WO2010110117A1 - 蛍光観察システム、蛍光観察装置および蛍光観察方法 - Google Patents

蛍光観察システム、蛍光観察装置および蛍光観察方法 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a fluorescence observation system, a fluorescence observation apparatus, and a fluorescence observation method.
  • JP-A-62-247232 Japanese Patent Publication No. 3-58729 JP 2006-175052 A
  • the present invention has been made in view of the above-described circumstances, and is a fluorescence observation apparatus capable of sufficiently observing a fluorescence image with high quantitativeness by sufficiently removing the dependency on the distance and angle remaining in the divided image.
  • An object of the present invention is to provide a fluorescence observation system and a fluorescence observation method.
  • a fluorescence observation system includes an illumination unit including a light source that emits illumination light and excitation light, a fluorescence imaging unit that captures fluorescence generated in a subject and acquires a fluorescence image, and returns from the subject.
  • a fluorescence provided with a return light imaging unit that captures the return light and acquires a reference image, and an image correction unit that corrects the fluorescence image captured by the fluorescence imaging unit using the reference image acquired by the return light imaging unit.
  • a calibration apparatus connected to the observation apparatus, the fluorescence observation apparatus, and comprising a standard sample and an observation state setting mechanism for setting the observation distance and the observation angle of the fluorescence observation apparatus to be changeable with respect to the standard sample;
  • the observation conditions are adjusted based on the observation distance and the observation angle set by the calibration device and the fluorescence image and the reference image acquired by photographing the standard sample by the fluorescence observation device.
  • An observation condition adjustment unit, and the observation condition adjustment unit includes an observation distance and an observation angle set by the calibration device, and a fluorescence image and a reference image acquired by photographing the standard sample with the fluorescence observation device.
  • the image correction unit performs the following processing: It is.
  • FL service FL after / RL after here
  • FL device luminance value of the fluorescent image after correction
  • RL before acquired fluorescence image, luminance value of reference image
  • y (an-bm) / (bc-ad) (2)
  • b a power approximation of the cosine characteristic from the illumination unit to the standard sample of the luminance of the fluorescence image obtained by the fluorescence imaging unit when the standard sample is irradiated with excitation light of a predetermined intensity
  • Obtained index c power of a distance characteristic from the illumination unit to the standard
  • the fluorescence observation apparatus prior to the fluorescence observation, is applied to the calibration apparatus, so that the fluorescence is obtained by the operation of the observation condition adjustment unit based on the image photographed using the standard sample. More accurate indices a to d in the observation apparatus can be calculated, and observation conditions can be set such that ⁇ is equal to or less than the threshold value ⁇ max . Thereby, it is possible to set appropriate indices x and y with sufficiently reduced dependency on the observation distance and the observation angle regardless of individual differences existing in the fluorescence observation apparatus and when there are detachable parts. .
  • the luminance value FL before of each pixel in the acquired fluorescent image and the luminance value RL before of the reference image are FL before ⁇ D a cos b ⁇ and RL before ⁇ D c cos d ⁇ , respectively, Has a separate dependency on the angle. Therefore, when considering the reduction of these dependencies by raising the luminance value FL before to some exponent x and raising the luminance value RL before to some exponent y, the exponent a calculated above is considered.
  • the indices x and y calculated by the equations (1) and (2) using the constants m and n satisfying .about.d and the equation (3) the fluctuation caused by the observation conditions is suppressed, and the observation distance and the observation are reduced.
  • a fluorescence image in which the dependence due to the angle is suppressed within the range of the maximum allowable error rate can be obtained, and fluorescence observation with high quantitativeness can be performed.
  • the fluorescence observation system includes an illumination unit including a light source that emits illumination light and excitation light, a fluorescence imaging unit that captures fluorescence generated in the subject and acquires a fluorescence image, and returns from the subject.
  • a fluorescence provided with a return light imaging unit that captures the return light and acquires a reference image, and an image correction unit that corrects the fluorescence image captured by the fluorescence imaging unit using the reference image acquired by the return light imaging unit.
  • An observation device a calibration device connected to the fluorescence observation device, comprising a standard sample, and an observation state setting mechanism for setting the observation distance and the observation angle of the fluorescence observation device to be changeable with respect to the standard sample;
  • An observation condition adjustment unit that adjusts the conditions, and the observation condition adjustment unit photographs the standard sample with the observation device and the observation distance set by the calibration device and the fluorescence observation device.
  • the corrected fluorescence image finally obtained by performing the process of reducing the dependency by raising to the power of the exponent x and further raising the power by the exponent of 1 / x.
  • the distance and angle dependency can be reduced while maintaining a proportional relationship between the luminance value of the light source and the concentration of the fluorescent substance contained in the subject.
  • the fluorescence observation apparatus includes an illumination unit including a light source that emits illumination light and excitation light, a fluorescence imaging unit that captures fluorescence generated in the subject and acquires a fluorescence image, and returns from the subject.
  • a fluorescence provided with a return light imaging unit that captures the return light and acquires a reference image, and an image correction unit that corrects the fluorescence image captured by the fluorescence imaging unit using the reference image acquired by the return light imaging unit.
  • An observation device a detachable component that is attached and detached to change the observation conditions, an identification information input device that inputs identification information attached to the detachable component, the identification information, the indices x and y, and the observation condition And setting the observation conditions stored in the storage unit in association with the identification information input by the identification information input device when the detachable component is attached.
  • An observation condition adjustment unit, and the image correction unit performs the following processing using the indices x and y stored in the storage unit in association with the identification information input by the identification information input device. This is a fluorescence observation apparatus.
  • FL service FL after / RL after here
  • FL device luminance value of the fluorescent image after correction
  • RL before acquired fluorescence image, luminance value of reference image A
  • y (an-bm) / (bc-ad) (2)
  • a an index obtained by power approximation of the distance characteristic from the illumination unit to the subject of the luminance of the fluorescent image obtained by the fluorescence imaging unit when the subject is irradiated with excitation light of a predetermined intensity
  • b Index obtained by power-approximation of the cosine characteristic from the illumination unit to the subject of the luminance of the fluorescent image obtained by the fluorescence imaging unit when the subject is irradiated with excitation light of a predetermined intensity
  • c obtained by approximating the distance characteristic from the illumination unit to the subject of the luminance
  • Exponential d Approximate cosine characteristic from the illumination unit to the subject of the brightness of the reference image obtained by the return light imaging unit when illumination light of a predetermined intensity is irradiated toward the subject.
  • the fluorescence observation apparatus includes an illumination unit including a light source that emits illumination light and excitation light, a fluorescence imaging unit that captures fluorescence generated in the subject and acquires a fluorescence image, and returns from the subject.
  • a fluorescence provided with a return light imaging unit that captures the return light and acquires a reference image, and an image correction unit that corrects the fluorescence image captured by the fluorescence imaging unit using the reference image acquired by the return light imaging unit.
  • An observation device a detachable component that is attached and detached to change the observation conditions, an identification information input device that inputs identification information attached to the detachable component, the identification information, the indices x and y, and the observation condition And setting the observation conditions stored in the storage unit in association with the identification information input by the identification information input device when the detachable component is attached.
  • An observation condition adjustment unit, and the image correction unit performs the following processing using the indices x and y stored in the storage unit in association with the identification information input by the identification information input device. This is a fluorescence observation apparatus.
  • Exponential d Approximate cosine characteristic from the illumination unit to the subject of the brightness of the reference image obtained by the return light imaging unit when illumination light of a predetermined intensity is irradiated toward the subject.
  • the identification information is associated with the storage unit.
  • the stored observation conditions and indices x and y can be set.
  • the detachable part include a scope in an endoscope apparatus.
  • the observation conditions that are changed by attaching / detaching the detachable parts can include the NA of the objective optical system, the pupil diameter, the wavelength of the fluorescence that can be observed, and the like.
  • the wavelength of the illumination light is adjusted by the observation condition adjustment unit, and the most suitable for the changed observation condition and the adjusted observation condition. Indexes x and y that reduce distance dependency and angle dependency can be set, and fluorescence observation with high quantitativeness can be performed even when observation conditions vary.
  • the observation condition adjusting unit may be a wavelength adjusting unit that adjusts the wavelength of the illumination light.
  • an objective optical system for condensing fluorescence and return light returning from the subject is provided, and the observation condition adjusting unit is a variable diaphragm provided in the objective optical system. May be.
  • the observation condition adjusting unit may be a variable stop that adjusts the beam diameters of the illumination light and the excitation light.
  • an index a representing the dependence of the observation distance and the observation angle .About.d fluctuate, and indices x and y for correcting this change. Therefore, the indices x and y for obtaining a corrected fluorescence image in which the dependence of the observation distance and the observation angle is sufficiently suppressed can be obtained by adjusting the observation conditions, thereby performing fluorescence observation with higher quantitativeness. Can do.
  • the following correction processing is performed using a fluorescence image obtained by photographing fluorescence generated in a subject and using a reference image obtained by photographing return light returning from the subject.
  • FL service FL after / RL after here
  • FL device luminance value of the fluorescent image after correction
  • RL before acquired fluorescence image, luminance value of reference image A
  • y (an-bm) / (bc-ad) (2)
  • b a power approximation of the cosine characteristic from the illumination unit to the standard sample of the luminance of the fluorescence
  • FIG. 4 is a flowchart illustrating a subroutine for calculating indices a to d in the flowchart of FIG. 3. It is a whole block diagram which shows the 1st modification of the fluorescence observation system of FIG. It is a whole block diagram which shows the 2nd modification of the fluorescence observation system of FIG.
  • the fluorescence observation system 1 includes a fluorescence observation device 100 including an endoscope device, and a calibration device 101 combined with the fluorescence observation device 100.
  • the fluorescence observation apparatus 100 illuminates a subject X with an elongated insertion portion 2 inserted into the body, a light source (illumination portion) 3, and illumination light and excitation light from the light source 3 from the distal end of the insertion portion 2.
  • a unit (illuminating unit) 4 an imaging unit 5 that is provided at the distal end of the insertion unit 2, acquires image information of a living tissue that is the subject X, and is arranged on the proximal end side of the insertion unit 2 and acquired by the imaging unit 5.
  • the image processing unit 6 that processes the processed image information and the monitor 7 that displays the image G processed by the image processing unit 6 are provided.
  • the light source 3 is emitted from two xenon lamps 8, an excitation filter 9 that extracts excitation light (for example, a long band 650 to 740 nm) from illumination light emitted from one xenon lamp 8, and the other xenon lamp 8.
  • a filter turret (wavelength adjusting unit: observation condition adjusting unit) 10 capable of changing the wavelength cut out from the illumination light, a coupling lens 11 for condensing the excitation light and the illumination light cut out by the filter 9 and the filter turret 10;
  • a dichroic mirror 12 that combines the excitation light and the illumination light collected by the coupling lens 11 in the same optical path.
  • Reference numeral 13 in the figure denotes a mirror.
  • the illumination unit 4 is disposed over substantially the entire length in the longitudinal direction of the insertion portion 2, and is provided at the distal end of the insertion portion 2 and a light guide fiber 14 that guides the excitation light and the illumination light collected by the coupling lens 11. And an illumination optical system 15 that diffuses the excitation light and illumination light guided by the light guide fiber 14 and irradiates the subject X facing the distal end surface 2a of the insertion portion 2.
  • the imaging unit 5 includes an objective lens 16 that condenses collected light returning from a predetermined observation range of the subject X, and light (excitation light and fluorescence) that is longer than the excitation wavelength among the return light collected by the objective lens 16.
  • Dichroic mirror 17 that transmits illumination light having a wavelength shorter than the excitation wavelength, and two condensing lenses that collect the illumination light transmitted through dichroic mirror 17 and the fluorescence reflected by dichroic mirror 17 (imaging optics) System) 18 and two imaging elements 19 and 20 such as a CCD for imaging fluorescence and illumination light collected by the condenser lens 18.
  • reference numeral 21 denotes an excitation light cut filter that blocks excitation light from the light reflected by the dichroic mirror 17.
  • the image processing unit 6 generates a reference image G 1 from the reference image information S 1 acquired by the image sensor 19 and a fluorescence image G 2 from the fluorescence image information S 2 acquired by the image sensor 20. generating a fluorescence image generation unit 23, image correction for generating a fluorescence image G 3 that has been corrected based on the reference image G 1 and the fluorescence image G 2 generated by these reference image generating unit 22 and the fluorescence image generating portion 23 a part 24, and an image combining unit 25 for generating the generated corrected fluorescence image G 3 and image G by synthesizing the reference image G 1 generated in the reference image generation unit 22 in the image correcting unit 24 I have.
  • the fluorescence image G 2 may be a fluorescent image from the fluorescent dye Cy7.
  • a tumor-specific fluorescent image can be obtained by previously administering to a subject X a tumor-specific fluorescent agent, for example, a fluorescent agent in which an antibody against the cancer-specific molecule CEA (Anti-CEA antibody) and Cy7 are bound. it can be obtained G 2.
  • the reference image G 1, for example, the illumination light may be used an image based on return light due to scattering inside the return light and the object X which is reflected by the surface of an object X.
  • the image processing unit 6 is further transmitted from the calibration device and the distance and angle information transmitted from 101, the reference image generating unit reference image G 1 coming from 22 and the fluorescence image generating unit 23 described later fluorescence based on the image G 2, described below exponent x, and a dependent constant determining section 26 for calculating a y.
  • the dependency constant determining unit 26 and the filter turret 10 constitute an observation condition adjusting unit.
  • the fluorescent image G 2 and the reference image G 1 obtained by irradiating the subject X with the excitation light and the illumination light while changing the distance D from the illumination unit 4 to the subject X are determined in advance.
  • the average value of the luminance values of the obtained area is plotted against the distance D.
  • indices a and c indicating dependence on the observation distance D are obtained by regressing the obtained distance characteristics to power approximation, that is, to the power functions D a and D c .
