ES2533092T3 - Compuesto neuroprotector, hipocolesterolémico y antiepiléptico - Google Patents

Abstract

Se describe un compuesto de fórmula (I); su forma hidroxiácida, las sales farmacéuticamente aceptables de dicho hidroxiácido y prodrogas y solvatos farmacéuticamente aceptables del compuesto y de su forma hidroxiácida y, en particular, dicho compuesto, su forma hidroxiácida, sales, etc. para su uso en la prevención de: enfermedades neurodegenerativas, deterioro cognitivo, enfermedades asociadas con una oxidación indeseada, procesos patológicos asociados a la edad y progeria, epilepsia, crisis epilépticas y convulsiones, enfermedades cardiovasculares como aterosclerosis, fibrilación auricular, dislipemia, hipercolesterolemia, hiperlipidemia, e hipertrigliceridemia, o infecciones fúngicas o víricas.

Description

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hipercolesterolemia asociada a enfermedades cardiovasculares (p. ej., infarto de miocardio, ateroesclerosis, cardiopatía congénita, cardiopatía adquirida, cardiopatía isquémica, cardiopatía hipertensiva, valvulopatías, miocardiopatías, trastornos sanguíneos, etc.).

La bioseguridad de dicho compuesto se ha puesto de manifiesto mediante la evaluación de su toxicidad en un modelo de embrión de pez cebra, en comparación con una estatina comercial, la simvastatina, observándose que es menos tóxica que la simvastatina a diferentes concentraciones ya que produce una menor mortalidad (Ejemplo 7, Figuras 24 y 25). Adicionalmente, se ha demostrado que la dosis letal 50 (LD50) es mayor en el caso del compuesto NST0037 que en el de la simvastatina en todos los puntos temporales evaluados, lo que indica una mayor bioseguridad de dicho compuesto (Ejemplo 7, Figuras 26). Adicionalmente, se ha demostrado que este compuesto produce un mayor porcentaje de larvas sanas al final del experimento, así como un menor porcentaje de larvas con deformidades o aspecto anómalo (Ejemplo 7, Figuras 27 y 28). Adicionalmente, este compuesto no produce una variación significativa del porcentaje de latidos cardíacos a altas concentraciones, a diferencia de la simvastatina que produce una disminución significativa del ritmo cardiaco a altas concentraciones (Ejemplo 7, Figuras 29).

Por tanto, un aspecto de la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (I) [también identificado en ocasiones en esta solicitud de patente como NST0037]:

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(I)

su forma hidroxiácida, las sales farmacéuticamente aceptables de dicho hidroxiácido y solvatos farmacéuticamente aceptables del compuesto y de su forma hidroxiácida.

Otro aspecto de la presente invención, es una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula

(I) y/o su forma hidroxiácida y/o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho hidroxiácido y/o un solvato farmacéuticamente aceptable del compuesto o de su forma hidroxiácida, y al menos un adyuvante, portador y/o vehículo farmacéuticamente aceptable.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (I), su forma hidroxiácida o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho hidroxiácido y/o un solvato farmacéuticamente aceptable del compuesto o de su forma hidroxiácida para su uso como medicamento.

Según otro aspecto, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (I), su forma hidroxiácida o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho hidroxiácido y/o un solvato farmacéuticamente aceptable del compuesto o de su forma hidroxiácida para su uso como agente neuroprotector, en particular en la prevención y/o el tratamiento de:

a. enfermedades neurodegenerativas (p. ej., Alzheimer, Parkinson, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, status epilepticus, Huntington, etc.), más concretamente, procesos de apoptosis, estrés oxidativo o estrés de retículo endoplásmico asociados a dichas enfermedades neurodegenerativas crónicas,

b.

deterioro cognitivo,

c.

procesos patológicos asociados a la edad y progeria,

d.

epilepsia, crisis epilépticas y convulsiones.

Un aspecto de la presente invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula (I), de su forma hidroxiácida, de una sal farmacéuticamente aceptable de dicho hidroxiácido y/o de un solvato farmacéuticamente aceptable del compuesto o de su forma hidroxiácida en la elaboración de un medicamento. Según una realización particular, el medicamento es para su uso como agente neuroprotector, en particular en la prevención y/o el tratamiento de:

a.

enfermedades neurodegenerativas (p. ej., Alzheimer, Parkinson, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, status epilepticus, Huntington, etc.), más concretamente, procesos de apoptosis, estrés oxidativo o estrés de retículo endoplásmico asociados a dichas enfermedades neurodegenerativas crónicas,

b.

deterioro cognitivo,

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La Figura 47 es un diagrama de barras que representa el efecto de la simvastatina y NST0037 sobre los niveles de colesterol en las líneas celulares humanas HepG2 y SK-N-MC. Los resultados se expresan como el porcentaje de reducción de colesterol respecto al control en cada, línea tras la incubación de los compuestos ácidos durante 20 h en ausencia de FBS. Las determinaciones fueron llevadas a cabo por medios enzimáticos y fluorométricos y los resultados son la media±DE. * Diferencia significativa respecto a las células sin tratar, según el test t de Student (p<0,05). En el caso de HepG2 se hicieron 2 ensayos independientes por triplicado y en el caso de las SK-N-MC tres ensayos independientes por triplicado.

La Figura 48 es un conjunto de gráficas de dispersión XY que representan la concentración plasmática de colesterol y sus diversas fracciones además de la concentración de apoB en ratones hembra apoB100 de 12 semanas de edad tras 7, 21 y 28 días de tratamiento oral con 50 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando la media±EEM de cada uno de los grupos y los tiempos. * Diferencia significativa respecto al control, según el test t de Student (p<0,05). + Diferencia significativa respecto tiempo inicial de ese mismo grupo.

La Figura 49 es un diagrama de barras que representa el número de veces que incrementa el colesterol libre y esterificado en ratones hembra apoB100 de 12 semanas de edad tras 7, 21 y 28 días de tratamiento con 50 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando la media±EEM de cada uno de los grupos. * Diferencia significativa respecto al grupo control, según el test t de Student (p<0,05).

La Figura 50 es un diagrama de barras que representa el número de veces que incrementa el estado de oxidación en el plasma de ratones hembra apoB100 de 12 semanas de edad tras 7, 21 y 28 días de tratamiento con 50 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando la media±EEM de cada uno de los grupos. * Diferencia significativa respecto al grupo control, según el test t de Student (p<0,05).

La Figura 51 es un conjunto de gráficas de dispersión XY que representan la concentración plasmática de colesterol y sus diversas fracciones en ratones hembra apoB100 de 6 meses de edad tras uno, dos y tres meses de tratamiento oral con 50 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando la media±EEM de cada uno de los grupos. * Diferencia significativa respecto al control, según el test t de Student (p<0,05). + Diferencia significativa respecto tiempo inicial de ese mismo grupo.

La Figura 52 es un diagrama de barras que representa el número de veces que incrementa el colesterol libre y esterificado en ratones hembra apoB100 de 6 meses de edad tras uno, dos o tres meses de tratamiento oral con 50 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando la media±EEM de cada uno de los grupos. * Diferencia significativa respecto al grupo control, según el test t de Student (p<0,05).

La Figura 53 es un diagrama de barras que representa el número de veces que incrementa el colesterol y sus diversas fracciones en ratas zucker macho de 11 semanas de edad tras 7 días de tratamiento oral con 30 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando la media±EEM de cada uno de los grupos. * Diferencia significativa respecto al grupo control, según el test t de Student (p<0,05).

La Figura 54 es un diagrama de barras que representa el número de veces que incrementan los triglicéridos plasmáticos en ratas zucker macho de 11 semanas de edad tras 7 días de tratamiento oral con 30 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando la media±EEM de cada uno de los grupos. * Diferencia significativa respecto al grupo control, según el test t de Student (p<0,05).

La Figura 55 es un diagrama de barras que representa el número de veces que incrementa el estado redox plasmático en ratas zucker macho de 11 semanas de edad tras 7 días de tratamiento oral con 30 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando la media±EEM de cada uno de los grupos. * Diferencia significativa respecto al grupo control, según el test t de Student (p<0,05).

La Figura 56 es un diagrama de barras que representa el número de veces que incrementa la expresión del gen seladin-1/DHCR24 en el cerebro de ratones salvajes C57BL6 a las 4 h de la administración oral a 50 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando la media±EEM de cada uno de los grupos. * Diferencia significativa respecto al grupo control, según el test t de Student (p<0,05).

La Figura 57 es un diagrama de barras que representa el porcentaje de larvas sanas (sin problemas toxicológicos) tras exposición del compuesto NST0037 en comparación con la simvastatina, representando la media del porcentaje±EEM de animales sanos después del tratamiento con diferentes dosis de NST0037 o de simvastatina. El eje de las Y determina el porcentaje de larvas sanas y el eje de las X, las concentraciones usadas de ambos compuestos. Las barras en gris representan el grupo de animales tratados con NST0037 y las barras de color negro representan los animales tratados con simvastatina.

La Figura 58 es un diagrama de barras que representa el porcentaje de larvas con aspecto anómalo (sintomatología) tras exposición del compuesto NST0037 en comparación con la simvastatina, representando la media del porcentaje±EEM de larvas con deformaciones o aspecto anómalo después del tratamiento con diferentes dosis de NST0037 o de simvastatina. El eje de las Y determina el porcentaje de larvas con aspecto anómalo y el eje de las X las diferentes alteraciones de la sintomatología. Las barras en gris representan el grupo de animales tratados con NST0037 y las barras de color negro representan los animales tratados con simvastatina.

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El término “deterioro cognitivo”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la pérdida o alteración de las funciones mentales, tales como memoria, orientación, lenguaje, reconocimiento visual o conducta que interfieren con la actividad e interacción social de la persona afectada de forma persistente en el tiempo

El término “infecciones fúngicas o víricas”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier colonización de un virus u hongo microscópico que resulta perjudicial para el funcionamiento normal o para la supervivencia del organismo colonizado o huésped.

El término “sujeto”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un miembro de una especie de mamífero, e incluye, pero no se limita a, animales domésticos, primates y humanos; preferentemente, el sujeto es un ser humano, masculino o femenino, de cualquier edad o raza. En una realización particular, dicho sujeto es un mamífero que padece, o es susceptible de padecer, procesos patológicos asociados a la edad, tal como envejecimiento, o una enfermedad neurodegenerativa, tal como una enfermedad neurodegenerativa crónica.

El término “farmacéuticamente aceptable”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a que el compuesto es tolerable fisiológicamente y no produce, en general, una reacción alérgica o una reacción desfavorable similar, tal como un trastorno gástrico, mareo o similares, cuando se administra a un sujeto; preferiblemente, dicho término “farmacéuticamente aceptable” significa aprobado por una agencia reguladora de un gobierno o recogido en la farmacopea estadounidense o en otra farmacopea reconocida generalmente para uso en animales (p. ej., farmacopea europea, etc.).

El término “sal farmacéuticamente aceptable”, tal como se utiliza en el presente documento, incluye “sales metálicas farmacéuticamente aceptables” así como “sales de amina farmacéuticamente aceptables”. El término “sal metálica farmacéuticamente aceptable” contempla sales formadas con iones de sodio, potasio, calcio, magnesio, aluminio, hierro o zinc. El término “sal de amina farmacéuticamente aceptable” contempla sales con amoníaco y bases nitrogenadas orgánicas suficientemente fuertes para formar sales con ácidos carboxílicos. Dichas sales farmacéuticamente aceptables pueden ser obtenidas por métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia.

El compuesto 2-etil-butirato de (1S,3R,7S,8S,8aR)-1,2,3,7,8,8a-hexahidro-3,7-dimetil-8-[2-[(2R,4R)-tetrahidro-4hidroxi-6-oxo-2H-piran-2-il]etil]-1-naftalenilo puede ser obtenido por métodos de semisíntesis, tal como se describe para otros compuestos de la misma familia en la patente de Estados Unidos US 4866090.

Numerosos ensayos realizados por los inventores han puesto de manifiesto el efecto neuroprotector del compuesto NST0037 frente a la acción de una sustancia causante de estrés oxidativo, así como su efecto neuroprotector frente a la acción de una sustancia causante de estrés de retículo endoplásmico, y su efecto neuroprotector frente a la acción de una sustancia causante de apoptosis en neuronas humanas colinérgicas, así como su efecto neuroprotector frente a una sustancia que causa excitotoxicidad, daño oxidativo, apoptosis, atrofia del hipocampo, muerte neuronal, deterioro cognitivo, pérdida de memoria temporal, pérdida de memoria espacial, etc.

El efecto neuroprotector frente a la acción de una sustancia causante de estrés oxidativo, tal como xantina/xantina oxidasa (XXO) se describe en el Ejemplo 2. En dicho ejemplo se observa que el compuesto NST0037, es capaz de reducir cuantitativamente y de forma significativa la muerte neuronal causada por estrés oxidativo, lo que pone de manifiesto la capacidad neuroprotectora de este compuesto (Figura 1). Con el objetivo de definir mejor el efecto neuroprotector del compuesto, los inventores analizaron con más detalle el proceso neurodegenerativo mediante el análisis de la muerte neuronal causada por la acción de una sustancia causante de estrés de retículo endoplásmico (tunicamicina), determinando que el compuesto NST0037 es capaz de reducir cuantitativamente y de forma significativa la muerte neuronal causada por estrés de retículo endoplásmico, lo que pone de manifiesto la capacidad neuroprotectora de dicho compuesto (Figura 2). Con el objetivo de definir mejor el efecto neuroprotector del compuesto, los inventores analizaron con más detalle el proceso neurodegenerativo mediante el análisis de la muerte neuronal causada por la acción de una sustancia causante de apoptosis (camptotecina), determinando que el compuesto NST0037 es capaz de reducir cuantitativamente y de forma significativa la muerte neuronal causada por apoptosis, lo que pone de manifiesto la capacidad neuroprotectora de dicho compuesto (Figura 3). Asimismo, con el objetivo de definir mejor el efecto neuroprotector de dicho compuesto, los inventores analizaron con más detalle el proceso neurodegenerativo mediante el análisis por citometría de flujo de la muerte neuronal causada por apoptosis y su inhibición por dicho compuesto, en comparación con un inhibidor específico de la muerte neuronal por apoptosis, el Z-VAD-fmk, determinando que el compuesto NST0037 es capaz de inhibir cuantitativamente y de forma significativa la muerte neuronal causada por apoptosis y que este efecto neuroprotector se potencia con el pretratamiento del compuesto NST0037 y que es parcialmente dependiente de la biosíntesis de colesterol (Figura 4).

