WO2010098471A1 - がん細胞を用いた免疫方法 - Google Patents

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cancer cells
cancer
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博幸 里深
雅浩 内野
弘子 小島
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株式会社バイオマトリックス研究所
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    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration

Definitions

  • the present invention relates to an immunization method using cancer cells.
  • Polyclonal antibodies and monoclonal antibodies are industrially useful substances as reagents or pharmaceuticals in research and clinical tests because they can specifically bind to trace amounts of proteins contained in mixed solutions such as blood.
  • the antibody molecule strongly induces an antigen-antibody reaction against the antigen expressed on the cell membrane. Therefore, an antibody that recognizes a membrane protein is desirable in order to expect a therapeutic effect when administered to a diseased patient. .
  • Non-patent Document 1 Most of the therapeutic antibodies on the market to date are monoclonal antibodies that recognize membrane proteins (Non-patent Document 1), and (1) bind to target cells and directly or indirectly cell death. (Patent Document 1), (2) Inhibiting the binding of a ligand to a membrane receptor to relieve intracellular signal transduction (Patent Document 2), etc.
  • Patent Document 1 Inhibiting the binding of a ligand to a membrane receptor to relieve intracellular signal transduction
  • Patent Document 2 Inhibiting the binding of a ligand to a membrane receptor to relieve intracellular signal transduction
  • Non-patent Document 3 As a method for immunizing a full-length protein, a gene immunization method in which a DNA vector for expression is directly introduced into a mouse has been reported (Patent Document 3).
  • Patent Document 3 a gene immunization method in which a DNA vector for expression is directly introduced into a mouse has been reported.
  • Such a method has many advantages such as not requiring a purified antigen and obtaining an antibody that recognizes the three-dimensional structure of the target molecule, but (1) an immune response cannot be induced unless expressed on the cell surface. 2) Insufficient immunity due to low expression level of transgene, (3) When extracellular region is too small, immune system does not react and antibody cannot be produced, (4) It is a membrane protein Many drawbacks have been pointed out, such as difficulty in obtaining an antibody against a multiple-transmembrane protein (Non-patent Document 2).
  • Patent Document 7 As an improved method for cell administration, it has been reported that human cancer tissue is administered subcutaneously or into a gonadal fat pad of a mouse (Patent Document 7).
  • JP 2001-010974 A Japanese Patent Laid-Open No. 7-188056 Japanese Unexamined Patent Publication No. 7-313187 International Publication No. 2006/109533 Pamphlet JP-A-6-327491 Japanese translation of publication No. 2004-517885 JP 2001-520011 A
  • Patent Documents 4 to 6 and Non-Patent Documents 4 to 8 (1) Since multiple types of proteins are simultaneously immunized, an immune response is unlikely to occur against a specific substance, and (2) a large amount of proteins Anaphylactic shock is caused by the administration of (3), and (3) animals tend to die early due to organ failure due to metastasis of cancer cells.
  • Non-patent Document 9 Hyperimmunization is a combination of three mechanisms: class shift to IgG, affinity maturation, and clonal dominance (selective killing of antibody-producing cells with low specificity due to apoptosis). It is known as a mechanism of proliferation (Non-patent Document 9).
  • Patent Documents 4 to 6 and Non-Patent Documents 4 to 8 since a large amount of cells is administered to elicit an immune response, the mouse is likely to die early, and hyper-immunization proceeds. Hateful. Therefore, the method of directly administering the cells disclosed in these documents cannot create conditions that sufficiently induce an effective immune response.
  • Patent Document 7 (1) it is necessary to isolate a human tissue containing B cells, (2) there is no reproducibility of the immune response because the types of cells contained in the tissue are different, (3) There is a problem that culturing in a test tube is difficult, and techniques such as gene transfer are difficult to use.
  • an object of the present invention is to provide an immunization method capable of overcoming the above problems and efficiently producing a target antibody.
  • the present inventors are able to efficiently obtain the target antibody by transplanting and engrafting cancer cells having metastasis to experimental animals.
  • the present invention has been completed.
  • [5] The method according to any one of [1] to [4], wherein the antigen is a membrane protein.
  • the cancer cell is at least one selected from the group consisting of MCF7-14, MDA-MB231, MDA-MB361, and MDA-MB435.
  • the site to be transplanted is in the vicinity of a lymph node.
  • the transplanted site is adipose tissue.
  • the site to be transplanted is at least one selected from the group consisting of an organ to which a primary tumor of cancer from which the cancer cells have been isolated belongs, and an organ to which a metastatic lesion belongs.
  • the method in any one of. [10] The method according to any one of [1] to [9], wherein the site to be transplanted is an organ to which a primary tumor site from which the cancer cells have been isolated belongs. [11] The method according to any one of [1] to [10], wherein the transplanted site is a mammary gland. [12] The method according to any one of [1] to [11], wherein the transplanted site is the fourth mammary gland.
  • [20] (1) transplanting cancer cells having metastatic properties and expressing an antigen into an experimental animal; (2) engrafting and immunizing the cancer cells in the experimental animal; (3) collecting antibody-producing cells from the experimental animal and fusing with myeloma cells to produce hybridoma cells; (4) A method for producing a monoclonal antibody, comprising a step of culturing the hybridoma cell.
  • a novel immunization method capable of efficiently obtaining a target antibody can be provided.
  • photographed the result of the immuno-staining under the phase-contrast microscope (1) and the fluorescence microscope (2) is shown.
  • the result of having confirmed the expression of the antigen protein in a cell is shown.
  • the vertical axis represents the reactivity of cells (1 to 7) into which the F3 gene has been introduced, cells that have not been introduced (Negative control), and antibodies that recognize F3.
  • the result of having analyzed the titer of the antibody and culture medium only (Negative control) contained in the culture supernatant of a hybridoma is shown.
  • the vertical axis represents the reactivity of each antibody to F3 protein.
  • the immunization method of the present invention comprises: (1) transplanting cancer cells having metastatic properties and expressing an antigen into an experimental animal; (2) A method for immunizing a laboratory animal, comprising a step of immunizing the cancer cell by engrafting the cancer cell in the laboratory animal.
  • a method for immunizing a laboratory animal comprising a step of immunizing the cancer cell by engrafting the cancer cell in the laboratory animal.
  • various types of antibody-producing cells in which hyper-immunization has sufficiently progressed can be obtained.
  • the present invention can cause a higher immune response compared to conventional immunization methods.
  • an antibody against an antigen having an original three-dimensional structure meaning a structure possessed in a living environment
  • an antibody having a sufficient neutralizing ability against the antigen can be induced.
  • antibodies are induced not only to membrane proteins but also to cytoplasmic and nuclear proteins, and thus have high utility as an immunization method. Induction of immunity against intracellular substances is thought to be due to the mechanism of phagocytosing and decomposing cancer cells transplanted by macrophages and the like and presenting intracellular substances as antigens.
  • HT-1080 fibrosarcoma
  • HepG2 liver cancer
  • T-24 bladedder cancer
  • SW620 colon cancer
  • A549 lung cancer
  • SW480 colon cancer
  • A375 melanoma
  • the transplantation site of the metastatic cancer cell is in the vicinity of the mammary gland, it is preferably a breast cancer cell expressing one or more proteins selected from estrogen receptor, progesterone receptor, and Her-2. Breast cancer cells expressing these proteins are easy to grow in the mammary gland and are effective for engraftment after transplantation.
  • the experimental animal to which the cancer cells having metastasis are transplanted is not particularly limited as long as the transplanted cells are engrafted and the humoral immune response functions.
  • the type of experimental animal is not particularly limited, but is preferably a rodent such as a mouse or a rat, more preferably an immunodeficient rodent, and still more preferably an immunodeficient mouse.
  • an inbred or closed colony immunodeficient mouse can be used as an experimental animal.
