WO2010103954A1 - 燃料の電解方法 - Google Patents

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隆平 松本
義夫 後藤
酒井　秀樹
戸木田　裕一
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ソニー株式会社
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    • H01M8/16—Biochemical fuel cells, i.e. cells in which microorganisms function as catalysts
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • Y02E60/30—Hydrogen technology
    • Y02E60/50—Fuel cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for electrolyzing fuel in a fuel cell. More specifically, the present invention relates to a method of electrolyzing a fuel such as glucose with an electrode on which an enzyme is immobilized in a biofuel cell.
  • a biofuel cell in which an enzyme is immobilized as a catalyst on at least one of the negative electrode and the positive electrode can efficiently extract electrons from fuels that cannot be used with ordinary industrial catalysts such as glucose and ethanol. It has attracted attention as a next-generation fuel cell with high capacity and high safety (see, for example, Patent Documents 1 to 3).
  • FIG. 8 is a diagram showing a reaction of an enzyme battery including a carbon electrode on which an electron mediator is immobilized together with an enzyme and using glucose as a fuel.
  • the oxidation reaction of glucose (Glucose) proceeds at the negative electrode
  • the reduction reaction of oxygen (O 2 ) in the atmosphere proceeds at the positive electrode.
  • electrons are transferred in the order of glucose (Glucose), glucose dehydrogenase, nicotinamide adenine dinucleotide (NAD +), diaphorase, electron mediator, and electrode (carbon). It is.
  • the main object of the present invention is to provide a fuel electrolysis method capable of suppressing the reverse reaction of the enzyme and improving the electrolysis rate.
  • the method for electrolyzing a fuel according to an embodiment of the present invention is to cause an electrolytic reaction only in an electrode when the fuel is electrolyzed by an electrode on which an enzyme is immobilized.
  • the reverse reaction of the enzyme is suppressed and the electrolysis rate is improved.
  • an enzyme that causes a reverse reaction can be used as the enzyme immobilized on the electrode.
  • the ratio of the oxidized form and the reduced form of the electron mediator may be controlled by immobilizing the electron mediator together with the enzyme on the electrode and changing the potential applied between the electrodes. In that case, a potential higher than the half-wave potential of the electron mediator can be applied between the electrodes.
  • examples of the enzyme that causes the reverse reaction include gluconate-5-dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, malate dehydrogenase, and the like.
  • the reverse reaction of the enzyme can be suppressed, and the enzyme does not cause the reverse reaction without performing genetic modification or the like.
  • the electrolysis rate is obtained.
  • (A) And (b) is a figure which shows the reaction rate of GDH, (a) shows a forward reaction, (b) shows a reverse reaction.
  • (A) And (b) is a figure which shows the reaction rate of Gn5DH, (a) shows a forward reaction, (b) shows a reverse reaction.
  • (A) And (b) is a figure which shows the result of having performed chronoamperometry by the method of the Example shown in FIG. 2, (a) is the result at the time of using a GDH fixed electrode, (b) is The results in the case of using the Gn5DH immobilized electrode are shown. It is a figure which shows the reaction of the enzyme cell which is equipped with the carbon electrode to which the electron mediator was fix
  • FIG. 1 is a diagram showing a reaction in which glucose is oxidized by an enzyme to extract four electrons.
  • glucose is oxidized by glucose dehydrogenase (GDH) to form gluconolactone, and two electrons are obtained by this reaction.
  • GDH glucose dehydrogenase
  • the produced gluconolactone is decomposed into 5-dehydrogluconate by gluconolactonase and gluconate-5-dehydorogenase (Gluconate-5-dehydorogenase: Gn5DH).
  • the present inventor examined in-electrode electrolysis instead of the conventional electrolysis outside the electrode, and found that the electrolysis rate by the enzyme was improved, leading to the present invention. That is, in the electrolysis method of the present invention, in a biofuel cell including an electrode on which an enzyme is immobilized, an electrolytic reaction of fuel is caused only in the electrode.
  • the fuel is decomposed by the enzyme immobilized on the electrode surface to take out electrons, and protons (H + ) are generated.
  • the electrode used at that time for example, an electrode having a void inside and a large surface area such as porous carbon, carbon pellet, carbon felt, and carbon paper is preferable.
  • the electrode material is not limited to the carbon-based material, and for example, a metal material such as titanium, gold, copper, and nickel may be used.
  • the enzyme immobilized on the electrode can be appropriately selected according to the fuel to be used.