  • the indices b and d with respect to the observation angle ⁇ are also obtained by irradiating the subject X with excitation light and illumination light while changing the angle ⁇ between the optical axis of the illumination unit 4 and the subject X.
  • indices c and d indicating dependence on the observation angle ⁇ are obtained by regressing the obtained cosine characteristic to power approximation, that is, to the power functions cos b ⁇ and cos d ⁇ .
  • the fluorescence image G 2 and the reference image G 1 have the following dependency on the observation distance D and the observation angle ⁇ : FL before ⁇ D a cos b ⁇ , RL before ⁇ D c cos d ⁇ If you divide this as it is, FL before / RL before ⁇ D a- c cos b-d ⁇ It becomes.
  • the observation distance D is, for example, the distance from the tip of the insertion portion 2 to the surface of the subject X
  • the observation angle ⁇ is, for example, the normal line of the surface of the subject X and the optical axis of the objective lens 16 (or the insertion portion 2). The angle formed with the major axis direction).
  • x (cn ⁇ dm) / (bc ⁇ ad) (1)
  • the assumed range of the observation distance D can be obtained from, for example, the depth of field of the objective lens 16, and the assumed range of the observation angle ⁇ can be obtained from, for example, the viewing angle of the objective lens 16.
  • the image synthesis unit 25 synthesizes the image G so that the reference image G 1 and the corrected fluorescence image G 3 are arranged in parallel and simultaneously displayed on the monitor 7, and outputs the synthesized image G to the monitor 7.
  • the image correction unit 24 includes a pre-processing unit 27 that performs pre-processing on the reference image G 1 generated by the reference image generation unit 22 and the fluorescent image G 2 generated by the fluorescent image generation unit 23. And a division processing unit that divides the pre-processed fluorescent image G 2 ′ by the pre-processed reference image G 1 ′.
  • the pre-processing unit 27 is configured to perform the following image processing method.
  • FL after A ⁇ FL before x (5)
  • a and B Constant It is.
  • the division processing unit 28 performs the following division operation using the luminance value FL after of the fluorescent image G 2 ′ preprocessed above and the luminance value RL after of the reference image G 1 ′ for each pixel, obtaining a corrected luminance value FL Revice fluorescence image G 3.
  • FL service FL after / RL after
  • the calibration device 101 includes a holder 29 that fixes the insertion portion 2 and a standard sample that is opposed to the distal end surface 2 a of the insertion portion 2 that is fixed to the holder 29 with an observation distance. 30, the linear motion stage 31 that changes the observation distance D between the distal end surface 2 a of the insertion portion 2 and the standard sample 30, and the angle (observation angle) of the surface of the standard sample 30 with respect to the optical axis of the objective lens 16. And a control unit 33 that controls the stages 31 and 32.
  • the dependence constant determining unit 26 first operates the filter turret 10 to switch the filter 10 a disposed on the optical path (step S ⁇ b> 1). Then, the dependency constant determination unit 26 performs the index a to d calculation step S2.
  • the start signal S 3 is output to the control unit 33 from the dependent constant determining section 26 (step S21), and the control unit 33, it depends on a constant determined It receives a start signal S 3 from the part 26, to drive each stage 31, 32.
  • control unit 33 drives the linear motion stage 31 so that the distal end surface 2a of the insertion unit 2 has an observation start distance with respect to the surface of the standard sample 30 (step S22), and sets the observation distance D at that time. It outputs to the dependence constant determination part 26 of the fluorescence observation apparatus 100 (step S23). In this state, illumination light and excitation light are emitted from the illumination unit 4 to the standard sample 30, and return light and fluorescence are photographed (step S24). Luminance values of the reference image G 1 generated in the luminance value and the reference image generating unit 21 of the fluorescence image G 2 generated in the fluorescence image generating unit 21 is sent to the dependent constant determining section 26 (step S25).
  • step S26 the control unit 33 repeats the above steps S22 to S25 a plurality of times a predetermined number of times (step S26).
  • the standard sample 30 is moved so that the distance between the distal end surface 2a of the insertion portion 2 and the surface of the standard sample 30 becomes the observation distance D of a plurality of points, and the observation distance D is changed to the dependence constant determining unit 26 each time.
  • Output to. Luminance value of the luminance value and the reference image G 1 of the fluorescence image G 2 obtained at each observation distance D is sent from the fluorescence image generating unit 23 and the reference image generating unit 22 in dependence constant determining section 26.
  • a plurality of observation distance D and the data group of a plurality of viewing distance luminance value of the fluorescence image G 2 and the reference image G 1 associated with the D is stored.
  • the function is returned to the power function (step S27), and indices a and c indicating the dependence on the observation distance D are calculated (step S28). .
  • control unit 33 drives the linear motion stage 31 and the tilt stage 32 so that the distal end surface 2a of the insertion unit 2 is at the observation start distance and angle with respect to the surface of the standard sample 30 (step S29).
  • illumination light and excitation light are applied to the standard sample 30 from the illumination unit 4, and return light and fluorescence are photographed (step S31).
  • Luminance values of the reference image G 1 generated in the luminance value and the reference image generating unit 22 of the generated fluorescence image G 2 in the fluorescence image generating unit 23 is sent to the dependent constant determining section 26 (step S32).
  • control unit 33 repeats the above steps S29 to S32 a plurality of times a predetermined number of times (step S33).
  • the standard sample 30 is moved so that the angle between the distal end surface 2a of the insertion portion 2 and the surface of the standard sample 30 becomes a plurality of observation angles ⁇ .
  • the observation angle ⁇ is changed to the dependence constant determining unit 26.
  • the luminance value of the fluorescent image G 2 and the luminance value of the reference image G 1 obtained at each observation angle ⁇ are sent from the fluorescent image generation unit 23 and the reference image generation unit 22 to the dependency constant determination unit 26.
  • a plurality of viewing angles ⁇ and data group of a plurality of viewing angles luminance value of the fluorescence image G 2 and the reference image G 1 associated with the ⁇ is stored, predetermined
  • the function is returned to the power function (step S34), and the indices b and d indicating the dependence on the observation angle ⁇ are calculated (step S35).
  • the index a to d calculation step S2 is completed.
  • the dependence constant determining unit 26 sets the filter turret 10 so that the determined wavelength of the illumination light is irradiated (step S7). Further, the dependence constant determining unit 26 corrects the luminance variation using the indices a to d obtained as described above and constants m and n set based on the preset allowable error e max. The indices x and y are calculated (step S8).
  • the error can be minimized by selecting the wavelength of illumination light that gives the dependence on the observation distance and the observation angle so that ⁇ becomes the minimum value, that is, as close to 0 as possible. Can do. That is, even if the allowable error e max is set as small as possible, there are constants m and n that satisfy the expression (3), and the indices x and y can be set based on the constants m and n.
  • the difference in types such as a rigid endoscope or a flexible endoscope, or an observation site such as an upper digestive endoscope or a lower digestive endoscopy is used. Even if there is a difference, the wavelength of the illumination light that minimizes ⁇ can be set for each of them. Therefore, optimal correction indices x and y corresponding to each can be set. . Even if the fluorescence observation apparatus 100 is the same type, the wavelength of illumination light that minimizes ⁇ can be set for each apparatus regardless of individual differences, and the optimum index corresponding to each can be set. x and y can be set.
  • the reference image G 1 and the fluorescence image G 2 acquired by the image sensors 19 and 20 include noise derived from dark current and readout of the image sensors 19 and 20.
  • the division processing the pixel of the luminance value of zero in the reference image G 1 is present, the division result can not perform appropriate correction becomes infinite. Therefore, in the preprocessing section 27, with respect to the fluorescence image G 2, given an offset so as to remove the noise component from the dark current and readout, the reference image G 1, the noise derived from the dark current and read In removing the component, an offset may be given so that the luminance values of all the pixels do not become zero.
  • the wavelength of the illumination light that can set the indices x and y that minimize ⁇ is selected.
  • a predetermined threshold value ⁇ max is provided, and an index that satisfies ⁇ ⁇ ⁇ max. You may decide to select the wavelength of the illumination light which can set x and y.
  • a phantom having scattering and absorption characteristics similar to those of a living body to be observed may be used, or a human or animal (pig, mouse, etc.) excised tissue may be used.
  • the filter turret 10 that is a wavelength adjusting unit is exemplified as the observation condition adjusting unit.
  • the wavelength adjusting unit other arbitrary means such as a slide-type switching filter and an acousto-optic device are employed. May be.
  • the filter turret 10 as shown in FIG. 5, the indexes a to d can be optimized by providing a variable diaphragm 36 after the objective lens 16 and adjusting the aperture of the objective lens 16.
  • Reference numeral 37 in the figure denotes a filter that transmits the wavelength bands of illumination light and excitation light.
  • the observed light includes not only the reflected light on the surface of the subject X but also a lot of light that is scattered and returned inside the subject X. If the aperture of the objective lens 16 is large, it is possible to capture a large amount of light that has been scattered and propagated from a position far from the optical axis. That is, the larger the aperture, the greater the contribution of light returned from inside the subject X. Since the ratio between the reflection of the surface of the subject X and the return light in the internal sky and the dependency on the observation distance D and the observation angle ⁇ are correlated, the indices a to d can be adjusted by adjusting the aperture.
  • the illumination unit 4 may be provided with a variable diaphragm 38.
  • the aperture is a point
  • the illuminance at the subject X is inversely proportional to the square of the distance, but when the aperture is not a point, the illuminance moves away from the relationship inversely proportional to the square.
  • Two one-dot chain lines intersect with the optical axis of the illumination optical system and are straight lines perpendicular to each other.
  • ⁇ proportional to the spread of the illumination light and the total intensity E of the illumination light
  • ⁇ is a constant (positive real number) related to the half width of Gaussian. (The larger the ⁇ , the smaller the half width.) Therefore, the total illuminance, which is the total illuminance when light emitted from all points in the opening reaches the irradiation surface, is as follows.
  • the total illuminance is as follows.
  • Equation 3 the opening becomes larger, the contribution of the term that is inversely proportional to the fourth power of the distance d 1 is increased, coming away from the property that the total illumination intensity is inversely proportional to the square of the distance.
  • an approximate value can be obtained by obtaining an approximate curve by the least square method or the like.
  • E 10
  • FIGS. 8A to 8C As described above, it can be approximated to a function proportional to the power of -1.997, -1.931, and -1.849. Thereby, fluorescence observation with higher quantitativeness can be performed.
  • a post-processing unit 35 that calculates the fluorescence image G 3 ′ by further raising the division value obtained by the division processing unit 28 to the exponent 1 / x may be provided.
  • the fluorescence intensity of the fluorescence image G 2 is proportional to the concentration of the fluorescent dye. Specifically, for example, the concentration of the fluorescent dye accumulated in the lesion or the like is C (mol / L), the volume of the sample is V (cm 3 ), and the disconnection occurs when the sample is cut along a plane parallel to the upper surface of the lesion.
  • the luminance E (W / cm 2 ⁇ sr) of the fluorescence generated from the lesion is E ⁇ CV / S ⁇ Ct It becomes.
  • the gradation value FL before the captured fluorescence image G 2 is, becomes roughly proportional to the thickness of the concentration and the lesion of the fluorescent dye accumulated in the lesion. That is, approximately FL before ⁇ Ct.
  • the fluorescence image G 3 ′ representing the fluorescence density linearly can be acquired by raising the exponent 1 / x in the post-processing unit 35. Therefore, it is possible to improve the quantitativeness of the fluorescence image and more accurately reflect the fluorescence density and the thickness of the lesion where the fluorescent dye is accumulated.
  • the wavelength of the illumination light that can set the indices x and y that minimize ⁇ is selected.
  • a predetermined threshold value ⁇ max is provided, and an index that satisfies ⁇ ⁇ ⁇ max.
  • ⁇ max is ⁇ max ⁇
  • the fluorescence observation system 1 Using light in a band including the excitation light of the white light and fluorescence agent as illumination light (wavelength band 400 ⁇ 740 nm), as the reference image G 1 employing a reflected light image of the illumination light reflected back in the sample Y surface.
  • the fluorescence image G 2 employing a fluorescence image generated from the fluorescent dye Cy7 injected into the interior of the sample Y.
  • sample Y a porcine isolated rectum was employed.
  • FIG. 10A shows that the axis of the insertion portion 2 is parallel to the normal line of the mounting surface 34 of the linear motion stage 31, while the linear motion stage 31 is lowered to increase the observation distance D. It was obtained by irradiating the illumination light and the excitation light and the reference image G 1 and the fluorescence image G 2 in a plurality of viewing distance D. As a result, plots showing observation distance characteristics as shown in FIGS. 11A and 11C were obtained.
  • FIG. 10B shows a plurality of observation angles while rotating around a center line arranged on the placement surface 34 from a position where the axis of the insertion portion 2 is parallel to the normal line of the placement surface 34. and it obtains a reference image G 1 and the fluorescence image G 2 is irradiated with illumination light and excitation light in. As a result, plots showing observation angle characteristics as shown in FIGS. 11B and 11D were obtained.
  • the fluorescence observation apparatus 40 is provided with an insertion portion (detachable part) 2 detachably attached to the light source 3.
  • an insertion portion (detachable part) 2 detachably attached to the light source 3.
  • various optical systems included in the insertion unit 2 including the objective lens 16 are changed.
  • the indices a to d change depending on changes in the numerical aperture (NA), the pupil diameter, etc., or the changes in the wavelength of fluorescence to be detected, the site to be observed (such as stomach tissue or large intestine tissue).
  • an IC chip (identification information input device) 41 that stores identification information in the insertion unit 2 and a reading device that reads identification information in the IC chip 41 on the light source 3 side to which the insertion unit 2 is attached.
  • 42 and a storage unit 43 that stores identification information, the wavelength of illumination light, and indices x and y suitable for each insertion unit 2 in association with each other.