  • Specific examples of immunodeficient mice include BALB / c, C57BL / 6, and ICR strain immunodeficient mice. Among them, BALB / c-nu / nu females have decreased T cell function. Therefore, the transplanted cells are suitable for engraftment and easy to breed.
  • “transplant” means that cancer cells are transferred to a laboratory animal and planted, and does not include direct administration of cancer cells into blood or intraperitoneally.
  • the cancer cells can be transplanted to the laboratory animal by a conventionally known method.
  • a method for transplanting cancer cells having metastasis include a method of injecting cells cultured in a two- to three-dimensional structure such as a sheet or multilayer structure into a laboratory animal in addition to a cell suspension.
  • the number of metastatic cancer cells used for transplantation is not particularly limited, but is preferably at least 0.1 ⁇ 10 6 cells, and more cells can be used as long as an immune response is effectively performed. preferable.
  • the scaffold material a gel mainly composed of laminin / entactin and collagen is preferable, and Matrigel (manufactured by Becton Dickinson) is more preferable from the viewpoint of the hardness of the formed gel and good cell growth after transplantation.
  • Matrigel preferably, J.M. Steroid. Biochem. Molec. Biol. 1993 44 (4-6) p.
  • Examples include growth factor reduced matrigel disclosed in 671-673.
  • organs to which cancer cells having metastasis are transplanted include an organ to which the primary tumor of the cancer from which the cancer cells are isolated and an organ to which the metastatic lesion belongs.
  • transplantation to the organ to which the primary lesion belongs is called orthotopic transplantation, and transplantation to the organ to which the metastasis belongs belongs to.
  • Organs to which metastases belong include not only organs that have been reported to form metastases of cancer cells so far, but also organs from which distant metastases are predicted in the same type of cancer from statistical data. For example, when breast cancer cells are used as metastatic cancer cells, orthotopic transplantation into the breast is possible, but metastasis of bone, lung, lymph node, skin, liver, pleura, brain, etc.
  • the organ to be transplanted is preferably orthotopic transplantation, for example, breast in the case of breast cancer cells.
  • orthotopic transplantation is performed even if the animal species from which the cancer cells are isolated and the animal species to which the cancer cells are transplanted are different, when transplanted into an organ having the same function, the orthotopic transplantation is performed.
  • any cancer cells that have metastatic potential can be transplanted as long as the transplanted cancer cells with metastatic potential can be engrafted. .
  • the breeding period of experimental animals in the process of engraftment and immunization should be within the viable range. Longer is preferable.
  • the hyperimmunization index include spleen size and cell number. Since the size of the spleen and the number of cells in the spleen reflect the degree of proliferation of the antibody-producing cells, it is considered that the types of antibody-producing cells increase as the number of spleen cells increases. That is, it is considered that an antibody having a better performance can be obtained as the number of spleen cells is increased.
  • the number of cells obtained from the spleen of a naive mouse is 0.5 to 1 ⁇ 10 8 , and when immunized with an adjuvant or the like, the administration can be repeated for 15 weeks. It is known that the number increases from 2 to 4 ⁇ 10 8 and hyper-immunization proceeds. It has been found that when the number of spleen cells is 3 ⁇ 10 8 or more, an antibody having a certain affinity and specificity for the target antigen can be obtained.
  • the antigen to be expressed in metastatic cancer cells is preferably a protein, and the target protein is not particularly limited, and examples thereof include membrane proteins.
  • the method for producing the hybridoma cell of the present invention comprises: (1) transplanting cancer cells having metastatic properties and expressing an antigen into an experimental animal; (2) engrafting and immunizing the cancer cells in the experimental animal; (3) A method comprising collecting antibody-producing cells from the experimental animal and fusing with myeloma cells.
  • the method for producing the monoclonal antibody of the present invention comprises: (1) transplanting cancer cells having metastatic properties and expressing an antigen into an experimental animal; (2) engrafting and immunizing the cancer cells in the experimental animal; (3) collecting antibody-producing cells from the experimental animal and fusing with myeloma cells to produce hybridoma cells; (4) A method comprising the step of culturing the hybridoma cell.
  • a monoclonal antibody can be obtained according to a method well known to those skilled in the art after the step of engrafting cancer cells having metastatic properties in an experimental animal and immunizing them.
  • Antibody-producing cells are collected from the spleen or lymph nodes of immunized experimental animals and fused with myeloma cells to produce hybridoma cells, which then produce monoclonal antibodies specific for the antigen of interest, preferably the protein of interest.
  • the hybridoma cells to be screened are screened.
  • a monoclonal antibody can be stably produced by culturing the hybridoma cell. According to the present invention, since a high immune response can be caused, the immunization method of the present invention is very advantageous for the establishment of hybridoma cells that produce antibodies with high affinity.
  • Example 1 Production of antibodies against membrane proteins
  • Cells MCF7 and MDA-MB231 were purchased from Tohoku University Institute of Aging Medicine (TKG 0479) and American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA), respectively.
  • MCF7-14 used was passaged from accession number: FERM BP-10944.
  • MCF7, MCF7-14, and MDA-MB231 were tested in RPMI1640 medium (Sigma) containing 10% (v / v) serum (EQUITECH-BIO) at 37 ° C., 5% CO2 so as not to exceed 80% confluence. 2 and culture and passage for 48-72 hours.
  • mice were reared for 15 weeks or more after transplantation. It was confirmed over time by naked eye and palpation that cancer was formed at the transplant site. 20 ⁇ L of blood was collected from the tail vein of mice transplanted with cancer cells and unimmunized mice. The collected blood was mixed with 1 ⁇ L of heparin solution (manufactured by Ajinomoto Pharma). The resulting mixture was centrifuged at 3000 ⁇ g for 5 minutes to precipitate cells. The supernatant was collected as a plasma solution.
  • heparin solution manufactured by Ajinomoto Pharma
  • the plasma collected in (3) above was diluted 20,000 times with TBS-T (25 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.05% (v / v) Tween 20, pH 7.4).
  • TBS-T 25 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.05% (v / v) Tween 20, pH 7.4
  • As a primary antibody 100 ⁇ L of plasma dilution was added to the immobilized plate per well, and allowed to react at room temperature for 1 hour. Each well was washed 3 times with 200 ⁇ L TBS-T.
  • anti-mouse IgG polyclonal antibody-HRP label BETHYL
  • Orthophenylenediamine (manufactured by Sigma) is diluted in 50 mM carbonate-citrate buffer (pH 5.0) to a final concentration of 0.5 mg / mL, and 35% (w / w) 100 ⁇ L of the mixed solution to which hydrogen peroxide solution (manufactured by WAKO) was added as a substrate solution was allowed to react at room temperature for 10 minutes. The reaction was stopped by adding 25 ⁇ L of 3N sulfuric acid (manufactured by WAKO). Absorption at 492 nm was measured with a plate reader (SpectraMaxPure 384, manufactured by Molecular Devices), and the titer in plasma was analyzed.
  • mice transplanted with MCF7 or MCF7-14 show the results of analysis of antibody titers contained in the plasma of mice transplanted with MCF7 or MCF7-14, and mice that have not been immunized.
  • MCF7 or MCF7-14 In mice transplanted with metastatic MCF7, antibody production was confirmed as compared to unimmunized mice, and in mice transplanted with MCF7-14 having improved metastasis, clear antibody production was confirmed. Antibody production was also confirmed in mice transplanted with MDA-MB231 (data not shown).
  • the size of the spleen and the number of white blood cells contained in the spleen The spleen is an organ responsible for the proliferation and differentiation of B cells. When a foreign body enters the individual and a humoral immune response is stimulated, it recognizes the foreign body It has the role of specifically increasing the number of B cells that make antibodies. From this, the number of white blood cells contained in the spleen can be used as one index of the immune response to the antigen.
