluyente diclorometano-metanol (10:1 ). Rendimiento: 96 %.
1.4. Preparación del derivado adiado
Figure imgf000043_0002
En un matraz con atmósfera inerte, se disuelven 0,3 g del derivado protegido obtenido previamente en 2 mi de piridina. Posteriormente, se añade 0,06 g de DMAP disuelta en 2 ml_ de piridina. Se coloca el matraz de reacción en baño de hielo y se añaden 0,378 mi del cloruro de 2-etilbutirilo. A continuación se agita durante una hora a 0o C y a temperatura ambiente durante 18 horas. Se sigue Ia reacción por TLC utilizando como eluyente hexano-acetato de etilo (2:1 ). Rendimiento 95%. 1.5. Síntesis del compuesto final
Figure imgf000043_0003
0,368g del derivado obtenido previamente se disuelven en 2 mi de THF. A continuación, se añade sobre el medio de reacción una disolución de 0,16 mi de ácido acético y 2,16 mi de fluoruro de tetrabutilamonio 1 M. La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 16 horas. Se sigue Ia reacción por TLC utilizando como eluyente diclorometano-acetona (6:1 ). Rendimiento 75 %.
EJEMPLO 2
Protección por NST0037 de Ia muerte neuronal inducida por diferentes agresiones: estrés oxidativo, estrés de retículo endoplásmico v apoptosis
2.1. Protección por NST0037 dé la muerte neuronal inducida por estrés oxidativo
El ensayo fue realizado sobre células en cultivo de neuroblastoma humano SK-N-MC procedentes de "American Type Culture Collection (ATCC)", en todos los casos se sigu ieron estrictas normas de esteril idad y Ia manipulación se llevó a cabo en cabinas de seguridad biológica clase Il que siguen Ia norma europea EN 12469. Las células fueron mantenidas en el sigu iente med io de cultivo: "Minimun Essential Méd ium Eagle" (MEM) suplementado con piruvato sódico 1 mM, L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, gentamicina 0,05 mg/ml y suero fetal bovino 10%.
Se analizó Ia inhibición producida por el compuesto NST0037 de Ia muerte celular causada por el tratamiento con xantina/xantina oxidasa que origina daño oxidativo (produce radicales libres como peróxido de hidrógeno, anión superóxido, radical hidroxilo) Io que desencadena muerte celular. Estas células, en pase no superior a 15, fueron sembradas sobre placas de 96 pocilios tratadas para células adherentes con una concentración celular de 5x104 células/pocilio; para cada condición del ensayo se sembraron 3 pocilios de Ia placa.
Tras 24 h de incubación de las células a 37 0C y 5% CO2 se procedió a los tratamientos celulares con 100 μl de volumen total para las condiciones siguientes: - Control: medio de cultivo (medio)
- Xantina/xantina oxidasa (XXO): medio más xantina 10 μM/ xantina oxidasa 60 mU/mL, que produce Ia muerte del 50% de las células. - XXO más NST0037: medio más XXO (10 μM / 60 mU/mL) más
NST0037 a 1 , 4, 10, 20, 40 ó 100 μM.
Las células fueron incubadas (a 370C y 5% CO2) con estos tratamientos durante 22 h, pasadas las cuales se añadió el reactivo WST-1 (Roche). El Test WST-1 se basa en Ia medida de Ia actividad metabólica. El daño celular produce Ia pérdida de Ia habilidad de las células de obtener Ia energ ía necesaria para mantener sus funciones metabólicas y el crecimiento celular, por Io que las células que metabólicamente activas (vivas) reducen Ia sal de tetrazolium a formazán mediante el sistema succinato-tetrazolium reductasa (de Ia cadena respiratoria mitocondhal). El formazán formado puede ser detectado colorimétricamente, ya que tiene una absorbancia de 440nm. A las 2 horas de añadido el reactivo se realizó Ia lectura en un lector de placas a 440 nm.
Los resultados obtenidos se muestran, como aparece en Ia Figura 1 , como el porcentaje de muerte celular para cada tratamiento referido a Ia muerte producida por Ia XXO. Se observó protección de Ia muerte desde 1 a 100 μM de NST0037, siendo las diferencias respecto a Ia XXO estad ísticamente significativas, según Ia f de Student, para todas las concentraciones evaluadas, alcanzando una máxima protección del 78% a 20 μM. Estos resultados indican que el compuesto NST0037 muestra un efecto protector de Ia muerte de células humanas de origen neuronal causada por estrés oxidativo.
2.2. Protección por NST0037 de Ia muerte neuronal inducida por estrés de retículo endoplásmico
El ensayo fue realizado sobre células en cultivo de neuroblastoma humano SK-N-MC procedentes de "American Type Culture Collection (ATCC)", en todos los casos se siguieron estrictas normas de esterilidad y Ia manipulación se llevó a cabo en cabinas de seguridad biológica clase Il que siguen Ia norma europea EN 12469. Las células fueron mantenidas en el siguiente medio de cultivo: "Minimun Essential Méd ium Eagle" (MEM) suplementado con piruvato sódico 1 mM, L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, gentamicina 0,05 mg/ml y suero fetal bovino 10%.
Se analizó Ia inhibición producida por el compuesto NST0037 de Ia muerte celular causada por el tratamiento con tunicamicina que origina estrés reticular. La tunicamicina es un inhibidor de Ia N-glicosilación de proteínas, Io que produce el plegam iento anormal de las prote ínas en el retículo endoplásmico, con Io que dichas proteínas se acumulan y producen estrés que desemboca en Ia muerte celular. Estas células, en pase no superior a 15, fueron sembradas sobre placas de 96 pocilios tratadas para células adherentes con una concentración celular de 5x104 células/pocilio; para cada condición del ensayo se sembraron 3 pocilios de Ia placa.
Tras 24 h de incubación de las células a 370C y 5% CO2 se procedió a los tratamientos celulares con 100 μl de volumen total para las condiciones siguientes:
- Control: medio de cultivo (medio)
- Tunicamicina (Tm): medio más tunicamicina 24 μM, que produce Ia muerte del 50% de las células.
- Tm más NST0037: medio más Tm (24 μM) más NST0037 a 1 , 4, 10, 40 ó 100 μM.
Las células fueron incubadas (a 370C y 5% CO2) con estos tratamientos durante 22 h, pasadas las cuales se añadió el reactivo WST-1 (Roche). El Test WST-1 se basa en Ia med ida de Ia actividad metabólica. El daño celular produce Ia pérdida de Ia habilidad de las células de obtener Ia energía necesaria para mantener sus funciones metabólicas y el crecimiento celular, por Io que las células metabólicamente activas (vivas) reducen Ia sal de tetrazolium a formazán mediante el sistema succinato-tetrazolium reductasa (de Ia cadena respiratoria mitocondrial). El formazán formado puede ser detectado colorimétricamente, ya que tiene una absorbancia de 440nm. A las 2 horas de añadido el reactivo se realizó Ia lectura en un lector de placas a 440 nm.
Los resultados obtenidos se muestran, como aparece en Ia Figura 2, como el porcentaje de muerte celular para cada tratamiento referido a Ia muerte producida por Ia Tm. Se observó protección de Ia muerte desde 1 a 100 μM de NST0037, alcanzando un 55% a 40 μM. Estos resultados indican que el compuesto NST0037 muestra un efecto protector de Ia muerte de células humanas de origen neuronal causada por estrés de retículo endoplásmico. 2.3. Protección por NST0037 de Ia muerte neuronal inducida por apoptosis El ensayo fue realizado sobre células en cultivo de neuroblastoma humano SK-N-MC procedentes de "American Type Culture Collection (ATCC)", en todos los casos se sigu ieron estrictas normas de esteril idad y Ia manipulación se llevó a cabo en cabinas de seguridad biológica clase Il que siguen Ia norma europea EN 12469. Las células fueron mantenidas en el siguiente medio de cultivo: "Minimun Essential Médium Eagle" (MEM) suplementado con piruvato sódico 1 mM, L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, gentamicina 0,05 mg/ml y suero fetal bovino 10%.
Se analizó Ia inhibición producida por el compuesto NST0037 de Ia muerte celular causada por el tratamiento con camptotecina que origina parada del ciclo celular. La camptotecina que es un inhibidor de Ia Topoisomerasa I, por Io que impide Ia duplicación del DNA y desencadena Ia parada del ciclo celular y Ia muerte por apoptosis. Estas células, en pase no superior a 15, fueron sembradas sobre placas de 96 pocilios tratadas para células adherentes con una concentración celular de 5x104 células/pocilio; para cada condición del ensayo se sembraron 3 pocilios de Ia placa.
Tras 24 h de incubación de las células a 370C y 5% CO2 se procedió a los tratamientos celulares con 100 μl de volumen total para las condiciones siguientes: - Control: medio de cultivo (medio)
- Camptotecina(CPT): medio más camptotecina 20 nM, que produce Ia muerte del 50% de las células.
- Camptotecina más NST0037: medio más camptotecina (20 nM) más NST0037 a 1 , 4, 10, 20, 40 ó 100 μM. Las células fueron incubadas (a 370C y 5% CO2) con estos tratamientos durante 22 h, pasadas las cuales se añadió el reactivo WST-1 (Roche). El Test WST-1 se basa en Ia medida de Ia actividad metabólica. El daño celular produce Ia pérdida de Ia habilidad de las células de obtener Ia energ ía necesaria para mantener sus funciones metabólicas y el crecimiento celular, por Io que las células metabólicamente activas (vivas) reducen Ia sal de tetrazolium a formazán mediante el sistema succinato-tetrazolium reductasa (de Ia cadena respiratoria mitocondrial). El formazán formado puede ser detectado colorimétricamente, ya que tiene una absorbancia de 440nm. A las 2 horas de añadido el reactivo se realizó Ia lectura en un lector de placas a 440 nm.
Los resultados obtenidos se muestran, como aparece en Ia Figura 3, como el porcentaje de muerte celular para cada tratamiento referido a Ia muerte producida por Ia camptotecina. Se observó protección de Ia muerte desde 4 a 100 μM de NST0037, alcanzando un 18%, 28%, 27% y 27% a 4, 10, 40 y 100 μM, respectivamente. Estos resultados indican que el compuesto NST0037 muestra un efecto protector de Ia muerte de células humanas de origen neuronal causada por parada del ciclo celular. 2.4. Determinación de Ia inhibición de Ia apoptosis mediante citometría de flujo
El ensayo fue realizado sobre células en cultivo de neuroblastoma humano SK-N-MC procedentes de "American Type Culture Collection (ATCC)", en todos los casos se sigu ieron estrictas normas de esteril idad y Ia manipulación se llevó a cabo en cabinas de seguridad biológica clase Il que siguen Ia norma europea EN 12469. Las células fueron mantenidas en el sigu iente med io de cultivo: "Minimun Essential Méd ium Eagle" (MEM) suplementado con piruvato sódico 1 mM, L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, gentamicina 0,05 mg/ml y suero fetal bovino 10%.
Se analizó Ia inhibición producida por el compuesto NST0037 de Ia apoptosis (muerte celular programada) causada por el tratamiento con camptotecina que inh ibe Ia enzima topoisomerasa I , Io que impide Ia duplicación del DNA y desencadena muerte celular apoptótica. Estas células, en pase no superior a 15, fueron sembradas sobre placas de 6 pocilios tratadas para células adherentes con una concentración celular de 8x105 células/pocilio y 7x105 células/pocilio para el ensayo con pretratamiento; para cada condición del ensayo se sembraron 2 pocilios de Ia placa.
Tras 24 h de incubación de las células a 370C y 5% CO2 se procedió a los tratamientos celulares con 2 mi de volumen total para las condiciones siguientes: - Control: medio de cultivo (medio)
- Camptotecina: medio más camptotecina 50 μM.
- Camptotecina más Z-VAD-fmk: medio más camptotecina 50 μM más Z-VAD-fmk 50 μM, como control positivo de inhibición. - Camptotecina más NST0037: medio más camptotecina 50 μM más
NST0037 a 10, 40 ó 100 μM.
En el ensayo con pretratamiento las células se trataron previamente con 40 μM de NST0037, 100 μM de mevalonato o ambos juntos durante 24 h y después se trataron con 50 μM camptotecina, el resto del procedimiento fue similar al ensayo sin pretratamiento.
Las células fueron incubadas (a 370C y 5% CO2) con estos tratamientos durante 6 h, pasadas las cuales se recogieron junto con su medio de cultivo y se centrifugaron a 300xg durante 5 min. Se eliminó el medio, se realizó un lavado con PBS y se fijaron durante 2 minutos con 500 μl de etanol al 70% a - 2O0C. Una vez fijadas se centrifugaron a 400xg durante 5 min, se lavaron con PBS y se les añadió yoduro de propidio a 0,05 mg/ml, diluido en buffer de ciclo (Citrato sódico 0,1 %, Nonidet P-40 0,3% y RNAsa 0,02 mg/ml) y se incubaron 1 hora a 370C. Pasado este tiempo se analizaron por citometría de flujo, comparando Ia fluorescencia del yoduro de propidio frente a Ia cantidad de DNA. El porcentaje de apoptosis se midió sobre Ia región sub-G1 de cada una de las condiciones.
Los resultados obtenidos se muestran, como aparece en Ia Figura 4A y B, como el porcentaje de Ia inhibición de Ia apoptosis de cada tratamiento referido a Ia apoptosis producida por Ia camptotecina. Se observó una protección máxima del 18% a 40 y 100 μM de NST0037 (Figura 4A), por Io que este compuesto muestra un efecto protector de Ia apoptosis en células humanas de origen neuronal. El Z-VAD-fmk, inhibidor específico de caspasas, inhibió específicamente Ia apoptosis producida por Ia camptotecina. Estos resultados fueron corroborados mediante experimentos de pretratamiento del NST0037 a 40 μM (Figura 4B), Io que produjo un aumento del porcentaje de protección (llegando hasta el 45%). Adicionalmente se determinó que Ia protección ejercida por NST0037 es inhibida parcialmente por Ia adición de mevalonato al medio, Io que indica que el efecto neuroprotector del NST0037 está relacionado con Ia biosíntesis del colesterol o con alguno de los precursores de Ia ruta.
EJEMPLO 3 Protección por NST0037 de Ia muerte neuronal en el hipocampo, del déficit cognitivo y de Ia muerte causada por una sustancia excitotóxica
3.1. Efecto protector de NST0037 frente a Ia muerte neuronal en el hipocampo de ratones causada por una sustancia excitotóxica
En base a los resultados del Ejemplo 2, los inventores decidieron averiguar si el efecto neuroprotector de NST0037 demostrado en neuronas colinérgicas humanas se corroboraba en un modelo de enfermedad de Alzheimer esporádica en ratón mediante administración de kainato (KA). Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 12 semanas de edad y de Ia cepa FVB/NHan. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con Ia máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones.
Veintiocho animales fueron utilizados en este ensayo y los tratamientos llevados a cabo, todos por vía intraperitoneal (i.p.) con un volumen de 100 μl, según las siguientes pautas: i) Pauta PBS+PBS+PBS: 4 animales se trataron inicialmente con
PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una nueva dosis de PBS y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de PBS. ii) Pauta PBS+KA+PBS: 6 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/Kg y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de PBS. iii) Pauta PBS+KA+NST0037: 7 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/Kg y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg. iv) Pauta NST0037+KA+NST0037: 6 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días con NST0037 a
50 mg/kg, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/Kg y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg. v) Pauta NST0037+PBS+NST0037: 5 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días con NST0037 a
50 mg/kg, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de PBS y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg.
Una vez concluido el tiempo de 7 días de tratamiento los animales fueron sacrificados y los encéfalos fueron diseccionados. Las muestras de encéfalo fueron procesadas e incluidas en parafina. Para el análisis de Ia arquitectura celular del hipocampo se utilizó Ia tinción con hematoxilina y eosina en cortes de 5 μm de grosor.
Como muestra Ia Figura 5, Ia pauta de administración PBS+KA+PBS produjo un severo daño neuronal en Ia región CA1 y CA2 del hipocampo de los ratones. En las muestras de dicho grupo observamos ausencia de neuronas, evidencias de necrosis y numerosos núcleos picnóticos, Io que demuestra muerte neuronal. Sin embargo, las muestras del grupo NST0037+KA+NST0037 presenta ba n u n a estru ctu ra cel u l a r ig u al a l os control es (g ru po
PBS+PBS+PBS) sin evidencias de daño celular en las regiones CA1 y CA2.
Además y de manera sorprendente, las muestras del grupo
PBS+KA+NST0037, mostraron diversas señales de daño y muerte neuronal en el hipocampo. Sin embargo, comparando de visu las muestras de los grupos
PBS+KA+PBS frente a las del grupo PBS+KA+NST0037 observamos un mayor número de neuronas del hipocampo sin daño en el grupo con el tratamiento de
NST0037, Io que indica su efecto neuroprotector. Por último las muestras del grupo NST0037+PBS+NST0037 presentaban un patrón igual al observado en los animales del grupo PBS+PBS+PBS.
En resumen, el pretratamiento con NST0037 (grupo NST0037+KA+NST0037) protegió completamente de Ia muerte neuronal producida por el KA en las regiones CA1 y CA2 del hipocampo. Además el comienzo del tratamiento con NST0037 después de Ia inoculación de KA redujo cualitativamente el daño y Ia muerte neuronal en esta región. También se demostró que Ia administración diaria de NST0037 durante 8 días no fue neurotóxica para los ratones. 3.2. Efecto protector de NST0037 frente al deterioro de Ia memoria de tipo episódica en ratones causado por una sustancia excitotóxica
La excitotoxicidad que produce el KA induce, a los pocos días tras su inoculación en ratones, el deterioro de Ia memoria de tipo episódico, afectando a Ia memoria temporal y produciendo un grave déficit en Ia memoria espacial. Debido a esto los inventores decidieron averiguar si el efecto neuroprotector de NST0037 se veía acompañado de una protección de Ia memoria que se deteriora por efecto de una sustancia excitotóxica.
Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 12 semanas de edad y de Ia cepa FVB/NHan. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con Ia máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones. Veintiocho animales fueron utilizados en este ensayo y los tratamientos llevados a cabo, todos por vía intraperitoneal (i.p.) con un volumen de 100 μl, según las siguientes pautas: i) Pauta PBS+PBS+PBS: 4 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una nueva dosis de PBS y durante los siguientes 3 días con una dosis diaria de PBS. ii) Pauta PBS+KA+PBS: 6 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/Kg y durante los siguientes 3 días con una dosis diaria de PBS. iii) Pauta PBS+KA+NST0037: 7 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/Kg y durante los siguientes 3 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg. iv) Pauta NST0037+KA+NST0037: 6 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días con NST0037 a 50 mg/kg, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/Kg y durante los siguientes 3 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg. v) Pauta NST0037+PBS+NST0037: 5 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días con NST0037 a 50 mg/kg, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de PBS y durante los siguientes 3 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg.
A los 3 días post-inoculación de KA les fue realizado a los animales un test de reconocimiento de objetos denominado test de memoria integral. En Ia
Figura 6 se muestran los resultados de Ia relación en el tiempo de exploración de los objetos antiguos frente a los objetos recientes (memoria temporal). Se observó que el grupo con Ia pauta de tratamiento NST0037+KA+NST0037 evitó
Ia disminución en Ia capacidad de memoria temporal en comparación con los ratones d e l g ru po PBS+KA+PBS. Además los animales del grupo
PBS+KA+NST0037 también presentaron una mejora del estado de Ia memoria temporal respecto a los tratados del grupo PBS+KA+PBS. Los datos también mostraron que el grupo de los ratones con Ia pauta NST0037+PBS+NST0037 también presentaron una mejora de Ia memoria temporal respecto al grupo
PBS+PBS+PBS.
En Ia Figura 7 se muestran los resultados de Ia relación en el tiempo de exploración del objeto antiguo desplazado frente al objeto antiguo sin desplazar
(memoria espacial). El grupo de ratones con las pautas de tratamiento
NST0037+KA+NST0037 o NST0037+PBS+NST0037 mostraron una ratio de exploración de objetos que demuestra que Ia memoria espacial se encuentra intacta ya que no se observan diferencias respecto al grupo PBS+PBS+PBS. Sin embargo los ratones del grupo PBS+KA+PBS presentaron un deterioro grave de Ia memoria espacial. El grupo del tratamiento PBS+KA+NST0037 mostró una mejora de este tipo de memoria respecto a los que fueron tratados del grupo PBS+KA+PBS. Estos estudios indican que el tratamiento antes y después (o sólo después) del daño con una sustancia excitotóxica con el compuesto NST0037, tiene un efecto de protección de Ia memoria episódica (temporal y espacial) que degenera tras Ia administración de una sustancia excitotóxica. 3.3. Efecto protector de NST0037 frente a Ia muerte causada por una sustancia excitotóxica
Es conocido que Ia administración de una sustancia excitotóxica a animales induce, en algunos casos, Ia muerte del animal. Debido a esto los inventores decidieron averiguar si el efecto neuroprotector de NST0037 se veía acompañado de una reducción de Ia mortalidad producida por una sustancia excitotóxica.
Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 12 semanas de edad y de Ia cepa FVB/NHan. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con Ia máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones.
Veintiocho animales fueron utilizados en este ensayo y los tratamientos llevados a cabo, todos por vía intraperitoneal (i.p.) con un volumen de 100 μl, siguieron Ia siguiente pauta: vi) Pauta PBS+PBS+PBS: 4 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una nueva dosis de PBS y durante los siguientes 3 días con una dosis diaria de PBS. vii) Pauta PBS+KA+PBS: 6 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/Kg y durante los siguientes 3 días con una dosis diaria de PBS. viii) Pauta PBS+KA+NST0037: 7 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/Kg y durante los siguientes 3 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg. ix) Pauta NST0037+KA+NST0037: 6 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días con NST0037 a 50 mg/kg, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/Kg y durante los siguientes 3 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg. x) Pauta NST0037+PBS+NST0037: 5 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días con NST0037 a 50 mg/kg, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de PBS y durante los siguientes 3 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg. Durante todo el tiempo del ensayo se registraron los óbitos, los resultados se muestran en Ia Figura 8 mediante curvas de supervivencia de Kaplan-Meier.
Los resultados del estudio de Ia mortalidad producida por el KA mostraron que el grupo con Ia pauta de tratamiento NST0037+KA+NST0037 protegió de Ia muerte asociada al daño producido por una sustancia excitotóxica. Además, y I o q u e es m ás i m porta nte , el grupo con Ia pauta de tratamiento
PBS+KA+NST0037 aumenta Ia supervivencia de los animales frente a los del grupo con Ia pauta PBS+KA+PBS.
Estos estudios indican que el tratamiento antes y después (o sólo después) del daño con una sustancia excitotóxica con el compuesto NST0037, tiene un efecto de protección de mortalidad causada por Ia administración de una sustancia excitotóxica.
EJEMPLO 4
Efecto antiepiléptico de NST0037 frente a Ia acción de una sustancia excitotóxica
Es conocido que Ia administración de una sustancia excitotóxica a animales induce, en algunos casos, crisis epilépticas y convulsiones en los an imales. Debido a esto los inventores decidieron averiguar si el efecto neuroprotector de NST0037 se veía acompañado de un efecto antiepiléptico producido por una sustancia excitotóxica.
Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 12 semanas de edad y de Ia cepa FVB/NHan. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con Ia máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones. Los animales fueron inoculados intraperitonealmente con 25 mg/kg de kainato (KA) disuelto en PBS. Trece animales fueron pretratados a 24 y 0.5 horas antes de Ia inoculación con KA mediante inyección intraperitoneal con PBS (pauta de administración PBS+KA) y 6 fueron pretratados a 24 y 0.5 horas antes de Ia inoculación con KA mediante inyección intraperitoneal con NST0037 a una dosis de 50 mg/kg (pauta de administración NST0037+KA). Tras Ia inoculación los animales fueron alojados en cubetas de manera individual para su seguimiento. Durante Ia observación se registró el nivel máximo de epilepsia de los animales según Ia escala Racine cada diez minutos y durante al menos 120 minutos post-inoculación (m.p.i.). Posteriormente se realizaron estudios comparativos de los fenómenos epileptogénicos entre el tratamiento con PBS (PBS+KA) y con NST0037 (NST0037+KA). Se observaron diferencias en el porcentaje de animales que entraron en status epilepticus, es decir que presentaron convulsiones clónico- tónicas, entre el grupo de NST0037+KA y que fue de un 33.3% (2 de 6) frente al grupo de pauta de tratamiento con PBS+KA y que fue de un 76.9% (10 de 13), Io que demuestra que el compuesto NST0037 es antiepiléptico y anticonvulsivante. También se observaron diferencias en el tiempo en el que aparecían las primeras convulsiones (periodo de latericia), donde Ia latencia del grupo NST0037+KA (1 03.3±13.1 min .) fue mayor que con Ia pauta de tratamiento PBS+KA (74.6±8.6 min.) como se muestra Ia Figura 9, Io que demuestra un efecto antiepiléptico y anticonvulsivante del compuesto NST0037. En base a estos resultados los inventores decidieron averiguar si el efecto antiepiléptico y anticonvulsivante se confirmaba con los niveles de epilepsia y por Ia gravedad de los síntomas, observando que los animales del grupo con Ia pauta PBS+KA alcanzaban un nivel de epilepsia 4 en Ia escala Racine, mientras Ia pauta NST0037+KA no produjo en ningún momento un nivel de epilepsia 3 en dicha escala, indicando que el compuesto NST0037 es antiepiléptico y anticonvulsivante. Además, a partir de los 100 m.p.i. Ia pauta NST0037+KA produjo Ia desaparición de los síntomas epileptogénicos, mientras Ia pauta de PBS+KA presentaba espasmos y convulsiones graves.
Estos estudios indican que el tratamiento con el compuesto NST0037, tiene un efecto antiepiléptico y anticonvulsivante debido a Ia administración de una sustancia excitotóxica.
EJEMPLO 5
Actividad inhibitoria de Ia HMGR y efecto hipocolesterolémico de NST0037 en un modelo de hiperlipidemia endógena en ratón
5.1. Efecto inhibitorio de NST0037 sobre Ia actividad enzimática de Ia HMGR
Debido a Ia naturaleza del compuesto, se determinó el grado de inhibición de Ia enzima HMGR por el compuesto NST0037, ya que este enzima es clave en Ia síntesis de colesterol celular y en Ia regulación fisiológica de dicha síntesis. El efecto de este compuesto se comparó con el de dos estatinas conocidas, Ia atorvastatina y Ia simvastatina, compuestos para los que ya está descrito un potente efecto inhibitorio sobre HMGR. Durante Ia reacción, Ia HMGR utiliza NADPH como agente reductor y como sustrato 3-hidroxi-3- metilglutaril coenzima A (HMGCoA), produciendo ácido mevalónico, CoASH y NADP+. La disminución de Ia absorbancia a Ia que absorbe el NADPH (340 nm) es una medida directa de Ia actividad catalítica de Ia HMGR y sirve para calcular los porcentajes de inhibición de diferentes compuestos. Para llevar a cabo las medidas de inhibición de HMGR, el ensayo se llevó a cabo en placa de 96 pocilios, con un volumen de reacción total de 200 μl. El buffer de reacción (KH2PO4 50 mM, KCI 1 M, Bovine Serum Albumin [BSA] 2 mg/ml y DTT 5 mM, a pH=7.3) se preparó en el momento de llevar a cabo Ia reacción y se mantuvo a 370C. En los ensayos se incluyeron:
- Un blanco: Carente de HMGR que informa de Ia estabilidad de NADPH durante Ia reacción.
- Un control: Contiene todos los componentes de Ia reacción pero carece de compuesto problema. - Compuestos problema: NST0037, Atorvastatina y Simvastatina a diversas concentraciones. En todos los casos se empleo Ia forma acida de los compuestos.
Se llevaron a cabo cinco ensayos independientes con NST0037, cuatro ensayos independientes con atorvastatina y seis ensayos independientes con simvastatina, determinándose Ia potencia de Ia inhibición en un rango de concentraciones que permitían definir las constantes de inhibición al 50% (IC5o), mediante determinación espectrofotométrica de Ia caída de NADPH a 370C, y tal y como se muestra en Ia Figura 1 1. El descenso de absorbancia a 340 nm permite calcular el porcentaje de actividad enzimática HMGR respecto al control . Las IC50 fueron determinadas mediante el método Trimmed Spearman-Karber (Versión 1 .5). Los resultados indican que Ia potencia de inhibición de NST0037 está sorprendentemente próxima a Ia de Ia estatina más potente, Ia atorvastatina, y es 7,5 veces más potente que Ia simvastatina, Io que demuestra un efecto inhibidor de Ia HMGR claro.
5.2. Efecto hipocolesterolémico de NST0037 en un modelo de hiperlipidemia endógena (familiar)
En base a los resultados del punto anterior, los inventores decidieron averiguar si Ia actividad inhibidora de Ia enzima HMGR por el compuesto NST0037 se correspondía con una variación de colesterol total y de sus fracciones en un modelo de hiperlipidemia endógena en ratón.
Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 46 semanas de edad y de Ia cepa ApoB100, Ia cual presenta una deficiencia en Ia retirada de colesterol de Ia sangre que produce un aumento anormalmente elevado de colesterol en plasma. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con Ia máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones.
Para llevar a cabo el experimento a los animales en condición de ayuno se les extrajo sangre por punción ocular. De dicha sangre se obtuvo el plasma en el que se determinaron los niveles de colesterol total y de sus fracciones previo a Ia administración de las sustancias a estudio. Inmediatamente después, los animales fueron inoculados intraperitonealmente con 50 mg/kg de cada uno de los compuestos problema. Cuatro animales fueron tratados únicamente con el vehículo y fueron considerados el grupo control. Un segundo grupo de cinco ratones recibió 50 mg/Kg de simvastatina. Por último, un tercer grupo de cinco ratones recibió 50 mg/Kg de NST0037. Transcurridas doce horas de los tratamientos, se extrajo sangre de nuevo a los animales en condición de ayuno y se obtuvo el plasma de dicha sangre. La Figura 12 muestra los niveles plasmáticos de colesterol a tiempo inicial (tO) y doce horas tras Ia administración de vehículo, simvastatina o NST0037 en los diferentes grupos de ratones (t12), demostrando que ambos compuestos presentan un efecto hipocolesterolémico significativo. En relación a las diferentes fracciones de colesterol, ambos compuestos disminuyeron apreciablemente los niveles de colesterol unido a lipoproteínas de baja densidad (c-LDL) y de muy baja densidad (c-VLDL), sin alterar los niveles de colesterol unido a lipoproteínas de alta densidad (c-HDL), tal y como se muestra en las Figuras 13 a 15. En relación a los niveles de colesterol libre (CL) y colesterol esterificado (CE), ambos compuestos disminuyeron de forma similar los niveles de CE sin alterar los de CL, tal y como se muestra en las Figuras 16 y 17. Los resultados mostrados en este apartado demuestran que el compuesto
NST0037 muestra un efecto sorprendentemente similar a Ia simvastatina, reduciendo los niveles de CT, c-LDL, c-VLDL y CE de manera significativa sin alterar los de c-HDL ni de CL.
EJEMPLO 6
Efecto hipocolesterolémico de NST0037 en un modelo de hiperlipidemia inducida en ratón
En base a los resultados obtenidos en Ia experimentación con animales ApoB100, los inventores decidieron averiguar si el compuesto NST0037 mostraba también un efecto hipocolesterolémico en un modelo de hiperlipidemia inducida aguda.
Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron ratones salvajes machos de 6 semanas de edad y de Ia cepa C57BL6. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con Ia máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones.
Para llevar a cabo el experimento a los animales en condición de ayuno se les extrajo sangre por punción ocular. De dicha sangre se obtuvo el plasma en el que se determinaron los niveles de colesterol total y de sus fracciones, previamente a Ia administración de las sustancias a estudio. Inmediatamente después, los animales fueron inoculados intraperitonealmente con 500 mg/kg de Tritón 1339 también conocido como tiloxapol. A los treinta minutos, los animales fueron inoculados intraperitonealmente con 50 mg/kg de cada uno de los compuestos problema. Siete animales fueron tratados únicamente con el vehículo y fueron considerados el grupo control. Un segundo grupo de seis ratones recibió 50 mg/Kg de simvastatina. Por último, un tercer grupo de siete ratones recibió 50 mg/Kg de NST0037. Transcurridas veinticuatro horas de los tratamientos, se extrajo sangre de nuevo a los animales en condición de ayuno y se obtuvo el plasma de dicha sangre. La Figura 18 muestra el número de veces que incrementa el colesterol total tras veinticuatro horas de Ia administración del Tritón 1339 seguida de Ia administración de vehículo, simvastatina o NST0037 en los diferentes grupos de ratones, demostrando que ambos compuestos problema presentan un efecto hipocolesterolémico, siendo estadísticamente significativo únicamente en el caso del tratamiento con NST0037. En relación a las diferentes fracciones de colesterol, ambos compuestos disminuyeron los niveles de colesterol unido a lipoproteínas de baja densidad (c-LDL), siendo estadísticamente significativa dicha reducción sólo en el caso de NST0037. Sólo Ia simvastatina disminuyó los niveles de colesterol unido a lipoproteínas de muy baja densidad (c-VLDL), no siendo alterados con ninguno de los dos compuestos los niveles de colesterol unido a lipoproteínas de alta densidad (c-HDL) tal y como se muestra en las Figuras 19 a 21 . A diferencia de Ia simvastatina, NST0037 disminuyó los niveles de colesterol esterificado (CE), tal y como se muestra en Ia Figura 22. En relación a los niveles de colesterol libre (CL), ambos compuestos disminuyeron de forma similar los niveles de esta fracción, tal y como se muestra en las Figura 23.
Los resultados mostrados en este apartado demuestran sorprendentemente que el compuesto NST0037 presenta u n efecto hipocolesterolémico igual o mayor a Ia simvastatina, reduciendo los niveles de CT y c-LDL de manera estadísticamente significativa. Estos resultados confirman el efecto hipocolesterolémico de NST0037 observado en el modelo de ratones apoB100.
EJEMPLO 7
Bioseguridad de NST0037 en embrión de pez cebra
7.1. Análisis del índice de supervivencia del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina
Para evaluar Ia bioseguridad del compuesto NST0037 se analizaron sus efectos toxicológicos en el modelo de embrión de pez cebra mediante Ia determinación de los parámetros de seguridad del protocolo C15 de Ia OECD.
Los huevos fertilizados fueron obtenidos por apareamiento natural del pez cebra (Danio rerio, cepa AB). Un total de 8-10 parejas fueron utilizadas para cada cruce y se generaron un total de 200-250 huevos de media por pareja. Los huevos se recogieron inmediatamente después del desove y fueron lavados con agua de dilución (CaCI2 »2H2O2 0.29 g/L, MgSO4 »7H2O2 0.12 g/L, NaHCO3 0.065 g/L, KCI 0.006 g/L) ajustándose a pH 7.8 ± 0.2, acorde con el Reglamento CE n° 440/2008 método C.1 y depositados en una placa petri.
Para asegurar Ia exposición en los estadios más tempranos del desarrollo, los huevos fueron rápidamente transferidos (un mínimo de 50 por condición) a otra placa petri con las soluciones a ensayar de los compuestos. Posteriormente, sólo los huevos fertilizados (10 por condición experimental) fueron transferidos de las placas petri a las cámaras de exposición (placas microtiter M24) por medio de pipetas y expuestos a las sustancias a testar (NST0037 o simvastatina), con agua de dilución (controles) o con diferentes concentraciones de los tratamientos. Los embriones fueron incubados sin aireación adicional, a Ia temperatura apropiada (25±1 0C) y bajo un régimen de 12 h luz/12 h oscuridad. Cada experimento fue realizado en triplicado. Los estudios fueron llevados a cabo en un total de 9 d ías postfertilización, donde Ia frecuencia de renovación del tratamiento se realizó todos los días, realizando así un ensayo semi-estático. Los tratamientos llevados a cabo siguieron Ia siguiente pauta: > 10 animales control, tratados con agua de dilución y con recambio diario durante los 9 días que duró el ensayo.