Con el objetivo de definir mejor el efecto neuroprotector del compuesto, los inventores analizaron con más detalle el proceso neurodegenerativo mediante el análisis de la muerte neuronal causada por una sustancia excitotóxica (el kainato) en las neuronas del hipocampo de ratones, tal como se describe en el Ejemplo 3. En dicho ejemplo se observa que el compuesto NST0037 es capaz de reducir cuantitativamente y de forma significativa la muerte neuronal causada por una sustancia excitotóxica, lo que pone de manifiesto la capacidad neuroprotectora de dicho

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compuesto (Figura 5). En dicha gráfica se demuestra que el tratamiento con NST0037 administrado antes y después, o solamente después, de la administración del kainato produce la protección de las neuronas del hipocampo inhibiendo la muerte neuronal en las zonas CA1 y CA2. Por el contrario, la administración del compuesto NST0037 por sí solo no produce ningún cambio histopatológico destacable, no mostrando diferencias apreciables con el grupo control. Asimismo, como es conocido, la muerte de neuronas del hipocampo induce, en algunos casos, el deterioro cognitivo del animal viéndose afectados los procesos de memoria; por este motivo, los inventores analizaron si el efecto neuroprotector del compuesto se veía acompañado de una reducción de la pérdida de memoria temporal y espacial producida por una sustancia excitotóxica. En los resultados obtenidos sobre la memoria temporal (Figura 6), se demuestra que el tratamiento con NST0037 administrado antes y después, o solamente después, de la administración del kainato produce la protección de la pérdida de este tipo de memoria. En los resultados obtenidos sobre la memoria espacial (Figura 7), se demuestra que el tratamiento con NST0037 administrado antes y después, o solamente después, de la administración del kainato produce la protección de la pérdida de este tipo de memoria. Por el contrario, la administración del compuesto NST0037 por sí solo no produce ningún cambio destacable sobre el estado cognitivo de los animales, no mostrando diferencias apreciables con el grupo control. Asimismo, como es conocido, la administración de una sustancia excitotóxica y la muerte neuronal induce, en algunos casos, la muerte del animal; por este motivo, los inventores analizaron si el efecto neuroprotector del compuesto NST0037 se veía acompañado de una reducción de la mortalidad producida por una sustancia excitotóxica. En los resultados obtenidos (Figura 8), se demuestra que el tratamiento con NST0037 administrado antes y después, o solamente después, de la administración del kainato produce un mayor índice de supervivencia, lo que indica que el tratamiento con dicho compuesto protege a los animales de la muerte y del resto de efectos orgánicos producidos por una sustancia excitotóxica. Por el contrario, la administración del compuesto NST0037 por sí solo no produce ninguna variación destacable sobre el índice de supervivencia de los animales, no mostrando diferencias apreciables con el grupo control.

Asimismo, como es conocido, la administración de una sustancia excitotóxica induce, en algunos casos, crisis convulsivas y epilepsia en el animal; por este motivo, los inventores analizaron si el efecto neuroprotector del compuesto NST0037 se veía acompañado de un efecto antiepiléptico y anticonvulsivante producido por una sustancia excitotóxica (Ejemplo 4), observándose que la administración de NST0037 retrasaba el tiempo de aparición de la primera convulsión (latencia) (Figura 9), produciendo además una disminución en la gravedad y la duración de los síntomas epilépticos (Figura 10), lo que demuestra el efecto antiepiléptico o anticonvulsivante del compuesto NST0037.

Además, y debido a la naturaleza del compuesto NST0037, se estudió la capacidad inhibidora de la enzima 3hidroxi-3-metilglutaril coenzima A reductasa (HMGR). Sorprendentemente, y tal como se muestra en el Ejemplo 5 los resultados demuestran que el compuesto NST0037 presenta un efecto hipocolesterolémico evidente. En los resultados obtenidos y tal como muestra la Figura 11, se puede apreciar que la actividad inhibitoria de la enzima HMGR por parte del compuesto NST0037 está dentro del rango de dos de las estatinas comerciales (atorvastatina y simvastatina) usadas habitualmente para disminuir los niveles de colesterol en la población humana. Aquí se demuestra que el compuesto NST0037 ejerce un efecto inhibitorio de dicha enzima muy similar a la estatina con mayor actividad demostrada (la atorvastatina), e inhibe 7,5 veces más la enzima HMGR que la estatina más segura (la simvastatina).

Con el objetivo de definir mejor el efecto hipocolesterolémico del compuesto, los inventores analizaron con más detalle la actividad hipocolesterolémica mediante el análisis de las variaciones de las fracciones de colesterol en el plasma de ratones con hipercolesterolemia endógena, tal como se describe en el Ejemplo 5. Para ello, se comparó el efecto del compuesto NST0037 y de la simvastatina en dos grupos de ratones, determinándose los niveles de colesterol total tras la administración de los compuestos (Figura 12), donde se observó, de forma sorprendente, que ambos compuestos producían un efecto hipocolesterolémico similar. Con el objetivo de definir mejor el efecto hipocolesterolémico del compuesto, se analizaron los niveles de colesterol en las fracciones de LDL, HDL y VLDL, determinándose que ambos compuestos disminuyen de forma similar los niveles de colesterol en las fracciones LDL y VLDL, pero no en las HDL (Figuras 13 a 15), lo que demuestra un efecto hipocolesterolémico y cardioprotector. Con el objetivo de definir mejor el efecto hipocolesterolémico del compuesto, se analizaron los niveles de colesterol libre y esterificado, determinándose que ambos compuestos disminuyen de forma similar los niveles de colesterol esterificado, pero no libre (Figura 16 a 17), lo que demuestra un efecto hipocolesterolémico y cardioprotector.

Con el objetivo de definir mejor el efecto hipocolesterolémico del compuesto, los inventores analizaron con más detalle la actividad hipocolesterolémica mediante el análisis de las variaciones de las fracciones de colesterol en el plasma de ratones con hipercolesterolemia inducida, tal como se describe en el Ejemplo 6. Para ello, se comparó el efecto del compuesto NST0037 y de la simvastatina en dos grupos de ratones, determinándose los niveles de colesterol total tras la administración de los compuestos (Figura 18), donde se observó, de forma sorprendente, que el compuesto NST0037 presentaba un mayor efecto hipocolesterolémico que la simvastatina. Con el objetivo de definir mejor el efecto hipocolesterolémico del compuesto, se analizaron los niveles de colesterol en las fracciones de LDL, HDL y VLDL, determinándose que el compuesto NST0037 disminuye más eficazmente los niveles de colesterol en la fracción LDL que la simvastatina, no alterando los niveles de colesterol ni en las fracciones HDL (al igual que la simvastatina) ni en las VLDL (al contrario que la simvastatina) (Figuras 19 a 21), lo que demuestra un efecto hipocolesterolémico y cardioprotector. Con el objetivo de definir mejor el efecto

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Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la invención.

Ejemplo 1

Síntesis de 2-etil-butirato de (1S,3R,7S,8S,8aR)-1,2,3,7,8,8a-hexahidro-3,7-dimetil-8-[2-[(2R,4R)-tetrahidro-4hidroxi-6-oxo-2H-piran-2-il]etil]-1-naftalenilo

5 El compuesto identificado como NST0037 se preparó siguiendo la metodología descrita en Hoffman, et al. (J. Med. Chem., 1986, 29, 849-852) para compuestos similares.

1.1. Purificación de lovastatina

Partiendo de un extracto de procedencia natural, la lovastatina se purificó por cromatografía en columna utilizando como eluyente un gradiente de hexano y acetato de etilo.

10 1.2. Obtención de monacolina J

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Se prepara una disolución de 0,7 g de hidróxido potásico en 0,5 ml de agua y se añade poco a poco 3 ml de metanol. Posteriormente, se añaden 0,5 g de Lovastatina y se pone la disolución a reflujo durante 21 horas. Después del tratamiento de la reacción se obtiene una mezcla al 50 % de monacolina J y producto de apertura.

15 1.3. Preparación del derivado protegido

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Se prepara una disolución de 0,5 g de Monacolina J en 10 ml de diclorometano. Se añaden 0,4345 g de imidazol y se agita hasta disolución. A continuación se añade 0,4835 g de cloruro de terc-butil-dimetilsilano disueltos en 5 ml de diclorometano, y se continúa la agitación durante 24 horas. Se sigue la reacción por TLC utilizando como

20 eluyente diclorometano-metanol (10:1). Rendimiento: 96 %.

1.4. Preparación del derivado acilado

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En un matraz con atmósfera inerte, se disuelven 0,3 g del derivado protegido obtenido previamente en 2 ml de piridina. Posteriormente, se añade 0,06 g de DMAP disuelta en 2 ml de piridina. Se coloca el matraz de reacción

25 en baño de hielo y se añaden 0,378 ml del cloruro de 2-etilbutirilo. A continuación se agita durante una hora a 0º C y a temperatura ambiente durante 18 horas. Se sigue la reacción por TLC utilizando como eluyente hexano-acetato de etilo (2:1). Rendimiento 95 %.

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1.5. Síntesis del compuesto final

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Se disuelven 0,368 g del derivado obtenido previamente se disuelven en 2 ml de THF. A continuación, se añade sobre el medio de reacción una disolución de 0,16 ml de ácido acético y 2,16 ml de fluoruro de tetrabutilamonio 1M. La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 16 horas. Se sigue la reacción por TLC utilizando como eluyente diclorometano-acetona (6:1). Rendimiento 75 %.

Ejemplo 2

Protección por NST0037 frente a la muerte neuronal inducida por diferentes agresiones: estrés oxidativo, estrés de retículo endoplásmico y apoptosis

2.1. Protección por NST0037 frente a la muerte neuronal inducida por estrés oxidativo

El ensayo fue realizado sobre células en cultivo de neuroblastoma humano SK-N-MC procedentes de “American Type Culture Collection (ATCC)”, en todos los casos se siguieron estrictas normas de esterilidad y la manipulación se llevó a cabo en cabinas de seguridad biológica clase II que siguen la norma europea EN 12469. Las células fueron mantenidas en el siguiente medio de cultivo: “Minimun Essential Médium Eagle” (MEM) suplementado con piruvato sódico 1 mM, L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, gentamicina 0,05 mg/ml y suero fetal bovino al 10 %.

Se analizó la inhibición producida por el compuesto NST0037 de la muerte celular causada por el tratamiento con xantina/xantina oxidasa que origina daño oxidativo (produce radicales libres como peróxido de hidrógeno, anión superóxido, radical hidroxilo) lo que desencadena muerte celular. Estas células, en pase no superior a 15, fueron sembradas sobre placas de 96 pocillos tratadas para células adherentes con una concentración celular de 5x104 células/pocillo; para cada condición del ensayo se sembraron 3 pocillos de la placa.

Tras 24 h de incubación de las células a 37 ºC y CO2 al 5 % se procedió a los tratamientos celulares con 100 µl de volumen total para las condiciones siguientes:

-Control: medio de cultivo (medio)

-Xantina/xantina oxidasa (XXO): medio más xantina 10 µM/ xantina oxidasa 60 mU/ml, que produce la muerte del 50 % de las células.

-XXO más NST0037: medio más XXO (10 µM / 60 mU/ml) más NST0037 a 1, 4, 10, 20, 40 o 100 µM.

Las células fueron incubadas (a 37 ºC y CO2 al 5 %) con estos tratamientos durante 22 h, pasadas las cuales se añadió el reactivo WST-1 (Roche). El test WST-1 se basa en la medida de la actividad metabólica. El daño celular produce la pérdida de la habilidad de las células de obtener la energía necesaria para mantener sus funciones metabólicas y el crecimiento celular, por lo que las células que metabólicamente activas (vivas) reducen la sal de tetrazolium a formazán mediante el sistema succinato-tetrazolium reductasa (de la cadena respiratoria mitocondrial). El formazán formado puede ser detectado colorimétricamente, ya que tiene una absorbancia de 440 nm. A las 2 horas de añadido el reactivo se realizó la lectura en un lector de placas a 440 nm.

Los resultados obtenidos se muestran, como aparece en la Figura 1, como el porcentaje de muerte celular para cada tratamiento referido a la muerte producida por la XXO. Se observó protección de la muerte desde 1 a 100 µM de NST0037, siendo las diferencias respecto a la XXO estadísticamente significativas, según el test t de Student, para todas las concentraciones evaluadas, alcanzando una máxima protección del 78 % a 20 µM. Estos resultados indican que el compuesto NST0037 muestra un efecto protector de la muerte de células humanas de origen neuronal causada por estrés oxidativo.

2.2. Protección por NST0037 frente a la muerte neuronal inducida por estrés de retículo endoplásmico

El ensayo fue realizado sobre células en cultivo de neuroblastoma humano SK-N-MC procedentes de “American Type Culture Collection (ATCC)”, en todos los casos se siguieron estrictas normas de esterilidad y la manipulación se llevó a cabo en cabinas de seguridad biológica clase II que siguen la norma europea EN 12469. Las células fueron mantenidas en el siguiente medio de cultivo: “Minimun Essential Médium Eagle” (MEM) suplementado con piruvato sódico 1 mM, L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, gentamicina 0,05 mg/ml y suero fetal bovino al 10 %.

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El ensayo fue realizado sobre células en cultivo de neuroblastoma humano SK-N-MC procedentes de “American Type Culture Collection (ATCC)”, en todos los casos se siguieron estrictas normas de esterilidad y la manipulación se llevó a cabo en cabinas de seguridad biológica clase II que siguen la norma europea EN 12469. Las células fueron mantenidas en el siguiente medio de cultivo: “Minimun Essential Médium Eagle” (MEM) suplementado con piruvato sódico 1 mM, L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, gentamicina 0,05 mg/ml y suero fetal bovino al 10 %.

