WO2010098378A1 - オオムギのβ－グルカン欠失遺伝子、合成遺伝子及びその利用 - Google Patents

オオムギのβ－グルカン欠失遺伝子、合成遺伝子及びその利用 Download PDF

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barley
dna
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卓司 塔野岡
藤治 吉岡
恵美子 青木
武田　真
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独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構
国立大学法人岡山大学
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Definitions

  • the present invention relates to a gene lacking (1-3, 1-4) - ⁇ -D-glucan (hereinafter referred to as ⁇ -glucan) in barley kernels (hereinafter referred to as ⁇ -glucan deleted gene),
  • ⁇ -glucan a gene lacking (1-3, 1-4) - ⁇ -D-glucan
  • ⁇ -glucan deleted gene a gene lacking (1-3, 1-4) - ⁇ -D-glucan (hereinafter referred to as ⁇ -glucan) in barley kernels (hereinafter referred to as ⁇ -glucan deleted gene)
  • ⁇ -glucan deleted gene hereinafter referred to as barley kernels
  • barley ⁇ -glucan deletion gene genomic DNA and cDNA barley ⁇ -glucan synthesis gene genomic DNA and cDNA, barley having ⁇ -glucan deletion gene genomic DNA, breeding method thereof, ⁇ -glucan synthesis
  • ⁇ -glucan synthesis A method for reducing or deleting ⁇ -glucan in barley grain by suppressing gene expression, and a barley, ⁇ -glucan obtained by reducing or deleting ⁇ -glucan in grain, which can be obtained by this method
  • the present invention relates to a method for producing alcohol or a fermented food comprising a step of fermenting a reduced or deleted barley grain, and an animal feed composition containing the barley grain.
  • the ⁇ -glucan synthesis gene means a gene that encodes a protein having a function of promoting the synthesis of ⁇ -glucan by being involved in the synthesis pathway of ⁇ -glucan.
  • barley kernels are rich in ⁇ -glucan, a type of polysaccharide.
  • ⁇ -glucan is a major component constituting the endosperm cell wall.
  • a large amount of ⁇ -glucan reduces starch saccharification and fermentation efficiency in beer and shochu brewing, and has negative effects such as poor digestion and absorption when used in pig and poultry feed I know. For this reason, barley used in these applications is required to have a low content of ⁇ -glucan, and a gene lacking ⁇ -glucan is useful.
  • ⁇ -glucan has physiological functions such as suppression of blood sugar level increase and reduction of blood cholesterol, and has been shown to be effective in preventing and improving lifestyle-related diseases. In recent years, it has been reported that it also has an effect on enhancement of immune function (Non-patent Document 1). Therefore, when barley is used for food, a higher ⁇ -glucan content has a higher utility value.
  • ⁇ -glucan is a highly functional polysaccharide attracting worldwide attention and at the same time an important component as a polysaccharide constituting the cell wall of plants, the genes involved in ⁇ -glucan synthesis have not yet been elucidated. Absent. The elucidation of this gene is a fierce competition worldwide.
  • An object of the present invention is to provide barley ⁇ -glucan-deficient gene genomic DNA and cDNA. Another object of the present invention is to provide barley ⁇ -glucan synthetic gene genomic DNA and cDNA.
  • the present invention further provides a barley having a ⁇ -glucan-deficient gene genomic DNA, a method for breeding the same, a method for producing alcohol comprising a step of fermenting the barley grain, and an animal feed composition comprising the barley grain. The purpose is to provide.
  • the present invention provides a protein comprising a nucleotide sequence having 90% or more homology with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and lacking ⁇ -glucan synthesis activity when transcribed and translated. ⁇ -glucan-deficient gene genomic DNA is provided.
  • the present invention provides a protein comprising a nucleotide sequence having 90% or more homology with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 18, and lacking ⁇ -glucan synthesis activity when transcribed and translated.
  • ⁇ -glucan-deficient gene genomic DNA is provided.
  • Such ⁇ -glucan-deficient gene genomic DNA can be used for the production of barley, in which ⁇ -glucan is completely deleted in the starch layer and the endosperm cell wall in the grain, and the endosperm cell wall is remarkably thin. .
  • barley kernels lacking ⁇ -glucan as a raw material, the efficiency of starch saccharification and fermentation in the production of beer and shochu can be improved.
  • animal feed compositions such as pigs and poultry containing barley grains lacking ⁇ -glucan have good digestion and absorption and high feeding effects.
  • barley lacking ⁇ -glucan contains a little more arabinoxylan, which is important as a functional polysaccharide, so it can be used to develop functional foods specialized for arabinoxylan. Normally, it is difficult to completely separate ⁇ -glucan and arabinoxylan, but pure arabinoxylan can be obtained by extracting arabinoxylan from barley lacking ⁇ -glucan.
  • the protein lacking ⁇ -glucan synthesizing activity which is produced when the ⁇ -glucan deletion gene genomic DNA of the present invention is transcribed and translated, has one or several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • a protein lacking ⁇ -glucan synthesizing activity comprising an amino acid sequence deleted, substituted or added, wherein the amino acid corresponding to position 660 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is an amino acid other than glycine preferable.
  • the amino acid corresponding to position 660 is more preferably aspartic acid.
  • the ⁇ -glucan-deficient gene genomic DNA of the present invention is particularly preferably composed of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the protein lacking ⁇ -glucan synthesis activity which is generated when the genomic DNA of the ⁇ -glucan deletion gene of the present invention is transcribed and translated, is one or several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20.
  • a protein lacking ⁇ -glucan synthesizing activity consisting of an amino acid sequence deleted, substituted or added, wherein the amino acid corresponding to position 253 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 is an amino acid other than cysteine Is more preferable.
  • the amino acid corresponding to position 253 is more preferably tyrosine.
  • the ⁇ -glucan-deficient gene genomic DNA of the present invention is particularly preferably composed of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 18.
  • the present invention consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, and corresponds to the 660th amino acid sequence in SEQ ID NO: 2
  • a ⁇ -glucan-deficient gene cDNA encoding a protein lacking ⁇ -glucan synthesis activity, wherein the amino acid is an amino acid other than glycine.
  • the present invention consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20, and corresponds to the 253rd position of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20
  • a ⁇ -glucan-deficient gene cDNA encoding a protein lacking ⁇ -glucan synthesizing activity, wherein the amino acid is an amino acid other than cysteine.
  • the ⁇ -glucan deletion gene cDNA Since the ⁇ -glucan deletion gene cDNA is involved in ⁇ -glucan synthesis, it can be used to elucidate genes involved in ⁇ -glucan synthesis in plants in the life science field. If the genes involved in ⁇ -glucan synthesis are elucidated, the results can be used to genetically control ⁇ -glucan content in breeding.
  • the amino acid corresponding to position 660 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is more preferably aspartic acid.
  • the ⁇ -glucan-deficient gene cDNA of the present invention is particularly preferably composed of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
  • the amino acid corresponding to position 253 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 is more preferably tyrosine.
  • the ⁇ -glucan deletion gene cDNA of the present invention is particularly preferably composed of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 19.
  • the present invention relates to a DNA comprising a base sequence having 90% or more homology with the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4, and producing a protein having ⁇ -glucan synthesis activity when transcribed and translated A ⁇ -glucan synthesis gene genomic DNA is provided.
  • This ⁇ -glucan synthetic gene genomic DNA is particularly preferably composed of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
  • the present invention relates to a DNA comprising a nucleotide sequence having 90% or more homology with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 15, and producing a protein having ⁇ -glucan synthesis activity when transcribed and translated A ⁇ -glucan synthesis gene genomic DNA is provided.
  • This ⁇ -glucan synthetic gene genomic DNA is particularly preferably composed of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 15.
  • ⁇ -glucan Although the genes involved in ⁇ -glucan synthesis have not been elucidated, the present inventors have revealed that the above DNA is involved in ⁇ -glucan synthesis. It is possible to develop plant varieties with high ⁇ -glucan production by methods such as increasing the number of copies of ⁇ -glucan synthesis gene genomic DNA in plants. ⁇ -glucan is highly useful because it has been reported to have effects such as suppression of an increase in blood glucose level and reduction of blood cholesterol and physiological functions and immune functions.
  • the present invention relates to ⁇ -glucan synthesis, which is a DNA encoding a protein having a ⁇ -glucan synthesis activity, comprising a base sequence having 90% or more homology with the base sequence set forth in SEQ ID NO: 6
  • Gene cDNA is provided.
  • This ⁇ -glucan synthetic gene cDNA is particularly preferably composed of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 6.
  • ⁇ -glucan can be mass-produced by ligating this cDNA downstream of an appropriate promoter and introducing it into bacteria, yeast, plants, or the like.
  • ⁇ -glucan is highly useful because it has been reported to have effects such as suppression of an increase in blood glucose level and reduction of blood cholesterol and physiological functions and immune functions.
  • the present invention relates to a method for breeding barley having a genomic DNA of ⁇ -glucan-deleted gene, comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4 that sits near the centromere of the 7H chromosome of barley.
  • a breeding method is provided.
  • the present invention relates to a method for breeding barley having a genomic DNA of ⁇ -glucan-deleted gene, comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4 that sits near the centromere of the 7H chromosome of barley.
  • a breeding method comprising a selection step of discriminating and selecting that the barley has ⁇ -glucan-deficient gene genomic DNA when the base corresponding to the 2385th position of genomic DNA has been mutated from G to A. provide.
  • the conventional method for determining the presence or absence of ⁇ -glucan is a method of detecting a fluorescent dye specifically adsorbed to ⁇ -glucan or a product produced by enzyme treatment using a grain as a sample. Therefore, in order to perform the discrimination, it was necessary to grow the plant up to the stage of seed formation. On the other hand, if the present invention is used, it can be determined even in the seedlings before the seeds are formed, and genotype homo / hetero can be determined. For this reason, the period required for breeding can be remarkably shortened.