  • Spleen tissues were removed from the mice transplanted with cells in (2) above, and the spleen sizes were compared. The spleen of the mouse transplanted with MCF7-14 was clearly enlarged compared to the spleen that was not immunized (FIG. 2). Spleen enlargement similar to that of MCF7-14 was confirmed in mice transplanted with MDA-MB231 (data not shown).
  • Cell fusion MCF7-14-derived mouse spleen-derived lymphocytes were isolated from mouse myeloma strain P3X63-Ag8 (ATCC) using 50% (v / w) polyethylene glycol 4000 (manufactured by Sigma) in a conventional manner. Fusion No. CRL-1580). The fused cells were suspended in HAT medium (manufactured by Invitrogen) and spread on 20 96-well plates so that each well would be 100 ⁇ L. On the way, 200 ⁇ L of HAT medium was added, and after culturing for 11 to 16 days, 3 to 6 colonies were formed per well when observed under a microscope.
  • HAT medium manufactured by Invitrogen
  • Antigen Human tissue factor (Tissue factor, coagulation factor III, F3), which is a membrane-bound protein, is a factor that initiates an exogenous blood coagulation reaction. Antibodies against this membrane protein were prepared.
  • the plasmid (2) was introduced into MDA-MB231 described in Example 1 (1) using FUGENE6 (Roche Applied Science). The operation was performed based on the data attached to the kit.
  • Cells were cultured in the medium described in Example 1 (1) to which blasticidin S hydrochloride was added at 10 ⁇ g / mL, and cells having drug resistance were selected by changing the medium every 3 to 5 days.
  • the expression level of F3 was determined by enzyme immunoassay (ELISA) using cells in the same manner as in Example 1 (4). confirmed.
  • anti-F3 polyclonal antibody Anti Coagulation Factor 3 / Tissue Factor (manufactured by R & D systems) diluted to 1 ⁇ g / mL was used.
  • Primary antibody anti-F3 polyclonal antibody Anti Coagulation Factor 3 / Tissue Factor (manufactured by R & D systems) diluted to 1 ⁇ g / mL was used.
  • secondary antibody Peroxidase AffiniPure Goat anti-bovine IgG (H + L) (manufactured by Jackson ImmunoResearch) was used.
  • TMB + (manufactured by DAKO) was used as a substrate solution, and absorption at 450 nm was measured with a plate reader to analyze the antibody titer.
  • FIG. 6 shows the results of analyzing the titers of the antibody produced from the hybridoma cells (indicated by the clone number) and the medium alone (Negative control).
  • a plurality of monoclonal antibodies represented by clones 13G5a, 15B4a, 18F3c, 9C3a and the like were obtained against membrane protein F3 expressed in cells.
  • the present invention it is possible to produce an antibody that was difficult to obtain by conventional methods. Further, according to the present invention, an antibody against the three-dimensional structure inherent to the antigen can be obtained, and therefore an antibody having a sufficient neutralizing ability for the antigen can be obtained.
  • the present invention can provide a new material to the market as a novel antibody for clinical examination or treatment.

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Abstract

　本発明の目的は、目的とする抗体を効率よく作製できる免疫方法を提供することにある。　本発明は、（１）転移性を有し、抗原を発現するがん細胞を実験動物に移植する工程、（２）前記がん細胞を前記実験動物内に生着させて免疫する工程を含む、実験動物を免疫する方法を提供する。

Description

がん細胞を用いた免疫方法
　本発明は、がん細胞を用いた免疫方法に関する。
　ポリクローナル抗体やモノクロ－ナル抗体は、血液などの混合溶液中に含まれる微量なタンパク質と特異的に結合できるため、研究や臨床検査における試薬あるいは医薬品などとして、産業上で有用な物質である。
　抗体分子は、細胞膜上に発現している抗原に対して抗原抗体反応を強く引き起こすため、疾病患者に投与した場合に治療効果が期待できるためには、膜タンパク質を認識する抗体であることが望ましい。
　現在までに上市されている疾病治療用の抗体は、大部分が膜タンパク質を認識するモノクローナル抗体であり（非特許文献１）、（１）標的細胞へ結合し、直接的または間接的に細胞死を誘導する（特許文献１）、（２）膜レセプターへのリガンドの結合を阻害して細胞内シグナル伝達を緩和する（特許文献２）、などの作用により治療効果を発揮している。
　これまでに上市された抗体は、一つ一つが創意工夫と膨大な作業を繰り返すことによって得られたものであり、膜タンパク質に対するモノクローナル抗体の製法として簡便な方法は依然確立されていない。
　膜タンパク質を認識する抗体の取得技術について、これまでのところ、様々な試みがなされている。
　例えば、細胞膜の表面に露出しているペプチド配列を、大腸菌などでの強制発現や化学合成により作製し、該ペプチド配列をキャリアータンパク質と結合させて、免疫応答を行なわせる方法が知られている。
　しかし、斯かる方法では、立体構造の形成や糖鎖などの翻訳後修飾が行われず、膜タンパク質の本来の構造を認識する抗体を得ることができないという欠点がある。
　膜タンパク質に対するモノクローナル抗体を得るためには、膜タンパク質が本来の立体構造を保持したまま、実験動物を免疫する必要がある。しかし、細胞膜から膜タンパク質を抽出する際に、界面活性剤を使用すると膜タンパク質の立体構造が崩れたり、界面活性剤を使用しないと膜タンパク質が疎水性領域同士で凝集したりするなどの問題があり、抗原として立体構造を保った膜タンパク質を容易に調製することはできない。