Se analizó la inhibición producida por el compuesto NST0037 frente a la apoptosis (muerte celular programada) causada por el tratamiento con camptotecina que inhibe la enzima topoisomerasa I, lo que impide la duplicación del DNA y desencadena muerte celular apoptótica. Estas células, en pase no superior a 15, fueron sembradas sobre placas de 6 pocillos tratadas para células adherentes con una concentración celular de 8x105 células/pocillo y 7x105 células/pocillo para el ensayo con pretratamiento; para cada condición del ensayo se sembraron 2 pocillos de la placa.

Tras 24 h de incubación de las células a 37 ºC y CO2 al 5 % se procedió a los tratamientos celulares con 2 ml de volumen total para las condiciones siguientes:

-Control: medio de cultivo (medio)

-Camptotecina: medio más camptotecina 50 µM.

-Camptotecina más Z-VAD-fmk: medio más camptotecina 50 µM más Z-VAD-fmk 50 µM, como control positivo de inhibición.

-Camptotecina más NST0037: medio más camptotecina 50 µM más NST0037 a 10, 40 o 100 µM.

En el ensayo con pretratamiento las células se trataron previamente con 40 µM de NST0037, 100 µM de mevalonato o ambos juntos durante 24 h y después se trataron con 50 µM camptotecina, el resto del procedimiento fue similar al ensayo sin pretratamiento.

Las células fueron incubadas (a 37 ºC y CO2 al 5 %) con estos tratamientos durante 6 h, pasadas las cuales se recogieron junto con su medio de cultivo y se centrifugaron a 300xg durante 5 min. Se eliminó el medio, se realizó un lavado con PBS y se fijaron durante 2 minutos con 500 µl de etanol al 70 % a -20 ºC. Una vez fijadas se centrifugaron a 400xg durante 5 min, se lavaron con PBS y se les añadió yoduro de propidio a 0,05 mg/ml, diluido en buffer de ciclo (Citrato sódico al 0,1 %, Nonidet P-40 al 0,3 % y RNAsa 0,02 mg/ml) y se incubaron 1 hora a 37 ºC. Pasado este tiempo se analizaron por citometría de flujo, comparando la fluorescencia del yoduro de propidio frente a la cantidad de DNA. El porcentaje de apoptosis se midió sobre la región sub-G1 de cada una de las condiciones.

Los resultados obtenidos se muestran, como aparece en la Figura 4A y B, como el porcentaje de la inhibición de la apoptosis de cada tratamiento referido a la apoptosis producida por la camptotecina. Se observó una protección máxima del 18 % a 40 y 100 µM de NST0037 (Figura 4A), por lo que este compuesto muestra un efecto protector de la apoptosis en células humanas de origen neuronal. El Z-VAD-fmk, inhibidor específico de caspasas, inhibió específicamente la apoptosis producida por la camptotecina. Estos resultados fueron corroborados mediante experimentos de pretratamiento del NST0037 a 40 µM (Figura 4B), lo que produjo un aumento del porcentaje de protección (llegando hasta el 45 %). Adicionalmente se determinó que la protección ejercida por NST0037 es inhibida parcialmente por la adición de mevalonato al medio, lo que indica que el efecto neuroprotector del NST0037 está relacionado con la biosíntesis del colesterol o con alguno de los precursores de la ruta.

Ejemplo 3

Protección por NST0037 frente a la muerte neuronal en el hipocampo, del déficit cognitivo y de la muerte causada por una sustancia excitotóxica

3.1. Efecto protector de NST0037 frente a la muerte neuronal en el hipocampo de ratones causada por una sustancia excitotóxica

En base a los resultados del Ejemplo 2, los inventores decidieron averiguar si el efecto neuroprotector de NST0037 demostrado en neuronas colinérgicas humanas se corroboraba en un modelo de enfermedad de Alzheimer esporádica en ratón mediante administración de kainato (KA).

Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 12 semanas de edad y de la cepa FVB/NHan. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animals (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con la máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones.

Veintiocho animales fueron utilizados en este ensayo y los tratamientos llevados a cabo, todos por vía intraperitoneal (i.p.) con un volumen de 100 µl, según las siguientes pautas:

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i) Pauta PBS+PBS+PBS: 4 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una nueva dosis de PBS y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de PBS.

ii) Pauta PBS+KA+PBS: 6 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/kg y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de PBS.

iii) Pauta PBS+KA+NST0037: 7 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/kg y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg.

iv) Pauta NST0037+KA+NST0037: 6 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días con NST0037 a 50 mg/kg, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/kg y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg.

v) Pauta NST0037+PBS+NST0037: 5 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días con NST0037 a 50 mg/kg, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de PBS y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg.

Una vez concluido el tiempo de 7 días de tratamiento los animales fueron sacrificados y los encéfalos fueron diseccionados. Las muestras de encéfalo fueron procesadas e incluidas en parafina. Para el análisis de la arquitectura celular del hipocampo se utilizó la tinción con hematoxilina y eosina en cortes de 5 µm de grosor.

Como muestra la Figura 5, la pauta de administración PBS+KA+PBS produjo un severo daño neuronal en la región CA1 y CA2 del hipocampo de los ratones. En las muestras de dicho grupo observamos ausencia de neuronas, evidencias de necrosis y numerosos núcleos picnóticos, lo que demuestra muerte neuronal. Sin embargo, las muestras del grupo NST0037+KA+NST0037 presentaban una estructura celular igual a los controles (grupo PBS+PBS+PBS) sin evidencias de daño celular en las regiones CA1 y CA2. Además y de manera sorprendente, las muestras del grupo PBS+KA+NST0037, mostraron diversas señales de daño y muerte neuronal en el hipocampo. Sin embargo, comparando de visu las muestras de los grupos PBS+KA+PBS frente a las del grupo PBS+KA+NST0037 observamos un mayor número de neuronas del hipocampo sin daño en el grupo con el tratamiento de NST0037, lo que indica su efecto neuroprotector. Por último las muestras del grupo NST0037+PBS+NST0037 presentaban un patrón igual al observado en los animales del grupo PBS+PBS+PBS.

En resumen, el pretratamiento con NST0037 (grupo NST0037+KA+NST0037) protegió completamente de la muerte neuronal producida por el KA en las regiones CA1 y CA2 del hipocampo. Además el comienzo del tratamiento con NST0037 después de la inoculación de KA redujo cualitativamente el daño y la muerte neuronal en esta región. También se demostró que la administración diaria de NST0037 durante 8 días no fue neurotóxica para los ratones.

3.2. Efecto protector de NST0037 frente al deterioro de la memoria de tipo episódica en ratones causado por una sustancia excitotóxica

La excitotoxicidad que produce el KA induce, a los pocos días tras su inoculación en ratones, el deterioro de la memoria de tipo episódico, afectando a la memoria temporal y produciendo un grave déficit en la memoria espacial. Debido a esto los inventores decidieron averiguar si el efecto neuroprotector de NST0037 se veía acompañado de una protección de la memoria que se deteriora por efecto de una sustancia excitotóxica.

Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 12 semanas de edad y de la cepa FVB/NHan. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animals (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con la máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones.

Veintiocho animales fueron utilizados en este ensayo y los tratamientos llevados a cabo, todos por vía intraperitoneal (i.p.) con un volumen de 100 µl, según las siguientes pautas:

i) Pauta PBS+PBS+PBS: 4 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una nueva dosis de PBS y durante los siguientes 3 días con una dosis diaria de PBS.

ii) Pauta PBS+KA+PBS: 6 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/kg y durante los siguientes 3 días con una dosis diaria de PBS.

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iii) Pauta PBS+KA+NST0037: 7 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/kg y durante los siguientes 3 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg.

iv) Pauta NST0037+KA+NST0037: 6 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días con NST0037 a 50 mg/kg, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/kg y durante los siguientes 3 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg.

v) Pauta NST0037+PBS+NST0037: 5 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días con NST0037 a 50 mg/kg, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de PBS y durante los siguientes 3 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg.

A los 3 días post-inoculación de KA les fue realizado a los animales un test de reconocimiento de objetos denominado test de memoria integral. En la Figura 6 se muestran los resultados de la relación en el tiempo de exploración de los objetos antiguos frente a los objetos recientes (memoria temporal). Se observó que el grupo con la pauta de tratamiento NST0037+KA+NST0037 evitó la disminución en la capacidad de memoria temporal en comparación con los ratones del grupo PBS+KA+PBS. Además los animales del grupo PBS+KA+NST0037 también presentaron una mejora del estado de la memoria temporal respecto a los tratados del grupo PBS+KA+PBS. Los datos también mostraron que el grupo de los ratones con la pauta NST0037+PBS+NST0037 también presentaron una mejora de la memoria temporal respecto al grupo PBS+PBS+PBS.

En la Figura 7 se muestran los resultados de la relación en el tiempo de exploración del objeto antiguo desplazado frente al objeto antiguo sin desplazar (memoria espacial). El grupo de ratones con las pautas de tratamiento NST0037+KA+NST0037 o NST0037+PBS+NST0037 mostraron una ratio de exploración de objetos que demuestra que la memoria espacial se encuentra intacta ya que no se observan diferencias respecto al grupo PBS+PBS+PBS. Sin embargo los ratones del grupo PBS+KA+PBS presentaron un deterioro grave de la memoria espacial. El grupo del tratamiento PBS+KA+NST0037 mostró una mejora de este tipo de memoria respecto a los que fueron tratados del grupo PBS+KA+PBS.

Estos estudios indican que el tratamiento antes y después (o solo después) del daño con una sustancia excitotóxica con el compuesto NST0037, tiene un efecto de protección de la memoria episódica (temporal y espacial) que degenera tras la administración de una sustancia excitotóxica.

3.3. Efecto protector de NST0037 frente a la muerte causada por una sustancia excitotóxica

Es conocido que la administración de una sustancia excitotóxica a animales induce, en algunos casos, la muerte del animal. Debido a esto los inventores decidieron averiguar si el efecto neuroprotector de NST0037 se veía acompañado de una reducción de la mortalidad producida por una sustancia excitotóxica.

Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 12 semanas de edad y de la cepa FVB/NHan. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animals (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con la máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones.

Veintiocho animales fueron utilizados en este ensayo y los tratamientos llevados a cabo, todos por vía intraperitoneal (i.p.) con un volumen de 100 µl, siguieron la siguiente pauta:

vi) Pauta PBS+PBS+PBS: 4 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una nueva dosis de PBS y durante los siguientes 3 días con una dosis diaria de PBS.

vii) Pauta PBS+KA+PBS: 6 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/kg y durante los siguientes 3 días con una dosis diaria de PBS.

viii) Pauta PBS+KA+NST0037: 7 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/kg y durante los siguientes 3 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg.

ix) Pauta NST0037+KA+NST0037: 6 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días con NST0037 a 50 mg/kg, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/kg y durante los siguientes 3 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg.

x) Pauta NST0037+PBS+NST0037: 5 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días con NST0037 a 50 mg/kg, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de PBS y durante los siguientes 3 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg.

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Durante todo el tiempo del ensayo se registraron las muertes, los resultados se muestran en la Figura 8 mediante curvas de supervivencia de Kaplan-Meier. Los resultados del estudio de la mortalidad producida por el KA mostraron que el grupo con la pauta de tratamiento NST0037+KA+NST0037 protegió de la muerte asociada al daño producido por una sustancia excitotóxica. Además, y lo que es más importante, el grupo con la pauta de tratamiento PBS+KA+NST0037 aumenta la supervivencia de los animales frente a los del grupo con la pauta PBS+KA+PBS.

Estos estudios indican que el tratamiento antes y después (o solo después) del daño con una sustancia excitotóxica con el compuesto NST0037, tiene un efecto de protección de mortalidad causada por la administración de una sustancia excitotóxica.

Ejemplo 4

Efecto antiepiléptico de NST0037 frente a la acción de una sustancia excitotóxica

Es conocido que la administración de una sustancia excitotóxica a animales induce, en algunos casos, crisis epilépticas y convulsiones en los animales. Debido a esto los inventores decidieron averiguar si el efecto neuroprotector de NST0037 se veía acompañado de un efecto antiepiléptico producido por una sustancia excitotóxica.

Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 12 semanas de edad y de la cepa FVB/NHan. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animals (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con la máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones.

Los animales fueron inoculados intraperitonealmente con 25 mg/kg de kainato (KA) disuelto en PBS. Trece animales fueron pretratados a 24 y 0,5 horas antes de la inoculación con KA mediante inyección intraperitoneal con PBS (pauta de administración PBS+KA) y 6 fueron pretratados a 24 y 0,5 horas antes de la inoculación con KA mediante inyección intraperitoneal con NST0037 a una dosis de 50 mg/kg (pauta de administración NST0037+KA). Tras la inoculación los animales fueron alojados en cubetas de manera individual para su seguimiento. Durante la observación se registró el nivel máximo de epilepsia de los animales según la escala Racine cada diez minutos y durante al menos 120 minutos post-inoculación (m.p.i.).

Posteriormente se realizaron estudios comparativos de los fenómenos epileptogénicos entre el tratamiento con PBS (PBS+KA) y con NST0037 (NST0037+KA). Se observaron diferencias en el porcentaje de animales que entraron en status epilepticus, es decir que presentaron convulsiones clónico-tónicas, entre el grupo de NST0037+KA y que fue de un 33,3 % (2 de 6) frente al grupo de pauta de tratamiento con PBS+KA y que fue de un 76,9 % (10 de 13), lo que demuestra que el compuesto NST0037 es antiepiléptico y anticonvulsivante. También se observaron diferencias en el tiempo en el que aparecían las primeras convulsiones (periodo de latencia), donde la latencia del grupo NST0037+KA (103,3±13,1 min.) fue mayor que con la pauta de tratamiento PBS+KA (74,6±8,6 min.) como se muestra la Figura 9, lo que demuestra un efecto antiepiléptico y anticonvulsivante del compuesto NST0037. En base a estos resultados los inventores decidieron averiguar si el efecto antiepiléptico y anticonvulsivante se confirmaba con los niveles de epilepsia y por la gravedad de los síntomas, observando que los animales del grupo con la pauta PBS+KA alcanzaban un nivel de epilepsia 4 en la escala Racine, mientras la pauta NST0037+KA no produjo en ningún momento un nivel de epilepsia 3 en dicha escala, indicando que el compuesto NST0037 es antiepiléptico y anticonvulsivante. Además, a partir de los 100 m.p.i. la pauta NST0037+KA produjo la desaparición de los síntomas epileptogénicos, mientras la pauta de PBS+KA presentaba crisis y espasmos graves.