  • glucose dehydrogenase GDH
  • GDH glucose dehydrogenase
  • a coenzyme oxidase and an electron mediator are immobilized together with an oxidase that contributes to the decomposition of fuel such as glucose dehydrogenase (GDH).
  • a coenzyme oxidase oxidizes a coenzyme (eg, NAD +, NADP +, etc.) reduced by an oxidase and a reduced form of the coenzyme (eg, NADH, NADPH, etc.).
  • a coenzyme eg, NAD +, NADP +, etc.
  • a reduced form of the coenzyme eg, NADH, NADPH, etc.
  • DI diaphorase
  • polysaccharide refers to a polysaccharide in a broad sense and refers to all carbohydrates that produce two or more monosaccharides by hydrolysis, and includes oligosaccharides such as disaccharides, trisaccharides, and tetrasaccharides. Specific examples include starch, amylose, amylopectin, glycogen, cellulose, maltose, sucrose, and lactose. These are a combination of two or more monosaccharides, and any polysaccharide contains glucose as a monosaccharide of the binding unit.
  • amylose and amylopectin are components contained in starch, and starch is a mixture of amylose and amylopectin.
  • starch is a mixture of amylose and amylopectin.
  • glucoamylase is used as a polysaccharide degrading enzyme and glucose dehydrogenase (GDH) is used as an oxidase degrading a monosaccharide
  • GDH glucose dehydrogenase
  • the polysaccharide can be decomposed into glucose by glucoamylase as a fuel.
  • Examples of such polysaccharides include starch, amylose, amylopectin, glycogen and maltose.
  • glucoamylase is a degrading enzyme that hydrolyzes ⁇ -glucan such as starch to produce glucose
  • glucose dehydrogenase is an oxidase that oxidizes ⁇ -D-glucose to D-glucono- ⁇ -lactone.
  • the electrolysis method of the present invention particularly comprises an enzyme that causes a reverse reaction, such as gluconate-5-dehydorogenase (GnonDH), alcohol dehydrogenase (Alcohol dehydrogenase), and malate dehydrogenase (Malate dehydrogenase).
  • GnonDH gluconate-5-dehydorogenase
  • Alcohol dehydrogenase Alcohol dehydrogenase
  • Malate dehydrogenase malate dehydrogenase
  • a compound having a quinone skeleton is preferably used, and a compound having a naphthoquinone skeleton is particularly preferable.
  • 2-amino-1,4-naphthoquinone (ANQ), 2-amino-3-methyl-1,4-naphthoquinone (AMNQ), 2-methyl-1,4-naphthoquinone (VK3), 2- Amino-3-carboxy-1,4-naphthoquinone (ACNQ) and the like can be used.
  • anthraquinone or a derivative thereof can be used in addition to the compound having a naphthoquinone skeleton. Furthermore, you may fix
  • Electrolysis method In the electrolysis method of the present invention, an electrolysis reaction is caused only in the electrode on which the enzyme is immobilized.
  • the method is not particularly limited. For example, a method of supplying a fuel solution in an amount corresponding to the surface area of the electrode surface, a micro flow channel is formed on the electrode surface, and the fuel solution is placed in the flow channel. A method to let it flow can be considered. In this case, extremely high electrolysis efficiency can be achieved by monitoring the amount of electrolysis and adjusting the fuel supply amount sequentially.
  • a pump having a feedback function of calculating the amount of evaporated solution using a mass sensor and replenishing the solution of the evaporated portion may be considered.
  • the potential applied between the electrodes is higher than the half-wave potential of the electron mediator.
  • the inside of an electrode can be made into an environment where the oxidant / reductant ratio of an electron mediator is high, and the entire reaction can be shifted in a desired direction.
  • the electrolysis method of the present invention since an electrolysis reaction is caused only in the electrode, dissolution of the electron mediator can be prevented, and furthermore, the ratio of the oxidized form and the reduced form of the electron mediator is It can be easily controlled by the set potential. As a result, the reaction of the entire system is promoted to be in the original reaction direction, and the reverse reaction of the enzyme can be suppressed, so that the overall electrolysis rate can be improved. As a result, even if an enzyme that causes a reverse reaction is used, power generation efficiency can be improved without modifying the enzyme.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing an in-electrode electrolysis method according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram schematically showing a method of electrolysis outside an electrode according to a comparative example.
  • an electrode on which gluconic acid-5-dehydorogenase (Gn5DH) was immobilized was used for electrolysis in the electrode shown in FIG. 2 (Example) and electrolysis outside the electrode shown in FIG. (Comparative example) was performed, and the electrolysis time of the fuel was measured.