  • the preprocessing unit 27 receives the indices x and y corresponding to the identification information of the insertion unit 2 output from the storage unit 43 from the reading device 42, performs the above calculation, and the illumination light output from the storage unit 43
  • the filter turret (observation condition adjusting unit) 10 is driven so that the wavelength of 1 is achieved.
  • the wavelength of illumination light that minimizes ⁇ is selected according to the insertion part 2, and according to the insertion part 2.
  • optimum indices x, y is set, there is an advantage that a high fluorescence image G 3 quantitativity can always be acquired.
  • the IC chip 41 is exemplified as the identification information input device.
  • any input means by manual input such as a keyboard may be adopted.
  • the filter turret 10 is exemplified as the observation condition adjusting unit.
  • the variable stop 36 of the objective optical system or the variable stop 38 of the illumination optical system may be adopted.

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Abstract

除算した画像に残存する距離と角度に対する依存性を十分に除去して定量性の高い蛍光画像によって観察を行う。蛍光観察装置（１００）と、該蛍光観察装置（１００）に接続され、標準試料（３０）と、該標準試料（３０）に対して蛍光観察装置（１００）の観察距離Ｄおよび観察角度θを変更可能に設定する観察状態設定機構（３１），（３２）とを備える較正装置（１０１）と、設定された観察距離Ｄおよび観察角度θと蛍光観察装置（１００）により標準試料（３０）を撮影して取得された参照画像Ｇ１および蛍光画像Ｇ２とに基づいて、観察条件を調節する観察条件調節部（１０）とを備える蛍光観察システム１を提供する。

Description

蛍光観察システム、蛍光観察装置および蛍光観察方法
　本発明は、蛍光観察システム、蛍光観察装置および蛍光観察方法に関するものである。
　従来、蛍光画像を反射光画像で除算して、観察距離や角度による蛍光画像の明るさの変動を補正する方法が知られている（例えば、特許文献１～特許文献３参照。）。
特開昭６２－２４７２３２号公報 特公平３－５８７２９号公報 特開２００６－１７５０５２号公報
　しかしながら、蛍光と反射光とでは、撮像される明るさの観察距離に対する依存性および観察角度に対する依存性が異なるため、単に蛍光画像を反射光画像で除算したのでは、距離および角度の影響を補正しきれないという問題がある。
　本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、除算した画像に残存する距離と角度に対する依存性を十分に除去して定量性の高い蛍光画像によって観察を行うことができる蛍光観察装置、蛍光観察システムおよび蛍光観察方法を提供することを目的としている。
　本発明の第１の態様にかかる蛍光観察システムは、照明光および励起光を照射する光源を備える照明部と、被写体において発生した蛍光を撮影し蛍光画像を取得する蛍光撮像部と、被写体から戻る戻り光を撮影し参照画像を取得する戻り光撮像部と、該戻り光撮像部により取得された参照画像を用いて前記蛍光撮像部により撮像された蛍光画像を補正する画像補正部とを備える蛍光観察装置と、該蛍光観察装置に接続され、標準試料と、該標準試料に対して前記蛍光観察装置の観察距離および観察角度を変更可能に設定する観察状態設定機構とを備える較正装置と、該較正装置により設定された観察距離および観察角度と前記蛍光観察装置により前記標準試料を撮影して取得された蛍光画像および参照画像とに基づいて、観察条件を調節する観察条件調節部とを備え、該観察条件調節部が、前記較正装置により設定された観察距離および観察角度と前記蛍光観察装置により前記標準試料を撮影して取得された蛍光画像および参照画像とに基づいて、指数ａ～ｄを算出し、ε＝｜ａｄ－ｂｃ｜が所定の閾値εｍａｘ以下となるように前記観察条件を調節し、前記画像補正部が、以下の処理を行う蛍光観察システムである。
　ＦＬｒｅｖｉｃｅ＝ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ
　ここで、
　ＦＬｒｅｖｉｃｅ：補正後の蛍光画像の輝度値
　ＦＬａｆｔｅｒ＝Ａ×ＦＬｂｅｆｏｒｅ ｘ
　ＲＬａｆｔｅｒ＝Ｂ×ＲＬｂｅｆｏｒｅ ｙ
　ＦＬｂｅｆｏｒｅ，ＲＬｂｅｆｏｒｅ：取得された蛍光画像、参照画像の輝度値
　Ａ，Ｂ：定数
　ｘ＝（ｃｎ－ｄｍ）／（ｂｃ－ａｄ）　　（１）
　ｙ＝（ａｎ－ｂｍ）／（ｂｃ－ａｄ）　　（２）
　ａ：所定の強度の励起光を前記標準試料に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの距離特性を累乗近似して得られた指数
　ｂ：所定の強度の励起光を前記標準試料に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの余弦特性を累乗近似して得られた指数
　ｃ：所定の強度の照明光を前記標準試料に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの距離特性を累乗近似して得られた指数
　ｄ：所定の強度の照明光を前記標準試料に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの余弦特性を累乗近似して得られた指数
　ｒＤ ｜ｍ｜・ｒθ ｜ｎ｜≦１＋ｅｍａｘ  　　　　　（３）
　ｒＤ＝Ｄｍａｘ／Ｄｍｉｎ
　ｒθ＝ｃｏｓθｍｉｎ／ｃｏｓθｍａｘ
　Ｄｍａｘ：想定される最大の観察距離
　Ｄｍｉｎ：想定される最小の観察距離
　θｍａｘ：想定される最大の観察角度
　θｍｉｎ：想定される最小の観察角度（ただし、０°≦θｍｉｎ＜θｍａｘ≦９０°）
　ｍ，ｎ：式（３）を満たす任意の定数
　ｅｍａｘ：（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍａｘ÷（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍｉｎ－１
　（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍａｘ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最大値
　（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍｉｎ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最小値
　ただし、ｂｃ－ａｄ＝０の場合には、ｘ，ｙは、ｘ：ｙ＝ｃ：ａ＝ｄ：ｂを満たす任意の実数から設定される。
　本発明の第１の態様によれば、蛍光観察に先立って、蛍光観察装置を較正装置にかけることで、標準試料を使用して撮影した画像に基づいて、観察条件調節部の作動により、蛍光観察装置における、より正確な指数ａ～ｄを算出し、かつ、εが閾値εｍａｘ以下となるような観察条件を設定することができる。これにより、蛍光観察装置に存在する個体差や、着脱部品が存在する場合にはその個体差にかかわらず、観察距離や観察角度に対する依存性を十分に低減した適正な指数ｘ、ｙを設定できる。
　すなわち、蛍光観察に際しては、照明部から被写体に励起光が照射されると、被写体内に存在する蛍光物質が励起され蛍光が発生する。発生した蛍光は蛍光撮像部によって撮影され蛍光画像が取得される。一方、照明部から被写体に照明光が照射されると、被写体の表面において反射等されて戻る戻り光が戻り光撮像部によって撮影され参照画像が取得される。取得された蛍光画像は、画像補正部において参照画像を用いて補正される。
　ここで、取得された蛍光画像における各画素の輝度値ＦＬｂｅｆｏｒｅおよび参照画像の輝度値ＲＬｂｅｆｏｒｅは、それぞれ、ＦＬｂｅｆｏｒｅ∝Ｄａｃｏｓｂθ、ＲＬｂｅｆｏｒｅ∝Ｄｃｃｏｓｄθであり、距離および角度に対して別々の依存性を有している。そこで、輝度値ＦＬｂｅｆｏｒｅを、何らかの指数ｘで累乗し、輝度値ＲＬｂｅｆｏｒｅを何らかの指数ｙで累乗することで、これらの依存性を低減することを考えた場合に、上記において算出された指数ａ～ｄおよび式（３）を満たす定数ｍ，ｎを用いて、式（１）、（２）により算出した指数ｘ，ｙを用いることで、観察条件に起因する変動を抑え、観察距離および観察角度による依存性を最大許容誤差率の範囲内に抑えた蛍光画像を得ることができ、定量性の高い蛍光観察を行うことができる。
　本発明の第２の態様にかかる蛍光観察システムは、照明光および励起光を照射する光源を備える照明部と、被写体において発生した蛍光を撮影し蛍光画像を取得する蛍光撮像部と、被写体から戻る戻り光を撮影し参照画像を取得する戻り光撮像部と、該戻り光撮像部により取得された参照画像を用いて前記蛍光撮像部により撮像された蛍光画像を補正する画像補正部とを備える蛍光観察装置と、該蛍光観察装置に接続され、標準試料と、該標準試料に対して前記蛍光観察装置の観察距離および観察角度を変更可能に設定する観察状態設定機構とを備える較正装置と、観察条件を調節する観察条件調節部とを備え、該観察条件調節部が、前記較正装置により設定された観察距離および観察角度と、前記蛍光観察装置により前記標準試料を撮影して取得された蛍光画像および参照画像とに基づいて指数ａ～ｄを算出し、ε＝｜ａｄ－ｂｃ｜が所定の閾値εｍａｘ以下となるように前記観察条件を調節し、前記画像補正部が、以下の処理を行う蛍光観察システムである。
　ＦＬｒｅｖｉｃｅ＝（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）1/ｘ
　ここで、
　ＦＬｒｅｖｉｃｅ：補正後の蛍光画像の輝度値
　ＦＬａｆｔｅｒ＝Ａ×ＦＬｂｅｆｏｒｅ ｘ
　ＲＬａｆｔｅｒ＝Ｂ×ＲＬｂｅｆｏｒｅ ｙ
　ＦＬｂｅｆｏｒｅ，ＲＬｂｅｆｏｒｅ：取得された蛍光画像、参照画像の輝度値
　Ａ，Ｂ：定数
　ｘ：ｙ＝ｃ：（ａ－ｍ）＝ｄ：（ｂ－ｎ）　　　（４）
　ａ：所定の強度の励起光を前記標準試料に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの距離特性を累乗近似して得られた指数
　ｂ：所定の強度の励起光を前記標準試料に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの余弦特性を累乗近似して得られた指数
　ｃ：所定の強度の照明光を前記標準試料に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの距離特性を累乗近似して得られた指数
　ｄ：所定の強度の照明光を前記標準試料に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの余弦特性を累乗近似して得られた指数
　ｒＤ ｜ｍ｜・ｒθ ｜ｎ｜≦１＋ｅｍａｘ  　　　　　（３）
　ｒＤ＝Ｄｍａｘ／Ｄｍｉｎ
　ｒθ＝ｃｏｓθｍｉｎ／ｃｏｓθｍａｘ
　Ｄｍａｘ：想定される最大の観察距離
　Ｄｍｉｎ：想定される最小の観察距離
　θｍａｘ：想定される最大の観察角度
　θｍｉｎ：想定される最小の観察角度（ただし、０°≦θｍｉｎ＜θｍａｘ≦９０°）
　ｍ，ｎ：式（３）および式（４）を満たす任意の定数
　ｅｍａｘ：（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍａｘ÷（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍｉｎ－１
　（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍａｘ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最大値
　（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍｉｎ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最小値。
　本発明の第２の態様によれば、指数ｘで累乗することで依存度を低減する処理を施した後にさらに、指数１／ｘで累乗することで、最終的に得られる補正された蛍光画像の輝度値と被写体内に含まれる蛍光物質の濃度との比例関係を保ちつつ、距離および角度依存性を低減することができる。
　上記第１の態様と第２の態様においては、ｍ＝０であることにしてもよい。
　このようにすることで、影響の大きな観察距離に対する依存性をなくし、観察角度に対する依存性を許容誤差の範囲内に納めることができ、さらに定量性の高い蛍光観察を行うことができる。
　本発明の第３の態様にかかる蛍光観察装置は、照明光および励起光を照射する光源を備える照明部と、被写体において発生した蛍光を撮影し蛍光画像を取得する蛍光撮像部と、被写体から戻る戻り光を撮影し参照画像を取得する戻り光撮像部と、該戻り光撮像部により取得された参照画像を用いて前記蛍光撮像部により撮像された蛍光画像を補正する画像補正部とを備える蛍光観察装置と、観察条件を変更するために着脱される着脱部品と、該着脱部品に付された識別情報を入力する識別情報入力装置と、前記識別情報と、指数ｘ，ｙと、前記観察条件とを対応づけて記憶する記憶部と、前記着脱部品が取り付けられたときに、前記識別情報入力装置により入力された前記識別情報に対応づけて前記記憶部に記憶されている観察条件に設定する観察条件調節部とを備え、前記画像補正部が、前記識別情報入力装置により入力された前記識別情報に対応づけて前記記憶部に記憶されている指数ｘ，ｙを用いて以下の処理を行う蛍光観察装置である。
