WO2010113983A1 - リポソーム組成物の製造方法 - Google Patents

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WO2010113983A1
WO2010113983A1 PCT/JP2010/055769 JP2010055769W WO2010113983A1 WO 2010113983 A1 WO2010113983 A1 WO 2010113983A1 JP 2010055769 W JP2010055769 W JP 2010055769W WO 2010113983 A1 WO2010113983 A1 WO 2010113983A1
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liposome
cyclodextrin
active compound
phase
composition
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PCT/JP2010/055769
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菊池　寛
健治 兵頭
比呂之 石原
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エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社
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    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a liposome composition.
  • the present invention also relates to a liposome composition and a kit for preparing the liposome composition.
  • Liposomes are fine closed vesicles having an internal phase surrounded by one or more lipid bilayers, and can retain a water-soluble substance in the internal phase and a fat-soluble substance in the lipid bilayer.
  • When encapsulating an active compound in a liposome and delivering it to a target tissue how to encapsulate the active compound in the liposome with high efficiency and how to ensure the retention stability of the active compound by the liposome It becomes an important point.
  • lipid-soluble compounds are encapsulated in liposomes, a high encapsulation rate can be achieved relatively easily.
  • lipid film method vortex method
  • reverse phase evaporation method surfactant removal method
  • freeze-thaw method remote loading method
  • remote loading method pH gradient method, ion gradient method
  • the pH gradient method which is a remote loading method using a pH gradient, is a technique for incorporating a compound into a liposome by utilizing a shift in molecular / ionic dissociation equilibrium depending on the pH of the target compound.
  • An example of a compound encapsulated in liposomes by the pH gradient method is, for example, doxorubicin (DOX, pKa: 8.2). After preparing a liposome solution with a pH 4 buffer, the liposome outer phase is replaced with a pH 7 buffer.
  • DOX When DOX is added to this liposome solution, molecular type DOX becomes fat-soluble in the added pH 7 solution, and therefore migrates to the liposome membrane instead of the aqueous phase. Further, when DOX transferred to the liposome membrane comes into contact with the liposome internal phase at pH 4, it becomes ionic and dissolves in the liposome internal phase. Thus, DOX is transported from the liposome outer phase to the inner phase by the movement of dissociation equilibrium (see Non-Patent Document 1, Non-Patent Document 2, and Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 3 discloses a technique for improving the encapsulation rate of an active compound by adding ethanol together with the active compound to the liposome external phase when performing a pH gradient method on a liposome having a special composition called cholesterol-free liposome.
  • Patent Document 2 discloses a technique for improving the encapsulation rate of an active compound by causing copper ions to be present in the liposome internal phase in addition to the pH gradient.
  • the ammonium sulfate method which is a remote loading method using an ammonium sulfate ion gradient, is a technique for incorporating an active compound into the liposome internal phase using an ion gradient of divalent ammonium sulfate instead of the pH gradient in the pH gradient method (non- (See Patent Document 1 and Patent Document 3.)
  • Patent Document 4 discloses a technique for incorporating an active compound into a liposome by adding a boronic acid together with the active compound to the liposome external phase in addition to an ion gradient by ammonium sulfate.
  • Patent Document 5 discloses that the active compound is incorporated into liposomes by using an ion gradient caused by glucuronic acid anions instead of an ion gradient caused by ammonium sulfate, so that the release rate of the active compound is increased as compared with the case where ammonium sulfate is used. Techniques for improving are disclosed.
  • the remote loading method is an excellent encapsulation method in terms of the encapsulation rate.
  • Doxil DOX's liposomal formulation
  • the active compound tends to leak from the liposome in the plasma when the remote loading method is used.
  • the retention stability of the active compound is low.
  • the active compound is solubilized in advance with cyclodextrin (hereinafter also referred to as “CyD”), and then activated with cyclodextrin by the vortexing method or the like.
  • CyD cyclodextrin
  • a technique for encapsulating a complex of a compound in a liposome has been reported. However, with this method, the encapsulation rate is 5 to 20%, and mass production is very difficult.
  • Non-Patent Document 4 a compound in which salicylic acid and CyD are covalently bonded is used as a model compound, and a lipid film method is employed for encapsulating the compound in liposomes (encapsulation rate is 8%). Less than). It has been suggested that retention stability is increased by forming a complex between the active compound and CyD in the liposome internal phase.
  • betamethasone which is a poorly water-soluble compound, is solubilized in advance using several types of CyD derivatives and encapsulated in liposomes by the lipid film method (encapsulation rate is 3% or less).
  • Non-Patent Document 6 ketoprofen, which is a poorly water-soluble compound, is previously solubilized with HP- ⁇ -cyclodextrin, and various encapsulation methods have been attempted for the obtained complex.
  • MLV multilamellar vesicles
  • SUV small unilamellar vesicles
  • Non-Patent Document 7 discloses that when a complex of prednisolone and CyD is prepared in advance and encapsulated in liposomes by a freeze-thaw method, the permeability of the water-soluble substance to the liposome membrane is increased.
  • Non-patent document 8 discloses that liposomes encapsulating a complex of DOX and ⁇ -cyclodextrin exhibit higher tumor DOX concentration and antitumor effect than liposomes encapsulating only DOX. Also in this document, a complex of DOX and ⁇ -cyclodextrin is formed in advance, and this complex is encapsulated in liposomes. Similarly, Patent Document 6 discloses a technique in which a complex of a water-soluble compound and CyD is formed in advance, and this complex is encapsulated in liposomes, whereby the active compound is released slowly.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a method for producing liposomes having high retention stability of active compounds at a high encapsulation rate.
  • the present inventors surprisingly encapsulated cyclodextrin in the liposome internal phase in advance, so that the active compound added to the liposome external phase moved to the liposome internal phase.
  • the inventors have found that the active compound can be encapsulated in the liposome internal phase with a very high encapsulation rate and that the retention stability of the active compound in the obtained liposome composition is extremely high, thereby completing the present invention.
  • a method for producing a liposome composition comprising: Providing a liposome dispersion containing liposomes and further containing cyclodextrin in the liposome internal phase; Mixing the liposome dispersion with an active compound; Introducing the active compound into the liposome internal phase of the liposome dispersion; Including methods.
  • the liposome dispersion liquid does not substantially contain cyclodextrin in the liposome external phase.
  • Providing the liposome dispersion comprises: Providing a liposome preparatory solution containing liposomes and further containing the cyclodextrin in the liposome internal phase and the liposome external phase; Adjusting the concentration of the cyclodextrin in the external phase of the liposome by substituting or diluting the external phase of the liposome in the liposome preparatory liquid, and the method according to any one of [1] to [3].
  • a liposome composition comprising a liposome and further comprising cyclodextrin and an active compound in the liposome internal phase, wherein the active compound is (8E, 12E, 14E) -7- ⁇ (4-cycloheptylpiperazin-1-yl) carbonyl ⁇ Oxy-3,6,16,21-tetrahydroxy-6,10,12,16,20-pentamethyl-18,19-epoxytricosa-8,12,14-trien-11-orido (E7107), eribulin,
  • a liposomal composition selected from the group consisting of doxorubicin, epirubicin, pirarubicin, daunorubicin, docetaxel and paclitaxel and pharmacologically acceptable salts thereof.
  • the liposome composition according to [9], wherein the active compound is eribulin mesylate.
  • a kit for preparing a liposome composition comprising an active compound in the liposome internal phase, comprising a liposome reagent comprising a liposome and further comprising cyclodextrin in the liposome internal phase.
  • the kit according to [12], wherein the liposome reagent is solid or liquid.
  • the active compound is an antitumor agent.
  • a novel method for producing a liposome composition can be provided.
  • the active compound can be encapsulated in the liposome internal phase with high efficiency by the liposome production method of the present invention.
  • the liposome manufactured by the said method has the high retention stability of an active compound.
  • FIG. 5 shows the retention stability of E7107 in invitro rat plasma (37 ° C).
  • Fig. 2 shows retention stability of eribulin mesylate in invitro rat plasma (37 ° C).
  • Fig. 6 shows the blood retention and tumor migration of E7107 in in vivo WiDr-bearing nude mice.
  • Fig. 6 shows the blood retention and tumor migration of E7107 in in vivo WiDr-bearing nude mice.
  • FIG. 6 shows the antitumor activity of eribulin mesylate by liposomes in nude mice bearing tumors in vivo.
  • FIG. 6 shows the antitumor activity of eribulin mesylate by liposomes in nude mice bearing in vivo Fadu.
  • FIG. 6 shows the antitumor activity of eribulin mesylate by liposomes in nude mice bearing in vivo Fadu.
  • FIG. 5 shows the antitumor activity of eribulin mesylate by liposomes in nude mice bearing in vivo ACHN.
  • Liposome means a microclosed vesicle having an internal phase surrounded by a lipid bilayer.
  • the liposome is a small unilamellar vesicle (SUV), a large unilamellar vesicle (LUV), a larger unilamellar vesicle (GUV), or a concentric circle.
  • Multilamellar vesicles (MLV) having a plurality of membranes, liposomes having a plurality of membranes irregularly (MVV: Multivesicular vesicles) and the like are included.
  • “Liposome internal phase” means an aqueous region surrounded by the lipid bilayer of the liposome, and is used synonymously with “internal aqueous phase” and “intraliposomal aqueous phase”.
  • “Liposome external phase” means a region that is not surrounded by the lipid bilayer of the liposome (ie, a region other than the internal phase and the lipid bilayer) when the liposome is dispersed in a liquid.
  • “Liposome composition” means a composition containing liposomes and further containing cyclodextrin and an active compound in the liposome internal phase.
  • the liposome composition includes solid and liquid forms.
  • “Liposome dispersion” is a composition containing liposomes and further containing cyclodextrin in the liposome internal phase, and the cyclodextrin concentration in the liposome external phase is adjusted, but the active compound is introduced into the liposome internal phase. Refers to the previous composition. The adjustment of the cyclodextrin concentration in the liposome outer phase will be described later.
  • the cyclodextrin concentration in the liposome outer phase is lower than the concentration in the liposome inner phase, or cyclodextrin is substantially contained in the liposome outer phase. Examples of the dispersion are not included.
  • the improvement of the solubility (apparent solubility) of the active compound by cyclodextrin is recognized significantly, it says that cyclodextrin is substantially included and the liposome external phase does not substantially contain cyclodextrin.
  • the cyclodextrin does not contain an amount of cyclodextrin in which significant improvement in the solubility (apparent solubility) of the active compound is observed.
  • the “liposome preparation solution” means a composition containing liposomes and further containing cyclodextrin in the liposome internal phase and the liposome external phase before the cyclodextrin concentration in the liposome external phase is adjusted.
  • the “liposome reagent” means a liposome dispersion when in a liquid state, and a reagent that can be obtained by dissolving or suspending in a predetermined solvent when in a solid state. The solvent will be described later. As will be described later, the solid liposome reagent can be obtained, for example, by drying a liposome dispersion.
  • mixing the solid and the liquid includes dissolving the solid in the liquid and suspending, and the mixing, dissolution, and suspension are used interchangeably.
  • the solvent and the dispersion medium are used interchangeably.
  • the active compound in the present invention is not particularly limited as long as it is a compound that forms a complex with cyclodextrin.
  • the active compound can be selected from compounds used in the fields of pharmaceuticals (including diagnostic agents), cosmetics, foods and the like.
  • the active compound may be a single compound or a combination of two or more compounds.
  • Examples of the active compound include low molecular weight compounds, among which compounds used as antitumor agents, antibacterial agents, anti-inflammatory agents, anti-myocardial infarction agents, and contrast agents are suitable.
  • the active compound preferably has a molecular weight of 100 to 2000, more preferably 200 to 1500, and still more preferably 300 to 1000. Generally in these ranges, the liposome membrane permeability of the active compound is good, and the present invention can be suitably applied.
  • the present invention can be applied to any active compound as long as it contains a water-soluble compound and a fat-soluble compound and is at least somewhat soluble in water or an aqueous solvent. Further, as described later, the present invention utilizes the interaction between the active compound and cyclodextrin, and the solubility (apparent solubility) increases in the presence of cyclodextrin than in the absence of cyclodextrin.
  • the present invention can be applied to any active compound.
  • the entire active compound molecule or a part of the molecule is included in the cyclodextrin cyclic structure (vacancies), so that the active compound solubility (apparent solubility) is It is believed to be higher than the solubility in water or aqueous solvent without cyclodextrin.
  • the pore inner diameter of ⁇ -cyclodextrin is 0.45 to 0.6 nm
  • the pore inner diameter of ⁇ -cyclodextrin is 0.6 to 0.8 nm
  • the pore inner diameter of ⁇ -cyclodextrin is 0.8 to 0.
  • cyclodextrins such as hydroxy- ⁇ -cyclodextrin, hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin, sulfobutyl ether- ⁇ -cyclodextrin are available, and these cyclodextrins also increase the solubility of active compounds. be able to.
  • the increase in the solubility of the active compound is not necessarily due to the inclusion of the cyclodextrin inside the cyclic structure (vacancies), but due to intermolecular interactions with hydroxy groups or sulfobutyl ether groups. It is known to be a thing.
  • the solubility may be increased based on such intermolecular interaction.
  • the antitumor agent is not particularly limited, and for example, irinotecan hydrochloride, nogitecan hydrochloride, exatecan, RFS-2000, Lurutecan, BNP-1350, Bay-383441, PNU-166148, IDEC-132, BN-80915 Camptothecin derivatives such as DB-38, DB-81, DB-90, DB-91, CKD-620, T-0128, ST-1480, ST-1481, DRF-1042, DE-310; Taxane derivatives such as docetaxel, paclitaxel, IND-5109, BMS-184476, BMS-188797, T-3782, TAX-1011, SB-RA-31012, SBT-1514, DJ-927; ifosfamide, nimustine hydrochloride, Ruvocon, cyclophosphamide, dacarbazine, thiotepa, busulfan, melphalan, rani
  • the compound described as a salt may be an arbitrary salt or a free form.
  • the compound described as a free form may be any salt.
  • the active compound is selected from the group consisting of the above compounds or pharmacologically acceptable salts thereof.
  • (8E, 12E, 14E) -7- ⁇ (4-cycloheptylpiperazin-1-yl) Carbonyl ⁇ oxy-3,6,16,21-tetrahydroxy-6,10,12,16,20-pentamethyl-18,19-epoxytricosa-8,12,14-trien-11-olide (E7107), It is selected from the group consisting of eribulin, doxorubicin, epirubicin, pirarubicin, daunorubicin, docetaxel and paclitaxel and pharmacologically acceptable salts thereof.
  • the antibacterial agent is not particularly limited, and examples include amphotericin B, cefotiam-hexesyl, cephalosporin, chloramphenicol, diclofenac and the like.
  • the compound may be any salt.
  • the anti-inflammatory agent is not particularly limited, and examples thereof include prostaglandins (PGE1, PGE2), dexamethasone, hydrocortisone, piroxicam, indomethacin, prednisolone and the like.
  • PGE1, PGE2 prostaglandins
  • dexamethasone hydrocortisone
  • piroxicam indomethacin
  • prednisolone prednisolone and the like.
  • the compound may be any salt.
  • the anti-myocardial infarction agent is not particularly limited, and examples thereof include adenosine, atenolol, pilcainide and the like.
  • the compound may be any salt.
  • the contrast agent is not particularly limited, and examples thereof include iopamidol, ioxaglic acid, iohexol, and iomeprol.
  • the compound may be any salt.
  • Cyclodextrin In the present invention, the cyclodextrin is not particularly limited as long as it forms a complex with the active compound. Cyclodextrins are those in which a plurality of glucose units are cyclically ⁇ - (1,4) -bonded and may have various substituents. Cyclodextrins composed of 6 to 8 glucose units (referred to as ⁇ , ⁇ , and ⁇ -cyclodextrin, respectively) and derivatives thereof are stable and preferable.
  • Cyclodextrin can be appropriately selected depending on the active compound and the like. Specifically, it is preferable that the solubility of cyclodextrin itself in water is high. This makes it easier to encapsulate more cyclodextrin in the liposome internal phase. More specifically, the cyclodextrin preferably has a water solubility of 10 mg / mL or more, more preferably 50 mg / mL or more, and even more preferably 100 mg / mL or more. Cyclodextrins are preferably those having a large association constant with the active compound. For example, a higher association constant can be obtained by selecting the number of glucose units in the cyclodextrin according to the size of the active compound.
  • association constant depends on pH
  • the association constant between the active compound and cyclodextrin is preferably 100 or more, and more preferably 1000 or more.
  • a preferred cyclodextrin can be selected in accordance with the safety of the cyclodextrin itself and the actual use.
  • cyclodextrin for example, ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin, hexakis (2,3,6-tri-O-acetyl) - ⁇ -cyclodextrin, heptakis (2, 3,6-tri-O-acetyl) - ⁇ -cyclodextrin, octakis (2,3,6-tri-O-acetyl) - ⁇ -cyclodextrin, acetylated ⁇ -cyclodextrin, acetylated ⁇ -cyclodextrin, Acetylated ⁇ -cyclodextrin, Acetylated ⁇ -cyclodextrin, hexakis (2,3,6-tri-O-methyl) - ⁇ -cyclodextrin, heptakis (2,3,6-tri-O-methyl) - ⁇ -cyclodextrin, octakis (2
  • the cyclodextrin may be one or a combination of two or more of these. Of these, highly water-soluble cyclodextrins are preferable, and ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin, HP- ⁇ -cyclodextrin, HP- ⁇ -cyclodextrin, HP- ⁇ -cyclodextrin, G2 are more preferable. - ⁇ -cyclodextrin and SBE- ⁇ -cyclodextrin, more preferably ⁇ -cyclodextrin, HP- ⁇ -cyclodextrin and SBE- ⁇ -cyclodextrin.
  • the liposome of the present invention preferably contains a phospholipid and / or a phospholipid derivative as a membrane constituent.
  • phospholipids and phospholipid derivatives include phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol, cardiolipin, sphingomyelin, ceramide phosphorylethanolamine, ceramide phosphorylglycerol, ceramide phosphorylglycerol phosphate, 1,2- Examples include dimyristoyl-1,2-deoxyphosphatidylcholine, plasmalogen, and phosphatidic acid.
  • a phospholipid and a phospholipid derivative may be one or a combination of two or more thereof.
  • Fatty acid residues in phospholipids and phospholipid derivatives are not particularly limited, and examples thereof include saturated or unsaturated fatty acid residues having 12 to 20 carbon atoms. Specific examples include lauric acid, myristic acid, and palmitic acid. Examples include acyl groups derived from fatty acids such as acids, stearic acid, oleic acid, and linoleic acid.
  • phospholipids derived from natural products such as egg yolk lecithin and soybean lecithin, and partially hydrogenated egg yolk lecithin partially or completely hydrogenated to unsaturated fatty acid residues, (fully) hydrogenated egg yolk lecithin, partially hydrogenated soybean Lecithin, (completely) hydrogenated soybean lecithin, etc. can also be used.
  • the blending amount (molar fraction) of the phospholipid and / or phospholipid derivative used in preparing the liposome is not particularly limited, but is preferably 10 to 80%, more preferably 30 to 60%, based on the entire liposome membrane component. preferable.
  • the liposome of the present invention contains sterols such as cholesterol and cholestanol as a membrane stabilizer, and a saturated or unsaturated acyl group having 8 to 22 carbon atoms, as a membrane constituent. It may also contain an antioxidant such as fatty acids and ⁇ -tocopherol.
  • the blending amount (molar fraction) of these sterols used in preparing the liposome is not particularly limited, but is preferably 1 to 60%, more preferably 10 to 50%, more preferably 30 to 50% is more preferable.
  • the blending amount (molar fraction) of the fatty acids is not particularly limited, but is preferably 0 to 30%, more preferably 0 to 20%, still more preferably 0 to 10% with respect to the entire liposome membrane component.
  • the blending amount (molar fraction) of the antioxidant is sufficient if it is added in such an amount that an antioxidant effect is obtained, but it is preferably 0 to 15%, more preferably 0 to 10% of the total liposome membrane component, 0 More preferably, it is ⁇ 5%.
  • the liposome of the present invention may contain a functional lipid or a modified lipid as a membrane constituent component.
  • functional lipids include blood retention lipid derivatives, temperature change sensitive lipid derivatives, pH sensitive lipid derivatives, and the like.
  • modified lipids include PEGylated lipids, glycolipids, antibody-modified lipids, and peptide-modified lipids.
  • blood-retaining lipid derivatives examples include glycophorin, ganglioside GM1, ganglioside GM3, glucuronic acid derivatives, glutamic acid derivatives, polyglycerin phospholipid derivatives, and a condensate of phosphoethanolamine and methoxypolyethylene glycol, N- ⁇ Carbonyl-methoxypolyethyleneglycol-2000 ⁇ -1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, N- ⁇ carbonyl-methoxypolyethyleneglycol-5000 ⁇ -1,2-dipalmitoyl-sn-glycero- 3-phosphoethanolamine, N- ⁇ carbonyl-methoxypolyethylene glycol-750 ⁇ -1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, N- ⁇ carbonyl-methoxypoly Tylene glycol-2000 ⁇ -1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (MPEG
  • temperature change sensitive lipid derivatives examples include dipalmitoyl phosphatidylcholine and the like.
  • the liposome can be disintegrated at a specific temperature, or the surface characteristics of the liposome can be changed. Furthermore, by combining with heating of a target site such as a tumor, the liposome can be disintegrated at the target site, and the active compound can be released to the target site.
  • pH-sensitive lipid derivatives examples include dioleoylphosphatidylethanolamine and the like. Liposomes containing pH-sensitive lipid derivatives can facilitate membrane fusion between liposomes and endosomes when liposomes are taken into cells by endocytosis, improving the delivery of active compounds to the cytoplasm, etc. .
  • glycolipid, antibody-modified lipid and peptide-modified lipid examples include lipids bound with a sugar, antibody or peptide having affinity for a target cell or target tissue.
  • modified lipids liposomes can be actively delivered to target cells or tissues.
  • the compounding amount (molar fraction) of the functional lipid or modified lipid used in preparing the liposome is not particularly limited, but is preferably 0 to 50%, more preferably 0 to 30% of the total liposome membrane component lipid, 0 to 20% is more preferable.
  • liposomes are microclosed vesicles having an internal phase surrounded by a lipid bilayer.
  • the liposome has a barrier function in which a cyclodextrin does not leak from the liposome internal phase to the external phase after substitution or dilution of the external phase of the liposome preparation solution, and b) the active compound is added to the liposome.
  • the active compound is permeated, and the cyclodextrin has a membrane permeability that simultaneously has a barrier ability that does not leak into the outer phase.
  • both the active compound and cyclodextrin complex also referred to as “active compound / cyclodextrin complex”
  • active compound / cyclodextrin complex both in the liposome outer phase
  • free active compound and cyclodextrin both in the liposome outer phase
  • the liposome is preferably stable in vivo, and the liposome is active compound / cyclodextrin complex in blood when administered to a living body and free active compound if temporarily present. Both of these and cyclodextrins preferably have a barrier ability that does not leak into the liposome external phase.
  • composition of the membrane constituents for liposomes having such membrane permeability at a practical level can be obtained by those skilled in the art by referring to the examples described later as necessary, such as active compounds, cyclodextrins, It can be set as appropriate according to the target tissue etc. (Hiroshi Kikuchi et al., “Liposome I—Preparation Method and Assay Method”, Cell Engineering, (1983), 2 (9): pp.1136-1149 and the literature) (Refer to cited documents etc.).
  • the substance permeability of the liposome membrane depends greatly on the molecular weight of the substance, and it is generally considered that the permeability changes greatly with a molecular weight of around 1000 as a boundary.
  • ⁇ -cyclodextrin the smallest cyclodextrin among the stable cyclodextrins, has a molecular weight of 973
  • ⁇ -cyclodextrin has a molecular weight of 1135
  • ⁇ -cyclodextrin has a molecular weight of 1297
  • the molecular weight of cyclodextrin (HP- ⁇ -cyclodextrin) is 1380 to 1480
  • cyclodextrin has low liposome membrane permeability.
  • an active compound can permeate
  • the active compound enters the liposome internal phase, it forms a complex with cyclodextrin (generally having a molecular weight greatly exceeding 1000), and the liposome membrane permeability becomes extremely low.
  • cyclodextrin is not only limited in its own low liposomal membrane permeability, but also forms a complex with the active compound, thereby improving the solubility of cyclodextrin ( Increasing the apparent solubility) and, further, forming a complex with the active compound, has the property of reducing the liposome membrane permeability of the active compound. Ideal properties for retention.
  • the active compound or the active compound / cyclodextrin complex is released from the liposome after the liposome reaches the target tissue, cell or organelle.
  • Liposomes generally have biodegradable membrane constituents themselves, and are eventually degraded in a target tissue or the like. This is believed to release the encapsulated active compound / cyclodextrin complex (and free active compound, if present). More ultimately, the active compound / cyclodextrin complex is believed to release free active compound by dilution effect, chemical equilibrium or enzymatic degradation of cyclodextrin.
  • the liposome itself may be taken up by the cell.
  • the liposome composition can be used not only for targeting to target tissues such as solid cancers but also for delivery of active compounds to blood cancers, etc., and can be used in slow release formulations and release in blood. It can also be used as a controlled release formulation.
  • the particle diameter of the liposome can be set according to the purpose.
  • the liposome particle size is preferably 30 to 400 nm, more preferably 50 to 200 nm. It is.
  • the particle size of the liposome is preferably 30 to 1000 nm, more preferably 100 to 400 nm.
  • the particle diameter of the liposome can be several microns.
  • the particle diameter of the liposome means a weight average particle diameter by a dynamic light scattering method (quasi-elastic light scattering method).
  • a dynamic light scattering measuring instrument for example, Zetasizer Nano ZS model manufactured by Malvern Instruments Ltd or ELS-8000 manufactured by Otsuka Electronics Co., Ltd.
  • the instrument measures the Brownian motion of the particles and determines the particle size based on established dynamic light scattering theory.
  • the liposome internal phase solvent is not particularly limited.
  • a buffer solution such as a phosphate buffer solution, a citrate buffer solution, and a phosphate buffered saline solution, a physiological saline solution, and a cell culture solution.
  • a culture medium etc. can be mentioned.
  • the concentration of the buffering agent is preferably 5 to 300 mM, more preferably 10 to 100 mM.
  • the pH of the liposome internal phase is not particularly limited, but is preferably 3 to 11, and more preferably 4 to 9.
  • a liposome composition comprises liposomes and further comprises cyclodextrin and an active compound in the liposome internal phase.
  • the liposome composition includes a solid form and a liquid form.
  • the liposome composition is solid, it can be made liquid by dissolving or suspending in a predetermined solvent as described later.
  • the liposome composition is a frozen solid, it can be made into a liquid form by thawing by standing at room temperature or the like.
  • the concentration of the liposome and the concentration of the active compound in the liposome composition can be appropriately set according to the purpose, dosage form, etc. of the liposome composition.
  • the concentration of the liposome can be 0.2 to 100 mM, preferably 1 to 30 mM, as the concentration of the total lipid that is a constituent of the liposome.
  • concentration (dose) of the active compound when the liposome composition is used as a pharmaceutical will be described later.
  • the amount of cyclodextrin in the liposome composition is preferably 0.1 to 1000 molar equivalents, more preferably 1 to 100 molar equivalents, relative to the active compound.
  • the active compound and cyclodextrin may be distributed in the lipid bilayer.
  • the solvent (dispersion medium) of the liposome composition when the liposome composition is a liquid preparation is not particularly limited, and examples thereof include a phosphate buffer solution, a citrate buffer solution, and a phosphate buffered physiological saline solution. Buffer solution, physiological saline, medium for cell culture, and the like.
  • the pH of the liposome external phase in the liposome composition is not particularly limited, but is preferably 3 to 11, and more preferably 4 to 9.
  • the liposome composition further includes monosaccharides such as glucose, galactose, mannose, fructose, inositol, ribose and xylose, disaccharides such as lactose, sucrose, cellobiose, trehalose and maltose, trisaccharides such as raffinose and melezitose, cyclo Polysaccharides such as dextrin, sugars such as sugar alcohols such as erythritol, xylitol, sorbitol, mannitol, maltitol, glycerin, diglycerin, polyglycerin, propylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol, diethylene glycol, triethylene glycol, polyethylene glycol , Polyhydric alcohols such as ethylene glycol monoalkyl ether, diethylene glycol monoalkyl ether, 1,3-butylene glycol It may be added.
  • a combination of sugar and alcohol may be used.
  • the concentration of the sugar or polyhydric alcohol contained in the liposome composition is not particularly limited, but in the state where the liposome is dispersed in a solvent, for example, the concentration of sugar is preferably 2 to 20% (W / V), and 5 to 10 % (W / V) is more preferable.
  • the concentration of the polyhydric alcohol is preferably 1 to 5% (W / V), more preferably 2 to 2.5% (W / V).
  • These solvents can also be used as the liposome external phase in the liposome dispersion, and the liposome external phase solution can be made into these solutions by substituting or diluting the liposome external phase of the liposome preparation liquid with these solvents.
  • Solid preparations of liposome compositions include, for example, glucose, galactose, mannose, fructose, inositol, ribose, xylose sugar monosaccharides, lactose, sucrose, cellobiose, trehalose, maltose, etc., disaccharides, raffinose, merezinose, etc.
  • sugars such as cyclodextrin and other polysaccharides, sugar alcohols such as erythritol, xylitol, sorbitol, mannitol, maltitol, etc., more preferably glucose, lactose, sucrose, trehalose, sorbitol More preferably, it is a combination of lactose, sucrose, and trehalose.
  • solid preparations are glycerin, diglycerin, polyglycerin, propylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol, diethylene glycol, triethylene glycol, polyethylene glycol, ethylene glycol monoalkyl ether, diethylene glycol monoalkyl ether, 1
  • a polyhydric alcohol aqueous solution
  • the polyhydric alcohol (aqueous solution) is more preferably glycerin, propylene glycol, or polyethylene glycol, and more preferably glycerin or propylene glycol.
  • a method for producing a liposome composition comprises the steps of: providing a liposome dispersion containing liposomes and further containing cyclodextrin in the liposome internal phase; mixing the liposome dispersion with an active compound; and liposomes in the liposome dispersion Introducing the active compound into the internal phase.
  • the step of providing the liposome dispersion includes a step of providing a liposome preparation and a step of adjusting the concentration of the cyclodextrin in the liposome external phase by substituting or diluting the liposome external phase of the liposome preparation.
  • the liposome preparation liquid can be prepared by preparing liposomes in a cyclodextrin solution.
  • the cyclodextrin solution is not particularly limited as long as it is a solution containing the cyclodextrin.
  • the concentration of cyclodextrin in the cyclodextrin solution is preferably as high as possible, and can be set according to the solubility of the cyclodextrin in a solvent (described later), the viscosity, and the like. As a result, the cyclodextrin concentration in the liposome internal phase of the liposome dispersion can be increased, and more active compounds can be encapsulated.
  • the concentration of cyclodextrin in the cyclodextrin solution can be 100 to 250 mM, preferably 100 to 200 mM.
  • the solvent for the cyclodextrin solution include a buffer solution such as a phosphate buffer solution, a citrate buffer solution, and a phosphate buffered saline solution, a physiological saline solution, a cell culture medium, and the like.
  • the pH of the cyclodextrin solution can be appropriately set and is not particularly limited, but is preferably 3 to 11, more preferably 4 to 9, and still more preferably 5 to 8.
  • the cyclodextrin solution can be obtained by mixing and dissolving cyclodextrin in the solvent. If necessary, the cyclodextrin solution can be obtained more rapidly by heating and dissolving the solvent at about 50 ° C., for example.
  • Liposomes were prepared by the lipid film method (vortex method), reverse phase evaporation method, ultrasonic method, pre-vessel method, ethanol injection method, French Press method, cholic acid removal method, Triton X-100 batch method, Ca 2+ fusion method , Ether injection method, annealing method, freeze-thaw fusion method and the like.
  • Various conditions (the amount of membrane constituents, temperature, etc.) in the preparation of liposomes can be appropriately set according to the preparation method of the liposome, the composition of the target liposome, the particle size, etc. (supra, Kikuchi (1983), etc.) reference).
  • cyclodextrins are known to have an effect of removing lipids (particularly cholesterol) from liposomes. For this reason, in consideration of this effect, it is preferable to set the amount of lipid used for preparing the liposome.
  • the particle size of the liposome can be adjusted arbitrarily.
  • the particle diameter can be adjusted, for example, by performing extrusion (extrusion filtration) under a high pressure using a membrane filter having a uniform pore diameter.
  • the particle diameter can be adjusted at any timing in the production of the liposome composition of the present invention. For example, before adjusting the liposome external phase in the liposome preparation liquid, after adjusting the liposome external phase in the liposome preparation liquid, or activity This can be done after introducing the compound into the liposome internal phase.
  • the particle size is preferably adjusted before introducing the active compound into the liposome internal phase, more preferably before adjusting the liposome external phase in the liposome preparation liquid.
  • a liposome dispersion can be obtained by adjusting the concentration of the cyclodextrin in the liposome external phase by substituting or diluting the liposome external phase of the obtained liposome preparation liquid.
  • the substitution or dilution of the liposome external phase may be performed once, or may be performed a plurality of times by combining various substitution or dilution methods.
  • Examples of a method for replacing the liposome external phase of the liposome preparation liquid include dialysis, centrifugation, and gel filtration.
  • Dialysis can be performed using, for example, a dialysis membrane.
  • the dialysis membrane include a membrane fractionated by molecular weight such as a cellulose tube and Spectrapore. Centrifugation can be performed, for example, at a centrifugal acceleration of preferably 100,000 g or more, more preferably 300,000 g or more. By substituting the liposome outer phase by centrifugation, the liposome can be concentrated together with the replacement of the liposome outer phase. Gel filtration can be implemented by fractionating based on molecular weight using columns, such as Sephadex and Sepharose, for example.
  • Examples of the method for diluting the liposome external phase of the liposome preparation liquid include a method of adding a solution not containing cyclodextrin to the liposome external phase.
  • Examples of the solvent (dispersion medium) used when substituting and / or diluting the liposome external phase include, for example, phosphate buffer, citrate buffer, phosphate buffered physiological saline buffer, physiological saline, Examples thereof include a medium for cell culture.
  • the pH of the solvent is not particularly limited, but is preferably 3 to 11, more preferably 4 to 10, and further preferably 5 to 10.
  • a pH gradient can also be used to introduce the active compound into the liposome internal phase.
  • the pH of the solvent can be set so that the liposome outer phase has a target pH.
  • the obtained liposome dispersion does not substantially contain cyclodextrin in the liposome external phase.
  • an active compound can be more effectively introduced into the liposome internal phase.
  • the active compound can be introduced into the liposome internal phase even if the liposome dispersion contains cyclodextrin in the liposome external phase, such as when cyclodextrin is added to the liposome external phase of the liposome dispersion for some reason.
  • the liposome dispersion preferably contains a higher concentration of cyclodextrin in the liposome internal phase than the liposome outer phase.
  • the cyclodextrin concentration in the liposome outer phase is preferably 1 ⁇ 2 or less, more preferably 1/5 or less, compared to the cyclodextrin concentration in the liposome inner phase.
  • a pH gradient can be used to introduce the active compound into the liposome internal phase as necessary.
  • the difference in pH between the liposome internal phase and the liposome external phase in the liposome dispersion is preferably 1 to 5, more preferably 2 to 3.
  • the pH of either the liposome internal phase or the external phase can be increased.
  • the pH of the liposome external phase and the liposome internal phase may be substantially the same.
  • the pH gradient can be adjusted by using a conventionally known compound used in the pH gradient method.
  • amino acids such as arginine, histidine, and glycine, ascorbic acid, benzoic acid, citric acid, glutamic acid, phosphoric acid, acetic acid, propionic acid , Tartaric acid, carbonic acid, lactic acid, boric acid, maleic acid, fumaric acid, malic acid, adipic acid, hydrochloric acid, sulfuric acid and other acids, sodium salts, potassium salts, ammonium salts, trishydroxymethylaminomethane, Examples include alkaline compounds such as aqueous ammonia, sodium hydroxide, and potassium hydroxide.
  • an ion gradient such as ammonium sulfate can be used for introducing the active compound into the liposome internal phase.
  • the difference in the ion concentration between the liposome internal phase and the liposome external phase in the liposome dispersion is preferably as large as possible, but is preferably 10 mM or more, more preferably 20 mM or more, and even more preferably 50 mM or more.
  • the ions used in the ion gradient method are not particularly limited, and examples include ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium borate, ammonium formate, ammonium acetate, ammonium citrate, ammonium tartrate, ammonium succinate, and ammonium phosphate.
  • the ion concentration of the liposome internal phase can be appropriately selected according to the type of the active compound, but the higher the better, preferably 10 mM or more, more preferably 20 mM or more, and even more preferably 50 mM or more. .
  • the ion concentration of either the liposome internal phase or the external phase can be increased.
  • the ion concentration between the liposome external phase and the liposome internal phase may be substantially the same.
  • the ion gradient can also be adjusted by replacing or diluting the liposome external phase.
  • the lipid concentration of the liposome in the liposome dispersion is preferably 1 to 100 mM, and more preferably 1 to 50 mM. Within these ranges, more liposome particles can be suitably formed without impairing the physical properties of the liposome dispersion.
  • a liposome composition can be obtained by mixing the resulting liposome dispersion and the active compound and introducing the active compound into the liposome internal phase of the liposome dispersion.
  • the step of introducing preferably includes the step of increasing the membrane permeability of the liposome in the mixture of the liposome dispersion and the active compound. Thereby, encapsulation of the active compound in the liposome can be performed in a shorter time. However, after mixing the liposome dispersion and the active compound, the active compound can be encapsulated in the liposome over a long period of time without any particular operation for increasing the membrane permeability of the liposome.