Estos estudios indican que el tratamiento con el compuesto NST0037, tiene un efecto antiepiléptico y anticonvulsivante debido a la administración de una sustancia excitotóxica.

Ejemplo 5

Actividad inhibitoria de la HMGR y efecto hipocolesterolémico de NST0037 en un modelo de hiperlipidemia endógena en ratón

5.1. Efecto inhibitorio de NST0037 sobre la actividad enzimática de la HMGR

Debido a la naturaleza del compuesto, se determinó el grado de inhibición de la enzima HMGR por el compuesto NST0037, ya que este enzima es clave en la síntesis de colesterol celular y en la regulación fisiológica de dicha síntesis. El efecto de este compuesto se comparó con el de dos estatinas conocidas, la atorvastatina y la simvastatina, compuestos para los que ya está descrito un potente efecto inhibitorio sobre HMGR. Durante la reacción, la HMGR utiliza NADPH como agente reductor y como sustrato 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A (HMGCoA), produciendo ácido mevalónico, CoASH y NADP+. La disminución de la absorbancia a la que absorbe el NADPH (340 nm) es una medida directa de la actividad catalítica de la HMGR y sirve para calcular los porcentajes de inhibición de diferentes compuestos. Para llevar a cabo las medidas de inhibición de HMGR, el

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ensayo se llevó a cabo en placa de 96 pocillos, con un volumen de reacción total de 200 µl. El buffer de reacción (KH2PO4 50 mM, KCl 1 M, Bovine Serum Albumin [BSA] 2 mg/ml y DTT 5 mM, a pH=7,3) se preparó en el momento de llevar a cabo la reacción y se mantuvo a 37 ºC. En los ensayos se incluyeron:

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Un blanco: Carente de HMGR que informa de la estabilidad de NADPH durante la reacción.

-

Un control: Contiene todos los componentes de la reacción pero carece de compuesto problema.

-

Compuestos problema: NST0037, Atorvastatina y Simvastatina a diversas concentraciones. En todos los

casos se empleó la forma ácida de los compuestos.

Se llevaron a cabo cinco ensayos independientes con NST0037, cuatro ensayos independientes con atorvastatina y seis ensayos independientes con simvastatina, determinándose la potencia de la inhibición en un rango de concentraciones que permitían definir las constantes de inhibición al 50 % (IC50), mediante determinación espectrofotométrica de la caída de NADPH a 37 ºC, y tal y como se muestra en la Figura 11. El descenso de absorbancia a 340 nm permite calcular el porcentaje de actividad enzimática HMGR respecto al control. Las IC50 fueron determinadas mediante el método Trimmed Spearman-Karber (Versión 1.5). Los resultados indican que la potencia de inhibición de NST0037 está sorprendentemente próxima a la de la estatina más potente, la atorvastatina, y es 7,5 veces más potente que la simvastatina, lo que demuestra un efecto inhibidor de la HMGR claro.

5.2. Efecto hipocolesterolémico de NST0037 en un modelo de hiperlipidemia endógena (familiar)

En base a los resultados del punto anterior, los inventores decidieron averiguar si la actividad inhibidora de la enzima HMGR por el compuesto NST0037 se correspondía con una variación de colesterol total y de sus fracciones en un modelo de hiperlipidemia endógena en ratón.

Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 46 semanas de edad y de la cepa ApoB100, la cual presenta una deficiencia en la retirada de colesterol de la sangre que produce un aumento anormalmente elevado de colesterol en plasma. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animals (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con la máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones.

Para llevar a cabo el experimento a los animales en condición de ayuno se les extrajo sangre por punción ocular. De dicha sangre se obtuvo el plasma en el que se determinaron los niveles de colesterol total y de sus fracciones previo a la administración de las sustancias a estudio. Inmediatamente después, los animales fueron inoculados intraperitonealmente con 50 mg/kg de cada uno de los compuestos problema. Cuatro animales fueron tratados únicamente con el vehículo y fueron considerados el grupo control. Un segundo grupo de cinco ratones recibió 50 mg/kg de simvastatina. Por último, un tercer grupo de cinco ratones recibió 50 mg/kg de NST0037. Transcurridas doce horas de los tratamientos, se extrajo sangre de nuevo a los animales en condición de ayuno y se obtuvo el plasma de dicha sangre. La Figura 12 muestra los niveles plasmáticos de colesterol a tiempo inicial (t0) y doce horas tras la administración de vehículo, simvastatina o NST0037 en los diferentes grupos de ratones (t12), demostrando que ambos compuestos presentan un efecto hipocolesterolémico significativo. En relación a las diferentes fracciones de colesterol, ambos compuestos disminuyeron apreciablemente los niveles de colesterol unido a lipoproteínas de baja densidad (c-LDL) y de muy baja densidad (c-VLDL), sin alterar los niveles de colesterol unido a lipoproteínas de alta densidad (c-HDL), tal y como se muestra en las Figuras 13 a 15. En relación a los niveles de colesterol libre (CL) y colesterol esterificado (CE), ambos compuestos disminuyeron de forma similar los niveles de CE sin alterar los de CL, tal y como se muestra en las Figuras 16 y 17.

Los resultados mostrados en este apartado demuestran que el compuesto NST0037 muestra un efecto sorprendentemente similar a la simvastatina, reduciendo los niveles de CT, c-LDL, c-VLDL y CE de manera significativa sin alterar los de c-HDL ni de CL.

Ejemplo 6

Efecto hipocolesterolémico de NST0037 en un modelo de hiperlipidemia inducida en ratón

En base a los resultados obtenidos en la experimentación con animales ApoB100, los inventores decidieron averiguar si el compuesto NST0037 mostraba también un efecto hipocolesterolémico en un modelo de hiperlipidemia inducida aguda.

Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron ratones salvajes machos de 6 semanas de edad y de la cepa C57BL6. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animals (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con la máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones.

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Para llevar a cabo el experimento a los animales en condición de ayuno se les extrajo sangre por punción ocular. De dicha sangre se obtuvo el plasma en el que se determinaron los niveles de colesterol total y de sus fracciones, previamente a la administración de las sustancias a estudio. Inmediatamente después, los animales fueron inoculados intraperitonealmente con 500 mg/kg de Tritón 1339 también conocido como tiloxapol. A los treinta minutos, los animales fueron inoculados intraperitonealmente con 50 mg/kg de cada uno de los compuestos problema. Siete animales fueron tratados únicamente con el vehículo y fueron considerados el grupo control. Un segundo grupo de seis ratones recibió 50 mg/kg de simvastatina. Por último, un tercer grupo de siete ratones recibió 50 mg/kg de NST0037. Transcurridas veinticuatro horas de los tratamientos, se extrajo sangre de nuevo a los animales en condición de ayuno y se obtuvo el plasma de dicha sangre. La Figura 18 muestra el número de veces que incrementa el colesterol total tras veinticuatro horas de la administración del Tritón 1339 seguida de la administración de vehículo, simvastatina o NST0037 en los diferentes grupos de ratones, demostrando que ambos compuestos problema presentan un efecto hipocolesterolémico, siendo estadísticamente significativo únicamente en el caso del tratamiento con NST0037. En relación a las diferentes fracciones de colesterol, ambos compuestos disminuyeron los niveles de colesterol unido a lipoproteínas de baja densidad (c-LDL), siendo estadísticamente significativa dicha reducción solo en el caso de NST0037. Solo la simvastatina disminuyó los niveles de colesterol unido a lipoproteínas de muy baja densidad (c-VLDL), no siendo alterados con ninguno de los dos compuestos los niveles de colesterol unido a lipoproteínas de alta densidad (c-HDL) tal y como se muestra en las Figuras 19 a 21. A diferencia de la simvastatina, NST0037 disminuyó los niveles de colesterol esterificado (CE), tal y como se muestra en la Figura 22. En relación a los niveles de colesterol libre (CL), ambos compuestos disminuyeron de forma similar los niveles de esta fracción, tal y como se muestra en las Figura 23.

Los resultados mostrados en este apartado demuestran sorprendentemente que el compuesto NST0037 presenta un efecto hipocolesterolémico igual o mayor a la simvastatina, reduciendo los niveles de CT y c-LDL de manera estadísticamente significativa. Estos resultados confirman el efecto hipocolesterolémico de NST0037 observado en el modelo de ratones apoB100.

Ejemplo 7

Bioseguridad de NST0037 en embrión de pez cebra

7.1. Análisis del índice de supervivencia del compuesto NST0037 en comparación con la simvastatina

Para evaluar la bioseguridad del compuesto NST0037 se analizaron sus efectos toxicológicos en el modelo de embrión de pez cebra mediante la determinación de los parámetros de seguridad del protocolo C15 de la OECD.

Los huevos fertilizados fueron obtenidos por apareamiento natural del pez cebra (Danio rerio, cepa AB). Un total de 8-10 parejas fueron utilizadas para cada cruce y se generaron un total de 200-250 huevos de media por pareja. Los huevos se recogieron inmediatamente después del desove y fueron lavados con agua de dilución (CaCl2•2H2O2 0,29 g/l, MgSO4•7H2O2 0,12 g/l, NaHCO3 0,065 g/l, KCl 0,006 g/l) ajustándose a pH 7,8 ± 0,2, acorde con el Reglamento CE n.º 440/2008 método C.1 y depositados en una placa petri.

Para asegurar la exposición en los estadios más tempranos del desarrollo, los huevos fueron rápidamente transferidos (un mínimo de 50 por condición) a otra placa petri con las soluciones a ensayar de los compuestos. Posteriormente, solo los huevos fertilizados (10 por condición experimental) fueron transferidos de las placas petri a las cámaras de exposición (placas microtiter M24) por medio de pipetas y expuestos a las sustancias a testar (NST0037 o simvastatina), con agua de dilución (controles) o con diferentes concentraciones de los tratamientos. Los embriones fueron incubados sin aireación adicional, a la temperatura apropiada (25±1 ºC) y bajo un régimen de 12 h luz/12 h oscuridad. Cada experimento fue realizado en triplicado.

Los estudios fueron llevados a cabo en un total de 9 días post-fertilización, donde la frecuencia de renovación del tratamiento se realizó todos los días, realizando así un ensayo semi-estático. Los tratamientos llevados a cabo siguieron la siguiente pauta:

•

10 animales control, tratados con agua de dilución y con recambio diario durante los 9 días que duró el ensayo.

•

30 animales tratados con el compuesto NST0037 (10 embriones por triplicado) diluido en agua de dilución y con recambio diario durante los 9 días que duró el ensayo.

•

30 animales tratados con el compuesto simvastatina (10 embriones por triplicado) diluido en agua de dilución y con recambio diario durante los 9 días que duró el ensayo.

Durante todo el tiempo que dura el ensayo se registró la mortalidad de los embriones-larvas, mostrándose los resultados en las Figuras 24 y 25 mediante la realización de curvas de Kaplan-Meier. Los resultados del estudio de la mortalidad inducida por las dos sustancias a estudio mostraron que el compuesto NST0037 es sorprendentemente más seguro que la simvastatina a las dosis evaluadas, siendo las curvas de supervivencia estadísticamente diferentes comparando ambos tratamientos.

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mientras el compuesto NST0037 no mostró efectos toxicológicos significativos, lo que indica su mayor bioseguridad. El tratamiento con simvastatina produjo trombosis intracraneales y cardíacas y edemas pericárdicos. También los datos de la gráfica muestran que los animales se fueron recuperando a lo largo del tiempo de los problemas inducidos por la simvastatina, indicando que el tratamiento con 0,2 mg/l de esta sustancia no fue suficientemente tóxico para inducir la muerte del animal, con la consiguiente mejora de los mismos.

Estos resultados indican que el compuesto NST0037 es más seguro que la simvastatina, ya que esta induce un mayor porcentaje de problemas toxicológicos de manera significativa con mayor gravedad.

7.5. Análisis de la variación de la cardiotoxicidad del compuesto NST0037 en comparación con la simvastatina en función de la dosis

En base a los resultados de los apartados anteriores, los inventores decidieron averiguar si la mayor bioseguridad del compuesto NST0037 en comparación con la simvastatina se corroboraba mediante el análisis de la cardiotoxicidad tras el tratamiento con los diferentes compuestos y a varias dosis. El estudio de este parámetro (cardiotoxicidad), no solo determina el ritmo cardiaco de los animales sino que además, nos permite observar alteraciones en el latido cardiaco (taquicardia, bradicardia, etc.) o anomalías en el desarrollo del corazón (pericarditis, atrofia, hipertrofia, etc.).

Los huevos fertilizados fueron obtenidos por apareamiento natural del pez cebra (Danio rerio, cepa AB). Un total de 8-10 parejas fueron utilizadas para cada cruce y se generaron un total de 200-250 huevos de media por pareja. Los huevos se recogieron inmediatamente después del desove y fueron lavados con agua de dilución (CaCl2•2H2O2 0,29 g/l, MgSO4•7H2O2 0,12 g/l, NaHCO3 0,065 g/l, KCl 0,006 g/l) ajustándose a pH 7,8 ± 0,2, acorde con el Reglamento CE n.º 440/2008 método C.1 y depositados en una placa petri.

Para asegurar la exposición en los estadios más tempranos del desarrollo, los huevos fueron rápidamente transferidos (un mínimo de 50 por condición) a otra placa petri con las soluciones a ensayar de los compuestos. Posteriormente, solo los huevos fertilizados (10 por condición experimental) fueron transferidos de las placas petri a las cámaras de exposición (placas microtiter M24) por medio de pipetas y expuestos a las sustancias a testar (NST0037 o simvastatina), con agua de dilución (controles) o con diferentes concentraciones de los tratamientos. Los embriones fueron incubados sin aireación adicional, a la temperatura apropiada (25±1 ºC) y bajo un régimen de 12 h luz/12 h oscuridad. Cada experimento fue realizado en triplicado.