> 30 animales tratados con el compuesto NST0037 (10 embriones por triplicado) diluido en agua de dilución y con recambio diario durante los 9 días que duró el ensayo. > 30 animales tratados con el compuesto simvastatina (10 embriones por triplicado) diluido en agua de dilución y con recambio diario durante los 9 días que duró el ensayo.
Durante todo el tiempo que dura el ensayo se registró Ia mortalidad de los embriones-larvas, mostrándose los resultados en las Figuras 24 y 25 mediante Ia realización de curvas de Kaplan-Meier. Los resultados del estudio de Ia mortalidad inducida por las dos sustancias a estudio mostraron que el compuesto NST0037 es sorprendentemente más seguro que Ia simvastatina a las dosis evaluadas, siendo las curvas de supervivencia estadísticamente diferentes comparando ambos tratamientos. 7.2. Análisis de las dosis letales 50 del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina en función del tiempo
En base a los resultados del apartado anterior, los inventores decidieron averiguar si Ia mayor bioseguridad del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina se corroboraba mediante el análisis de las dosis letales 50 (LD5o) a Io largo del tiempo.
Los huevos fertilizados fueron obtenidos por apareamiento natural del pez cebra (Danio rerio, cepa AB). Un total de 8-10 parejas fueron utilizadas para cada cruce y se generaron un total de 200-250 huevos de media por pareja. Los huevos se recogieron inmediatamente después del desove y fueron lavados con agua de dilución (CaCI2 »2H2O2 0.29 g/L, MgSO4 »7H2O2 0.12 g/L, NaHCO3 0.065 g/L, KCI 0.006 g/L) ajustándose a pH 7.8 ± 0.2, acorde con el Reglamento CE n° 440/2008 método C.1 y depositados en una placa petri. Para asegurar Ia exposición en los estadios más tempranos del desarrollo, los huevos fueron rápidamente transferidos (un mínimo de 50 por condición) a otra placa petri con las soluciones a ensayar de los compuestos.
Posteriormente, sólo los huevos fertilizados (10 por condición experimental) fueron transferidos de las placas petri a las cámaras de exposición (placas microtiter M24) por medio de pipetas y expuestos a las sustancias a testar
(NST0037 o simvastatina), con agua de dilución (controles) o con diferentes concentraciones de los tratamientos. Los embriones fueron incubados sin aireación adicional, a Ia temperatura apropiada (25±1 0C) y bajo un régimen de 12 h luz/12 h oscuridad. Cada experimento fue realizado en triplicado.
Los estudios fueron llevados a cabo en u n total de 9 d ías postfertilización, donde Ia frecuencia de renovación del tratamiento se realizó todos los días, realizando así un ensayo semi-estático. Los tratamientos llevados a cabo siguieron Ia siguiente pauta: > 10 animales control, tratados con agua de dilución y con recambio diario durante los 9 días que duró el ensayo.
> 30 animales tratados con el compuesto NST0037 (10 embriones por triplicado) diluido en agua de dilución y con recambio diario durante los 9 días que duró el ensayo. > 30 animales tratados con el compuesto simvastatina (10 embriones por triplicado) diluido en agua de dilución y con recambio diario durante los 9 días que duró el ensayo.
Durante el tiempo que duró el estudio, se registró el número de embriones/larvas muertas a intervalos de 24 horas y se calculó Ia LD50 en cada punto temporal del experimento, tal y como se muestra en Ia Figura 26. Los resultados muestran que en los primeros días post-tratamiento (hasta día 2) Ia
LD50 de ambos compuestos se encuentra por encima de Ia máxima dosis evaluada. No obstante, a partir del tercer día y hasta Ia finalización del experimento Ia simvastatina presentó una LD50 menor que Ia del compuesto NST0037, Io que indica su mayor toxicidad. A partir del día 2 de tratamiento las
LD50 de ambos compuestos fue diminuyendo progresivamente a Io largo de todo el experimento, aunque Ia simvastatina siempre presentó una LD50 por debajo del compuesto NST0037, indicando que NST0037 es más bioseguro que Ia simvastatina.
7.3. Análisis del porcentaje de larvas sanas al final del experimento del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina en función del tiempo En base a los resultados de los apartados anteriores, los inventores decidieron averiguar si Ia mayor bioseguridad del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina se corroboraba mediante el análisis del porcentaje de larvas sanas al final del experimento.
Los huevos fertilizados fueron obtenidos por apareamiento natural del pez cebra (Danio rerio, cepa AB). Un total de 8-10 parejas fueron utilizadas para cada cruce y se generaron un total de 200-250 huevos de media por pareja. Los huevos se recogieron inmediatamente después del desove y fueron lavados con agua de dilución (CaCI2 »2H2O2 0.29 g/L, MgSO4 »7H2O2 0.12 g/L, NaHCO3 0.065 g/L, KCI 0.006 g/L) ajustándose a pH 7.8 ± 0.2, acorde con el Reglamento CE n° 440/2008 método C.1 y depositados en una placa petri.
Para asegurar Ia exposición en los estadios más tempranos del desarrollo, los huevos fueron rápidamente transferidos (un mínimo de 50 por condición) a otra placa petri con las soluciones a ensayar de los compuestos. Posteriormente, sólo los huevos fertilizados (10 por condición experimental) fueron transferidos de las placas petri a las cámaras de exposición (placas microtiter M24) por medio de pipetas y expuestos a las sustancias a testar (NST0037 o simvastatina), con agua de dilución (controles) o con diferentes concentraciones de los tratamientos. Los embriones fueron incubados sin aireación adicional, a Ia temperatura apropiada (25±1 0C) y bajo un régimen de 12 h luz/12 h oscuridad. Cada experimento fue realizado en triplicado.
Los estudios fueron llevados a cabo en un total de 9 días postfertilización, donde Ia frecuencia de renovación del tratamiento se realizó todos los días, realizando así un ensayo sem i-estático. Los tratamientos llevados a cabo siguieron Ia siguiente pauta: > 10 animales control, tratados con agua de dilución y con recambio diario durante los 9 días que duró el ensayo. > 30 animales tratados con el compuesto NST0037 (10 embriones por triplicado) diluido en agua de dilución y con recambio diario durante los 9 días que duró el ensayo.
> 30 animales tratados con el compuesto simvastatina (10 embriones por triplicado) diluido en agua de dilución y con recambio diario durante los 9 días que duró el ensayo.
Los resultados al final del experimento permitieron recoger el porcentaje de larvas que llegan sanas al final del experimento, definido como el número de larvas vivas y sin síntomas de anomalías fisiopatológicas externas (morfológica y/o en comportamiento), siendo éste un parámetro que determina Ia bioseguridad de una sustancia a estudio y es complementaria a los índices de supervivencia y a las LD5O- Tal y como se muestra en Ia Figura 27, se observaron diferencias evidentes entre los porcentajes de larvas sanas entre los dos tratamientos evaluados en las dosis más altas a estudio (0.06 y 0.2 mg/L), llegando más larvas sanas al final del experimento con el tratamiento con NST0037, Io que indica su mayor bioseguridad.
7.4. Análisis del porcentaje de larvas con deformidades o aspecto anómalo al final del experimento del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina en función del tiempo En base a los resultados de los apartados anteriores, los inventores decidieron averiguar si Ia mayor bioseguridad del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina se corroboraba mediante el análisis del porcentaje de larvas con deformidades o aspecto anómalo, recogiendo el número de larvas que presenten anomalías corporales y/o pigmentarias, así como Ia fase de reabsorción de Ia vesícula vitelina a intervalos adecuados (cada 24 horas). Las anomalías registradas en el estudio se describen a continuación:
• Trombosis intracraneal : es un coágulo en el interior de un vaso sanguíneo, en este caso de cualquier vaso cerebral. • Trombosis cardiaca: ocurre en un vaso cardiaco.
• Edema (o hidropesía) cardiaco: es Ia acumulación de líquido en el espacio tisular intercelular o intersticial y también en las cavidades del organismo. En el caso del corazón, se produce acumulación de líquido en Ia bolsa pericárdica.
• Malformación: es una diferencia notable en Ia forma del cuerpo o parte del cuerpo, u órgano del cuerpo (interno o externo) comparada con Ia forma promedio de Ia parte en cuestión. Normalmente las malformaciones observadas en nuestro estudio son del saco vitelino
(yolk).
Los huevos fertilizados fueron obtenidos por apareamiento natural del pez cebra (Danio rerio, cepa AB). Un total de 8-10 parejas fueron utilizadas para cada cruce y se generaron un total de 200-250 huevos de media por pareja. Los huevos se recogieron inmediatamente después del desove y fueron lavados con agua de dilución (CaCI2^H2O2 0.29 g/L, MgSOWH2O2 0.12 g/L, NaHCO3 0.065 g/L, KCI 0.006 g/L) ajustándose a pH 7.8 ± 0.2, acorde con el Reglamento CE n° 440/2008 método C.1 y depositados en una placa petri. Para asegurar Ia exposición en los estadios más tempranos del desarrollo, los huevos fueron rápidamente transferidos (un mínimo de 50 por condición) a otra placa petri con las soluciones a ensayar de los compuestos. Posteriormente, sólo los huevos fertilizados (10 por condición experimental) fueron transferidos de las placas petri a las cámaras de exposición (placas microtiter M24) por medio de pipetas y expuestos a las sustancias a testar (NST0037 o simvastatina), con agua de dilución (controles) o con diferentes concentraciones de los tratamientos. Los embriones fueron incubados sin aireación adicional, a Ia temperatura apropiada (25±1 0C) y bajo un régimen de 12 h luz/12 h oscuridad. Cada experimento fue realizado en triplicado. Los estudios fueron llevados a cabo en un total de 9 días postfertilización, donde Ia frecuencia de renovación del tratamiento se realizó todos los días, realizando así un ensayo semi-estático. Los tratamientos llevados a cabo siguieron Ia siguiente pauta:
> 10 animales control, tratados con agua de dilución y con recambio diario durante los 9 días que duró el ensayo.
> 30 animales tratados con el compuesto NST0037 (10 embriones por triplicado) diluido en agua de dilución y con recambio diario durante los 9 días que duró el ensayo. > 30 animales tratados con el compuesto simvastatina (10 embriones por triplicado) diluido en agua de dilución y con recambio diario durante los 9 días que duró el ensayo.
Los resultados indican que el porcentaje de larvas con deformidades o aspecto anómalo es dependiente del tiempo y del tratamiento, tal y como se muestra en Ia Figura 28, observándose que a Ia dosis evaluada (0.2 mg/L) Ia simvastatina indujo en los embriones-larvas un porcentaje significativo de anomalías o problemas toxicológicos, mientras el compuesto NST0037 no mostró efectos toxicológicos significativos, Io que indica su mayor bioseguridad. El tratamiento con simvastatina produjo trombosis intracraneales y cardíacas y edemas pericárdicos. También los datos de Ia gráfica muestran que los animales se fueron recuperando a Io largo del tiempo de los problemas inducidos por Ia simvastatina, indicando que el tratamiento con 0.2 mg/L de esta sustancia no fue suficientemente tóxico para inducir Ia muerte del animal, con Ia consiguiente mejora de los mismos.
Estos resultados indican que el compuesto NST0037 es más seguro que Ia simvastatina, ya q ue ésta induce un mayor porcentaje de problemas toxicológicos de manera significativa con mayor gravedad. 7.5. Análisis de Ia variación de Ia cardiotoxicidad del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina en función de Ia dosis
En base a los resultados de los apartados anteriores, los inventores decidieron averiguar si Ia mayor bioseguridad del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina se corroboraba mediante el análisis de Ia cardiotoxicidad tras el tratamiento con los diferentes compuestos y a varias dosis. El estudio de este parámetro (cardiotoxicidad), no sólo determina el ritmo cardiaco de los animales sino que además, nos permite observar alteraciones en el latido cardiaco (taquicardia, bradicardia, etc) o anomalías en el desarrollo del corazón (pericarditis, atrofia, hipertrofia, etc.).
Los huevos fertilizados fueron obtenidos por apareamiento natural del pez cebra (Danio rerio, cepa AB). Un total de 8-10 parejas fueron utilizadas para cada cruce y se generaron un total de 200-250 huevos de media por pareja. Los huevos se recogieron inmediatamente después del desove y fueron lavados con agua de dilución (CaCI2^H2O2 0.29 g/L, MgSOWH2O2 0.12 g/L, NaHCO3 0.065 g/L, KCI 0.006 g/L) ajustándose a pH 7.8 ± 0.2, acorde con el Reglamento CE n° 440/2008 método C.1 y depositados en una placa peth.
Para asegurar Ia exposición en los estadios más tempranos del desarrollo, los huevos fueron rápidamente transferidos (un mínimo de 50 por condición) a otra placa peth con las soluciones a ensayar de los compuestos. Posteriormente, sólo los huevos fertilizados (10 por condición experimental) fueron transferidos de las placas peth a las cámaras de exposición (placas microtiter M24) por medio de pipetas y expuestos a las sustancias a testar (NST0037 o simvastatina), con agua de dilución (controles) o con diferentes concentraciones de los tratamientos. Los embriones fueron incubados sin aireación adicional, a Ia temperatura apropiada (25±1 0C) y bajo un régimen de 12 h luz/12 h oscuridad. Cada experimento fue realizado en triplicado.
Los estudios fueron llevados a cabo en un total de 9 d ías postfertilización, donde Ia frecuencia de renovación del tratamiento se realizó todos los días, realizando así un ensayo semi-estático. Los tratamientos llevados a cabo siguieron Ia siguiente pauta:
> 10 animales control, tratados con agua de dilución y con recambio diario durante los 9 días que duró el ensayo.
> 30 animales tratados con el compuesto NST0037 (10 embriones por triplicado) diluido en agua de dilución y con recambio diario durante los 9 días que duró el ensayo.
> 30 animales tratados con el compuesto simvastatina (10 embriones por triplicado) diluido en agua de dilución y con recambio diario durante los 9 días que duró el ensayo. Se determinó el ritmo cardiaco de los embriones-larva de pez cebra mediante análisis visual en estereomicroscopio, con determinación del latido cardiaco con Ia ayuda de un contador manual durante un periodo de un minuto. Los diferentes tratamientos variaron el ritmo cardíaco de los animales, tal y como se muestra en Ia Figura 29, observándose que las larvas tratadas con simvastatina presentaron una disminución estadísticamente significativa respecto los controles a partir de Ia dosis de 0.06, y que llegó a ser muy evidente a Ia dosis de 2 mg/L. Por el contrario, Ia disminución del ritmo cardíaco con el compuesto NST0037 sólo fue estadísticamente significativo a Ia dosis 2 mg/L en comparación con los controles, mientras a concentraciones menores no presentó diferencias con los controles. Además, a Ia máxima dosis utilizada de ambos compuestos (2 mg/L), el ritmo cardiaco de los animales tratados con simvastatina fue estadísticamente menor que a los tratados con NST0037, demostrando de nuevo que el compuesto NST0037 es más bioseguro que Ia simvastatina. Por Io tanto, NST0037 es un compuesto más cardioseguro que Ia simvastatina.
EJEMPLO 8 Actividad fungicida de NST0037
La actividad fungicida de NST0037 se analizó mediante bioensayo frente a Candida albicans. Para ello se prepararon disoluciones de Ia forma β- hidroxiácida de NST0037, lovastatina, atorvastatina y simvastatina. Las concentraciones ensayadas fueron las siguientes: 2, 1 .5, 1 , 0.5, 0.25, 0.125, 0.06, 0.025 y 0.01 mM. Se prepararon placas de medio MA (conteniendo por litro: 20 g de extracto de malta, 20 g de glucosa, 1 g de micopeptona y 10 g de agar) previamente inoculadas con un cultivo de Candida albicans CECT 1002. Con ayuda de un sacabocados (6 mm diámetro) se prepararon varios pocilios en los que se depositaron 40 μL de las soluciones anteriores. El estudio se realizó por triplicado y en cada placa se incluyeron triplicados para cada compuesto y concentración. Las placas se mantuvieron a 40C durante 1 hora y posteriormente se incubaron a 280C durante toda Ia noche. La presencia de actividad antifúngica se determinó mediante Ia formación de halos de inhibición del crecimiento de C. albicans. Los resultados obtenidos mostraron que el compuesto NST0037 tiene una mayor actividad antifúngica que las estatinas incluidas en el ensayo. Como se muestra en Ia Figura 30 este comportamiento se observó durante todo el rango de concentraciones. En el caso de las concentraciones más elevadas (2- 0.25 mM) el compuesto NST0037 mostró valores ligeramente superiores a Ia simvastatina, Ia estatina que mostró Ia mayor actividad fungicida. Sin embargo, al utilizar las concentraciones más bajas (0.06 y 0.025 mM), el compuesto NST0037 fue el único capaz de producir halos de inhibición. EJEMPLO 9
Inducción de Ia expresión celular del gen 24- dehidrocolesterol reductasa (Seladin-1/DHCR24) por el tratamiento con NST0037
El ensayo fue realizado sobre células en cultivo de neuroblastoma humano SK-N-MC procedentes de "American Type Culture Collection (ATCC)", en todos los casos se sigu ieron estrictas normas de esteril idad y Ia manipulación se llevó a cabo en cabinas de seguridad biológica clase Il que siguen Ia norma europea EN 12469. Las células fueron mantenidas en el siguiente medio de cultivo: "Minimun Essential Médium Eagle" (MEM) suplementado con piruvato sódico 1 mM, L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, gentamicina 0,05 mg/ml y suero fetal bovino 10%.