  • the present invention includes an amplification step of amplifying a DNA fragment containing a base corresponding to the 4275th position of the base sequence described in SEQ ID NO: 4 using genomic DNA extracted from barley as a template;
  • a DNA fragment amplified in the amplification step is cleaved with a restriction enzyme selected from the group consisting of TaqI, BanI and NlaIV, and a detection step for detecting the cleaved DNA fragment;
  • a selection step in which the barley is discriminated and selected as having a ⁇ -glucan-deficient gene genomic DNA when it is cleaved with a restriction enzyme BanI or NlaIV. .
  • This breeding method can quickly discriminate when the base corresponding to the 4275th position of the genomic DNA consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 4 has been mutated.
  • the restriction enzyme BanI or NlaIV it can be discriminated when the base corresponding to the 4275th position is mutated from G to A, C (cytosine) or T (thymine).
  • the restriction enzyme TaqI it can be discriminated when the base corresponding to the 4275th position is mutated from G to A.
  • the present invention includes an amplification step of amplifying a DNA fragment containing a base corresponding to the 2385th position of the base sequence described in SEQ ID NO: 4 using genomic DNA extracted from barley as a template;
  • the DNA fragment amplified in the amplification step is cleaved with the restriction enzyme Fnu4HI, and the detection step detects the cleaved DNA fragment.
  • the detection step the DNA fragment is located at the 2386th position of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • a breeding method comprising: a selection step of discriminating and selecting that the barley has ⁇ -glucan-deficient gene genomic DNA when it is not cleaved between the corresponding base and the base corresponding to the 2387th position To do.
  • This breeding method can quickly discriminate when the base corresponding to the 2385th position of the genomic DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 has been mutated. That is, when the base is G, the amplified DNA fragment is expressed by Fnu4HI between the base corresponding to the 2386th position and the base corresponding to the 2387th position of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4. Cleaved, indicating that the barley is wild type.
  • the amplified DNA fragment is represented by SEQ ID NO: 4 is not cleaved by Fnu4HI between the base corresponding to the 2386th position and the base corresponding to the 2387th position of the base sequence described in 4, indicating that the barley has ⁇ -glucan-deficient gene genomic DNA.
  • the present invention relates to a barley bred by the breeding method described above, wherein the following DNA: (A) DNA comprising a nucleotide sequence having 90% or more homology with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, wherein a protein lacking ⁇ -glucan synthesis activity is produced when transcribed and translated ⁇ -glucan deletion gene genomic DNA, (B) In the ⁇ -glucan deletion gene genomic DNA described in (a) above, the protein produced when transcribed and translated is deleted in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or several amino acids.
  • ⁇ -glucan deletion gene genomic DNA consisting of a substituted or added amino acid sequence, wherein the amino acid corresponding to position 660 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is an amino acid other than glycine
  • C ⁇ -glucan deletion gene genomic DNA as described in (b) above, wherein the amino acid other than glycine is aspartic acid
  • D ⁇ -glucan deletion gene genomic DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1
  • E a DNA comprising a nucleotide sequence having 90% or more homology with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 18, wherein a protein lacking ⁇ -glucan synthesis activity is produced when transcribed and translated ⁇ -glucan deletion gene genomic DNA
  • F In the ⁇ -glucan-deficient gene genomic DNA described in (e) above, the protein produced when transcribed and translated is deleted in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20 or several amino acids.
  • ⁇ -glucan-deleted gene genomic DNA consisting of a substituted or added amino acid sequence, wherein the amino acid corresponding to position 253 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 is an amino acid other than cysteine
  • G the ⁇ -glucan-deficient gene genomic DNA according to (f) above, wherein the amino acid other than cysteine is tyrosine
  • H a ⁇ -glucan-deficient gene genomic DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 18, A barley having any of the above.
  • the barley of the present invention has the ⁇ -glucan-deficient gene genomic DNA of any one of (a) to (h) above.
  • the barley having the ⁇ -glucan-deficient gene genomic DNA of any one of the above (a) to (h) has a reduced ⁇ -glucan in the grain as compared with the wild-type barley.
  • the barley that has the ⁇ -glucan-deficient gene genomic DNA of any one of (a) to (h) completely lacks the ⁇ -glucan in the grain.
  • the present invention relates to a DNA comprising a base sequence having 90% or more homology with the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4, and producing a protein having ⁇ -glucan synthesis activity when transcribed and translated ⁇ -glucan in barley kernels is reduced or deleted, comprising the step of suppressing the expression of ⁇ -glucan synthetic gene genomic DNA or ⁇ -glucan synthetic gene genomic DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4
  • a method and a barley with reduced or deleted ⁇ -glucan obtainable by this method are provided.
  • the barley has a reduced or complete loss of ⁇ -glucan in the grain.
  • the present invention relates to a DNA comprising a nucleotide sequence having 90% or more homology with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 15, and producing a protein having ⁇ -glucan synthesis activity when transcribed and translated ⁇ -glucan in barley kernels is reduced or deleted, including the step of suppressing the expression of ⁇ -glucan synthetic gene genomic DNA, or ⁇ -glucan synthetic gene genomic DNA comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 15
  • a method and a barley with reduced or deleted ⁇ -glucan obtainable by this method are provided.
  • the barley has a reduced or complete loss of ⁇ -glucan in the grain.
  • the present invention relates to a barley bred by the breeding method described above, wherein the barley has the ⁇ -glucan-deficient gene genomic DNA of any one of (a) to (h) above.
  • production of an alcohol comprising a step of fermenting a grain derived from barley, wherein ⁇ -glucan in the grain is reduced or deleted, which can be obtained by suppressing the expression of the above-mentioned ⁇ -glucan synthetic gene genomic DNA
  • Barley that has a heterozygous ⁇ -glucan-deleted gene genomic DNA has fewer ⁇ -glucans in the grain than wild-type barley.
  • the ⁇ -glucan is completely deleted.
  • the present invention relates to a barley bred by the breeding method described above, wherein the barley has the ⁇ -glucan-deficient gene genomic DNA of any one of (a) to (h) above. Or fermenting a barley-derived grain having a reduced or deleted ⁇ -glucan in the grain, which can be obtained by suppressing the expression of the above-mentioned ⁇ -glucan synthesis gene genomic DNA.
  • a manufacturing method is provided. Fermented foods are foods containing fermented barley grains, such as miso and soy sauce.
  • the present invention relates to a barley bred by the breeding method described above, wherein the barley has the ⁇ -glucan-deficient gene genomic DNA of any one of (a) to (h) above.
  • an animal feed composition comprising a barley-derived grain having a reduced or deleted ⁇ -glucan in the grain, which can be obtained by suppressing the expression of the above-mentioned ⁇ -glucan synthetic gene genomic DNA.
  • Animal feed compositions containing barley kernels in which ⁇ -glucan is reduced or completely eliminated have good digestion and absorption and high feeding effects.
  • effects such as a reduction in the amount of feces are obtained.
  • the endosperm cell wall is thin and the grain is soft, the grain can be pulverized more easily during the production of the feed composition.
  • the present invention provides the following DNA: (A) ⁇ -glucan, which is a DNA comprising a base sequence having 90% or more homology with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4 and producing a protein having ⁇ -glucan synthesis activity when transcribed and translated Synthetic gene genomic DNA, (B) ⁇ -glucan synthetic gene genomic DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4, (C) ⁇ -glucan synthetic gene cDNA, which is a DNA encoding a protein having a ⁇ -glucan synthesizing activity, comprising the base sequence of SEQ ID NO: 6 and having a homology of 90% or more (D) a ⁇ -glucan synthetic gene cDNA comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 6, (E) ⁇ -glucan, which is a DNA comprising a nucleotide sequence having 90% or more homology with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 15 and producing a protein having ⁇ -glucan, (
  • the transformant may be a barley, or a plant that originally does not contain ⁇ -glucan or contains only a trace amount.
  • the transformant may be a microorganism exemplified by prokaryotes such as E. coli and eukaryotes such as yeast.
  • Such a transformed plant has high added value because it contains a larger amount of ⁇ -glucan.
  • ⁇ -glucan can be industrially produced in large quantities using such a transformed microorganism.
  • the transformant overexpresses ⁇ -glucan synthetic gene genomic DNA or ⁇ -glucan synthetic gene cDNA.
  • Overexpression means that a larger amount of ⁇ -glucan synthesis gene is expressed at the mRNA level or protein level as compared to the host before transformation.
  • the present invention provides barley ⁇ -glucan-deficient gene genomic DNA and cDNA. Also provided are barley ⁇ -glucan synthetic gene genomic DNA and cDNA. Further, a barley having ⁇ -glucan-deficient gene genomic DNA, a method for breeding the same, a method for reducing or deleting ⁇ -glucan in barley kernels by suppressing expression of a ⁇ -glucan synthesis gene, and a method obtained by this method Barley with reduced or deleted ⁇ -glucan in the grain, a method for producing alcohol or fermented foods comprising fermenting barley kernels with reduced or deleted ⁇ -glucan, and the barley grain Animal feed compositions comprising the grains are provided.
  • Modification of genes involved in ⁇ -glucan synthesis is useful in elucidating genes involved in ⁇ -glucan synthesis in plants in the life science field, and in breeding barley varieties that do not contain ⁇ -glucan in the agricultural field. Elucidation of the ⁇ -glucan deletion gene and the ⁇ -glucan deletion mechanism contributes to the identification of genes involved in ⁇ -glucan synthesis.
  • barley lacking ⁇ -glucan contains an important amount of arabinoxylan, which is important as a functional polysaccharide, together with ⁇ -glucan, and is therefore an important resource in the development of functional foods specialized for arabinoxylan.
  • the conventional method for determining the presence or absence of ⁇ -glucan is a method of detecting a fluorescent dye specifically adsorbed to ⁇ -glucan or a product produced by enzyme treatment using a grain as a sample. Therefore, in order to perform the discrimination, it was necessary to grow the plant up to the stage of seed formation. On the other hand, if the present invention is used, it can be determined even in the seedlings before the seeds are formed, and genotype homo / hetero can be determined.