Los estudios fueron llevados a cabo en un total de 9 días post-fertilización, donde la frecuencia de renovación del tratamiento se realizó todos los días, realizando así un ensayo semi-estático. Los tratamientos llevados a cabo siguieron la siguiente pauta:

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10 animales control, tratados con agua de dilución y con recambio diario durante los 9 días que duró el ensayo.

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30 animales tratados con el compuesto NST0037 (10 embriones por triplicado) diluido en agua de dilución y con recambio diario durante los 9 días que duró el ensayo.

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30 animales tratados con el compuesto simvastatina (10 embriones por triplicado) diluido en agua de dilución y con recambio diario durante los 9 días que duró el ensayo.

Se determinó el ritmo cardiaco de los embriones-larva de pez cebra mediante análisis visual en estereomicroscopio, con determinación del latido cardiaco con la ayuda de un contador manual durante un periodo de un minuto. Los diferentes tratamientos variaron el ritmo cardiaco de los animales, tal y como se muestra en la Figura 29, observándose que las larvas tratadas con simvastatina presentaron una disminución estadísticamente significativa respecto los controles a partir de la dosis de 0,06, y que llegó a ser muy evidente a la dosis de 2 mg/l. Por el contrario, la disminución del ritmo cardiaco con el compuesto NST0037 solo fue estadísticamente significativo a la dosis 2 mg/l en comparación con los controles, mientras a concentraciones menores no presentó diferencias con los controles. Además, a la máxima dosis utilizada de ambos compuestos (2 mg/l), el ritmo cardiaco de los animales tratados con simvastatina fue estadísticamente menor que a los tratados con NST0037, demostrando de nuevo que el compuesto NST0037 es más bioseguro que la simvastatina. Por lo tanto, NST0037 es un compuesto más cardioseguro que la simvastatina.

Ejemplo 8

Actividad fungicida de NST0037

La actividad fungicida de NST0037 se analizó mediante bioensayo frente a Candida albicans. Para ello se prepararon disoluciones de la forma β-hidroxiácida de NST0037, lovastatina, atorvastatina y simvastatina. Las concentraciones ensayadas fueron las siguientes: 2, 1,5, 1, 0,5, 0,25, 0,125, 0,06, 0,025 y 0,01 mM. Se prepararon placas de medio MA (conteniendo por litro: 20 g de extracto de malta, 20 g de glucosa, 1 g de micopeptona y 10 g de agar) previamente inoculadas con un cultivo de Candida albicans CECT 1002. Con ayuda de un sacabocados (6 mm diámetro) se prepararon varios pocillos en los que se depositaron 40 μl de las soluciones anteriores. El

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estudio se realizó por triplicado y en cada placa se incluyeron triplicados para cada compuesto y concentración. Las placas se mantuvieron a 4 ºC durante 1 hora y posteriormente se incubaron a 28 ºC durante toda la noche. La presencia de actividad antifúngica se determinó mediante la formación de halos de inhibición del crecimiento de C. albicans.

Los resultados obtenidos mostraron que el compuesto NST0037 tiene una mayor actividad antifúngica que las estatinas incluidas en el ensayo. Como se muestra en la Figura 30 este comportamiento se observó durante todo el rango de concentraciones. En el caso de las concentraciones más elevadas (2–0,25 mM) el compuesto NST0037 mostró valores ligeramente superiores a la simvastatina, la estatina que mostró la mayor actividad fungicida. Sin embargo, al utilizar las concentraciones más bajas (0,06 y 0,025 mM), el compuesto NST0037 fue el único capaz de producir halos de inhibición.

Ejemplo 9

Inducción de la expresión celular del gen 24-dehidrocolesterol reductasa (Seladin-1/DHCR24) por el tratamiento con NST0037

El ensayo fue realizado sobre células en cultivo de neuroblastoma humano SK-N-MC procedentes de “American Type Culture Collection (ATCC)”, en todos los casos se siguieron estrictas normas de esterilidad y la manipulación se llevó a cabo en cabinas de seguridad biológica clase II que siguen la norma europea EN 12469. Las células fueron mantenidas en el siguiente medio de cultivo: “Minimun Essential Médium Eagle” (MEM) suplementado con piruvato sódico 1 mM, L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, gentamicina 0,05 mg/ml y suero fetal bovino al 10 %.

Se analizó la expresión del gen seladin-1/DHCR24 (NCBI Reference Sequence: NM_014762.3) mediante RT-PCR cuantitativa a tiempo real en comparación con la memantina (fármaco habitualmente utilizado para tratar la enfermedad de Alzheimer). Las células SK-N-MC fueron tratadas durante 24 h en ausencia (control) o presencia de NST0037 o de memantina a 1, 4, 10 o 40 µM. El RNA total se extrajo mediante el kit High Pure RNA Isolation (Roche) y la cantidad y calidad del RNA se analizaron mediante espectrofotometría (Infinite 200 con NanoQuant, Tecan) y visualización de las bandas 18S y 28S mediante electroforesis. La RT-PCR se realizó mediante dos pasos, en primer lugar se pasó el mRNA a cDNA usando el RNA to cDNA kit (Applied Biosystem) y posteriormente se analizó la expresión génica mediante sondas TaqMan utilizando las sondas validadas Hs00207388_m1 para seladin-1/DHCR24 y Hs99999901_s1 para 18S (utilizado para normalizar los resultados) en el equipo 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystem). Se realizaron dos ensayos independientes por triplicado. La cantidad relativa de la expresión del gen se determinó utilizando el método ΔΔCt con el software SDS v2.1.1 (Applied Biosystem); la expresión de 18S fue usada para normalizar la medida.

Los resultados obtenidos, como aparece en la Figura 31, muestran el aumento de la expresión del gen seladin1/DHCR24 con el tratamiento con NST0037 a las concentraciones ensayadas, pero no con el tratamiento con memantina, lo que indica que el tratamiento con NST0037 produce el aumento específico de la expresión del gen seladin-1/DHCR24, que está relacionado con la biosíntesis de colesterol y con capacidad anti-apoptótica mediante la inhibición de la caspasa 3.

Ejemplo 10

Protección por NST0037 frente a la muerte neuronal inducida por la inhibición de la proteín fosfatasa 1 (PP1)

El ensayo fue realizado sobre células en cultivo de neuroblastoma humano SK-N-MC procedentes de “American Type Culture Collection (ATCC)”, en todos los casos se siguieron estrictas normas de esterilidad y la manipulación se llevó a cabo en cabinas de seguridad biológica clase II que siguen la norma europea EN 12469. Las células fueron mantenidas en el siguiente medio de cultivo: “Minimun Essential Médium Eagle” (MEM) suplementado con piruvato sódico 1 mM, L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, gentamicina 0,05 mg/ml y suero fetal bovino al 10 %.

Se analizó la inhibición producida por el compuesto NST0037 de la muerte celular causada por el tratamiento con ácido okadaico (OA) que inhibe la actividad de la proteín fosfatasa 1 (PP1). El OA es una de las drogas más utilizadas para el estudio del mecanismo de fosforilación de la proteína tau, involucrada en la patogénesis y la progresión de la EA. La inhibición de la PP1 produce alteraciones del citoesqueleto y daño mitocondrial. Estas células, en pase no superior a 15, fueron sembradas sobre placas de 96 pocillos tratadas para células adherentes con una concentración celular de 5x104 células/pocillo; para cada condición del ensayo se sembraron 3 pocillos de la placa.

Tras 24 h de incubación de las células a 37 ºC y CO2 al 5 % se procedió a los tratamientos celulares con 100 µl de volumen total para las condiciones siguientes:

-Control: medio de cultivo (medio)

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Los resultados obtenidos para los tratamientos se muestran en la Figura 35, en la que se muestra el porcentaje de Aβ(1–40) (A) y Aβ(1-42) (B) respecto a las células control a 48 h. Para Aβ(1-40) se obtiene una reducción tras el tratamiento con 10, 40 y 100 µM de NST0037. Para Aβ(1-42) se obtuvo una reducción tanto a 10 como a 40 µM de NST0037.

De estos resultados se concluye que NST0037 reduce la secreción de Aβ en células de neuroblastoma humano que sobreexpresan APP. La producción de Aβ se ha relacionado con muerte celular tanto in vitro como in vivo y, además, está asociado con las placas seniles que se encuentran en los enfermos de alzhéimer.

Ejemplo 14

Efecto del mevalonato sobre la protección por NST0037 frente a la muerte neuronal inducida por estrés oxidativo.

El ensayo fue realizado sobre células en cultivo de neuroblastoma humano SK-N-MC procedentes de “American Type Culture Collection (ATCC)”, en todos los casos se siguieron estrictas normas de esterilidad y la manipulación se llevó a cabo en cabinas de seguridad biológica clase II que siguen la norma europea EN 12469. Las células fueron mantenidas en el siguiente medio de cultivo: “Minimun Essential Médium Eagle” (MEM) suplementado con piruvato sódico 1 mM, L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, gentamicina 0,05 mg/ml y suero fetal bovino al 10 %.

Se analizó el efecto del mevalonato sobre la protección producida por el compuesto NST0037 de la muerte celular causada por el tratamiento con xantina/xantina oxidasa que origina daño oxidativo y muerte celular. Estas células, en pase no superior a 15, fueron sembradas sobre placas de 96 pocillos tratadas para células adherentes con una concentración celular de 5x104 células/pocillo; para cada condición del ensayo se sembraron 3 pocillos de la placa.

Tras 24 h de incubación de las células a 37 ºC y CO2 al 5 % se procedió a los tratamientos celulares con 100 µl de volumen total para las condiciones siguientes:

-Control: medio de cultivo

-Xantina/xantina oxidasa (XXO): medio más xantina 10 µM/ xantina oxidasa 60 mU/ml, que produce la muerte del 50 % de las células.

-XXO más NST0037: medio más XXO (10 µM / 60 mU/ml) más NST0037 a 40 µM.

-XXO más mevalonato: medio más XXO (10 µM / 60 mU/ml) más mevalonato a 10, 40 o 100 µM.

-XXO más NST0037 más mevalonato: medio más XXO (10 µM / 60 mU/ml) más NST0037 a 40 µM más mevalonato a 10, 40 o 100 µM.

Las células fueron incubadas (a 37 ºC y CO2 al 5 %) con los tratamientos durante 22 h, pasadas las cuales se añadió el reactivo WST-1 (Roche). El test WST-1 se basa en la medida de la actividad metabólica. El daño celular produce la pérdida de la habilidad de las células de obtener la energía necesaria para mantener sus funciones metabólicas y el crecimiento celular, por lo que las células que metabólicamente activas (vivas) reducen la sal de tetrazolium a formazán mediante el sistema succinato-tetrazolium reductasa (de la cadena respiratoria mitocondrial). El formazán formado puede ser detectado colorimétricamente, ya que tiene una absorbancia de 440 nm. A las 2 horas de añadido el reactivo se realizó la lectura en un lector de placas a 440 nm.

Los resultados obtenidos se muestran, como aparece en la Figura 36, como el porcentaje de muerte celular para cada tratamiento referido a la muerte producida por la XXO. Se observó que el mevalonato por sí solo no protege de la muerte por XXO, ni produce aumento de toxicidad, mientras que el NST0037 a 40 µM protegió un 57 % de la muerte y este efecto fue inhibido por la adición de mevalonato a 10, 40 y 100 µM, siendo las diferencias estadísticamente significativas, según el test t de Student, para 10 y 100 µM. Estos resultados indican que la protección observada del compuesto NST0037 está relacionada con la biosíntesis del colesterol o de alguno de los precursores de la ruta.

Ejemplo 15

Protección por NST0037 de las huellas neuropatológicas asociadas a la muerte neuronal en el hipocampo

15.1. Efecto protector de NST0037 frente a la distrofia neurítica producida por una sustancia excitotóxica en el hipocampo

En base a los resultados de neuroprotección, los inventores decidieron averiguar si el efecto neuroprotector de NST0037 en el hipocampo demostrado en un modelo de enfermedad de Alzheimer esporádica en ratón mediante administración de kainato (KA) estaba acompañado de la protección de otro signo de daño neuronal como es la distrofia neurítica.

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Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 12 semanas de edad y de la cepa FVB/NHan. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animals (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con la máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones.

Veinticinco animales fueron utilizados en este ensayo y los tratamientos llevados a cabo, todos por vía intraperitoneal (i.p.) con un volumen de 100 µl, según las siguientes pautas:

i) Pauta PBS+PBS+PBS: 4 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una nueva dosis de PBS y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de PBS.

ii) Pauta NST0037+KA+NST0037: 7 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días con NST0037 a 50 mg/kg, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/kg y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg.

iii) Pauta PBS+KA+PBS: 7 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/kg y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de PBS.

iv) Pauta PBS+KA+NST0037: 7 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/kg y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg.

Una vez concluido el tiempo de 7 días de tratamiento los animales fueron sacrificados y los encéfalos fueron diseccionados. Las muestras de encéfalo fueron procesadas e incluidas en parafina. Para el análisis de la distrofia neurítica en el hipocampo se realizó la inmunohistoquímica de campo claro contra la proteína asociada a microtúbulos tipo 2 (MAP2) en cortes coronales de 5 µm de grosor.

Como muestra la Figura 37, la pauta de administración PBS+KA+PBS produce una disminución del marcaje de MAP2 en especial en zonas de CA1, CA3 y giro dentado del hipocampo, respecto a la pauta de administración PBS+PBS+PBS que muestra un marcaje uniforme. Sin embargo, las muestras del grupo NST0037+KA+NST0037 presentaron un patrón de tinción igual a los controles (grupo PBS+PBS+PBS) sin evidencias de distrofia neurítica en estas regiones del hipocampo. Además, y de manera sorprendente, observamos que el tratamiento con NST0037 tras el pretratamiento con PBS y la inoculación de KA disminuye claramente la pérdida de marcaje de MAP2 en el hipocampo.

En resumen, el tratamiento con NST0037, tanto anterior como posterior a la inoculación de KA, protege de la distrofia neurítica producida por este en el hipocampo.