　ＦＬｒｅｖｉｃｅ＝ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ
　ここで、
　ＦＬｒｅｖｉｃｅ：補正後の蛍光画像の輝度値
　ＦＬａｆｔｅｒ＝Ａ×ＦＬｂｅｆｏｒｅ ｘ
　ＲＬａｆｔｅｒ＝Ｂ×ＲＬｂｅｆｏｒｅ ｙ
　ＦＬｂｅｆｏｒｅ，ＲＬｂｅｆｏｒｅ：取得された蛍光画像、参照画像の輝度値
　Ａ，Ｂ：定数
　ｘ＝（ｃｎ－ｄｍ）／（ｂｃ－ａｄ）　　（１）
　ｙ＝（ａｎ－ｂｍ）／（ｂｃ－ａｄ）　　（２）
　ａ：所定の強度の励起光を前記被写体に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記被写体までの距離特性を累乗近似して得られた指数
　ｂ：所定の強度の励起光を前記被写体に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記被写体までの余弦特性を累乗近似して得られた指数
　ｃ：所定の強度の照明光を前記被写体に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記被写体までの距離特性を累乗近似して得られた指数
　ｄ：所定の強度の照明光を前記被写体に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記被写体までの余弦特性を累乗近似して得られた指数
　ｒＤ ｜ｍ｜・ｒθ ｜ｎ｜≦１＋ｅｍａｘ  　　　　　（３）
　ｒＤ＝Ｄｍａｘ／Ｄｍｉｎ
　ｒθ＝ｃｏｓθｍｉｎ／ｃｏｓθｍａｘ
　Ｄｍａｘ：想定される最大の観察距離
　Ｄｍｉｎ：想定される最小の観察距離
　θｍａｘ：想定される最大の観察角度
　θｍｉｎ：想定される最小の観察角度（ただし、０°≦θｍｉｎ＜θｍａｘ≦９０°）
　ｍ，ｎ：式（３）を満たす任意の定数
　ｅｍａｘ：（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍａｘ÷（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍｉｎ－１
　（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍａｘ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最大値
　（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍｉｎ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最小値
　ただし、ｂｃ－ａｄ＝０の場合には、ｘ，ｙは、ｘ：ｙ＝ｃ：ａ＝ｄ：ｂを満たす任意の実数から設定される。
　本発明の第４の態様にかかる蛍光観察装置は、照明光および励起光を照射する光源を備える照明部と、被写体において発生した蛍光を撮影し蛍光画像を取得する蛍光撮像部と、被写体から戻る戻り光を撮影し参照画像を取得する戻り光撮像部と、該戻り光撮像部により取得された参照画像を用いて前記蛍光撮像部により撮像された蛍光画像を補正する画像補正部とを備える蛍光観察装置と、観察条件を変更するために着脱される着脱部品と、該着脱部品に付された識別情報を入力する識別情報入力装置と、前記識別情報と、指数ｘ，ｙと、前記観察条件とを対応づけて記憶する記憶部と、前記着脱部品が取り付けられたときに、前記識別情報入力装置により入力された前記識別情報に対応づけて前記記憶部に記憶されている観察条件に設定する観察条件調節部とを備え、前記画像補正部が、前記識別情報入力装置により入力された前記識別情報に対応づけて前記記憶部に記憶されている指数ｘ，ｙを用いて以下の処理を行う蛍光観察装置である。
　ＦＬｒｅｖｉｃｅ＝（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）1/ｘ
　ここで、
　ＦＬｒｅｖｉｃｅ：補正後の蛍光画像の輝度値
　ＦＬａｆｔｅｒ＝Ａ×ＦＬｂｅｆｏｒｅ ｘ
　ＲＬａｆｔｅｒ＝Ｂ×ＲＬｂｅｆｏｒｅ ｙ
　ＦＬｂｅｆｏｒｅ，ＲＬｂｅｆｏｒｅ：取得された蛍光画像、参照画像の輝度値
　Ａ，Ｂ：定数
　ｘ：ｙ＝ｃ：（ａ－ｍ）＝ｄ：（ｂ－ｎ）　　　（４）
　ａ：所定の強度の励起光を前記被写体に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記被写体までの距離特性を累乗近似して得られた指数
　ｂ：所定の強度の励起光を前記被写体に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記被写体までの余弦特性を累乗近似して得られた指数
　ｃ：所定の強度の照明光を前記被写体に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記被写体までの距離特性を累乗近似して得られた指数
　ｄ：所定の強度の照明光を前記被写体に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記被写体までの余弦特性を累乗近似して得られた指数
　ｒＤ ｜ｍ｜・ｒθ ｜ｎ｜≦１＋ｅｍａｘ  　　　　　（３）
　ｒＤ＝Ｄｍａｘ／Ｄｍｉｎ
　ｒθ＝ｃｏｓθｍｉｎ／ｃｏｓθｍａｘ
　Ｄｍａｘ：想定される最大の観察距離
　Ｄｍｉｎ：想定される最小の観察距離
　θｍａｘ：想定される最大の観察角度
　θｍｉｎ：想定される最小の観察角度（ただし、０°≦θｍｉｎ＜θｍａｘ≦９０°）
　ｍ，ｎ：式（３）および式（４）を満たす任意の定数
　ｅｍａｘ：（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍａｘ÷（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍｉｎ－１
　（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍａｘ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最大値
　（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍｉｎ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最小値。
　本発明の第４の態様によれば、着脱部品を着脱して観察条件を変更し、着脱部品に付された識別情報が識別情報入力部から入力されると、記憶部に識別情報と対応づけて記憶されている観察条件および指数ｘ，ｙを設定することができる。着脱部品としては、例えば、内視鏡装置におけるスコープ等を挙げることができる。その場合に着脱部品の着脱によって変更される観察条件としては、対物光学系のＮＡや瞳径、観察可能な蛍光の波長等を挙げることができ、観察条件調節部により調節される観察条件としては、εが閾値εｍａｘ以下となるような照明光の波長や対物光学系の絞り値あるいは照明部における絞り値を挙げることができる。例えば、スコープの交換によって対物光学系のＮＡや瞳径が変更された場合に、観察条件調節部によって、照明光の波長が調節され、変更された観察条件および調節された観察条件に対して最も距離依存性および角度依存性を低減する指数ｘ，ｙを設定でき、観察条件が変動した場合においても定量性の高い蛍光観察を行うことができる。
　上記第３の態様と第４の態様においては、ｍ＝０であることにしてもよい。
　このようにすることで、影響の大きな観察距離に対する依存性をなくし、観察角度に対する依存性を許容誤差の範囲内に納めることができ、さらに定量性の高い蛍光観察を行うことができる。
　上記第２の態様と第４の態様においては、前記観察条件調節部が、前記照明光の波長を調節する波長調節部であってもよい。
　上記第２の態様と第４の態様においては、前記被写体から戻る蛍光および戻り光を集光する対物光学系を備え、前記観察条件調節部が、前記対物光学系に備えられた可変絞りであってもよい。
　上記いずれかの態様においては、前記観察条件調節部が、前記照明光および前記励起光の光束径を調節する可変絞りであってもよい。
　照明光の波長、対物光学系の開口径、照明光および励起光の光速径を変化させることによっても被写体における光の散乱や経路が変化するので、観察距離や観察角度の依存性を表す指数ａ～ｄが変動し、これを補正するための指数ｘ，ｙが変化する。したがって、観察距離や観察角度の依存性を十分に抑えた補正蛍光画像を得るための指数ｘ，ｙを観察条件の調節によって得ることができ、これによって、より定量性の高い蛍光観察を行うことができる。
　本発明の第５の態様にかかる蛍光観察方法は、標準試料に対して照明光および励起光を観察距離および観察角度を変更しながら照射し、前記標準試料において発生した蛍光を撮影して観察距離および／または観察角度の異なる複数の蛍光画像を取得し、前記標準試料から戻る戻り光を撮影して観察距離および／または観察角度の異なる複数の参照画像を取得し、取得された複数の蛍光画像および参照画像に基づいて、指数ａ～ｄを算出し、ε＝｜ａｄ－ｂｃ｜が所定の閾値εｍａｘ以下となるように観察条件を調節しておき、照明光および励起光を被写体に照射し、被写体において発生した蛍光を撮影して取得した蛍光画像を、被写体から戻る戻り光を撮影して取得した参照画像を用いて、以下の補正処理を行う蛍光観察方法である。
　ＦＬｒｅｖｉｃｅ＝ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ
　ここで、
　ＦＬｒｅｖｉｃｅ：補正後の蛍光画像の輝度値
　ＦＬａｆｔｅｒ＝Ａ×ＦＬｂｅｆｏｒｅ ｘ
　ＲＬａｆｔｅｒ＝Ｂ×ＲＬｂｅｆｏｒｅ ｙ
　ＦＬｂｅｆｏｒｅ，ＲＬｂｅｆｏｒｅ：取得された蛍光画像、参照画像の輝度値
　Ａ，Ｂ：定数
　ｘ＝（ｃｎ－ｄｍ）／（ｂｃ－ａｄ）　　　（１）
　ｙ＝（ａｎ－ｂｍ）／（ｂｃ－ａｄ）　　　（２）
　ａ：所定の強度の励起光を前記標準試料に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの距離特性を累乗近似して得られた指数
　ｂ：所定の強度の励起光を前記標準試料に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの余弦特性を累乗近似して得られた指数
　ｃ：所定の強度の照明光を前記標準試料に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの距離特性を累乗近似して得られた指数
　ｄ：所定の強度の照明光を前記標準試料に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの余弦特性を累乗近似して得られた指数
　ｒＤ ｜ｍ｜・ｒθ ｜ｎ｜≦１＋ｅｍａｘ  　　　　　（３）
　ｒＤ＝Ｄｍａｘ／Ｄｍｉｎ
　ｒθ＝ｃｏｓθｍｉｎ／ｃｏｓθｍａｘ
　Ｄｍａｘ：想定される最大の観察距離
　Ｄｍｉｎ：想定される最小の観察距離
　θｍａｘ：想定される最大の観察角度
　θｍｉｎ：想定される最小の観察角度（ただし、０°≦θｍｉｎ＜θｍａｘ≦９０°）
　ｍ，ｎ：式（３）を満たす任意の定数
　ｅｍａｘ：（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍａｘ÷（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍｉｎ－１
　（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍａｘ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最大値
　（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍｉｎ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最小値
　ただし、ｂｃ－ａｄ＝０の場合には、ｘ，ｙは、ｘ：ｙ＝ｃ：ａ＝ｄ：ｂを満たす任意の実数から設定される。
　本発明の第６の態様にかかる蛍光観察方法は、標準試料に対して照明光および励起光を観察距離および観察角度を変更しながら照射し、前記標準試料において発生した蛍光を撮影して観察距離および／または観察角度の異なる複数の蛍光画像を取得し、前記標準試料から戻る戻り光を撮影して観察距離および／または観察角度の異なる複数の参照画像を取得し、取得された複数の蛍光画像および参照画像に基づいて、指数ａ～ｄを算出し、ε＝｜ａｄ－ｂｃ｜が所定の閾値εｍａｘ以下となるように観察条件を調節しておき、照明光および励起光を被写体に照射し、被写体において発生した蛍光を撮影して取得した蛍光画像を、被写体から戻る戻り光を撮影して取得した参照画像を用いて、以下の補正処理を行う蛍光観察方法である。
　ＦＬｒｅｖｉｃｅ＝（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）1/ｘ
　ここで、
　ＦＬｒｅｖｉｃｅ：補正後の蛍光画像の輝度値
　ＦＬａｆｔｅｒ＝Ａ×ＦＬｂｅｆｏｒｅ ｘ
　ＲＬａｆｔｅｒ＝Ｂ×ＲＬｂｅｆｏｒｅ ｙ
　ＦＬｂｅｆｏｒｅ，ＲＬｂｅｆｏｒｅ：取得された蛍光画像、参照画像の輝度値
　Ａ，Ｂ：定数
　ｘ：ｙ＝ｃ：（ａ－ｍ）＝ｄ：（ｂ－ｎ）　　　（４）
　ａ：所定の強度の励起光を前記標準試料に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの距離特性を累乗近似して得られた指数
　ｂ：所定の強度の励起光を前記標準試料に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの余弦特性を累乗近似して得られた指数
　ｃ：所定の強度の照明光を前記標準試料に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの距離特性を累乗近似して得られた指数
　ｄ：所定の強度の照明光を前記標準試料に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの余弦特性を累乗近似して得られた指数