  • the same measurement was performed on an electrode on which glucose dehydrogenase (GDH) was immobilized.
  • NaH 2 PO 4 sodium dihydrogen phosphate
  • DI enzyme buffer solution 5 to 50 mg of diaphorase (DI) (EC 1.6.99, manufactured by Unitika Ltd., B1D111) was weighed and dissolved in 1 ml of buffer solution.
  • GDH enzyme buffer solution 5-50 mg of glucose dehydrogenase (GDH) (NAD-dependent, EC1.1.1.17, manufactured by Toyobo Co., Ltd., GLD-311) was weighed and dissolved in 1 ml of buffer solution.
  • Gn5DH enzyme buffer solution 5 to 50 mg of gluconate-5-dehydrogenase (Gn5DH) (NAD-dependent, EC1.1.1.16, manufactured by Amano Enzyme) was weighed and dissolved in 1 ml of buffer solution.
  • NADH buffer solution 10-50 mg of NADH (Sigma Aldrich, N-8129) was weighed and dissolved in 0.1 ml of buffer solution.
  • ANQ 2-amino-1,4-naphthoquinone
  • PLL poly-L-lysine hydrobromide
  • PAAcNa aqueous solution An appropriate amount of sodium polyacrylate (PAAcNa) (manufactured by Aldrich, 041-00595) was weighed and dissolved in ion-exchanged water so as to be 0.22% by mass.
  • PLL aqueous solution 50 ⁇ L (PLL: equivalent to 0.2 ⁇ g) and (7) PAAcNa aqueous solution: 50 ⁇ L (PAAcNa: equivalent to 0.003 ⁇ g) were further applied to the enzyme / electron mediator-coated electrode. Then, it was dried to obtain an enzyme / electron mediator fixed electrode.
  • GDH immobilized electrodes those coated with a mixed solution containing a GDH enzyme buffer solution are referred to as “GDH immobilized electrodes”, and those coated with a mixed solution containing a Gn5DH enzyme buffer solution are “ It is referred to as “Gn5DH immobilized electrode”.
  • the thus prepared enzyme / electron mediator-immobilized electrode 1 is set to 0.1 V, which is sufficiently higher than the half-wave potential of the electron mediator, with respect to the reference electrode 2 (Ag
  • the chronoamperometry was performed by the method.
  • the fuel solution was prepared by dissolving the fuel glucose or gluconic acid in a 2M imidazole buffer solution (pH 7.0) to a concentration of 0.4M.
  • these fuel solutions are referred to as “0.4 M glucose fuel solution” and “0.4 M gluconic acid fuel solution”, respectively.
  • electrolysis of glucose or gluconic acid outside the electrode was performed by an electrochemical measurement method using a three-electrode system shown in FIG. At that time, 2 ml (0.8 mmol) of 0.4 M glucose fuel solution or 0.4 M gluconic acid fuel solution was added and electrolysis was performed while stirring the solution with a stirrer 5.
  • the enzyme / electron mediator immobilized electrode 1 was used as an anode (working electrode), and a platinum wire 3 was used as a counter electrode.
  • FIGS. 4 (a) and 4 (b) are diagrams showing the results of performing chronoamperometry by the method of the comparative example shown in FIG. 3, and FIG. 4 (a) is the result of using a GDH-immobilized electrode.
  • FIG. 4B shows the results when using a Gn5DH-immobilized electrode.
  • FIGS. 4 (a) and 4 (b) when electrolysis is performed using a Gn5DH-fixed electrode, the total electrolysis requires approximately 20 times as long as when using a GDH-fixed electrode. did. Thereby, it turned out that the electrolysis rate of a Gn5DH fixed electrode is very slow.
  • the oxygen activity of each forward / reverse reaction in GDH and Gn5DH was measured by ultraviolet light (UV).
  • the detection wavelength was 340 nm, and the spectroscopic measurement cell with an optical path length of 1 cm was used.
  • As the measurement solution a phosphate buffer solution (pH 7.0) containing 10 mM of glucose or gluconic acid was used, and the NAD + concentration of each measurement solution was adjusted so that the total was 3 ml. Then, the reaction was started by adding an enzyme to the adjusted measurement solution, and the rate at which NADH was generated from NAD + ( ⁇ ABS / min) was defined as the reaction rate of each enzyme.
  • FIGS. 5 (a) and 5 (b) are graphs showing the reaction rate of GDH, FIG. 5 (a) shows the forward reaction, and FIG. 5 (b) shows the reverse reaction.