　全長タンパク質を免疫する方法として、マウスに発現用のＤＮＡベクターを直接導入する遺伝子免疫法が報告されている（特許文献３）。
　しかし、斯かる方法では、精製抗原を必要としない、標的分子の立体構造を認識する抗体が得られるなどの利点も多いが、（１）細胞表面に発現させなければ免疫応答を誘導できない、（２）導入遺伝子の発現量の低さが原因で十分な免疫が行われない、（３）細胞外領域が小さすぎる場合は免疫システムが反応せず、抗体ができない、（４）膜タンパク質である複数回膜貫通型のタンパク質に対して抗体を得るのが困難である、などの欠点も多く指摘されている（非特許文献２）。
　バキュロウイルスの膜に機能的な膜タンパク質を再構成させて免疫する方法が報告されている（非特許文献３）。
　しかし、標的分子に特異的な抗体誘導を行う場合に免疫応答性が弱いことが文献中に記載されている。また、斯かる方法では、昆虫細胞でバキュロウイルスを調製するため、翻訳後修飾（例えば複合型のＮ型糖鎖付加）が哺乳類細胞に見られる翻訳後修飾とは異なる点や、全ての膜タンパク質がウイルス膜上で機能的な構造を取ることができるのか、という問題とその検証が依然として残されている。
　立体構造の問題を考慮せずに済むよう、増殖させた細胞をそのままマウスの尾静脈や腹腔へ投与して、免疫応答を行う方法が報告されている（特許文献４～６および非特許文献４～８）。これらの方法では、通常の抗原量（１００～２００μｇの標的タンパク質）よりも多量な１～１０×１０６個の細胞（約４～４０ｍｇのタンパク質に相当）を短期間（１週間間隔）で投与し、免疫開始から１～６週間後には抗体産生細胞を取り出している。
　細胞投与の手法として改良された方法として、ヒトがん組織をマウスの皮下または性腺脂肪パッド内へ投与することが報告されている（特許文献７）。
特開２００１－０１０９７４号公報 特開平７－１８８０５６号公報 特開平７－３１３１８７号公報 国際公開第２００６／１０９５３３号パンフレット 特開平６－３２７４９１号公報 特表２００４－５１７８８５号公報 特表２００１－５２００１１号公報
日薬理誌　２００８　１３１　ｐ．１０２－１０８ 生物工学　２００８　８６（８）　ｐ．３８４－３８６ Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　２００７　３２２　（１－２）　ｐ．１０４－１１７ Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅｌｌ　Ｇｅｎｅｔ．　１９７９　５（６）　ｐ．９５７－９７１ Ｊ　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．　１９８１　６８（５）　ｐ．１３３１－１３３７ Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　１９８６　４６（１０）　ｐ．５１３７－５１４３ Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　１９８２　４２（２）　ｐ．６０１－６０８ Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９７９　７６（３）　ｐ．１４３８－１４４２ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　１９８８　Ｃｈａｐｔｅｒ　５　ｐ．１１４－１１５
　特許文献４～６および非特許文献４～８に開示された方法では、（１）多種類のタンパク質を同時に免疫するため、特定の物質に対して免疫応答が起こり難い、（２）多量のタンパク質を投与するためにアナフィラキシーショックが引き起こされる、（３）がん細胞の転移による臓器不全などにより早期に動物が死亡しやすい、という問題がある。
　また、親和性の高い抗体を多種類得るには、ハイパーイミュニゼーション（ｈｙｐｅｒｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）を進行させることが重要であり、従来の方法では、少ない抗原量で長い期間免疫するほど、ハイパーイミュニゼーションが進みやすいことが知られている。例えば、マウスの場合は３週間以上の間隔で複数回（経験的に５回以上）投与することが好ましいことが知られている（非特許文献９）。ハイパーイミュニゼーションとは、ＩｇＧへのクラスシフトやアフィニティーマチュレーション、クローナルドミナンス（アポトーシスによる特異性の低い抗体産生細胞の選択的死滅）の３つの機構をあわせて言い、親和性の高い抗体が選択的に増殖する機構として知られている（非特許文献９）。
　特許文献４～６および非特許文献４～８に開示された方法では、免疫応答を惹起するために多量の細胞を投与することから、マウスが早期に死亡しやすく、ハイパーイミュニゼーションが進行しにくい。したがって、これら文献に開示された細胞を直接投与する方法では、効果的な免疫応答を十分誘導する条件を作り出せていない。
　特許文献７に開示された方法では、（１）Ｂ細胞を含むヒト組織を分離する必要がある、（２）組織に含まれる細胞の種類が異なるため免疫応答の再現性がない、（３）試験管内での培養が困難であり、遺伝子導入などの技術が利用困難である、という問題がある。
　以上のとおり、膜タンパク質に対する抗体の簡便な製法の確立が求められている。
　そこで、本発明は、上記問題点を克服し、目的とする抗体を効率よく作製できる免疫方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、転移性を有するがん細胞を実験動物に移植して生着させることにより、目的とする抗体を効率的に得ることができることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、以下のとおりである。
［１］
　（１）転移性を有し、抗原を発現するがん細胞を実験動物に移植する工程、
　（２）前記がん細胞を前記実験動物内に生着させて免疫する工程を含む、実験動物を免疫する方法。
［２］
　前記工程（２）が、１０週以上生着させる工程である、［１］に記載の方法。
［３］
　前記工程（２）が、前記実験動物の脾臓の細胞数を４×１０８細胞以上に増加させる工程である、［１］または［２］に記載の方法。
［４］
　前記がん細胞が、乳がん細胞である、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］
　前記抗原が、膜タンパク質である、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］
　前記がん細胞が、ＭＣＦ７－１４、ＭＤＡ－ＭＢ２３１、ＭＤＡ－ＭＢ３６１、およびＭＤＡ－ＭＢ４３５からなる群より選択される少なくとも１種である、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］
　前記移植する部位が、リンパ節の近傍である、［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］
　前記移植する部位が、脂肪組織である、［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］
　前記移植する部位が、前記がん細胞が単離されたがんの原発巣が属する器官、および転移巣が属する器官からなる群より選択される少なくとも１種である、［１］～［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］
　前記移植する部位が、前記がん細胞が単離されたがんの原発巣が属する器官である、［１］～［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］
　前記移植する部位が、乳腺である、［１］～［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］
　前記移植する部位が、第４乳腺である、［１］～［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３］
　前記実験動物が、齧歯類である、［１］～［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］
　前記実験動物が、免疫不全動物である、［１］～［１３］のいずれかに記載の方法。
［１５］
　前記実験動物が、ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕヌードマウスである、［１］～［１４］のいずれかに記載の方法。
［１６］
　前記工程（１）で、足場材料を用いて移植する、［１］～［１５］のいずれかに記載の方法。
［１７］
　前記足場材料の構成成分が、ラミニン、エンタクチン、コラーゲン、フィブリン、アガロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、およびポリグリコール酸からなる群より選択される少なくとも１種である、［１６］に記載の方法
［１８］
　前記足場材料が、マトリゲルである、［１７］に記載の方法。
［１９］
　（１）転移性を有し、抗原を発現するがん細胞を実験動物に移植する工程、
　（２）前記がん細胞を前記実験動物内に生着させて免疫する工程、