15.2. Efecto protector de NST0037 frente al daño oxidativo producido por una sustancia excitotóxica en el hipocampo

En base a los resultados de protección de la neurodegeneración y la distrofia neurítica, los inventores decidieron averiguar si el efecto neuroprotector de NST0037 en el hipocampo demostrado en un modelo de enfermedad de Alzheimer esporádica en ratón mediante administración de kainato (KA) estaba acompañado de la protección de otro signo de neurodegeneración asociado a la enfermedad como es el daño oxidativo.

Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 12 semanas de edad y de la cepa FVB/NHan. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animals (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con la máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones.

Veinticinco animales fueron utilizados en este ensayo y los tratamientos llevados a cabo, todos por vía intraperitoneal (i.p.) con un volumen de 100 µl, según las siguientes pautas:

i) Pauta PBS+PBS+PBS: 4 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una nueva dosis de PBS y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de PBS.

ii) Pauta NST0037+KA+NST0037: 7 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días con NST0037 a 50 mg/kg, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/kg y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg.

iii) Pauta PBS+KA+PBS: 7 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/kg y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de PBS.

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iv) Pauta PBS+KA+NST0037: 7 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/kg y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg.

Una vez concluido el tiempo de 7 días de tratamiento los animales fueron sacrificados y los encéfalos fueron diseccionados. Las muestras de encéfalo fueron procesadas e incluidas en parafina. Para el análisis del daño oxidativo por peroxidación lipídica en el hipocampo se realizó la inmunohistoquímica de campo claro contra el 4hidroxinonenal (HNE) en cortes coronales de 5 µm de grosor.

Como muestra la Figura 38, la pauta de administración PBS+KA+PBS produce un aumento de la señal de HNE en la región CA3 del hipocampo respecto a la pauta de administración PBS+PBS+PBS que no muestra este marcaje de peroxidación lipídica. Sin embargo, las muestras del grupo NST0037+KA+NST0037 presentaron un patrón de tinción igual a los controles (grupo PBS+PBS+PBS) sin neuronas marcadas con HNE en estas regiones del hipocampo. Además, y de manera sorprendente, observamos que el tratamiento con NST0037 tras el pretratamiento con PBS y la inoculación de KA reduce el número de neuronas con marcaje de HNE en el hipocampo.

En resumen, el tratamiento con NST0037, tanto anterior como posterior a la inoculación de KA, protege del daño oxidativo inducido por este en el hipocampo.

15.3. Efecto protector de NST0037 frente a la apoptosis producida por una sustancia excitotóxica en el hipocampo

En base a los anteriores resultados, los inventores decidieron averiguar si el efecto antioxidante de NST0037 en el hipocampo demostrado en un modelo de enfermedad de Alzheimer esporádica en ratón mediante administración de kainato (KA) estaba acompañado de la protección frente a la muerte por apoptosis, mecanismo que está asociado a la enfermedad.

Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 12 semanas de edad y de la cepa FVB/NHan. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animals (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con la máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones.

Veinticinco animales fueron utilizados en este ensayo y los tratamientos llevados a cabo, todos por vía intraperitoneal (i.p.) con un volumen de 100 µl, según las siguientes pautas:

i) Pauta PBS+PBS+PBS: 4 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una nueva dosis de PBS y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de PBS.

ii) Pauta NST0037+KA+NST0037: 7 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días con NST0037 a 50 mg/kg, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/kg y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg.

iii) Pauta PBS+KA+PBS: 7 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/kg y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de PBS.

iv) Pauta PBS+KA+NST0037: 7 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/kg y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg.

Una vez concluido el tiempo de 7 días de tratamiento los animales fueron sacrificados y los encéfalos fueron diseccionados. Las muestras de encéfalo fueron procesadas e incluidas en parafina. Para el análisis de la presencia de neuronas en apoptosis en el hipocampo se realizó la técnica de T.U.N.E.L. (Marcación de la UTP final mediada por la transferasa desoxinucleotidil terminal del inglés TdT-mediated dUTP nick end labelling) de fluorescencia en cortes coronales de 5 µm de grosor.

La pauta de administración PBS+KA+PBS produce muerte neuronal por apoptosis en el hipocampo y en especial en las regiones CA1, CA3 (Figura 38) y giro dentado. Sin embargo, las muestras del grupo NST0037+KA+NST0037 no presentaron neuronas positivas para T.U.N.E.L. mostrando un patrón igual a los controles (grupo PBS+PBS+PBS). Adicionalmente, observamos que el tratamiento con NST0037 tras el pretratamiento con PBS y la inoculación de KA reduce el número de neuronas en apoptosis a unas pocas células aisladas en la región CA3 del hipocampo.

En resumen, el tratamiento con NST0037, tanto anterior como posterior a la inoculación de KA, protege del daño oxidativo y de la apoptosis inducida por este en las neuronas del hipocampo.

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tratados con la máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones.

Cuarenta animales fueron utilizados en este ensayo y los tratamientos llevados a cabo con un volumen de 100 µl, según las siguientes pautas:

5 i) Pauta PBS+PBS+PBS: 10 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días por vía subcutánea (s.c.), en el segundo día los animales fueron inoculados con 4 dosis de PBS, a intervalos de 2 horas por vía intraperitoneal (i.p.). Durante los siguientes 7 días se les administró una dosis diaria de PBS por vía

s.c.

ii) Pauta PBS+MPTP+PBS: 10 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días de PBS

10 por vía s.c., en el segundo día los animales fueron inoculados con 4 dosis de MPTP a 20 mg/kg, a intervalos de 2 horas por vía i.p. Durante los siguientes 7 días se les administró una dosis diaria de PBS por vía s.c.

iii) Pauta NST0037+MPTP+NST0037: 10 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días de NST0037 a 50 mg/kg por vía s.c., en el segundo día los animales fueron inoculados con 4 dosis de MPTP a 20 mg/kg, a intervalos de 2 horas por vía i.p. Durante los siguientes 7 días se les administró una dosis diaria de

15 NST0037 a 50 mg/kg por vía s.c.

Durante todo el procedimiento experimental fueron registradas las muertes en los distintos grupos de tratamiento, con estos datos se realizaron las correspondientes curvas de supervivencia que se presentan en la Figura 39.

La pauta de administración PBS+MPTP+PBS produce un aumento estadísticamente significativo (p<0,05) de la mortalidad en los ratones. Sin embargo, y de forma sorprendente, el tratamiento con NST0037 promueve la

20 supervivencia de los animales tras la administración aguda de MPTP ya que no se observaron diferencias significativas entre el grupo NST0037+MPTP+NST0037 y el grupo PBS+PBS+PBS (p>0,05).

16.2. Efecto protector de NST0037 frente al declive en la resistencia motora causado por la administración aguda de una sustancia neurotóxica que induce la muerte de las neuronas dopaminérgicas

Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 12 semanas de edad y de la cepa

25 CD1. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animals (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con la máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones.

Cuarenta animales fueron utilizados en este ensayo y los tratamientos llevados a cabo con un volumen de 100 µl, 30 según las siguientes pautas:

i) Pauta PBS+PBS+PBS: 10 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días por vía subcutánea (s.c.), en el segundo día los animales fueron inoculados con 4 dosis de PBS, a intervalos de 2 horas por vía intraperitoneal (i.p.). Durante los siguientes 7 días se les administró una dosis diaria de PBS por vía

s.c.

35 ii) Pauta PBS+MPTP+PBS: 10 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días de PBS por vía s.c., en el segundo día los animales fueron inoculados con 4 dosis de MPTP a 20 mg/kg, a intervalos de 2 horas por vía i.p. Durante los siguientes 7 días se les administró una dosis diaria de PBS por vía s.c.

iii) Pauta NST0037+MPTP+NST0037: 10 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días de NST0037 a 50 mg/kg por vía s.c., en el segundo día los animales fueron inoculados con 4 dosis de MPTP a

40 20 mg/kg, a intervalos de 2 horas por vía i.p. Durante los siguientes 7 días se les administró una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg por vía s.c.

Antes del inicio de los tratamientos y una vez concluido el tiempo de 7 días de tratamiento les fue realizado a los animales un test de resistencia locomotora denominado test de Rotarod durante 2 minutos, registrando el tiempo que resistían los animales caminando por un cilindro que aumentaba su velocidad desde los 4 a los 40 r.p.m. En la

45 figura 40 se muestra la ratio, entre el final del ensayo y el estado basal, del tiempo que los animales de los diferentes grupos se mantienen caminando sobre el cilindro.

La pauta de administración PBS+MPTP+PBS produce una disminución estadísticamente significativa de la resistencia motora en los ratones desde su estado basal hasta 7 días después de la administración aguda del MPTP (p<0,05). Sin embargo, sorprendentemente, el tratamiento con NST0037 evita el deterioro motor de los

50 animales manteniendo la resistencia de los ratones en el nivel que mostraban antes de la administración del MPTP (p>0,05), patrón que es igual al de los ratones no inyectados con MPTP y tratados con PBS (p>0,05).

En resumen, el tratamiento con NST0037 protege de la pérdida de resistencia inducida por la administración aguda de MPTP.

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16.2. Efecto protector de NST0037 frente a la disminución de la fuerza causada por la administración aguda de una sustancia neurotóxica que induce la muerte de las neuronas dopaminérgicas

Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 12 semanas de edad y de la cepa CD1, Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animals (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con la máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones.

Cuarenta animales fueron utilizados en este ensayo y los tratamientos llevados a cabo con un volumen de 100 µl, según las siguientes pautas:

i) Pauta PBS+PBS+PBS: 10 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días por vía subcutánea (s.c.), en el segundo día los animales fueron inoculados con 4 dosis de PBS, a intervalos de 2 horas por vía intraperitoneal (i.p.). Durante los siguientes 7 días se les administró una dosis diaria de PBS por vía

s.c.

ii) Pauta PBS+MPTP+PBS: 10 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días de PBS por vía s.c., en el segundo día los animales fueron inoculados con 4 dosis de MPTP a 20 mg/kg, a intervalos de 2 horas por vía i.p. Durante los siguientes 7 días se les administró una dosis diaria de PBS por vía s.c.

iii) Pauta NST0037+MPTP+NST0037: 10 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días de NST0037 a 50 mg/kg por vía s.c., en el segundo día los animales fueron inoculados con 4 dosis de MPTP a 20 mg/kg, a intervalos de 2 horas por vía i.p. Durante los siguientes 7 días se les administró una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg por vía s.c.

Antes del inicio de los tratamientos y una vez concluido el tiempo de 7 días de tratamiento les fue realizado a los animales un test de fuerza en las denominado test de fuerza de agarre, registrando la fuerza de agarre a una barra en gramos que realizaban los animales con las patas delanteras por quintuplicado. En la figura 41 se muestra la ratio, entre la fuerza mostrada por los animales al final del ensayo respecto la del estado basal.

La pauta de administración PBS+MPTP+PBS produce una disminución estadísticamente significativa de la fuerza que los ratones ejercen al agarrarse con las patas delanteras desde su estado basal hasta 7 días después de la administración aguda del MPTP (p<0,05). Además, el tratamiento con NST0037 evita la pérdida de fuerza que induce el MPTP y tras 7 días de tratamiento los ratones del grupo NST0037+MPTP+NST0037 muestran unos niveles de fuerza iguales a los de antes de la administración del MPTP (p>0,05), patrón que es muy similar al de los ratones no inyectados con MPTP y tratados con PBS (p>0,05).

En resumen, el tratamiento con NST0037 protege de la pérdida de resistencia y de fuerza inducida por la administración aguda de MPTP.

16.3. Efecto protector de NST0037 frente a la neurodegeneración causada por la administración aguda de una sustancia neurotóxica que induce la muerte de las neuronas dopaminérgicas

Basándose en los resultados anteriores, los inventores quisieron determinar si la protección que mostraba el compuesto NST0037 frente al deterioro del estado psicomotor producido por el MPTP, se veía acompañado de la neurodegeneración en regiones del cerebro implicadas en la actividad locomotora, y relacionadas con la enfermedad de Parkinson como son la sustancia nigra y el estriado.

Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 12 semanas de edad y de la cepa CD1. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animals (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con la máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones.

Cuarenta animales fueron utilizados en este ensayo y los tratamientos llevados a cabo con un volumen de 100 µl, según las siguientes pautas:

i) Pauta PBS+PBS+PBS: 10 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días por vía subcutánea (s.c.), en el segundo día los animales fueron inoculados con 4 dosis de PBS, a intervalos de 2 horas por vía intraperitoneal (i.p.). Durante los siguientes 7 días se les administró una dosis diaria de PBS por vía

s.c.

ii) Pauta PBS+MPTP+PBS: 10 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días de PBS por vía s.c., en el segundo día los animales fueron inoculados con 4 dosis de MPTP a 20 mg/kg, a intervalos de 2 horas por vía i.p. Durante los siguientes 7 días se les administró una dosis diaria de PBS por vía s.c.

iii) Pauta NST0037+MPTP+NST0037: 10 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días de NST0037 a 50 mg/kg por vía s.c., en el segundo día los animales fueron inoculados con 4 dosis de MPTP a

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20 mg/kg, a intervalos de 2 horas por vía i.p. Durante los siguientes 7 días se les administró una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg por vía s.c.

Una vez concluido el tiempo de 7 días de tratamiento los animales fueron sacrificados y los encéfalos fueron diseccionados. Las muestras de encéfalo fueron procesadas e incluidas en parafina. Para el análisis de la neurodegeneración en la sustancia nigra y del estriado se realizó la tinción fluorescente de Fluoro Jade B (FJB) en cortes sagitales de 5 µm de grosor. En la figura 42 se muestra una fotografía representativa de cada grupo y en ambas zonas bajo estudio.

La pauta de administración PBS+MPTP+PBS produce un claro aumento de las células positivas para FJB tanto en la sustancia nigra como en el estriado respecto a las muestras del grupo PBS+PBS+PBS. En contraste, las muestras del grupo NST0037+MPTP+NST0037 presentaron un número de células en degeneración y positivas para FJB significativamente menor a las del grupo PBS+MPTP+PBS.

En resumen, el tratamiento con NST0037 protege frente al deterioro psicomotor y de la neurodegeneración, inducida por la administración aguda de MPTP, en las neuronas dopaminérgicas de la sustancia nigra, así como de las terminaciones nerviosas que inervan el estriado.