  • the ⁇ -glucan deletion gene according to the present invention it is possible to produce a barley in which the ⁇ -glucan is completely deleted in the paste layer and the endosperm cell wall, and the endosperm cell wall is remarkably thin.
  • FIG. 3 is a diagram showing the locus position on the chromosome of a ⁇ -glucan deletion gene. It is a figure which shows the base sequence and deduced amino acid sequence of HvCslF6 gene in ⁇ -glucan-deficient barley variety and wild type variety. It is a photograph which shows the discrimination example of HvCslF6 genotype by a CAPS marker. It is a photograph which shows the observation result by the optical microscope of the Nishinohoshi (bgl) near-isogenic line and the grain fragment of Nishinohoshi.
  • TN5-cDNA A part of the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 16) of Sachiho Golden HvCslF6 gene cDNA.
  • TN5-a. a. Shows a part of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 17) of Sachiho Golden HvCslF6.
  • KM27-DNA A part of the genomic DNA base sequence (SEQ ID NO: 18) of KM27 HvCslF6 gene (bgl gene).
  • KM27-cDNA A part of the base sequence (SEQ ID NO: 19) of the cDNA for the bgl gene of KM27 is shown.
  • a base sequence having 90% or more homology means 90% or more when two base sequences are compared in parallel so that as many bases as possible coincide with each other. , Preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more of a base sequence having the same base sequence.
  • a gap may be included so as to give the maximum homology.
  • amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added refers to 1 to 10, more preferably 1 to 5, compared to a reference amino acid sequence.
  • the amino acid sequence in which is deleted, substituted or added refers to 1 to 10, more preferably 1 to 5, compared to a reference amino acid sequence.
  • genomic DNA means DNA containing an intron
  • cDNA means DNA not containing an intron
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 shows the base sequence of the genomic DNA of the ⁇ -glucan deletion gene.
  • the 328th to 1954th positions and the 2699th to 3367th positions are introns.
  • Introns are removed by splicing in the process where genomic DNA is transcribed into mRNA and translated into protein in the host.
  • the host is preferably a plant, and more preferably a barley.
  • SEQ ID NO: 3 shows the base sequence of ⁇ -glucan-deleted gene cDNA obtained by removing the intron part from the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the “ ⁇ -glucan deletion gene” may mean both genomic DNA and cDNA.
  • ⁇ -glucan synthesis activity means an activity that is involved in the synthesis pathway of ⁇ -glucan and promotes the synthesis of ⁇ -glucan.
  • the “ ⁇ -glucan synthesizing gene” means a gene encoding a protein that has a function of promoting the synthesis of ⁇ -glucan by participating in the ⁇ -glucan synthesis pathway.
  • the present invention relates to a method for breeding a barley having a ⁇ -glucan-deficient gene genomic DNA, comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4 that sits near the centromere of the 7H chromosome of barley.
  • a breeding method comprising a selection step of discriminating and selecting that the barley has a ⁇ -glucan-deficient gene genomic DNA when the base corresponding to the 4275th position of the genomic DNA has been mutated from G to A. provide.
  • the method for detecting a mutation in genomic DNA is not particularly limited.
  • the region of genomic DNA to be detected is amplified by PCR, and the nucleotide sequence is determined by direct sequencing of the PCR fragment, or by inserting the PCR fragment into a sequencing vector and then sequencing, and whether or not the target mutation is present. It may be determined. However, since the discrimination operation is simpler, it is preferable to detect the presence of the target mutation using as an index whether or not it is cleaved by a restriction enzyme.
  • a genomic DNA extracted from barley as a template, for example, a DNA fragment consisting of a base sequence corresponding to the 3893th to 4361rd base sequence of SEQ ID NO: 4 is PCR amplified, and the amplified 469 bp
  • the DNA fragment is cleaved with the restriction enzyme BanI
  • the cleaved DNA fragment is detected by agarose electrophoresis or the like, and the DNA fragment is not cleaved with the restriction enzyme BanI
  • the barley has the ⁇ -glucan-deleted gene genomic DNA. Then it can be determined.
  • TaqI, NlaIV, and the like can be used in the same manner as BanI.
  • the TaqI recognition sequence is 5'-TCGA-3 ', which is cleaved into 5'-T / CGA-3' by TaqI digestion. For this reason, when the base corresponding to the 4275th position of the genomic DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 has been mutated from G to A, it is cleaved.
  • the recognition sequence of NlaIV is 5'-GGNNCC-3 ', which is cleaved into 5'-GGN / NCC-3' form by NlaIV digestion.
  • N means A, T, G or C.
  • the base corresponding to the 4275th position of the genomic DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 has been mutated from G to A, C or T, it is cleaved.
  • a restriction enzyme such as BanI, TaqI or NlaIV
  • a person skilled in the art prepares a DNA fragment by amplifying which region of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 when discriminating the mutation of the base corresponding to the 4275th position by cleavage with these restriction enzymes. In this case, it can be easily selected whether it can be discriminated.
  • usable restriction enzymes other than these restriction enzymes will be apparent to those skilled in the art.
  • the method of extracting genomic DNA from barley is not particularly limited. For example, about 0.1 g of young leaves are collected, added with liquid nitrogen, ground on a mortar, and handled using DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen). It can be extracted according to the instructions.
  • the breeding method of this embodiment can be carried out as follows, for example. First, wild-type barley is treated with a mutagen such as ethyl methanesulfonate (EMS) to obtain a mutant. Subsequently, genomic DNA was extracted from each of the obtained mutants, and a mutation of the base corresponding to the 4275th position of the genomic DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 was detected by the above method, and ⁇ -glucan was detected. A barley individual having the deleted gene genomic DNA is identified and selected. In this way, barley having a ⁇ -glucan-deficient gene genomic DNA can be bred.
  • EMS ethyl methanesulfonate
  • a wild-type barley variety is crossed with a barley variety already known to have a ⁇ -glucan-deleted gene genomic DNA, and a ⁇ -glucan-deleted gene is produced from the progeny by the same method as described above.
  • barley having ⁇ -glucan-deficient gene genomic DNA can be bred.
  • the base corresponding to the 4275th position of the genomic DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 is artificially converted to G by a molecular biological method such as gene targeting method by homologous recombination.
  • Barley having ⁇ -glucan-deficient gene genomic DNA can be bred by mutating from 1 to A, C or T.
  • the artificially introduced mutation is more preferably a G to A mutation.
  • the present invention relates to a method for breeding barley having a genomic DNA of ⁇ -glucan-deleted gene, comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4 that sits near the centromere of the 7H chromosome of barley.
  • a breeding method comprising a selection step of discriminating and selecting that the barley has ⁇ -glucan-deficient gene genomic DNA when the base corresponding to the 2385th position of genomic DNA has been mutated from G to A. provide.
  • the method for detecting a mutation in genomic DNA is not particularly limited.
  • the region of genomic DNA to be detected is amplified by PCR, and the nucleotide sequence is determined by direct sequencing of the PCR fragment, or by inserting the PCR fragment into a sequencing vector and then sequencing, and whether or not the target mutation is present. It may be determined. However, since the discrimination operation is simpler, it is preferable to detect the presence of the target mutation using as an index whether or not it is cleaved by a restriction enzyme.
  • a genomic DNA extracted from barley as a template, for example, a DNA fragment consisting of a base sequence corresponding to the 2219th to 2529th base sequences of SEQ ID NO: 4 is PCR-amplified, and the amplified 311 bp of 311 bp
  • the DNA fragment is cleaved with a restriction enzyme Fnu4HI, and the cleaved DNA fragment is detected by agarose electrophoresis or the like.
  • this amplified fragment is cleaved into 6 fragments of 3, 41, 50, 56, 62 and 99 bp by digestion with the restriction enzyme Fnu4HI.
  • Fnu4HI is 5'-GCNGC-3 ', which is cleaved into 5'-GC / NGC-3' by digestion with Fnu4HI.
  • N means A, T, G or C.
  • BisI, BsoFI, Fsp4HI, ItaI, SatI, etc. are known as restriction enzymes that recognize the same base sequence as Fnu4HI and cleave in the same form as Fnu4HI. These restriction enzymes can also be used in the same manner as Fnu4HI.
  • a plurality of recognition sequences cleaved by Fnu4HI exist around the base corresponding to the 2385th position of the genomic DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
  • Fnu4HI the region of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 is amplified to prepare a DNA fragment. It is easy to select whether it is possible.
  • usable restriction enzymes other than Fnu4HI will be apparent to those skilled in the art.
  • the breeding method of this embodiment can be carried out as follows, for example. First, wild-type barley is treated with a mutagen such as ethyl methanesulfonate (EMS) to obtain a mutant. Subsequently, genomic DNA was extracted from each of the obtained mutants, and a mutation of the base corresponding to the 2385th position of the genomic DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 was detected by the above method, and ⁇ -glucan was detected. A barley individual having the deleted gene genomic DNA is identified and selected. In this way, barley having a ⁇ -glucan-deficient gene genomic DNA can be bred.
  • EMS ethyl methanesulfonate
  • a wild-type barley variety is crossed with a barley variety already known to have a ⁇ -glucan-deleted gene genomic DNA, and a ⁇ -glucan-deleted gene is produced from the progeny by the same method as described above.
  • barley having ⁇ -glucan-deficient gene genomic DNA can be bred.
  • the base corresponding to the 2385th position of the genomic DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4 is artificially converted to G by a molecular biological method such as gene targeting by homologous recombination.
  • Barley having ⁇ -glucan-deficient gene genomic DNA can be bred by mutating from 1 to A, C or T.
  • the artificially introduced mutation is more preferably a G to A mutation.
  • the present invention provides barley ⁇ -glucan synthetic gene genomic DNA and cDNA.