  • a compound dissolved in a solvent or a solid compound can be used as the active compound depending on the physical properties of the active compound.
  • the solvent is not particularly limited, and for example, the same solvent as the liposome external phase in the liposome dispersion can be used. It is also possible to add a solution of the active compound and mix the active compound with the liposome dispersion.
  • the amount of the active compound to be mixed is preferably 0.001 to 10 molar equivalents, more preferably 0.01 to 1 molar equivalents relative to the cyclodextrin in the liposome dispersion.
  • Examples of a method for increasing the membrane permeability of the liposome in the obtained mixed solution include a method of heating the mixed solution and a method of adding a membrane fluidizing agent to the mixed solution.
  • the active compound can be more efficiently introduced into the liposome internal phase by raising the temperature to a higher temperature.
  • the temperature for raising the temperature is preferably equal to or higher than the phase transition temperature of the lipid bilayer membrane of the liposome.
  • the temperature to be raised is not particularly limited, but is preferably 5 ° C. or higher, for example, room temperature, for example 20 ° C. or higher. More preferred.
  • these temperature raising temperatures do not limit the present invention.
  • the “phase transition temperature” of the lipid bilayer membrane of the liposome means the endothermic start temperature (temperature when the endothermic reaction starts) in the differential thermal analysis in the elevated temperature state.
  • Differential thermal analysis is a technique that can analyze the thermal characteristics of a sample by measuring the temperature difference between the sample and the reference material as a function of time or temperature while changing the temperature of the sample and the reference material.
  • differential thermal analysis is performed on the membrane constituent components of the liposome, fluidization of the liposome membrane component occurs as the temperature rises, and an endothermic reaction is observed.
  • the temperature range where the endothermic reaction is observed varies greatly depending on the membrane components of the liposome.
  • the temperature range where the endothermic reaction is observed is very narrow, and the endothermic reaction is often observed within a range of ⁇ 1 ° C with respect to the endothermic peak temperature.
  • the temperature range in which the endothermic reaction is observed tends to be widened.
  • the temperature may be observed within a range of ⁇ 5 ° C. (that is, a broad peak is observed).
  • the membrane fluidity of the liposome is increased and the membrane permeability of the active compound is increased by raising the temperature to a temperature higher than the phase transition temperature of the lipid bilayer membrane of the liposome.
  • the temperature range is from the phase transition temperature of the lipid bilayer of the liposome to the phase transition temperature + 20 ° C.
  • a temperature range of the phase transition temperature + 10 ° C. is more preferable, and a temperature range of the phase transition temperature + 5 ° C. to the phase transition temperature + 10 ° C. is more preferable.
  • the temperature for raising the temperature is usually 20 to 100 ° C., preferably 40 to 80 ° C., more preferably 45 to 65 ° C., and preferably higher than the phase transition temperature.
  • the temperature rising temperature is generally 40 to 60 ° C., although it depends on the composition. Preferably, it is 45 to 50 ° C.
  • the temperature rise temperature is generally 50 to 70, depending on the composition. ° C is preferred, and 55 to 65 ° C is more preferred.
  • these temperature raising temperatures do not limit the present invention.
  • the time for maintaining the temperature above the phase transition temperature is not particularly limited, and can be appropriately set within a range of, for example, several seconds to 30 minutes. In consideration of mechanical stability and efficient mass production, it is desirable to process in a short time. That is, the temperature rising maintenance time is preferably 1 minute to 30 minutes, and more preferably 2 minutes to 5 minutes. However, these temperature maintaining times do not limit the present invention.
  • the membrane permeability of the liposome can also be increased by adding a membrane fluidizing agent to the resulting mixture (that is, adding it to the outer phase side of the liposome).
  • membrane fluidizing agents include organic solvents soluble in aqueous solvents, surfactants, enzymes, and the like. More specifically, examples of the organic solvent include monohydric alcohols such as ethyl alcohol and benzyl alcohol, polyhydric alcohols such as glycerin and propylene glycol, and aprotic polar solvents such as dimethyl sulfoxide (DMSO). be able to.
  • Surfactants include anionic surfactants such as fatty acid sodium, monoalkyl sulfates, monoalkyl phosphates, cationic surfactants such as alkyltrimethylammonium salts, and amphoteric surfactants such as alkyldimethylamine oxide. And nonionic surfactants such as polyoxyethylene alkyl ether, alkyl monoglyceryl ether, and fatty acid sorbitan ester. Examples of the enzyme include cholinesterase and cholesterol oxidase.
  • the person skilled in the art considers the degree of efficiency of encapsulation of the active compound by adding a membrane fluidizing agent, the stability of the liposome, etc., depending on the composition of the liposome membrane constituent, the membrane fluidizing agent, etc.
  • the amount of the membrane fluidizing agent can be set.
  • the active compound added to the liposome external phase automatically moves to the liposome internal phase by the following mechanism. It is conceivable that. That is, for an active compound, if the solubility in the liposome inner phase is higher than the solubility in the liposome outer phase, that is, the liposome inner phase is energetically more stable than the liposome outer phase, the active compound that can permeate the liposome membrane is It is thought that it permeates the liposome membrane against the concentration gradient of the active compound and moves from the liposome external phase to the liposome internal phase.
  • cyclodextrin is known to have an effect of removing lipids (particularly cholesterol) from biological membranes and liposome membranes. For example, it has been reported that erythrocytes are hemolyzed by cyclodextrin. . For this reason, it is considered that the idea of encapsulating cyclodextrin in the liposome internal phase in advance was difficult when preparing the liposome.
  • the method for producing a liposome composition of the present invention further comprises, after the introducing step, a step of adjusting the liposome external phase of the obtained liposome composition and / or a step of drying the obtained liposome composition. Can do.
  • the liquid liposome composition obtained by the introducing step can be used as it is as the final liposome composition, or in the obtained liquid liposome composition
  • the final liposome composition can be obtained by adjusting (substitution, etc.) the liposome external phase.
  • the adjustment of the liposome outer phase at this time can be performed in the same manner as the adjustment of the liposome outer phase in the liposome preparation liquid.
  • the liposome composition is a liquid, it can be used as it is.
  • the liquid liposome composition obtained in the introducing step can be dried to obtain a final solid liposome composition.
  • the method for drying the liposome composition include freeze drying and spray drying.
  • the liposome composition can be used as a solution by dissolving or suspending in a suitable solvent.
  • the solvent can be appropriately set according to the purpose of use of the liposome composition.
  • the solvent is preferably sterile distilled water.
  • the liposome composition When used as a medicine, such a preparation can be performed by a doctor or patient by injecting a solvent into, for example, a vial in which a solid preparation is sealed.
  • a solid preparation in which a liquid liposome composition is frozen it can be stored in a frozen state and used as a liquid preparation by allowing it to stand at room temperature at the time of use or to return to a liquid state by rapid melting by heating. .
  • the liposome composition of the present invention can be used as a pharmaceutical composition such as a therapeutic agent and a diagnostic agent in the pharmaceutical field.
  • the liposome composition can be used as a therapeutic agent by using an antitumor agent as an active compound, for example, and can be used as a diagnostic agent by using a contrast agent.
  • the liposome composition can also be used as a cosmetic or food additive.
  • the liposome composition of the present invention can be administered by injection (intravenous injection, intraarterial injection, topical injection), oral, nasal, transdermal, pulmonary, eye drops, In particular, in addition to intravenous injection, subcutaneous injection, intradermal injection, intraarterial injection, injection such as local injection to a target cell or organ is preferable.
  • injection intravenous injection, intraarterial injection, topical injection
  • subcutaneous injection, intradermal injection, intraarterial injection injection such as local injection to a target cell or organ is preferable.
  • Examples of the dosage form of the liposome composition for oral administration include tablets, powders, granules, syrups, capsules, and liquids for internal use.
  • Examples of the dosage form of the liposome composition for parenteral administration include injections, drops, eye drops, ointments, suppositories, suspensions, poultices, lotions, aerosols and plasters. In particular, injections and infusions are preferred.
  • the dosage of the pharmaceutical composition varies considerably depending on the type of the target disease, the type of active compound, the patient's age, sex, weight, symptom level, etc., but is usually about 0.1 to 2000 mg per day for an adult, depending on the case. Preferably, 1 to 100 mg can be administered once to several times a day.
  • the cosmetic forms include, for example, lotions, creams, lotions, emulsions, foams, foundations, lipsticks, packs, skin cleansers, shampoos, rinses, conditioners, A hair tonic, a hair liquid, a hair cream, etc. can be mentioned.
  • kits According to the present invention, a kit for preparing a liposome composition is provided.
  • the kit can be used to prepare a liposome composition as a medicine, and can be used by a doctor or patient in a clinical setting.
  • the kit contains a liposome reagent.
  • the liposome reagent may be either solid or liquid.
  • the liposome dispersion can be used as a liposome reagent.
  • the liposome reagent is a reagent that can be obtained by dissolving or suspending in a suitable solvent, and the liposome reagent can be obtained by drying the liposome dispersion. Obtainable. Drying can be performed in the same manner as the above liposome composition.
  • the liposome reagent when used the kit, when the liposome reagent is in a solid state, the liposome reagent is dissolved or suspended in an appropriate solvent to obtain a liposome dispersion.
  • the solvent at this time is the same as the liposome external phase in the liposome dispersion.
  • the kit of the present invention preferably further contains an active compound.
  • the active compound may be either solid or liquid (dissolved or suspended in a solvent).
  • the active compound when the active compound is in a solid state, the active compound is preferably dissolved or suspended in a suitable solvent to form a liquid.
  • the solvent can be appropriately set according to the physical properties of the active compound, and can be the same as the liposome external phase in the liposome dispersion, for example.
  • the liposome reagent and the active compound may be packaged separately, or the liposome reagent and the active compound may be in a solid state and mixed.
  • the kit is a solution of the liposome dispersion and the active compound in the method for producing a liposome composition, except that the liposome dispersion is dissolved or suspended as described above. It can be used by performing the same steps as mixing and introducing the active compound into the liposome internal phase of the liposome dispersion. Thereby, the liposome composition in which the active compound is introduced into the liposome internal phase of the liposome reagent can be produced.
  • the liposome reagent and the active compound are each solid and packaged together, the mixture of the liposome reagent and the active compound is dissolved or suspended in a suitable solvent.
  • the solvent at this time is the same as the liposome external phase in the liposome dispersion.
  • the liposome dispersion liquid and the active compound can be mixed, and then the other steps in the introduction of the active compound into the liposome internal phase of the liposome dispersion liquid in the method for producing the liposome composition are performed.
  • Example 1 ⁇ Preparation of aqueous solution for liposome internal phase> Citric acid monohydrate (840.6 mg) was dissolved in pure water and made up to 20 mL to prepare a 200 mM citric acid aqueous solution.
  • HP- ⁇ -cyclodextrin manufactured by ROQUETTE 280 mg or 560 mg is dissolved in 1 mL of 200 mM aqueous citric acid solution, adjusted to pH 5.5 with aqueous ammonia, and then made up to 2 mL with pure water to make it inside the liposome.
  • a phase aqueous solution was prepared.
  • aqueous solution for liposome internal phase not containing HP- ⁇ -cyclodextrin was prepared by adjusting 1 mL of 200 mM aqueous citric acid solution to pH 5.5 with aqueous ammonia and then measuring up to 2 mL with pure water (Table 1).
  • ⁇ Preparation of liposome preparation solution Hydrogenated soybean phosphatidylcholine (manufactured by Lipoid) 44.4 mg, cholesterol (manufactured by Sigma) 14.5 mg and polyethylene glycol 2000-phosphatidylethanolamine (Genzyme, MPEG2000-distearoylphosphatidylethanolamine) 17.4 mg were added to 3 mL of chloroform. After dissolution, chloroform was distilled off under reduced pressure using a rotary evaporator to prepare a lipid film. To the obtained lipid film, 2 mL of aqueous solution for liposome inner phase having various compositions described in Table 1 below was added at about 60 ° C. and stirred to prepare a liposome preparation solution.
  • the liposome preparation solution was sonicated for 20 minutes, and then sized using an extruder (manufactured by Lipex Biomembranes) heated to about 65 ° C. to obtain a sized liposome preparation solution.
  • an extruder manufactured by Lipex Biomembranes
  • the particle size of the liposome in the obtained liposome preparatory solution was measured by a dynamic light scattering method, all were 90 to 100 nm.
  • E7107 ((8E, 12E, 14E) -7- ⁇ (4-cycloheptylpiperazin-1-yl) carbonyl ⁇ oxy-3,6,16,21-tetrahydroxy-6,10,12,16,20-pentamethyl -18,19-epoxytricosa-8,12,14-trien-11-orido) in ethanol (50 mg / mL) was diluted 500-fold with 0.9% sodium chloride / 10 mM histidine aqueous solution to give 0.1 mg / mL. mL of E7107 solution was obtained.
  • ⁇ Preparation of liposome composition> In a 10 mL glass container, 0.1 mL of the liposome dispersion and 1 mL of the E7107 solution were mixed and incubated in a water bath at 55 ° C. for 3 minutes to obtain a liposome composition in which E7107 was introduced into the liposome.
  • the encapsulation rate was determined as follows.
  • the liposome composition encapsulating the active compound was ultracentrifuged at 400,000 ⁇ g for 30 minutes.
  • the amount of the active compound not encapsulated in the liposome was quantified by measuring the concentration of the active compound in the supernatant by HPLC.
  • the encapsulation rate was calculated by the following formula.
  • the residual ratio in the liposome was measured by dividing the amount of E7107 after 24 hours, 48 hours and 72 hours by the amount of E7107 immediately after mixing. The measurement results are shown in FIG.
  • HP- ⁇ -CD means HP- ⁇ -cyclodextrin.
  • Example 2 ⁇ Preparation of liposome composition>
  • the liposome dispersion and the E7107 solution are mixed in a 10 mL glass container and incubated in a water bath at 5 ° C., 20 ° C., 40 ° C., 50 ° C., 60 ° C.
  • Table 2 shows the measurement results of the encapsulation rate. As can be seen from Table 2, it was possible to shorten the sealing operation time by heating during the sealing operation of E7107. It was also revealed that E7107 was gradually enclosed even at room temperature (20 ° C.).
  • Example 3 ⁇ Preparation of aqueous solution for liposome internal phase> 396.4 mg of ammonium sulfate and 189.1 mg of citric acid monohydrate were dissolved in pure water and made up to 15 mL to prepare a 200 mM ammonium sulfate / 60 mM citric acid aqueous solution. Dissolve 700 mg of HP- ⁇ -cyclodextrin or 790 mg of HP- ⁇ -cyclodextrin (manufactured by Sigma) with 2.5 mL of 200 mM ammonium sulfate / 60 mM citric acid aqueous solution, adjust the pH to 5.5 with aqueous ammonia, and then add pure water.
  • An aqueous solution for liposome internal phase was prepared by using up to 5 mL.
  • the aqueous solution for liposome internal phase not containing cyclodextrin was prepared by adjusting 2.5 mL of 200 mM ammonium sulfate / 60 mM citric acid aqueous solution to pH 5.5 with aqueous ammonia and then measuring up to 5 mL with pure water (Table 3). .
  • ⁇ Preparation of liposome preparation solution Hydrogenated soybean phosphatidylcholine (317.9 mg), cholesterol (116.0 mg) and polyethylene glycol 2000-phosphatidylethanolamine (130.4 mg) were dissolved in 10 mL of chloroform and then accurately dispensed into three parts. A lipid film was created. To the obtained lipid film, 5 mL of aqueous solution for liposome inner phase having various compositions shown in Table 3 below was added by heating to about 60 ° C. and stirred to prepare a liposome preparation solution. The liposome preparatory solution was sonicated for 20 minutes and then sized using an extruder (Lipex Biomembranes) heated to about 65 ° C. to obtain a liposome preparatory solution. When the particle size of the liposome in the obtained liposome preparatory solution was measured by a dynamic light scattering method, all were 90 to 100 nm.
  • Liposomes in which eribulin mesylate is introduced into liposomes by mixing 0.5 mL of the liposome dispersion and 0.5 mL of eribulin mesylate solution in a 10 mL glass container and incubating in a 55 ° C. water bath for 3 minutes. A composition was obtained.
  • encapsulation rate was determined in the same manner as in Example 1. The results are shown in Table 3. As can be seen from Table 3, eribulin mesylate could be encapsulated more efficiently by the presence of cyclodextrin in the liposome aqueous phase.
  • the aqueous solution for liposome internal phase not containing cyclodextrin was prepared by adjusting 1 mL of 200 mM ammonium sulfate / 60 mM citric acid aqueous solution to pH 5.5 with aqueous ammonia, and then measuring up to 2 mL with pure water (Table 4).
  • the lipid mixture was weighed by 80 mg, and the various compositions described in Table 4 above were weighed.
  • 2 mL of the liposome internal phase aqueous solution was heated to about 80 ° C. and added, and stirred to prepare a liposome preparation solution.
  • the liposome preparation solution was sized using an extruder (Lipex Biomembranes) heated to about 80 ° C. to obtain a liposome preparation solution.
  • ⁇ Preparation of liposome composition A liposome in which eribulin mesylate is introduced into the liposome by mixing 0.96 mL of the liposome dispersion and 0.24 mL of eribulin mesylate solution in a 10 mL glass container and incubating in a water bath at 60 ° C. for 3 minutes. A composition was obtained.
  • ⁇ Stability in rat plasma The prepared eribulin mesylate-encapsulated liposome (0.2 mL) and rat plasma (1.8 mL) were mixed and shaken at 37 ° C. using a liquid phase incubator. Sampling was performed immediately after mixing the liposome composition and rat plasma, 6 hours, 12 hours, 24 hours, 48 hours, and 120 hours after the start of shaking, and the free body fraction was fractionated using a gel filtration column. The resulting free fraction of eribulin mesylate was measured by HPLC as the amount of eribulin mesylate leaked from the liposomes. The measurement results are shown in FIG. As can be seen from FIG.
  • eribulin mesylate can be stably retained and sustainedly released in plasma for a long period of 120 hours.
  • liposomes containing cyclodextrin in the internal phase can hold eribulin mesylate more stably for a long period of time.
  • Example 4 ⁇ Preparation of liposome composition>
  • a liposome dispersion liquid substituted with a 10 mM histidine aqueous solution (pH 7.6) was obtained.
  • the liposome dispersion and the eribulin mesylate solution are mixed in a 10 mL glass container, and are placed in a water bath at 5 ° C, 20 ° C, 40 ° C, 50 ° C, 60 ° C for 1 minute, 5 minutes, 1 hour, 6 hours. By incubating, a liposome composition was obtained.
  • Table 5 shows the measurement results of the encapsulation rate. As can be seen from Table 5, it was possible to shorten the encapsulation operation time by heating during the encapsulation operation of eribulin mesylate. It was also revealed that eribulin mesylate was gradually encapsulated even at room temperature (20 ° C.).
  • Example 5 ⁇ Preparation of aqueous solution for liposome internal phase> 1.46 g of glutamine was dissolved in pure water and made up to 100 mL to prepare a 100 mM glutamine aqueous solution. The pH was measured and found to be 5.2. Further, 28.0 g of HP- ⁇ -cyclodextrin and 1.46 g of glutamine were dissolved in pure water and made up to 100 mL to prepare a 200 mM HP- ⁇ -cyclodextrin / 100 mM glutamine aqueous solution.
  • captisol and 1.46 g glutamine were dissolved in pure water and made up to 100 mL to prepare a 200 mM captisol / 100 mM glutamine aqueous solution.
  • the glutamine aqueous solution containing the above cyclodextrin was adjusted to pH 5.2 with hydrochloric acid and sodium hydroxide (Table 6).
  • the aqueous arginine solution containing cyclodextrin was adjusted to pH 11.1 using hydrochloric acid and sodium hydroxide (Table 6).
  • a liposome internal phase solution (5 mL) was heated to about 80 ° C. and added, and stirred to prepare a liposome preparation solution.
  • the liposome preparation solution was sonicated for 20 minutes, and then sized using an extruder (manufactured by Lipex Biomembranes) heated to about 80 ° C. to obtain a sized liposome preparation solution.
  • an extruder manufactured by Lipex Biomembranes
  • Liposome composition in which eribulin mesylate is introduced into liposomes by mixing these liposome dispersions and eribulin mesylate solution prepared in the same manner as in Example 3 and incubating in a water bath at 60 ° C. for 5 minutes. I got a thing.
  • Example 6 ⁇ Preparation of liposome composition>
  • a liposome dispersion was obtained (Table 7).
  • a 10 mL glass container 0.1 mL of the liposome dispersion and 0.1 mL of doxorubicin aqueous solution were mixed and incubated in a 60 ° C. water bath for 5 minutes.
  • encapsulation rate was determined in the same manner as in Example 1. The results are shown in Table 7. As can be seen from Table 7, the doxorubicin encapsulation rate was improved by the presence of cyclodextrin in the liposome internal phase.
  • Example 7 ⁇ Preparation of liposome dispersion> As in Example 5, the liposome internal phase was 100 mM glutamine aqueous solution, 200 mM HP- ⁇ -cyclodextrin / 100 mM glutamine aqueous solution, 200 mM HP- ⁇ -cyclodextrin / 100 mM glutamine aqueous solution, or 200 mM G 2 - ⁇ -cyclodextrin / A liposome dispersion having a 100 mM glutamine aqueous solution and an outer phase of a 100 mM glutamine aqueous solution was obtained (Table 8).
  • the liposome internal phase is a 100 mM histidine aqueous solution, a 200 mM HP- ⁇ -cyclodextrin / 100 mM histidine aqueous solution, a 200 mM HP- ⁇ -cyclodextrin / 100 mM histidine aqueous solution, or a 200 mM G 2 - ⁇ -cyclodextrin / 100 mM histidine aqueous solution.
  • Liposome dispersion was obtained which is a 100 mM histidine aqueous solution (Table 8).
  • ⁇ Preparation of liposome composition In a 10 mL glass container, 5.3 mg of HP- ⁇ -cyclodextrin was dissolved in 0.75 mL of a liposome dispersion, and the liposome external phase solution was made 5 mM HP- ⁇ -cyclodextrin. A 0.25 mL paclitaxel aqueous solution was mixed there, and it incubated in a 60 degreeC water bath for 5 minutes, and the liposome composition was obtained.
  • ⁇ Measurement of encapsulation rate> The liposome composition immediately after encapsulation was made up to 2 mL with 5 mM HP- ⁇ -cyclodextrin. Of these, 1 mL was used to measure paclitaxel concentration and hydrogenated soybean phosphatidylcholine (HSPC) concentration by HPLC. The remaining 1 mL was made up to 10 mL with pure water and centrifuged at 400,000 ⁇ g for 40 minutes. The supernatant was completely discarded, and the resulting precipitate was resuspended with pure water and made up to 10 mL. Again, centrifugation was performed at 400,000 ⁇ g for 40 minutes.
  • HSPC hydrogenated soybean phosphatidylcholine
  • the supernatant was completely discarded, and the resulting precipitate was resuspended with pure water and made up to 1 mL.
  • the paclitaxel concentration and HSPC concentration of the obtained liposome composition were measured by HPLC.
  • the encapsulation rate was determined by the following formula. The results are shown in Table 8. As can be seen from Table 8, when the same kind of cyclodextrin was present in the liposome inner phase and the outer phase, the encapsulation rate of paclitaxel was significantly improved by increasing the concentration of cyclodextrin on the inner phase side. Even when different types of cyclodextrin were present in the inner phase and the outer phase, the encapsulation rate of paclitaxel was improved by increasing the concentration of the inner phase side.
  • Example 8 In the same manner as in Example 1, using a liposome internal phase aqueous solution having a composition of 250 mM HP- ⁇ -cyclodextrin and 100 mM citric acid, a liposome composition (E7107 concentration: 0.2 mg / mL, total lipid concentration: 10 ⁇ mol) / ML). Further, as non-formulated E7107, E7107 was dissolved in a physiological saline solution (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) containing 5% DMSO / 5% Tween 80 (E7107 concentration: 3 mg / mL).
  • WiDr obtained from Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.
  • a human colon cancer cell line was cultured and grown in RPMI 1640 medium containing 10% fetal bovine serum. Cells were released from the flask using a 0.05% Trypsin-EDTA solution and collected. After washing with PBS, it was suspended with Hanks' Balanced Salt Solution (manufactured by GIBCO) at 5 ⁇ 10 7 cells / mL, and kept on ice. A cell suspension of 100 ⁇ L per mouse was subcutaneously injected into the right flank of 6-8 week old female nude mice (BALB / cAJcl-nu / nu; CLEA Japan, Inc.).
  • the size of the tumor was measured over time using calipers, and the size of the tumor was calculated based on the calculation formula: major axis ⁇ (minor square) ⁇ 2.
  • the body weight of the mice was also measured over time. When the tumor size reached 100 to 200 mm 3 , grouping was performed so that the average tumor size and the average body weight of the mice were uniform among the test groups.
  • the prepared liposome composition (1 mg / kg) or non-formulated E7107 (30 mg / kg) was administered once intravenously from the tail vein of cancer-bearing mice, and blood and tumor tissue were collected over time after administration. The obtained blood was centrifuged at 4 ° C., and plasma was collected.
  • FIG. 3 shows changes in E7107 concentration in plasma and tumor tissue when a single intravenous administration was performed on tumor-bearing mice. As can be seen from FIG. 3, it became clear that the formulation of E7107 in liposomes markedly improves the retention of E7107 in plasma and tumor.
  • Example 9 In the same manner as in Example 1, a liposome dispersion was obtained using an aqueous solution for an internal phase of a liposome having a composition of 250 mM HP- ⁇ -cyclodextrin and 100 mM citric acid.
  • the mixing ratio of the liposome dispersion and the E7107 solution was changed, and five types of liposome compositions (E7107 concentration: 0.2 mg / mL, total lipid concentration: 2.5 ⁇ mol / mL; E7107 concentration: 0.2 mg / mL, total Lipid concentration: 5 ⁇ mol / mL; E7107 concentration: 0.2 mg / mL, total lipid concentration: 10 ⁇ mol / mL; E7107 concentration: 0.2 mg / mL, total lipid concentration: 20 ⁇ mol / mL; E7107 concentration: 0.2 mg / mL, Total lipid concentration: 40 ⁇ mol / mL) was obtained.
  • the encapsulation rate was 95% or more in any liposome composition.
  • Tumor-bearing mice were prepared by transplanting WiDr (obtained from Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), a human colon cancer-derived cell, subcutaneously into the abdomen of female nude mice (BALB / cAJcl-nu / nu).
  • WiDr obtained from Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.
  • the prepared various liposome preparations E7107 were administered once intravenously from the tail vein of cancer-bearing mice, and blood was collected at 24 and 72 hours after administration. Plasma was collected by centrifuging the obtained blood at 4 ° C., and the plasma concentration of E7107 was measured in the same manner as in Example 8.
  • FIG. 4 shows changes in E7107 concentration in plasma and tumor tissue when a single intravenous administration was performed on tumor-bearing mice. As can be seen from FIG. 4, each liposome composition showed similar changes in E7107 concentration in plasma and tumor.
  • WiDr obtained from Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.
  • a human colon cancer cell line was cultured and grown in RPMI 1640 medium containing 10% fetal bovine serum. Cells were released from the flask using a 0.05% Trypsin-EDTA solution and collected. After washing with PBS, it was suspended with Hanks' Balanced Salt Solution (manufactured by GIBCO) at 5 ⁇ 10 7 cells / mL, and kept on ice. 100 ⁇ L of cell suspension per mouse was subcutaneously injected into the right flank of 6-8 week old nude mice (CLEA Japan, Inc.). Each mouse was observed every day, and when abnormalities were found, recording was performed as appropriate.
  • Hanks' Balanced Salt Solution manufactured by GIBCO
  • the size of the tumor was measured over time using calipers, and the size of the tumor was calculated based on the calculation formula: major axis ⁇ (minor square) ⁇ 2.
  • the body weight of the mice was also measured over time. When the tumor size reached 100-200 mm 3 , grouping was performed so that the average tumor size and the average body weight of the mice were uniform between each test group (the number of mice in each test group was 5 animals) and E7107 (200 ⁇ L / 20 g) were administered once via the tail vein.
  • E7107-2.5 mg / kg group group 2
  • DMSO solution, Tween-80 solution, and 5% glucose solution were added to E7107 at a ratio of 3.5: 6.5: 90, and the E7107 concentration was adjusted. It was set to 0.25 mg / mL.
  • the liposome composition encapsulating 3E7107 used in Group 3 and Group 4 was prepared in the same manner as in Example 1, and the E7107 concentration was 0.25 mg / mL.
  • Table 9 shows the tumor size, the control ratio, and the average value of body weight as therapeutic effects on tumor growth on the fifth day after administration.
  • the daily dose of E7107 is not particularly limited, but the antitumor effect of E7107 can be exerted by administering the liposome composition to humans so that the dose is usually 1 to 100 mg. Can do.
  • ⁇ Preparation of liposome preparation solution Hydrogenated soybean phosphatidylcholine, cholesterol, and polyethylene glycol 2000-phosphatidylethanolamine were each weighed in the amounts shown in Table 10. Each was dissolved in 3 mL of chloroform, and then chloroform was distilled off under reduced pressure using a rotary evaporator to prepare a lipid film. To the resulting lipid film, 10 mL of the prepared aqueous solution for liposome internal phase (Rp. 1 to 4 is 100 mM ammonium sulfate / 30 mM citric acid aqueous solution, Rp.
  • 5 to 8 is 200 mM HP- ⁇ -cyclodextrin / 100 mM ammonium sulfate / 30 mM citric acid.
  • Aqueous solution was heated to about 80 ° C. and added, and stirred to prepare a liposome preparation solution.
  • the size was adjusted using an extruder (manufactured by Lipex Biomembranes) heated to about 80 ° C. to obtain a sized liposome preparation solution.
  • Rp. 1 is 77 nm
  • Rp. 2 is 95 nm
  • Rp. 3 is 79 nm
  • Rp. 4 is 128 nm
  • Rp. 5 is 81 nm
  • Rp. 6 is 122 nm
  • Rp. 7 is 76 nm
  • Rp. 8 was 110 nm.
  • ⁇ Preparation of liposome composition> In the same manner as in Example 1, a liposome dispersion was obtained. Further, eribulin mesylate was dissolved in 0.9% sodium chloride / 10 mM histidine aqueous solution to obtain a 5 mg / mL eribulin mesylate solution. In a 10 mL glass container, 4.8 mL of each liposome dispersion and 0.6 mL of eribulin mesylate solution were mixed and incubated in a 60 ° C. water bath for 3 minutes to introduce eribulin mesylate into the liposomes. Liposome composition was obtained.
  • Eribulin mesylate in plasma and tumor tissue was measured using LC / MS / MS.
  • the PK parameters were calculated using non-compartment model analysis software (WinNonlin v.5.0.1).
  • the results of eribulin mesylate plasma PK parameter and tumor tissue PK parameter are shown in Table 11 and Table 12, respectively.
  • ⁇ Preparation of liposome preparation solution> Weighed 221.8 mg of hydrogenated soybean phosphatidylcholine and 72.5 mg of cholesterol and 86.9 mg of polyethylene glycol 2000-phosphatidylethanolamine. After dissolving in 3 mL of chloroform, chloroform was distilled off under reduced pressure using a rotary evaporator to prepare a lipid film. To the obtained lipid film, 10 mL of the prepared aqueous solution for liposome inner phase was added by heating to about 80 ° C. and stirred to prepare a liposome preparation solution. The size was adjusted using an extruder (manufactured by Lipex Biomembranes) heated to about 80 ° C. to obtain a sized liposome preparation solution. When the particle diameter of the liposome in the obtained liposome preparation liquid was measured by the dynamic light scattering method, it was about 90 nm.
  • eribulin mesylate was dissolved in 0.9% sodium chloride / 10 mM histidine aqueous solution to obtain a 1 mg / mL eribulin mesylate solution.
  • the eribulin mesylate solution was diluted with 0.9% sodium chloride / 10 mM histidine aqueous solution, and sterilized by filtration using a 0.22 ⁇ m PVDF filter. : 0.1 mg / mL and 0.2 mg / mL and 0.4 mg / mL).
  • ⁇ Preparation of liposome composition In a 10 mL glass container, 1.8 mL of the liposome dispersion and 1.2 mL of eribulin mesylate solution were mixed and incubated in a 60 ° C. water bath for 3 minutes to introduce eribulin mesylate into the liposomes. A liposome composition was obtained. The obtained liposome composition was diluted with a 0.9% sodium chloride / 10 mM histidine aqueous solution and sterilized by filtration using a 0.22 ⁇ m PVDF filter, so that an administration sample (eribulin mesylate concentration: 0.1 mg / mL and 0.2 mg / mL) was obtained. The encapsulation rate was measured by ultracentrifugation and confirmed to be 90% or more.
  • an administration sample eribulin mesylate concentration: 0.1 mg / mL and 0.2 mg / mL
  • WiDr a human colorectal cancer cell line
  • RPMI 1640 medium containing 10% fetal bovine serum.
  • Cells were released from the flask using a 0.05% Trypsin-EDTA solution and collected. After washing with PBS, the suspension was suspended at 5 ⁇ 10 7 cells / mL with Hanks' Balanced Salt Solution (manufactured by Gibco) and kept on ice.
  • a 7-week-old nude mouse (Nippon Charles River Co., Ltd.) was subcutaneously injected with 0.1 mL of cell suspension per mouse into the right ventral region. Each mouse was observed every day, and when abnormalities were found, recording was performed as appropriate.
  • the size of the tumor was measured over time using calipers, and the size of the tumor was calculated based on the calculation formula: major axis ⁇ (minor square) ⁇ 2.
  • major axis ⁇ (minor square) ⁇ 2 When the tumor size reached 100-200 mm 3 , grouping was performed so that the average tumor size and the average body weight of the mice were uniform among the test groups (the number of mice in each test group was 5) and intravenous administration of the drug into the tail vein (0.2 mL / 20 g; twice at 7-day intervals).
  • the measurement results are shown in FIG.
  • the liposome composition 1 mg / kg administration group showed significantly superior antitumor effect than the free body 2 mg / kg administration group or the free body 4 mg / kg (maximum tolerated dose) administration group.
  • a liposome composition (concentration of eribulin mesylate: 0.3 mg / mL) was obtained in the same manner as in Example 11 except that the liposome-compatible aqueous solution prepared as described above was used. In the same manner as in Example 1, the encapsulation rate was measured and confirmed to be 90% or more.
  • FaDu obtained from American Type Culture Collection
  • a human pharyngeal squamous cell carcinoma cell line was cultured and grown in a 10% fetal bovine serum-containing MEM medium.
  • Cells were released from the flask using a 0.05% Trypsin-EDTA solution and collected. After washing with PBS, the suspension was suspended in PBS to 5 ⁇ 10 7 cells / mL, and kept on ice.
  • a 6-week-old nude mouse (Charles River Japan, Inc.) was subcutaneously injected with 0.1 mL of cell suspension per mouse into the right ventral region. Each mouse was observed every day, and when abnormalities were found, recording was performed as appropriate.
  • the size of the tumor was measured over time using calipers, and the size of the tumor was calculated based on the calculation formula: major axis ⁇ (minor square) ⁇ 2.
  • major axis ⁇ (minor square) ⁇ 2 When the tumor size reached 100-200 mm 3 , grouping was performed so that the average tumor size and the average body weight of the mice were uniform among the test groups (the number of mice in each test group was 5), and intravenous administration of the drug into the tail vein (0.2 mL / 20 g; 3 times at 7-day intervals).
  • the transition results of the average tumor volume after sample administration are shown in FIG. As can be seen from FIG.
  • Each liposome composition (concentration of eribulin mesylate: 0.2 mg / mL) was obtained in the same manner as in Example 11, except that the liposome-compatible aqueous solution prepared as described above was used. The encapsulation rate was measured in the same manner as in Example 1, and it was confirmed that both were 90% or more.
  • FaDu obtained from American Type Culture Collection
  • a human pharyngeal squamous cell carcinoma cell line was cultured and grown in a 10% fetal bovine serum-containing MEM medium.
  • Cells were released from the flask using a 0.05% Trypsin-EDTA solution and collected. After washing with PBS, the suspension was suspended in PBS to 5 ⁇ 10 7 cells / mL, and kept on ice.
  • a 6-week-old nude mouse (Charles River Japan, Inc.) was subcutaneously injected with 0.1 mL of cell suspension per mouse into the right ventral region. Each mouse was observed every day, and when abnormalities were found, recording was performed as appropriate.
  • the size of the tumor was measured over time using calipers, and the size of the tumor was calculated based on the calculation formula: major axis ⁇ (minor square) ⁇ 2.
  • major axis ⁇ (minor square) ⁇ 2 When the tumor size reached 100-200 mm 3 , grouping was performed so that the average tumor size and the average body weight of the mice were uniform among the test groups (the number of mice in each test group was 5), and intravenous administration of the drug into the tail vein (0.2 mL / 20 g; 3 times at 7-day intervals).
  • the transition results of the average tumor volume after sample administration are shown in FIG.
  • FaDu is a cell line that is less sensitive to eribulin mesylate.
  • Example 15 ⁇ Preparation of aqueous solution for liposome internal phase>
  • Example 12 ⁇ Preparation of drug solution> The same procedure as in Example 12 was carried out to obtain free-form administration samples (eribulin mesylate concentrations: 0.2 mg / mL, 0.3 mg / mL, and 0.4 mg / mL).
  • a liposome composition (concentration of eribulin mesylate: 0.3 mg / mL) was obtained in the same manner as in Example 12 except that the liposome-compatible aqueous solution prepared as described above was used. The encapsulation rate was measured in the same manner as in Example 1, and it was confirmed that both were 90% or more.
  • ACHN obtained from American Type Culture Collection
  • a human renal cancer cell line was cultured and grown in a MEM medium containing 10% fetal bovine serum. Cells were released from the flask using a 0.05% Trypsin-EDTA solution and collected. After washing with PBS, the suspension was suspended in PBS to 5 ⁇ 10 7 cells / mL, and kept on ice.
  • a 6-week-old nude mouse (Charles River Japan, Inc.) was subcutaneously injected with 0.1 mL of cell suspension per mouse into the right ventral region. Each mouse was observed every day, and when abnormalities were found, recording was performed as appropriate.
  • the size of the tumor was measured over time using calipers, and the size of the tumor was calculated based on the calculation formula: major axis ⁇ (minor square) ⁇ 2.
  • major axis ⁇ (minor square) ⁇ 2 When the tumor size reached 150 to 200 mm 3 , grouping was performed so that the average tumor size and the average body weight of the mice were uniform between the test groups (the number of mice in each test group was 5), and intravenous administration of the drug into the tail vein (0.2 mL / 20 g; 3 times at 7-day intervals).
  • the transition result of the average tumor volume after sample administration is shown in FIG. As can be seen from FIG.
  • ACHN is a cell line resistant to eribulin mesylate, so that in the free body administration, the 2 mg / kg administration group, the 3 mg / kg administration group, and the 4 mg / kg (maximum tolerated dose) administration group In any case, no significant difference from the untreated group was found 45 days after the start of sample administration.
  • any of the liposome composition 3 mg / kg administration groups a tumor growth inhibitory effect was observed, and the tumor volume values were significantly smaller than those in the untreated group and free body administration group 45 days after the start of sample administration.
  • a liposome composition containing HP- ⁇ -cyclodextrin in the liposome internal phase showed a high tumor growth inhibitory effect.
  • the daily dose of eribulin mesylate is not particularly limited, but it is generally possible to administer eribulin mesylate anti-eribulin by administering the liposome composition to humans at 0.1 to 10 mg. A tumor effect can be exerted.
  • Japanese Patent Application No. 2009-082521 Japanese Patent Application No. 2009-082521
  • provisional US patent application 61/164653
  • Japanese patent application Japanese Patent Application No. 2009-082516
  • US patent provisional application 61/164678
  • the present invention can provide a method for producing a liposome having a high retention stability of an active compound at a high encapsulation rate.
  • the liposome composition of the present invention has industrial applicability in the fields of medicine, cosmetics and food. Among them, the liposome composition of the present invention is preferably used as a medicine for therapeutic use and diagnostic use.