  • 6 (a) and 6 (b) are diagrams showing the reaction rate of Gn5DH, FIG. 6 (a) shows the forward reaction, and FIG. 6 (b) shows the reverse reaction.
  • FIGS. 5 (a), 5 (b) and FIGS. 6 (a), (b) it was confirmed that Gn5DH has a significantly higher reverse reaction rate than GDH.
  • in-electrode electrolysis of glucose or gluconic acid was then performed by an electrochemical measurement method using a three-electrode system shown in FIG. At that time, 2 ⁇ L of 0.4 M glucose fuel solution or 0.4 M gluconic acid fuel solution was dropped on the surface of the enzyme / electron mediator immobilized electrode 1 (GDH immobilized electrode or Gn5DH immobilized electrode), and electrolysis was performed.
  • the enzyme / electron mediator immobilized electrode 1 is used as an anode (working electrode), a platinum mesh 6 is used as a counter electrode, and an insulator (paper) 7 is disposed between them. did.
  • FIGS. 7 (a) and 7 (b) are diagrams showing the results of chronoamperometry performed by the method of the example shown in FIG. 2, and FIG. 7 (a) shows the results when a GDH-immobilized electrode is used.
  • FIG. 7B shows the results when using a Gn5DH-immobilized electrode.
  • both the Gn5DH immobilized electrode and the GDH immobilized electrode were electrolyzed in 2000 to 3000 seconds, and there was almost no difference in the electrolysis time. Was not seen.

Abstract

　酵素の逆反応を抑制し、電解速度を向上させることが可能な燃料の電解方法を提供する。カーボン系材料などからなる多孔質電極に、例えばグルコン酸－５－デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼまたはリンゴ酸デヒドロゲナーゼなどの酵素と、電子メディエーターとが固定化された酵素／電子メディエーターを使用して、グルコースなどの燃料を電解する際に、酵素／電子メディエーター電極内でのみ電解反応が生じるようにする。

Description

燃料の電解方法
　本発明は、燃料電池における燃料の電解方法に関する。より詳しくは、バイオ燃料電池において、酵素が固定化された電極により、グルコースなどの燃料を電解する方法に関する。
　負極又は正極の少なくとも一方の電極上に触媒として酵素を固定化したバイオ燃料電池は、例えばグルコース及びエタノールのように通常の工業触媒では利用できない燃料から、効率よく電子を取り出すことができるため、高容量でかつ安全性が高い次世代の燃料電池として注目されている（例えば、特許文献１～３参照。）。
　図８は酵素と共に電子メディエーターが固定化されたカーボン電極を備え、グルコースを燃料とする酵素電池の反応を示す図である。図８に示す酵素電池においては、負極でグルコース（Glucose）の酸化反応が進行し、正極で大気中の酸素（Ｏ２）の還元反応が進行する。そして、負極では、グルコース（Glucose）、グルコース脱水素酵素（Glucose Dehydrogenase）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋；Nicotinamide Adenine Dinucleotide）、ジアホラーゼ（Diaphorase）、電子メディエーター、電極（カーボン）の順に電子が受け渡される。