Se analizó Ia expresión del gen seladin-1/DHCR24 (NCBI Reference Sequence: NM_014762.3) mediante RT-PCR cuantitativa a tiempo real en comparación con Ia memantina (fármaco habitualmente utilizado para tratar Ia enfermedad de Alzheimer). Las células SK-N-MC fueron tratadas durante 24 h en ausencia (control) o presencia de NST0037 o de memantina a 1 , 4, 10 ó 40 μM. El RNA total se extrajo mediante el kit High Puré RNA Isolation (Roche) y Ia cantidad y calidad del RNA se analizaron mediante espectrofotometría (Infinite 200 con NanoQuant, Tecan) y visualización de las bandas 18S y 28S mediante electroforesis. La RT-PCR se realizó mediante dos pasos, en primer lugar se pasó el m RNA a cDNA usando el RNA to cDNA kit (Applied Biosystem) y posteriormente se analizó Ia expresión génica mediante sondas TaqMan utilizando las sondas val idadas Hs00207388_m 1 para seladin- 1/DHCR24 y Hs99999901_s1 para 18S (utilizado para normalizar los resultados) en el equipo 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystem). Se realizaron dos ensayos independientes por triplicado. La cantidad relativa de Ia expresión del gen se determinó utilizando el método ΔΔCt con el software SDS v2.1.1 (Applied Biosystem); Ia expresión de 18S fue usada para normalizar Ia medida. Los resultados obtenidos, como aparece en Ia Figura 31 , muestran el aumento de Ia expresión del gen seladin-1/DHCR24 con el tratamiento con NST0037 a las concentraciones ensayadas, pero no con el tratamiento con memantina, Io que indica que el tratamiento con NST0037 produce el aumento específico de Ia expresión del gen seladin-1/DHCR24, que está relacionado con Ia biosíntesis de colesterol y con capacidad anti-apoptótica mediante Ia inhibición de Ia caspasa 3.
EJEMPL0 10
Protección por NST0037 de Ia muerte neuronal inducida por Ia inhibición de Ia proteín fosfatasa 1 (PPD
El ensayo fue realizado sobre células en cultivo de neuroblastoma humano SK-N-MC procedentes de "American Type Culture Collection (ATCC)", en todos los casos se siguieron estrictas normas de esterilidad y Ia manipulación se llevó a cabo en cabinas de seguridad biológica clase Il que siguen Ia norma europea EN 12469. Las células fueron mantenidas en el siguiente medio de cultivo: "Minimun Essential Méd ium Eagle" (MEM) suplementado con piruvato sódico 1 mM, L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, gentamicina 0,05 mg/ml y suero fetal bovino 10%.
Se analizó Ia inhibición producida por el compuesto NST0037 de Ia muerte celular causada por el tratamiento con ácido okadaico (OA) que inhibe Ia actividad de Ia proteín fosfatasa 1 (PP1 ). El OA es una de las drogas más utilizadas para el estudio del mecanismo de fosforilación de Ia proteína tau, involucrada en Ia patogénesis y Ia progresión de Ia EA. La inhibición de Ia PP1 produce alteraciones del citoesqueleto y daño mitocondrial. Estas células, en pase no superior a 15, fueron sembradas sobre placas de 96 pocilios tratadas para células adherentes con una concentración celular de 5x104 células/pocilio; para cada condición del ensayo se sembraron 3 pocilios de Ia placa. Tras 24 h de incubación de las células a 370C y 5% CO2 se procedió a los tratamientos celulares con 100 μl de volumen total para las condiciones siguientes:
- Control: medio de cultivo (medio)
- Ácido okadaico (OA): medio más OA 20 nM, que produce Ia muerte del 50% de las células.
- OA más NST0037: medio más OA (20 nM) más NST0037 a 1 , 4, 10, 40 ó 100 μM. Las células fueron incubadas (a 370C y 5% CO2) con estos tratamientos durante 22 h, pasadas las cuales se añadió el reactivo WST-1 (Roche). El Test WST-1 se basa en Ia medida de Ia actividad metabólica. El daño celular produce Ia pérdida de Ia habilidad de las células de obtener Ia energía necesaria para mantener sus funciones metabólicas y el crecimiento celular, por Io que las células metabólicamente activas (vivas) reducen Ia sal de tetrazolium a formazán mediante el sistema succinato-tetrazolium reductasa (de Ia cadena respiratoria mitocondrial). El formazán formado puede ser detectado colorimétricamente, ya que tiene una absorbancia de 440nm. A las 2 horas de añadido el reactivo se realizó Ia lectura en un lector de placas a 440 nm.
Los resultados obtenidos se muestran, como aparece en Ia Figura 32, como el porcentaje de muerte celular para cada tratamiento referido a Ia muerte producida por OA. Se observó protección de Ia muerte desde 4 a 40 μM de NST0037, alcanzando un 57% a 40 μM. Estos resultados indican que el compuesto NST0037 muestra un efecto protector de Ia muerte de células humanas de origen neuronal causada por inhibición de Ia PP1.
EJEMPLO 11 Protección por NST0037 de Ia muerte neuronal inducida por Ia inhibición de Ia succinato deshidroqenasa
El ensayo fue realizado sobre células en cultivo de neuroblastoma humano SK-N-MC procedentes de "American Type Culture Collection (ATCC)", en todos los casos se sigu ieron estrictas normas de esteril idad y Ia manipulación se llevó a cabo en cabinas de seguridad biológica clase Il que siguen Ia norma europea EN 12469. Las células fueron mantenidas en el sigu iente med io de cultivo: "Minimun Essential Méd ium Eagle" (MEM) suplementado con piruvato sódico 1 mM, L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, gentamicina 0,05 mg/ml y suero fetal bovino 10%. Se analizó Ia inhibición producida por el compuesto NST0037 de Ia muerte celular causada por el tratamiento con ácido 3-Nitropropiónico (3-NP). El 3-NP es un inhibidor irreversible de Ia enzima succinato deshidrogenasa que en modelos animales produce estrés oxidativo y muerte celular apoptótica en el estriado, que mimetiza cambios neuroquímicos y anatómicos asociados a Ia enfermedad de Huntington (HD). Estas células, en pase no superior a 15, fueron sembradas sobre placas de 96 pocilios tratadas para células adherentes con una concentración celular de 5x104 células/pocilio; para cada condición del ensayo se sembraron 3 pocilios de Ia placa.
Tras 24 h de incubación de las células a 370C y 5% CO2 se procedió a los tratamientos celulares con 100 μl de volumen total para las condiciones siguientes:
- Control: medio de cultivo (medio) - 3-Nitropropiónico (3-NP): medio más 3-NP 30 μM, que produce Ia muerte del 50% de las células.
- 3-NP más NST0037: medio más 3-NP (30 μM) más NST0037 a 0.1 , 1 , 4, 10, 40, 100 o 200 μM.
Las células fueron incubadas (a 370C y 5% CO2) con estos tratamientos durante 22 h, pasadas las cuales se añadió el reactivo WST-1 (Roche). El test WST-1 se basa en Ia medida de Ia actividad metabólica. El daño celular produce Ia pérdida de Ia habilidad de las células de obtener Ia energ ía necesaria para mantener sus funciones metabólicas y el crecimiento celular, por Io que las células metabólicamente activas (vivas) reducen Ia sal de tetrazolium a formazán mediante el sistema succinato-tetrazolium reductasa (de Ia cadena respiratoria mitocondrial). El formazán formado puede ser detectado colorimétricamente, ya que tiene una absorbancia de 440nm. A las 2 horas de añadido el reactivo se realizó Ia lectura en un lector de placas a 440 nm. Los resultados obtenidos se muestran, como aparece en Ia Figura 33, como el porcentaje de muerte celular para cada tratamiento referido a Ia muerte producida por 3-NP. Se observó protección de Ia muerte desde 1 a 100 μM de NST0037, alcanzando un 41 % a 40 μM. Estos resultados indican que el compuesto NST0037 muestra un efecto protector de Ia muerte de células humanas de origen neuronal causada por inhibición de enzima succinato deshidrogenasa.
EJEMPLO 12 Inhibición del NST0037 de Ia activación de caspasa 3/7 en un modelo celular de apoptosis
El ensayo fue realizado sobre células en cultivo de neuroblastoma humano SK-N-MC procedentes de "American Type Culture Collection (ATCC)", en todos los casos se siguieron estrictas normas de esterilidad y Ia manipulación se llevó a cabo en cabinas de seguridad biológica clase Il que siguen Ia norma europea EN 12469. Las células fueron mantenidas en el siguiente medio de cultivo:" Minimun Essential Médium Eagle" (MEM) suplementado con piruvato sódico 1 mM, L-glutamina 2 mM, aminoácido no esenciales 0,1 mM, gentamicina 0,05 mg/ml y suero fetal bovino 10%.
La inducción de apoptosis sobre las células en cultivo se realizó mediante incubación con camptotecina (CPT), que desencadena Ia activación
Ia apoptosis celular. La apoptosis fue determinada mediante Ia medida de Ia activación de las caspasas efectoras, caspasa 3 o caspasa 7, para Io que se utilizó un kit de detección fluorimétrica de caspasa 3/7 activa (Apo-ONE®
Homogeneous Caspase-3/7, Promega). La caspasa 3 ó 7 activa de las células, producen Ia ruptura de un sustrato, Io que lleva a Ia emisión de fluorescencia, que es leída mediante un fluorímetro. De esta manera, se analizó el efecto del pretratamiento del compuesto NST0037 a 10 y 40 μM sobre Ia activación de Ia caspasa 3/7 producida por 50 μM de camptotecina (CPT) en las células SK-N-
MC. Estas células, en pase no superior a 15, fueron sembradas sobre placas de 96 pocilios tratadas para células adherentes con una concentración celular de 5x104 células/pocilio, para cada condición del ensayo se sembraron 3 pocilios de Ia placa. Tras 24 h de incubación de las células a 37 0C y 5% CO2 se procedió al pretratamiento con NST0037 a 10 y 40 μM.
Tras 24 h, se realizaron los tratamientos celulares con 100 μl de volumen total para las condiciones siguientes: Control: medio de cultivo (medio) Camptotecina (CPT): medio con CPT a 50 μM - Camptotecina (CPT): medio con CPT a 50 μM, con diferentes pretratamientos con NST0037 (10 ó 40 μM) y/o mevalonato (MEV; a 100 μM) o Z-VAD-fmk (50 μM). Las células fueron incubadas (a 37 0C y 5% CO2) con estos tratamientos durante 6 h, tras Io que se añadió el tampón de lisis celular y el sustrato de las caspasas a las concentraciones especificadas por el fabricante; se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos y después se congeló a -2O0C durante una noche. Al día siguiente se midió Ia fluorescencia (499/521 nm, Exci/Emi).
En Ia Figura 34 se muestra el porcentaje de activación de Ia caspasa 3/7 respecto a las células control de los diferentes tratamientos. Se observó una inhibición de Ia caspasa 3/7 respecto a Ia camptotecina del 26 y 33 % a 10 y 40 μM de NST0037, respectivamente, Io que demuestra un efecto anti-apoptótico funcional de este compuesto. Por otro lado, el mevalonato revirtió esta inhibición, por Io que se demuestra que el efecto del NST0037 sobre Ia caspasa 3/7 está relacionado con Ia biosíntesis del colesterol o de alguno de los precursores de Ia ruta de biosíntesis de este. El Z-VAD-fmk, como inhibidor de caspasas, inhibió totalmente Ia activación de Ia caspasa 3/7.
EJEMPLO 13
El compuesto NST0037 reduce Ia producción del péptido β-amiloide en un modelo celular El ensayo fue realizado sobre células en cultivo de neuroblastoma humano SK-N-MC procedentes de "American Type Culture Collection (ATCC)" transfectadas establemente con una construcción que lleva el gen APP (proteína precursora del beta amiloide, Gen ID: 351 ) en Ia isoforma 695, que es Ia variante más frecuente expresada en neuronas, con Io que se consigue sobreexpresión de Ia proteína APP. En todos los casos se siguieron estrictas normas de esterilidad y Ia manipulación se llevó a cabo en cabinas de seguridad biológica clase Il que siguen Ia norma europea EN 12469. Las células fueron mantenidas en el siguiente medio de cultivo: "Minimun Essential Médium Eagle" (MEM) suplementado con piruvato sódico 1 mM, L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, gentamicina 0,05 mg/ml y suero fetal bovino 10%, Ia expresión de APP se selecciona mediante Ia adición del antibiótico higromicina B a 0.16 mg/mL. Estas células, en pase no superior a 15, fueron sembradas sobre placas de 6 pocilios tratadas para células adherentes con una concentración celular de 8x105 células/pocilio, para cada condición del ensayo se sembraron 2 pocilios de Ia placa. Tras 24 h de incubación de las células a 370C y 5% CO2 se procedió a los tratamientos celulares con 2 mi de volumen total para las condiciones siguientes:
- Control: medio de cultivo (medio)
- NST0037: medio más NST0037 a 1 , 4, 10 ó 40 μM.
Las células fueron incubadas (a 370C y 5% CO2) con estos tratamientos durante 48 h, recogiéndose entonces 500 μl de medio condicionado para realizar las medidas. Del medio condicionado fueron eliminados los restos celulares mediante centrifugación a 300xg y después se añadió inhibidores de proteasas (Mini EDTA-free, Roche). Se midieron las dos especies más frecuentes de Aβ: 1 -40 y 1 -42. Para Aβ(1 -42) fue necesario concentrar el medio 5 veces para realizar las medidas, utilizando el sistema de filtración Amicon Ultra (Millipore). Se analizó Ia cantidad de Aβ(1 -40) y Aβ(1-42) del medio condicionado para cada tratamiento mediante ELISA (Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas), utilizando el kit "beta amyloid 40 ELISA" y "beta amyloid 42 ELISA" (Biosource), siguiendo las recomendaciones del fabricante. Los resultados se cuantificaron utilizando una curva de concentraciones crecientes con péptidos sintéticos. Los valores básales de Aβ secretado en estas células son de 1340+141 pg/ml para Aβ(1-40) y de y 20+3 pg/mL para Aβ(1 -42).
Los resultados obtenidos para los tratamientos se muestran en Ia Figura 35, en Ia que se muestra el porcentaje de Aβ(1-40) (A) y Aβ(1 -42) (B) respecto a las células control a 48 h. Para Aβ(1 -40) se obtiene una reducción tras el tratamiento con 10, 40 y 100 μM de NST0037. Para Aβ(1-42) se obtuvo una reducción tanto a 10 como a 40 μM de NST0037.
De estos resultados se concluye que NST0037 reduce Ia secreción de Aβ en células de neuroblastoma humano que sobreexpresan APP. La producción de Aβ se ha relacionado con muerte celular tanto in vitro como in vivo y, además, está asociado con las placas seniles que se encuentran en los enfermos de alzhéimer.
EJEMPLO 14 Efecto del mevalonato sobre Ia protección por NST0037 de Ia muerte neuronal inducida por estrés oxidativo.
El ensayo fue realizado sobre células en cultivo de neuroblastoma humano SK-N-MC procedentes de "American Type Culture Collection (ATCC)", en todos los casos se sigu ieron estrictas normas de esteril idad y Ia manipulación se llevó a cabo en cabinas de seguridad biológica clase Il que siguen Ia norma europea EN 12469. Las células fueron mantenidas en el siguiente medio de cultivo: "Minimun Essential Médium Eagle" (MEM) suplementado con piruvato sódico 1 mM, L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 0.1 mM, gentamicina 0.05 mg/ml y suero fetal bovino 10%. Se analizó el efecto del mevalonato sobre Ia protección producida por el compuesto NST0037 de Ia muerte celular causada por el tratamiento con xantina/xantina oxidasa que origina daño oxidativo y muerte celular. Estas células, en pase no superior a 15, fueron sembradas sobre placas de 96 pocilios tratadas para células adherentes con una concentración celular de 5x104 células/pocilio; para cada condición del ensayo se sembraron 3 pocilios de Ia placa.
Tras 24 h de incubación de las células a 37 0C y 5% CO2 se procedió a los tratamientos celulares con 100 μl de volumen total para las condiciones siguientes: - Control: medio de cultivo
- Xantina/xantina oxidasa (XXO): medio más xantina 10 μM/ xantina oxidasa 60 mU/mL, que produce Ia muerte del 50% de las células.
- XXO más NST0037: medio más XXO (10 μM / 60 mU/mL) más NST0037 a 40 μM. - XXO más mevalonato: medio más XXO (10 μM / 60 mU/mL) más mevalonato a 10, 40 ó 100 μM.
- XXO más NST0037 más mevalonato: medio más XXO (10 μM / 60 mU/mL) más NST0037 a 40 μM más mevalonato a 10, 40 ó 100 μM. Las células fueron incubadas (a 370C y 5% CO2) con los tratamientos durante 22 h, pasadas las cuales se añadió el reactivo WST-1 (Roche). El test WST-1 se basa en Ia medida de Ia actividad metabólica. El daño celular produce Ia pérdida de Ia habilidad de las células de obtener Ia energ ía necesaria para mantener sus funciones metabólicas y el crecimiento celular, por Io que las células que metabólicamente activas (vivas) reducen Ia sal de tetrazolium a formazán mediante el sistema succinato-tetrazolium reductasa (de Ia cadena respiratoria mitocondrial). El formazán formado puede ser detectado colorimétricamente, ya que tiene una absorbancia de 440nm. A las 2 horas de añadido el reactivo se realizó Ia lectura en un lector de placas a 440 nm.
Los resultados obtenidos se muestran, como aparece en Ia Figura 36, como el porcentaje de muerte celular para cada tratamiento referido a Ia muerte producida por Ia XXO. Se observó que el mevalonato por sí solo no protege de Ia muerte por XXO, ni produce aumento de toxicidad, mientras que el NST0037 a 40 μM protegió un 57 % de Ia muerte y este efecto fue inhibido por Ia adición de mevalonato a 10, 40 y 100 μM, siendo las diferencias estadísticamente significativas, según Ia t de Student, para 10 y 100 μM. Estos resultados indican que Ia protección observada del compuesto NST0037 está relacionada con Ia biosíntesis del colesterol o de alguno de los precursores de Ia ruta.
EJEMPLO 15
Protección por NST0037 de las huellas neuropatolóqicas asociadas a Ia muerte neuronal en el hipocampo 15.1. Efecto protector de NST0037 de Ia distrofia neurítica producida por una sustancia excitotóxica en el hipocampo
En base a los resultados de neuroprotección, los inventores decidieron averiguar si el efecto neuroprotector de NST0037 en el hipocampo demostrado en un modelo de enfermedad de Alzheimer esporádica en ratón mediante administración de kainato (KA) estaba acompañado de Ia protección de otro signo de daño neuronal como es Ia distrofia neurítica.
Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 12 semanas de edad y de Ia cepa FVB/NHan. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con Ia máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones.
Veinticinco animales fueron utilizados en este ensayo y los tratamientos llevados a cabo, todos por vía intraperitoneal (i.p.) con un volumen de 100 μl, según las siguientes pautas: i) Pauta PBS+PBS+PBS: 4 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una nueva dosis de PBS y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de PBS. ii) Pauta NST0037+KA+NST0037: 7 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días con NST0037 a 50 mg/kg, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/Kg y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg. iii) Pauta PBS+KA+PBS: 7 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 d ías, en el segundo d ía los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/Kg y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de PBS. iv) Pauta PBS+KA+NST0037: 7 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/Kg y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg. Una vez concluido el tiempo de 7 días de tratamiento los animales fueron sacrificados y los encéfalos fueron diseccionados. Las muestras de encéfalo fueron procesadas e incluidas en parafina. Para el análisis de Ia distrofia neurítica en el hipocampo se realizó Ia inmunohistoquímica de campo claro contra Ia proteína asociada a microtúbulos tipo 2 (MAP2) en cortes coronales de 5 μm de grosor. Como muestra Ia Figura 37, Ia pauta de administración PBS+KA+PBS produce una disminución del mareaje de MAP2 en especial en zonas de CA1 , CA3 y giro dentado del hipocampo, respecto a Ia pauta de administración PBS+PBS+PBS que muestra un mareaje uniforme. Sin embargo, las muestras del grupo NST0037+KA+NST0037 presentaron un patrón de tinción igual a los controles (grupo PBS+PBS+PBS) sin evidencias de distrofia neurítica en estas regiones del hipocampo. Además, y de manera sorprendente, observamos que el tratamiento con NST0037 tras el pretratamiento con PBS y Ia inoculación de KA disminuye claramente Ia pérdida de mareaje de MAP2 en el hipocampo. En resumen, el tratamiento con NST0037, tanto anterior como posterior a Ia inoculación de KA, protege de Ia distrofia neurítica producida por éste en el hipocampo.
15.2. Efecto protector de NST0037 del daño oxidativo producido por una sustancia excitotóxica en el hipocampo En base a los resultados de protección de Ia neurodegeneración y Ia distrofia neurítica , los i nventores decid ieron averig uar si el efecto neuroprotector de NST0037 en el hipocampo demostrado en un modelo de enfermedad de Alzheimer esporádica en ratón mediante administración de kainato (KA) estaba acompañado de Ia protección de otro signo d e neurodegeneración asociado a Ia enfermedad como es el daño oxidativo.
Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 12 semanas de edad y de Ia cepa FVB/NHan. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con Ia máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones.
Veinticinco animales fueron utilizados en este ensayo y los tratamientos llevados a cabo, todos por vía intraperitoneal (i.p.) con un volumen de 100 μl, según las siguientes pautas: i) Pauta PBS+PBS+PBS: 4 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 d ías, en el segundo d ía los animales fueron inoculados con una nueva dosis de PBS y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de PBS. ii) Pauta NST0037+KA+NST0037: 7 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días con NST0037 a 50 mg/kg, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/Kg y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg. iii) Pauta PBS+KA+PBS: 7 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/Kg y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de PBS. iv) Pauta PBS+KA+NST0037: 7 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/Kg y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg.
Una vez concluido el tiempo de 7 días de tratamiento los animales fueron sacrificados y los encéfalos fueron diseccionados. Las muestras de encéfalo fueron procesadas e incluidas en parafina. Para el análisis del daño oxidativo por peroxidación lipídica en el hipocampo se realizó Ia inmunohistoquímica de campo claro contra el 4-hidroxinonenal (HNE) en cortes coronales de 5 μm de grosor.
Como muestra Ia Figura 38, Ia pauta de administración PBS+KA+PBS produce un aumento de Ia señal de HNE en Ia región CA3 del hipocampo respecto a Ia pauta de administración PBS+PBS+PBS que no muestra este mareaje de peroxidación lipídica. Sin embargo, las muestras del grupo NST0037+KA+NST0037 presentaron un patrón de tinción igual a los controles (grupo PBS+PBS+PBS) sin neuronas marcadas con HNE en estas regiones del hipocampo. Además, y de manera sorprendente, observamos que el tratamiento con NST0037 tras el pretratamiento con PBS y Ia inoculación de KA reduce el número de neuronas con mareaje de HNE en el hipocampo. En resumen, el tratamiento con NST0037, tanto anterior como posterior a Ia inoculación de KA, protege del daño oxidativo inducido por este en el hipocampo.
15.3. Efecto protector de NST0037 de Ia apoptosis producida por una sustancia excitotóxica en el hipocampo
En base a los anteriores resultados, los inventores decidieron averiguar si el efecto antioxidante de NST0037 en el hipocampo demostrado en un modelo de enfermedad de Alzheimer esporádica en ratón mediante administración de kainato (KA) estaba acompañado de Ia protección frente a Ia muerte por apoptosis, mecanismo que está asociado a Ia enfermedad.
Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 12 semanas de edad y de Ia cepa FVB/NHan. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con Ia máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones.
Veinticinco animales fueron utilizados en este ensayo y los tratamientos llevados a cabo, todos por vía intraperitoneal (i.p.) con un volumen de 100 μl, según las siguientes pautas: i) Pauta PBS+PBS+PBS: 4 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 d ías, en el segundo d ía los animales fueron inoculados con una nueva dosis de PBS y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de PBS. ii) Pauta NST0037+KA+NST0037: 7 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días con NST0037 a 50 mg/kg, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/Kg y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg. iii) Pauta PBS+KA+PBS: 7 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 d ías, en el segundo d ía los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/Kg y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de PBS. iv) Pauta PBS+KA+NST0037: 7 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/Kg y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg.
Una vez concluido el tiempo de 7 días de tratamiento los animales fueron sacrificados y los encéfalos fueron diseccionados. Las muestras de encéfalo fueron procesadas e incluidas en parafina. Para el análisis de Ia presencia de neuronas en apoptosis en el hipocampo se realizó Ia técnica de T. U . N . E . L . (Marcación de Ia UTP fi nal med iada por I a transferasa desoxinucleotidil terminal del inglés TdT-mediated dUTP nick end labelling) de fluorescencia en cortes coronales de 5 μm de grosor.
La pauta de administración PBS+KA+PBS produce muerte neuronal por apoptosis en el hipocampo y en especial en las regiones CA1 , CA3 (Figura 38) y giro dentado. Sin embargo, las muestras del grupo NST0037+KA+NST0037 no presentaron neuronas positivas para T.U.N.E.L. mostrando un patrón igual a los controles (grupo PBS+PBS+PBS). Adicionalmente, observamos que el tratamiento con NST0037 tras el pretratamiento con PBS y Ia inoculación de KA reduce el número de neuronas en apoptosis a unas pocas células aisladas en
Ia región CA3 del hipocampo.
En resumen, el tratamiento con NST0037, tanto anterior como posterior a Ia inoculación de KA, protege del daño oxidativo y de Ia apoptosis inducida por este en las neuronas del hipocampo. 15.4. Efecto protector de NST0037 de Ia astroqliosis producida por una sustancia excitotóxica en el hipocampo
En base a los anteriores resultados, los inventores decidieron averiguar si el efecto antioxidante y antiapoptótico mostrado por el NST0037 en el hipocampo demostrado en un modelo de enfermedad de Alzheimer esporádica en ratón mediante administración de kainato (KA) estaba acompañado de Ia reducción de Ia astrogliosis reactiva, que es otra huella histopatológica que se detecta en el cerebro de pacientes de Ia enfermedad de Alzheimer.
Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 12 semanas de edad y de Ia cepa FVB/NHan. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con Ia máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones. Veinticinco animales fueron utilizados en este ensayo y los tratamientos llevados a cabo, todos por vía intraperitoneal (i.p.) con un volumen de 100 μl, según las siguientes pautas: i) Pauta PBS+PBS+PBS: 4 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 d ías, en el segundo día los animales fueron inoculados con una nueva dosis de PBS y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de PBS. ii) Pauta NST0037+KA+NST0037: 7 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días con NST0037 a 50 mg/kg, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/Kg y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg. iii) Pauta PBS+KA+PBS: 7 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 d ías, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/Kg y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de PBS. iv) Pauta PBS+KA+NST0037: 7 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/Kg y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg.
Una vez concluido el tiempo de 7 días de tratamiento los animales fueron sacrificados y los encéfalos fueron diseccionados. Las muestras de encéfalo fueron procesadas e incluidas en parafina. El análisis de Ia astrogliosis reactiva se realizó mediante Ia inmunohistoquímica de campo claro contra Ia proteína fibrilar acida de Ia glía (GFAP) en cortes coronales de 5 μm de grosor, Ia cual está presente en los astrocitos.
La pauta de administración PBS + KA+PBS produce un aumento significativo de Ia activación y propagación de astrocitos en el neuropilo del hipocampo (Figura 38). Por el contrario, las muestras del grupo
NST0037+KA+NST0037 presentaron un patrón astrocítico muy similar al de los controles (grupo PBS+PBS+PBS). Sorprendentemente, también observamos que el tratamiento con NST0037 tras el pretratamiento con PBS y Ia inoculación de KA reduce el número de astrocitos y Ia intensidad del mareaje con GFAP en el hipocampo.
En resumen, el tratamiento con NST0037, tanto anterior como posterior a Ia inoculación de KA, protege del daño oxidativo, de Ia apoptosis y evita Ia astrogliosis reactiva inducida por este en Ia región del hipocampo.
EJEMPLO 16
Protección por NST0037 de los síntomas clínicos, de los déficits locomotores, de Ia neurodeqeneración y de Ia muerte neuronal causada por una neuortoxina parkinsoniana administrada de forma En base a los resultados de neuro protección demostrada por el compuesto NST0037 en un modelo de enfermedad de Alzheimer esporádica en ratón, los investigadores decidieron evaluar Ia capacidad neuroprotectora del compuesto en un modelo de Ia enfermedad de Parkinson basado en Ia muerte de neuronas dopaminérgicas inducida por una sustancia neurotóxica como es el 1 -metil-4-fenil-1 ,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) . La inyección sistémica de
MPTP en ratón induce una muerte masiva de las neuronas dopaminérgicas de
Ia sustancia nigra, Io cual reduce Ia concentración de dopamina en esta región y en otras como el estriado que están muy vinculadas a Ia actividad locomotora en humanos. Debido a estos fenómenos este modelo ha sido ampliamente utilizado para el estudio de Ia enfermedad de Parkinson ya que reproduce uno de los eventos centrales en dicha enfermedad como es el deterioro motor. En este ejemplo se presentan los resultados del análisis del efecto de NST0037 frente a Ia neurodegeneración y los síntomas que induce el MPTP en una administración aguda.
16.1. Efecto protector de NST0037 frente a Ia muerte causada por Ia administración aguda de una sustancia neurotóxica que induce Ia muerte de las neuronas dopaminérqicas
Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 12 semanas de edad y de Ia cepa CD1. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con Ia máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones.
Cuarenta animales fueron utilizados en este ensayo y los tratamientos llevados a cabo con un volumen de 100 μl, según las siguientes pautas: i) Pauta PBS+PBS+PBS: 10 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días por vía subcutánea (s.c), en el segundo día los animales fueron inoculados con 4 dosis de PBS, a intervalos de 2 horas por vía intraperitoneal (i.p.). Durante los siguientes 7 días se les administró una dosis diaria de PBS por vía s.c. ii) Pauta PBS+MPTP+PBS: 10 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días de PBS por vía s.c, en el segundo día los animales fueron inoculados con 4 dosis de MPTP a 20 mg/Kg, a intervalos de 2 horas por vía i.p. Durante los siguientes 7 días se les administró una dosis diaria de PBS por vía s.c.
MI) Pauta NST0037+MPTP+NST0037: 10 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días de NST0037 a 50 mg/kg por vía s.c, en el segundo día los animales fueron inoculados con 4 dosis de MPTP a 20 mg/Kg, a intervalos de 2 horas por vía i.p. Durante los siguientes 7 días se les administró una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg por vía s.c. Durante todo el procedimiento experimental fueron registrados los óbitos en los distintos grupos de tratamiento, con estos datos se realizaron las correspondientes curvas de supervivencia que se presentan en Ia Figura 39.
La pauta de administración PBS+MPTP+PBS produce un aumento estadísticamente significativo (p<0.05) de Ia mortalidad en los ratones. Sin embargo, y de forma sorprendente, el tratamiento con NST0037 promueve Ia supervivencia de los animales tras Ia administración aguda de MPTP ya que no se observaron diferencias significativas entre el grupo NST0037+MPTP+NST0037 y el grupo PBS+PBS+PBS (p>0.05). 16.2. Efecto protector de NST0037 frente al declive en Ia resistencia motora causado por Ia administración aguda de una sustancia neurotóxica que induce Ia muerte de las neuronas dopaminérgicas
Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 12 semanas de edad y de Ia cepa CD1. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con Ia máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones. Cuarenta animales fueron utilizados en este ensayo y los tratamientos llevados a cabo con un volumen de 100 μl, según las siguientes pautas: i) Pauta PBS+PBS+PBS: 10 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días por vía subcutánea (s.c), en el segundo día los animales fueron inoculados con 4 dosis de PBS, a intervalos de 2 horas por vía intraperitoneal (i.p.). Durante los siguientes 7 días se les administró una dosis diaria de PBS por vía s.c. ii) Pauta PBS+MPTP+PBS: 10 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días de PBS por vía s.c, en el segundo día los animales fueron inoculados con 4 dosis de MPTP a 20 mg/Kg, a intervalos de 2 horas por vía i.p. Durante los siguientes 7 días se les administró una dosis diaria de PBS por vía s.c.
MI) Pauta NST0037+MPTP+NST0037: 10 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días de NST0037 a 50 mg/kg por vía s.c, en el segundo día los animales fueron inoculados con 4 dosis de
MPTP a 20 mg/Kg, a intervalos de 2 horas por vía i.p. Durante los siguientes 7 días se les administró una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg por vía s.c.
Antes del inicio de los tratamientos y una vez concluido el tiempo de 7 días de tratamiento les fue realizado a los animales un test de resistencia locomotora denominado test de Rota-rod durante 2 minutos, registrando el tiempo que resistían los animales caminando por un cilindro que aumentaba su velocidad desde los 4 a los 40 r.p.m. En Ia figura 40 se muestra Ia ratio, entre el final del ensayo y el estado basal, del tiempo que los animales de los diferentes grupos se mantienen caminando sobre el cilindro.
La pauta de administración PBS+MPTP+PBS produce una disminución estadísticamente significativa de Ia resistencia motora en los ratones desde su estado basal hasta 7 días después de Ia administración aguda del MPTP (p<0.05). Sin embargo, sorprendentemente, el tratamiento con NST0037 evita el deterioro motor de los animales manteniendo Ia resistencia de los ratones en el nivel que mostraban antes de Ia administración del MPTP (p>0.05), patrón que es igual al de los ratones no inyectados con MPTP y tratados con PBS (p>0.05).
En resumen, el tratamiento con NST0037 protege de Ia pérdida de resistencia inducida por Ia administración aguda de MPTP.
16.2. Efecto protector de NST0037 frente a Ia disminución de Ia fuerza causada por Ia administración aguda de una sustancia neurotóxica que induce Ia muerte de las neuronas dopaminérgicas
Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 12 semanas de edad y de Ia cepa CD1. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con Ia máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones.
Cuarenta animales fueron utilizados en este ensayo y los tratamientos llevados a cabo con un volumen de 100 μl, según las siguientes pautas: i) Pauta PBS+PBS+PBS: 10 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días por vía subcutánea (s.c), en el segundo día los animales fueron inoculados con 4 dosis de PBS, a intervalos de 2 horas por vía intraperitoneal (i.p.)- Durante los siguientes 7 días se les administró una dosis diaria de PBS por vía s.c. ii) Pauta PBS+MPTP+PBS: 10 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días de PBS por vía s.c, en el segundo día los animales fueron inoculados con 4 dosis de MPTP a 20 mg/Kg, a intervalos de 2 horas por vía i.p. Durante los siguientes 7 días se les administró una dosis diaria de PBS por vía s.c.
MI) Pauta NST0037+MPTP+NST0037: 10 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días de NST0037 a 50 mg/kg por vía s.c, en el segundo día los animales fueron inoculados con 4 dosis de MPTP a 20 mg/Kg, a intervalos de 2 horas por vía i.p. Durante los siguientes 7 días se les administró una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg por vía s.c.
Antes del inicio de los tratamientos y una vez concluido el tiempo de 7 días de tratamiento les fue realizado a los animales un test de fuerza en las denominado test de Grip-strength, registrando Ia fuerza de agarre a una barra en gramos que realizaban los animales con las patas delanteras por quintuplicado. En Ia figura 41 se muestra Ia ratio, entre Ia fuerza mostrada por los animales al final del ensayo respecto Ia del estado basal.
La pauta de administración PBS+MPTP+PBS produce una disminución estadísticamente significativa de Ia fuerza que los ratones ejercen al agarrarse con las patas delanteras desde su estado basal hasta 7 días después de Ia administración aguda del MPTP (p<0.05). Además, el tratamiento con NST0037 evita Ia pérdida de fuerza que induce el MPTP y tras 7 días de tratamiento los ratones del grupo NST0037+MPTP+NST0037 muestran unos niveles de fuerza iguales a los de antes de Ia administración del MPTP (p>0.05), patrón que es muy similar al de los ratones no inyectados con MPTP y tratados con PBS (p>0.05).
En resumen, el tratamiento con NST0037 protege de Ia pérdida de resistencia y de fuerza inducida por Ia administración aguda de MPTP.