　ｒＤ ｜ｍ｜・ｒθ ｜ｎ｜≦１＋ｅｍａｘ  　　　　　（３）
　ｒＤ＝Ｄｍａｘ／Ｄｍｉｎ
　ｒθ＝ｃｏｓθｍｉｎ／ｃｏｓθｍａｘ
　Ｄｍａｘ：想定される最大の観察距離
　Ｄｍｉｎ：想定される最小の観察距離
　θｍａｘ：想定される最大の観察角度
　θｍｉｎ：想定される最小の観察角度（ただし、０°≦θｍｉｎ＜θｍａｘ≦９０°）
　ｍ，ｎ：式（３）および式（４）を満たす任意の定数
　ｅｍａｘ：（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍａｘ÷（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍｉｎ－１
　（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍａｘ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最大値
　（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍｉｎ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最小値。
　除算した画像に残存する距離と角度に対する依存性を十分に除去して定量性の高い蛍光画像によって観察を行うことができるという効果を奏する。
本発明の一実施形態に係る蛍光観察システムを示す全体構成図である。 図１の蛍光観察システムの較正装置を示す図である。 図１の蛍光観察システムの依存定数決定部による指数ｘ，ｙの設定方法を示すフローチャートである。 図３のフローチャートにおける指数ａ～ｄの算出サブルーチンを説明するフローチャートである。 図１の蛍光観察システムの第１の変形例を示す全体構成図である。 図１の蛍光観察システムの第２の変形例を示す全体構成図である。 開口が有限の大きさを有するときの被写体上の照射面への照度と距離との関係を説明する図である。 図７において開口径を変えたときの所定の条件下で得られた照度の観察距離特性を累乗近似したグラフを示す図である。 図７において開口径を変えたときの所定の条件下で得られた照度の観察距離特性を累乗近似したグラフを示す図である。 図７において開口径を変えたときの所定の条件下で得られた照度の観察距離特性を累乗近似したグラフを示す図である。 図１の蛍光観察システムの第３の変形例を示す全体構成図である。 図１の蛍光観察システムにおける距離依存性の測定を説明する図である。 図１の蛍光観察システムにおける角度依存性の測定を説明する図である。 図１０Ａの測定結果に基づく観察距離特性とそれに基づく累乗近似曲線のグラフを示す図である。 図１０Ｂの測定結果に基づく観察角度特性とそれに基づく累乗近似曲線のグラフを示す図である。 図１０Ａの測定結果に基づく観察距離特性とそれに基づく累乗近似曲線のグラフを示す図である。 図１０Ｂの測定結果に基づく観察角度特性とそれに基づく累乗近似曲線のグラフを示す図である。 本発明の一実施形態に係る蛍光観察装置を示す全体構成図である。
　以下、本発明の一実施形態に係る蛍光観察システム１について、図面を参照して説明する。
　本実施形態に係る蛍光観察システム１は、図１に示されるように、内視鏡装置からなる蛍光観察装置１００と、該蛍光観察装置１００に組み合わせられる較正装置１０１とを備えている。
　蛍光観察装置１００は、体内に挿入される細長い挿入部２と、光源（照明部）３と、該光源３からの照明光および励起光を挿入部２の先端から被写体Ｘに向けて照射する照明ユニット（照明部）４と、挿入部２の先端に設けられ、被写体Ｘである生体組織の画像情報を取得する撮像ユニット５と、挿入部２の基端側に配置され、撮像ユニット５により取得された画像情報を処理する画像処理部６と、該画像処理部６により処理された画像Ｇを表示するモニタ７とを備えている。
　光源３は、２つのキセノンランプ８と、一方のキセノンランプ８から発せられた照明光から、励起光（例えば、長帯域６５０～７４０ｎｍ）を切り出す励起フィルタ９と、他方のキセノンランプ８から発せられた照明光から切り出す波長を変更可能なフィルタターレット（波長調節部：観察条件調節部）１０と、フィルタ９およびフィルタターレット１０により切り出された励起光および照明光を集光するカップリングレンズ１１と、該カップリングレンズ１１により集光された励起光および照明光を同一光路に合波するダイクロイックミラー１２とを備えている。図中符号１３はミラーである。
　照明ユニット４は、挿入部２の長手方向のほぼ全長にわたって配置され、カップリングレンズ１１によって集光された励起光および照明光を導光するライトガイドファイバ１４と、挿入部２の先端に設けられ、ライトガイドファイバ１４によって導光されてきた励起光および照明光を拡散させて、挿入部２の先端面２ａに対向する被写体Ｘに照射する照明光学系１５とを備えている。
　撮像ユニット５は、被写体Ｘの所定の観察範囲から戻る取り光を集光する対物レンズ１６と、該対物レンズ１６によって集光された戻り光の内、励起波長以上の光（励起光および蛍光）を反射し、励起波長より短い波長の照明光を透過するダイクロイックミラー１７と、ダイクロイックミラー１７を透過した照明光およびダイクロイックミラー１７により反射された蛍光をそれぞれ集光する２つの集光レンズ（撮像光学系）１８と、集光レンズ１８によって集光された蛍光および照明光を撮像するＣＣＤのような２個の撮像素子１９，２０とを備えている。図中、符号２１は、ダイクロイックミラー１７によって反射された光から励起光を遮断する励起光カットフィルタである。
　画像処理部６は、撮像素子１９により取得された参照画像情報Ｓ１から参照画像Ｇ１を生成する参照画像生成部２２と、撮像素子２０により取得された蛍光画像情報Ｓ２から蛍光画像Ｇ２を生成する蛍光画像生成部２３と、これら参照画像生成部２２および蛍光画像生成部２３により生成された参照画像Ｇ１および蛍光画像Ｇ２に基づいて補正された蛍光画像Ｇ３を生成する画像補正部２４と、該画像補正部２４において生成された補正された蛍光画像Ｇ３と参照画像生成部２２において生成された参照画像Ｇ１とを合成して画像Ｇを生成する画像合成部２５とを備えている。
　ここで、蛍光画像Ｇ２としては、例えば、蛍光色素Ｃｙ７からの蛍光画像とすればよい。特に、腫瘍特異的な蛍光薬剤、例えば、癌特異的分子ＣＥＡに対する抗体（Ａｎｔｉ－ＣＥＡ抗体）とＣｙ７とを結合させた蛍光薬剤を予め被写体Ｘに投与しておけば、腫瘍特異的な蛍光画像Ｇ２を得ることができる。参照画像Ｇ１としては、例えば、照明光が被写体Ｘの表面で反射した戻り光および被写体Ｘの内部での散乱による戻り光に基づく画像を用いればよい。
　画像処理部６は、さらに、後述する較正装置１０１から送られてくる距離および角度情報と、参照画像生成部２２から送られてくる参照画像Ｇ１および蛍光画像生成部２３から送られてくる蛍光画像Ｇ２とに基づいて、後述する指数ｘ，ｙを算出する依存定数決定部２６を備えている。
　依存定数決定部２６は、フィルタターレット１０を作動させて切り出す照明光の波長を切り替えるとともに、較正装置１０１に起動信号Ｓ３を出力し、各照明光の波長において後述する指数ａ～ｄを算出するようになっている。そして、依存定数決定部２６は、ε＝｜ａｄ－ｂｃ｜が最小となる照明光の波長を求めて、その波長のフィルタ１０ａが光路上に配置されるようにフィルタターレット１０を設定し、かつ、そのときの指数ａ～ｄに基づいて指数ｘ，ｙを選択するようになっている。依存定数決定部２６およびフィルタターレット１０は観察条件調節部を構成している。
　ここで、依存定数決定部２６における指数ａ～ｄの算出方法について説明する。
　すなわち、照明ユニット４から被写体Ｘまでの距離Ｄを変更しながら、照明ユニット４から被写体Ｘに対して励起光および照明光を照射して得られた蛍光画像Ｇ２および参照画像Ｇ１の予め定められた領域の輝度値の平均値を、距離Ｄに対してプロットする。このようにして、得られた距離特性を累乗近似、すなわち、累乗関数Ｄａ，Ｄｃに回帰することにより観察距離Ｄに対する依存性を示す指数ａ，ｃを得る。
　同様にして、観察角度θに対する指数ｂ，ｄも、照明ユニット４の光軸と被写体Ｘとの角度θを変更しながら、照明ユニット４から被写体Ｘに対して励起光および照明光を照射して得られた蛍光画像Ｇ２および参照画像Ｇ１の予め定められた領域の輝度値の平均値を、角度の余弦値ｃｏｓθに対してプロットする。このようにして、得られた余弦特性を累乗近似、すなわち、累乗関数ｃｏｓｂθ、ｃｏｓｄθに回帰することにより観察角度θに対する依存性を示す指数ｂ，ｄを得る。
　次に、依存定数決定部２６における指数ｘ，ｙの算出方法について説明する。
　一般に、蛍光画像Ｇ２および参照画像Ｇ１は、観察距離Ｄと観察角度θに対して以下のような依存性を有している
　ＦＬｂｅｆｏｒｅ∝Ｄａｃｏｓｂθ、ＲＬｂｅｆｏｒｅ∝Ｄｃｃｏｓｄθ
　これをこのまま除算すると、
　ＦＬｂｅｆｏｒｅ／ＲＬｂｅｆｏｒｅ∝Ｄａ－ｃｃｏｓｂ－ｄθ
となる。
　ここで、観察距離Ｄは、例えば、挿入部２の先端から被写体Ｘ表面までの距離、観察角度θは、例えば、被写体Ｘの表面の法線と対物レンズ１６の光軸（または挿入部２の長軸方向）とのなす角度とすることができる。
　そこで、指数ｘ，ｙをそれぞれ蛍光画像Ｇ２、参照画像Ｇ１の輝度値に累乗した場合には、
　ＦＬｂｅｆｏｒｅ ｘ／ＲＬｂｅｆｏｒｅ ｙ∝Ｄａｘ－ｃｙｃｏｓｂｘ－ｄｙθ
　となるので、ここで、ｍ＝ａｘ－ｃｙ、ｎ＝ｂｘ－ｄｙとして、ｍ，ｎが許容限度となるように指数ｘ，ｙを設定する。
　すなわち、
　ｘ＝（ｃｎ－ｄｍ）／（ｂｃ－ａｄ）　　　（１）
　ｙ＝（ａｎ－ｂｍ）／（ｂｃ－ａｄ）　　　（２）
であり、分母ｂｃ－ａｄ＝０となる場合には、ｘ：ｙ＝ｃ：ａ＝ｄ：ｂとなるように指数ｘ，ｙを設定する。
　想定される最大の観察距離Ｄｍａｘ、最小の観察距離Ｄｍｉｎ、想定される最大の観察角度θｍａｘ、最小の観察角度θｍｉｎ（０°≦θｍｉｎ＜θｍａｘ≦９０°）とすると、それぞれの比ｒＤ，ｒθは、
　ｒＤ＝Ｄｍａｘ／Ｄｍｉｎ，ｒθ＝ｃｏｓθｍｉｎ／ｃｏｓθｍａｘ
となり、補正蛍光画像における最大許容誤差率ｅｍａｘを用いて、
　ｒＤ ｜ｍ｜・ｒθ ｜ｎ｜≦１＋ｅｍａｘ　　　（３）
となるｍ，ｎを選択する。
　ここで、想定される観察距離Ｄの範囲は、例えば、対物レンズ１６の被写界深度から求めることができ、想定される観察角度θの範囲は、例えば、対物レンズ１６の視野角から求めることができる。
　ｅｍａｘは、
　（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍａｘ÷（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍｉｎ＝１＋ｅｍａｘ
により求められる。
　したがって、まず、予め最大許容誤差率ｅｍａｘを設定し、次に式（３）を満たすようなｍ、ｎを設定し、設定したｍ、ｎに基づき式（１）および式（２）を満たすようなｘ、ｙを設定すればよい。
　画像合成部２５は、例えば、参照画像Ｇ１と補正された蛍光画像Ｇ３とを並列に配置してモニタ７に同時に表示させるよう画像Ｇを合成し、モニタ７に出力するようになっている。
　画像補正部２４は、参照画像生成部２２により生成された参照画像Ｇ１および蛍光画像生成部２３により生成された蛍光画像Ｇ２に前処理を施す前処理部２７と、該前処理部２７において前処理を施された蛍光画像Ｇ２’を、前処理を施された参照画像Ｇ１’で除算する除算処理部２８とを備えている。
　前処理部２７は、以下の画像処理方法を実施するようになっている。
　ＦＬａｆｔｅｒ＝Ａ×ＦＬｂｅｆｏｒｅ ｘ　　　（５）
　ＲＬａｆｔｅｒ＝Ｂ×ＲＬｂｅｆｏｒｅ ｙ　　　（６）
　ここで、
　ＦＬｂｅｆｏｒｅ，ＲＬｂｅｆｏｒｅ：取得された蛍光画像Ｇ２、参照画像Ｇ１の輝度値
　ＦＬａｆｔｅｒ，ＲＬａｆｔｅｒ：前処理された蛍光画像Ｇ２’、参照画像Ｇ１’の輝度値
　Ａ，Ｂ：定数
である。
　除算処理部２８においては、画素毎に上記において前処理された蛍光画像Ｇ２’の輝度値ＦＬａｆｔｅｒと、参照画像Ｇ１’の輝度値ＲＬａｆｔｅｒとを用いて、以下の除算演算を行い、補正された蛍光画像Ｇ３の輝度値ＦＬｒｅｖｉｃｅを取得する。
　ＦＬｒｅｖｉｃｅ＝ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ
　較正装置１０１は、図２に示されるように、挿入部２を固定するホルダ２９と、該ホルダ２９に固定された挿入部２の先端面２ａに対して観察距離をあけて対向させられる標準試料３０と、挿入部２の先端面２ａと標準試料３０との間の観察距離Ｄを変更する直動ステージ３１と、対物レンズ１６の光軸に対する標準試料３０の表面の角度（観察角度）を変更するチルトステージ３２と、これらのステージ３１，３２を制御する制御部３３とを備えている。
　ここで、依存定数決定部２６による指数ｘ，ｙの設定方法について図３および図４を参照して説明する。
　依存定数決定部２６は、図３に示されるように、まず、フィルタターレット１０を作動させて光路上に配置するフィルタ１０ａを切り替える（ステップＳ１）。そして、依存定数決定部２６は、指数ａ～ｄ算出ステップＳ２を実施する。
　指数ａ～ｄ算出ステップＳ２においては、図４に示されるように、依存定数決定部２６から制御部３３に対して起動信号Ｓ３が出力され（ステップＳ２１）、制御部３３は、依存定数決定部２６からの起動信号Ｓ３を受けて、各ステージ３１，３２を駆動する。
　制御部３３は、まず、標準試料３０の表面に対して挿入部２の先端面２ａが観察開始の距離となるように直動ステージ３１を駆動させ（ステップＳ２２）、そのときの観察距離Ｄを蛍光観察装置１００の依存定数決定部２６に出力する（ステップＳ２３）。この状態で、照明ユニット４から照明光および励起光を標準試料３０に対して照射し、戻り光および蛍光が撮影される（ステップＳ２４）。蛍光画像生成部２１において生成された蛍光画像Ｇ２の輝度値および参照画像生成部２１において生成された参照画像Ｇ１の輝度値は依存定数決定部２６に送られる（ステップＳ２５）。
　そして、制御部３３は、上記ステップＳ２２～Ｓ２５を予め定められた回数だけ、複数回にわたって繰り返す（ステップＳ２６）。これにより、挿入部２の先端面２ａと標準試料３０の表面との距離が、複数点の観察距離Ｄとなるように標準試料３０を移動させ、その都度、観察距離Ｄを依存定数決定部２６に出力する。各観察距離Ｄにおいて得られた蛍光画像Ｇ２の輝度値および参照画像Ｇ１の輝度値が、蛍光画像生成部２３および参照画像生成部２２から依存定数決定部２６に送られる。