特開２００７－２８０９４４号公報 特開２００８－１７７０８８号公報 特開２００８－２７０２０６号公報
　しかしながら、従来のバイオ燃料電池には、以下に示す問題点がある。即ち、バイオ燃料電池で使用される酵素の中には、本来の反応とその逆の反応とを同時に起こす酵素が存在している。このため、この逆反応を起こす酵素を使用すると、燃料の電解時間が長くなり、発電効率が低下するという問題点がある。そこで、従来、遺伝子改変などにより、逆反応を起こさないようにした酵素も開発されている。この逆反応を起こさない酵素を使用すれば、燃料の電解時間を短縮し、発電効率を高くすることが可能であるが、このような酵素を実用化するには、手間とコストを要する。
　そこで、本発明は、酵素の逆反応を抑制し、電解速度を向上させることが可能な燃料の電解方法を提供することを主目的とする。
　本発明の一実施の形態に係る燃料の電解方法は、酵素が固定化された電極により燃料を電解する際に、電極内でのみ電解反応を生じさせるものである。
　本発明においては、燃料を電極内電解しているため、酵素の逆反応が抑制され、電解速度が向上する。
　この電解方法では、電極に固定化される酵素に、逆反応を起こす酵素を使用することができる。
　また、電極に、酵素と共に電子メディエーターを固定化し、電極間に印加する電位を変えることにより、電子メディエーターの酸化体及び還元体の比率を制御してもよい。
その場合、電極間に、前記電子メディエーターの半波電位よりも高い電位を印加することもできる。
　更に、逆反応を起こす酵素としては、例えば、グルコン酸－５－デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼなどが挙げられる。
　本発明の一実施の形態によれば、燃料を電極内電解しているため、酵素の逆反応を抑制することができ、遺伝子改変などを行わなくても、逆反応を起こさない酵素と同等以上の電解速度が得られる。
酵素によりグルコースを酸化して４電子を取り出す反応を示す図である。 本発明の実施例に係る電極内電解の方法を模式的に示す図である。 比較例に係る電極外電解の方法を模式的に示す図である。 （ａ）及び（ｂ）は図３に示す比較例の方法でクロノアンペロメトリーを行った結果を示す図であり、（ａ）はＧＤＨ固定化電極を用いた場合の結果、（ｂ）はＧｎ５ＤＨ固定化電極を用いた場合の結果をそれぞれ示す。 （ａ）及び（ｂ）はＧＤＨの反応速度を示す図であり、（ａ）は順反応を示し、（ｂ）は逆反応を示す。 （ａ）及び（ｂ）はＧｎ５ＤＨの反応速度を示す図であり、（ａ）は順反応を示し、（ｂ）は逆反応を示す。 （ａ）及び（ｂ）は図２に示す実施例の方法でクロノアンペロメトリーを行った結果を示す図であり、（ａ）はＧＤＨ固定化電極を用いた場合の結果、（ｂ）はＧｎ５ＤＨ固定化電極を用いた場合の結果をそれぞれ示す。 酵素と共に電子メディエーターが固定化されたカーボン電極を備え、グルコースを燃料とする酵素電池の反応を示す図である。
　以下、本発明を実施するための形態について、添付の図面を参照して詳細に説明する。なお、本発明は、以下に示す実施の形態に限定されるものではない。
［全体構成］
　本発明者は、従来のバイオ燃料電池における問題点を解決するために、鋭意実験検討を行った。そして、特許文献１～３に記載のバイオ燃料電池のように、電極外に溶液が存在する系で電解を行った場合、逆反応を起こす酵素による電解時間と、逆反応を起こさない酵素による電解時間との差が、特に大きいことを見出した。
　図１は酵素によりグルコースを酸化して４つの電子を取り出す反応を示す図である。この系では、先ず、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）によりグルコースを酸化してグルコノラクトンとし、この反応により２つの電子を得ている。引き続き、生成したグルコノラクトンを、グルコノラクトナーゼ（Gluconolactonase）及びグルコン酸－５－デヒドロゲナーゼ（Gluconate-5-dehydorogenase：Ｇｎ５ＤＨ）によって、５－デヒドログルコネートに分解している。このような系において、グルコン酸－５－デヒドロゲナーゼ（Ｇｎ５ＤＨ）のような逆反応の速度が高い酵素を使用すると、その酵素が寄与する反応において律速するため、電池全体の電解速度が低下してしまう。
　そこで、本発明者は、従来の電極外電解に代えて、電極内電解について検討を行ったところ、酵素による電解速度が向上することを見出し、本発明に至った。即ち、本発明の電解方法では、酵素が固定化された電極を備えるバイオ燃料電池において、電極内でのみ、燃料の電解反応を生じさせる。