16.3. Efecto protector de NST0037 frente a Ia neurodegeneración causada por Ia administración aguda de una sustancia neurotóxica que induce Ia muerte de las neuronas dopaminérgicas
Basándose en los resultados anteriores, los inventores quisieron determinar si Ia protección que mostraba el compuesto NST0037 frente al deterioro del estado psicomotor producido por el MPTP, se veía acompañado de Ia neurodegeneración en regiones del cerebro implicadas en Ia actividad locomotora, y relacionadas con Ia enfermedad de Parkinson como son Ia sustancia nigra y el estriado.
Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 12 semanas de edad y de Ia cepa CD1. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con Ia máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones. Cuarenta animales fueron utilizados en este ensayo y los tratamientos llevados a cabo con un volumen de 100 μl, según las siguientes pautas: i) Pauta PBS+PBS+PBS: 10 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días por vía subcutánea (s.c), en el segundo día los animales fueron inoculados con 4 dosis de PBS, a intervalos de 2 horas por vía intraperitoneal (i.p.). Durante los siguientes 7 días se les administró una dosis diaria de PBS por vía s. c. ii) Pauta PBS+MPTP+PBS: 10 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días de PBS por vía s.c, en el segundo día los animales fueron inoculados con 4 dosis de MPTP a 20 mg/Kg, a intervalos de 2 horas por vía i.p. Durante los siguientes 7 días se les administró una dosis diaria de PBS por vía s.c.
MI) Pauta NST0037+MPTP+NST0037: 10 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días de NST0037 a 50 mg/kg por vía s.c, en el segundo día los animales fueron inoculados con 4 dosis de
MPTP a 20 mg/Kg, a intervalos de 2 horas por vía i.p. Durante los siguientes 7 días se les administró una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg por vía s.c.
Una vez concluido el tiempo de 7 días de tratamiento los animales fueron sacrificados y los encéfalos fueron diseccionados. Las muestras de encéfalo fueron procesadas e incluidas en parafina. Para el análisis de Ia neurodegeneración en Ia sustancia nigra y del estriado se realizó Ia tinción fluorescente de Fluoro Jade B (FJB) en cortes sagitales de 5 μm de grosor. En
Ia figura 42 se muestra una fotografía representativa de cada grupo y en ambas zonas bajo estudio.
La pauta de administración PBS+MPTP+PBS produce un claro aumento de las células positivas para FJB tanto en Ia sustancia nigra como en el estriado respecto a las muestras del grupo PBS+PBS+PBS. En contraste, las muestras del grupo NST0037+MPTP+NST0037 presentaron un número de células en degeneración y positivas para FJB significativamente menor a las del grupo PBS+MPTP+PBS.
En resumen , el tratam iento con NST0037 protege del deterioro psicomotor y de Ia neurodegeneración, inducida por Ia administración aguda de MPTP, en las neuronas dopaminérgicas de Ia sustancia nigra, así como de las terminaciones nerviosas que inervan el estriado. 16.4. Efecto protector de NST0037 frente a Ia pérdida de neuronas dopaminérgicas por Ia administración aguda de una sustancia neurotóxica
Basándose en los resultados anteriores, los inventores quisieron determinar si Ia protección que mostraba el compuesto NST0037 frente a Ia neurodegeneración producida por el MPTP, se veía acompañada de Ia protección de neuronas dopaminérgicas en regiones del cerebro deterioradas en Ia enfermedad de Parkinson como son Ia sustancia nigra y el estriado.
Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 12 semanas de edad y de Ia cepa CD1. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con Ia máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones. Cuarenta animales fueron utilizados en este ensayo y los tratamientos llevados a cabo con un volumen de 100 μl, según las siguientes pautas: i) Pauta PBS+PBS+PBS: 10 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días por vía subcutánea (s.c), en el segundo día los animales fueron inoculados con 4 dosis de PBS, a intervalos de 2 horas por vía intraperitoneal (i.p.). Durante los siguientes 7 días se les administró una dosis diaria de PBS por vía s.c. ii) Pauta PBS+MPTP+PBS: 10 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días de PBS por vía s.c, en el segundo día los animales fueron inoculados con 4 dosis de MPTP a 20 mg/Kg, a intervalos de 2 horas por vía i.p. Durante los siguientes 7 días se les administró una dosis diaria de PBS por vía s.c.
MI) Pauta NST0037+MPTP+NST0037: 10 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días de NST0037 a 50 mg/kg por vía s.c, en el segundo día los animales fueron inoculados con 4 dosis de
MPTP a 20 mg/Kg, a intervalos de 2 horas por vía i.p. Durante los siguientes 7 días se les administró una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg por vía s.c.
Una vez concluido el tiempo de 7 días de tratamiento los animales fueron sacrificados y los encéfalos fueron diseccionados. Las muestras de encéfalo fueron procesadas e incluidas en parafina. Para el análisis de Ia presencia de neuronas dopaminérgicas en Ia sustancia nigra y del estriado se realizó Ia inmunohistoquímica contra Ia proteína tirosina-hidroxilasa (TH) en cortes sagitales de 5 μm de grosor. En Ia figura 43 se muestra una fotografía representativa de cada grupo y en ambas zonas bajo estudio. La pauta de administración PBS+MPTP+PBS produce una evidente disminución de Ia cantidad de neuronas dopaminérgicas ya que se detecta una ausen cia cl a ra d e m a reaj e con TH en com pa rac ión con el g ru po PBS+PBS+PBS, tanto en los cuerpos neuronales de Ia sustancia nigra como en las extensiones nerviosas en el estriado. En cambio, las muestras del grupo NST0037+MPTP+NST0037 presentaron un mayor número de células TH- positivas en Ia sustancia nigra así como una mayor intensidad de mareaje en el estriado que las del grupo PBS+MPTP+PBS.
En resumen , el tratam iento con NST0037 protege del deterioro psicomotor de los ratones, además de Ia neurodegeneración y de Ia muerte neuronal inducida por Ia administración aguda de MPTP, en Ia sustancia nigra y el estriado.
EJEMPLO 17 Protección por NST0037 de los déficits locomotores, de Ia muerte neuronal v del daño oxidativo causado por una neurotoxina parkinsoniana administrada de forma subcrónica
Debido a los resultados obtenidos y presentados en el Ejemplo 16 los inventores decidieron analizar el efecto del NST0037 en los síntomas clínicos y en Ia neuropatología inducida en Ia sustancia nigra por Ia administración subcrónica del MPTP en ratón. 17.1. Efecto protector de NST0037 frente al declive en Ia resistencia motora causado por Ia administración subcrónica de una sustancia neurotóxica que induce Ia muerte de las neuronas dopaminérgicas
Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 12 semanas de edad y de Ia cepa CD1. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con Ia máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones.
Veinte animales fueron utilizados en este ensayo y los tratamientos, todos por vía intraperitoneal, fueron llevados a cabo con un volumen de 100 μl, según las siguientes pautas: i.) Pauta PBS+MPTP+PBS: 10 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días de PBS, a partir del segundo día los animales fueron inoculados con 1 dosis diaria de MPTP a 30 mg/Kg durante 5 días, a intervalos de 2 horas por vía i.p. Durante los siguientes 21 días se les administró 3 dosis semanales de PBS. ii.) Pauta NST0037+MPTP+NST0037: 10 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días de NST0037 a 50 mg/kg, a partir del segundo día los animales fueron inoculados con 1 dosis diaria de MPTP a 30 mg/Kg durante 5 días, a intervalos de 2 horas por vía i.p. Durante los siguientes 21 días se les administró 3 dosis semanales de NST0037 a 50 mg/kg. Siete días antes del inicio de los tratamientos y a los 7, 14 y 21 días post-inoculación del M PTP les fue real izado a los animales un test de resistencia locomotora denominado test de Rota-rod durante 2 minutos, registrando el tiempo que resistían los animales caminando por un cilindro que aumentaba su velocidad desde los 4 a los 40 r.p.m. En Ia figura 44 se muestra Ia ratio, entre los diferentes puntos temporales del ensayo y el estado basal, del tiempo que los animales de los diferentes grupos se mantienen caminando sobre el cilindro.
La pauta de administración PBS+MPTP+PBS produce una disminución estadísticamente significativa de Ia resistencia motora en los ratones desde su estado basal a partir de los 14 días después de Ia administración subcrónica del MPTP (p<0.05). Sin embargo, sorprendentemente, el tratamiento con NST0037 evita el deterioro motor de los animales manteniendo Ia resistencia de los ratones en el nivel que mostraban antes de Ia administración del MPTP (p>0.05). En resumen, el tratamiento con NST0037 protege de Ia pérdida de resistencia inducida por Ia administración sub-crónica de MPTP.
17.2. Efecto protector de NST0037 frente a Ia pérdida de neuronas dopaminérgicas por Ia administración subcrónica de una sustancia neurotóxica Basándose en los resultados anteriores, los inventores quisieron determinar si Ia protección que mostraba el compuesto NST0037 frente al deterioro del estado psicomotor producido por el MPTP, se veía acompañada de neurodegeneración en una de las regiones más importantes del cerebro que está implicada en Ia enfermedad de Parkinson como es Ia sustancia nigra.
Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 12 semanas de edad y de Ia cepa CD1. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con Ia máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones.
Veinte animales fueron utilizados en este ensayo y los tratamientos, todos por vía intraperitoneal, fueron llevados a cabo con un volumen de 100 μl, según las siguientes pautas: i.) Pauta PBS+MPTP+PBS: 10 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días de PBS, a partir del segundo día los animales fueron inoculados con 1 dosis diaria de MPTP a 30 mg/Kg durante 5 días, a intervalos de 2 horas por vía i.p. Durante los siguientes 21 días se les administró 3 dosis semanales de PBS. ii.) Pauta NST0037+MPTP+NST0037: 10 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días de NST0037 a 50 mg/kg, a partir del segundo día los animales fueron inoculados con 1 dosis diaria de
MPTP a 30 mg/Kg durante 5 días, a intervalos de 2 horas por vía i.p. Durante los siguientes 21 días se les administró 3 dosis semanales de NST0037 a 50 mg/kg.
Una vez concluido el tiempo de 21 días de tratamiento los animales fueron sacrificados y los encéfalos fueron diseccionados. Las muestras de encéfalo fueron procesadas e incluidas en parafina. Para el análisis de Ia presencia de neuronas dopaminérgicas en Ia sustancia nigra se realizó Ia inmunohistoquímica contra Ia proteína tirosina-hidroxilasa (TH) en cortes sagitales de 5 μm de grosor. En Ia Figura 45 se muestra una fotografía representativa de cada grupo.
La pauta de administración PBS+MPTP+PBS produce una evidente pérdida de neuronas dopaminérgicas ya que observamos una ausencia clara de mareaje con TH en algunas regiones de Ia sustancia nigra. En cambio, las muestras del grupo NST0037+MPTP+NST0037 presentaron un mayor número de células TH-positivas en Ia misma región de Ia sustancia nigra.
En resumen, el tratamiento con NST0037 protege del deterioro psicomotor de los ratones, además de Ia muerte neuronal inducida en Ia sustancia nigra por Ia administración subcrónica de MPTP.
17.3. Efecto protector de NST0037 frente al daño oxidativo inducido por Ia administración subcrónica de una sustancia neurotóxica para las neuronas dopaminérgicas
Basándose en los resultados anteriores, los inventores quisieron determinar si Ia neuroprotección mostrada por el compuesto NST0037 frente a
Ia neurodegeneración producida por el MPTP en Ia sustancia nigra se veía acompañada de Ia reducción de otra huella histopatológica del daño neuronal como es el daño oxidativo. Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 12 semanas de edad y de Ia cepa CD1. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con Ia máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones.
Veinte animales fueron utilizados en este ensayo y los tratamientos, todos por vía intraperitoneal, fueron llevados a cabo con un volumen de 100 μl, según las siguientes pautas: i.) Pauta PBS+MPTP+PBS: 10 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días de PBS, a partir del segundo d ía los animales fueron inoculados con 1 dosis diaria de MPTP a 30 mg/Kg durante 5 días, a intervalos de 2 horas por vía i.p. Durante los siguientes 21 días se les administró 3 dosis semanales de PBS. ii.) Pauta NST0037+MPTP+NST0037: 10 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días de NST0037 a 50 mg/kg, a partir del segundo día los animales fueron inoculados con 1 dosis diaria de MPTP a 30 mg/Kg durante 5 días, a intervalos de 2 horas por vía i.p. Durante los siguientes 21 días se les administró 3 dosis semanales de NST0037 a 50 mg/kg.
Una vez concluido el tiempo de 21 días de tratamiento los animales fueron sacrificados y los encéfalos fueron diseccionados. Las muestras de encéfalo fueron procesadas e incluidas en parafina. Para el análisis de Ia peroxidación lipídica en las neuronas de Ia sustancia nigra se realizó Ia inmunohistoquímica de campo claro contra el 4-hidroxinonenal (HNE) en cortes sagitales de 5 μm de grosor. En Ia Figura 45 se muestra una fotografía representativa de cada grupo.
La pauta de administración PBS+MPTP+PBS induce Ia presencia de mareaje contra HNE en numerosas neuronas de Ia sustancia nigra. En contraste, las muestras del grupo NST0037+MPTP+NST0037 presentan un número discreto de neuronas aisladas con mareaje HNE-positivo en Ia sustancia nigra.
En resumen , el tratam iento con NST0037 protege del deterioro psicomotor de los ratones, además de Ia muerte neuronal y del daño oxidativo por peroxidación lipídica inducido en Ia sustancia nigra por Ia administración sub-crónica de MPTP.
EJEMPLO 18
Estudio del paso de barrera hematoencefálica de Ia forma acida de NST0037 en un ensayo in vitro (PAMPA)
El ensayo tuvo por objeto predecir si el compuesto NST0037, en comparación con Ia simvastatina y Ia atorvastatina, en sus formas activas, eran capaces de atravesar Ia barrera hematoencefálica (BHE) para Io cual, dicha barrera se mimetizó en un sistema in vitro que permitió Ia evaluación del compuesto sin empleo de células. Para ello, se llevó a cabo el denominado ensayo PAMPA (Parallel Artificial Membrane Permeation Assay), que emplea un sistema sandwich que contempla el paso de compuestos por medio de difusión pasiva. Como control positivo se empleó verapamilo, un compuesto de elevada permeabilidad, mientras que como control negativo se empleó teofilina, un compuesto que no atraviesa BHE.
Para mimetizar Ia BHE se hizo uso de una mezcla de lípidos comercial derivada de cerebro de cerdo con una composición de fosfol ípidos muy semejante a Ia que constituye Ia barrera, y que se denomina PBL (Porcine Polar Brain Lipid). El verapamilo, Ia teofilina y Ia atorvastatina se prepararon a 10 mM en DMSO, mientras que el NST0037 y Ia simvastatina se prepararon en agua y se activaron con NaOH 0.1 N a 40C durante 12h.
En el momento del ensayo, se preparó 1 .5 mL de los compuestos a evaluar y de los controles, en todos los casos a 100 μM a partir de los stocks en un tampón fosfato a pH 7.4 que contenía fosfato sódico monobásico (0.41 M) y fosfato potásico dibásico (0.287M). Para ello se llevó a cabo una dilución 1/100 de los compuestos, igualando el contenido de DMSO al 1 % en todos los casos. En una placa con filtro de 96 pocilios, con una membrana de PVDF, con un tamaño de poro de 45 μm (MAIPN4550, Millipore) se añadieron 5 μl_ de PBL a 20 μg/mL. Transcurridos dos minutos, se añadieron 300 μl_ del tampón fosfato empleado para diluir los compuestos. Esta placa se consideró Ia placa aceptora y se situó en Ia parte superior del sandwich. Sobre otra placa de 96 pocilios que ensamblaba perfectamente con Ia anterior (MATRNP550 de Millipore) se añadieron 300 μl_ de los compuestos a 100 μM y por triplicado. Además, se incluyó un blanco que incluía únicamente el 1 % de DMSO en el tampón fosfato empleado. Esta placa se denominó placa donadora. La placa aceptora fue situada cuidadosamente sobre Ia placa donadora formando el sistema sandwich. Los compuestos objeto de estudio difundieron desde los pocilios de Ia placa donadora a los pocilios correspondientes de Ia placa aceptora durante las 18h en las que el sistema se mantuvo intacto. El compuesto restante preparado se conservó en las mismas condiciones de humedad, temperatura y oscuridad que el sistema sandwich constituido por las placas. Transcurrido este tiempo, 100 μL de los pocilios de las placas donadoras y de las aceptoras se transvasaron a una placa de 96 pocilios especial para lectura al UV. Además, se transvasaron 100 μL, por triplicado, de los compuestos preparados para Ia realización del ensayo y conservados de modo igual a las placas (pocilios básales). La placa UV se introdujo en un espectrofotómetro en el cual se llevó a cabo un sean en el UV desde 230 a 498 nm, con lecturas cada 4 nm. A partir de los datos del espectrofotómetro se calculó el porcentaje de paso de barrera así como Ia permeabilidad efectiva (Pe). Para calcular Ia Pe, se aplicó Ia siguiente fórmula:
[Droga] aceptora Pe = C x - Ln { 1- ) [Droga] equilibrio
Donde:
V0 X V1
C =
(V0 x VA) x Área x Tiempo [Droga] acePtora = Absorbancia del pocilio aceptor
[Droga] equilibrio = Aborbancia de Ia media de los pocilios básales / 2
VA= Volumen del pocilio aceptor = 0.3 cm3
V0= Volumen del pocilio donador = 0.3 cm3
Área = 0.24 cm2
Tiempo = 64.000 s
El cálculo teórico de Ia lipofilicidad de un compuesto se puede obtener calculando el logaritmo del coeficiente de partición octanol/agua, que viene dado por cLogP. cLogP se calculó teóricamente mediante el programa CLOGP (OSIRIS Property Explorer) introduciendo las estructuras químicas en el software. La n para cada compuesto viene indicada en Ia tabla junto con los resultados numéricos de Ia media±SD de los valores obtenidos en el ensayo.