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Abstract

　本発明は、リポソーム組成物を製造する方法であって、リポソームを含み、リポソーム内相にシクロデキストリンをさらに含むリポソーム分散液を供するステップと、前記リポソーム内相に活性化合物を導入するステップと、を含む方法およびリポソーム組成物を提供する。

Description

リポソーム組成物の製造方法
　本発明は、リポソーム組成物の製造方法に関する。また、本発明は、リポソーム組成物、およびリポソーム組成物を調製するためのキットに関する。
　リポソームは、１つ以上の脂質二重層により包囲された内相を有する微細閉鎖小胞であり、水溶性物質を内相に、脂溶性物質を脂質二重層に保持することができる。リポソームに活性化合物を封入し、標的組織へ送達する際には、いかにして活性化合物をリポソームへ高い効率で封入するか、また、いかにしてリポソームによる活性化合物の保持安定性を確保するかが重要なポイントとなる。
　脂溶性化合物をリポソームへ封入する場合、比較的容易に高い封入率を達成できるが、アムホテリシンＢ（リポソーム医薬品アンビゾームの主薬）のような膜親和性の非常に高い化合物の場合を除き、一般的に血漿中での保持安定性は低く、体内動態が十分に改善されることは難しい。水溶性化合物のリポソームへの封入方法にはリピドフィルム法（ボルテックス法）、逆相蒸発法、界面活性剤除去法、凍結融解法やリモートローディング法（ｐＨ勾配法、イオン勾配法）等様々な方法がある。しかしながら、１００％近い高い封入率が得られるのはリモートローディング法のみであり、その他の方法では５～３０％程度の封入率しか得られない。
　リモートローディング法として、ｐＨ勾配や硫酸アンモニウムイオン勾配を利用したものが知られている。ｐＨ勾配を利用したリモートローディング法であるｐＨ勾配法とは、目的の化合物のｐＨによる分子型／イオン型の乖離平衡の移動を利用して化合物をリポソーム内に取り込む技術である。
　ｐＨ勾配法によりリポソームに封入される化合物の一例として、例えば、ドキソルビシン(ＤＯＸ、ｐＫａ：８．２)が挙げられる。ｐＨ４の緩衝液によりリポソーム溶液を調製した後に、リポソーム外相をｐＨ７の緩衝液に置換する。このリポソーム溶液にＤＯＸを加えた場合、加えられたｐＨ７の溶液中では分子型のＤＯＸは脂溶性となるため、水相ではなくリポソーム膜に移行する。さらにリポソーム膜に移行したＤＯＸがｐＨ４のリポソーム内相と接触した場合、イオン型となりリポソーム内相に溶け込んでいく。このように、解離平衡の移動によってＤＯＸはリポソーム外相から内相に輸送される（非特許文献１、非特許文献２、および特許文献１を参照。）。
　また、このようなリモートローディング法を改良した種々の技術が報告されている。
　非特許文献３には、コレステロールフリーリポソームという特別な組成のリポソームにおいてｐＨ勾配法を行う際に、リポソーム外相に活性化合物と共にエタノールを添加することで、活性化合物の封入率を向上させる技術が開示されている。
　特許文献２には、ｐＨ勾配に加えて、リポソーム内相に銅イオンを存在させることで、活性化合物の封入率を向上させる技術が開示されている。
　硫酸アンモニウムイオン勾配を利用したリモートローディング法である硫酸アンモニウム法とは、ｐＨ勾配法におけるｐＨ勾配に代えて、２価の硫酸アンモニウムのイオン勾配を利用して活性化合物をリポソーム内相に取り込む技術である（非特許文献１および特許文献３を参照。）。
　特許文献４には、硫酸アンモニウムによるイオン勾配に加えて、リポソーム外相に活性化合物と共にボロン酸を添加することで、リポソーム内に活性化合物を取り込む技術が開示されている。
　また、特許文献５には、硫酸アンモニウムによるイオン勾配に変えて、グルクロン酸アニオンによるイオン勾配を利用して活性化合物をリポソームに取り込むことで、硫酸アンモニウムを利用した場合に比べて、活性化合物の放出速度を向上させる技術が開示されている。
　このように、封入率の面からリモートローディング法は優れた封入方法である。しかしながら、リポソーム内相に封入された活性化合物が結晶化するＤｏｘｉｌ(ＤＯＸのリポソーム製剤)等の特殊な例を除くと、リモートローディング法を用いた場合、活性化合物は血漿中でリポソームから漏出しやすく、活性化合物の保持安定性が低いという問題点がある。
　一方で、保持安定性を高めるため、あるいは活性化合物の溶解度を高めるためにシクロデキストリン（以下、「ＣｙＤ」とも記す。）で活性化合物を予め可溶化させた後、Ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ法等によりシクロデキストリンと活性化合物の複合体をリポソームに封入する技術が報告されている。しかしながら、この方法では封入率が５～２０％であり、大量生産を行うのは非常に困難である。
　非特許文献４では、モデル化合物としてサリチル酸とＣｙＤを共有結合で結合させた化合物が用いられており、当該化合物のリポソーム内への封入にはリピドフィルム法が採用されている（封入率は８％以下）。リポソーム内相中で活性化合物とＣｙＤがコンプレックスを作ることで保持安定性が高まることが示唆されている。
　非特許文献５では、難水溶性化合物であるベタメタゾンを数種類のＣｙＤ誘導体を用いて予め可溶化し、リピドフィルム法によってリポソーム内に封入している（封入率は３％以下）。ベタメタゾンとの会合定数が高いＣｙＤ誘導体を用いることで、保持安定性が高まり徐放効果が得られることが示されている。
　また、非特許文献６では、難水溶性化合物であるケトプロフェンをＨＰ－β－シクロデキストリンで予め可溶化しており、得られた複合体に対して種々の封入法が試みられている。ＭＬＶ（multilamellar vesicles）では約７５％と比較的高い封入率を達成しているが、ＥＰＲ効果を狙う際に用いるＳＵＶ（small unilamellar vesicles）では約５５％の封入率に留まる。しかしながら、当該文献で用いられている封入方法でリポソーム内相にこのような高い封入率で封入するのは理論的に不可能であり、ケトプロフェンがリポソーム内水相ではなく脂質二重層に分配している可能性が高い。
　さらに、非特許文献７では、予めプレドニゾロンとＣｙＤの複合体を作成し、凍結融解法でリポソーム内へ封入すると、水溶性物質のリポソーム膜透過性が上がることが開示されている。
　非特許文献８では、ＤＯＸのみを封入したリポソームよりもＤＯＸとγ－シクロデキストリンの複合体を封入したリポソームの方が高い腫瘍内ＤＯＸ濃度と抗腫瘍効果を示すことが開示されている。当該文献においても、予めＤＯＸとγ－シクロデキストリンとの複合体を形成し、この複合体をリポソームに内包させている。同様に、特許文献６には、予め水溶性化合物とＣｙＤとの複合体を形成し、この複合体をリポソームに内包させることで、活性化合物の放出を徐放化する技術が開示されている。
　以上のように、従来技術の方法では、リポソームへの活性化合物の高い封入率と、リポソームにおける活性化合物の保持安定性を両立することは難しいのが現状である。
米国特許第５１９２５４９号明細書 国際公開第２００６／０３７２３０号パンフレット 米国特許第５３１６７７１号明細書 米国特許第６０５１２５１号明細書 国際公開第２００５／０４６６４３号パンフレット 国際公開第９４／２３６９７号パンフレット
佐塚泰之，"リポソームの調製法"，「リポソーム応用の新展開：人工細胞の開発に向けて（秋吉一成，辻井薫監修）」，エヌ・ティー・エス, (2005), pp.33-37. Mayer LD et al., Biochimica et Biophysica Acta, (1986), 857:pp.123-126. N. Dos Santos et al., Biochimica et Biophysica Acta, (2004), 1661(1):pp.47-60 Y. Hagiwara et al., Chem. Pharm. Bull., (2006), 54(1):pp.26-32 G. Piel et al., International Journal of Pharmaceutics, (2006), 312:pp.75-82 F. Maestrelli et al., International Journal of Pharmaceutics, (2006), 312:pp.53-60 D.G. Fatouros et al., European Journal of Pharmaceutical Sciences, (2001), 13:pp.287-296 H. Arima et al., Journal of Drug Targeting, 2006, 14(4):pp.225-232
　本発明が解決しようとする課題は、活性化合物の保持安定性が高いリポソームを高い封入率で製造する方法を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、驚くべきことに、予めリポソーム内相にシクロデキストリンを封入することで、リポソーム外相に添加した活性化合物がリポソーム内相へと移動し、極めて高い封入率で活性化合物をリポソーム内相に封入できること、また得られたリポソーム組成物における活性化合物の保持安定性が極めて高いことを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、以下のとおりである。
［１］
　リポソーム組成物を製造する方法であって、
　リポソームを含み、リポソーム内相にシクロデキストリンをさらに含むリポソーム分散液を供するステップと、
　前記リポソーム分散液と活性化合物とを混合するステップと、
　前記リポソーム分散液のリポソーム内相に前記活性化合物を導入するステップと、
　を含む方法。
［２］
　前記リポソーム分散液が、リポソーム外相と比べてより高濃度のシクロデキストリンをリポソーム内相に含む、［１］に記載の方法。
［３］
　前記リポソーム分散液が、シクロデキストリンをリポソーム外相に実質的に含まない、［１］または［２］に記載の方法。
［４］
　前記リポソーム分散液を供するステップが、
　リポソームを含み、リポソーム内相およびリポソーム外相に前記シクロデキストリンをさらに含むリポソーム準備液を供するステップと、
　前記リポソーム準備液のリポソーム外相を置換または希釈することにより、リポソーム外相における前記シクロデキストリンの濃度を調整するステップと
　を含む、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］
　前記導入するステップが、混合するステップにより得られた混合液におけるリポソームの膜透過性を上げるステップを含む、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］
　前記導入するステップが、前記混合液をリポソームの脂質二重膜の相転移温度以上に昇温するステップを含む、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］
　［１］～［６］のいずれかに記載の方法で製造されたリポソーム組成物。
［８］
　前記活性化合物が抗腫瘍剤である、［７］に記載のリポソーム組成物。
［９］
　リポソームを含み、リポソーム内相にシクロデキストリンおよび活性化合物をさらに含むリポソーム組成物であって、活性化合物が（８Ｅ、１２Ｅ、１４Ｅ）－７－｛（４－シクロヘプチルピペラジン－１－イル）カルボニル｝オキシ－３、６、１６、２１－テトラヒドロキシ－６、１０、１２、１６、２０－ペンタメチル－１８、１９－エポキシトリコサ－８、１２、１４－トリエン－１１－オリド（Ｅ７１０７）、エリブリン、ドキソルビシン、エピルビシン、ピラルビシン、ダウノルビシン、ドセタキセルおよびパクリタキセルならびにこれらの薬理学的に許容される塩からなる群から選択される、リポソーム組成物。
［１０］
　前記活性化合物がメシル酸エリブリンである、［９］に記載のリポソーム組成物。
［１１］
　前記リポソーム組成物が固体状または液体状である、［７］～［１０］のいずれかに記載のリポソーム組成物。
［１２］
　リポソーム内相に活性化合物を含むリポソーム組成物を調製するためのキットであって、リポソームを含み、リポソーム内相にシクロデキストリンをさらに含むリポソーム試薬を含む、キット。
［１３］
　前記リポソーム試薬が固体状または液体状である、［１２］に記載のキット。
［１４］
　前記リポソーム試薬を含み、活性化合物をさらに含む、［１２］または［１３］に記載のキット。
［１５］
　前記活性化合物が抗腫瘍剤である、［１４］に記載のキット。
　本発明によれば、新規なリポソーム組成物の製造方法を提供することができる。本発明のリポソームの製造方法により高い効率でリポソーム内相へ活性化合物を封入することができる。また、当該方法により製造されるリポソームは、活性化合物の高い保持安定性を有する。
in vitroラット血漿中（３７℃）でのＥ７１０７の保持安定性を示す。 in vitroラット血漿中（３７℃）でのメシル酸エリブリンの保持安定性を示す。 in vivo ＷｉＤｒ担癌ヌードマウスでのＥ７１０７の血中滞留性および腫瘍移行性を示す。 in vivo ＷｉＤｒ担癌ヌードマウスでのＥ７１０７の血中滞留性および腫瘍移行性を示す。 in vivo ＷｉＤｒ担癌ヌードマウスでのリポソームによるメシル酸エリブリンの抗腫瘍活性を示す。 in vivo ＦａＤｕ担癌ヌードマウスでのリポソームによるメシル酸エリブリンの抗腫瘍活性を示す。 in vivo ＦａＤｕ担癌ヌードマウスでのリポソームによるメシル酸エリブリンの抗腫瘍活性を示す。 in vivo ＡＣＨＮ担癌ヌードマウスでのリポソームによるメシル酸エリブリンの抗腫瘍活性を示す。
　本発明を、発明を実施するための形態により具体的に説明するが、本発明は、以下の発明を実施するための形態に限定されるものではなく、種々変形して実施することができる。
　本発明において参照される文献に開示されている内容は、本発明に参照として取り込まれる。
［定義］
　「リポソーム」とは、脂質二重層により包囲された内相を有する微細閉鎖小胞を意味する。本発明において、リポソームは、小さな１枚膜リポソーム（ＳＵＶ：small unilamellar vesicle）、大きな１枚膜リポソーム（ＬＵＶ：large unilamellar vesicle）、さらに大きな１枚膜リポソーム（ＧＵＶ：giant unilamellar vesicle）、同心円状の複数の膜を有する多重層リポソーム（ＭＬＶ：multilamellar vesicle）、同心円状でなく不規則に複数の膜を有するリポソーム（ＭＶＶ：Multivesicular vesicle）等を含む。
　「リポソーム内相」は、リポソームの脂質二重層に包囲された水性領域を意味し、「内水相」および「リポソーム内水相」と同義で用いる。「リポソーム外相」は、リポソームが液体中に分散している場合に、リポソームの脂質二重層に包囲されていない領域（すなわち、内相および脂質二重層以外の領域）を意味する。
　「リポソーム組成物」とは、リポソームを含み、リポソーム内相にシクロデキストリンと活性化合物とをさらに含む組成物を意味する。本発明において、リポソーム組成物は、固体状および液体状のものを含む。
　「リポソーム分散液」とは、リポソームを含み、リポソーム内相にシクロデキストリンをさらに含む組成物であって、リポソーム外相のシクロデキストリン濃度は調整されているが、リポソーム内相に活性化合物が導入される前の組成物を意味する。リポソーム外相におけるシクロデキストリンの濃度の調整については後述するが、リポソーム分散液としては、リポソーム外相のシクロデキストリン濃度が、リポソーム内相の濃度よりも低い分散液や、リポソーム外相にシクロデキストリンが実質的に含まれない分散液が挙げられる。
　なお、シクロデキストリンによる活性化合物の溶解度（みかけの溶解度）の向上が有意に認められる場合、シクロデキストリンを実質的に含むと言い、リポソーム外相が、シクロデキストリンを実質的に含まないとは、リポソーム外相が、シクロデキストリンによる活性化合物の溶解度（みかけの溶解度）の向上が有意に認められる量のシクロデキストリンを含まないことを意味する。
　「リポソーム準備液」とは、リポソームを含み、リポソーム内相およびリポソーム外相にシクロデキストリンをさらに含む組成物であって、リポソーム外相のシクロデキストリン濃度が調整される前の組成物を意味する。
　「リポソーム試薬」とは、液体状の場合、リポソーム分散液を意味し、固体状の場合は、所定の溶媒に溶解または懸濁することでリポソーム分散液を得ることのできる試薬を意味する。溶媒については後述する。後述するように、固体状のリポソーム試薬は、例えばリポソーム分散液を乾燥させることで得られる。
　なお、本明細書において、固体と液体を混合するとは、固体を液体に溶解することと懸濁することとを包含するものとし、混合、溶解、懸濁は互いに交換可能に用いる。同様に、溶媒と分散媒も互いに交換可能に用いる。
［活性化合物］
　本発明における活性化合物は、シクロデキストリンと複合体を形成する化合物であれば特に限定されるものではない。活性化合物は、医薬（診断薬を含む）、化粧料、食品などの分野において用いられる化合物から選択することができる。活性化合物は、１種の化合物または２種以上の化合物の組み合わせであってもよい。
　活性化合物としては、低分子化合物等が挙げられ、中でも、抗腫瘍剤、抗菌剤、抗炎症剤、抗心筋梗塞剤、造影剤として用いられる化合物が好適である。
　活性化合物は、分子量が１００～２０００であるものが好ましく、２００～１５００であるものがより好ましく、３００～１０００であるものがさらに好ましい。一般にこれらの範囲において、活性化合物のリポソーム膜透過性が良好であり、好適に本発明を適用できる。
　活性化合物は、水溶性化合物および脂溶性化合物を含み、水または水性溶媒へ少なくとも多少とも溶解するものであれば、本発明を適用することができる。
　また、後述するように本発明は、活性化合物とシクロデキストリンとの相互作用を利用するものであり、シクロデキストリンの存在下で、シクロデキストリンの非存在下よりも溶解度（みかけの溶解度）が上昇する活性化合物であれば、本発明を適用することができる。理論に拘束されるものではないが、活性化合物の分子全体または分子の一部がシクロデキストリンの環状構造内部（空孔）に包接されることにより、活性化合物の溶解度（みかけの溶解度）が、シクロデキストリンを含まない水または水性溶媒中での溶解度よりも上昇すると考えられる。例えば、α－シクロデキストリンの空孔内径は０．４５～０．６ｎｍ、β－シクロデキストリンの空孔内径は０．６～０．８ｎｍ、γ－シクロデキストリンの空孔内径は０．８～０．９５ｎｍと言われており、活性化合物が、これら空孔内径と相互作用（包接）できる領域（特に疎水性領域）を有している場合、活性化合物はシクロデキストリン存在下で溶解度が上昇すると考えられる。
　また、近年は、ヒドロキシ－β－シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン、スルフォブチルエーテル－β－シクロデキストリンのようなシクロデキストリンが入手可能であり、これらシクロデキストリンでも活性化合物の溶解度を上昇させることができる。しかしながら、これらシクロデキストリンの場合には、活性化合物の溶解度上昇は必ずしもシクロデキストリンの環状構造内部（空孔）への包接によるものではなく、ヒドロキシ基やスルフォブチルエーテル基との分子間相互作用によるものであることが知られている。本発明においては、このような分子間相互作用に基づく溶解度上昇でもよい。
　本発明において、抗腫瘍剤としては、特に限定されないが、例えば、塩酸イリノテカン、塩酸ノギテカン、エキサテカン、ＲＦＳ－２０００、Ｌｕｒｔｏｔｅｃａｎ、ＢＮＰ－１３５０、Ｂａｙ－３８３４４１、ＰＮＵ－１６６１４８、ＩＤＥＣ－１３２、ＢＮ－８０９１５、ＤＢ－３８、ＤＢ－８１、ＤＢ－９０、ＤＢ－９１、ＣＫＤ－６２０、Ｔ－０１２８、ＳＴ－１４８０、ＳＴ－１４８１、ＤＲＦ－１０４２、ＤＥ－３１０等のカンプトテシン誘導体；ドセタキセル水和物、ドセタキセル、パクリタキセル、ＩＮＤ－５１０９、ＢＭＳ－１８４４７６、ＢＭＳ－１８８７９７、Ｔ－３７８２、ＴＡＸ－１０１１、ＳＢ－ＲＡ－３１０１２、ＳＢＴ－１５１４、ＤＪ－９２７等のタキサン誘導体；イホスファミド、塩酸ニムスチン、カルボコン、シクロホスファミド、ダカルバジン、チオテパ、ブスルファン、メルファラン、ラニムスチン、リン酸エストラムスチンナトリウム、６－メルカプトプリンリボシド、エノシタビン、塩酸ゲムシタビン、カルモフール、シタラビン、シタラビンオクホスファート、テガフール、ドキシフルリジン、ヒドロキシカルバミド、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン、リン酸フルダラビン、アクチノマイシンＤ、塩酸アクラルビシン、塩酸イダルビシン、塩酸ピラルビシン、塩酸エピルビシン、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、エピルビシン、ピラルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、塩酸ピラルビシン、塩酸ブレオマイシン、ジノスタチンスチマラマー、ネオカルチノスタチン、マイトマイシンＣ、硫酸ブレオマイシン、硫酸ペプロマイシン、エトポシド、酒石酸ビノレルビン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、硫酸ビンブラスチン、塩酸アムルビシン、ゲフィニチブ、エキセメスタン、カペシタビン、ＴＮＰ－４７０、ＴＡＫ－１６５、ＫＷ－２４０１、ＫＷ－２１７０、ＫＷ－２８７１、ＫＴ－５５５５、ＫＴ－８３９１、ＴＺＴ－１０２７、Ｓ－３３０４、ＣＳ－６８２、ＹＭ－５１１、ＹＭ－５９８、ＴＡＴ－５９、ＴＡＳ－１０１、ＴＡＳ－１０２、ＴＡ－１０６、ＦＫ－２２８、ＦＫ－３１７、Ｅ７０７０、（８Ｅ、１２Ｅ、１４Ｅ）－７－｛（４－シクロヘプチルピペラジン－１－イル）カルボニル｝オキシ－３、６、１６、２１－テトラヒドロキシ－６、１０、１２、１６、２０－ペンタメチル－１８、１９－エポキシトリコサ－８、１２、１４－トリエン－１１－オリド（Ｅ７１０７）、エリブリン、メシル酸エリブリン、ＫＲＮ－７００、ＫＲＮ－５５００、Ｊ－１０７０８８、ＨＭＮ－２１４、ＳＭ－１１３５５、ＺＤ－０４７３等を挙げることができる。上記抗腫瘍剤において、塩として記載している化合物は、任意の塩であってもよく、フリー体であってもよい。また、フリー体として記載している化合物は、任意の塩であってもよい。活性化合物としては、上記化合物またはその薬理学的に許容される塩からなる群から選択されるが、例えば、（８Ｅ、１２Ｅ、１４Ｅ）－７－｛（４－シクロヘプチルピペラジン－１－イル）カルボニル｝オキシ－３、６、１６、２１－テトラヒドロキシ－６、１０、１２、１６、２０－ペンタメチル－１８、１９－エポキシトリコサ－８、１２、１４－トリエン－１１－オリド（Ｅ７１０７）、エリブリン、ドキソルビシン、エピルビシン、ピラルビシン、ダウノルビシン、ドセタキセルおよびパクリタキセルならびにこれらの薬理学的に許容される塩からなる群から選択される。
　抗菌剤としては、特に限定されないが、例えば、アンホテリシンＢ、セフォチアム－ヘキセシル、セファロスポリン、クロラムフェニコール、ジクロフェナック等を挙げることができる。上記抗菌剤において、化合物は、任意の塩であってもよい。
　抗炎症剤としては、特に限定されないが、例えば、プロスタグランジン類（ＰＧＥ１、ＰＧＥ２）、デキサメサゾン、ハイドロコルチゾン、ピロキシカム、インドメタシン、プレドニゾロン等を挙げることができる。上記抗炎症剤において、化合物は、任意の塩であってもよい。
　抗心筋梗塞剤としては、特に限定されないが、例えば、アデノシン、アテノロール、ピルジカイニド等を挙げることができる。上記抗心筋梗塞剤において、化合物は、任意の塩であってもよい。
　造影剤としては、特に限定されないが、例えば、イオパミドール、イオキサグル酸、イオヘキソール、イオメプロール等を挙げることができる。上記造影剤において、化合物は、任意の塩であってもよい。
［シクロデキストリン］
　本発明において、シクロデキストリンは、活性化合物と複合体を形成するものであれば、特に限定されるものではない。シクロデキストリンは、複数のグルコース単位が環状にα－（１，４）－結合したものであり、種々の置換基を有してもよい。６～８個のグルコース単位により構成されるシクロデキストリン（それぞれα、β、γ－シクロデキストリンと呼ばれる。）およびこれらの誘導体が安定であり好ましい。
　シクロデキストリンは、活性化合物等に応じて適宜選択することができる。具体的には、シクロデキストリン自体の水への溶解度が高いことが好ましい。これにより、より多くのシクロデキストリンをリポソーム内相に封入することが容易となる。より具体的には、シクロデキストリンは、水への溶解度が１０ｍｇ／ｍＬ以上であるものが好ましく、５０ｍｇ／ｍＬ以上であるものがより好ましく、１００ｍｇ／ｍＬ以上であるものがさらに好ましい。
　また、シクロデキストリンは、活性化合物との会合定数の大きいものが好ましい。例えば、活性化合物の大きさに応じてシクロデキストリンにおけるグルコース単位の数を選択することでより高い会合定数を得ることができる。また、会合定数がｐＨに依存する場合には、リポソーム内相のｐＨにおける会合定数が大きくなるようシクロデキストリンを選択することが好ましい。これらによりシクロデキストリン存在下での活性化合物の溶解度（みかけの溶解度）をより向上させることができる。具体的には、活性化合物とシクロデキストリンの会合定数が、１００以上であることが好ましく、１０００以上であることがより好ましい。
　さらに、目的に応じて、シクロデキストリン自体の安全性や使用実績などに応じて好ましいシクロデキストリンを選択することができる。