16.4. Efecto protector de NST0037 frente a la pérdida de neuronas dopaminérgicas por la administración aguda de una sustancia neurotóxica

Basándose en los resultados anteriores, los inventores quisieron determinar si la protección que mostraba el compuesto NST0037 frente a la neurodegeneración producida por el MPTP, se veía acompañada de la protección de neuronas dopaminérgicas en regiones del cerebro deterioradas en la enfermedad de Parkinson como son la sustancia nigra y el estriado.

Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 12 semanas de edad y de la cepa CD1. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animals (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con la máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones.

Cuarenta animales fueron utilizados en este ensayo y los tratamientos llevados a cabo con un volumen de 100 µl, según las siguientes pautas:

i) Pauta PBS+PBS+PBS: 10 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días por vía subcutánea (s.c.), en el segundo día los animales fueron inoculados con 4 dosis de PBS, a intervalos de 2 horas por vía intraperitoneal (i.p.). Durante los siguientes 7 días se les administró una dosis diaria de PBS por vía

s.c.

ii) Pauta PBS+MPTP+PBS: 10 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días de PBS por vía s.c., en el segundo día los animales fueron inoculados con 4 dosis de MPTP a 20 mg/kg, a intervalos de 2 horas por vía i.p. Durante los siguientes 7 días se les administró una dosis diaria de PBS por vía s.c.

iii) Pauta NST0037+MPTP+NST0037: 10 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días de NST0037 a 50 mg/kg por vía s.c., en el segundo día los animales fueron inoculados con 4 dosis de MPTP a 20 mg/kg, a intervalos de 2 horas por vía i.p. Durante los siguientes 7 días se les administró una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg por vía s.c.

Una vez concluido el tiempo de 7 días de tratamiento los animales fueron sacrificados y los encéfalos fueron diseccionados. Las muestras de encéfalo fueron procesadas e incluidas en parafina. Para el análisis de la presencia de neuronas dopaminérgicas en la sustancia nigra y del estriado se realizó la inmunohistoquímica contra la proteína tirosina-hidroxilasa (TH) en cortes sagitales de 5 µm de grosor. En la figura 43 se muestra una fotografía representativa de cada grupo y en ambas zonas bajo estudio.

La pauta de administración PBS+MPTP+PBS produce una evidente disminución de la cantidad de neuronas dopaminérgicas ya que se detecta una ausencia clara de marcaje con TH en comparación con el grupo PBS+PBS+PBS, tanto en los cuerpos neuronales de la sustancia nigra como en las extensiones nerviosas en el estriado. En cambio, las muestras del grupo NST0037+MPTP+NST0037 presentaron un mayor número de células TH-positivas en la sustancia nigra así como una mayor intensidad de marcaje en el estriado que las del grupo PBS+MPTP+PBS.

En resumen, el tratamiento con NST0037 protege frente al deterioro psicomotor de los ratones, además de la neurodegeneración y de la muerte neuronal inducida por la administración aguda de MPTP, en la sustancia nigra y el estriado.

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Protección por NST0037 frente a los déficits locomotores, muerte neuronal y daño oxidativo causado por una neurotoxina parkinsoniana administrada de forma subcrónica

Debido a los resultados obtenidos y presentados en el Ejemplo 16 los inventores decidieron analizar el efecto del NST0037 en los síntomas clínicos y en la neuropatología inducida en la sustancia nigra por la administración subcrónica del MPTP en ratón.

17.1. Efecto protector de NST0037 frente al declive en la resistencia motora causado por la administración subcrónica de una sustancia neurotóxica que induce la muerte de las neuronas dopaminérgicas

Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 12 semanas de edad y de la cepa CD1. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animals (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con la máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones.

Veinte animales fueron utilizados en este ensayo y los tratamientos, todos por vía intraperitoneal, fueron llevados a cabo con un volumen de 100 µl, según las siguientes pautas:

i) Pauta PBS+MPTP+PBS: 10 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días de PBS, a partir del segundo día los animales fueron inoculados con 1 dosis diaria de MPTP a 30 mg/kg durante 5 días, a intervalos de 2 horas por vía i.p. Durante los siguientes 21 días se les administró 3 dosis semanales de PBS.

ii) Pauta NST0037+MPTP+NST0037: 10 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días de NST0037 a 50 mg/kg, a partir del segundo día los animales fueron inoculados con 1 dosis diaria de MPTP a 30 mg/kg durante 5 días, a intervalos de 2 horas por vía i.p. Durante los siguientes 21 días se les administró 3 dosis semanales de NST0037 a 50 mg/kg.

Siete días antes del inicio de los tratamientos y a los 7, 14 y 21 días post-inoculación del MPTP les fue realizado a los animales un test de resistencia locomotora denominado test de Rotarod durante 2 minutos, registrando el tiempo que resistían los animales caminando por un cilindro que aumentaba su velocidad desde los 4 a los 40 r.p.m. En la figura 44 se muestra la ratio, entre los diferentes puntos temporales del ensayo y el estado basal, del tiempo que los animales de los diferentes grupos se mantienen caminando sobre el cilindro.

La pauta de administración PBS+MPTP+PBS produce una disminución estadísticamente significativa de la resistencia motora en los ratones desde su estado basal a partir de los 14 días después de la administración subcrónica del MPTP (p<0,05). Sin embargo, sorprendentemente, el tratamiento con NST0037 evita el deterioro motor de los animales manteniendo la resistencia de los ratones en el nivel que mostraban antes de la administración del MPTP (p>0,05).

En resumen, el tratamiento con NST0037 protege de la pérdida de resistencia inducida por la administración subcrónica de MPTP.

17.2. Efecto protector de NST0037 frente a la pérdida de neuronas dopaminérgicas por la administración subcrónica de una sustancia neurotóxica

Basándose en los resultados anteriores, los inventores quisieron determinar si la protección que mostraba el compuesto NST0037 frente al deterioro del estado psicomotor producido por el MPTP, se veía acompañada de neurodegeneración en una de las regiones más importantes del cerebro que está implicada en la enfermedad de Parkinson como es la sustancia nigra.

Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 12 semanas de edad y de la cepa CD1. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animals (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con la máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones.

Veinte animales fueron utilizados en este ensayo y los tratamientos, todos por vía intraperitoneal, fueron llevados a cabo con un volumen de 100 µl, según las siguientes pautas:

i) Pauta PBS+MPTP+PBS: 10 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días de PBS, a partir del segundo día los animales fueron inoculados con 1 dosis diaria de MPTP a 30 mg/kg durante 5 días, a intervalos de 2 horas por vía i.p. Durante los siguientes 21 días se les administró 3 dosis semanales de PBS.

ii) Pauta NST0037+MPTP+NST0037: 10 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días de NST0037 a 50 mg/kg, a partir del segundo día los animales fueron inoculados con 1 dosis diaria de MPTP a 30 mg/kg durante 5 días, a intervalos de 2 horas por vía i.p. Durante los siguientes 21 días se les administró 3 dosis semanales de NST0037 a 50 mg/kg.

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Ejemplo 19

Efecto de NST0037 sobre los niveles intracelulares de colesterol total en líneas celulares humanas hepáticas y neuronales

El ensayo tuvo por objeto determinar en qué grado el compuesto NST0037 en comparación con la simvastatina, era capaz de modificar los niveles de colesterol total en líneas celulares de origen neuronal y hepático. Para llevar a cabo este ensayo, los compuestos se activaron con NaOH hasta la apertura completa de la forma lactona.

Tanto la línea Hep G2 (hepatocarcinoma humano) como la línea SK-N-MC (neuroblastoma humano) se obtuvieron de Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC n.º HB-8065 y HTB-10 respectivamente). En todos los casos se siguieron estrictas normas de esterilidad y la manipulación se llevó a cabo en cabinas de seguridad biológica clase II que siguen la norma europea EN 12469. Las células mantenidas en pase se sembraron en placas de 96 pocillos en MEM suplementado con FBS al 10 %, 2 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato sódico, 0,1 mM de aminoácidos no esenciales y 0,05 mg/ml de gentamicina. En el caso de las HepG2 se sembraron 4x104 células/pocillo y en el caso de las SK-N-MC 5x104 células/pocillo. Transcurridas 24 h de la siembra, las células fueron desprovistas de FBS durante 8h. Seguidamente, las células fueron incubadas con los tratamientos a diversas concentraciones durante 20h. Tras el periodo de incubación, las células se lavaron con PBS y se lisaron con un tampón fosfato con tritón X-100 al 0,5 %. La lisis se completó mediante una doble congelación-descongelación.

La cuantificación de colesterol total se llevó a cabo mediante técnicas enzimáticas y fluorométricas. 25 µl de cada lisado se transvasaron a una placa de 96 pocillos junto con una curva patrón de colesterol que partía de 10 µg/ml hasta 0,08 µg/ml. Sobre las muestras se añadieron 75 µl de la mezcla reactiva preparada a base de MES 0,05 M (pH 6,5) conteniendo colesterol oxidasa (0,5 U/ml), colesterol esterasa (0,8 U/ml), peroxidasa de rábano (4 U/ml) y ampliflu red (20 µg/ml) y se incubó 15 minutos a 37 ºC. La intensidad de fluorescencia se determinó a 530 nm de excitación y 580 nm de emisión mediante un fluorímetro. Los resultados fueron normalizados por proteína la cual se determinó mediante la técnica del BCA.

En la Figura 47 se puede apreciar como el NST0037 presentó un efecto hipocolesterolémico en ambos tipos celulares, si bien fue en las células neuronales donde las reducciones de colesterol fueron más drásticas. En el caso de HepG2, NST0037 resultó ser más potente que la simvastatina, mientras que en SK-N-MC, las reducciones de colesterol con ambos compuestos fueron semejantes.

Ejemplo 20

Efecto hipocolesterolémico de NST0037 administrado oralmente durante 28 días en un modelo de hiperlipidemia endógena (familiar)

En base a los resultados presentados previamente sobre el carácter hipocolesterolémico del compuesto NST0037, los investigadores decidieron evaluar el efecto de la administración oral y en el tiempo de NST0037 en el mismo modelo de hipelipidemia endógena familiar (ratones apoB100) que se había empleado en el Ejemplo 5.2. El objetivo de este nuevo estudio fue analizar si la administración oral prolongada es eficaz para disminuir los niveles de colesterol en el tiempo.

Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron ratones hembra de 12 semanas de edad. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animals (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con la máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante los tratamientos y manipulaciones.

Los ratones fueron divididas en tres grupos: grupo control (n =8); grupo simvastatina (n = 8); grupo NST0037 (n = 8). Tras un acondicionamiento a la dieta, a los ratones se les administró oralmente y a la misma hora (15.00 a

18.00 h) durante 28 días consecutivos 50 mg/kg de simvastatina o NST0037 (en sus formas lactonas), empleando en ambos casos como vehículo carboximetilcelulosa al 0,25 % en agua. El grupo control recibió este mismo vehículo. Antes de iniciar los tratamientos y a los 7, 21 y 28 días de iniciar los mismos, se llevaron a cabo extracciones de sangre retro-orbital previo ayuno de 16h. De dicha sangre se obtuvo el plasma donde se evaluaron los niveles de colesterol total (CT), colesterol libre (CL), colesterol (CE), c-HDL, c-LDL, c-VLDL y apoB100 por técnicas enzimáticas y espectrofotométricas. Para comprobar si el efecto a nivel de lípidos implicaba una alteración del estrés oxidativo, se evaluó además el estado redox en los plasmas obtenidos mediante la técnica del TEAC (“Trolox Antioxidant Capacity Assay”). Esta técnica, determina la capacidad antioxidante in vitro dando una idea del estado redox de la muestra analizada mediante la capacidad de absorbancia por transferencia de electrones. A los plasmas diluidos 1/10 en PBS (10 µl), se les añadió en una placa de 96 pocillos los diferentes componentes de la reacción, mioglobina, ABTS (ácido 2,2-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-sulfónico), peróxido de hidrógeno y H2O2. Tras 3 minutos de incubación, la absorbancia se midió a 405 nm (con una referencia de 600 nm).

En la Figura 48 se puede observar que ambos tratamientos son capaces de disminuir de manera significativa los niveles plasmáticos de colesterol total. Este hecho se manifiesta principalmente en una disminución de VLDL y HDL además de en un menor incremento de LDL. Además, los niveles de la apolipoproteína B (apoB) fueron visiblemente disminuidos por los tratamientos. En la Figura 49 se muestran además la disminución de los niveles

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de CL y CE tras los tratamientos con el compuesto NST0037 en comparación con la simvastatina, siendo esta reducción más acusada a partir de los 21 días de tratamiento. Adicionalmente se demostró, como se presenta en la Figura 50, que los tratamientos con NST0037 y con simvastatina disminuyen el estado redox de los plasmas de los animales.

En resumen, el tratamiento con NST0037 durante 28 días mediante administración oral a ratones con hiperlipidemia congénita produce una disminución de los niveles de colesterol total, esterificado, libre, de todas las fracciones lipoprotéicas asociadas al colesterol, de los niveles de ApoB y del estado redox de los animales.

Ejemplo 21

Efecto hipocolesterolémico de NST0037 administrado oralmente durante tres meses en un modelo de hiperlipidemia endógena (familiar)

En base a los resultados presentados previamente sobre el carácter hipocolesterolémico del compuesto NST0037, los investigadores decidieron evaluar el efecto de la administración oral durante 3 meses de NST0037 en el mismo modelo de hipelipidemia endógena familiar (ratones apoB100).

Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron ratones hembra de 6 meses de edad. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animals (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con la máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante los tratamientos y manipulaciones.

Los animales fueron divididos en tres grupos: grupo control (n =8); grupo simvastatina (n = 6); grupo NST0037 (n = 8). Tras un acondicionamiento a la dieta, a los ratones se les administró oralmente durante 3 meses 50 mg/kg de NST0021 o NST0037, tres veces semanales, empleando en ambos casos como vehículo carboximetilcelulosa al 0,25 % en suero salino fisiológico. El grupo control recibió este mismo vehículo. Antes de iniciar los tratamientos y a los uno, dos y tres meses de iniciar el mismo, se llevó a cabo una extracción de sangre retro-orbital previo ayuno de 16h. De dicha sangre se obtuvo el plasma donde se evaluaron los niveles de colesterol total, colesterol libre (CL), colesterol (CE), c-HDL, c-LDL y, c-VLDL por técnicas enzimáticas y espectrofotométricas.