Tabla I
Figure imgf000100_0001
Como se puede observar en Ia Tabla I y en Ia Figura 46, tanto Ia simvastatina como el NST0037 presentaron un índice de paso de BHE muy similar. En ambos casos, se prevee para estos compuestos un paso de BHE intermedio entre el verapamilo (Pe=10±2 x 10~6 cm/s) y Ia teofilina (Pe=0.2±0.1 x 10~6 cm/s). Estos datos de paso de BHE vienen confirmados por el rango de lipofilicidad, mostrando por ambos compuestos, y que presentan una cLogP muy parecida. Sin embargo, Ia atorvastatina, a pesar de presentar una elevada cLogP, apenas atraviesa BHE, haciéndolo en el mismo rango que Io hace el control negativo, Ia teofilina.
EJEMPLO 19
Efecto de NST0037 sobre los niveles intracelulares de colesterol total en líneas celulares humanas hepáticas y neuronales
El ensayo tuvo por objeto determinar en qué grado el compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina, era capaces de modificar los niveles de colesterol total en líneas celulares de origen neuronal y hepático. Para llevar a cabo este ensayo, los compuestos se activaron con NaOH hasta Ia apertura completa de Ia forma lactona.
Tanto Ia línea Hep G2 (hepatocarcinoma humano) como Ia línea SK-N- MC (neuroblastoma humano) se obtuvieron de Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC no. HB-8065 y HTB-10 respectivamente). En todos los casos se siguieron estrictas normas de esterilidad y Ia manipulación se llevó a cabo en cabinas de seguridad biológica clase Il que siguen Ia norma europea EN 12469. Las células mantenidas en pase se sembraron en placas de 96 pocilios en MEM suplementado con 10% de FBS, 2 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato sódico, 0.1 mM de aminoácidos no esenciales y 0.05 mg/mL de gentamicina. En el caso de las HepG2 se sembraron 4x104 células/pocilio y en el caso de las SK-N-MC 5x104 células/pocilio. Transcurridas 24h de Ia siembra, las células fueron desprovistas de FBS durante 8h. Seguidamente, las células fueron incubadas con los tratamientos a diversas concentraciones durante 2Oh. Tras el periodo de incubación, las células se lavaron con PBS y se usaron con un tampón fosfato con 0.5% de tritón X-100. La lisis se completó mediante una doble congelación-descongelación.
La cuantificación de colesterol total se llevó a cabo mediante técnicas enzimáticas y fluorométricas. 25 μL de cada lisado se transvasaron a una placa de 96 pocilios junto con una curva patrón de colesterol que partía de 10 μg/mL hasta 0.08 μg/mL. Sobre las muestras se añadieron 75 μL de Ia mezcla reactiva preparada a base de MES 0.05 M (pH 6.5) conteniendo colesterol oxidasa (0.5 U/mL), colesterol esterasa (0.8 U/mL), peroxidasa de rábano (4 U/mL) y ampliflu red (20 μg/mL) y se incubó 15 minutos a 370C. La intensidad de fluorescencia se determinó a 530 nm de excitación y 580 nm de emisión mediante un fluorímetro. Los resultados fueron normalizados por proteína Ia cual se determinó mediante Ia técnica del BCA.
En Ia Figura 47 se puede apreciar como el NST0037 presentó un efecto hipocolesterolémico en ambos tipos celulares, si bien fue en las células neuronales donde las reducciones de colesterol fueron más drásticas. En el caso de HepG2, NST0037 resultó ser más potente que Ia simvastatina, mientras q ue en S K-N-MC, las reducciones de colesterol con ambos compuestos fueron semejantes. EJEMPLO 20
Efecto hipocolesterolémico de NST0037 administrado oralmente durante 28 días en un modelo de hiperlipidemia endógena (familiar) En base a los resultados presentados previamente sobre el carácter hipocolesterolémico del compuesto NST0037, los investigadores decidieron evaluar el efecto de Ia administración oral y en el tiempo de NST0037 en el mismo modelo de hipelipidemia endógena familiar (ratones apoB100) que se había empleado en el Ejemplo 5.2. El objetivo de este nuevo estudio fue analizar si Ia administración oral prolongada es eficaz para disminuir los niveles de colesterol en el tiempo.
Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron ratones hembra de 12 semanas de edad. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con Ia máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante los tratamientos y manipulaciones.
Los ratones fueron divididas en tres grupos: grupo control (n =8); grupo simvastatina (n = 8); grupo NST0037 (n = 8). Tras un acondicionamiento a Ia dieta, a los ratones se les administró oralmente y a Ia misma hora (15.00 a 18.0Oh) durante 28 días consecutivos 50 mg/kg de simvastatina o NST0037 (en sus formas lactonas), em pleando en am bos casos como veh ícu lo carboximetilcelulosa al 0.25 % en agua. El grupo control recibió este mismo vehículo. Antes de iniciar los tratamientos y a los 7, 21 y 28 días de iniciar los mismos, se llevaron a cabo extracciones de sangre retro-orbital previo ayuno de 16h. De dicha sangre se obtuvo el plasma donde se evaluaron los niveles de colesterol total (CT), colesterol libre (CL), colesterol (CE), c-HDL, c-LDL, c- VLDL y apoB100 por técnicas enzimáticas y espectrofotométricas. Para comprobar si el efecto a nivel de lípidos implicaba una alteración del estrés oxidativo, se evaluó además el estado redox en los plasmas obtenidos mediante Ia técnica del TEAC ("Trolox Antioxidant Capacity Assay"). Esta técnica, determina Ia capacidad antioxidante in vitro dando una idea del estado redox de Ia muestra analizada mediante Ia capacidad de absorbancia por transferencia de electrones. A los plasmas diluidos 1/10 en PBS (10 μl_), se les añadió en una placa de 96 pocilios los diferentes componentes de Ia reacción, mioglobina, ABTS (ácido 2,2-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-sulfónico), peróxido de hidrógeno y H2O2. Tras 3 minutos de incubación, Ia absorbancia se midió a 405 nm (con una referencia de 600 nm).
En Ia Figura 48 se puede observar que ambos tratamientos son capaces de disminuir de manera significativa los niveles plasmáticos de colesterol total. Este hecho se manifiesta principalmente en una disminución de VLDL y HDL además de en un menor incremento de LDL. Además, los niveles de Ia apolipoproteína B (apoB) fueron visiblemente disminuidos por los tratamientos. En Ia Figura 49 se muestran además Ia disminución de los niveles de CL y CE tras los tratamientos con el compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina, siendo esta reducción más acusada a partir de los 21 d ías de tratamiento. Adicionalmente se demostró, como se presenta en Ia Figura 50, que los tratamientos con NST0037 y con simvastatina disminuyen el estado redox de los plasmas de los animales.
En resumen, el tratamiento con NST0037 durante 28 d ías mediante administración oral a ratones con hiperlipidemia congénita produce una disminución de los niveles de colesterol total, esterificado, libre, de todas las fracciones lipoprotéicas asociadas al colesterol, de los niveles de ApoB y del estado redox de los animales.
EJEMPLO 21
Efecto hipocolesterolémico de NST0037 administrado oralmente durante tres meses en un modelo de hiperlipidemia endógena (familiar)
En base a los resultados presentados previamente sobre el carácter hipocolesterolémico del compuesto NST0037, los investigadores decidieron evaluar el efecto de Ia administración oral durante 3 meses de NST0037 en el mismo modelo de hipelipidemia endógena familiar (ratones apoB100). Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron ratones hembra de 6 meses de edad. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con Ia máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante los tratamientos y manipulaciones.
Los animales fueron divididas en tres grupos: grupo control (n =8); grupo simvastatina (n = 6); grupo NST0037 (n = 8). Tras un acondicionamiento a Ia dieta, a los ratones se les administró oralmente durante 3 meses 50 mg/kg de NST0021 o NST0037, tres veces semanales, empleando en ambos casos como vehículo carboximetilcelulosa al 0.25 % en suero salino fisiológico. El grupo control recibió este mismo vehículo. Antes de iniciar los tratamientos y a los uno, dos y tres meses de iniciar el mismo, se llevó a cabo una extracción de sangre retro-orbital previo ayuno de 16h. De dicha sangre se obtuvo el plasma donde se evaluaron los niveles de colesterol total, colesterol libre (CL), colesterol (CE), c-HDL, c-LDL y, c-VLDL por técn icas enzimáticas y espectrofotométricas. En Ia Figura 51 se puede observar como ambos tratamientos disminuyeron las diferentes fracciones de colesterol. No obstante, y de forma sorprendente, NST0037 disminuyó en mayor medida los niveles de c-LDL y aumentó los de c-HDL, mostrando así un mejor perfil cardioprotector que Ia simvastatina. Estos resultados se correlacionaron con los efectos de los tratamientos sobre los niveles de CL y CE (Figura 52), y donde que se apreció que el NST0037 produce una disminución significativa tanto de CL como de CE.
En resumen, el tratamiento con NST0037 durante 3 meses mediante administración oral a ratones con hiperlipidemia congénita produce una disminución de los niveles de colesterol total, esterificado, libre, así como una disminución de los niveles de c-LDL y un aumento del c-HDL, Io que demuestra su poder cardioprotector.
EJEMPLO 22 Efecto hipolipemiante de NST0037 en ratas zucker genéticamente obesas En base a los resultados presentados previamente sobre el carácter hipocolesterolémico del compuesto NST0037 en ratones, los investigadores decidieron evaluar el efecto de Ia administración oral durante 7 días de
NST0037 en un modelo de h ipel ipidem ia endógena en ratas Zucker genéticamente obesas, con niveles de lípidos anormalmente elevados.
Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron ratas zucker macho de 11 semanas de edad. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con Ia máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante los tratamientos y manipulaciones.
Los animales fueron divididas en tres grupos: grupo control (n =7); grupo simvastatina (n = 7); grupo NST0037 (n = 7). Tras un acondicionamiento a Ia dieta, a las ratas se les administró oralmente y a Ia misma hora (15.00 a 18.0Oh) durante 7 días consecutivos 30 mg/kg de NST0021 o NST0037, empleando en ambos casos como vehículo carboximetilcelulosa al 0.5 % en agua. El grupo control recibió este mismo veh ículo. Antes de iniciar los tratamientos y a los 7 días del mismo se extrajo sangre por punción lingual bajo anestesia previo ayuno de 16h. De dicha sangre se obtuvo el plasma donde se evaluaron los niveles de colesterol total, c-HDL, c-LDL, c-VLDL, y triglicéridos (TG) por técnicas enzimáticas y espectrofotométricas. Para comprobar si el efecto a nivel de lípidos implicaba una alteración del estrés oxidativo, se evaluó además el estado redox en los plasmas obtenidos mediante Ia técnica del TEAC ("Trolox Antioxidant Capacity Assay"). Esta técnica, determina Ia capacidad antioxidante in vitro dando una idea del estado redox de Ia muestra analizada mediante Ia capacidad de absorbancia por transferencia de electrones. A los plasmas diluidos 1/10 en PBS (10 μL), se les añadió en una placa de 96 pocilios los diferentes componentes de Ia reacción, mioglobina, ABTS [ácido 2 , 2-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-sulfónico)] y peróxido de hidrógeno. Tras 3 minutos de incubación, Ia absorbancia se midió a 405 nm (con una referencia de 600 nm).
En Ia Figura 53 se puede apreciar que tanto Ia simvastatina como el NST0037 fueron capaces de disminuir igualmente los niveles plasmáticos de LDL, hecho directamente relacionado con Ia inhibición de Ia actividad HMGR, que lleva a un aumento de expresión de receptores LDL. En este caso, el efecto de NST0037 alcanzó significación estad ística. Además, ambos compuestos produjeron un aumento de HDL, Io que implica un efecto cardioprotector. En Ia Figura 54 se observa como los compuestos disminuyeron los n iveles de trigl icéridos plasmáticos, Io que indica un efecto hipotrigliceridémico. Además, mientras que en las ratas control se produjo un incremento del estrés oxidativo (Figura 55), determinado por medio del estado redox en plasma mediante TEAC, en las ratas tratadas con simvastatina y NST0037 se produjo una drástica disminución, Io que indica un efecto antioxidante. En este caso, los resultaros fueron estadísticamente significativos sólo en el caso de NST0037.
En resumen, el tratamiento con NST0037 durante 7 días mediante administración oral a ratas Zucker genéticamente obesas con hiperlipidemia endógena produjo una disminución de los niveles de c-LDL, de triglicéridos, y del estado redox, Io que demuestra su poder cardioprotector.
EJEMPLO 23
Efecto de NST0037 sobre Ia expresión del gen 24- dehidrocolesterol reductasa (Seladin-1/DHCR24) en ratones salvajes
En base a los resultados presentados en el Ejemplo 9 sobre Ia inducción del gen seladin-1/DHCR24 en líneas neuronales humanas, los investigadores decidieron analizar si el NST0037 modulaba dicho gen en cerebros de ratones tratados con este compuesto. Para llevar a cabo este estudio, ratones macho C57BL6 de 3 meses de edad (n=3/grupo) fueron tratados oralmente con 50 mg/kg de simvastatina o NST0037. Un grupo control recibió únicamente el vehículo, y que consistió en carboximetilcelulosa al 0.25% en suero salino fisiológico. 4h después de las administraciones orales, los animales fueron sacrificados bajo anestesia gaseosa con isofluorano y los cerebros, previamente perfundidos con PBS, fueron extraídos e inmediatamente después congelados en nitrógeno líquido. Posteriormente, el RNA total del cerebro se extrajo mediante el kit High Puré RNA Isolation (Roche) y Ia cantidad y calidad del RNA se analizaron mediante espectrofotometría (Infinite 200 con NanoQuant, Tecan) y visualización de las bandas 18S y 28S mediante electroforesis. La RT-PCR se realizó mediante dos pasos, en primer lugar se pasó el mRNA a cDNA usando el RNA to cDNA kit (Applied Biosystem) y posteriormente se analizó Ia expresión génica mediante sondas TaqMan utilizando las sondas validadas Mn00519071_m1 para seladin- 1/DHCR24 y Hs99999901_s1 para 1 8S (util izado para normal izar los resultados) en el equipo 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystem). La cantidad relativa de Ia expresión del gen se determinó utilizando el método ΔΔCt con el software SDS v2.1.1 (Applied Biosystem); Ia expresión de 18S fue usada para normalizar Ia medida.
En Ia Figura 56 se puede observar como tanto Ia simvastatina como el NST0037 aumentaron Ia expresión del gen a las 4h de su administración en igual medida. Estos resultados confirman los datos previos en neuronas humanas donde se observaba un aumento de Ia expresión de seladin-1 como mecanismo neuroprotector del NST0037. Además, estos resultados confirman el paso de barrera hematoencefálica presentado en ejemplos previos.
En resumen, el tratamiento oral con NST0037 a ratones salvajes produce un aumento del gen neuroprotector seladin-1 /DHCR24, Io que confirma además que el compuesto atraviesa Ia barrera hematoencefálica.
EJEMPLO 24
Análisis comparativo en índice de supervivencia de dos compuestos en larvas de pez cebra 24.1. Análisis del índice de supervivencia del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina en larvas de pez cebra. Ensayo de toxicidad aguda.
Para evaluar Ia bioseguridad del compuesto NST0037 se analizaron sus efectos toxicológicos en el modelo de larva de pez cebra med iante Ia determinación de los parámetros de seguridad del protocolo C15 de Ia OECD.
Los huevos fertilizados fueron obtenidos por apareamiento natural del pez cebra (Danio rerio, cepa AB). Un total de 8-10 parejas fueron utilizadas para cada cruce y se generaron un total de 200-250 huevos de media por pareja. Los huevos se recogieron inmediatamente después del desove y fueron lavados con agua de dilución (CaCI2^H2O2 0.29 g/L, MgSOWH2O2 0.12 g/L, NaHCO3 0.065 g/L, KCI 0.006 g/L) ajustándose a pH 7.8 ± 0.2, acorde con el Reglamento CE n° 440/2008 método C.1 y depositados en una placa petri.
Los embriones se desarrollaron con normalidad hasta 96 horas postfertilización en su medio de crecimiento. En dicho momento, las larvas fueron transferidas de las placas petri de crecimiento a las cámaras de exposición (placas microtiter M24) por medio de pipetas y expuestos a las sustancias a testar (NST0037 o simvastatina), con agua de dilución (controles) o con diferentes concentraciones de los tratamientos. Las larvas fueron incubadas sin aireación adicional, a Ia temperatura apropiada (25±1 0C) y bajo un régimen de 12 h luz/12 h oscuridad. Cada experimento fue realizado en triplicado.
Los estudios fueron llevados a cabo durante 24 horas de tratamiento, realizando así un ensayo de toxicidad aguda. Los tratamientos llevados a cabo siguieron Ia siguiente pauta:
> 10 animales control, tratados con agua de dilución durante un periodo de 24 horas.
> 30 animales tratados con el compuesto NST0037 (10 larvas por triplicado) diluido en agua de dilución durante un periodo de 24 horas.
> 30 animales tratados con el compuesto simvastatina (10 embriones por triplicado) diluido en agua de dilución durante un periodo de 24 horas. Después del tiempo de exposición de las sustancias a estudio, se determinó el registro de Ia mortalidad de las larvas. La Tabla Il muestra el análisis del índice de supervivencia del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina en larvas de pez cebra. En Ia tabla se muestra el número de larvas utilizadas para Ia experimentación, Ia dosis en mg/Kg (de peso del animal), el tiempo de tratamiento y el número de larvas muertas respecto al total. Tabla Il Grupo (NST0037) Larvas Dosis (mg/Kg) Tiempo (Dias) Mortalidad
1 10 Vehiclea 1 0/10
2 30 10 1 0/30
3 30 30 1 0/30
4 30 100 1 0/30
5 30 300 1 0/30
6 30 1000 1 0/30
Grupo
Larvas Dosis (mg/Kg) Tiempo (Días) Mortalidad (simvastatína}
1 10 Vehiclea 1 0/10
2 30 10 1 0/30
3 30 30 1 0/30
4 30 100 1 0/30
5 30 300 1 0/30
6 30 1000 1 0/30 aAαuadeembrιones
Los resultados del estudio mostraron que ambos compuestos presentan un perfil toxicológico similar en cuanto al parámetro de inducción de mortalidad de larvas de pez cebra, no observándose Ia presencia de ningún óbito a ninguna de las dosis usadas.