　具体的には、シクロデキストリンとして、例えば、α－シクロデキストリン、β－シクロデキストリン、γ－シクロデキストリン、ヘキサキス（２，３，６－トリ－Ｏ－アセチル）－α－シクロデキストリン、ヘプタキス（２，３，６－トリ－Ｏ－アセチル）－β－シクロデキストリン、オクタキス（２，３，６－トリ－Ｏ－アセチル）－γ－シクロデキストリン、アセチル化α－シクロデキストリン、アセチル化β－シクロデキストリン、アセチル化γ－シクロデキストリン、ヘキサキス（２，３，６－トリ－Ｏ－メチル）－α－シクロデキストリン、ヘプタキス（２，３，６－トリ－Ｏ－メチル）－β－シクロデキストリン、オクタキス（２，３，６－トリ－Ｏ－メチル）－γ－シクロデキストリン、ヘキサキス（２，６－ジ－Ｏ－メチル）－α－シクロデキストリン、ヘプタキス（２，６－ジ－Ｏ－メチル）－β－シクロデキストリン、オクタキス（２，６－ジ－Ｏ－メチル）－γ－シクロデキストリン、部分メチル化α－シクロデキストリン、部分メチル化β－シクロデキストリン、部分メチル化γ－シクロデキストリン、２－Ｏ－（２－ヒドロキシ）プロピル－α－シクロデキストリン、２－Ｏ－（２－ヒドロキシ）プロピル－β－シクロデキストリン、２－Ｏ－（２－ヒドロキシ）プロピル－γ－シクロデキストリン、（２－ヒドロキシ）プロピル－α－シクロデキストリン（ヒドロキシプロピル－α－シクロデキストリン、ＨＰ－α－シクロデキストリン）、（２－ヒドロキシ）プロピル－β－シクロデキストリン（ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン、ＨＰ－β－シクロデキストリン）、（２－ヒドロキシ）プロピル－γ－シクロデキストリン（ヒドロキシプロピル－γ－シクロデキストリン、ＨＰ－γ－シクロデキストリン）、カルボキシルメチル化α－シクロデキストリン、カルボキシルメチル化β－シクロデキストリン、カルボキシルメチル化γ－シクロデキストリン、スクシニル化α－シクロデキストリン、スクシニル化β－シクロデキストリン、スクシニル化γ－シクロデキストリン、ヘプタキス（３－Ｏ－アリル－２，６－ジ－Ｏ－メチル）－β－シクロデキストリン、カルボキシルエチル化α－シクロデキストリン、カルボキシルエチル化β－シクロデキストリン、カルボキシルエチル化γ－シクロデキストリン、ヘキサキス（２，６－ジ－Ｏ－ｎ－ペンチル）－α－シクロデキストリン、ヘプタキス（２，６－ジ－Ｏ－ｎ－ペンチル）－β－シクロデキストリン、オクタキス（２，６－ジ－Ｏ－ｎ－ペンチル）－γ－シクロデキストリン、ヘキサキス（３－Ｏ－ｎ－ブチル－２，６－ジ－Ｏ－ｎ－ペンチル）－α－シクロデキストリン、ヘプタキス（３－Ｏ－ｎ－ブチル－２，６－ジ－Ｏ－ｎ－ペンチル）－β－シクロデキストリン、オクタキス（３－Ｏ－ｎ－ブチル－２，６－ジ－Ｏ－ｎ－ペンチル）－γ－シクロデキストリン、ヘプタキス（２，６－ジ－Ｏ－ｎ－ブチル）－β－シクロデキストリン、ｎ－ブチル化α－シクロデキストリン、ｎ－ブチル化β－シクロデキストリン、ｎ－ブチル化γ－シクロデキストリン、ヘキサキス（２，３，６－トリ－Ｏ－ベンゾイル）－α－シクロデキストリン、ヘプタキス（２，３，６－トリ－Ｏ－ベンゾイル）－β－シクロデキストリン、オクタキス（２，３，６－トリ－Ｏ－ベンゾイル）－γ－シクロデキストリン、パルミチル化β－シクロデキストリン、６－Ｏ－モノトシル化β－シクロデキストリン、エチル化α－シクロデキストリン、エチル化β－シクロデキストリン、エチル化γ－シクロデキストリン、ヘプタキス（２，６－ジ－Ｏ－エチル）－β－シクロデキストリン、ヘキサキス（２，３，６－トリ－Ｏ－エチル）－α－シクロデキストリン、ヘプタキス（２，３，６－トリ－Ｏ－エチル）－β－シクロデキストリン、オクタキス（２，３，６－トリ－Ｏ－エチル）－γ－シクロデキストリン、６－モノデオキシ－６－モノアミノ－β－シクロデキストリン塩酸塩、ヘキサキス（３－Ｏ－アセチル－２，６－ジ－Ｏ－ｎ－ペンチル）－α－シクロデキストリン、ヘプタキス（３－Ｏ－アセチル－２，６－ジ－Ｏ－ｎ－ペンチル）－β－シクロデキストリン、オクタキス（３－Ｏ－アセチル－２，６－ジ－Ｏ－ｎ－ペンチル）－γ－シクロデキストリン、ヘキサキス（２，６－ジ－Ｏ－ｎ－ペンチル－３－Ｏ－トリフルオロアセチル）－α－シクロデキストリン、ヘプタキス（２，６－ジ－Ｏ－ｎ－ペンチル－３－Ｏ－トリフルオロアセチル）－β－シクロデキストリン、オクタキス（２，６－ジ－Ｏ－ｎ－ペンチル－３－Ｏ－トリフルオロアセチル）－γ－シクロデキストリン、ヘキサキス（２，６－ジ－Ｏ－メチル－３－Ｏ－ｎ－ペンチル）－α－シクロデキストリン、ヘプタキス（２，６－ジ－Ｏ－メチル－３－Ｏ－ｎ－ペンチル）－β－シクロデキストリン、オクタキス（２，６－ジ－Ｏ－メチル－３－Ｏ－ｎ－ペンチル）－γ－シクロデキストリン、（２－ヒドロキシ）エチル化α－シクロデキストリン、（２－ヒドロキシ）エチル化β－シクロデキストリン、（２－ヒドロキシ）エチル化γ－シクロデキストリン、ヘキサキス（２，３，６－トリ－Ｏ－ｎ－オクチル）－α－シクロデキストリン、ヘプタキス（２，３，６－トリ－Ｏ－ｎ－オクチル）－β－シクロデキストリン、オクタキス（２，３，６－トリ－Ｏ－ｎ－オクチル）－γ－シクロデキストリン、ヘキサキス（２，３－ジ－Ｏ－アセチル－６－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－α－シクロデキストリン、ヘプタキス（２，３－ジ－Ｏ－アセチル－６－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－β－シクロデキストリン、オクタキス（２，３－ジ－Ｏ－アセチル－６－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－γ－シクロデキストリン、スクシニル化（２－ヒドロキシ）プロピルα－シクロデキストリン、スクシニル化（２－ヒドロキシ）プロピルβ－シクロデキストリン、スクシニル化（２－ヒドロキシ）プロピルγ－シクロデキストリン、ヘキサキス（６－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－α－シクロデキストリン、ヘプタキス（６－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－β－シクロデキストリン、オクタキス（６－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－γ－シクロデキストリン、ヘキサキス（６－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル－２，３－ジ－Ｏ－メチル）－α－シクロデキストリン、ヘプタキス（６－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル－２，３－ジ－Ｏ－メチル）－β－シクロデキストリン、オクタキス（６－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル－２，３－ジ－Ｏ－メチル）－γ－シクロデキストリン、ヘキサキス（２，６－ジ－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－α－シクロデキストリン、ヘプタキス（２，６－ジ－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－β－シクロデキストリン、オクタキス（２，６－ジ－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－γ－シクロデキストリン、オクタメシチレン－γ－シクロデキストリン、ヘキサキス（２，３，６－トリ－Ｏ－トリフルオロアセチル）－α－シクロデキストリン、ヘプタキス（２，３，６－トリ－Ｏ－トリフルオロアセチル）－β－シクロデキストリン、オクタキス（２，３，６－トリ－Ｏ－トリフルオロアセチル）－γ－シクロデキストリン、スルホプロピル化α－シクロデキストリン、スルホプロピル化β－シクロデキストリン、スルホプロピル化γ－シクロデキストリン、６－Ｏ－モノマルトシル－β－シクロデキストリン、６－Ｏ－マルトシル－β－シクロデキストリン（いわゆるＧ２－β－シクロデキストリン）、（２－カルボメトキシ）プロポキシ－β－シクロデキストリン、ヘプタキス（３－Ｏ－アセチル－２，６－ジ－Ｏ－ｎ－ブチル）－β－シクロデキストリン、（２－シアノ）エチル－α－シクロデキストリン、（２－シアノ）エチル－β－シクロデキストリン、（２－シアノ）エチル－γ－シクロデキストリン、６－モノデオキシ－６－モノアジド－β－シクロデキストリン、６－モノデオキシ－６－モノイオド－β－シクロデキストリン、６Ａ，６Ｅ－ジデオキシ－６Ａ，６Ｂ－ジイオド－β－シクロデキストリン、６－モノデオキシ－６－モノブロモ－β－シクロデキストリン、６Ａ，６Ｂ－ジデオキシ－６Ａ，６Ｂ－ジブロモ－β－シクロデキストリン、スルホブチルエーテル－β－シクロデキストリン（いわゆるＳＢＥ－β－シクロデキストリン；カプチゾール）等を挙げることができる。シクロデキストリンは、これらのうち１種または２種以上の組み合わせであってもよい。
　これらのうち、水溶性の高いシクロデキストリン類が好ましいが、より好ましくはα－シクロデキストリン、γ－シクロデキストリン、ＨＰ－α－シクロデキストリン、ＨＰ－β－シクロデキストリン、ＨＰ－γ－シクロデキストリン、Ｇ２－β－シクロデキストリン、ＳＢＥ－β－シクロデキストリンであり、更に好ましくはα－シクロデキストリン、ＨＰ－β－シクロデキストリン、ＳＢＥ－β－シクロデキストリンを挙げることができる。
［脂質］
　本発明のリポソームは、膜構成成分として、リン脂質および／またはリン脂質誘導体を含むことが好ましい。リン脂質およびリン脂質誘導体としては、例えば、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、セラミドホスホリルエタノールアミン、セラミドホスホリルグリセロール、セラミドホスホリルグリセロールホスファート、１，２－ジミリストイル－１，２－デオキシホスファチジルコリン、プラスマロゲン、ホスファチジン酸等を挙げることができる。リン脂質およびリン脂質誘導体は、これらのうち１種または２種以上の組み合わせであってもよい。
　リン脂質およびリン脂質誘導体における脂肪酸残基は特に限定されないが、例えば、炭素数１２～２０の飽和または不飽和の脂肪酸残基を挙げることができ、具体的には、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸等の脂肪酸由来のアシル基を挙げることができる。また、卵黄レシチン、大豆レシチン等の天然物由来のリン脂質、および不飽和脂肪酸残基に部分的にまたは完全に水素添加した部分水素添加卵黄レシチン、（完全）水素添加卵黄レシチン、部分水素添加大豆レシチン、（完全）水素添加大豆レシチン等を用いることもできる。
　リポソームを調製する際に用いるリン脂質および／またはリン脂質誘導体の配合量（モル分率）は、特に限定されないが、リポソーム膜成分全体に対して１０～８０％が好ましく、３０～６０％がより好ましい。
　本発明のリポソームは、膜構成成分として、リン脂質および／またはリン脂質誘導体以外に、膜安定化剤としてコレステロール、コレスタノール等のステロール類、炭素数８～２２の飽和または不飽和のアシル基を有する脂肪酸類、α－トコフェロール等の酸化防止剤を含んでもよい。
　リポソームを調製する際に用いるこれらステロール類の配合量（モル分率）は、特に限定されないが、リポソーム膜成分全体に対して、１～６０％が好ましく、１０～５０％がより好ましく、３０～５０％がさらに好ましい。また、脂肪酸類の配合量（モル分率）は、特に限定されないが、リポソーム膜成分全体に対して、０～３０％が好ましく、０～２０％がより好ましく、０～１０％がさらに好ましい。酸化防止剤の配合量（モル分率）は酸化防止効果が得られる量が添加されれば十分であるが、リポソーム膜成分全体の０～１５％が好ましく、０～１０％がより好ましく、０～５％がさらに好ましい。
　本発明のリポソームは、膜構成成分として、機能性脂質または修飾脂質を含有していてもよい。
　機能性脂質として、血中滞留性脂質誘導体、温度変化感受性脂質誘導体、ｐＨ感受性脂質誘導体等を挙げることができる。修飾脂質として、ＰＥＧ化脂質、糖脂質、抗体修飾脂質、ペプチド修飾脂質等が挙げられる。
　血中滞留性脂質誘導体としては、例えば、グリコフォリン、ガングリオシドＧＭ１、ガングリオシドＧＭ３、グルクロン酸誘導体、グルタミン酸誘導体、ポリグリセリンリン脂質誘導体、ホスフォエタノールアミンとメトキシポリエチレングリコールの縮合体である、Ｎ－｛カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－２０００｝－１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン、Ｎ－｛カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－５０００｝－１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン、Ｎ－｛カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－７５０｝－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン、Ｎ－｛カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－２０００｝－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン（ＭＰＥＧ２０００－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン）、Ｎ－｛カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－５０００｝－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン等のポリエチレングリコール誘導体（メトキシポリエチレングリコール縮合体など）等を挙げることができる。リポソームが血中滞留性脂質誘導体を含有することにより、リポソームが外来異物として肝臓などにおいて捕捉されにくくなることで、リポソームの血中滞留性を向上させることなどが可能となる。
　温度変化感受性脂質誘導体としては、例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン等を挙げることができる。リポソームが温度変化感受性脂質誘導体を含有することにより、特定の温度においてリポソームを崩壊させる、リポソームの表面特性を変化させるなどが可能となる。さらに腫瘍等の標的部位の加温と組み合わせることで、標的部位でリポソームが崩壊し、標的部位に活性化合物を放出させることなどが可能となる。
　ｐＨ感受性脂質誘導体としては、例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン等を挙げることができる。リポソームがｐＨ感受性脂質誘導体を含有することにより、エンドサイトーシスによりリポソームが細胞へ取り込まれる際にリポソームとエンドソームとの膜融合を促し、活性化合物の細胞質への送達を改良することなどが可能となる。
　糖脂質、抗体修飾脂質およびペプチド修飾脂質としては、標的細胞または標的組織に親和性のある糖、抗体またはペプチドを結合した脂質が挙げられる。修飾脂質を用いることで、能動的にリポソームを標的細胞または標的組織に送達することができる。
　リポソームを調製する際に用いる機能性脂質または修飾脂質の配合量（モル分率）は、特に限定されないが、リポソーム膜構成成分脂質全体の０～５０％が好ましく、０～３０％がより好ましく、０～２０％がさらに好ましい。
［リポソーム］
　上記した通り、リポソームは脂質二重層により包囲された内相を有する微細閉鎖小胞である。
　理想的には、リポソームは、ａ）リポソーム準備液の外相を置換又は希釈した後では、シクロデキストリンがリポソーム内相から外相には漏れ出ないバリア能を有しており、ｂ）活性化合物をリポソーム外相から内相に導入するステップでは活性化合物を透過させ、しかもシクロデキストリンが外相には漏れ出ないバリア能を同時に併せ持つ膜透過性を有し、ｃ）活性化合物を内相にいったん封入した後では、活性化合物とシクロデキストリンとの複合体（「活性化合物／シクロデキストリン複合体」とも記す）ならびに仮に存在する場合はフリーの（複合体を形成していない）活性化合物およびシクロデキストリンのいずれもリポソーム外相には漏れ出ないバリア能を有していることが好ましい。また、医薬として用いる場合、リポソームは生体内で安定であることが好ましく、また、リポソームは、生体に投与した際に血中では活性化合物／シクロデキストリン複合体ならびに仮に存在する場合はフリーの活性化合物およびシクロデキストリンのいずれもリポソーム外相には漏れ出ないバリア能を有することが好ましい。
　実用可能なレベルでこのような膜透過性を有するリポソームのための膜構成成分の組成は、当業者であれば、必要に応じて後述する実施例を参照することで、活性化合物やシクロデキストリン、標的組織などに応じて適宜設定することができる（菊池寛他、「リポソームI－調製法と検定法－」、細胞工学, (1983), 2(9):pp.1136-1149および当該文献に引用される文献等参照）。
　なお、生体膜と同様にリポソーム膜の物質透過性は、その物質の分子量に大きく依存し、一般的には分子量１０００前後を境界として透過性が大きく変化すると考えられている。偶然にも安定なシクロデキストリンのうち一番小さなシクロデキストリンであるα―シクロデキストリンの分子量が９７３であり、β－シクロデキストリンの分子量が１１３５、γ－シクロデキストリンの分子量が１２９７、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰ－β―シクロデキストリン）の分子量が１３８０～１４８０であり、シクロデキストリンはリポソーム膜透過性が低い。このため、シクロデキストリンに応じて膜構成成分等を適切に設定することで、シクロデキストリンが一度リポソーム内相に封入されれば、後述するように温度を上げるなどにより膜流動性を上げたとしても、シクロデキストリンのリポソーム外相への漏出を十分に抑制することができる。一方で、活性化合物に応じて膜構成成分等を適切に設定することで、活性化合物はリポソーム膜を透過できる。活性化合物はリポソーム内相に入ると、シクロデキストリンとの複合体（一般に分子量が１０００を大きく超える）を形成し、リポソーム膜透過性が極めて低くなる。
　理論に拘束されるものではないが、このように、シクロデキストリンは、それ自身のリポソーム膜透過性が十分に低い性質のみならず、活性化合物と複合体を形成することで、シクロデキストリンの溶解度（みかけの溶解度）を上昇させ、さらに活性化合物と複合体を形成することで、活性化合物のリポソーム膜透過性を低下させる性質を有し、偶然ではあるが、本発明によるリポソームによる活性化合物の封入および保持にとって理想的な性質を有する。
　なお、医薬として用いる場合、リポソームが、標的組織、細胞または細胞内小器官に到達した後は、活性化合物または活性化合物／シクロデキストリン複合体がリポソームから放出されることが好ましい。リポソームは、一般に膜構成成分自体は生分解性であり、最終的には標的組織等で分解される。これにより、封入されていた活性化合物／シクロデキストリン複合体（および存在する場合はフリーの活性化合物）が放出されると考えられる。更に最終的には、活性化合物／シクロデキストリン複合体は、希釈効果、化学平衡または酵素によるシクロデキストリンの分解によってフリーの活性化合物を放出すると考えられる。また、リポソーム自体が細胞に取り込まれてもよい。
　また、リポソーム組成物は固形癌などの標的組織へのターゲティングばかりでなく、血液癌などへの活性化合物の送達にも用いることができ、血中での徐放性製剤（slow release formulation）や放出制御製剤（controlled release formulation）等として用いることも可能である。
　リポソームの粒子径は目的に応じて設定することができる。例えば、注射剤等としてＥＰＲ（Enhanced Permeability and Retention）効果により癌組織や炎症組織へとリポソームを送達することを意図する場合、リポソームの粒子径は、好ましくは３０～４００ｎｍ、より好ましくは５０～２００ｎｍである。また、マクロファージへとリポソームを送達することを意図する場合、リポソームの粒子径は、好ましくは３０～１０００ｎｍ、より好ましくは１００～４００ｎｍである。また、リポソーム組成物を経口製剤や経皮製剤として用いる場合など、リポソームの粒子径は、数ミクロンとすることができる。なお、(1)正常組織では（血管内皮細胞が密に血管壁を構成しているため）血管壁がバリアーとなり、高分子や特定の大きさのリポソームのような微細粒子は組織内に分布できないが、病変組織では（血管内皮細胞間に隙間ができていて）血管壁がルーズとなって血管透過性が亢進しており、高分子や微細粒子は血管外の組織に分布でき（enhanced permeability）、また、(2)正常組織ではリンパ系が発達しているが、病変組織ではリンパ系が発達していないためにいったん取り込まれた高分子や微細粒子が全身系に回収されずにその病変組織に留まる（enhanced retention）ことが知られており、ＥＰＲ効果と呼ばれている（松村、前田, Cancer Research, (1986), 46:pp.6387-6392）。これにより、リポソームの粒子径を調整することで、体内動態を制御することができる。
　なお、本発明において、リポソームの粒子径は、動的光散乱法（準弾性光散乱法）による重量平均粒子径を意味する。ここでは動的光散乱(Dynamic Light Scattering)測定器（例えば、Malvern Instruments Ltd社製Zetasizer Nano ZSモデルや大塚電子株式会社製ELS-8000）により測定された粒子径を示す。測定器は粒子のブラウン運動を測定し、確立された動的光散乱法理論に基づいて粒子径を決定している。
　リポソーム内相の溶媒は特に限定されるべきものではなく、例えば、リン酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝化生理食塩液等の緩衝液、生理食塩水、細胞培養用の培地などを挙げることができる。溶媒として、緩衝液を用いる場合には、緩衝剤の濃度が５～３００ｍＭであることが好ましく、１０～１００ｍＭであることがより好ましい。リポソーム内相のｐＨは、特に限定されるものではないが、３～１１が好ましく、４～９がより好ましい。
［リポソーム組成物］
　本発明によるとリポソーム組成物が提供される。リポソーム組成物は、リポソームを含み、リポソーム内相にシクロデキストリンおよび活性化合物をさらに含む。上記した通り、リポソーム組成物は、固体状および液体状のものを含む。リポソーム組成物が固体状のものの場合、後述するように所定の溶媒に溶解または懸濁することで、液体状のものとすることができる。また、リポソーム組成物が凍結した固体の場合には室温放置等により融解させることで、液体状のものとすることができる。
　リポソーム組成物におけるリポソームの濃度および活性化合物の濃度は、リポソーム組成物の目的、剤形等に応じて適宜設定することができる。リポソーム組成物が液剤の場合において、リポソームの濃度はリポソームの構成成分である全脂質の濃度として、０．２～１００ｍＭ、好ましくは１～３０ｍＭとすることができる。リポソーム組成物を医薬として用いる場合における活性化合物の濃度（用量）については後述する。リポソーム組成物におけるシクロデキストリンの量は、活性化合物に対して０．１～１０００モル当量が好ましく、１～１００モル当量がより好ましい。
　本発明におけるリポソームは、脂質二重層に活性化合物およびシクロデキストリンが分配されていてもよい。
　リポソーム組成物が液剤の場合におけるリポソーム組成物の溶媒（分散媒）は特に限定されるべきものではなく、例えば、リン酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝化生理食塩液等の緩衝液、生理食塩水、細胞培養用の培地などを挙げることができる。リポソーム組成物におけるリポソーム外相のｐＨは、特に限定されるものではないが、３～１１が好ましく、４～９がより好ましい。
　リポソーム組成物には、さらに、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、イノシトール、リボース、キシロース等の単糖類、乳糖、ショ糖、セロビオース、トレハロース、マルトース等の二糖類、ラフィノース、メレジトース等の三糖類、シクロデキストリン等の多糖類、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルチトール等の糖アルコールなどの糖や、グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、エチレングリコールモノアルキルエーテル、ジエチレングリコールモノアルキルエーテル、１，３－ブチレングリコールなどの多価アルコール等を加えてもよい。糖とアルコールとを組み合わせて用いてもよい。
　この溶媒（分散媒）に分散したリポソームを安定に長期間保存するには、凝集などの物理的安定性の面から、溶媒（分散媒）中の電解質を極力なくすことが好ましい。また、脂質の化学的安定性の面から、溶媒（分散媒）のｐＨを酸性から中性付近（ｐＨ３．０～８．０）に設定することや窒素バブリングにより溶存酸素を除去することが好ましい。
　リポソーム組成物に含まれる糖または多価アルコールの濃度は特に限定されないが、リポソームが溶媒に分散した状態において、例えば、糖の濃度は、２～２０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、５～１０％（Ｗ／Ｖ）がより好ましい。多価アルコールの濃度は、１～５％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、２～２．５％（Ｗ／Ｖ）がより好ましい。これら溶媒をリポソーム分散液におけるリポソーム外相として用いることもでき、リポソーム準備液のリポソーム外相をこれら溶媒で置換または希釈することで、リポソーム外相の溶液をこれら溶液とすることができる。
　リポソーム組成物の固形製剤は、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、イノシトール、リボース、キシロース糖の単糖類、乳糖、ショ糖、セロビオース、トレハロース、マルトース等の二糖類、ラフィノース、メレジノース等の三糖類、シクロデキストリン等の多糖類、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルチトール等の糖アルコールなどの糖を含むことが好ましいが、より好ましくは、グルコース、乳糖、ショ糖、トレハロース、ソルビトールの配合であり、さらに好ましくは、乳糖、ショ糖、トレハロースの配合である。これにより、固形製剤を安定に長期間保存することができる。また、凍結する場合には、固形製剤は、グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、エチレングリコールモノアルキルエーテル、ジエチレングリコールモノアルキルエーテル、１，３－ブチレングリコール等の多価アルコール（水溶液）を含むことが好ましい。多価アルコール（水溶液）は、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールがより好ましく、グリセリン、プロピレングリコールがさらに好ましい。これにより、固形製剤を安定に長期間保存することができる。糖と多価アルコールとを組み合わせて用いてもよい。
［リポソーム組成物の製造方法］
　本発明によるとリポソーム組成物を製造する方法が提供される。リポソーム組成物を製造する方法は、リポソームを含み、リポソーム内相にシクロデキストリンをさらに含むリポソーム分散液を供するステップと、前記リポソーム分散液と活性化合物とを混合するステップと、前記リポソーム分散液のリポソーム内相に前記活性化合物を導入するステップとを含む。
　リポソーム分散液を供するステップは、リポソーム準備液を供するステップと、前記リポソーム準備液のリポソーム外相を置換または希釈することにより、リポソーム外相における前記シクロデキストリンの濃度を調整するステップとを含むことが好ましい。
　リポソーム準備液は、シクロデキストリン溶液中でリポソームを調製することで調製できる。シクロデキストリン溶液は、前記シクロデキストリンを含む溶液であれば特に限定されるものではない。
　シクロデキストリン溶液におけるシクロデキストリンの濃度は、より濃いほど好ましく、シクロデキストリンの溶媒（後述）への溶解度や粘度等に応じて設定することができる。これによりリポソーム分散液のリポソーム内相におけるシクロデキストリン濃度をより濃くでき、より多くの活性化合物を封入できる。例えば、シクロデキストリン溶液におけるシクロデキストリンの濃度は、１００～２５０ｍＭ、好ましくは１００～２００ｍＭとすることができる。
　シクロデキストリン溶液の溶媒としては、例えば、リン酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝化生理食塩液等の緩衝液、生理食塩水、細胞培養用の培地などを挙げることができる。シクロデキストリン溶液のｐＨは、適宜設定することができ特に限定されるものではないが、３～１１が好ましく、４～９がより好ましく、５～８がさらに好ましい。
　シクロデキストリン溶液は、前記溶媒にシクロデキストリンを混合して溶解させることにより得ることができる。必要に応じて、例えば５０℃程度に溶媒を加温して溶解させることにより、より迅速にシクロデキストリン溶液を得ることもできる。
　リポソームの調製は、リピドフィルム法（ボルテックス法、）、逆相蒸発法、超音波法、プレーベジクル法、エタノール注入法、Ｆｒｅｎｃｈ　Ｐｒｅｓｓ法、コール酸除去法、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００バッチ法、Ｃａ２＋融合法、エーテル注入法、アニーリング法、凍結融解融合法等が挙げられる。
　リポソームの調製における各種条件（膜構成成分の量、温度など）は、リポソームの調製方法や目的とするリポソームの組成、粒子径等に応じて適宜設定することができる（前掲、菊池(1983)等参照）。ただし、シクロデキストリンは、リポソームから脂質（特にコレステロールなど）を取り去る効果があることが知られている。このため、この効果を考慮し、リポソームの調製に用いる脂質の量を設定することが好ましい。