　（３）前記実験動物より抗体産生細胞を採取し、ミエローマ細胞と融合する工程を含む、ハイブリドーマ細胞の製造方法。
［２０］
　（１）転移性を有し、抗原を発現するがん細胞を実験動物に移植する工程、
　（２）前記がん細胞を前記実験動物内に生着させて免疫する工程、
　（３）前記実験動物より抗体産生細胞を採取し、ミエローマ細胞と融合してハイブリドーマ細胞を作製する工程、
　（４）前記ハイブリドーマ細胞を培養する工程を含む、モノクローナル抗体の製造方法。
　本発明によれば、目的とする抗体を効率的に得ることのできる、新規な免疫方法を提供することができる。
血漿中に含まれる抗体の力価を解析した結果を示す。マウス群Ａは、ＭＣＦ７を移植した群であり、マウス群Ｂは、ＭＣＦ７－１４を移植した群であり、マウス群Ｃは、免疫を行っていない群である。マウス群ＡおよびＢは、移植した細胞との反応性を示し、マウス群Ｃは、ＭＣＦ７とＭＣＦ７－１４に対する反応性を示す。 摘出した脾臓を直径６ｃｍの培養皿上に置いて撮影した写真を示す。免疫を行っていない群の脾臓と、ＭＣＦ７－１４を移植した群の脾臓を示す。 脾臓細胞数を算出した結果を示し、エラーバーは標準偏差を示す。 免疫染色の結果を位相差顕微鏡（１）および蛍光顕微鏡（２）下で撮影した像を示す。 細胞における抗原タンパク質の発現を確認した結果を示す。縦軸は、Ｆ３遺伝子を導入した細胞（１～７）、導入していない細胞（Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ）と、Ｆ３を認識する抗体との反応性を表す。 ハイブリドーマの培養上清に含まれる抗体および培地のみ（Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ）の力価を解析した結果を示す。縦軸は、各抗体のＦ３タンパク質に対する反応性を表す。
　以下、本発明について、その好ましい態様を具体的に説明する。なお。本発明は、以下の発明を実施するための形態に限定されるものではなく、本発明の要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
　本発明の免疫方法は、
　（１）転移性を有し、抗原を発現するがん細胞を実験動物に移植する工程、
　（２）前記がん細胞を前記実験動物内に生着させて免疫する工程を含む、実験動物を免疫する方法である。
　本発明において、転移性を有し、抗原を発現するがん細胞を実験動物に移植し生着させることで、効果的に免疫することが可能である。本発明によれば、ハイパーイミュニゼーションが十分に進行した多種類の抗体産生細胞を得ることができる。また、本発明により、従来の免疫方法と比較して高い免疫応答を引き起こすことができる。
　実験動物に移植する細胞は、転移性を有し、抗原を発現するがん細胞であればよく、がん細胞が由来する動物種や器官は特に限定されない。
　以下、「転移性を有し、抗原を発現するがん細胞」を、単に、「転移性を有するがん細胞」と記載する場合がある。
　本発明では転移性を有するがん細胞を生着させて、直接免疫に用いることで、機能的な立体構造や翻訳後修飾を保持したまま抗原を免疫することが可能であり、これまで取得が困難であった膜タンパク質に対する抗体を誘導することができる。また、本発明では本来の（生体環境で有する構造を意味する）立体構造を有する抗原に対する抗体を得ることができるため、抗原に対して十分な中和能力を持つ抗体を誘導することができる。さらに、本発明では膜タンパク質だけでなく細胞質および核内のタンパク質に対しても抗体が誘導されるため、免疫方法として利用価値が高い。細胞内物質に対する免疫誘導は、マクロファージなどが移植したがん細胞を貪食して分解し、細胞内物質を抗原提示するという機構によるものと考えられる。
　本発明において、「転移性を有する」とは、細胞の転移能を評価する方法により、転移能が認められることを意味する。例えば、がん細胞を実験動物に移植した場合に、遠隔転移が見られることを、転移性を有するという。
　本発明において、「高転移性を有する」とは、細胞の転移能を評価する方法により、高い割合で転移能が認められることを意味する。例えば、がん細胞を実験動物に移植した場合に、移植した実験動物群において、少なくとも２０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上の個体に遠隔転移が見られることを、高転移性を有するという。
　本発明において、「遠隔転移」とは、原発巣より遠く離れた器官に転移することを意味する。
　本発明において、「抗原を発現する」とは、免疫応答を引き起こすことが可能な量の抗原を含むことを意味する。
　本発明において、「抗原」は、免疫応答を引き起こさせる物質を意味し、移植するがん細胞で発現し、抗原抗体反応を生じる物質であれば特に限定されない。抗原として、タンパク質、核酸、ペプチド、糖類、および脂質などを使用することができる。抗原としては、好ましくはタンパク質が挙げられ、タンパク質としては、がん細胞が本来発現しているタンパク質でもよく、任意の遺伝子を細胞に導入して発現させたタンパク質でもよい。任意の遺伝子を細胞に導入する方法としては、公知の方法、例えば、プラスミドなどベクターを用いて行うことができる。この場合、タンパク質に付加された糖鎖も抗原となりうる。抗原は、１種類だけでなく、複数種類を用いてもよい。いずれの場合も細胞内でタンパク質が局在する部位は、特に限定されず、核内、細胞質内、細胞膜上が挙げられる。
　また、抗原の大きさも特に限定されない。抗原としてタンパク質を同種の動物に由来するがん細胞に発現させて移植した場合、タンパク質の立体構造や糖鎖などの修飾が本来の形を保ったまま免疫応答を刺激できるため好適である。
　転移性を有するがん細胞としては、例えば、骨、肺、リンパ節、皮膚、肝臓、胸膜、脳、乳房、乳腺、膀胱、大腸、または結腸から樹立された転移性を有するがん細胞などが挙げられる。
　転移性を有するがん細胞としては、好ましくは転移性を有する乳がん細胞であり、ＭＣＦ７が挙げられる。
　転移性を有するがん細胞としては、より好ましくは高転移性を有する乳がん細胞である。高転移性を有する乳がん細胞としては、具体的には、ヒトの乳がんより樹立されたＭＣＦ７由来のＭＣＦ７－１４（国際公開第２００８／０９３８８６号公報、受託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９４４）、ＭＤＡ－ＭＢ２３１、ＭＤＡ－ＭＢ３６１、およびＭＤＡ－ＭＢ４３５などが挙げられる。乳がん細胞以外の、高転移性を有するがん細胞としては、ＨＴ－１０８０（繊維肉腫）、ＨｅｐＧ２（肝臓がん）、Ｔ－２４（膀胱がん）、ＳＷ６２０（大腸がん）、Ａ５４９（肺がん）、ＳＷ４８０（結腸がん）、およびＡ３７５（黒色腫）などが挙げられる。
　転移性を有するがん細胞の移植部位が乳腺近傍である場合は、エストロゲンレセプター、プロゲステロンレセプター、およびＨｅｒ－２から選ばれる１つ以上のタンパク質が発現している乳がん細胞であることが好ましい。これらのタンパク質が発現している乳がん細胞は、乳腺で増殖しやすく、移植後の生着に効果的である。
　転移性を有するがん細胞として、転移性が細胞に本来備わっているほか、遺伝子を導入する、ホルモンやサイトカインなどの増殖因子を投与する、紫外線や薬剤で遺伝子変異を誘発する、および自然突然変異や後天的にクロマチンの修飾が変わった細胞を分離するなど、当業者が想到する手段により、転移性を持つよう調製したがん細胞を用いることができる。
　転移性を有するがん細胞としては、単一のがん細胞であってもよく、複数種のがん細胞であってもよいが、単一のがん細胞を用いることが好ましく、中でも、株化されたがん細胞を用いることが好ましい。
　転移性を有するがん細胞が移植される実験動物は、移植した細胞が生着して、液性免疫応答が機能する動物であれば、特に限定されない。
　実験動物の種類は特に限定されないが、好ましくはマウスやラットなどの齧歯類であり、より好ましくは免疫不全の齧歯類であり、さらに好ましくは免疫不全のマウスである。
　実験動物としては、近交系やクローズドコロニー系の免疫不全のマウスが利用できる。免疫不全マウスとして、具体的には、ＢＡＬＢ／ｃやＣ５７ＢＬ／６、ＩＣＲ系統の免疫不全マウスなどが挙げられ、中でも、ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕのメスは、Ｔ細胞の機能が低下しているために移植した細胞が生着しやすく、飼育もしやすいため好適である。
　本発明において、「移植する」とは、がん細胞を実験動物に移し植え付けることを意味し、血液中または腹腔内にがん細胞を直接投与することは含まない。
　転移性を有するがん細胞を実験動物に移植する工程においては、従来公知の方法により、がん細胞を実験動物に移植することができる。
　転移性を有するがん細胞の移植を行う方法としては、細胞懸濁液の他、シート状や多層構造など、二～三次元構造様に培養した細胞を実験動物に注入する方法が挙げられる。
　移植に用いる転移性を有するがん細胞数は特に限定されないが、少なくとも０．１×１０６個であることが好ましく、免疫応答が効果的に行われる範囲において、より多数の細胞を用いることが好ましい。
　従来の尾静脈や腹腔内に細胞を投与する免疫方法において用いる細胞数は、初回免疫および追加免疫の各回に、１×１０６個から１×１０７個が必要である。本発明においては、移植時にのみ、少なくとも０．１×１０６個の細胞を用いればよいため、従来よりも少ない量で免疫応答を誘導することができる。