  • the ⁇ -glucan synthetic gene genomic DNA or cDNA of the present invention can be introduced into microorganisms such as prokaryotes such as Escherichia coli and eukaryotes such as yeast to industrially mass-produce ⁇ -glucan. It is.
  • ⁇ -glucan is highly useful because it has been reported to have effects such as suppression of an increase in blood glucose level and reduction of blood cholesterol and physiological functions and immune functions.
  • an expression vector for the ⁇ -glucan synthesis gene is constructed.
  • the expression vector contains a promoter that can be expressed in plants, a ⁇ -glucan synthesis gene, and a translation termination sequence.
  • the ⁇ -glucan synthesis gene may be genomic DNA or cDNA.
  • the host plant is not particularly limited, but is preferably barley.
  • the expression vector also has an origin of replication in E. coli, selectable markers in E. coli (ampicillin resistance gene, tetracycline resistance gene, etc.), and selectable markers in plants (kanamycin resistance gene, hygromycin resistance gene, bialaphos (bar) resistance, as necessary. Gene), polyadenylation sequences, enhancer sequences, and the like.
  • the promoter that can be expressed in the plant body may be one that induces seed-specific expression or may be constitutively expressed regardless of the tissue.
  • ubiquitin promoter, actin promoter, Em promoter, cauliflower mosaic virus 35S promoter and the like can be exemplified.
  • Gene introduction into barley can be performed using a general particle bombardment method or an Agrobacterium method.
  • gene expression is carried out by implanting an expression vector DNA of a ⁇ -glucan synthesis gene coated on gold particles into an immature embryo taken from an immature seed of barley using the particle bombardment method. Subsequently, the immature embryo into which the gene has been introduced is cultured in a medium containing plant hormone auxin and the like, and then the auxin concentration is lowered to redifferentiate the individual to obtain a transformed plant body.
  • a ⁇ -glucan synthetic gene expression vector containing a beer holas resistance gene is introduced into barley, the transformed plant body into which the transgene has been incorporated becomes resistant to beiaphorus, and therefore is selected by using a medium supplemented with beer holas. be able to.
  • the ⁇ -glucan synthesis gene can be introduced into barley by immersing the callus derived from barley in an Agrobacterium solution into which an expression vector for ⁇ -glucan synthesis gene has been introduced and infecting Agrobacterium.
  • the transformant incorporating the gene is a disinfectant such as carbenicillin for disinfecting hygromycin and Agrobacterium.
  • the cells are cultured in a redifferentiation medium excluding auxin, redifferentiated, and then transferred to a rooting medium, whereby a transformed plant body capable of expressing a ⁇ -glucan synthesis gene can be obtained.
  • Prokaryotes such as E. coli and microorganisms exemplified by eukaryotes such as yeast can also be used as a host into which an expression vector for ⁇ -glucan synthesis gene is introduced.
  • the E. coli for example, the K12 strain is preferably used, and as the vector, pBR322 or pUC-type plasmid is generally used, but is not limited thereto.
  • a promoter for E. coli tryptophan (trp) promoter, lactose (lac) promoter, etc. can be used.
  • yeast that can be used include Saccharomyces yeasts such as baker's yeast Saccharomyces cerevisiae and petroleum yeast Pichia pastoris.
  • a promoter for yeast for example, a promoter of alcohol dehydrogenase gene or a promoter of acid phosphatase gene can be used.
  • the present invention is a DNA comprising a base sequence having 90% or more homology with the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4, and producing a protein having ⁇ -glucan synthesis activity when transcribed and translated ⁇ -glucan in barley kernels is reduced or deleted, comprising the step of suppressing the expression of ⁇ -glucan synthetic gene genomic DNA or ⁇ -glucan synthetic gene genomic DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4 Provide a method.
  • the present invention is a DNA comprising a nucleotide sequence having 90% or more homology with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 15, and producing a protein having ⁇ -glucan synthesis activity when transcribed and translated ⁇ -glucan in barley kernels is reduced or deleted, including the step of suppressing the expression of ⁇ -glucan synthetic gene genomic DNA, or ⁇ -glucan synthetic gene genomic DNA comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 15 Provide a method.
  • a known method for introducing siRNA or antisense nucleic acid into cells can be used.
  • a vector expressing siRNA targeting ⁇ -glucan synthesizing gene genomic DNA or a vector expressing antisense RNA targeting ⁇ -glucan synthesizing gene genomic DNA are used in the same manner as described above. It may be introduced into barley using the bombardment method or the Agrobacterium method. According to this method, barley in which ⁇ -glucan in the grain is reduced or completely deleted can be obtained by suppressing the expression of ⁇ -glucan synthesis gene genomic DNA.
  • OUM125 is a semi-dwarf mutant produced at Okayama University by treating Akagami power, a naked six-rowed barley variety, with ethyl methanesulfonate (EMS).
  • EMS ethyl methanesulfonate
  • Nishinohoshi is a Nijo barley variety with excellent traits.
  • Izumi line A41 is a line created at the Kyushu National Agricultural Experiment Station in 1997 by crossing between the progeny of Nishikaihoku 55 and OUM125 with Nishikaihoshi 54 (the development name of Nishinohoshi). And has a naked phenotype.
  • the inventors made a quasi-isogenic line of Nishinohoshi that is ⁇ -glucan-deficient and cutaneous by mating using the fountain line A41 as a single parent and Nishinohoshi as a recurrent parent.
  • ⁇ -glucan deficiency (Analysis of ⁇ -glucan deficiency) Individual grains were cut laterally, and the part far from the embryo was crushed with pliers. ⁇ -glucan deficiency was determined by treating crushed grains with lichenase and ⁇ -glucosidase and coloring glucose with a glucose assay kit (glucose C-II test, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). In ⁇ -glucan-deficient kernels, the reaction solution was colorless or light pink, whereas in wild-type kernels, the reaction solution was deep red.
  • Linkage analysis of ⁇ -glucan deficiency and nakedness In 228 individuals obtained by crossing Nishinohoshi and its near-isogenic lines, linkage analysis was performed for ⁇ -glucan deficiency and nakedness. The results of linkage analysis are shown in Table 1. The separation ratio between ⁇ -glucan-deficient and wild type was 1: 3. Therefore, ⁇ -glucan deficiency was thought to be due to a single factor inferior gene. This gene was named ⁇ -glucan deletion gene ((1-3, 1-4) - ⁇ -D-glucanless, bgl). Significant linkage was detected between the ⁇ -glucan deletion gene and the nakedness gene (nud).
  • the recombination titer between these genes was calculated to be 14.4% ⁇ 2.5% by the maximum likelihood method of Allard (Hilgardia 24: 235-278, 1956). Since the nud gene is known to exist in the long arm of the 7H chromosome, it was considered that the ⁇ -glucan deletion gene was also located on the 7H chromosome.
  • Genomic DNA was extracted by the CTAB method from Nishinohoshi, its near-isogenic lines and 228 individuals obtained by crossing them. These genomic DNAs were analyzed using the SSR markers reported by Ramsay et al. (Genetics 156: 1997-2005, 2000) to map the ⁇ -glucan deletion gene. The SSR marker of the 7H chromosome that showed polymorphism among parents was selected and analyzed by PCR. The position of each marker on the chromosome is determined by analysis using a wheat barley chromosome addition line (Islam, Sakamoto, S. Proc. 6th Int. Wheat Genet. Symp. Maruzen Kyoto. Pp. 233-238, 1983). Were determined.
  • the recombination titer was calculated using MAPMKER version 2.0 (Lander et al., Genomics 1: 174-181, 1987). The genetic distance was calculated using the Kosambi function (Kosambi, Ann. Eugen. 12: 172-175, 1944).
  • Figure 1 shows the mapping results.
  • the ⁇ -glucan deletion gene was mapped at a position of 3.4 cM from Bmac0162, and was found to be colocalized with the Bmag0321, Bmag0359, Bmac0167, and HvCslF6 genes.
  • the HvCslF6 gene is one of a subfamily of cellulose synthase-like genes. It was revealed that the ⁇ -glucan deletion gene sits near the 7H chromosome centromere.
  • a single nucleotide polymorphism (SNP) that can be detected by the restriction enzyme BanI exists on the HvCslF6 gene, and the ⁇ -glucan-deficient phenotype completely matches the genotype of the HvCslF6 locus.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • FIG. 2 a ⁇ -glucan deletion gene is obtained by substituting the 4275th base of the base sequence of the HvCslF6 gene from G to A. The grains of ⁇ -glucan are completely deleted.
  • the deduced amino acid is glycine in the wild type cultivar, whereas it is aspartic acid in the cultivar having the ⁇ -glucan deletion gene.
  • CAPS cleaved amplified polymorphic sequence
  • the codominant marker means a marker whose hetero pattern can be distinguished from any of the homotypes of the parents.
  • the following primers (CAPS marker) 5′-GCCAAGACCAAGTACGAGAAGC-3 ′ (Forward, SEQ ID NO: 11) and 5′-TGTTCTTGGAGAAGAAGATCCTCG-3 ′ (Reverse, SEQ ID NO: 12) It was created.
  • PCR amplification of barley genomic DNA using these primers yields a 469 bp amplified fragment.
  • this amplified fragment is cleaved into 382 bp and 87 bp by digestion with the restriction enzyme BanI.
  • varieties having a ⁇ -glucan deletion gene do not have a BanI recognition site due to a single base substitution, and therefore are not cleaved even when digested with the restriction enzyme BanI.
  • the BanI recognition sequence is 5'-GGYRCC-3 ', which is cleaved into 5'-G / GYRCC-3' by BanI digestion.
  • Y means C or T
  • R means A or G.
  • FIG. 3 shows the results of determining the presence or absence of a ⁇ -glucan deletion gene by CAPS analysis.
  • genomic DNA was PCR amplified with the above primers, the amplified fragment was cleaved with restriction enzyme BanI and subjected to agarose gel electrophoresis.