　必要に応じて任意に、リポソームの粒子径を調整することができる。粒子径は、例えば孔径のそろったメンブランフィルターを用いて、高圧力下でイクストルージョン（押し出し濾過）を行うことで調整することができる。粒子径の調整は、本発明のリポソーム組成物の製造における任意のタイミングで行うことができ、例えば、リポソーム準備液におけるリポソーム外相を調整する前、リポソーム準備液におけるリポソーム外相を調整した後、または活性化合物をリポソーム内相へ導入した後に行うことができる。粒子径の調整は、活性化合物をリポソーム内相へ導入する前に行うことが好ましく、リポソーム準備液におけるリポソーム外相を調整する前に行うことがより好ましい。
　得られたリポソーム準備液のリポソーム外相を置換または希釈することにより、リポソーム外相における前記シクロデキストリンの濃度を調整することで、リポソーム分散液を得ることができる。リポソーム外相の置換または希釈は、１回で行ってもよく、各種置換または希釈する方法を組み合わせて複数回行ってもよい。
　リポソーム準備液のリポソーム外相を置換する方法としては、透析、遠心分離、ゲルろ過等の方法が挙げられる。
　透析は、例えば、透析膜を用いて行うことができる。透析膜としては、セルロースチューブやスペクトラポア等の分子量で分画する膜が挙げられる。
　遠心分離は、例えば、遠心加速度が、好ましくは１００，０００ｇ以上、より好ましくは３００，０００ｇ以上で実施することができる。遠心によりリポソーム外相を置換することで、リポソーム外相の置換とあわせて、リポソームの濃縮を行うことができる。
　ゲルろ過は、例えば、ＳｅｐｈａｄｅｘやＳｅｐｈａｒｏｓｅ等のカラムを用いて、分子量に基づいて分画することにより実施することができる。
　リポソーム準備液のリポソーム外相を希釈する方法としては、例えばシクロデキストリンを含有しない溶液をリポソーム外相に添加する方法が挙げられる。
　リポソーム外相を置換および／または希釈する際に用いる溶媒（分散媒）としては、例えばリン酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝化生理食塩液等の緩衝液、生理食塩水、細胞培養用の培地などを挙げることができる。当該溶媒のｐＨは、特に限定されるものではないが、３～１１であることが好ましく、４～１０であることがより好ましく、５～１０がさらに好ましい。後述するように、活性化合物のリポソーム内相への導入にｐＨ勾配を利用することもできる。この場合、リポソーム外相が目的のｐＨとなるように溶媒のｐＨを設定することができる。
　得られたリポソーム分散液は、リポソーム外相に実質的にシクロデキストリンを含有していないことがより好ましい。これにより、より効果的に活性化合物をリポソーム内相に導入することができる。
　しかしながら、何らかの理由でリポソーム分散液のリポソーム外相にシクロデキストリンを添加した場合など、リポソーム分散液が、リポソーム外相にシクロデキストリンを含有していても、活性化合物をリポソーム内相に導入することができる。この場合であっても、リポソーム分散液は、リポソーム外相と比べてより高濃度のシクロデキストリンをリポソーム内相に含むことが好ましい。特に、リポソーム外相のシクロデキストリン濃度がリポソーム内相のシクロデキストリン濃度と比して、１／２以下あることが好ましく、１／５以下であることがより好ましい。
　必要に応じて任意に、活性化合物のリポソーム内相への導入にｐＨ勾配を利用することもできる。この場合、リポソーム分散液におけるリポソーム内相およびリポソーム外相のｐＨの差は、好ましくは１～５であり、より好ましくは２～３である。活性化合物の種類に応じて、リポソーム内相と外相のいずれのｐＨを高くすることもできる。一方で、リポソーム内相とリポソーム外相のｐＨの差が実質的になくても、すなわち、リポソーム外相とリポソーム内相とのｐＨが実質的に同じであってもよい。ｐＨ勾配は、ｐＨ勾配法で用いられる従来公知の化合物を用いることにより調整できるが、例えばアルギニン、ヒスチジン、グリシンなどのアミノ酸、アスコルビン酸、安息香酸、クエン酸、グルタミン酸、リン酸、酢酸、プロピオン酸、酒石酸、炭酸、乳酸、ホウ酸、マレイン酸、フマル酸、りんご酸、アジピン酸、塩酸、硫酸などの酸、上記酸のナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩などの塩、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、アンモニア水、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ性化合物等が挙げられる。
　また、必要に応じて任意に、活性化合物のリポソーム内相への導入に硫酸アンモニウム等のイオン勾配を利用することもできる。この場合、リポソーム分散液におけるリポソーム内相およびリポソーム外相のイオン濃度の差は大きければ大きいほど良いが、好ましくは１０ｍＭ以上、より好ましくは２０ｍＭ以上、さらに好ましくは５０ｍＭ以上あることが望ましい。
　イオン勾配法において用いるイオンとしては、特に限定されるものではないが、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、ホウ酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム、酒石酸アンモニウム、コハク酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等が挙げられる。また、イオン勾配法において、リポソーム内相のイオン濃度は、活性化合物の種類に応じて適宜選択できるが、高ければ高いほどよく、好ましくは１０ｍＭ以上、より好ましくは２０ｍＭ以上、さらに好ましくは５０ｍＭ以上ある。活性化合物の種類に応じて、リポソーム内相と外相のいずれのイオン濃度を高くすることもできる。一方で、リポソーム内相とリポソーム外相のイオン濃度の差が実質的になくても、すなわち、リポソーム外相とリポソーム内相とのイオン濃度が実質的に同じであってもよい。リポソーム外相を置換または希釈することによっても、イオン勾配を調整することもできる。
　リポソーム分散液におけるリポソームの脂質濃度は、１～１００ｍＭであることが好ましく、１～５０ｍＭであることがより好ましい。これらの範囲において、リポソーム分散液の物性を損なうことなく、より多くのリポソーム粒子を好適に形成することができる。
　得られたリポソーム分散液と活性化合物とを混合し、リポソーム分散液のリポソーム内相に活性化合物を導入することで、リポソーム組成物を得ることができる。導入するステップは、リポソーム分散液と活性化合物との混合液におけるリポソームの膜透過性を上げるステップとを含むことが好ましい。これにより、活性化合物のリポソームへの封入をより短時間に行うことができる。しかしながら、リポソーム分散液と活性化合物とを混合した後、リポソームの膜透過性を上げるための操作を特に行わなくても、時間をかければ活性化合物をリポソームへ封入することができる。
　活性化合物を混合するステップにおいて、活性化合物の物性に応じて、活性化合物として、溶媒に溶解したものや、固体状のものを用いることができる。溶媒は特に限定されるものではなく、例えば、リポソーム分散液におけるリポソーム外相と同じものを用いることができる。また、活性化合物の溶液を添加して活性化合物をリポソーム分散液と混合することもできる。混合する活性化合物の量は、リポソーム分散液におけるシクロデキストリンに対して好ましくは０．００１～１０モル当量、より好ましくは０．０１～１モル当量である。
　得られた混合液におけるリポソームの膜透過性を上げる方法として、混合液を加熱する方法、混合液に膜流動化剤を添加する方法等が挙げられる。
　混合液を加熱する場合、一般的には、より高い温度に昇温することで、より効率的に活性化合物をリポソーム内相に導入できる。具体的には、活性化合物や用いるリポソーム膜構成成分の熱的安定性を考慮して、昇温する温度を設定することが好ましい。特に、昇温する温度は、リポソームの脂質二重膜の相転移温度以上とすることが好ましい。また、リポソーム内相に活性化合物を導入するステップにおいて、昇温する温度は特に限定されるものではないが、例えば、５℃以上であることが好ましく、室温、例えば、２０℃以上であることがより好ましく。また、相転移温度以上とすることが好ましい。しかしながら、これら昇温する温度は本発明を何ら限定するものではない。
　リポソームの脂質二重膜の「相転移温度」とは、昇温状態での示差熱分析における吸熱開始温度（吸熱反応が始まった際の温度）を意味する。示差熱分析とは、試料および基準物質の温度を変化させながら、当該試料と基準物質の温度差を時間または温度の関数として測定することで試料の熱特性を分析することができる技術である。リポソームの膜構成成分について示差熱分析を行った場合、温度の上昇につれリポソーム膜成分の流動化が起こり、吸熱反応が観察される。本技術分野において広く知られているように、リポソームの膜成分によって吸熱反応が観察される温度域は大きく変化する。例えばリポソーム膜成分が純粋な脂質で構成される場合、吸熱反応が観察される温度域は非常に狭く、吸熱反応は、吸熱ピーク温度に対して±１℃の範囲内で観察されることが多い。一方で、リポソーム膜成分が複数の脂質で構成される場合、特に天然物由来の脂質で構成される場合など、吸熱反応が観察される温度域が広くなる傾向があり、吸熱反応は、吸熱ピーク温度に対して例えば±５℃の範囲内で観察される（すなわちブロードなピークが観察される）ことがある。本発明において、リポソームの脂質二重膜の相転移温度以上に昇温することで、リポソームの膜流動性が上昇し、活性化合物の膜透過性が上昇すると考えられる。
　例えば、活性化合物や用いるリポソーム膜構成成分の熱的安定性等にもよるが、リポソームの脂質二重膜の相転移温度～相転移温度＋２０℃の温度範囲であることが好ましく、相転移温度～相転移温度＋１０℃の温度範囲であることがより好ましく、相転移温度＋５℃～相転移温度＋１０℃の温度範囲であることがさらに好ましい。
　一般的には、昇温する温度は、通常２０～１００℃であり、好ましくは４０～８０℃、より好ましくは４５～６５℃であり、相転移温度以上であることが好ましい。
　具体的には、ジパルミトイルホスファチジルコリン（単体での相転移温度：４１℃）とコレステロールを主体としたリポソーム膜の場合には、その組成にもよるが、一般に昇温温度は、４０～６０℃が好ましく、４５～５０℃がより好ましい。また、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ，単体での相転移温度：５０～６０℃）とコレステロールを主体としたリポソーム膜の場合には、その組成にもよるが、一般に昇温温度は、５０～７０℃が好ましく、５５～６５℃がより好ましい。しかしながら、これら昇温する温度は本発明を何ら限定するものではない。
　昇温するステップにおいて、相転移温度以上の温度に維持する時間は特に限定されるものではなく、例えば、数秒～３０分の範囲で適宜設定することが可能であるが、活性化合物や脂質の熱的安定性や、効率的な大量生産を考慮すれば、短時間で処理することが望ましい。すなわち、昇温維持時間は１分～３０分であることが好ましく、２分～５分であることがより好ましい。しかしながら、これら温度維持の時間は本発明を何ら限定するものではない。
　また、上記した通り、得られた混合液に膜流動化剤を添加（すなわち、リポソームの外相側に添加）することでも、リポソームの膜透過性を上げることができる。膜流動化剤として、水系溶媒に可溶な有機溶媒、界面活性剤、酵素等を挙げることができる。より具体的には、有機溶媒として、たとえばエチルアルコール、ベンジルアルコール等の一価アルコール類、グリセリン、プロピレングリコール等の多価アルコール類、ジメチルスルホキサイド（ＤＭＳＯ）等の非プロトン性極性溶媒を挙げることができる。界面活性剤として、脂肪酸ナトリウム、モノアルキル硫酸塩、モノアルキルリン酸塩等の陰イオン系界面活性剤、アルキルトリメチルアンモニウム塩等の陽イオン系面活性剤、アルキルジメチルアミンオキシド等の両性界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、アルキルモノグリセリルエーテル、脂肪酸ソルビタンエステル等の非イオン性界面活性剤を挙げることができる。酵素として、コリンエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ等を挙げることができる。当業者であれば、リポソーム膜構成成分の組成、膜流動化剤などに応じて、膜流動化剤の添加による活性化合物の封入の効率化の程度や、リポソームの安定性などを考慮して、膜流動化剤の量を設定することができる。
　理論に拘束されるものではないが、本発明によると、リポソーム内相にシクロデキストリンを予め封入することで、以下のメカニズムでリポソーム外相に添加した活性化合物がリポソーム内相に自動的に移動するものと考えられる。すなわち、活性化合物にとって、リポソーム内相における溶解度がリポソーム外相での溶解度よりも高い条件、つまりリポソーム内相がリポソーム外相よりもエネルギー的に安定な条件であれば、リポソーム膜を透過できる活性化合物は、活性化合物の濃度勾配に逆らってリポソーム膜を透過し、リポソーム外相からリポソーム内相へと移動すると考えられる。上記した通り、一度リポソーム内相に移動した活性化合物はシクロデキストリンと複合体を形成することで、リポソーム外相へと透過できなくなり、リポソーム内相に保持されると考えられる。
　なお、上記した通り、従来から、シクロデキストリンは生体膜やリポソーム膜から脂質（特にコレステロール）を取り去る効果があることが知られており、例えば、シクロデキストリンにより赤血球が溶血することが報告されている。このため、リポソームを調製するにあたって、リポソーム内相に予めシクロデキストリンを封入するという発想は困難であったと考えられる。
　本発明のリポソーム組成物の製造方法は、前記導入するステップの後に、得られたリポソーム組成物のリポソーム外相を調整するステップ、および／または、得られたリポソーム組成物を乾燥させるステップをさらに含むことができる。
　すなわち、リポソーム組成物を液剤とする場合、上記導入するステップにより得られた液体状のリポソーム組成物をそのまま最終的なリポソーム組成物とすることができ、または得られた液体状のリポソーム組成物におけるリポソーム外相を調整（置換等）することで最終的なリポソーム組成物とすることができる。この際のリポソーム外相の調整は、リポソーム準備液におけるリポソーム外相の調整と同様に行うことができる。リポソーム組成物が液剤である場合、そのまま使用に供することができる。
　また、リポソーム組成物を固形製剤とする場合、上記導入するステップにより得られた液体状のリポソーム組成物を乾燥させることにより最終的な固体状のリポソーム組成物とすることができる。リポソーム組成物を乾燥させる方法としては、凍結乾燥や噴霧乾燥等を挙げることができる。リポソーム組成物が固形製剤の場合、リポソーム組成物は適当な溶媒に溶解または懸濁させることで液剤として使用に供することができる。溶媒は、リポソーム組成物の使用の目的等に応じて適宜設定することができ、例えばリポソーム組成物を注射剤として用いる場合、溶媒は、滅菌蒸留水であることが好ましい。リポソーム組成物を医薬として用いる場合、医者や患者により、例えば固形製剤を封入したバイアルに溶媒を注入することで、このような用時調製を行うことができる。また、液体状のリポソーム組成物を凍結させた固形製剤の場合、凍結状態で保存し、使用時に室温で放置融解または加温による急速融解により液体状に戻すことで液剤として使用に供することができる。
［医薬組成物等］
　本発明のリポソーム組成物は、医薬分野において治療薬、診断薬等の医薬組成物として用いることができる。リポソーム組成物は、例えば、活性化合物として抗腫瘍剤を用いることで治療薬として用いることができ、造影剤を用いることで診断薬として用いることができる。リポソーム組成物は、化粧料、食品添加物としても用いることができる。
　本発明のリポソーム組成物を医薬組成物として用いる場合、リポソーム組成物は、注射（静注、動注、局所注射）、経口、経鼻、経皮、経肺、点眼により投与することができ、特に静脈注射、皮下注射、皮内注射、動脈内注射の他、標的とする細胞や臓器に対しての局所注射などの注射が好ましい。経口投与する場合のリポソーム組成物の剤形としては、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、カプセル剤、内服液剤等を挙げることができる。非経口投与する場合のリポソーム組成物の剤形としては、例えば、注射剤、点滴剤、点眼剤、軟膏剤、座剤、懸濁剤、パップ剤、ローション剤、エアゾール剤、プラスター剤等を挙げることができ、特に注射剤、点滴剤が好ましい。
　医薬組成物の投与量は、対象となる疾患の種類、活性化合物の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度等により著しく異なるが、通常成人１日当たり約０．１～２０００ｍｇ、場合により好ましくは１～１００ｍｇを１日１～数回にわけて投与することができる。
　リポソーム組成物を化粧料として用いる場合においては、化粧料の形態としては、例えば、ローション、クリーム、化粧水、乳液、フォーム剤、ファンデーション、口紅、パック剤、皮膚洗浄剤、シャンプー、リンス、コンディショナー、ヘアトニック、ヘアリキッド、ヘアクリーム等を挙げることができる。
［キット］
　本発明によるとリポソーム組成物を調製するためのキットが提供される。キットは、医薬としてのリポソーム組成物を調製するために用いることができ、臨床現場で医者や患者自身が使用することができる。
　キットは、リポソーム試薬を含む。リポソーム試薬は、固体状または液体状のいずれでもよい。リポソーム試薬が液体状である場合、上記リポソーム分散液をリポソーム試薬とすることができる。また、リポソーム試薬が固体状である場合、リポソーム試薬は、適当な溶媒に溶解または懸濁することでリポソーム分散液を得ることのできる試薬であり、上記リポソーム分散液を乾燥させることでリポソーム試薬を得ることができる。乾燥は、上記リポソーム組成物の乾燥と同様に行うことができる。キットを使用する際は、リポソーム試薬が固体状である場合、リポソーム試薬を適当な溶媒に溶解または懸濁させることでリポソーム分散液とする。この際の溶媒は、上記リポソーム分散液におけるリポソーム外相と同様である。
　本発明のキットは、活性化合物をさらに含むことが好ましい。活性化合物は、固体状または液体状（溶媒に溶解または懸濁された状態）のいずれでもよい。キットを使用する際は、活性化合物が固体状である場合、活性化合物を適当な溶媒に溶解または懸濁させ、液体状とすることが好ましい。溶媒は、活性化合物の物性等に応じて適宜設定することができ、例えば上記リポソーム分散液におけるリポソーム外相と同様とすることができる。
　キットにおいて、リポソーム試薬と活性化合物は、別個に包装されていてもよく、または、リポソーム試薬と活性化合物は、それぞれ固体状であり、混合されていてもよい。
　リポソーム試薬が固体状である場合に、上記した通り溶解または懸濁させることでリポソーム分散液とすることを除けば、キットは、上記リポソーム組成物の製造方法における、リポソーム分散液と活性化合物との混合、およびリポソーム分散液のリポソーム内相への活性化合物の導入と同様のステップを行うことで使用することができる。これにより、リポソーム試薬のリポソーム内相へ活性化合物が導入されたリポソーム組成物を製造することができる。
　リポソーム試薬と活性化合物が、それぞれ固体状であり、一緒に包装されている場合には、このリポソーム試薬と活性化合物との混合物を適当な溶媒に溶解または懸濁させる。この際の溶媒は、上記リポソーム分散液におけるリポソーム外相と同様である。これにより、リポソーム分散液と活性化合物とを混合した状態とすることができ、その後、上記リポソーム組成物の製造方法における、リポソーム分散液のリポソーム内相への活性化合物の導入におけるその他のステップを行うことで使用することができる。
　本発明を実施例および比較例を挙げて具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
＜リポソーム内相用水溶液の調製＞
　クエン酸一水和物８４０．６ｍｇを純水で溶解し、２０ｍＬにメスアップすることで２００ｍＭ　クエン酸水溶液を作成した。ＨＰ－β－シクロデキストリン（ROQUETTE社製）２８０ｍｇまたは５６０ｍｇを２００ｍＭ　クエン酸水溶液１ｍＬで溶解し、アンモニア水でｐＨを５．５に調整後、純水を用いて２ｍＬにメスアップすることによりリポソーム内相用水溶液を調製した。
　ＨＰ-β-シクロデキストリンを含まないリポソーム内相用水溶液は２００ｍＭ　クエン酸水溶液１ｍＬをアンモニア水でｐＨ５．５に調整後、純水を用いて２ｍＬにメスアップすることにより調製した（表１）。
＜リポソーム準備液の調製＞
　水素添加大豆ホスファチジルコリン（Lipoid社製）４４．４ｍｇ、コレステロール（Sigma社製）１４．５ｍｇおよびポリエチレングリコール２０００－ホスファチジルエタノールアミン（Genzyme社製、ＭＰＥＧ２０００－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン）１７．４ｍｇをクロロホルム３ｍＬに溶解した後にロータリーエバポレーターでクロロホルムを減圧留去し、リピッドフィルムを作成した。得られたリピッドフィルムに、下記表１に記載の種々の組成のリポソーム内相用水溶液２ｍＬを約６０℃に加温して添加し、撹拌してリポソーム準備液を調製した。このリポソーム準備液を２０分間超音波処理した後に、約６５℃に加温したエクストルーダー（Lipex Biomembranes社製）を用いて整粒し、整粒したリポソーム準備液を得た。得られたリポソーム準備液中のリポソームの粒子径を動的光散乱法で測定したところ、いずれも９０～１００ｎｍであった。
＜リポソーム分散液の調製＞
　Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－５０カラムを用い、得られたリポソーム準備液を０．９％塩化ナトリウム／１０ｍＭ　ヒスチジン水溶液（ｐＨ＝７．６）で溶出することで、リポソーム外相を０．９％塩化ナトリウム／１０ｍＭ　ヒスチジン水溶液へと置換した。リポソーム外相を置換した後、４００，０００×ｇで３０分間遠心した。遠心後、再分散し、０．９％塩化ナトリウム／１０ｍＭ　ヒスチジン水溶液を用いて液量を２ｍＬに調整し、リポソーム分散液を得た。
＜活性化合物溶液の調製＞
　Ｅ７１０７（（８Ｅ，１２Ｅ，１４Ｅ）－７－｛（４－シクロヘプチルピペラジン－１－イル）カルボニル｝オキシ－３，６，１６，２１－テトラヒドロキシ－６，１０，１２，１６，２０－ペンタメチル－１８，１９－エポキシトリコサ－８，１２，１４－トリエン－１１－オリド）のエタノール溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）を０．９％塩化ナトリウム／１０ｍＭヒスチジン水溶液で５００倍希釈し、０．１ｍｇ／ｍＬのＥ７１０７溶液を得た。
＜リポソーム組成物の調製＞
　１０ｍＬのガラス容器中、０．１ｍＬのリポソーム分散液と１ｍＬのＥ７１０７溶液を混合し、５５℃の水浴中で３分間インキュベートすることにより、リポソーム内にＥ７１０７が導入されたリポソーム組成物を得た。
＜封入率の測定＞
　封入率は、以下のようにして求めた。
　活性化合物が封入されたリポソーム組成物を４００，０００×ｇで３０分間超遠心した。上清中の活性化合物濃度をＨＰＬＣで測定することで、リポソームに未封入の活性化合物量を定量した。封入率を下記式により計算した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　結果を表１に示す。表１から分かるとおり、リポソーム内水相にシクロデキストリンを存在させることで非常に高効率にＥ７１０７を封入可能であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
＜ラット血漿中での安定性＞
　超遠心後のＥ７１０７封入リポソームを０．１ｍＬとなるように再懸濁し、ラット血漿１ｍＬと混合した。混合直後、２４時間後、４８時間後、７２時間後に、以下に記載する方法によりリポソーム内Ｅ７１０７量を測定し、活性化合物の封入率の経時的安定性を評価した。
　リポソームと、リポソーム外相に漏れ出たＥ７１０７とは、ＰＤ－１０　Ｃｏｌｕｍｎ（Ge Healthcare社製）を用い分離した。回収したリポソーム画分と１０％Ｔｗｅｅｎ　８０溶液を９：１で混合することでリポソームを破壊し、ＨＰＬＣでリポソーム内に保持されているＥ７１０７量を定量した。
　２４時間後、４８時間後、７２時間後のそれぞれのＥ７１０７量を混合直後のＥ７１０７量で除することでリポソーム内の残存率を測定した。
　測定結果を図１に示す。リポソーム内相にシクロデキストリンを存在させることで血漿中での安定性が飛躍的に向上した。なお、図１中、ＨＰ－β－ＣＤは、ＨＰ－β－シクロデキストリンを意味する。
［実施例２］
＜リポソーム組成物の調製＞
　実施例１と同様にして、リポソーム内相用水溶液の組成が２５０ｍＭ　ＨＰ－β－シクロデキストリン／１００ｍＭ　クエン酸（ｐＨ＝５．５）であり、リポソーム外相を０．９％塩化ナトリウム／１０ｍＭ　ヒスチジン水溶液（ｐＨ＝７．６）へと置換した、リポソーム分散液を得た。
　続いて、１０ｍＬのガラス容器中、リポソーム分散液とＥ７１０７溶液を混合し、５℃、２０℃、４０℃、５０℃、６０℃の水浴中で１分間、５分間、１時間、６時間インキュベートすることにより、リポソーム組成物を得た。
　封入率の測定結果を表２に示す。表２から分かるとおり、Ｅ７１０７の封入操作時に加温することで封入操作時間を短縮することが可能であった。また、常温（２０℃）でも徐々にＥ７１０７が封入されることが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  
［実施例３］
＜リポソーム内相用水溶液の調製＞
　硫酸アンモニウム３９６．４ｍｇおよびクエン酸一水和物１８９．１ｍｇを純水で溶解し、１５ｍＬにメスアップすることで２００ｍＭ　硫酸アンモニウム／６０ｍＭ　クエン酸水溶液を作成した。ＨＰ－β－シクロデキストリン７００ｍｇあるいはＨＰ－γ－シクロデキストリン（Sigma社製）７９０ｍｇを２００ｍＭ　硫酸アンモニウム／６０ｍＭ　クエン酸水溶液２．５ｍＬで溶解し、アンモニア水でｐＨを５．５に調整後、純水を用いて５ｍＬにメスアップすることによりリポソーム内相用水溶液を調製した。
　シクロデキストリンを含まないリポソーム内相用水溶液は２００ｍＭ　硫酸アンモニウム／６０ｍＭ　クエン酸水溶液２．５ｍＬをアンモニア水でｐＨ５．５に調整後、純水を用いて５ｍＬにメスアップすることにより調製した（表３）。
＜リポソーム準備液の調製＞
　水素添加大豆ホスファチジルコリン３１７．９ｍｇ、コレステロール１１６．０ｍｇおよびポリエチレングリコール２０００－ホスファチジルエタノールアミン１３０．４ｍｇをクロロホルム１０ｍＬに溶解した後に正確に３本に分注し、それぞれをロータリーエバポレーターでクロロホルムを減圧留去し、リピッドフィルムを作成した。得られたリピッドフィルムに、下記表３に記載の種々の組成のリポソーム内相用水溶液５ｍＬを約６０℃に加温して添加し、撹拌してリポソーム準備液を調製した。このリポソーム準備液を２０分間超音波処理した後に、約６５℃に加温したエクストルーダー（Lipex Biomembranes社製）を用いて整粒し、リポソーム準備液を得た。得られたリポソーム準備液中のリポソームの粒子径を動的光散乱法で測定したところ、いずれも９０～１００ｎｍであった。
＜リポソーム分散液の調製＞
　実施例１と同様に実施して、リポソーム分散液５ｍＬを得た。
＜活性化合物溶液の調製＞
　メシル酸エリブリンを０．９％塩化ナトリウム／１０ｍＭ　ヒスチジン水溶液で溶解し、１ｍｇ／ｍＬのメシル酸エリブリン溶液を得た。
＜リポソーム組成物の調製＞
　１０ｍＬのガラス容器中、０．５ｍＬのリポソーム分散液と０．５ｍＬのメシル酸エリブリン溶液を混合し、５５℃の水浴中で３分間インキュベートすることにより、リポソーム内にメシル酸エリブリンが導入されたリポソーム組成物を得た。
＜封入率の測定＞
　封入率は、実施例１と同様に求めた。結果を表３に示す。表３から分かるとおり、リポソーム内水相にシクロデキストリンを存在させることでより高効率にメシル酸エリブリンを封入可能であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
  