［電極］
　本発明の電解方法においては、電極表面に固定化された酵素により燃料を分解して電子を取り出すと共に、プロトン（Ｈ＋）を発生する。その際使用する電極としては、例えば、多孔質カーボン、カーボンペレット、カーボンフェルト及びカーボンペーパーなどのように、内部に空隙を有し、表面積が大きいカーボン系材料で形成されているものが好ましい。なお、電極材料は、カーボン系材料に限定されるものではなく、例えば、チタン、金、銅及びニッケルなどの金属材料を使用してもよい。
［酵素］
　前述した電極に固定化される酵素は、使用する燃料に応じて適宜選択することができる。例えば、燃料にグルコースを用いる場合には、グルコースを酸化し分解するグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を使用することができる。また、グルコースなどの単糖類を用いる場合には、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）のような燃料の分解に寄与する酸化酵素と共に、補酵素酸化酵素及び電子メディエーターが固定化されていることが望ましい。
　補酵素酸化酵素は、酸化酵素によって還元される補酵素（例えば、ＮＡＤ＋，ＮＡＤＰ＋など）と、補酵素の還元体（例えば、ＮＡＤＨ，ＮＡＤＰＨなど）を酸化するものであり、例えば、ジアホラーゼ（ＤＩ）などが挙げられる。この補酵素酸化酵素の作用により、補酵素が酸化体に戻るときに電子が生成され、補酵素酸化酵素から電子メディエーターを介して電極に電子が渡される。
　また、燃料に多糖類を用いる場合には、酸化酵素、補酵素酸化酵素及び電子メディエーターに加えて、多糖類の加水分解などの分解を促進し、グルコースなどの単糖類を生成する分解酵素が固定化されていることが望ましい。なお、ここでいう「多糖類」は、広義の多糖類であり、加水分解によって２分子以上の単糖を生じる全ての炭水化物を指し、二糖、三糖及び四糖などのオリゴ糖を含む。具体的には、デンプン、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、セルロース、マルトース、スクロース及びラクトースなどが挙げられる。これらは２以上の単糖類が結合したものであり、いずれの多糖類においても結合単位の単糖類としてグルコースが含まれている。
　また、アミロースとアミロペクチンとはデンプンに含まれる成分であり、デンプンはアミロースとアミロペクチンとの混合物である。例えば、多糖類の分解酵素としてグルコアミラーゼを使用し、単糖類を分解する酸化酵素としてグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を使用する場合には、燃料にはグルコアミラーゼによりグルコースにまで分解することができる多糖類を使用することができる。このような多糖類としては、例えばデンプン、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン及びマルトースなどが挙げられる。ここで、グルコアミラーゼは、デンプンなどのα－グルカンを加水分解しグルコースを生成する分解酵素であり、グルコースデヒドロゲナーゼは、β－Ｄ－グルコースをＤ－グルコノ－δ－ラクトンに酸化する酸化酵素である。
　そして、本発明の電解方法は、特に、グルコン酸－５－デヒドロゲナーゼ（Gluconate-5-dehydorogenase：Ｇｎ５ＤＨ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（Alcohol dehydrogenase）、及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Malate dehydrogenase）などの逆反応を起こす酵素を使用した系への適用が好適である。
［電子メディエーター］
　前述した酵素と共に電極表面に固定される電子メディエーターとしては、キノン骨格を有する化合物を使用することが好ましく、特に、ナフトキノン骨格を有する化合物が好適である。具体的には、２－アミノ－１，４－ナフトキノン（ＡＮＱ）、２－アミノ－３－メチル－１，４－ナフトキノン（ＡＭＮＱ）、２－メチル－１，４－ナフトキノン（ＶＫ３）、２－アミノ－３－カルボキシ－１，４－ナフトキノン（ＡＣＮＱ）などを用いることができる。また、キノン骨格を有する化合物としては、ナフトキノン骨格を有する化合物以外に、例えば、アントラキノンやその誘導体を用いることもできる。更に、必要に応じて、キノン骨格を有する化合物と共に、電子メディエーターとして作用する１種又は２種以上の他の化合物を固定化してもよい。
［電解方法］