24.2. Análisis del porcentaje de larvas sanas tras exposición del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina en larvas. Ensayo de toxicidad aguda.
Basándose en los resultados anteriores, los inventores quisieron determinar si Ia ausencia de mortalidad registrada por el compuesto NST0037 estaba asociada a un porcentaje de larvas sanas igual o menor al del tratamiento con simvastatina. El porcentaje de larvas sanas fue definido como el número de larvas vivas y sin síntomas de anomalías fisiopatológicas externas (morfológica y/o en comportam iento), siendo éste un parámetro que determ ina Ia bioseguridad de una sustancia a estudio y es complementaria a los índices de supervivencia y a las LD5O- Tal y como se muestra en Ia Figura 58, se observaron diferencias en los porcentajes de larvas sanas entre los dos tratamientos evaluados a Ia dosis más alta de estudio (1000 mg/Kg), llegando al 67.9 ± 3.3 para el compuesto NST0037, siendo del 53.3 ± 8.8 para Ia simvastatina, Io que indica sorprendentemente una mayor bioseguridad del compuesto NST0037 en el modelo de larva de pez cebra.
24.3. Análisis del porcentaje de larvas con aspecto anómalo (sintomatología) tras exposición del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina en larvas. Ensayo de toxicidad aguda. En base a los resultados de los apartados anteriores, los inventores decidieron averiguar si Ia mayor bioseguridad del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina se corroboraba mediante el análisis del porcentaje de larvas con deformidades o aspecto anómalo, recogiendo el porcentaje de larvas que presenten anomalías corporales y/o pigmentarias. Las anomalías registradas en el estudio se describen a continuación:
• Trombosis en el saco vitelino o yolk: es un coágulo en el interior de un vaso sanguíneo, en este caso de cualquier vaso que riega el yolk.
• Trombosis cardiaca: ocurre en un vaso cardiaco. • Edema (o hidropesía) cardiaco: es Ia acumulación de líquido en el espacio tisular intercelular o intersticial y también en las cavidades del organismo. En el caso del corazón, se produce acumulación de líquido en Ia bolsa pericárdica.
Los resultados indican que el porcentaje de larvas con deformidades o aspecto anómalo es muy similar entre ambos compuestos, no obstante, y tal y como muestra Ia Figura 58, se observa sorprendentemente que Ia simvastatina indujo un mayor porcentaje de larvas con sintomatología toxicológica que el compuesto NST0037, Io que indica una mayor bioseguridad de este último.
En resumen, el tratamiento con NST0037 a larvas de pez cebra en un amplio rango de concentraciones no produce mortalidad alguna, además de presentar un mayor porcentaje de larvas sanas y un menos número de larvas con deformidades o aspecto anómalo que Ia simvastatina.
EJEMPLO 25 25.1. Estudio de Ia variación del peso de peces cebra adultos en un ensayo de Toxicidad de dosis única (24 horas) por exposición en el agua del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina
En base a los resultados de ejemplos anteriores, los inventores decidieron averiguar si Ia mayor bioseguridad del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina se corroboraba mediante el análisis de Ia variación del peso de peces cebra adultos, mediante un ensayo de dosis simple recogido por Ia Agencia Europea del Medicamento (EMEA). Este estudio del EMEA trata sobre Ia calidad y Ia cantidad del fenómeno tóxico producido por Ia adm in istración ún ica de una sustancia o combinación de sustancias, relacionado con el tiempo. Estos estudios dan parte de información de los posibles efectos de sobredosis producidos en humanos y pueden ser útiles para el diseño de estudios de toxicidad donde se requiere dosis repetidas de administración del tratamiento.
Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). El ensayo desarrollado presentó los siguientes parámetros de estudio: S Duración del tratamiento: 24 horas por exposición en el agua. S Tiempo post-tratamiento: 14 días. S Número de animales: 7 por concentración.
S Recipientes de ensayo: peceras de 9 litros de capacidad, llenándolas con un volumen de 5 litros con agua de recirculación de los racks filtrado.
S Carga de animal: peso medio de los peces, entre 0.54-0.60 gr. S Concentración de ensayo: 2000 mg/kg. S Luz: fotoperiodos de 12/12 horas de luz/oscuridad. S Temperatura: 25 ± 1 0C. S Alimento: no se alimenta a los animales 24 horas antes del tratamiento y tampoco durante las 24 horas que dura el ensayo. Posteriormente, se alimentaron como al resto de los animales. •/ Peso de los animales: se pesaron a tiempo 0 (antes del tratamiento), a 7 y a 14 días post-tratamiento. En este caso se utilizó como parámetro de toxicidad el peso de los animales de los diferentes grupos de estudio a tres tiempos establecidos: antes del comienzo de los tratamientos (0 dpt), a día 7 post-tratamiento y a día 14 post-tratamiento. En Ia Figura 59 se muestra el promedio de los pesos de los animales en función del tratamiento y del tiempo post-exposición de las sustancias. Los resultados indicaron que mientras que los peces sin tratamiento aumentaron de peso a Io largo del estudio, mientras que los tratados con simvastatina redujeron significativamente el peso. Por su parte el tratamiento con NST0037, de manera sorprendente, no modificó el peso durante Ia duración del ensayo, Io que indica que presenta un mejor perfil de seguridad de Ia simvastatina.
25.2. Estudio histopatolóqico en peces cebra adultos tras ensayo de toxicidad de dosis única (24 horas) por exposición en el agua del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina
En base a los resultados de los estudios anteriores, los inventores decidieron averiguar si existían diferencias en el estudio histopatológico de los diferentes grupos de tratamiento mediante Ia tinción de las muestras con hematoxilina-eosina, Ia cual permite discernir marcas patológicas en los órganos o tejidos de los animales a estudio. Para ello, los peces se sacrificaron a 14 días post-tratamiento (previamente anestesiados) y las muestras (pez entero) fueron incluidas en parafina. Posteriormente se realizó Ia tinción de hematoxilina-eosina para Ia realización de los estudios histopatológicos, obteniéndose un mínimo de 6 cortes longitudinales por animal, con el objetivo de recoger diferentes zonas de estudio del mismo órgano. Los órganos estudiados fueron los siguientes: cerebro, riñon, páncreas, intestino, ojo, branquias, ovario, testículo, músculo e hígado. En Ia figura 60, se muestran imágenes representativas del estudio histopatológico realizado en los animales tratados con Ia dosis de 2000 mg/Kg. De todos los órganos estudiados, los únicos que presentaron rasgos patológicos discernibles fueron el intestino y el ovario. En el intestino se detectó huellas de atrofia en las vellosidades intestinales, siendo más acusada en los animales tratados con simvastatina que en los tratados con NST0037. En el ovario de las hembras tratadas con simvastatina se detectó atrofia en ovocitos terciarios. Además, el hígado de los animales tratados con ambos compuestos presentó zonas discretas de inflamación.
En resumen, el tratamiento con NST0037 a peces cebra adultos no modificó el peso de los mismos durante un experimento de 14 días, mientras con simvastatina se detectó una disminución significativa del peso de los animales. Además, Ia simvastatina produjo mayores efectos histopatológicos que el NST0037, demostrándose que este último compuesto es más seguro. EJEMPLO 26
26. 1 . Estudio de letalidad por exposición constante en el agua (4 días) de NST0037 en comparación con Ia simvastatina en pez cebra adulto.
En base a los resultados de ejemplos anteriores, los inventores decidieron averiguar si Ia mayor bioseguridad del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina se corroboraba mediante el análisis de Ia letalidad por exposición constante en el agua durante 4 días según el test de toxicidad aguda para peces de Ia OECD (Draft Revised Guideline 203). El objeto de este ensayo es determinar Ia toxicidad letal aguda de una sustancia en peces de agua dulce. La toxicidad aguda es el efecto adverso, discernible, inducido en un organismo como consecuencia de Ia exposición a una sustancia dada durante un corto período de tiempo (días). En el presente ensayo, Ia toxicidad aguda viene expresada como Ia dosis letal media (LD50), es decir, Ia dosis que en el agua causa Ia muerte del 50% de los peces de un lote sometido a ensayo durante un período de exposición continuo.
Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). El ensayo desarrollado presentó los siguientes parámetros de estudio:
S Método estático: se realizó un ensayo de toxicidad durante el cual no hubo renovación de Ia solución de ensayo.
S Se efectúa un control (o testigo), sin sustancia de ensayo además de las concentraciones de ensayo propiamente dichas. S Duración: 4 días.
S Número de animales: 7 por concentración. S Recipientes: cubetas de 9 litros, llenándolas con un volumen de 5 litros, con agua de recirculación de los racks filtrado. S Carga: peso medio de los peces: 0.46 gr ± 0.03, quedando Ia carga en
0.49 gr/litro.
S Concentraciones de ensayo: 5 concentraciones (1 , 3.2, 10, 32 y 100 mg/kg).
S Luz: fotopehodos de 12/12 horas de luz/oscuridad. S Temperatura: 25±1 0C. S Alimento: ninguno. Como parámetro de toxicidad se registraron los óbitos de los animales a estudio durante todo el tiempo del ensayo.
La Tabla III muestra el anál isis del índ ice de supervivencia del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina en peces cebra adultos tratados durante 4 días con los compuestos en el agua. En Ia tabla se muestra el número de animales utilizados para Ia experimentación, Ia dosis en mg/Kg (de peso del animal), el tiempo de tratamiento y el número de animales muertos respecto al total.
Tabla III
Dosis
Grupo (NSTG037) Anímales Tiempo (Días) Mortalidad (mg/kg)
1 7 Vehículo8 4 0/7
2 7 1 4 0/7
3 7 3.2 4 0/7
4 7 10 4 0/7
5 7 32 4 0/7
6 7 100 4 1/7
Dosis
Grupo (símvastatín) Anímales Tiempo (Días) Mortalidad (mg/kg)
1 7 1 4 0/7
2 7 3.2 4 0/7
3 7 10 4 0/7
4 7 32 4 0/7
5 7 100 4 6/7 βAgua del sistema.
Tal y como se muestra en Ia Tabla III, Ia mortalidad producida por ambos compuestos en este ensayo de toxicidad aguda demuestran sorprendentemente que Ia simvastatina fue significativamente más tóxica que el compuesto NST0037 (χ2, p-valor < 0.001 ), ya que a día 4 post-tratamiento, el 14% (1/7) de los animales tratados con NST0037 murieron, siendo del 86 % (6/7) el porcentaje de mortalidad observado para el grupo de tratamiento con simvastatina. Según Io observado en este estudio, Ia LD5O del compuesto NST0037 fue superior a 100 mg/Kg después de 4 días de tratamiento continuo con el compuesto. La simvastatina presentó una LD50 de 60.55 mg/Kg después de 4 dpt; de nuevo y de manera sorprendente fue más tóxica que el compuesto NST0037, ya que Ia simvastatina alcanzó Ia LD50 con menos dosis que NST0037 y en el mismo tiempo. 26. 2. Estudio histopatolóqico en peces cebra adultos tras ensayo de letalidad por exposición constante en el agua (4 días) de NST0037 en comparación con Ia simvastatina en pez cebra adulto
En base a los resultados de los estudios anteriores, los inventores decidieron averiguar si existían diferencias en el estudio histopatológico de los diferentes grupos de tratamiento mediante Ia tinción de las muestras con hematoxilina-eosina, Ia cual permite discernir marcas patológicas en los órganos o tejidos de los animales a estudio. Para ello, los peces Los peces que sobrevivieron al tratamiento se sacrificaron a 4 d ías post-tratamiento (previamente anestesiados) y las muestras (pez entero) fueron incluidas en parafina. Posteriormente se realizó Ia tinción de hematoxilina-eosina para Ia realización de los estudios histopatológicos, obteniéndose un mínimo de 6 cortes longitudinales por animal, con el objetivo de recoger diferentes zonas de estudio del mismo órgano. Los órganos estudiados fueron los siguientes: cerebro, riñon, páncreas, intestino, ojo, branquias, ovario, testículo, músculo e hígado.
En Ia Figura 61 , se muestran imágenes representativas del estudio histopatológico realizado en los animales tratados. En ella se muestran imágenes representativas del estudio histopatológico realizado. Las únicas dosis que indujeron problemas toxicológicos fueron las de 32 y 100 mg/Kg, restringiéndose las alteraciones patológicas a los ovarios. Mientras las hembras control mostraron fol ículos ováricos normales en diferentes estadios de maduración, las hembras tratadas con 100 mg/Kg de ambos compuestos presentaron daño ovárico, observándose una degeneración masiva de los ovocitos secundarios y terciarios, además de alteración estromal. Por otro lado, el grupo de hembras tratadas con 30 mg/kg de simvastatina también presentó daño histopatológico en el ovario, no siendo observado sorprendentemente en el grupo de hembras tratadas con Ia misma dosis del compuesto NST0037, Io que indica que el compuesto NST0037 es más seguro que Ia simvastatina en este modelo experimental.
En resumen, el tratamiento con NST0037 a peces cebra adultos durante 4 días a 100 mg/Kg presentó una mortalidad residual, Ia cual fue ampliada en las mismas condiciones con simvastatina. Además, los daños histopatológicos encontrados se restringieron a los ovarios de los animales y se detectaron a las dosis de 32 y 100 mg/Kg para Ia simvastatina, mientras que con NST0037 el daño ovárico sólo se detecto a Ia dosis más alta, Io que demuestra que este último compuesto es más seguro.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto de fórmula (I)
Figure imgf000117_0001
(I) su forma hidroxiácida, las sales farmacéuticamente aceptables de dicho hidroxiácido y prodrogas y solvatos farmacéuticamente aceptables del compuesto y de su forma hidroxiácida.
2. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (I) según Ia reivindicación 1 y/o su forma hidroxiácida y/o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho hidroxiácido y/o una prodroga o solvato farmacéuticamente aceptable del compuesto o de su forma h id rox i ác id a , y a l m e nos u n adyu va nte , portado r y/o ve h ículo farmacéuticamente aceptable.
3. Un compuesto de fórmula (I) según Ia reivindicación 1 , su forma hidroxiácida o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho hidroxiácido y/o una prodroga o solvato farmacéuticamente aceptable del compuesto o de su forma hidroxiácida para su uso como medicamento.
4. Un compuesto de fórmula (I) según Ia reivindicación 1 , su forma hidroxiácida o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho hidroxiácido y/o una prodroga o solvato farmacéuticamente aceptable del compuesto o de su forma hidroxiácida para su uso en Ia prevención y/o el tratamiento de: a. enfermedades neurodegenerativas, b. deterioro cognitivo, c. enfermedades asociadas con una oxidación indeseada, d. procesos patológicos asociados a Ia edad y progeria, e. epilepsia, crisis epilépticas y convulsiones, f. enfermedades cardiovasculares como aterosclerosis, fibrilación auricular, dislipemia, hipercolesterolemia, hiperlipidemia, e hipertrigliceridemia, o g. infecciones fúngicas o víricas.
5. Un compuesto d e fórm u l a ( I ), su form a hidroxiácida o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho hidroxiácido y/o una prodroga o solvato farmacéuticamente aceptable del compuesto o de su forma hidroxiácida según Ia reivindicación 4 donde las enfermedades neurodegenerativas son: enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica (ELA) o esclerosis múltiple.
6. Uso de un compuesto de fórmula (I) según Ia reivindicación 1 , de su forma hidroxiácida, de una sal farmacéuticamente aceptable de dicho hidroxiácido y/o de una prodroga o solvato farmacéuticamente aceptable del compuesto o de su forma hidroxiácida en Ia elaboración de un medicamento.
7. Uso según Ia reivindicación 6 donde el medicamento se emplea en Ia prevención y/o el tratamiento de: a. enfermedades neurodegenerativas, b. deterioro cognitivo, c. enfermedades asociadas con una oxidación indeseada, d. procesos patológicos asociados a Ia edad y progeria, e. epilepsia, crisis epilépticas y convulsiones, f. enfermedades cardiovasculares como aterosclerosis, fibrilación auricular, dislipemia, hipercolesterolemia, hiperlipidemia, e hipertrigliceridemia, o g. infecciones fúngicas o víricas.
8. Un compuesto de fórmula (I) según Ia reivindicación 1 , su forma hidroxiácida o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho hidroxiácido y/o una prodroga o solvato farmacéuticamente aceptable del compuesto o de su forma hidroxiácida para su uso en el aumento de Ia expresión del gen seladin-1/DHCR24.
9. Un compuesto de fórmula (I) según Ia reivindicación 1 , su forma hidroxiácida o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho hidroxiácido y/o una prodroga o solvato farmacéuticamente aceptable del compuesto o de su forma hidroxiácida para su uso en Ia prevención y/o tratamiento de enfermedades relacionadas con el gen seladin-1/DHCR24.
10.U n com puesto d e fórm u l a ( I ) , su forma h id roxiácida o u n a sa l farmacéuticamente aceptable de dicho hidroxiácido y/o una prodroga o solvato farmacéuticamente aceptable del compuesto o de su forma hidroxiácida según Ia reivindicación 9, donde se previene y/o se trata Ia muerte neuronal asociada a enfermedades neurodegenerativas, enfermedades asociadas con una oxidación indeseada o procesos patológicos asociados a Ia edad.
11.Uso de un compuesto de fórmula (I) según Ia reivindicación 1 , de su forma hidroxiácida, de una sal farmacéuticamente aceptable de dicho hidroxiácido y/o de una prodroga o solvato farmacéuticamente aceptable del compuesto o de su forma hidroxiácida en Ia elaboración de un medicamento caracterizado por incrementar Ia expresión del gen seladin-1/DHCR24.
12. Uso de un compuesto de fórmula (I) según Ia reivindicación 1 , de su forma hidroxiácida, de una sal farmacéuticamente aceptable de dicho hidroxiácido y/o de una prodroga o solvato farmacéuticamente aceptable del compuesto o de su forma hidroxiácida en Ia elaboración de un medicamento para Ia prevención y/o tratamiento de enfermedades relacionadas con el gen seladin-1/DHCR24.
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