＜リポソーム内相用水溶液の調製＞
　同様にして、硫酸アンモニウム２６４．３ｍｇおよびクエン酸一水和物１２６．１ｍｇを純水で溶解し、メスフラスコを用いて１０ｍＬにメスアップすることで２００ｍＭ　硫酸アンモニウム／６０ｍＭ　クエン酸水溶液を作成した。ＨＰ－β－シクロデキストリン　５６０ｍｇ、ＨＰ－γ－シクロデキストリン　６３２ｍｇ、Ｇ２－β－シクロデキストリン（塩水港精糖株式会社）　５８４ｍｇ、およびＣａｐｔｉｓｏｌ（CyDex社製）　４３２ｍｇを秤量し、２００ｍＭ　硫酸アンモニウム／６０ｍＭ　クエン酸水溶液１ｍＬでそれぞれを溶解した。アンモニア水でｐＨを５．５に調整後、純水で２ｍＬにメスアップすることによりリポソーム内相用水溶液を調製した。
　シクロデキストリンを含まないリポソーム内相用水溶液は２００ｍＭ　硫酸アンモニウム／６０ｍＭ　クエン酸水溶液１ｍＬをアンモニア水でｐＨ５．５に調整後、純水を用いて２ｍＬにメスアップすることにより調製した（表４）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
  