　本発明の電解方法では、酵素が固定化された電極内でのみ電解反応を生じさせる。その方法は特に限定されるものではないが、例えば、電極表面に、その表面積に応じた量の燃料溶液を供給する方法、電極表面にマイクロ流路を形成し、その流路内に燃料溶液を通流させる方法などが考えられる。また、その場合、電解量をモニターし、逐次燃料供給量を調節することにより、極めて高い電解効率を達成することができる。更に、その他の方法としては、質量センサを利用して蒸発した溶液量を算出し、蒸発分の溶液を補充するといったフィードバック機能を備えたポンプなども考えられる。
　電解反応を行う際、電極間に印加される電位は、電子メディエーターの半波電位よりも高い電位を印加することが望ましい。これにより、電極内部を電子メディエーターの酸化体／還元体比率が高い環境にすることができ、全体の反応を望ましい方向へシフトさせることができる。
　このように、本発明の電解方法においては、電極内でのみ電解反応を生じさせているため、電子メディエーターの溶解を防止することができ、更に、電子メディエーターの酸化体と還元体の比率を、設定電位によって容易に制御することが可能となる。これにより、系全体の反応が本来の反応方向になるように促し、酵素の逆反応を抑制することができるため、全体の電解速度を向上させることができる。その結果、逆反応を起こす酵素を使用する場合であっても、酵素の改変などを行わずに、発電効率を向上させることができる。
　以下、本発明の実施例及び比較例を挙げて、本発明の効果について具体的に説明する。図２は本発明の実施例に係る電極内電解の方法を模式的に示す図である。図３は比較例に係る電極外電解の方法を模式的に示す図である。本実施例においては、グルコン酸－５－デヒドロゲナーゼ（Gluconate-5-dehydorogenase：Ｇｎ５ＤＨ）を固定化した電極を使用して、図２に示す電極内電解（実施例）及び図３に示す電極外電解（比較例）を行い、燃料の電解時間を測定した。また、比較のため、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を固定化した電極についても同様の測定を行った。
　各酵素固定化電極の作製するにあたって、先ず、下記（１）～（７）の各溶液を調整した。なお、緩衝溶液には、１００ｍＭリン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ2ＰＯ4 ）緩衝溶液（Ｉ．Ｓ．＝０．３、ｐＨ＝７．０）を用いた。また、酵素を溶解させる緩衝溶液は、直前まで冷蔵しておくことが望ましく、調整された酵素緩衝溶液も、できるだけ冷蔵保存しておくことが望ましい。
（１）ＤＩ酵素緩衝溶液
　ジアホラーゼ（ＤＩ）（ＥＣ１．６．９９，ユニチカ社製，Ｂ１Ｄ１１１）を、５～５０ｍｇ秤量し、緩衝溶液１ｍｌに溶解させた。
（２）ＧＤＨ酵素緩衝溶液
　グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）（ＮＡＤ依存型、ＥＣ１．１．１．４７，東洋紡社製，ＧＬＤ－３１１）を、５～５０ｍｇ秤量し、緩衝溶液１ｍｌに溶解させた。
（３）Ｇｎ５ＤＨ酵素緩衝溶液
　グルコン酸－５－デヒドロゲナーゼ（Ｇｎ５ＤＨ）（ＮＡＤ依存型、ＥＣ１．１．１．６９，アマノエンザイム社製）を、５～５０ｍｇ秤量し、緩衝溶液１ｍｌに溶解させた。
（４）ＮＡＤＨ緩衝溶液
　ＮＡＤＨ（シグマアルドリッチ社製，Ｎ－８１２９）を、１０～５０ｍｇ秤量し、緩衝溶液０．１ｍｌに溶解させた。
（５）ＡＮＱアセトン溶液
　２－アミノ－１，４－ナフトキノン（ＡＮＱ）（合成品）を、１０～５０ｍｇ秤量し、アセトン１ｍｌに溶解させた。
（６）ＰＬＬ水溶液
　ポリ－Ｌ－リシン臭化水素酸塩（ＰＬＬ）（和光純薬工業社製，１６４－１６９６１）を適量秤量し、２質量％となるようにイオン交換水に溶解させた。
（７）ＰＡＡｃＮａ水溶液
　ポリアクリル酸ナトリウム（ＰＡＡｃＮａ）（アルドリッチ社製，０４１－００５９５）を適量秤量し、０．２２質量％となるようにイオン交換水に溶解させた。
　次に、上記各溶液を所定量分取し、混合した溶液を、多孔質カーボン電極に塗布した後、乾燥して、酵素／電子メディエーター塗布電極を作製した。多孔質電極に塗布した混合溶液における各溶液の配合量を下記表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　次に、酵素／電子メディエーター塗布電極に、更に、（６）ＰＬＬ水溶液：５０μＬ（ＰＬＬ：０．２μｇに相当）及び（７）ＰＡＡｃＮａ水溶液：５０μＬ（ＰＡＡｃＮａ：０．００３μｇに相当）を塗布した後、乾燥し、酵素／電子メディエーター固定化電極とした。以下、これらの酵素／電子メディエーター固定化電極のうち、ＧＤＨ酵素緩衝溶液を含む混合溶液を塗布したものを「ＧＤＨ固定化電極」といい、Ｇｎ５ＤＨ酵素緩衝溶液を含む混合液を塗布したものを「Ｇｎ５ＤＨ固定化電極」という。