　転移性を有するがん細胞の生着を向上させるために、足場材料と混合した細胞懸濁液を注入することが好ましい。
　足場材料としては、生着させるがん細胞が生育するための足場となる材料であれば特に限定されず、好ましくはラミニン、エンタクチン、コラーゲン、フィブリン、アガロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、およびポリグリコール酸などを成分として構成されたゲル、ハイドロゲル、および樹脂などが挙げられる。
　足場材料としては、形成されるゲルの硬さや移植後の細胞増殖の良さの観点で、ラミニン／エンタクチンとコラーゲンを主成分とするゲルが好ましく、マトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）がより好ましい。マトリゲルとしては、好ましくは、Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．　１９９３　４４（４－６）　ｐ．６７１－６７３に開示されたグロースファクターリデューストマトリゲルなどが挙げられる。
　転移性を有するがん細胞を移植する部位については、移植した細胞が生着しやすい器官や組織であれば特に限定されない。
　転移性を有するがん細胞を移植する器官としては、当該がん細胞が単離されたがんの原発巣が属する器官および転移巣が属する器官が挙げられる。本発明において、原発巣が属する器官への移植を同所移植といい、転移巣が属する器官への移植を異所移植という。
　転移巣が属する器官とは、これまでに当該がん細胞の転移巣形成が報告されている器官のほか、統計的なデータから、同種のがんにおいて遠隔転移が予測される器官も含む。
　転移性を有するがん細胞として、例えば、乳がん細胞を用いる場合には、乳房への同所移植が可能であるが、骨、肺、リンパ節、皮膚、肝臓、胸膜、および脳などの転移が頻繁に発生する器官への異所移植も利用できる。移植する器官としては、好ましくは同所移植であり、例えば乳がん細胞では乳房である。
　本発明において、がん細胞を単離した動物種と、がん細胞を移植する動物種が異なった場合でも、同じ機能を有する器官に移植した場合には、同所移植とする。
　転移性を有するがん細胞を移植する組織としては、原発巣が形成された組織と同じ組織が好ましく、このほか、リンパ節の近傍の組織、脂肪組織、または脂肪組織に包まれた組織が好ましい。
　転移性を有するがん細胞を移植する組織としては、原発巣が形成された組織と同じ組織のように、原発巣が属する器官または転移巣が属する器官の中の、組織であってもよく、また、転移性を有するがん細胞が生着する組織であれば、原発巣が属する器官または転移巣が属する器官外にある組織であってもよい。
　本発明において、「リンパ節の近傍」とは、リンパ節の周辺を意味し、リンパ節に隣接することが好適である。
　リンパ節の近傍として、特に限定されるものではないが、例えば、マウスにおいては、リンパ節から１ｃｍ以内、好ましくは５ｍｍ以内、より好ましくは１ｍｍ以内であることが挙げられる。リンパ節の近傍では、生着後に細胞がリンパ節へ供給されやすいため、免疫応答が刺激されやすく好適である。
　本発明において、「脂肪組織」とは、脂肪細胞で構成された組織を意味する。脂肪組織に包まれた組織は、例えば、乳腺が挙げられる。
　脂肪組織は、外科的に移植作業がしやすく、細胞が生着しやすいため、がん細胞の移植部位として適している。実験動物としてマウスを用いて乳がん細胞を移植する場合は、第４乳腺に移植することが好ましい。第４乳腺はリンパ節の近傍に位置し、脂肪組織に包まれているうえ、乳腺の中でも特に移植作業が容易であり、かつ長期間にわたり生着しやすい部位である。
　がん細胞の原発巣や転移巣が属する器官に限らず、移植した転移性を有するがん細胞を生着させることができる部位であれば、転移性を有するがん細胞を移植することができる。
　本発明において、「生着する」とは、移植したがん細胞がその部位に留まり増殖し、細胞塊を作ることを意味する。
　転移性を有するがん細胞を実験動物内に生着させるためには、がん細胞を移植した後は、当該実験動物を、免疫応答が行われる期間、飼育するだけでよく、通常の免疫で行われる追加免疫は不要である。転移性を有するがん細胞を実験動物内に移植した後は、実験動物内に生着させる際に、追加免疫を行わない方法であることが好適である。
　本発明において、追加免疫を行う工程を含まないのは、移植したがん細胞が転移性を有することから、生着した部位から、転移性を有するがん細胞がリンパ節や血管内に恒常的に供給され、免疫応答を継続して刺激することができると考えられるためである。
　抗原に対する親和性や特異性の高いモノクローナル抗体を得るには、ハイパーイミュニゼーションを進行させることが重要であるため、生着させて免疫する工程における実験動物の飼育期間は、生存可能な範囲で長いほど好ましい。
　ハイパーイミュニゼーションの指標としては、脾臓の大きさおよび細胞数が挙げられる。脾臓の大きさおよび脾臓の細胞数は、抗体産生細胞の増殖の程度を反映しているため、脾臓の細胞数が増加するに従い、抗体産生細胞の種類も増加すると考えられている。すなわち、脾臓の細胞数を多くさせるほど、より優れた性能の抗体を取得できると考えられる。
　実験動物がマウスである場合、未感作のマウスの脾臓から得られる細胞数は０．５～１×１０８個であり、アジュバントなどを用いて免疫した場合は、１５週間投与を繰り返すことで２～４×１０８個まで増加し、ハイパーイミュニゼーションが進行することが知られている。脾臓の細胞数が３×１０８個以上であると、目的の抗原に対して一定の親和性および特異性を有する抗体が得られることが分かっている。
　本発明においては、少量の細胞で免疫することができるため、早期に実験動物が死亡しにくい。
　細胞を腹腔内や尾静脈へ投与して免疫する従来の方法では、マクロファージなどの貪食作用により、投与した細胞が早期に消滅しやすい。また、転移性を有するがん細胞をマウスの尾静脈に投与した場合、急激に免疫応答が刺激されることにより、短期間（移植後１～６週間）にマウスは死亡する。実際に、投与後７週間以内には全てのマウスが死亡する例がある（東亞合成研究年報　ＴＲＥＮＤ　１９９９　第２号　ｐ．３２）。
　本発明においては、移植を行った多くのマウスで、少なくとも１０週以上、大抵は１５週以上の長期間に渡り生存が確認されている。さらに、本発明においては、がん細胞の供給が持続することから、免疫応答が刺激され続け、効率よくハイパーイミュニゼーションが進み、脾臓の細胞数を９～１３×１０８個にまで増やすことができる。
　本発明においては、抗原や移植する細胞の種類、移植する細胞数などによって、短期間でハイパーイミュニゼーションが進行する場合がある。この場合は、早期に飼育を終了して、後述する抗体産生細胞の採取を行うことができる。
　転移性を有するがん細胞に発現させる抗原としては、タンパク質であることが好ましく、目的タンパク質としては、特に限定されるものではないが、膜タンパク質などが挙げられる。
　本発明のハイブリドーマ細胞を製造する方法は、
　（１）転移性を有し、抗原を発現するがん細胞を実験動物に移植する工程、
　（２）前記がん細胞を前記実験動物内に生着させて免疫する工程、
　（３）前記実験動物より抗体産生細胞を採取し、ミエローマ細胞と融合する工程を含む、方法である。
　本発明のモノクローナル抗体を製造する方法は、
　（１）転移性を有し、抗原を発現するがん細胞を実験動物に移植する工程、
　（２）前記がん細胞を前記実験動物内に生着させて免疫する工程、
　（３）前記実験動物より抗体産生細胞を採取し、ミエローマ細胞と融合してハイブリドーマ細胞を作製する工程、
　（４）前記ハイブリドーマ細胞を培養する工程を含む、方法である。
　本発明において、転移性を有するがん細胞を実験動物内に生着させ免疫する工程の後に、当業者周知の方法に従い、モノクローナル抗体を取得することができる。
　免疫した実験動物の脾臓またはリンパ節などより抗体産生細胞を採取し、ミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を作製した後、目的の抗原、好ましくは目的のタンパク質に対して特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞のスクリーニングを行う。
　当該ハイブリドーマ細胞を培養することにより、安定的にモノクローナル抗体を製造することができる。
　本発明によれば、高い免疫応答を引き起こすことができるため、本発明の免疫方法は、親和性の高い抗体を生産するハイブリドーマ細胞の樹立に非常に有利である。
　以下に、実施例および比較例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１．膜タンパク質に対する抗体の作製
（１）細胞
　ＭＣＦ７およびＭＤＡ－ＭＢ２３１は、それぞれ東北大学加齢医学研究所（ＴＫＧ　０４７９）およびＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から購入した。
　ＭＣＦ７－１４は、受託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９４４を継代したものを用いた。