　これにより、依存定数決定部２６においては、複数の観察距離Ｄと複数の観察距離Ｄに対応づけられた蛍光画像Ｇ２および参照画像Ｇ１の輝度値のデータ群が記憶される。そして、予め定められた数のデータ群が集められたところで、上述したように、累乗関数に回帰し（ステップＳ２７）、観察距離Ｄに対する依存性を示す指数ａ，ｃを算出する（ステップＳ２８）。
　制御部３３は、次いで、標準試料３０の表面に対して挿入部２の先端面２ａが観察開始の距離および角度となるように直動ステージ３１およびチルトステージ３２を駆動させ（ステップＳ２９）、そのときの観察角度θを蛍光観察装置１００の依存定数決定部２６に出力するようになっている（ステップＳ３０）。この状態で、照明ユニット４から照明光および励起光を標準試料３０に対して照射し、戻り光および蛍光を撮影する（ステップＳ３１）。蛍光画像生成部２３において生成された蛍光画像Ｇ２の輝度値および参照画像生成部２２において生成された参照画像Ｇ１の輝度値は依存定数決定部２６に送られる（ステップＳ３２）。
　そして、制御部３３は、上記ステップＳ２９～Ｓ３２を予め定められた回数だけ、複数回にわたって繰り返す（ステップＳ３３）。これにより、挿入部２の先端面２ａと標準試料３０の表面との角度が、複数点の観察角度θとなるように標準試料３０を移動させ、その都度、観察角度θを依存定数決定部２６に出力する。各観察角度θにおいて得られた蛍光画像Ｇ２の輝度値および参照画像Ｇ１の輝度値が、蛍光画像生成部２３および参照画像生成部２２から依存定数決定部２６に送られる。これにより、依存定数決定部２６においては、複数の観察角度θと複数の観察角度θに対応づけられた蛍光画像Ｇ２および参照画像Ｇ１の輝度値のデータ群が記憶され、予め定められた数のデータ群が集められたところで、上述したように、累乗関数に回帰し（ステップＳ３４）、観察角度θに対する依存性を示す指数ｂ，ｄを算出する（ステップＳ３５）。これにより、指数ａ～ｄ算出ステップＳ２が終了する。
　次に、依存定数決定部は、ε＝｜ａｄ－ｂｃ｜を算出し（ステップＳ３）、ε、ａ～ｄおよび照明光の波長を対応づけて記憶し（ステップＳ４）、必要な全ての波長について指数ａ～ｄが算出されたかを判定する（ステップＳ５）。必要な全ての波長について指数ａ～ｄが算出されていないときには、ステップＳ１に戻って照明光の波長を切り替え、ステップＳ２～ステップＳ５を繰り返す。一方、必要な全ての波長について指数ａ～ｄが算出されているときには、εを比較して最小値となる照明光の波長と指数ａ～ｄを決定する（ステップＳ６）。
　そして、依存定数決定部２６は、決定された照明光の波長が照射されるようにフィルタターレット１０を設定する（ステップＳ７）。さらに、依存定数決定部２６は、上記により求められた指数ａ～ｄおよび、予め設定されている許容誤差ｅｍａｘに基づいて設定された定数ｍ，ｎを用いて、輝度の変動を補正するための指数ｘ，ｙを算出する（ステップＳ８）。
　ここで、仮にｍ＝ｎ＝０と設定することができるならば、許容誤差ｅｍａｘを限りなく０に近い値に設定することができる。つまり誤差を最小に抑えることができる。
　一方で、通常は、ｍ＝ａｘ－ｃｙ、ｎ＝ｂｘ－ｄｙに対して、定数ｍ，ｎをｍ＝ｎ＝０と設定すると、ｘ＝ｙ＝０以外の解が存在しないため、このような設定をすることができない。ただし、｜ａｄ－ｂｃ｜＝εとして、ε＝０となるような観察距離Ｄに対する依存性または観察角度θに対する依存性が得られるように照明光の波長を設定することができれば、ｍ＝ａｘ－ｃｙ、ｎ＝ｂｘ－ｄｙに対して、定数ｍ，ｎをｍ＝ｎ＝０と設定しても、ｘ：ｙ＝ｃ：ａ＝ｄ：ｂとなるような指数ｘ，ｙを設定することができる。
　したがって、照明光の波長が、ε＝０あるいは、できる限り０に近い値になるように設定されていることが好ましい。このようにすることで、補正後の蛍光画像Ｇ３の観察距離Ｄと観察角度θに対する依存性を両方ともほぼ消去することができ、誤差をおおむねゼロにすることができ、蛍光画像Ｇ３の定量性を最大限に向上させることができる。
　以上のことから、εが最小値となる、つまりできるだけ０に近い値になるように観察距離および観察角度に対する依存性が得られる照明光の波長を選択することによって、誤差を最小限に抑えることができる。つまり許容誤差ｅｍａｘをできるだけ小さな値に設定しても式（３）を満たす、定数ｍ，ｎが存在し、定数ｍ，ｎをもとに指数ｘ，ｙを設定することができる。
　例えば、蛍光観察装置１００として内視鏡に適用する場合には、硬性鏡や軟性鏡のような種類の違い、あるいは、上部消化器内視鏡や下部消化器内視鏡のような観察部位の違いなどがあったとしても、それぞれに対してεが最小となるような照明光の波長を設定することができるため、それぞれに対応した最適な補正用の指数ｘ，ｙを設定することができる。同一種類の蛍光観察装置１００であったとしても、個体差に拘わらず、個々の装置に対してεが最小となるような照明光の波長を設定することができ、それぞれに対応した最適な指数ｘ，ｙを設定することができる。
　このように構成された本実施形態に係る蛍光観察システム１によれば、相互に異なる依存性をもって蛍光画像Ｇ２および参照画像Ｇ１内に含まれている観察距離Ｄおよび観察角度θの依存性を許容可能な範囲内において十分に低減することができる。したがって、定量性の高い補正後の蛍光画像Ｇ３を得て、精度良く観察することができるという利点がある。
　本実施形態においては、撮像素子１９，２０によって取得された参照画像Ｇ１および蛍光画像Ｇ２には、撮像素子１９，２０の暗電流や読み出しに由来したノイズが含まれている。除算処理をする際に、参照画像Ｇ１に輝度値ゼロの画素が存在すると、除算結果が無限大となって適正な補正を行うことができない。
　そこで、前処理部２７において、蛍光画像Ｇ２に対しては、暗電流や読み出しに由来するノイズ成分を除去するようなオフセットを与え、参照画像Ｇ１には、暗電流や読み出しに由来するノイズ成分を除去する上に、全ての画素の輝度値がゼロとならないようなオフセットを与えることにしてもよい。
　本実施形態においては、εが最小となる指数ｘ，ｙを設定できる照明光の波長を選択することとしたが、これに代えて、所定の閾値εｍａｘを設け、ε≦εｍａｘとなる指数ｘ，ｙを設定できる照明光の波長を選択することにしてもよい。
　本実施形態における標準試料３０としては、観察しようとする生体と同様の散乱や吸収特性を有するファントムを用いてもよいし、ヒトや動物（ブタやマウス等）の切除組織を用いてもよい。
　本実施形態においては、観察条件調節部として、波長調節部であるフィルタターレット１０を例示したが、波長調節部としては、スライド式の切替フィルタや音響光学素子等の他の任意の手段を採用してもよい。フィルタターレット１０に代えて、図５に示されるように、対物レンズ１６の後段に可変絞り３６を設け、対物レンズ１６の開口を調節することによっても、指数ａ～ｄを最適化することができる。図中符号３７は照明光および励起光の波長帯域を透過させるフィルタである。
　観察される光には被写体Ｘの表面における反射光だけではなく、被写体Ｘの内部で散乱されて戻ってきた光も多く含まれる。対物レンズ１６の開口が大きければ、多重散乱して光軸から大きく外れた所から伝播してきた光も多く取り込むことができる。つまり、開口が大きいほど被写体Ｘ内部から戻ってきた光の寄与が大きくなる。被写体Ｘの表面の反射と内部空の戻り光との比率と、観察距離Ｄおよび観察角度θに対する依存性とが相関するため、開口を調整することにより指数ａ～ｄを調節することができる。
　図６に示されるように、照明ユニット４に可変絞り３８を設けることにしてもよい。例えば、開口が点である場合には被写体Ｘでの照度は距離の２乗に反比例するが、点ではない場合には２乗に反比例する関係から遠ざかる。
　ここで、例として、照明光が光軸を中心にガウシアン分布を有し、開口が有限の大きさを有するときの被写体Ｘ上の照射面への照度と距離との関係を考える。図７に示されるように、照明光の光軸上にあり、照明光学系１５の開口から距離ｄ１だけ離れた被写体Ｘ上の照射面における照度と距離の変化を考える。開口の半径ａ１、距離ｄ１とする。ここで、照明光光学系の開口平面上において光軸からａ１’～ａ１’＋ｄａ１’だけ離れ、角度θ～θ＋ｄθの範囲から放出される光が照射面に到達するときの照度を表す。角度θは、図７の下側の図（照明光学系の開口を下方から見た図）のように定義される。２本の一点鎖線は照明光学系の光軸と交わり、互いに垂直な直線である。照明光の広がりに比例する定数α、照明光の総強度Ｅとして、照射面における照度は、以下の通りとなる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
  
　ここで、βはガウシアンの半値幅に関連する定数（正の実数）である。（βが大きいほど半値幅は小さい。）。したがって、開口内の全ての点から発する光が照射面に到達するときの照度の合計である総照度は、以下の通りとなる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
  
　ここで、指数関数の指数を４乗の項まで近似すると、総照度は以下の通りとなる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
  
　数３によれば、開口が大きくなるほど、距離ｄ１の４乗に反比例する項の寄与が大きくなり、総照度が距離の２乗に反比例する性質から離れてくる。この場合には、単純な累乗関数とはならないが、最小自乗法などによる近似曲線を得ることによって、おおよその値を求めることができる。
　例えば、Ｅ＝１０，α＝１，β＝１．５とし、観察距離２～１５における回帰曲線をａ１＝０．２，１，１．５としてそれぞれ算出すると、図８Ａ～図８Ｃに示されるように、距離の－１．９９７乗、－１．９３１乗および－１．８４９乗に比例する関数に近似することができる。
　これにより、より定量性の高い蛍光観察を行うことができる。
　図９に示されるように、除算処理部２８により得られた除算値をさらに指数１／ｘで累乗して蛍光画像Ｇ３’を算出する後処理部３５を備えることにしてもよい。
　蛍光画像Ｇ２の蛍光強度は蛍光色素の濃度に比例する。具体的には、例えば、病変部等に集積した蛍光色素の濃度をＣ（ｍｏｌ／Ｌ）、試料の体積をＶ（ｃｍ３）、病変部の上表面と平行な平面で切断したときの断面積をＳ（ｃｍ２）とすると、病変部から発生する蛍光の輝度Ｅ（Ｗ／ｃｍ２・ｓｒ）は、
　Ｅ∝ＣＶ／Ｓ≒Ｃｔ
となる。
　ただし、ｔ（ｃｍ）は病変部の厚さを表す。したがって、撮影された蛍光画像Ｇ２の階調値ＦＬｂｅｆｏｒｅは、病変部に蓄積した蛍光色素の濃度と病変部の厚さに概ね比例したものとなる。つまり、おおむねＦＬｂｅｆｏｒｅ∝Ｃｔとなる。
　しかしながら、上述のように、蛍光画像Ｇ２の輝度値を指数ｘで累乗する前処理を施す場合には、補正された蛍光画像Ｇ３の階調値ＦＬｒｅｖｉｃｅとＣｔは
　ＦＬｒｅｖｉｃｅ∝（Ｃｔ）ｘ
という関係となり、ｘ＝１以外の場合には、蛍光濃度をリニアに表した蛍光画像Ｇ３とはならない。そこで、後処理部３５において指数１／ｘで累乗することにより、蛍光濃度をリニアに表した蛍光画像Ｇ３’を取得することができる。したがって、蛍光画像の定量性を高め、かつ蛍光濃度および蛍光色素が集積した病変部の厚さをより正確に反映したものとすることができる。
　この場合、後処理部３５による後処理を含めて、観察距離Ｄおよび観察角度θに対する依存性を除去することが好ましいので、上記実施例における、ｍ＝ａｘ－ｃｙ、ｎ＝ｂｘ－ｄｙとしたことに代えて、ｍ＝（ａｘ－ｃｙ）／ｘ、ｎ＝（ｂｘ－ｄｙ）／ｘとして、ｍ，ｎが許容限度となるように指数ｘ，ｙを設定することにしてもよい。
　ここで、これらの式が、ｘ，ｙに関して、ｘ＝ｙ＝０以外の解を持つためには、
　　ｘ：ｙ＝ｃ：（ａ－ｍ）＝ｄ：（ｂ－ｎ）　　　（４）
を満たしていなければならない。したがって、式（４）および式（３）を満たすｍ、ｎを設定し、設定したｍ、ｎをもとに、式（４）からｘ，ｙを設定すればよい。
　ここで、ｍ＝０とした場合、ε＝｜ａｄ－ｂｃ｜とすれば、式（４）より、ｎ＝（ｂｃ－ａｄ）／ｃ＝－ε／ｃ（ｂｃ－ａｄ＜０のとき）となる。したがって、上述したように、εが最小値となるように設定されるように、参照画像Ｇ１や蛍光画像Ｇ２の波長を調整することにより、式（３）を満たす範囲内で、さらにｎの値を最小にすることができ、補正後の蛍光画像Ｇ３の観察距離Ｄおよび観察角度θに対する依存性を最小にすることができる。ここで、対物レンズ１６や照明ユニット４の開口の大きさを設定することにしてもよい。このような調整により、蛍光画像Ｇ３の定量性をさらに最大限向上させることができる。
　特に、ε＝０となるような観察距離Ｄに対する依存性または観察角度θに対する依存性が得られるように、照明光の波長、もしくは対物レンズ１３や照明ユニット４の開口の大きさを設定することができれば、式（４）より、ｍ＝ｎ＝０、かつｘ：ｙ＝ｃ：ａ＝ｄ：ｂとなるようなｘ、ｙを設定することができるため、補正後の蛍光画像Ｇ３の観察距離Ｄと観察角度θに対する依存性を両方とも消去することができ、誤差をほぼゼロにすることができる。
　本実施形態においても、εが最小となる指数ｘ，ｙを設定できる照明光の波長を選択することとしたが、これに代えて、所定の閾値εｍａｘを設け、ε≦εｍａｘとなる指数ｘ，ｙを設定できる照明光の波長を選択することにしてもよい。
　例えば、一般に、距離依存性を表す指数ａ，ｃの絶対値の方が指数ｂ，ｄの絶対値よりも大きくなることを考慮して、ｍ＝０となるようなｘ，ｙを、例えば、ｘ＝ｃ、ｙ＝ａとするときを考える。すると、式（４）よりｎ＝（ｂｃ－ａｄ）／ｃ＝－ε／ｃ（ｂｃ－ａｄ＜０のとき）となる。
　したがって、式（３）を満たすようなεｍａｘを設定すると、εｍａｘは
　εｍａｘ≦｜ｃ｜×ｌｏｇ（１＋ｅｍａｘ）／ｌｏｇ（ｒθ）
を満たす必要がある。
　ここで　例えば、後述する実験例により求められた指数ａ～ｄ、
　ａ＝－１．５１８、ｂ＝０．５１４、ｃ＝－１．６０５、ｄ＝０．６７５
を用いるとε＝｜ａｄ－ｂｃ｜≒０．２０となる。
　一般に、消化器内視鏡の視野角は片側７５°程度である。したがって、θは最大でも７５°程度であると想定できる。また、許容誤差ｅｍａｘは、この範囲内で２０％程度に抑えるとすると、
　ｒθ＝ｃｏｓθｍｉｎ／ｃｏｓθｍａｘ＝ｃｏｓ０°／ｃｏｓ７５°＝３．８６
であるため、例えば、εｍａｘは
　εｍａｘ＝｜ｃ｜×ｌｏｇ（１＋ｅｍａｘ）／ｌｏｇ（ｒθ）≒０．２１７
と設定することができる。
　すると、この条件においては、εは、
　ε＝｜ａｄ－ｂｃ｜≒０．２０＜εｍａｘ＝０．２１７
を満たしているといえる。これは同時に、許容誤差ｅｍａｘの範囲内での定量性が得られていることを意味する。したがって、この実験条件において観察を行えば常に、