  • Lanes A to F are OUM125 ( ⁇ -glucan deficiency), Akagami power (wild type), OUM125 and Akagami F1 (heterotype), Nishinohoshi near-isogenic lines ( ⁇ -glucan deficiency and nakedness), respectively. ), Nishinohoshi (wild type), Nishinohoshi near-isogenic lines ( ⁇ -glucan-deficient and naked) and Nishinohoshi F1 (heterotype) genomic DNA.
  • Nishinohoshi (bgl) and Nishinohoshi were raised and harvested.
  • Nishinohoshi (bgl) means a near-isogenic line of Nishinohoshi that is ⁇ -glucan-deficient and cutaneous.
  • ⁇ -glucan content was measured by enzymatic methods (McCleary and Codd, 1991) using the Mixed linkage ⁇ -glucan assay kit (Megazyme International, Ireland).
  • the arabinoxylan content was determined by measuring the arabinose and xylose content separately after hydrolysis of the sample with sulfuric acid according to the method of Sekiwa et al. (2003).
  • the arabinose content was measured by the enzymatic method described in “Arabana assay procedure (Megazyme International Ireland 2002)”.
  • the xylose content was measured using a D-xylose assay kit (Megazyme International, Ireland).
  • Prior to measurement of ⁇ -glucan and arabinoxylan content free low molecular sugars in the ground sample were removed by 80% ethanol treatment. The results are shown in Table 2.
  • ⁇ -glucan was not detected in the grain of Nishinohoshi (bgl), whereas 3.2% by mass of ⁇ -glucan was contained in the grain of Nishinohoshi.
  • the arabinoxylan content was 6.3% by mass in the Nishinohoshi kernel, whereas it was 7.2% by mass in the Nishinohoshi (bgl) kernel.
  • Nishinohoshi (bgl) and Nishinohoshi kernels were sliced, fixed in glutaraldehyde, dehydrated by a series of ethanol treatments, and embedded in low temperature polymerized resin Technonov 7100 (Heraeus Kulzer, Germany).
  • a 7 ⁇ m-thick section was double-stained with 0.5% Fast Green FCF (Sigma Aldrich, USA) and 0.01% Calcfluor (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). The sections were observed at a magnification of 200 times with an optical microscope equipped with a UV filter (Axiophoto, Carl Zeiss, Germany).
  • FIG. 4 A shows a bright field observation image
  • B shows an ultraviolet light irradiation image
  • “a” represents cereal skin
  • “b” represents seed coat and pericarp
  • “c” represents a paste layer
  • “d” represents endosperm.
  • Nishinohoshi sample fluorescence was observed in the paste and endosperm cell wall, whereas in Nishinohoshi (bgl), these fluorescence was not observed. This result indicates that the line having the ⁇ -glucan deletion gene has a complete deletion of ⁇ -glucan in both the paste layer and the endosperm.
  • Nishinohoshi (bgl) and horizontal slices of Nishinohoshi grain were observed with a scanning electron microscope (N-3400, Hitachi) at an observation magnification of 5000 times.
  • A shows the bright field observation image (observation magnification 200 times) by an optical microscope
  • B shows the electron microscope observation image (observation magnification 5000 times).
  • the Nishinohoshi endosperm cell wall was thick, whereas Nishinohoshi (bgl) was found to have a remarkably thin endosperm cell wall. There was no difference in the thickness of the cell walls of the paste cells.
  • Nishinohoshi (bgl) and young rosette seedlings before the stems of Nishinohoshi were elongated were collected from the field and lyophilized. Subsequently, the ⁇ -glucan content of the leaf blades and leaf sheaths was measured using the Mixed linkage ⁇ -glucan assay kit (Megazyme International, Ireland). Prior to measurement of ⁇ -glucan content, free low molecular sugars were removed by 80% hot ethanol treatment. The results are shown in Table 3.
  • Nishinohoshi (bgl) lacks ⁇ -glucan not only in grains but also in vegetative organs.
  • Nishinohoshi (bgl) is significantly softer and more brittle than the grain of Nishinohoshi. This result is thought to originate from the fact that the endosperm cell wall became thinner due to ⁇ -glucan deletion. The property that the grain is soft and brittle indicates the usefulness of being easily crushed and processed into grits in the production of animal feed.
  • TR251 is a Dr. TR251.
  • W. G. Legage (Brandon Research Center, Agricultural and Agri-Food Canada, Canada).
  • CDC-Bold is described in Dr. B. G. Distributed by Rossnagel (Crop Development Center, University of Sakatchewan, Canada).
  • Genomic DNA was extracted from these barley lines by the CTAB method, and the base sequence of the genome about 2 kb upstream of the start codon of the HvCslF6 gene including the promoter region of the HvCslF6 gene (hereinafter referred to as “promoter sequence”) was determined.
  • the promoter sequences of TR251 and CDC-Bold HvCslF6 genes are shown in SEQ ID NOs: 13 and 14, respectively.
  • the TR251 promoter sequence (SEQ ID NO: 13) showed the 10th and 45th nucleotide sequences of SEQ ID NO: 14 (CDC-Bold promoter sequence). It was revealed that the bases corresponding to the No., No. 614 and No. 2002 were mutated from A to T, A to G, G to A and C to A, respectively. Furthermore, insertion of 8 base pairs of 5'-TCTCTCAA-3 'was observed between the bases corresponding to the 678th and 679th positions of the base sequence of SEQ ID NO: 14. In the figure, each mutation location is indicated by white letters. It was shown that TR251 exhibits a phenotype of high production of ⁇ -glucan due to the difference in these base sequences.
  • the 1755th to 1758th positions of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14 correspond to this.
  • a typical TATA box was found in the position. In FIG. 7, the TATA box is indicated by white letters.
  • the start codon of the HvCslF6 gene is boxed and the coding region is underlined.
  • the base sequence of the genomic DNA of the coding region of TR251 HvCslF6 gene is shown in SEQ ID NO: 23, the base sequence of cDNA is shown in SEQ ID NO: 24, and the deduced amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 25.
  • the base sequence of the genomic DNA of the coding region of the CDC-Bold HvCslF6 gene is shown in SEQ ID NO: 26
  • the base sequence of cDNA is shown in SEQ ID NO: 27
  • the deduced amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 28.
  • the base sequence of the genome of the ⁇ -glucan deletion gene of KM27 is shown in SEQ ID NO: 18, the base sequence of cDNA is shown in SEQ ID NO: 19, and the deduced amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 20.
  • the 2385th base of the genome sequence of the ⁇ -glucan deletion gene of KM27 shown in SEQ ID NO: 18 is G to A which is the base of the HvCslF6 gene of Sachiho Golden corresponding to this base. It became clear that it was mutated.
  • the 2385th base of SEQ ID NO: 18 corresponds to the 758th position in SEQ ID NO: 19 (base sequence of cDNA of ⁇ -glucan deletion gene of KM27).
  • the 253rd amino acid of the amino acid sequence encoded by the ⁇ -glucan deletion gene of KM27 shown in SEQ ID NO: 20 is an amino acid residue on the HvCslF6 protein of Sachiho Golden corresponding to this amino acid. It was revealed that the mutation was from cysteine to tyrosine. This mutation differs from the mutation identified in the ⁇ -glucan deletion gene of OUM125 and Nishinohoshi (bgl).
  • FIG. 9 shows the result.
  • KM27 a site where cysteine is mutated to tyrosine is indicated by (i)
  • OUM125 a site where glycine is mutated to aspartic acid is indicated by (ii).
  • the positions of the D motif and the QxxRW motif are indicated as D and QxxRW, respectively.
  • CAS analysis In order to perform a CAPS analysis of the same ⁇ -glucan deletion gene as KM27, the following primers (CAPS marker) 5′-ATCAAGGAGCCCCATCCTCTC-3 ′ (HvCSLF6_MPP2-1F, SEQ ID NO: 21) and 5′-TTGATCCTGCCCTTGAACTC-3 ′ (HvCSLF6_MPP2 -1R, SEQ ID NO: 22) was prepared.
  • Fnu4HI The recognition sequence of Fnu4HI is 5'-GCNGC-3 ', and it is cleaved into 5'-GC / NGC-3' by digestion with Fnu4HI.
  • N means A, T, G or C.
  • BisI, BsoFI, Fsp4HI, ItaI, SatI, etc. are known as restriction enzymes that recognize the same base sequence as Fnu4HI and cleave in the same form as Fnu4HI. These restriction enzymes can also be used in the same manner as Fnu4HI.
  • FIG. 10 shows the result of discriminating the presence or absence of the same ⁇ -glucan deletion gene as KM27 by CAPS analysis.
  • genomic DNA was PCR amplified with the above primers, the amplified fragment was cleaved with the restriction enzyme Fnu4HI and subjected to agarose gel electrophoresis.
  • Lanes A to F are Sachiho Golden (wild type), KM27 ( ⁇ -glucan-deficient), Sachiho Golden and KM27 F1 (heterotype), KM27 ( ⁇ -glucan-deficient), Nishinohoshi (bgl), respectively. ( ⁇ -glucan deficiency), analysis results of Sachiho Golden and KM27 F1 (heterotype) genomic DNA.
  • the use of the present invention makes it possible to elucidate genes involved in ⁇ -glucan synthesis of plants in the life science field. If the genes involved in ⁇ -glucan synthesis are elucidated, it is expected that genetic control of ⁇ -glucan content in breeding will be possible using the results. In addition, it becomes possible to cultivate varieties of brewing and feed barley that do not contain ⁇ -glucan in the agricultural field. In addition, it can be applied to foods using the functionality of arabinoxylan.