＜リポソーム準備液の調製＞
　脂質混合物（水素添加大豆ホスファチジルコリン：コレステロール：ポリエチレングリコール２０００－ホスファチジルエタノールアミン＝５８．６：１９．２：２２．２（重量比））を８０ｍｇずつ秤量し、上記表４に記載の種々の組成のリポソーム内相用水溶液２ｍＬを約８０℃に加温して添加し、撹拌してリポソーム準備液を調製した。このリポソーム準備液を約８０℃に加温したエクストルーダー（Lipex Biomembranes社製）を用いて整粒し、リポソーム準備液を得た。
＜リポソーム分散液の調製＞
　得られたリポソーム準備液を０．９％塩化ナトリウム／１０ｍＭ　ヒスチジン水溶液（ｐＨ＝７．６）で１０ｍＬにメスアップし、４００，０００×ｇで３０分間遠心した。遠心後、上清を全て廃棄した。沈殿を０．９％塩化ナトリウム／１０ｍＭ　ヒスチジン水溶液で再分散し、メスフラスコを用いて液量を１ｍＬに調整し、リポソーム分散液を得た。
＜薬物溶液の調製＞
　メシル酸エリブリンを０．９％　塩化ナトリウム／１０ｍＭ　ヒスチジン水溶液で溶解し、５ｍｇ／ｍＬのメシル酸エリブリン溶液を得た。
＜リポソーム組成物の調製＞
　１０ｍＬのガラス容器中、０．９６ｍＬのリポソーム分散液と０．２４ｍＬのメシル酸エリブリン溶液を混合し、６０℃の水浴中で３分間インキュベートすることにより、リポソーム内にメシル酸エリブリンが導入されたリポソーム組成物を得た。
＜ラット血漿中での安定性＞
　調製したメシル酸エリブリン封入リポソーム０．２ｍＬとラット血漿１．８ｍＬを混合し、液相インキュベーターを用いて３７℃で振盪した。リポソーム組成物とラット血漿の混合直後、振盪開始６時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、１２０時間後にサンプリングを行い、ゲル濾過カラムによりフリー体画分を分取した。得られたメシル酸エリブリンのフリー体画分をリポソームから漏出したメシル酸エリブリン量としてＨＰＬＣで測定した。
　測定結果を図２に示す。図２から分かるとおり、血漿中でも１２０時間という長時間に亘ってメシル酸エリブリンを安定に保持し、徐放することが可能であることが示された。また、特に、シクロデキストリンを内相に含有するリポソームではメシル酸エリブリンを長期間より安定に保持可能であることが示された。
［実施例４］
＜リポソーム組成物の調製＞
　実施例３と同様にして、リポソーム内相用水溶液の組成が２００ｍＭ　ＨＰ－β－シクロデキストリン／１００ｍＭ　硫酸アンモニウム／３０ｍＭ　クエン酸（ｐＨ＝７．０）であり、リポソーム外相を０．９％塩化ナトリウム／１０ｍＭ　ヒスチジン水溶液（ｐＨ＝７．６）へと置換した、リポソーム分散液を得た。
　続いて、１０ｍＬのガラス容器中、リポソーム分散液とメシル酸エリブリン溶液を混合し、５℃、２０℃、４０℃、５０℃、６０℃の水浴中で１分間、５分間、１時間、６時間インキュベートすることにより、リポソーム組成物を得た。
＜封入率の測定＞
　封入率の測定結果を表５に示す。表５から分かるとおり、メシル酸エリブリンの封入操作時に加温することで封入操作時間を短縮することが可能であった。また、常温（２０℃）でも徐々にメシル酸エリブリンが封入されることが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
  
［実施例５］
＜リポソーム内相用水溶液の調製＞
　グルタミン１．４６ｇを純水で溶解し、１００ｍＬにメスアップすることで１００ｍＭグルタミン水溶液を作成した。ｐＨを測定したところ、５．２であった。また、ＨＰ－β－シクロデキストリン２８．０ｇおよびグルタミン１．４６ｇを純水で溶解し、１００ｍＬにメスアップすることで２００ｍＭ　ＨＰ－β－シクロデキストリン／１００ｍＭ　グルタミン水溶液を作成した。ＨＰ－γ－シクロデキストリン３１．６ｇおよびグルタミン１．４６ｇを純水で溶解し、１００ｍＬにメスアップすることで２００ｍＭ　ＨＰ－γ－シクロデキストリン／１００ｍＭ　グルタミン水溶液を作成した。Ｇ２－β－シクロデキストリン２９．２ｇおよびグルタミン１．４６ｇを純水で溶解し、１００ｍＬにメスアップすることで２００ｍＭ　Ｇ２－β－シクロデキストリン／１００ｍＭ　グルタミン水溶液を作成した。カプチゾル４３．２ｇおよびグルタミン１．４６ｇを純水で溶解し、１００ｍＬにメスアップすることで２００ｍＭ　カプチゾル／１００ｍＭ　グルタミン水溶液を作成した。以上のシクロデキストリンを含むグルタミン水溶液は塩酸および水酸化ナトリウムを用いてｐＨを５．２に調整した（表６）。
　同様に、ヒスチジン１．５５ｇを純水で溶解し、１００ｍＬにメスアップすることで１００ｍＭ　ヒスチジン水溶液（ｐＨ＝７．６）を作成した。また、２００ｍＭ　ＨＰ－β－シクロデキストリン／１００ｍＭ　ヒスチジン水溶液、２００ｍＭ　ＨＰ－γ－シクロデキストリン／１００ｍＭ　ヒスチジン水溶液、２００ｍＭ　Ｇ２－β－シクロデキストリン／１００ｍＭ　ヒスチジン水溶液、および２００ｍＭ　カプチゾル／１００ｍＭ　ヒスチジン水溶液を作成した。以上のシクロデキストリンを含むヒスチジン水溶液は塩酸および水酸化ナトリウムを用いてｐＨを７．６に調整した（表６）。
　また同様に、アルギニン１．７４ｇを純水で溶解し、１００ｍＬにメスアップすることで１００ｍＭ　アルギニン水溶液（ｐＨ＝１１．１）を作成した。また、２００ｍＭ　ＨＰ－β－シクロデキストリン／１００ｍＭ　アルギニン水溶液、２００ｍＭ　ＨＰ－γ－シクロデキストリン／１００ｍＭ　アルギニン水溶液、２００ｍＭ　Ｇ２－β－シクロデキストリン／１００ｍＭ　アルギニン水溶液、および２００ｍＭ　カプチゾル／１００ｍＭ　アルギニン水溶液を作成した。以上のシクロデキストリンを含むアルギニン水溶液は塩酸および水酸化ナトリウムを用いてｐＨを１１．１に調整した（表６）。
＜リポソーム準備液の調製＞
　脂質混合物（水素添加大豆ホスファチジルコリン：コレステロール：ポリエチレングリコール２０００－ホスファチジルエタノールアミン＝５８．６：１９．２：２２．２（重量比））を２００ｍｇずつ秤量し、下記表６に記載の種々の組成のリポソーム内相用水溶液５ｍＬを約８０℃に加温して添加し、撹拌してリポソーム準備液を調製した。このリポソーム準備液を２０分間超音波処理した後に、約８０℃に加温したエクストルーダー（Lipex Biomembranes社製）を用いて整粒し、整粒したリポソーム準備液を得た。得られたリポソーム準備液中のリポソームの粒子径を動的光散乱法で測定したところ、いずれも９０～１００ｎｍであった。
＜リポソーム分散液の調製＞
　Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－５０カラムを用い、得られたリポソーム準備液を下記表６に記載の種々の組成のリポソーム外相用水溶液で溶出することで、リポソーム外相を置換した。リポソーム外相を置換した後、４００，０００×ｇで３０分間遠心した。遠心後、再分散し、下記表６に記載の種々の組成のリポソーム外相用水溶液を用いて液量を５ｍＬに調整し、リポソーム分散液を得た。
＜リポソーム組成物の調製＞
　これらリポソーム分散液と、実施例３と同様にして作成したメシル酸エリブリン溶液と、を混合し、６０℃の水浴中で５分間インキュベートすることにより、リポソーム内にメシル酸エリブリンが導入されたリポソーム組成物を得た。
＜封入率の測定＞
　封入率は、実施例１と同様にして測定した。結果を表６に示す。表６から分かるとおり、いずれのシクロデキストリンを内相に用いた場合でもメシル酸エリブリンの封入率が向上することが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
  
［実施例６］
＜リポソーム組成物の調製＞
　実施例５と同様にして、リポソーム分散液を得た（表７）。
　ドキソルビシンを１００ｍＭ　グルタミン水溶液（ｐＨ＝５．２）または１００ｍＭ　ヒスチジン水溶液（ｐＨ＝７．６）で溶解し、１ｍｇ／ｍＬのドキソルビシン水溶液を得た。
　１０ｍＬのガラス容器中、０．１ｍＬのリポソーム分散液と０．１ｍＬのドキソルビシン水溶液を混合し、６０℃の水浴中で５分間インキュベートした。
＜封入率の測定＞
　封入率は、実施例１と同様に求めた。結果を表７に示す。表７から分かるとおり、リポソーム内相にシクロデキストリンを存在させることでドキソルビシン封入率が向上した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
  
［実施例７］
＜リポソーム分散液の調製＞
　実施例５と同様にして、リポソーム内相が１００ｍＭ　グルタミン水溶液、２００ｍＭ　ＨＰ－β－シクロデキストリン／１００ｍＭ　グルタミン水溶液、２００ｍＭ　ＨＰ－γ－シクロデキストリン／１００ｍＭ　グルタミン水溶液、または２００ｍＭ　Ｇ２－β－シクロデキストリン／１００ｍＭ　グルタミン水溶液で、外相が１００ｍＭ　グルタミン水溶液であるリポソーム分散液を得た（表８）。
　また、リポソーム内相が１００ｍＭ　ヒスチジン水溶液、２００ｍＭ　ＨＰ－β－シクロデキストリン／１００ｍＭ　ヒスチジン水溶液、２００ｍＭ　ＨＰ－γ－シクロデキストリン／１００ｍＭ　ヒスチジン水溶液、または２００ｍＭ　Ｇ２－β－シクロデキストリン／１００ｍＭ　ヒスチジン水溶液で、外相が１００ｍＭ　ヒスチジン水溶液であるリポソーム分散液を得た（表８）。
＜活性化合物溶液の調製＞
　パクリタキセルを５ｍＭ　ＨＰ－β－シクロデキストリン／１００ｍＭ　グルタミン水溶液（ｐＨ＝５．２）または５ｍＭ　ＨＰ－β－シクロデキストリン／１００ｍＭ　ヒスチジン水溶液（ｐＨ＝７．６）で溶解し、４μｇ／ｍＬのパクリタキセル水溶液を得た。
＜リポソーム組成物の調製＞
　１０ｍＬのガラス容器中、５．３ｍｇのＨＰ－β－シクロデキストリンを０．７５ｍＬのリポソーム分散液で溶解し、リポソーム外相液を５ｍＭ　ＨＰ－β－シクロデキストリンとした。そこに０．２５ｍＬのパクリタキセル水溶液を混合し、６０℃の水浴中で５分間インキュベートすることにより、リポソーム組成物を得た。
＜封入率の測定＞
　封入直後のリポソーム組成物を５ｍＭ　ＨＰ－β－シクロデキストリンで２ｍＬにメスアップした。そのうち１ｍＬを使用してパクリタキセル濃度および水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）濃度をＨＰＬＣにより測定した。また、残りの１ｍＬを純水で１０ｍＬにメスアップし、４００，０００×ｇで４０分間遠心を行った。上清を完全に廃棄し、得られた沈殿を純水で再懸濁し、１０ｍＬにメスアップした。再度、４００，０００×ｇで４０分間遠心を行った。上清を完全に廃棄し、得られた沈殿を純水で再懸濁し、１ｍＬにメスアップした。得られたリポソーム組成物のパクリタキセル濃度およびＨＳＰＣ濃度をＨＰＬＣにより測定した。封入率を下記式により求めた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000009
　結果を表８に示す。表８から分かるとおり、リポソーム内相および外相に同種のシクロデキストリンを存在させた場合においては、内相側のシクロデキストリン濃度を高濃度にすることでパクリタキセルの封入率が顕著に向上した。また、内相と外相に異種のシクロデキストリンを存在させた場合においても、内相側を高濃度にすることによりパクリタキセルの封入率は向上した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
  
［実施例８］
　実施例１と同様にして、組成が２５０ｍＭ　ＨＰ－β－シクロデキストリンおよび１００ｍＭ　クエン酸であるリポソーム内相用水溶液を用いて、リポソーム組成物（Ｅ７１０７濃度：０．２ｍｇ／ｍＬ，総脂質濃度:１０μｍｏｌ／ｍＬ）を得た。
　また、非製剤化Ｅ７１０７として、Ｅ７１０７を５％ＤＭＳＯ／５％Ｔｗｅｅｎ　８０を含有する生理食塩液（大塚製薬株式会社）に溶解した（Ｅ７１０７濃度：３ｍｇ／ｍＬ）。
　ヒト大腸癌細胞株であるＷｉＤｒ（大日本製薬株式会社より入手）を１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、増殖させた。細胞を０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ溶液を用いてフラスコより遊離させ回収した。ＰＢＳで洗浄後、Ｈａｎｋｓ’　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（GIBCO社製）にて５×１０７個／ｍＬになるように懸濁し、氷上で保持した。６－８週齢の雌性ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ－ｎｕ／ｎｕ；日本クレア株式会社）の右腹側部へ、１匹あたり１００μＬの細胞懸濁液を皮下注射した。各々のマウスを毎日観察し、状態異常が発見された場合には適宜記録を行った。腫瘍の大きさを経時的にノギスを用いて測定し、腫瘍の大きさを、計算式：長径×（短径の２乗）÷２に基づき算出した。また、マウスの体重も経時的に測定した。腫瘍の大きさが１００～２００ｍｍ３になった時点で、各試験群間での腫瘍の大きさおよびマウスの体重の平均値が均一になるように群分けを行った。調製したリポソーム組成物（１ｍｇ／ｋｇ）または非製剤化Ｅ７１０７（３０ｍｇ／ｋｇ）を担癌マウスの尾静脈から単回静脈内投与し、投与後経時的に血液と腫瘍組織を採取した。得られた血液を４℃で遠心分離し、血漿を分取した。腫瘍組織については生理食塩液を約４倍量添加し、均一なホモジネートを調製した。得られた血漿（０．０５ｍＬ）および腫瘍ホモジネート（０．０５ｇ）に０．２ｍＬの内部標準物質（プロプラノロール（Sigma社製）、１００ｎｇ／ｍＬ）を含むアセトニトリル（和光純薬工業株式会社）とメタノール（和光純薬工業株式会社）の等量混和液を添加し、混合した。遠心分離することによりタンパク質を除去し、得られた上清をＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ　Ｆｉｌｔｅｒ　ｐｌａｔｅ（Millipore社製）で濾過した。その後、濾液（５μＬ）を以下に示した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）／質量分析計（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）で分析し、血漿中および腫瘍中Ｅ７１０７濃度を測定した。
　担癌マウスに単回静脈内投与した時の血漿中および腫瘍組織中Ｅ７１０７濃度推移を図３に示す。図３から分かるとおり、Ｅ７１０７をリポソームで製剤化することにより、Ｅ７１０７の血漿中および腫瘍中での滞留性が著しく向上することが明らかとなった。
［実施例９］
　実施例１と同様にして、組成が２５０ｍＭ　ＨＰ－β－シクロデキストリンおよび１００ｍＭ　クエン酸であるリポソーム内相用水溶液を用いてリポソーム分散液を得た。リポソーム分散液とＥ７１０７溶液の混合比率をそれぞれ変化させ、５種類のリポソーム組成物（Ｅ７１０７濃度：０．２ｍｇ／ｍＬ，総脂質濃度:２．５μｍｏｌ／ｍＬ；Ｅ７１０７濃度：０．２ｍｇ／ｍＬ，総脂質濃度:５μｍｏｌ／ｍＬ；Ｅ７１０７濃度：０．２ｍｇ／ｍＬ，総脂質濃度:１０μｍｏｌ／ｍＬ；Ｅ７１０７濃度：０．２ｍｇ／ｍＬ，総脂質濃度:２０μｍｏｌ／ｍＬ；Ｅ７１０７濃度：０．２ｍｇ／ｍＬ，総脂質濃度:４０μｍｏｌ／ｍＬ）を得た。実施例１と同様に封入率を測定したところ、いずれのリポソーム組成物においても封入率は９５％以上であった。
　担癌マウスは、ヒト大腸癌由来細胞であるＷｉＤｒ（大日本製薬株式会社より入手）を雌性ヌードマウス（ＢＡＬＢ/ｃＡＪｃｌ－ｎｕ/ｎｕ）の腹部皮下に移植することにより作製した。調製した各種リポソーム製剤化Ｅ７１０７を担癌マウスの尾静脈から単回静脈内投与し、投与後２４時間および７２時間に血液を採取した。得られた血液を４℃で遠心分離することにより血漿を分取し、実施例８と同様にして、Ｅ７１０７の血漿中濃度を測定した。
　担癌マウスに単回静脈内投与した時の血漿中および腫瘍組織中Ｅ７１０７濃度推移を図４に示す。図４から分かるとおり、各リポソーム組成物において同様の血漿中および腫瘍中のＥ７１０７濃度推移を示した。
［実施例１０］
　ヒト大腸癌細胞株であるＷｉＤｒ（大日本製薬株式会社より入手）を１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、増殖させた。細胞を０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ溶液を用いてフラスコより遊離させ回収した。ＰＢＳで洗浄後、Ｈａｎｋｓ’　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（GIBCO社製）にて５×１０７個／ｍＬになるように懸濁し、氷上で保持した。６－８週齢のヌードマウス（日本クレア株式会社）の右腹側部へ、１匹あたり１００μＬの細胞懸濁液を皮下注射した。各々のマウスを毎日観察し、状態異常が発見された場合には適宜記録を行った。腫瘍の大きさを経時的にノギスを用いて測定し、腫瘍の大きさを、計算式：長径×（短径の２乗）÷２に基づき算出した。また、マウスの体重も経時的に測定した。腫瘍の大きさが１００～２００ｍｍ３になった時点で、各試験群間での腫瘍の大きさおよびマウスの体重の平均値が均一になるように群分けを行い（各試験群のマウス頭数は５匹）、Ｅ７１０７（２００μＬ／２０ｇ）を単回尾静脈内投与した。
　Ｅ７１０７－２．５ｍｇ／ｋｇ群（群２）の投与液として、Ｅ７１０７に３．５：６．５：９０の割合で、ＤＭＳＯ溶液、Ｔｗｅｅｎ－８０溶液、５％ブドウ糖液を加え、Ｅ７１０７濃度を０．２５ｍｇ/ｍＬとした。
　群３および群４で用いた３Ｅ７１０７を封入したリポソーム組成物は、実施例１と同様にして作成し、Ｅ７１０７濃度を０．２５ｍｇ／ｍＬとした。
　投与後５日目の腫瘍増殖に対する治療効果として、腫瘍の大きさ、対コントロール比、体重の平均値を表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
  