許容誤差ｅｍａｘの範囲内での定量性を保った観察を行うことができる。
　このようにεの値を適切に調整することによって、許容誤差ｅｍａｘを下回るような条件での定量性を得ることができる。
　εが十分に小さければ、ｍ＝０に対して、ｎ＝（ｂｃ－ａｄ）／ｃ＝－ε／ｃ（ｂｃ－ａｄ＜０のとき）も十分に小さくなる。したがって、仮に許容誤差ｅｍａｘをできるだけ小さく設定したとしても、式（３）および（４）を満たすｍ、ｎが存在することになり、定数ｍ，ｎに基づき指数ｘ，ｙを設定できる。
　ここで、本実施形態に係る蛍光観察システム１を用いた実験例について図面を参照して以下に説明する。
　照明光として白色光および蛍光薬剤の励起光を含む帯域（波長帯域４００～７４０ｎｍ）の光を用い、参照画像Ｇ１としては試料Ｙ表面において反射して戻る照明光の反射光画像を採用した。蛍光画像Ｇ２としては、試料Ｙの内部に注入された蛍光色素Ｃｙ７から発生する蛍光画像を採用した。試料Ｙとしては、ブタの摘出直腸を採用した。
　図１０Ａ，図１０Ｂに示されるように、挿入部２の先端面２ａを試料Ｙの表面に対向させた。
　距離依存性の測定図１０Ａは、挿入部２の軸線が直動ステージ３１の載置面３４の法線と平行となる位置で、直動ステージ３１を下降させて観察距離Ｄを増大させつつ、複数の観察距離Ｄにおいて照明光および励起光を照射して参照画像Ｇ１および蛍光画像Ｇ２を取得した。その結果、図１１Ａ，図１１Ｃに示されるような観察距離特性を示すプロットが得られた。
　角度依存性の測定図１０Ｂは、挿入部２の軸線が載置面３４の法線と平行となる位置から、載置面３４上に配置される中心線回りに回転させつつ、複数の観察角度において照明光および励起光を照射して参照画像Ｇ１および蛍光画像Ｇ２を取得した。その結果、図１１Ｂ，図１１Ｄに示されるような観察角度特性を示すプロットが得られた。
　そして、図中に実線で示すように、これらのプロットをＹ＝Ｐ・ＸＱ（Ｘが横軸、Ｙが縦軸、Ｐは定数、Ｑは指数）の曲線に回帰させることにより、観察距離に関する指数ａ，ｃ、および観察角度に関する指数ｂ，ｄを算出すると、ａ＝－１．５１８、ｂ＝０．５１４、ｃ＝－１．６０５、ｄ＝０．６７５が得られた。
　次に、本発明の一実施形態に係る蛍光観察装置４０について、図面を参照して以下に説明する。
　本実施形態の説明において、上述した一実施形態に係る蛍光観察システム１と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。
　本実施形態に係る蛍光観察装置４０は、図１２に示されるように、挿入部（着脱部品）２が光源３に着脱可能に設けられている。この場合には、挿入部２が着脱されて他の挿入部２に交換されることによって、対物レンズ１６を始め、挿入部２に含まれる種々の光学系が変更されるので、対物レンズ１６の開口数（ＮＡ）や瞳径等の変化、あるいは、検出する蛍光の波長、観察対象部位（胃組織や大腸組織など）等の変化によって、上記指数ａ～ｄが変化する。
　そこで、本実施形態においては、挿入部２に識別情報を記憶するＩＣチップ（識別情報入力装置）４１を備え、挿入部２が取り付けられる光源３側にＩＣチップ４１内の識別情報を読み取る読取装置４２と、識別情報、照明光の波長および各挿入部２に適した指数ｘ，ｙを対応づけて記憶する記憶部４３とを備えている。そして、前処理部２７が、記憶部４３から出力される挿入部２の識別情報に対応する指数ｘ，ｙを読取装置４２から受け取って、上記演算を行い、記憶部４３から出力された照明光の波長が達成されるようにフィルタターレット（観察条件調節部）１０が駆動される。
　このようにすることで、光源３に対して挿入部２が交換されても、該挿入部２に応じてεを最小にするような照明光の波長が選択され、該挿入部２に応じて最適の指数ｘ，ｙが設定され、定量性の高い蛍光画像Ｇ３を常に取得することができるという利点がある。
　本実施形態においては、識別情報入力装置としてＩＣチップ４１を例示したが、これに代えて、キーボードその他の手入力による任意の入力手段を採用してもよい。
　本実施形態においては、観察条件調節部としてフィルタターレット１０を例示したが、これに代えて、対物光学系の可変絞り３６や、照明光学系の可変絞り３８を採用してもよい。
Ｘ　被写体
１　蛍光観察システム
２　挿入部（着脱部品）
３　光源（照明部）
４　照明ユニット（照明部）
１０　フィルタターレット（波長調節部：観察条件調節部）
１５　照明光学系
１６　対物レンズ（対物光学系）
１９　撮像素子（戻り光撮像部）
２０　撮像素子（蛍光撮像部）
２４　画像補正部
２６　依存定数決定部（観察条件設定部）
３０　標準試料
３１　直動ステージ（観察状態設定機構）
３２　チルトステージ（観察状態設定機構）
３６，３８　可変絞り（観察条件調節部）
４０，１００　蛍光観察装置
４１　ＩＣチップ（識別情報入力装置）
４２　読取装置（観察条件調節部）
４３　記憶部
１０１　較正装置

Claims (14)

  1. 　　照明光および励起光を照射する光源を備える照明部と、
    　被写体において発生した蛍光を撮影し蛍光画像を取得する蛍光撮像部と、
    　被写体から戻る戻り光を撮影し参照画像を取得する戻り光撮像部と、
    　該戻り光撮像部により取得された参照画像を用いて前記蛍光撮像部により撮像された蛍光画像を補正する画像補正部とを備える蛍光観察装置と、
    　該蛍光観察装置に接続され、標準試料と、該標準試料に対して前記蛍光観察装置の観察距離および観察角度を変更可能に設定する観察状態設定機構とを備える較正装置と、
    　該較正装置により設定された観察距離および観察角度と前記蛍光観察装置により前記標準試料を撮影して取得された蛍光画像および参照画像とに基づいて、
    　観察条件を調節する観察条件調節部とを備え、
    　該観察条件調節部が、前記較正装置により設定された観察距離および観察角度と前記蛍光観察装置により前記標準試料を撮影して取得された蛍光画像および参照画像とに基づいて、指数ａ～ｄを算出し、ε＝｜ａｄ－ｂｃ｜が所定の閾値εｍａｘ以下となるように前記観察条件を調節し、
    　前記画像補正部が、以下の処理を行う蛍光観察システム：
    　ＦＬｒｅｖｉｃｅ＝ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ
    　ここで、
    　ＦＬｒｅｖｉｃｅ：補正後の蛍光画像の輝度値
    　ＦＬａｆｔｅｒ＝Ａ×ＦＬｂｅｆｏｒｅ ｘ
    　ＲＬａｆｔｅｒ＝Ｂ×ＲＬｂｅｆｏｒｅ ｙ
    　ＦＬｂｅｆｏｒｅ，ＲＬｂｅｆｏｒｅ：取得された蛍光画像、参照画像の輝度値
    　Ａ，Ｂ：定数
    　ｘ＝（ｃｎ－ｄｍ）／（ｂｃ－ａｄ）　　　（１）
    　ｙ＝（ａｎ－ｂｍ）／（ｂｃ－ａｄ）　　　（２）
    　ａ：所定の強度の励起光を前記標準試料に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの距離特性を累乗近似して得られた指数
    　ｂ：所定の強度の励起光を前記標準試料に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの余弦特性を累乗近似して得られた指数
    　ｃ：所定の強度の照明光を前記標準試料に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの距離特性を累乗近似して得られた指数
    　ｄ：所定の強度の照明光を前記標準試料に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの余弦特性を累乗近似して得られた指数
    　ｒＤ ｜ｍ｜・ｒθ ｜ｎ｜≦１＋ｅｍａｘ  　　　　　（３）
    　ｒＤ＝Ｄｍａｘ／Ｄｍｉｎ
    　ｒθ＝ｃｏｓθｍｉｎ／ｃｏｓθｍａｘ
    　Ｄｍａｘ：想定される最大の観察距離
    　Ｄｍｉｎ：想定される最小の観察距離
    　θｍａｘ：想定される最大の観察角度
    　θｍｉｎ：想定される最小の観察角度（ただし、０°≦θｍｉｎ＜θｍａｘ≦９０°）
    　ｍ，ｎ：式（３）を満たす任意の定数
    　ｅｍａｘ：（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍａｘ÷（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍｉｎ－１
    　（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍａｘ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最大値
    　（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍｉｎ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最小値
    　ただし、ｂｃ－ａｄ＝０の場合には、ｘ，ｙは、ｘ：ｙ＝ｃ：ａ＝ｄ：ｂを満たす任意の実数から設定される。
  2. 　照明光および励起光を照射する光源を備える照明部と、被写体において発生した蛍光を撮影し蛍光画像を取得する蛍光撮像部と、被写体から戻る戻り光を撮影し参照画像を取得する戻り光撮像部と、該戻り光撮像部により取得された参照画像を用いて前記蛍光撮像部により撮像された蛍光画像を補正する画像補正部とを備える蛍光観察装置と、該蛍光観察装置に接続され、標準試料と、該標準試料に対して前記蛍光観察装置の観察距離および観察角度を変更可能に設定する観察状態設定機構とを備える較正装置と、観察条件を調節する観察条件調節部とを備え、
    　該観察条件調節部が、前記較正装置により設定された観察距離および観察角度と、前記蛍光観察装置により前記標準試料を撮影して取得された蛍光画像および参照画像とに基づいて指数ａ～ｄを算出し、ε＝｜ａｄ－ｂｃ｜が所定の閾値εｍａｘ以下となるように前記観察条件を調節し、
    　前記画像補正部が、以下の処理を行う蛍光観察システム：
    　ＦＬｒｅｖｉｃｅ＝（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）1/ｘ
    　ここで、
    　ＦＬｒｅｖｉｃｅ：補正後の蛍光画像の輝度値
    　ＦＬａｆｔｅｒ＝Ａ×ＦＬｂｅｆｏｒｅ ｘ
    　ＲＬａｆｔｅｒ＝Ｂ×ＲＬｂｅｆｏｒｅ ｙ
    　ＦＬｂｅｆｏｒｅ，ＲＬｂｅｆｏｒｅ：取得された蛍光画像、参照画像の輝度値
    　Ａ，Ｂ：定数
    　ｘ：ｙ＝ｃ：（ａ－ｍ）＝ｄ：（ｂ－ｎ）　　　（４）
    　ａ：所定の強度の励起光を前記標準試料に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの距離特性を累乗近似して得られた指数
    　ｂ：所定の強度の励起光を前記標準試料に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの余弦特性を累乗近似して得られた指数
    　ｃ：所定の強度の照明光を前記標準試料に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの距離特性を累乗近似して得られた指数
    　ｄ：所定の強度の照明光を前記標準試料に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの余弦特性を累乗近似して得られた指数
    　ｒＤ ｜ｍ｜・ｒθ ｜ｎ｜≦１＋ｅｍａｘ  　　　　　（３）
    　ｒＤ＝Ｄｍａｘ／Ｄｍｉｎ
    　ｒθ＝ｃｏｓθｍｉｎ／ｃｏｓθｍａｘ
    　Ｄｍａｘ：想定される最大の観察距離
    　Ｄｍｉｎ：想定される最小の観察距離
    　θｍａｘ：想定される最大の観察角度
    　θｍｉｎ：想定される最小の観察角度（ただし、０°≦θｍｉｎ＜θｍａｘ≦９０°）
    　ｍ，ｎ：式（３）および式（４）を満たす任意の定数
    　ｅｍａｘ：（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍａｘ÷（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍｉｎ－１
    　（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍａｘ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最大値
    　（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍｉｎ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最小値。
  3. 　ｍ＝０である請求項１または請求項２に記載の蛍光観察システム。
  4. 　前記観察条件調節部が、前記照明光の波長を調節する波長調節部である請求項１または請求項２に記載の蛍光観察システム。
  5. 　前記被写体から戻る蛍光および戻り光を集光する対物光学系を備え、
    　前記観察条件調節部が、前記対物光学系に備えられた可変絞りである請求項１または請求項２に記載の蛍光観察システム。
  6. 　前記観察条件調節部が、前記照明光および前記励起光の光束径を調節する可変絞りである請求項１または請求項２に記載の蛍光観察システム。
  7. 　照明光および励起光を照射する光源を備える照明部と、被写体において発生した蛍光を撮影し蛍光画像を取得する蛍光撮像部と、被写体から戻る戻り光を撮影し参照画像を取得する戻り光撮像部と、該戻り光撮像部により取得された参照画像を用いて前記蛍光撮像部により撮像された蛍光画像を補正する画像補正部とを備える蛍光観察装置と、
    　観察条件を変更するために着脱される着脱部品と、
    　該着脱部品に付された識別情報を入力する識別情報入力装置と、
    　前記識別情報と、指数ｘ，ｙと、前記観察条件とを対応づけて記憶する記憶部と、
    　前記着脱部品が取り付けられたときに、前記識別情報入力装置により入力された前記識別情報に対応づけて前記記憶部に記憶されている観察条件に設定する観察条件調節部とを備え、
    　前記画像補正部が、前記識別情報入力装置により入力された前記識別情報に対応づけて前記記憶部に記憶されている指数ｘ，ｙを用いて以下の処理を行う蛍光観察装置：
    　ＦＬｒｅｖｉｃｅ＝ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ
    　ここで、
    　ＦＬｒｅｖｉｃｅ：補正後の蛍光画像の輝度値
    　ＦＬａｆｔｅｒ＝Ａ×ＦＬｂｅｆｏｒｅ ｘ
    　ＲＬａｆｔｅｒ＝Ｂ×ＲＬｂｅｆｏｒｅ ｙ
    　ＦＬｂｅｆｏｒｅ，ＲＬｂｅｆｏｒｅ：取得された蛍光画像、参照画像の輝度値
    　Ａ，Ｂ：定数
    　ｘ＝（ｃｎ－ｄｍ）／（ｂｃ－ａｄ）　　　（１）
    　ｙ＝（ａｎ－ｂｍ）／（ｂｃ－ａｄ）　　　（２）
    　ａ：所定の強度の励起光を前記被写体に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記被写体までの距離特性を累乗近似して得られた指数
    　ｂ：所定の強度の励起光を前記被写体に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記被写体までの余弦特性を累乗近似して得られた指数
    　ｃ：所定の強度の照明光を前記被写体に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記被写体までの距離特性を累乗近似して得られた指数
    　ｄ：所定の強度の照明光を前記被写体に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記被写体までの余弦特性を累乗近似して得られた指数
    　ｒＤ ｜ｍ｜・ｒθ ｜ｎ｜≦１＋ｅｍａｘ  　　　　　（３）
    　ｒＤ＝Ｄｍａｘ／Ｄｍｉｎ
    　ｒθ＝ｃｏｓθｍｉｎ／ｃｏｓθｍａｘ
    　Ｄｍａｘ：想定される最大の観察距離
    　Ｄｍｉｎ：想定される最小の観察距離
    　θｍａｘ：想定される最大の観察角度
    　θｍｉｎ：想定される最小の観察角度（ただし、０°≦θｍｉｎ＜θｍａｘ≦９０°）
    　ｍ，ｎ：式（３）を満たす任意の定数
    　ｅｍａｘ：（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍａｘ÷（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍｉｎ－１
    　（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍａｘ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最大値
    　（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍｉｎ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最小値
    　ただし、ｂｃ－ａｄ＝０の場合には、ｘ，ｙは、ｘ：ｙ＝ｃ：ａ＝ｄ：ｂを満たす任意の実数から設定される。
  8. 　照明光および励起光を照射する光源を備える照明部と、被写体において発生した蛍光を撮影し蛍光画像を取得する蛍光撮像部と、被写体から戻る戻り光を撮影し参照画像を取得する戻り光撮像部と、該戻り光撮像部により取得された参照画像を用いて前記蛍光撮像部により撮像された蛍光画像を補正する画像補正部とを備える蛍光観察装置と、
    　観察条件を変更するために着脱される着脱部品と、
    　該着脱部品に付された識別情報を入力する識別情報入力装置と、
    　前記識別情報と、指数ｘ，ｙと、前記観察条件とを対応づけて記憶する記憶部と、
    　前記着脱部品が取り付けられたときに、前記識別情報入力装置により入力された前記識別情報に対応づけて前記記憶部に記憶されている観察条件に設定する観察条件調節部とを備え、
    　前記画像補正部が、前記識別情報入力装置により入力された前記識別情報に対応づけて前記記憶部に記憶されている指数ｘ，ｙを用いて以下の処理を行う蛍光観察装置：
    　ＦＬｒｅｖｉｃｅ＝（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）1/ｘ
    　ここで、
    　ＦＬｒｅｖｉｃｅ：補正後の蛍光画像の輝度値
    　ＦＬａｆｔｅｒ＝Ａ×ＦＬｂｅｆｏｒｅ ｘ
    　ＲＬａｆｔｅｒ＝Ｂ×ＲＬｂｅｆｏｒｅ ｙ
    　ＦＬｂｅｆｏｒｅ，ＲＬｂｅｆｏｒｅ：取得された蛍光画像、参照画像の輝度値
    　Ａ，Ｂ：定数
    　ｘ：ｙ＝ｃ：（ａ－ｍ）＝ｄ：（ｂ－ｎ）　　　（４）
    　ａ：所定の強度の励起光を前記被写体に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記被写体までの距離特性を累乗近似して得られた指数
    　ｂ：所定の強度の励起光を前記被写体に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記被写体までの余弦特性を累乗近似して得られた指数
    　ｃ：所定の強度の照明光を前記被写体に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記被写体までの距離特性を累乗近似して得られた指数
    　ｄ：所定の強度の照明光を前記被写体に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記被写体までの余弦特性を累乗近似して得られた指数
    　ｒＤ ｜ｍ｜・ｒθ ｜ｎ｜≦１＋ｅｍａｘ  　　　　　（３）
    　ｒＤ＝Ｄｍａｘ／Ｄｍｉｎ
    　ｒθ＝ｃｏｓθｍｉｎ／ｃｏｓθｍａｘ
    　Ｄｍａｘ：想定される最大の観察距離
    　Ｄｍｉｎ：想定される最小の観察距離
    　θｍａｘ：想定される最大の観察角度
    　θｍｉｎ：想定される最小の観察角度（ただし、０°≦θｍｉｎ＜θｍａｘ≦９０°）
    　ｍ，ｎ：式（３）および式（４）を満たす任意の定数
    　ｅｍａｘ：（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍａｘ÷（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍｉｎ－１
    　（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍａｘ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最大値
    　（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍｉｎ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最小値
  9. 　ｍ＝０である請求項７または請求項８に記載の蛍光観察装置。
  10. 　前記観察条件調節部が、前記照明光の波長を調節する波長調節部である請求項７または請求項８に記載の蛍光観察装置。
  11. 　前記被写体から戻る蛍光および戻り光を集光する対物光学系を備え、
    　前記観察条件調節部が、前記対物光学系に備えられた可変絞りである請求項７または請求項８に記載の蛍光観察装置。
  12. 　前記観察条件調節部が、前記照明光および前記励起光の光束径を調節する可変絞りである請求項７または請求項８に記載の蛍光観察装置。
  13. 　標準試料に対して照明光および励起光を観察距離および観察角度を変更しながら照射し、前記標準試料において発生した蛍光を撮影して観察距離および／または観察角度の異なる複数の蛍光画像を取得し、前記標準試料から戻る戻り光を撮影して観察距離および／または観察角度の異なる複数の参照画像を取得し、取得された複数の蛍光画像および参照画像に基づいて、指数ａ～ｄを算出し、ε＝｜ａｄ－ｂｃ｜が所定の閾値εｍａｘ以下となるように観察条件を調節しておき、
    　照明光および励起光を被写体に照射し、
    　被写体において発生した蛍光を撮影して取得した蛍光画像を、被写体から戻る戻り光を撮影して取得した参照画像を用いて、以下の補正処理を行う蛍光観察方法：
    　ＦＬｒｅｖｉｃｅ＝ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ
    　ここで、
    　ＦＬｒｅｖｉｃｅ：補正後の蛍光画像の輝度値
    　ＦＬａｆｔｅｒ＝Ａ×ＦＬｂｅｆｏｒｅ ｘ
    　ＲＬａｆｔｅｒ＝Ｂ×ＲＬｂｅｆｏｒｅ ｙ
    　ＦＬｂｅｆｏｒｅ，ＲＬｂｅｆｏｒｅ：取得された蛍光画像、参照画像の輝度値
    　Ａ，Ｂ：定数
    　ｘ＝（ｃｎ－ｄｍ）／（ｂｃ－ａｄ）　　　（１）
    　ｙ＝（ａｎ－ｂｍ）／（ｂｃ－ａｄ）　　　（２）
    　ａ：所定の強度の励起光を前記標準試料に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの距離特性を累乗近似して得られた指数
    　ｂ：所定の強度の励起光を前記標準試料に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの余弦特性を累乗近似して得られた指数
    　ｃ：所定の強度の照明光を前記標準試料に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの距離特性を累乗近似して得られた指数
    　ｄ：所定の強度の照明光を前記標準試料に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの余弦特性を累乗近似して得られた指数
    　ｒＤ ｜ｍ｜・ｒθ ｜ｎ｜≦１＋ｅｍａｘ  　　　　　（３）
    　ｒＤ＝Ｄｍａｘ／Ｄｍｉｎ
    　ｒθ＝ｃｏｓθｍｉｎ／ｃｏｓθｍａｘ
    　Ｄｍａｘ：想定される最大の観察距離
    　Ｄｍｉｎ：想定される最小の観察距離
    　θｍａｘ：想定される最大の観察角度
    　θｍｉｎ：想定される最小の観察角度（ただし、０°≦θｍｉｎ＜θｍａｘ≦９０°）
    　ｍ，ｎ：式（３）を満たす任意の定数
    　ｅｍａｘ：（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍａｘ÷（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍｉｎ－１
    　（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍａｘ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最大値
    　（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍｉｎ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最小値
    　ただし、ｂｃ－ａｄ＝０の場合には、ｘ，ｙは、ｘ：ｙ＝ｃ：ａ＝ｄ：ｂを満たす任意の実数から設定される。
  14. 　標準試料に対して照明光および励起光を観察距離および観察角度を変更しながら照射し、前記標準試料において発生した蛍光を撮影して観察距離および／または観察角度の異なる複数の蛍光画像を取得し、前記標準試料から戻る戻り光を撮影して観察距離および／または観察角度の異なる複数の参照画像を取得し、取得された複数の蛍光画像および参照画像に基づいて、指数ａ～ｄを算出し、ε＝｜ａｄ－ｂｃ｜が所定の閾値εｍａｘ以下となるように観察条件を調節しておき、
    　照明光および励起光を被写体に照射し、
    　被写体において発生した蛍光を撮影して取得した蛍光画像を、被写体から戻る戻り光を撮影して取得した参照画像を用いて、以下の補正処理を行う蛍光観察方法：
    　ＦＬｒｅｖｉｃｅ＝（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）1/ｘ
    　ここで、
    　ＦＬｒｅｖｉｃｅ：補正後の蛍光画像の輝度値
    　ＦＬａｆｔｅｒ＝Ａ×ＦＬｂｅｆｏｒｅ ｘ
    　ＲＬａｆｔｅｒ＝Ｂ×ＲＬｂｅｆｏｒｅ ｙ
    　ＦＬｂｅｆｏｒｅ，ＲＬｂｅｆｏｒｅ：取得された蛍光画像、参照画像の輝度値
    　Ａ，Ｂ：定数
    　ｘ：ｙ＝ｃ：（ａ－ｍ）＝ｄ：（ｂ－ｎ）　　　（４）
    　ａ：所定の強度の励起光を前記標準試料に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの距離特性を累乗近似して得られた指数
    　ｂ：所定の強度の励起光を前記標準試料に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの余弦特性を累乗近似して得られた指数
    　ｃ：所定の強度の照明光を前記標準試料に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの距離特性を累乗近似して得られた指数
    　ｄ：所定の強度の照明光を前記標準試料に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの余弦特性を累乗近似して得られた指数
    　ｒＤ ｜ｍ｜・ｒθ ｜ｎ｜≦１＋ｅｍａｘ  　　　　　（３）
    　ｒＤ＝Ｄｍａｘ／Ｄｍｉｎ
    　ｒθ＝ｃｏｓθｍｉｎ／ｃｏｓθｍａｘ
    　Ｄｍａｘ：想定される最大の観察距離
    　Ｄｍｉｎ：想定される最小の観察距離
    　θｍａｘ：想定される最大の観察角度
    　θｍｉｎ：想定される最小の観察角度（ただし、０°≦θｍｉｎ＜θｍａｘ≦９０°）
    　ｍ，ｎ：式（３）および式（４）を満たす任意の定数
    　ｅｍａｘ：（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍａｘ÷（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍｉｎ－１
    　（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍａｘ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最大値
    　（ＦＬａｆｔｅｒ／ＲＬａｆｔｅｒ）ｍｉｎ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最小値。
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