En la Figura 51 se puede observar como ambos tratamientos disminuyeron las diferentes fracciones de colesterol. No obstante, y de forma sorprendente, NST0037 disminuyó en mayor medida los niveles de c-LDL y aumentó los de c-HDL, mostrando así un mejor perfil cardioprotector que la simvastatina. Estos resultados se correlacionaron con los efectos de los tratamientos sobre los niveles de CL y CE (Figura 52), y donde que se apreció que el NST0037 produce una disminución significativa tanto de CL como de CE.

En resumen, el tratamiento con NST0037 durante 3 meses mediante administración oral a ratones con hiperlipidemia congénita produce una disminución de los niveles de colesterol total, esterificado, libre, así como una disminución de los niveles de c-LDL y un aumento del c-HDL, lo que demuestra su poder cardioprotector.

Ejemplo 22

Efecto hipolipemiante de NST0037 en ratas zucker genéticamente obesas

En base a los resultados presentados previamente sobre el carácter hipocolesterolémico del compuesto NST0037 en ratones, los investigadores decidieron evaluar el efecto de la administración oral durante 7 días de NST0037 en un modelo de hipelipidemia endógena en ratas Zucker genéticamente obesas, con niveles de lípidos anormalmente elevados.

Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron ratas zucker macho de 11 semanas de edad. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animals (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con la máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante los tratamientos y manipulaciones.

Los animales fueron divididas en tres grupos: grupo control (n =7); grupo simvastatina (n = 7); grupo NST0037 (n = 7). Tras un acondicionamiento a la dieta, a las ratas se les administró oralmente y a la misma hora (15.00 a 18.00h) durante 7 días consecutivos 30 mg/kg de NST0021 o NST0037, empleando en ambos casos como vehículo carboximetilcelulosa al 0,5 % en agua. El grupo control recibió este mismo vehículo. Antes de iniciar los tratamientos y a los 7 días del mismo se extrajo sangre por punción lingual bajo anestesia previo ayuno de 16h. De dicha sangre se obtuvo el plasma donde se evaluaron los niveles de colesterol total, c-HDL, c-LDL, c-VLDL, y triglicéridos (TG) por técnicas enzimáticas y espectrofotométricas. Para comprobar si el efecto a nivel de lípidos implicaba una alteración del estrés oxidativo, se evaluó además el estado redox en los plasmas obtenidos mediante la técnica del TEAC (“Trolox Antioxidant Capacity Assay”). Esta técnica, determina la capacidad antioxidante in vitro dando una idea del estado redox de la muestra analizada mediante la capacidad de absorbancia por transferencia de electrones. A los plasmas diluidos 1/10 en PBS (10 µl), se les añadió en una placa de 96 pocillos los diferentes componentes de la reacción, mioglobina, ABTS [ácido 2,2-azino-bis-(3

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etilbenztiazolin-sulfónico)] y peróxido de hidrógeno. Tras 3 minutos de incubación, la absorbancia se midió a 405 nm (con una referencia de 600 nm).

En la Figura 53 se puede apreciar que tanto la simvastatina como el NST0037 fueron capaces de disminuir igualmente los niveles plasmáticos de LDL, hecho directamente relacionado con la inhibición de la actividad HMGR, que lleva a un aumento de expresión de receptores LDL. En este caso, el efecto de NST0037 alcanzó significación estadística. Además, ambos compuestos produjeron un aumento de HDL, lo que implica un efecto cardioprotector. En la Figura 54 se observa como los compuestos disminuyeron los niveles de triglicéridos plasmáticos, lo que indica un efecto hipotrigliceridémico. Además, mientras que en las ratas control se produjo un incremento del estrés oxidativo (Figura 55), determinado por medio del estado redox en plasma mediante TEAC, en las ratas tratadas con simvastatina y NST0037 se produjo una drástica disminución, lo que indica un efecto antioxidante. En este caso, los resultaros fueron estadísticamente significativos solo en el caso de NST0037.

En resumen, el tratamiento con NST0037 durante 7 días mediante administración oral a ratas Zucker genéticamente obesas con hiperlipidemia endógena produjo una disminución de los niveles de c-LDL, de triglicéridos, y del estado redox, lo que demuestra su poder cardioprotector.

Ejemplo 23

Efecto de NST0037 sobre la expresión del gen 24-dehidrocolesterol reductasa (Seladin-1/DHCR24) en ratones salvajes

En base a los resultados presentados en el Ejemplo 9 sobre la inducción del gen seladin-1/DHCR24 en líneas neuronales humanas, los investigadores decidieron analizar si el NST0037 modulaba dicho gen en cerebros de ratones tratados con este compuesto.

Para llevar a cabo este estudio, ratones macho C57BL6 de 3 meses de edad (n=3/grupo) fueron tratados oralmente con 50 mg/kg de simvastatina o NST0037. Un grupo control recibió únicamente el vehículo, y que consistió en carboximetilcelulosa al 0,25 % en suero salino fisiológico. 4 h después de las administraciones orales, los animales fueron sacrificados bajo anestesia gaseosa con isofluorano y los cerebros, previamente perfundidos con PBS, fueron extraídos e inmediatamente después congelados en nitrógeno líquido. Posteriormente, el RNA total del cerebro se extrajo mediante el kit High Pure RNA Isolation (Roche) y la cantidad y calidad del RNA se analizaron mediante espectrofotometría (Infinite 200 con NanoQuant, Tecan) y visualización de las bandas 18S y 28S mediante electroforesis. La RT-PCR se realizó mediante dos pasos, en primer lugar se pasó el mRNA a cDNA usando el RNA to cDNA kit (Applied Biosystem) y posteriormente se analizó la expresión génica mediante sondas TaqMan utilizando las sondas validadas Mn00519071_m1 para seladin-1/DHCR24 y Hs99999901_s1 para 18S (utilizado para normalizar los resultados) en el equipo 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystem). La cantidad relativa de la expresión del gen se determinó utilizando el método ΔΔCt con el software SDS v2.1.1 (Applied Biosystem); la expresión de 18S fue usada para normalizar la medida.

En la Figura 56 se puede observar como tanto la simvastatina como el NST0037 aumentaron la expresión del gen a las 4 h de su administración en igual medida. Estos resultados confirman los datos previos en neuronas humanas donde se observaba un aumento de la expresión de seladin-1 como mecanismo neuroprotector del NST0037. Además, estos resultados confirman el paso de barrera hematoencefálica presentado en ejemplos previos.

En resumen, el tratamiento oral con NST0037 a ratones salvajes produce un aumento del gen neuroprotector seladin-1/DHCR24, lo que confirma además que el compuesto atraviesa la barrera hematoencefálica.

Ejemplo 24

Análisis comparativo en índice de supervivencia de dos compuestos en larvas de pez cebra

24.1. Análisis del índice de supervivencia del compuesto NST0037 en comparación con la simvastatina en larvas de pez cebra. Ensayo de toxicidad aguda.

Para evaluar la bioseguridad del compuesto NST0037 se analizaron sus efectos toxicológicos en el modelo de larva de pez cebra mediante la determinación de los parámetros de seguridad del protocolo C15 de la OECD.

Los huevos fertilizados fueron obtenidos por apareamiento natural del pez cebra (Danio rerio, cepa AB). Un total de 8-10 parejas fueron utilizadas para cada cruce y se generaron un total de 200-250 huevos de media por pareja. Los huevos se recogieron inmediatamente después del desove y fueron lavados con agua de dilución (CaCl2•2H2O2 0,29 g/l, MgSO4•7H2O2 0,12 g/l, NaHCO3 0,065 g/l, KCl 0,006 g/l) ajustándose a pH 7,8 ± 0,2, acorde con el Reglamento CE n.º 440/2008 procedimiento C.1 y depositados en una placa petri.

Los embriones se desarrollaron con normalidad hasta 96 horas post-fertilización en su medio de crecimiento. En dicho momento, las larvas fueron transferidas de las placas petri de crecimiento a las cámaras de exposición (placas microtiter M24) por medio de pipetas y expuestos a las sustancias a testar (NST0037 o simvastatina), con

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5

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17-03-2015

Tabla III

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Tal y como se muestra en la Tabla III, la mortalidad producida por ambos compuestos en este ensayo de toxicidad aguda demuestran sorprendentemente que la simvastatina fue significativamente más tóxica que el compuesto NST0037 (2, p-valor < 0,001), ya que a día 4 post-tratamiento, el 14 % (1/7) de los animales tratados con NST0037 murieron, siendo del 86 % (6/7) el porcentaje de mortalidad observado para el grupo de tratamiento con simvastatina. Según lo observado en este estudio, la LD50 del compuesto NST0037 fue superior a 100 mg/kg después de 4 días de tratamiento continuo con el compuesto. La simvastatina presentó una LD50 de 60,55 mg/kg después de 4 dpt; de nuevo y de manera sorprendente fue más tóxica que el compuesto NST0037, ya que la simvastatina alcanzó la LD50 con menos dosis que NST0037 y en el mismo tiempo.

26. 2. Estudio histopatológico en peces cebra adultos tras ensayo de letalidad por exposición constante en el agua (4 días) de NST0037 en comparación con la simvastatina en pez cebra adulto

En base a los resultados de los estudios anteriores, los inventores decidieron averiguar si existían diferencias en el estudio histopatológico de los diferentes grupos de tratamiento mediante la tinción de las muestras con hematoxilina-eosina, la cual permite discernir marcas patológicas en los órganos o tejidos de los animales a estudio. Para ello, los peces Los peces que sobrevivieron al tratamiento se sacrificaron a 4 días post-tratamiento (previamente anestesiados) y las muestras (pez entero) fueron incluidas en parafina. Posteriormente se realizó la tinción de hematoxilina-eosina para la realización de los estudios histopatológicos, obteniéndose un mínimo de 6 cortes longitudinales por animal, con el objetivo de recoger diferentes zonas de estudio del mismo órgano. Los órganos estudiados fueron los siguientes: cerebro, riñón, páncreas, intestino, ojo, branquias, ovario, testículo, musculo e hígado.

En la Figura 61, se muestran imágenes representativas del estudio histopatológico realizado en los animales tratados. En ella se muestran imágenes representativas del estudio histopatológico realizado. Las únicas dosis que indujeron problemas toxicológicos fueron las de 32 y 100 mg/kg, restringiéndose las alteraciones patológicas a los ovarios. Mientras las hembras control mostraron folículos ováricos normales en diferentes estadios de maduración, las hembras tratadas con 100 mg/kg de ambos compuestos presentaron daño ovárico, observándose una degeneración masiva de los ovocitos secundarios y terciarios, además de alteración estromal. Por otro lado, el grupo de hembras tratadas con 30 mg/kg de simvastatina también presentó daño histopatológico en el ovario, no siendo observado sorprendentemente en el grupo de hembras tratadas con la misma dosis del compuesto NST0037, lo que indica que el compuesto NST0037 es más seguro que la simvastatina en este modelo experimental.

En resumen, el tratamiento con NST0037 a peces cebra adultos durante 4 días a 100 mg/kg presentó una mortalidad residual, la cual fue ampliada en las mismas condiciones con simvastatina. Además, los daños histopatológicos encontrados se restringieron a los ovarios de los animales y se detectaron a las dosis de 32 y 100 mg/kg para la simvastatina, mientras que con NST0037 el daño ovárico solo se detectó a la dosis más alta, lo que demuestra que este último compuesto es más seguro.

Claims (6)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un compuesto de fórmula (I)

   O

   imagen1 imagen2OH

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   H3C

   CH3

   imagen5

   5 su forma hidroxiácida, las sales farmacéuticamente aceptables de dicho hidroxiácido y solvatos farmacéuticamente aceptables del compuesto y de su forma hidroxiácida.
2. 2. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 1 y/o su forma hidroxiácida y/o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho hidroxiácido y/o un solvato farmacéuticamente aceptable del compuesto o de su forma hidroxiácida, y al menos un adyuvante, portador

   10 y/o vehículo farmacéuticamente aceptable.

3. 3.

   Un compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 1, su forma hidroxiácida o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho hidroxiácido y/o un solvato farmacéuticamente aceptable del compuesto o de su forma hidroxiácida para su uso como medicamento.

4. 4.

   Un compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 1, su forma hidroxiácida o una sal farmacéuticamente

   15 aceptable de dicho hidroxiácido y/o un solvato farmacéuticamente aceptable del compuesto o de su forma hidroxiácida para su uso en la prevención y/o el tratamiento de:

   -enfermedades neurodegenerativas,

   -deterioro cognitivo,

   -procesos patológicos asociados a la edad que se refieren a cualquier evento o combinación de eventos

   20 relacionado/s con el envejecimiento que producen pérdida de viabilidad celular del tejido nervioso o sensibilización celular del tejido nervioso, pérdida de la función celular y/o pérdida del número de células; y progeria, o

   -epilepsia, crisis epilépticas y convulsiones.
5. 5. Un compuesto de fórmula (I), su forma hidroxiácida o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho

   25 hidroxiácido y/o un solvato farmacéuticamente aceptable del compuesto o de su forma hidroxiácida según la reivindicación 4, en el que las enfermedades neurodegenerativas son: enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica (ELA) o esclerosis múltiple.
6. 6. Uso de un compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 1, de su forma hidroxiácida, de una sal farmacéuticamente aceptable de dicho hidroxiácido y/o de un solvato farmacéuticamente aceptable del

   30 compuesto o de su forma hidroxiácida en la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de:

   -enfermedades neurodegenerativas,

   -deterioro cognitivo,

   -procesos patológicos asociados a la edad que se refieren a cualquier evento o combinación de eventos

   35 relacionado/s con el envejecimiento que producen pérdida de viabilidad celular del tejido nervioso o sensibilización celular del tejido nervioso, pérdida de la función celular y/o pérdida del número de células; y progeria, o

   -epilepsia, crisis epilépticas y convulsiones.

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