　投与後５日目の腫瘍増殖抑制効果および体重減少の統計的分析をパラメトリック法により行った。各試験群間の比較において０．０５未満のＰ値を示す場合、統計的有意差を意味する。コントロール群に対して、各投与群の腫瘍増殖抑制効果は０．０５未満の値を示した。Ｅ７１０７－２．５ｍｇ/ｋｇ群に対しては、リポソームＥ７１０７－２．５ｍｇ/ｋｇ群の有意な抗腫瘍効果の亢進は認められなかった（Ｐ＝０．２２）。しかし、ＨＰ－β－シクロデキストリンを含むリポソームＥ７１０７(１３０ｍＭ　ＨＰ－β－シクロデキストリン)－２．５ｍｇ/ｋｇ群は、Ｅ７１０７－２．５ｍｇ/ｋｇ群に対して、有意な腫瘍縮小の亢進を示した（Ｐ＝０．０１８）。
　体重減少については、どの群間比較においても有意な減少は見られなかった。
　以上の結果から、Ｅ７１０７の１日当たりの投与量は、特に限定されないが、通常、ヒトに対し、１～１００ｍｇとなるようにリポソーム組成物を投与することにより、Ｅ７１０７の抗腫瘍効果を発揮させることができる。
[実施例１１]
＜リポソーム内相用水溶液の調製＞
　実施例１と同様に、１００ｍＭ　硫酸アンモニウム／３０ｍＭ　クエン酸水溶液（ｐＨ＝５．５）および２００ｍＭ　ＨＰ－β－シクロデキストリン／１００ｍＭ　硫酸アンモニウム／３０ｍＭ　クエン酸水溶液（ｐＨ＝５．５）を調製した。
＜リポソーム準備液の調製＞
　水素添加大豆ホスファチジルコリン、コレステロール、およびポリエチレングリコール２０００－ホスファチジルエタノールアミンを表１０に記載の量でそれぞれ秤量した。それぞれをクロロホルム３ｍＬに溶解した後にロータリーエバポレーターでクロロホルムを減圧留去し、リピッドフィルムを作成した。得られたリピッドフィルムに、作成したリポソーム内相用水溶液１０ｍＬ（Ｒｐ．１～４は１００ｍＭ　硫酸アンモニウム／３０ｍＭ　クエン酸水溶液、Ｒｐ．５～８は２００ｍＭ　ＨＰ－β－シクロデキストリン／１００ｍＭ　硫酸アンモニウム／３０ｍＭ　クエン酸水溶液）を約８０℃に加温して添加し、撹拌してリポソーム準備液を調製した。約８０℃に加温したエクストルーダー（Lipex Biomembranes社製）を用いて整粒し、整粒したリポソーム準備液を得た。得られたリポソーム準備液中のリポソームの粒子径を動的光散乱法で測定したところ、Ｒｐ．１は７７ｎｍ、Ｒｐ．２は９５ｎｍ、Ｒｐ．３は７９ｎｍ、Ｒｐ．４は１２８ｎｍ、Ｒｐ．５は８１ｎｍ、Ｒｐ．６は１２２ｎｍ、Ｒｐ．７は７６ｎｍ、Ｒｐ．８は１１０ｎｍであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
  
＜リポソーム組成物の調製＞
　実施例１と同様にして、リポソーム分散液を得た。また、メシル酸エリブリンを０．９％塩化ナトリウム／１０ｍＭ　ヒスチジン水溶液で溶解し、５ｍｇ／ｍＬのメシル酸エリブリン溶液を得た。
　１０ｍＬのガラス容器中、４．８ｍＬの各リポソーム分散液と０．６ｍＬのメシル酸エリブリン溶液をそれぞれ混合し、６０℃の水浴中で３分間インキュベートすることにより、リポソーム内にメシル酸エリブリンが導入されたリポソーム組成物を得た。それぞれのリポソーム組成物に２４．６ｍＬの０．９％塩化ナトリウム／１０ｍＭ　ヒスチジン水溶液を添加し、０．２μｍポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）フィルター（Whatman社製ＧＤ／Ｘフィルター）を用いて濾過滅菌することで、投与検体（メシル酸エリブリン濃度：０．１ｍｇ／ｍＬ）を得た。
　実施例１と同様にして、封入率を測定し、いずれの処方においても９０％以上であることを確認した。
　雌性ヌードマウス（ＮＵ／ＮＵ、日本チャールズ・リバー株式会社）にヒトメラノーマＬＯＸ細胞を皮下に接種し、１１日後または１２日後に、１０ｍＬ／ｋｇ（メシル酸エリブリンとして１．０ｍｇ／ｋｇ）となるように尾静脈内投与した。投与後一定時間（１５分，３０分，１，２，４，８，１２，２４，３６，４８時間）経過後に心穿刺による血液採取と腫瘍組織の摘出を実施した（ｎ＝３）。血液はヘパリンを含む試験管に取り、採取後３０分以内に４℃で１０分間１，５００×ｇで遠心分離して血漿を得た。腫瘍は全組織を摘出してＰＢＳで洗浄し、吸水紙でふき取った後にただちに組織重量を測定した。組織を試験管に入れて氷水中で冷却した後、分析操作までは－８０℃で保存した。
　血漿中および腫瘍組織中のメシル酸エリブリンはＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて測定した．
　ＰＫパラメーターはｎｏｎ－ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ　ｍｏｄｅｌ解析ソフトウェア（WinNonlin v.5.0.1）を用いて算出した。メシル酸エリブリンの血漿ＰＫパラメーターおよび腫瘍組織ＰＫパラメーターの結果を、それぞれ表１１および表１２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
  
　表１１および表１２から、Ｒｐ.１～８の全てのリポソーム組成物において，フリーのメシル酸エリブリンと比較して血漿および腫瘍組織のＡＵＣが増大していることから、メシル酸エリブリンの腫瘍移行量および滞留性が向上していた。
[実施例１２]
＜リポソーム内相用水溶液の調製＞
　実施例３と同様に、２００ｍＭ　ＨＰ－β－シクロデキストリン／１００ｍＭ　硫酸アンモニウム／３０ｍＭ　クエン酸水溶液（ｐＨ＝５．５）を調製した。
＜リポソーム準備液の調製＞
　水素添加大豆ホスファチジルコリン２２１．８ｍｇおよびコレステロール７２．５ｍｇおよびポリエチレングリコール２０００－ホスファチジルエタノールアミン８６．９ｍｇを秤量した。クロロホルム３ｍＬに溶解した後にロータリーエバポレーターでクロロホルムを減圧留去し、リピッドフィルムを作成した。得られたリピッドフィルムに、作成したリポソーム内相用水溶液１０ｍＬを約８０℃に加温して添加し、撹拌してリポソーム準備液を調製した。約８０℃に加温したエクストルーダー（Lipex Biomembranes社製）を用いて整粒し、整粒したリポソーム準備液を得た。得られたリポソーム準備液中のリポソームの粒子径を動的光散乱法で測定したところ、約９０ｎｍであった。
＜リポソーム分散液の調製＞
　Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－５０カラムを用い、得られたリポソーム準備液を０．９％塩化ナトリウム／１０ｍＭヒスチジン水溶液（ｐＨ＝７．６）で溶出することで、リポソーム外相を０．９％塩化ナトリウム／１０ｍＭヒスチジン水溶液へと置換した。リポソーム外相を置換した後、４００，０００×ｇで３０分間遠心した。遠心後、再分散し、０．９％塩化ナトリウム／１０ｍＭヒスチジン水溶液を用いて液量を１０ｍＬに調整し、リポソーム分散液を得た。
＜薬物溶液の調製＞
　メシル酸エリブリンを０．９％　塩化ナトリウム／１０ｍＭ　ヒスチジン水溶液で溶解し、１ｍｇ／ｍＬのメシル酸エリブリン溶液を得た。また、フリー体の投与検体として、０．９％　塩化ナトリウム／１０ｍＭ　ヒスチジン水溶液でメシル酸エリブリン溶液を希釈し、０．２２μｍのＰＶＤＦフィルターを用いて濾過滅菌することで、投与検体（メシル酸エリブリン濃度：０．１ｍｇ／ｍＬおよび０．２ｍｇ／ｍＬおよび０．４ｍｇ／ｍＬ）を得た。
＜リポソーム組成物の調製＞
　１０ｍＬのガラス容器中、１．８ｍＬのリポソーム分散液と１．２ｍＬのメシル酸エリブリン溶液をそれぞれ混合し、６０℃の水浴中で３分間インキュベートすることにより、リポソーム内にメシル酸エリブリンが導入されたリポソーム組成物を得た。得られたリポソーム組成物を０．９％　塩化ナトリウム／１０ｍＭ　ヒスチジン水溶液で希釈し、０．２２μｍのＰＶＤＦフィルターを用いて濾過滅菌することで、投与検体（メシル酸エリブリン濃度：０．１ｍｇ／ｍＬおよび０．２ｍｇ／ｍＬ）を得た。超遠心法により封入率を測定し、９０％以上であることを確認した。
　ヒト大腸癌細胞株であるＷｉＤｒを１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、増殖させた。細胞を０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ溶液を用いてフラスコより遊離させ回収した。ＰＢＳで洗浄後、Ｈａｎｋｓ’　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Gibco社製）にて５×１０７個／ｍＬになるように懸濁し、氷上で保持した。７週齢のヌードマウス（日本チャールス・リバー株式会社）の右腹側部へ、１匹あたり０．１ｍＬの細胞懸濁液を皮下注射した。各々のマウスを毎日観察し、状態異常が発見された場合には適宜記録を行った。腫瘍の大きさを経時的にノギスを用いて測定し、腫瘍の大きさを、計算式：長径×（短径の２乗）÷２に基づき算出した。腫瘍の大きさが１００～２００ｍｍ３になった時点で、各試験群間での腫瘍の大きさおよびマウスの体重の平均値が均一になるように群分けを行い（各試験群のマウス数は５匹）、薬物の尾静脈内投与（０．２ｍＬ／２０ｇ；７日間隔で２回）を行った。
　測定結果を図５に示す。図５から分かるとおり、リポソーム組成物１ｍｇ／ｋｇ投与群はフリー体２ｍｇ／ｋｇ投与群またはフリー体４ｍｇ／ｋｇ（最大耐用量）投与群より明らかに優れた抗腫瘍効果を示した。また、リポソーム組成物１ｍｇ／ｋｇ投与群およびリポソーム組成物２ｍｇ／ｋｇ投与群では全個体から腫瘍が完全に消失した。フリー体２ｍｇ／ｋｇ投与群では５匹中２匹のみが完全治癒であり、リポソーム化による最大薬効の増大および薬効幅の拡大が明らかとなった。また、本試験では全群において一般状態の悪化は観察されなかった。
[実施例１３]
＜リポソーム内相用水溶液の調製＞
　実施例３と同様に、２００ｍＭ　ＨＰ－γ－シクロデキストリン／１００ｍＭ　硫酸アンモニウム／３０ｍＭ　クエン酸水溶液（ｐＨ＝５．５）を調製した。
＜薬物溶液の調製＞
　実施例１２と同様にして、フリー体の投与検体（メシル酸エリブリン濃度：０．４ｍｇ／ｍＬ）を得た。
＜リポソーム組成物の調製＞
　上述のように作製したリポソーム内相溶水溶液を用いた以外は実施例１１と同様にして、リポソーム組成物（メシル酸エリブリン濃度：０．３ｍｇ／ｍＬ）を得た。実施例１と同様にして、封入率を測定し、９０％以上であることを確認した。
　ヒト咽頭扁平上皮癌細胞株であるＦａＤｕ（American Type Culture Collectionより入手）を１０％ウシ胎児血清含有ＭＥＭ培地で培養し、増殖させた。細胞を０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ溶液を用いてフラスコより遊離させ回収した。ＰＢＳで洗浄後、ＰＢＳにて５×１０７個／ｍＬになるように懸濁し、氷上で保持した。６週齢のヌードマウス（日本チャールス・リバー株式会社）の右腹側部へ、１匹あたり０．１ｍＬの細胞懸濁液を皮下注射した。各々のマウスを毎日観察し、状態異常が発見された場合には適宜記録を行った。腫瘍の大きさを経時的にノギスを用いて測定し、腫瘍の大きさを、計算式：長径×（短径の２乗）÷２に基づき算出した。腫瘍の大きさが１００～２００ｍｍ３になった時点で、各試験群間での腫瘍の大きさおよびマウスの体重の平均値が均一になるように群分けを行い（各試験群のマウス数は５匹）、薬物の尾静脈内投与（０．２ｍＬ／２０ｇ；７日間隔で３回）を行った。
　検体投与後の平均腫瘍体積の推移結果を図６に示す。図６から分かるとおり、メシル酸エリブリンに感受性の低い細胞株を使用したため、フリー体では最大耐用量である４．０ｍｇ／ｋｇ投与でも腫瘍縮小効果は得られなかった。一方、リポソーム組成物３ｍｇ／ｋｇ投与群では腫瘍縮小効果が明確に認められ、全例において腫瘍が消失した。
[実施例１４]
＜リポソーム内相用水溶液の調製＞
　実施例３と同様に、１００ｍＭ　硫酸アンモニウム／３０ｍＭ　クエン酸水溶液（ｐＨ＝５．５）および２００ｍＭ　ＨＰ－β－シクロデキストリン／１００ｍＭ　硫酸アンモニウム／３０ｍＭ　クエン酸水溶液（ｐＨ＝５．５）および２００ｍＭ　ＨＰ－γ－シクロデキストリン／１００ｍＭ　硫酸アンモニウム／３０ｍＭ　クエン酸水溶液（ｐＨ＝５．５）を調製した。
＜薬物溶液の調製＞
　実施例１２と同様に実施し、フリー体の投与検体（メシル酸エリブリン濃度：０．３ｍｇ／ｍＬおよび０．４ｍｇ／ｍＬ）を得た。
＜リポソーム組成物の調製＞
　上述のように作製したリポソーム内相溶水溶液を用いた以外は実施例１１と同様にして、各リポソーム組成物（メシル酸エリブリン濃度：０．２ｍｇ／ｍＬ）を得た。実施例１と同様にして、封入率を測定し、いずれも９０％以上であることを確認した。
　ヒト咽頭扁平上皮癌細胞株であるＦａＤｕ（American Type Culture Collectionより入手）を１０％ウシ胎児血清含有ＭＥＭ培地で培養し、増殖させた。細胞を０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ溶液を用いてフラスコより遊離させ回収した。ＰＢＳで洗浄後、ＰＢＳにて５×１０７個／ｍＬになるように懸濁し、氷上で保持した。６週齢のヌードマウス（日本チャールス・リバー株式会社）の右腹側部へ、１匹あたり０．１ｍＬの細胞懸濁液を皮下注射した。各々のマウスを毎日観察し、状態異常が発見された場合には適宜記録を行った。腫瘍の大きさを経時的にノギスを用いて測定し、腫瘍の大きさを、計算式：長径×（短径の２乗）÷２に基づき算出した。腫瘍の大きさが１００～２００ｍｍ３になった時点で、各試験群間での腫瘍の大きさおよびマウスの体重の平均値が均一になるように群分けを行い（各試験群のマウス数は５匹）、薬物の尾静脈内投与（０．２ｍＬ／２０ｇ；７日間隔で３回）を行った。
　検体投与後の平均腫瘍体積の推移結果を図７に示す。図７から分かるとおり、ＦａＤｕは、メシル酸エリブリンに感受性の低い細胞株であるため、フリー体では最大耐用量である４．０ｍｇ／ｋｇ投与でも腫瘍縮小効果は得られなかった。一方、リポソーム組成物２ｍｇ／ｋｇ投与群では腫瘍縮小効果が明確に認められた。特にＨＰ－γ－シクロデキストリンをリポソーム内相に含有するリポソーム組成物では５匹中１匹で腫瘍が完全に消失するなど高い効果が認められた。
[実施例１５]
＜リポソーム内相用水溶液の調製＞
　実施例３と同様に、１００ｍＭ　硫酸アンモニウム／３０ｍＭ　クエン酸水溶液（ｐＨ＝５．５）および２００ｍＭ　ＨＰ－β－シクロデキストリン／１００ｍＭ　硫酸アンモニウム／３０ｍＭ　クエン酸水溶液（ｐＨ＝５．５）を調製した。
＜薬物溶液の調製＞
　実施例１２と同様に実施し、フリー体の投与検体（メシル酸エリブリン濃度：０．２ｍｇ／ｍＬおよび０．３ｍｇ／ｍＬおよび０．４ｍｇ／ｍＬ）を得た。
＜リポソーム組成物の調製＞
　上述のように作製したリポソーム内相溶水溶液を用いた以外は実施例１２と同様にして、リポソーム組成物（メシル酸エリブリン濃度：０．３ｍｇ／ｍＬ）を得た。実施例１と同様にして、封入率を測定し、いずれも９０％以上であることを確認した。
　ヒト腎癌細胞株であるＡＣＨＮ（American Type Culture Collectionより入手）を１０％ウシ胎児血清含有ＭＥＭ培地で培養し、増殖させた。細胞を０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ溶液を用いてフラスコより遊離させ回収した。ＰＢＳで洗浄後、ＰＢＳにて５×１０７個／ｍＬになるように懸濁し、氷上で保持した。６週齢のヌードマウス（日本チャールス・リバー株式会社）の右腹側部へ、１匹あたり０．１ｍＬの細胞懸濁液を皮下注射した。各々のマウスを毎日観察し、状態異常が発見された場合には適宜記録を行った。腫瘍の大きさを経時的にノギスを用いて測定し、腫瘍の大きさを、計算式：長径×（短径の２乗）÷２に基づき算出した。腫瘍の大きさが１５０～２００ｍｍ３になった時点で、各試験群間での腫瘍の大きさおよびマウスの体重の平均値が均一になるように群分けを行い（各試験群のマウス数は５匹）、薬物の尾静脈内投与（０．２ｍＬ／２０ｇ；７日間隔で３回）を行った。
　検体投与後の平均腫瘍体積の推移結果を図８に示す。図８から分かるとおり、ＡＣＨＮは、メシル酸エリブリンに耐性のある細胞株であるため、フリー体投与では２ｍｇ／ｋｇ投与群、３ｍｇ／ｋｇ投与群、および４ｍｇ／ｋｇ（最大耐用量）投与群のいずれにおいても検体投与開始４５日後において無処置群との有意な差は認められなかった。一方、いずれのリポソーム組成物３ｍｇ／ｋｇ投与群においては腫瘍増殖抑制効果が認められ、検体投与開始４５日後において無処置群およびフリー体投与群に対し有意に小さい腫瘍体積値を示した。特にＨＰ－β－シクロデキストリンをリポソーム内相に含有するリポソーム組成物で高い腫瘍増殖抑制効果が示された。
　以上の結果から、メシル酸エリブリンの１日当たりの投与量は、特に限定されないが、通常、ヒトに対し、０．１～１０ｍｇとなるようにリポソーム組成物を投与することにより、メシル酸エリブリンの抗腫瘍効果を発揮させることができる。
　本出願は、２００９年３月３０日出願の日本特許出願（特願２００９－０８２５２１号）および米国特許仮出願（６１／１６４６５３）、ならびに日本特許出願（特願２００９－０８２５１６号）および米国特許仮出願（６１／１６４６７８）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
　本発明は、活性化合物の保持安定性が高いリポソームを高い封入率で製造する方法を提供することができる。
　本発明のリポソーム組成物は、医薬、化粧料、食品の分野で、産業上の利用可能性を有する。中でも、本発明のリポソーム組成物は、医薬として、治療用途、診断用途に用いることが好適である。

Claims (15)

  1. 　リポソーム組成物を製造する方法であって、
    　リポソームを含み、リポソーム内相にシクロデキストリンをさらに含むリポソーム分散液を供するステップと、
    　前記リポソーム分散液と活性化合物とを混合するステップと、
    　前記リポソーム分散液のリポソーム内相に前記活性化合物を導入するステップと
    　を含む方法。
  2. 　前記リポソーム分散液が、リポソーム外相と比べてより高濃度のシクロデキストリンをリポソーム内相に含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記リポソーム分散液が、シクロデキストリンをリポソーム外相に実質的に含まない、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記リポソーム分散液を供するステップが、
    　リポソームを含み、リポソーム内相およびリポソーム外相に前記シクロデキストリンをさらに含むリポソーム準備液を供するステップと、
    　前記リポソーム準備液のリポソーム外相を置換または希釈することにより、リポソーム外相における前記シクロデキストリンの濃度を調整するステップと
    　を含む、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. 　前記導入するステップが、混合するステップにより得られた混合液におけるリポソームの膜透過性を上げるステップを含む、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. 　前記導入するステップが、前記混合液をリポソームの脂質二重膜の相転移温度以上に昇温するステップを含む、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
  7. 　請求項１～６のいずれかに記載の方法で製造されたリポソーム組成物。
  8. 　前記活性化合物が抗腫瘍剤である、請求項７に記載のリポソーム組成物。
  9. 　リポソームを含み、リポソーム内相にシクロデキストリンおよび活性化合物をさらに含むリポソーム組成物であって、活性化合物が（８Ｅ、１２Ｅ、１４Ｅ）－７－｛（４－シクロヘプチルピペラジン－１－イル）カルボニル｝オキシ－３、６、１６、２１－テトラヒドロキシ－６、１０、１２、１６、２０－ペンタメチル－１８、１９－エポキシトリコサ－８、１２、１４－トリエン－１１－オリド（Ｅ７１０７）、エリブリン、ドキソルビシン、エピルビシン、ピラルビシン、ダウノルビシン、ドセタキセルおよびパクリタキセルならびにこれらの薬理学的に許容される塩からなる群から選択される、リポソーム組成物。
  10. 　前記活性化合物がメシル酸エリブリンである、請求項９に記載のリポソーム組成物。
  11. 　前記リポソーム組成物が固体状または液体状である、請求項７～１０のいずれかに記載のリポソーム組成物。
  12. 　リポソーム内相に活性化合物を含むリポソーム組成物を調製するためのキットであって、
    　リポソームを含み、リポソーム内相にシクロデキストリンをさらに含むリポソーム試薬を含む、キット。
  13. 　前記リポソーム試薬が固体状または液体状である、請求項１２に記載のキット。
  14. 　前記リポソーム試薬を含み、活性化合物をさらに含む、請求項１２または１３に記載のキット。
  15. 　前記活性化合物が抗腫瘍剤である、請求項１４に記載のキット。
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