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Abstract

　オオムギのβ－グルカン欠失遺伝子及びβ－グルカン合成遺伝子のゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡ、β－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡを有するオオムギ及びその育種方法、β－グルカンを減少又は欠失したオオムギの穀粒を利用したアルコール又は発酵食品の製造方法並びに動物用飼料組成物を提供する。　配列番号１に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、転写・翻訳された時にβ－グルカン合成活性を欠失したタンパク質が生成されるＤＮＡである、β－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡ、及び、オオムギの７Ｈ染色体の動原体付近に座乗する配列番号４に記載の塩基配列からなる遺伝子の第４２７５番目に対応する塩基、又は第２３８５番目に対応する塩基が、ＧからＡに変異していた場合に、そのオオムギはβ－グルカン欠失遺伝子を有すると判別して選択するステップを含む育種方法。

Description

オオムギのβ－グルカン欠失遺伝子、合成遺伝子及びその利用
　本発明は、オオムギ穀粒の（１―３，１－４）－β－Ｄ－グルカン（以下、β－グルカンという。）を欠失する遺伝子（以下、β－グルカン欠失遺伝子という。）、β－グルカン合成遺伝子及びその利用に関する。具体的には、オオムギのβ－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡ、オオムギのβ－グルカン合成遺伝子ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡ、β－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡを有するオオムギ及びその育種方法、β－グルカン合成遺伝子の発現を抑制することによってオオムギ穀粒のβ－グルカンを減少又は欠失させる方法及びこの方法によって得ることのできる、穀粒中のβ－グルカンを減少又は欠失したオオムギ、β－グルカンを減少又は欠失したオオムギの穀粒を発酵させるステップを含むアルコール又は発酵食品の製造方法、並びにこのオオムギ穀粒を含む動物用飼料組成物に関する。ここで、β－グルカン合成遺伝子とは、β－グルカンの合成経路に関与して、β－グルカンの合成を促進する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を意味する。
　コムギやイネなどの穀物と異なり、オオムギ穀粒には、多糖類の一種であるβ－グルカンが豊富に含まれている。β－グルカンは胚乳細胞壁を構成する主要成分である。β－グルカンが多いと、ビールや焼酎の醸造においてデンプンの糖化や発酵の効率を低下させ、ブタや家禽の飼料に用いる場合には消化吸収が劣り飼養効果が低い等の負の作用があることが分かっている。そのため、これらの用途に用いられるオオムギにおいてはβ－グルカンの低含有化が求められており、β－グルカンを欠失する遺伝子は有用である。
　一方で、β－グルカンには血糖値上昇抑制や血中コレステロールの低減などの生理機能があり、生活習慣病の予防と改善に効果があることが明らかにされている。近年では免疫機能の増進にも効果があることが報告されている（非特許文献１）。そのため、オオムギを食用として用いる場合には、β－グルカン含量が高いほうが利用価値が高い。
Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｃ．Ｓ．　ａｎｄ　Ｌ．Ｊ．Ｃｌｅａｒｙ　（２００５）　Ｊ．Ｃｅｒｅａｌ　Ｓｃｉ．　４２：１－１３．
　育種におけるβ－グルカン含量の遺伝的制御のためには、β－グルカンの合成や制御に関わる遺伝子の解明が不可欠である。β－グルカンは世界的に注目を集めている高機能性多糖であると同時に植物の細胞壁を構成する多糖として重要な成分であるにもかかわらず、β－グルカン合成に関わる遺伝子は未だ解明されていない。この遺伝子の解明は世界的に熾烈な競争となっている。
　本発明は、オオムギのβ－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡを提供することを目的とする。本発明はまた、オオムギのβ－グルカン合成遺伝子ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡを提供することを目的とする。本発明は更に、β－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡを有するオオムギ及びその育種方法、このオオムギの穀粒を発酵させるステップを含むアルコールの製造方法、並びにこのオオムギ穀粒を含む動物用飼料組成物を提供することを目的とする。
　１つの態様において、本発明は、配列番号１に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、転写・翻訳された時にβ－グルカン合成活性を欠失したタンパク質が生成されるＤＮＡである、β－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡを提供する。
　別の態様において、本発明は、配列番号１８に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、転写・翻訳された時にβ－グルカン合成活性を欠失したタンパク質が生成されるＤＮＡである、β－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡを提供する。
　このようなβ－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡは、穀粒中の糊粉層及び胚乳の細胞壁においてβ－グルカンが完全に欠失し、胚乳細胞壁が顕著に薄い、オオムギの作出に利用可能である。β－グルカンが欠失したオオムギ穀粒を原料に用いることによって、ビールや焼酎の製造におけるデンプンの糖化や発酵の効率を向上させることができる。また、β－グルカンが欠失したオオムギ穀粒を含む、ブタや家禽などの動物用飼料組成物は、消化吸収が良く、飼養効果が高い。また、β－グルカンを欠失するオオムギは、機能性多糖として重要なアラビノキシランをやや多く含むため、アラビノキシランに特化した機能性食品の開発に利用することも可能である。通常はβ－グルカンとアラビノキシランを完全に分離することは困難であるが、β－グルカンが欠失したオオムギからアラビノキシランを抽出することにより、純粋なアラビノキシランを得ることができる。
　本発明のβ－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡが転写・翻訳された時に生成される、β－グルカン合成活性を欠失したタンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の第６６０番目に対応するアミノ酸がグリシン以外のアミノ酸である、β－グルカン合成活性を欠失したタンパク質であることが更に好ましい。また、上記の第６６０番目に対応するアミノ酸は、アスパラギン酸であることが更に好ましい。さらに、本発明のβ－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡは、配列番号１に記載の塩基配列からなることが特に好ましい。
　あるいは、本発明のβ－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡが転写・翻訳された時に生成される、β－グルカン合成活性を欠失したタンパク質は、配列番号２０に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号２０のアミノ酸配列の第２５３番目に対応するアミノ酸がシステイン以外のアミノ酸である、β－グルカン合成活性を欠失したタンパク質であることが更に好ましい。また、上記の第２５３番目に対応するアミノ酸は、チロシンであることが更に好ましい。さらに、本発明のβ－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡは、配列番号１８に記載の塩基配列からなることが特に好ましい。
　別の態様において、本発明は、配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の第６６０番目に対応するアミノ酸がグリシン以外のアミノ酸である、β－グルカン合成活性を欠失したタンパク質をコードする、β－グルカン欠失遺伝子ｃＤＮＡを提供する。
　別の態様において、本発明は、配列番号２０に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号２０のアミノ酸配列の第２５３番目に対応するアミノ酸がシステイン以外のアミノ酸である、β－グルカン合成活性を欠失したタンパク質をコードする、β－グルカン欠失遺伝子ｃＤＮＡを提供する。
　β－グルカンの欠失遺伝子ｃＤＮＡは、β－グルカン合成に関わっているため、生命科学分野で植物のβ－グルカン合成に関わる遺伝子の解明に利用できる。β－グルカン合成に関わる遺伝子が解明されれば、その結果を利用して、育種におけるβ－グルカン含量の遺伝的制御が可能になる。
　本発明のβ－グルカン欠失遺伝子ｃＤＮＡがコードするアミノ酸配列において、配列番号２のアミノ酸配列の第６６０番目に対応するアミノ酸は、アスパラギン酸であることが更に好ましい。また、本発明のβ－グルカン欠失遺伝子ｃＤＮＡは、配列番号３に記載の塩基配列からなることが特に好ましい。
　あるいは、本発明のβ－グルカン欠失遺伝子ｃＤＮＡがコードするアミノ酸配列において、配列番号２０のアミノ酸配列の第２５３番目に対応するアミノ酸は、チロシンであることが更に好ましい。また、本発明のβ－グルカン欠失遺伝子ｃＤＮＡは、配列番号１９に記載の塩基配列からなることが特に好ましい。
　別の態様において、本発明は、配列番号４に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、転写・翻訳された時にβ－グルカン合成活性を有するタンパク質が生成されるＤＮＡである、β－グルカン合成遺伝子ゲノムＤＮＡを提供する。このβ－グルカン合成遺伝子ゲノムＤＮＡは、配列番号４に記載の塩基配列からなることが特に好ましい。
　別の態様において、本発明は、配列番号１５に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、転写・翻訳された時にβ－グルカン合成活性を有するタンパク質が生成されるＤＮＡである、β－グルカン合成遺伝子ゲノムＤＮＡを提供する。このβ－グルカン合成遺伝子ゲノムＤＮＡは、配列番号１５に記載の塩基配列からなることが特に好ましい。
　β－グルカンの合成に関与する遺伝子は解明されていなかったが、本発明者らは、上記のＤＮＡがβ－グルカン合成に関与していることを明らかにした。植物中のβ－グルカン合成遺伝子ゲノムＤＮＡのコピー数を増やすなどの方法によって、β－グルカンの産生量が高い植物品種を開発することが可能である。β－グルカンは、血糖値上昇抑制や血中コレステロールの低減などの生理機能、免疫機能の増進などの効果を持つことが報告されているため、利用価値が高い。
　別の態様において、本発明は、配列番号６に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、β－グルカン合成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、β－グルカン合成遺伝子ｃＤＮＡを提供する。このβ－グルカン合成遺伝子ｃＤＮＡは、配列番号６に記載の塩基配列からなることが特に好ましい。
　β－グルカンの合成に関与する遺伝子は解明されていなかったが、本発明により、上記のｃＤＮＡがβ－グルカン合成に関与していることが明らかとなった。このｃＤＮＡを適切なプロモーターの下流に連結して細菌や酵母、植物などに導入することにより、β－グルカンを大量生産することが可能である。β－グルカンは、血糖値上昇抑制や血中コレステロールの低減などの生理機能、免疫機能の増進などの効果を持つことが報告されているため、利用価値が高い。