　ＭＣＦ７、ＭＣＦ７－１４およびＭＤＡ－ＭＢ２３１は、１０％（ｖ／ｖ）の血清（ＥＱＵＩＴＥＣＨ－ＢＩＯ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ社製）で８０％コンフルエントを越えないよう３７℃、５％ＣＯ２下で４８～７２時間培養および継代を行った。
（２）細胞の移植
　増殖した細胞を回収し、ＰＢＳ（－）（０．０１Ｍ　ｓｏｄｉｕｍ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ、０．１３８Ｍ　ＮａＣｌ、０．００２７Ｍ　ＫＣｌ、ｐＨ　７．４）で２回洗浄した。洗浄後の細胞を最終濃度が８．６×１０７細胞／ｍＬとなるようグロースファクターリデューストマトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に懸濁し、移植するまで氷上で保存した。
　生理食塩水に３．５％（ｗ／ｖ）となるよう抱水クロラール（Ｓｉｇｍａ社製）を溶解して、３．５％抱水クロラール生理食塩水溶液を調製した。６～８週齢のヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡＬｃｌ－ｎｕ／ｎｕ系統（日本クレア社製））の腹腔内に３．５％抱水クロラール生理食塩水溶液を０．２ｍＬ投与して麻酔した。マウスの第４乳腺に、マトリゲルに懸濁した細胞を１乳腺あたり１×１０６個、２４Ｇの注射針を用いて乳腺からはみ出さないよう移植した。１匹のマウスに対して、２箇所の移植となるように、胴体左右両方の第４乳腺にそれぞれ移植を行った。
　本方法では、通常の免疫で行われるような追加免疫は行わなかった。
（３）血漿の回収
　移植した後１５週間以上飼育した。移植部位にがんが形成されていくことを肉眼および触診により経時的に確認した。がん細胞を移植したマウスおよび未免疫のマウスの尾静脈から、２０μＬの血液を採取した。採取した血液を１μＬのヘパリン溶液（味の素ファルマ社製）と混合した。得られた混合液を３０００×ｇで５分間遠心分離して、細胞を沈殿させた。血漿溶液として、上清を回収した。
（４）免疫応答の解析
　上記（１）の方法で培養したＭＣＦ７、ＭＣＦ７－１４およびＭＤＡ－ＭＢ２３１それぞれを８０％コンフルエントとなるよう９６ウエルプレートに植え、３７℃、５％ＣＯ２下で１６時間培養した。
　培養上清を除去後、１０％（ｖ／ｖ）中性緩衝ホルマリン溶液（ＷＡＫＯ社製）を１００μＬ添加し、１０分間室温で反応させた。ホルマリン溶液を除去後、ＰＢＳ（－）で３回洗浄し、風乾させることで各々の細胞を固定化したプレートを作製した。
　上記（３）で回収した血漿をＴＢＳ－Ｔ（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）　Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ　７．４）でそれぞれ２万倍希釈した。一次抗体として血漿の希釈液を固定化プレートへ１ウエルあたり１００μＬ添加し、室温で１時間反応させた。各ウエルを２００μＬのＴＢＳ－Ｔで３回洗浄した。
　二次抗体として、抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体－ＨＲＰ標識（ＢＥＴＨＹＬ社製）をＴＢＳ－Ｔで５千倍に希釈した。前記抗体の希釈液を１ウエルあたり１００μＬ添加し、室温で３０分反応させた。各ウエルを２００μＬのＴＢＳ－Ｔで３回洗浄した。
　最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬとなるようオルソフェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ社製）を５０ｍＭの炭酸－クエン酸バッファー（ｐＨ　５．０）に希釈し、この溶液の１万分の１量の３５％（ｗ／ｗ）過酸化水素水（ＷＡＫＯ社製）を添加した混合液を基質溶液として各ウエルに１００μＬ入れ、室温で１０分間反応させた。２５μＬの３Ｎ硫酸（ＷＡＫＯ社製）を添加することで反応を停止させた。４９２ｎｍの吸収をプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＰｕｒｅ３８４、モレキュラーデバイス社製）で測定して、血漿中の力価を解析した。
　図１に、ＭＣＦ７またはＭＣＦ７－１４を移植したマウス、および免疫していないマウスの血漿に含まれる抗体の力価を解析した結果を示す。
　転移性を有するＭＣＦ７を移植したマウスでは、未免疫マウスに比べて抗体産生が確認され、さらに転移性が向上したＭＣＦ７－１４を移植したマウスでは、明確な抗体産生が確認された。ＭＤＡ－ＭＢ２３１を移植したマウスでも抗体産生が確認された（データ未掲載）。
（５）脾臓の大きさおよび脾臓に含まれる白血球細胞数
　脾臓はＢ細胞の増殖と分化を担う臓器であり、異物が個体内に侵入して液性免疫応答が刺激された際、異物を認識する抗体を作るＢ細胞を特異的に増やす役割を持っている。このことから抗原に対する免疫応答のひとつの指標として、脾臓に含まれる白血球細胞の数が利用できる。
　上記（２）で細胞を移植したマウスから脾臓組織を取り出し、脾臓の大きさを比較した。
　免疫していない脾臓に比べ、ＭＣＦ７－１４を移植したマウスの脾臓は明確に肥大化していた（図２）。ＭＤＡ－ＭＢ２３１を移植したマウスでもＭＣＦ７－１４と同様な脾臓の肥大化が確認された（データ未掲載）。
　それぞれの細胞数を算出するために脾臓内の細胞を注射針とピンセットを用いてＲＰＭＩ１６４０培地に取り出して、細胞懸濁液とした。細胞懸濁液１００μＬとチュルク液（ナカライテスク社製）９００μＬとを混合した。血球計算盤（アズワン社製）を用いて白血球細胞濃度を測定した。脾臓中の白血球細胞数に換算した結果、未免疫のマウスの脾臓では０．８～１×１０８細胞であるのに対し、ＭＣＦ７－１４を移植した場合では１０×１０８細胞と約１０倍細胞数が増加していた。図３に、免疫していないマウス２匹、一般的な免疫法であるアジュバント（フロイント完全アジュバント（ＰＩＥＲＣＥ社製）、不完全アジュバント（ＰＩＥＲＣＥ社製）、Ｒｉｂｉアジュバントシステム（フナコシ社製）、ＧＥＲＢＵアジュバント（ナカライテスク社製）など）を用いたマウス１００匹、ＭＣＦ７－１４を移植したマウス３匹より得た脾臓細胞数（脾臓中の白血球細胞数）を示す。アジュバントを用いた方法では、２～４×１０８細胞までしか細胞が得られないことと比較すると、本発明の方法では従来にない高い免疫応答が確認された。
（６）細胞融合
　ＭＣＦ７－１４由来のマウスの脾臓由来のリンパ球を、５０％（ｖ／ｗ）ポリエチレングリコール４０００（Ｓｉｇｍａ社製）を用いて、従来法でマウス骨髄腫株Ｐ３Ｘ６３－Ａｇ８（ＡＴＣＣ受託番号　ＣＲＬ－１５８０）と融合させた。
　融合後の細胞をＨＡＴ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に懸濁し、各ウエル１００μＬとなるよう２０枚の９６ウエルプレートに散布した。途中、ＨＡＴ培地を２００μＬ添加し、１１～１６日間培養後に顕微鏡下で観察すると、１ウエルあたり３～６個のコロニーが形成された。
（７）ハイブリドーマ細胞の解析
　ハイブリドーマ細胞が成育した９６ウエルプレートから２００μＬの培養上清を回収し、上記（４）と同様の方法で細胞との反応性を解析して、ＭＣＦ７－１４に反応する抗体をスクリーニングした。
　得られた抗体からランダムに５つのハイブリドーマ細胞を選び出し、モノクローン化した。これらの細胞をＨＴ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で培養し、上清に含まれる抗体、およびＦＩＴＣ標識したａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いて、ＭＣＦ７－１４に対する免疫染色を行った。
　図４に、位相差顕微鏡にて細胞の形態を観察した結果（１）、および蛍光顕微鏡にて染色された部分を検出した結果（２）を示す。
　５種類のハイブリドーマ細胞から得られた抗体のうち３種類（クローンＡ、Ｃ、Ｄ）は細胞膜タンパク質を認識し、１種類は核（クローンＢ）、残りの１種類は細胞質（クローンＥ）にそれぞれ存在するタンパク質を認識した。無作為的に選んだ５つのクローンのうち、３種類（６０％）が膜タンパク質に対する抗体であったことは、本発明の免疫方法が作製困難とされている膜タンパク質の抗体を容易に作製できる手法であることを強く示している。
実施例２．膜タンパク質（Ｆ３）に対する抗体の作製
（１）抗原
　膜結合型のタンパク質であるヒト組織因子（Ｔｉｓｓｕｅ　ｆａｃｔｏｒ，ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＩＩＩ，Ｆ３）は、外因性の血液凝固反応を開始する因子である。この膜タンパク質に対する抗体作製を行った。
（２）発現ベクターの作製
　ＨｅＬａ細胞からＳＶ　Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて抽出したＲＮＡをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ　ＲＮａｓｅ　Ｈ－Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてｃＤＮＡとし、これを鋳型にＰＣＲ法によりＦ３を増幅した。増幅断片をｐＥＦ６／Ｍｙｃ－ＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にＴａｇ配列が欠除するようクローニングした。各操作はそれぞれのキットに添付された資料に基づいて行った。