　こうして作製した酵素／電子メディエーター固定化電極１を、参照電極２（Ａｇ｜ＡｇＣｌ）に対して、０．１Ｖと電子メディエーターの半波電位より充分高い電位に設定し、図２及び図３に示す方法で、クロノアンペロメトリーを行った。その際、燃料溶液には、２Ｍイミダゾール緩衝液（ｐＨ７．０）に、燃料のグルコース又はグルコン酸を、濃度が０．４Ｍとなるように溶解させたものを使用した。以下、これらの燃料溶液を、それぞれ「０．４Ｍグルコース燃料溶液」及び「０．４Ｍグルコン酸燃料溶液」という。
　先ず、比較例として、図３に示す３電極方式による電気化学測定法で、グルコース又はグルコン酸の電極外電解を行った。その際、０．４Ｍグルコース燃料溶液又は０．４Ｍグルコン酸燃料溶液を２ｍｌ（０．８ｍｍｏｌ）投入し、スターラー５で溶液を撹拌しながら、電解を行った。この比較例の電極外電解においては、酵素／電子メディエーター固定化電極１をアノード（作用電極）とし、対極には白金ワイヤー３を使用した。
　図４（ａ）及び（ｂ）は図３に示す比較例の方法でクロノアンペロメトリーを行った結果を示す図であり、図４（ａ）はＧＤＨ固定化電極を用いた場合の結果、図４（ｂ）はＧｎ５ＤＨ固定化電極を用いた場合の結果をそれぞれ示す。図４（ａ）及び（ｂ）に示すように、Ｇｎ５ＤＨ固定化電極を用いて電極外電解を行うと、ＧＤＨ固定化電極を用いた場合に比べて、全電解に約２０倍の時間を要した。これにより、Ｇｎ５ＤＨ固定化電極の電解速度が、極めて遅いことがわかった。
　そこで、紫外光（ＵＶ）により、ＧＤＨ及びＧｎ５ＤＨにおける各々の順・逆反応の酸素活性測定を行った。検出波長は３４０ｎｍとし、分光測定用セルは光路長１ｃｍのものを使用した。測定溶液には、グルコース又はグルコン酸を１０ｍＭ含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を使用し、各測定溶液のＮＡＤ＋濃度を調節して、全体が３ｍｌになるようにした。そして、調整した測定溶液に酵素を添加することにより反応を開始し、ＮＡＤ＋からＮＡＤＨを生成する速度（ΔＡＢＳ／分）を、各酵素の反応速度とした。
　図５（ａ）及び（ｂ）はＧＤＨの反応速度を示す図であり、図５（ａ）は順反応を示し、図５（ｂ）は逆反応を示す。図６（ａ）及び（ｂ）はＧｎ５ＤＨの反応速度を示す図であり、図６（ａ）は順反応を示し、図６（ｂ）は逆反応を示す。図５（ａ），（ｂ）及び図６（ａ），（ｂ）に示すように、Ｇｎ５ＤＨはＧＤＨに比べて、逆反応速度が著しく高いことが確認された。
　そこで、次に、本発明の実施例として、図２に示す３電極方式による電気化学測定法で、グルコース又はグルコン酸の電極内電解を行った。その際、酵素／電子メディエーター固定化電極１（ＧＤＨ固定化電極又はＧｎ５ＤＨ固定化電極）の表面に、０．４Ｍグルコース燃料溶液又は０．４Ｍグルコン酸燃料溶液を２μＬ滴下し、電解を行った。この実施例の電極内電解においては、酵素／電子メディエーター固定化電極１をアノード（作用電極）とし、対極には白金メッシュ６を使用し、これらの間には、絶縁体（紙）７を配置した。
　図７（ａ）及び（ｂ）は図２に示す実施例の方法でクロノアンペロメトリーを行った結果を示す図であり、図７（ａ）はＧＤＨ固定化電極を用いた場合の結果、図７（ｂ）はＧｎ５ＤＨ固定化電極を用いた場合の結果をそれぞれ示す。図７（ａ）及び（ｂ）に示すように、電極内電解においては、Ｇｎ５ＤＨ固定化電極及びＧＤＨ固定化電極のいずれも、２０００～３０００秒で電解が完了しており、電解時間にほとんど差が見られなかった。
　以上の結果から、本発明の電解方法を適用することにより、遺伝子改変などを行わずに酵素の逆反応を抑制することが可能となり、逆反応を起こす酵素を使用する場合でも、逆反応を起こさない酵素と同等以上の電解速度が得られることが確認された。
 

Claims (5)

  1. 　酵素が固定化された電極によって燃料を電解する際に、電極内でのみ電解反応を生じさせる燃料の電解方法。
  2. 　前記酵素として、逆反応を起こす酵素を使用する請求項１に記載の燃料の電解方法。
  3. 　前記電極には、酵素と共に電子メディエーターを固定化し、電極間に印加する電位を変えることにより、該電子メディエーターの酸化体及び還元体の比率を制御する請求項１に記載の燃料の電解方法。
  4. 　前記電子メディエーターの半波電位よりも高い電位を印加する請求項３に記載の燃料の電解方法。
  5. 　前記酵素が、グルコン酸－５－デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ又はリンゴ酸デヒドロゲナーゼである請求項２に記載の燃料の電解方法。
     
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