　別の態様において、本発明は、β－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡを有するオオムギの育種方法であって、オオムギの７Ｈ染色体の動原体付近に座乗する配列番号４に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡの第４２７５番目に対応する塩基が、Ｇ（グアニン）からＡ（アデニン）に変異していた場合に、上記オオムギはβ－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡを有すると判別して選択する選択ステップを含む、育種方法を提供する。
　別の態様において、本発明は、β－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡを有するオオムギの育種方法であって、オオムギの７Ｈ染色体の動原体付近に座乗する配列番号４に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡの第２３８５番目に対応する塩基が、ＧからＡに変異していた場合に、前記オオムギはβ－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡを有すると判別して選択する選択ステップを含む、育種方法を提供する。
　この育種方法により、β－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡを有するオオムギを育種することができる。従来のβ－グルカン有無の判別法は、穀粒を試料として、β－グルカンに特異的に吸着する蛍光色素や酵素処理により生ずる産物を検出する方法であった。したがって、その判別を行うためには種子を形成する段階にまで植物を生育させることが必要であった。これに対し、本発明を利用すれば、種子を形成する前の幼植物においても判定でき、かつ遺伝子型のホモ・ヘテロの判定も可能である。このため、育種に要する期間を格段に短縮することができる。
　上記の育種方法の１つの態様において、本発明は、オオムギから抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号４に記載の塩基配列の第４２７５番目に対応する塩基を含むＤＮＡ断片を増幅する増幅ステップと、増幅ステップで増幅されたＤＮＡ断片を、ＴａｑＩ、ＢａｎＩ及びＮｌａＩＶからなる群から選択される制限酵素で切断し、切断したＤＮＡ断片を検出する検出ステップと、検出ステップにおいて、ＤＮＡ断片が制限酵素ＴａｑＩで切断された場合、又は制限酵素ＢａｎＩ若しくはＮｌａＩＶで切断されなかった場合に、上記オオムギはβ－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡを有すると判別して選択する選択ステップとを含む、育種方法を提供する。
　この育種方法により、配列番号４に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡの第４２７５番目に対応する塩基が変異していた場合に迅速に判別することができる。制限酵素ＢａｎＩ又はＮｌａＩＶを用いる場合には、上記の第４２７５番目に対応する塩基が、ＧからＡ、Ｃ（シトシン）又はＴ（チミン）に変異していた場合に判別することができる。制限酵素ＴａｑＩを用いる場合には、上記の第４２７５番目に対応する塩基が、ＧからＡに変異していた場合に判別することができる。
　上記の育種方法の１つの態様において、本発明は、オオムギから抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号４に記載の塩基配列の第２３８５番目に対応する塩基を含むＤＮＡ断片を増幅する増幅ステップと、増幅ステップで増幅されたＤＮＡ断片を、制限酵素Ｆｎｕ４ＨＩで切断し、切断したＤＮＡ断片を検出する検出ステップと、検出ステップにおいて、ＤＮＡ断片が、配列番号４に記載の塩基配列の第２３８６番目に対応する塩基と第２３８７番目に対応する塩基の間で切断されなかった場合に、上記オオムギはβ－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡを有すると判別して選択する選択ステップとを含む、育種方法を提供する。
　この育種方法により、配列番号４に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡの第２３８５番目に対応する塩基が変異していた場合に迅速に判別することができる。すなわち、当該塩基がＧである場合には、上記の増幅されたＤＮＡ断片が、配列番号４に記載の塩基配列の第２３８６番目に対応する塩基と第２３８７番目に対応する塩基の間でＦｎｕ４ＨＩにより切断され、そのオオムギは野生型であることを示す。また、配列番号４に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡの第２３８５番目に対応する塩基がＧからＡ、Ｃ又はＴに変異していた場合には、上記の増幅されたＤＮＡ断片が、配列番号４に記載の塩基配列の第２３８６番目に対応する塩基と第２３８７番目に対応する塩基の間でＦｎｕ４ＨＩにより切断されず、そのオオムギがβ－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡを有することを示す。
　別の態様において、本発明は、上記の育種方法によって育種されたオオムギであって、次のＤＮＡ：
　（ａ）配列番号１に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡであって、転写・翻訳された時にβ－グルカン合成活性を欠失したタンパク質が生成されるＤＮＡである、β－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡ、
　（ｂ）上記（ａ）に記載のβ－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡにおいて、転写・翻訳された時に生成されるタンパク質が、配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の第６６０番目に対応するアミノ酸がグリシン以外のアミノ酸である、β－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡ、
　（ｃ）上記（ｂ）に記載のβ－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡにおいて、グリシン以外のアミノ酸がアスパラギン酸である、β－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡ、
　（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列からなる、β－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡ、
　（ｅ）配列番号１８に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡであって、転写・翻訳された時にβ－グルカン合成活性を欠失したタンパク質が生成されるＤＮＡである、β－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡ、
　（ｆ）上記（ｅ）に記載のβ－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡにおいて、転写・翻訳された時に生成されるタンパク質が、配列番号２０に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号２０のアミノ酸配列の第２５３番目に対応するアミノ酸がシステイン以外のアミノ酸である、β－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡ、
　（ｇ）上記（ｆ）に記載のβ－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡにおいて、システイン以外のアミノ酸がチロシンである、β－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡ、
　（ｈ）配列番号１８に記載の塩基配列からなる、β－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡ、
　のいずれかを有するオオムギを提供する。また、本発明のオオムギは、上記の（ａ）～（ｈ）のいずれかのβ－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡをホモで有している事が更に好ましい。
　上記の（ａ）～（ｈ）のいずれかのβ－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡをヘテロで有するオオムギは、野生型のオオムギに比べて穀粒中のβ－グルカンが減少しており、上記の（ａ）～（ｈ）のいずれかのβ－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡをホモで有しているオオムギは、穀粒のβ－グルカンを完全に欠失している。
　別の態様において、本発明は、配列番号４に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、転写・翻訳された時にβ－グルカン合成活性を有するタンパク質が生成されるＤＮＡであるβ－グルカン合成遺伝子ゲノムＤＮＡ、又は配列番号４に記載の塩基配列からなるβ－グルカン合成遺伝子ゲノムＤＮＡの発現を抑制するステップを含む、オオムギ穀粒のβ－グルカンを減少又は欠失させる方法及びこの方法によって得ることのできる、β－グルカンを減少又は欠失したオオムギを提供する。このオオムギは、穀粒のβ－グルカンを減少又は完全に欠失している。
　別の態様において、本発明は、配列番号１５に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、転写・翻訳された時にβ－グルカン合成活性を有するタンパク質が生成されるＤＮＡであるβ－グルカン合成遺伝子ゲノムＤＮＡ、又は配列番号１５に記載の塩基配列からなるβ－グルカン合成遺伝子ゲノムＤＮＡの発現を抑制するステップを含む、オオムギ穀粒のβ－グルカンを減少又は欠失させる方法及びこの方法によって得ることのできる、β－グルカンを減少又は欠失したオオムギを提供する。このオオムギは、穀粒のβ－グルカンを減少又は完全に欠失している。
　別の態様において、本発明は、上記の育種方法によって育種されたオオムギであって、上記の（ａ）～（ｈ）のいずれかのβ－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡを有しているオオムギ、又は上記のβ－グルカン合成遺伝子ゲノムＤＮＡの発現を抑制することによって得ることのできる、穀粒中のβ－グルカンを減少又は欠失したオオムギ由来の穀粒を発酵させるステップを含む、アルコールの製造方法を提供する。β－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡをヘテロで有しているオオムギは、野生型のオオムギに比べて穀粒中のβ－グルカンが減少しており、ホモで有しているオオムギは、穀粒中のβ－グルカンを完全に欠失している。β－グルカンが減少又は欠失したオオムギ穀粒を原料に用いることによって、ビールや焼酎の製造において、デンプンの糖化時間の短縮、麦汁の濾過時間の短縮、アルコール生成量の増加、発酵残渣の減少などの効果が得られる。
　別の態様において、本発明は、上記の育種方法によって育種されたオオムギであって、上記の（ａ）～（ｈ）のいずれかのβ－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡを有しているオオムギ、又は上記のβ－グルカン合成遺伝子ゲノムＤＮＡの発現を抑制することによって得ることのできる、穀粒中のβ－グルカンを減少又は欠失したオオムギ由来の穀粒を発酵させるステップを含む、発酵食品の製造方法を提供する。発酵食品はオオムギの穀粒を発酵させたものを含む食品であり、例えば味噌や醤油である。β－グルカンが減少又は欠失したオオムギ穀粒を原料に用いることによって、発酵の効率を上げることができるため、発酵に要する時間を短縮できるなどの効果が得られる。
　別の態様において、本発明は、上記の育種方法によって育種されたオオムギであって、上記の（ａ）～（ｈ）のいずれかのβ－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡを有しているオオムギ、又は上記のβ－グルカン合成遺伝子ゲノムＤＮＡの発現を抑制することによって得ることのできる、穀粒中のβ－グルカンを減少又は欠失したオオムギ由来の穀粒を含む、動物用飼料組成物を提供する。β－グルカンが減少又は完全に欠失したオオムギ穀粒を含む動物用飼料組成物は、消化吸収が良く飼養効果が高い。また、消化性が改善される結果、糞の量が減少するなどの効果が得られる。また、胚乳細胞壁が薄く穀粒が軟質であるため、飼料組成物の製造時に、より容易に穀粒を粉砕することができる。