（３）細胞上への遺伝子発現
　実施例１（１）記載のＭＤＡ－ＭＢ２３１へ、上記（２）のプラスミドを、ＦＵＧＥＮＥ６（ロシュアプライドサイエンス社製）を用いて導入した。操作は当該キットに添付された資料に基づいて行った。ブラストサイジンＳ塩酸塩が１０μｇ／ｍＬとなるよう添加した実施例１（１）記載の培地で細胞を培養し、３～５日毎に培地を交換して薬剤耐性を持つ細胞を選択した。得られた耐性株の中からＦ３を強制発現している細胞を選び出すため、実施例１（４）記載の方法と同様に、細胞を用いた酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によりＦ３の発現レベルを確認した。なお、一次抗体としては、抗Ｆ３ポリクローナル抗体であるＡｎｔｉ　Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ　３／Ｔｉｓｓｕｅ　Ｆａｃｔｏｒ、（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を１μｇ／ｍＬに希釈したものを用いた。また、二次抗体としては、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ　Ｇｏａｔ　ａｎｔｉ－ｂｏｖｉｎｅ　ＩｇＧ　（Ｈ＋Ｌ）　（Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いた。さらに、ＴＭＢ＋（ＤＡＫＯ社製）を基質溶液として用い、４５０ｎｍの吸収をプレートリーダーで測定して、抗体の力価を解析した。
　図５に、Ｆ３遺伝子を導入した細胞（１～７）、および遺伝子を導入していない細胞（Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ）に関して、抗Ｆ３ポリクローナル抗体を用いて発現解析した結果を示す。
　遺伝子を導入した細胞では、導入していない細胞に比べ、Ｆ３の発現が有意に上昇していることが確認された。
（４）Ｆ３発現細胞の移植
　これらＦ３の発現が確認された細胞の中から増殖がほぼ均一な５種類の細胞（１～５）を選択して培養した。増殖した細胞を、トリプシンを用いて回収し、ＰＢＳ（－）で２回洗浄した。５種類の細胞が均一になるよう混合した後、実施例１（２）記載の方法でマウスに移植を行った。本方法では、通常の免疫で行われるような追加免疫は行わなかった。
（５）モノクローナル抗体の取得
　移植７ヶ月後に脾臓細胞を取り出し、実施例１（６）記載の方法でハイブリドーマ細胞を作製した。Ｆ３を認識する抗体を選択するために、Ｆ３タンパク質を用いたＥＬＩＳＡを以下のように行って、ハイブリドーマ細胞より産生された抗体の力価を解析した。
　組換えタンパク質Ｆ３（Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ　ＩＩＩ／Ｔｉｓｓｕｅ　Ｆａｃｔｏｒ，ｈｕｍａｎ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，Ｃａｒｒｉｅｒ－ｆｒｅｅ、Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を２μｇ／ｍＬとなるようＰＢＳ（－）に希釈し、１００μＬずつ９６穴プレートに分注した。１時間室温で吸着させた後、ＰＢＳ(－)に１％（ｗ／ｖ）Ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｖｕｍｉｎとなるように調製した溶液でブロッキングを３０分間室温で行った。ＴＢＳ－Ｔで洗浄後、一次抗体としてハイブリドーマ細胞の培養上清に含まれる抗体を、二次抗体として抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体－ＨＲＰ標識（ＢＥＴＨＹＬ社製）をＴＢＳ－Ｔで５千倍に希釈した溶液を用いて、実施例１（４）記載の方法と同様に操作を行った。
　図６に、ハイブリドーマ細胞より産生された抗体（クローン番号にて表記）、および培地のみ（Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ）の力価を解析した結果を示す。
　細胞に発現させた膜タンパク質Ｆ３に対し、クローン１３Ｇ５ａ、１５Ｂ４ａ、１８Ｆ３ｃ、９Ｃ３ａなどに代表されるような複数のモノクローナル抗体が得られた。
（関連出願の相互参照）
　本出願は、２００９年２月２７日出願の日本特許出願（特願２００９－４６７３０号）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
　本発明によれば、従来の方法では取得が困難であった抗体を製造することができる。また、本発明によれば、抗原が本来有する立体構造に対する抗体を得ることができるため、抗原に対して十分な中和能力を持つ抗体を得ることができる。
　本発明は、臨床検査や治療用の新規な抗体として、新たな材料を市場へ提供することができる。

Claims (20)

  1. 　（１）転移性を有し、抗原を発現するがん細胞を実験動物に移植する工程、
    　（２）前記がん細胞を前記実験動物内に生着させて免疫する工程を含む、実験動物を免疫する方法。
  2. 　前記工程（２）が、１０週以上生着させる工程である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記工程（２）が、前記実験動物の脾臓の細胞数を４×１０８細胞以上に増加させる工程である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記がん細胞が、乳がん細胞である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　前記抗原が、膜タンパク質である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　前記がん細胞が、ＭＣＦ７－１４、ＭＤＡ－ＭＢ２３１、ＭＤＡ－ＭＢ３６１、およびＭＤＡ－ＭＢ４３５からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　前記移植する部位が、リンパ節の近傍である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　前記移植する部位が、脂肪組織である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　前記移植する部位が、前記がん細胞が単離されたがんの原発巣が属する器官、および転移巣が属する器官からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　前記移植する部位が、前記がん細胞が単離されたがんの原発巣が属する器官である、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 　前記移植する部位が、乳腺である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 　前記移植する部位が、第４乳腺である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 　前記実験動物が、齧歯類である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 　前記実験動物が、免疫不全動物である、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 　前記実験動物が、ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕヌードマウスである、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 　前記工程（１）で、足場材料を用いて移植する、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 　前記足場材料の構成成分が、ラミニン、エンタクチン、コラーゲン、フィブリン、アガロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、およびポリグリコール酸からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１６に記載の方法
  18. 　前記足場材料が、マトリゲルである、請求項１７に記載の方法。
  19. 　（１）転移性を有し、抗原を発現するがん細胞を実験動物に移植する工程、
    　（２）前記がん細胞を前記実験動物内に生着させて免疫する工程、
    　（３）前記実験動物より抗体産生細胞を採取し、ミエローマ細胞と融合する工程を含む、ハイブリドーマ細胞の製造方法。
  20. 　（１）転移性を有し、抗原を発現するがん細胞を実験動物に移植する工程、
    　（２）前記がん細胞を前記実験動物内に生着させて免疫する工程、
    　（３）前記実験動物より抗体産生細胞を採取し、ミエローマ細胞と融合してハイブリドーマ細胞を作製する工程、
    　（４）前記ハイブリドーマ細胞を培養する工程を含む、モノクローナル抗体の製造方法。
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