　別の態様において、本発明は、次のＤＮＡ：
　（ａ）配列番号４に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、転写・翻訳された時にβ－グルカン合成活性を有するタンパク質が生成されるＤＮＡである、β－グルカン合成遺伝子ゲノムＤＮＡ、
　（ｂ）配列番号４に記載の塩基配列からなるβ－グルカン合成遺伝子ゲノムＤＮＡ、
　（ｃ）配列番号６に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、β－グルカン合成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、β－グルカン合成遺伝子ｃＤＮＡ
　（ｄ）配列番号６に記載の塩基配列からなるβ－グルカン合成遺伝子ｃＤＮＡ、
　（ｅ）配列番号１５に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、転写・翻訳された時にβ－グルカン合成活性を有するタンパク質が生成されるＤＮＡである、β－グルカン合成遺伝子ゲノムＤＮＡ、
　（ｆ）配列番号１５に記載の塩基配列からなるβ－グルカン合成遺伝子ゲノムＤＮＡ、
　のいずれかを含むベクターを発現可能に保持する形質転換体を提供する。形質転換体は、オオムギであってもよいし、本来はβ－グルカンを含まないか、微量にしか含まない植物であってもよい。あるいは、形質転換体は、大腸菌などの原核生物や、酵母などの真核生物に例示される微生物であってもよい。
　このような形質転換植物体は、β－グルカンをより大量に含むため、付加価値が高い。あるいは、このような形質転換微生物を利用して、β－グルカンを大量に工業生産することも可能である。
　形質転換体は、β－グルカン合成遺伝子ゲノムＤＮＡ又はβ－グルカン合成遺伝子ｃＤＮＡを過剰発現することがより好ましい。過剰発現とは、形質転換前の宿主と比較して、ｍＲＮＡレベル又はタンパクレベルで、より大量のβ－グルカン合成遺伝子を発現することを意味する。
　本発明により、オオムギのβ－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡが提供される。また、オオムギのβ－グルカン合成遺伝子ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡが提供される。さらに、β－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡを有するオオムギ及びその育種方法、β－グルカン合成遺伝子の発現を抑制することによってオオムギ穀粒のβ－グルカンを減少又は欠失させる方法及びこの方法によって得ることのできる、穀粒中のβ－グルカンを減少又は欠失したオオムギ、これらのβ－グルカンを減少又は欠失したオオムギ穀粒を発酵させるステップを含むアルコール又は発酵食品の製造方法、並びにこのオオムギ穀粒を含む動物用飼料組成物が提供される。
　β－グルカン合成に関与する遺伝子の改変は、生命科学分野で植物のβ－グルカン合成に関わる遺伝子の解明、並びに農業分野でβ－グルカンを含まないオオムギの品種育成において有用である。β－グルカン欠失遺伝子とβ－グルカン欠失性機構の解明は、β－グルカン合成に関わる遺伝子の特定に寄与するものである。また、β－グルカンを欠失するオオムギは、β－グルカンとともに機能性多糖として重要なアラビノキシランをやや多く含むため、アラビノキシランに特化した機能性食品の開発において重要な資源である。従来のβ－グルカン有無の判別法は、穀粒を試料として、β－グルカンに特異的に吸着する蛍光色素や酵素処理により生ずる産物を検出する方法であった。したがって、その判別を行うためには種子を形成する段階にまで植物を生育させることが必要であった。これに対し、本発明を利用すれば、種子を形成する前の幼植物においても判定でき、かつ遺伝子型のホモ・ヘテロの判定も可能である。本発明によるβ－グルカン欠失遺伝子を利用すると、糊粉層及び胚乳の細胞壁においてβ－グルカンが完全に欠失し、胚乳細胞壁が顕著に薄いオオムギを作出することが可能である。
β－グルカン欠失遺伝子の染色体上の座乗位置を示す図である。 β－グルカン欠失オオムギ品種及び野生型品種における、ＨｖＣｓｌＦ６遺伝子の塩基配列と推定アミノ酸配列を示す図である。 ＣＡＰＳマーカーによるＨｖＣｓｌＦ６遺伝子型の判別例を示す写真である。 ニシノホシ（ｂｇｌ）準同質遺伝子系統及びニシノホシの穀粒断片の光学顕微鏡による観察結果を示す写真である。 ニシノホシ（ｂｇｌ）準同質遺伝子系統及びニシノホシの穀粒断片の光学顕微鏡及び走査型電子顕微鏡による観察結果を示す写真である。 ＴＲ２５１及びＣＤＣ－ＢｏｌｄのＨｖＣｓｌＦ６遺伝子のプロモーター配列を示す図である。 ＴＲ２５１及びＣＤＣ－ＢｏｌｄのＨｖＣｓｌＦ６遺伝子のプロモーター配列を示す図である。 サチホゴールデン（ＴＮ５）及びＫＭ２７のＨｖＣｓｌＦ６遺伝子の塩基配列を示す図である。　ＴＮ５－ＤＮＡ：サチホゴールデンのＨｖＣｓｌＦ６遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列（配列番号１５）の一部を示す。ＴＮ５－ｃＤＮＡ：サチホゴールデンのＨｖＣｓｌＦ６遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列（配列番号１６）の一部を示す。ＴＮ５－ａ．ａ．：サチホゴールデンのＨｖＣｓｌＦ６のアミノ酸配列（配列番号１７）の一部を示す。　ＫＭ２７－ＤＮＡ：ＫＭ２７のＨｖＣｓｌＦ６遺伝子（ｂｇｌ遺伝子）のゲノムＤＮＡの塩基配列（配列番号１８）の一部を示す。ＫＭ２７－ｃＤＮＡ：ＫＭ２７のｂｇｌ遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列（配列番号１９）の一部を示す。ＫＭ２７－ａ．ａ．：ＫＭ２７のｂｇｌ遺伝子がコードするアミノ酸配列（配列番号２０）の一部を示す。 ＨｖＣｓｌＦ６の予測される立体構造を示す図である。（ｉ）：ＫＭ２７において、システインがチロシンに変異した部位を示す。（ｉｉ）：ＯＵＭ１２５において、グリシンがアスパラギン酸に変異した部位を示す。 ＣＡＰＳマーカーによるＨｖＣｓｌＦ６遺伝子型の判別例を示す写真である。
　本明細書において、「９０％以上の相同性を有する塩基配列」とは、２つの塩基配列を、可能な限り多数の塩基が相互に一致するように並列させて比較した場合に、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、更に好ましくは９９％以上の塩基が同一である塩基配列を意味する。ここで、塩基配列を並列させる際には、最大の相同性を与えるようにギャップを含んでもよい。
　本明細書において、「１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、基準となるアミノ酸配列と比較して、１～１０個、より好ましくは１～５個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味する。
　本明細書において、「ゲノムＤＮＡ」とは、イントロンを含むＤＮＡを意味し、「ｃＤＮＡ」は、イントロンを含まないＤＮＡを意味する。例えば、配列番号１に記載の塩基配列は、β－グルカン欠失遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列を示しており、この塩基配列において、第３２８～１９５４番目及び第２６９９～３３６７番目はイントロンである。イントロンは、宿主中でゲノムＤＮＡがｍＲＮＡに転写され、タンパクに翻訳される過程で、スプライシングにより除去される。ここにおいて、宿主は植物であることが好ましく、オオムギであることが更に好ましい。例えば、配列番号３は、配列番号１に記載の塩基配列からイントロン部分を除去した、β－グルカン欠失遺伝子ｃＤＮＡの塩基配列を示す。本明細書において、「β－グルカン欠失遺伝子」とは、ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡの両者を意味する場合がある。
　本明細書において、「β－グルカン合成活性」とは、β－グルカンの合成経路に関与して、β－グルカンの合成を促進する活性を意味する。また、「β－グルカン合成遺伝子」とは、β－グルカンの合成経路に関与して、β－グルカンの合成を促進する機能を有するタンパクをコードする遺伝子を意味する。
　１つの態様において、本発明は、β－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡを有するオオムギの育種方法であって、オオムギの７Ｈ染色体の動原体付近に座乗する配列番号４に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡの第４２７５番目に対応する塩基が、ＧからＡに変異していた場合に、前記オオムギはβ－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡを有すると判別して選択する選択ステップを含む、育種方法を提供する。この育種方法における選択ステップにおいて、ゲノムＤＮＡの変異を検出する方法は特に制限されない。例えば、検出したいゲノムＤＮＡ上の領域をＰＣＲ増幅し、ＰＣＲ断片のダイレクトシークエンスにより、又はＰＣＲ断片をシークエンス用ベクターに挿入後、シークエンスすることにより、塩基配列決定を行い、目的の変異を持つか否かを判別しても良い。しかしながら、判別操作がより簡便であることから、制限酵素で切断されるか否かを指標として目的の変異の存在を検出することが好ましい。
　具体的には、オオムギから抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、例えば、配列番号４に記載の塩基配列の第３８９３～４３６１番目に対応する塩基配列からなるＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅し、増幅された４６９ｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｎＩで切断し、切断したＤＮＡ断片をアガロース電気泳動などにより検出し、ＤＮＡ断片が制限酵素ＢａｎＩで切断されなかった場合に、前記オオムギはβ－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡを有すると判別することができる。この方法の場合、配列番号４に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡの第４２７５番目に対応する塩基がＡに変異していた場合に迅速に判別することができる。さらに、上記の４２７５番目に対応する塩基がＣ又はＴに変異していた場合においても同様に判別することができる。
　制限酵素としては、ＢａｎＩと同様に、ＴａｑＩや、ＮｌａＩＶなども利用可能である。ＴａｑＩの認識配列は５’－ＴＣＧＡ－３’であり、ＴａｑＩ消化によって５’－Ｔ／ＣＧＡ－３’の形に切断される。このため、配列番号４に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡの第４２７５番目に対応する塩基が、ＧからＡに変異していた場合に切断される。ＮｌａＩＶの認識配列は５’－ＧＧＮＮＣＣ－３’であり、ＮｌａＩＶ消化によって５’－ＧＧＮ／ＮＣＣ－３’の形に切断される。ここで、ＮはＡ、Ｔ、Ｇ又はＣを意味する。このため、配列番号４に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡの第４２７５番目に対応する塩基が、ＧからＡ、Ｃ又はＴに変異していた場合に切断される。
　配列番号４に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡの第４２７５番目に対応する塩基の周辺には、ＢａｎＩ、ＴａｑＩ又はＮｌａＩＶなどの制限酵素によって切断される認識配列が複数存在する。当業者は、これらの制限酵素による切断によって上記の第４２７５番目に対応する塩基の変異を判別する場合に、配列番号４に記載の塩基配列のうちの、どの領域を増幅してＤＮＡ断片を調製すれば判別可能であるかを容易に選択することができる。また、これらの制限酵素以外の使用可能な制限酵素は、当業者にとって明らかである。
　オオムギからのゲノムＤＮＡの抽出方法は特に制限されないが、例えば０．１ｇ程度の若い葉を採取し、液体窒素を加えてすり鉢上で磨砕し、ＤＮｅａｓｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて取扱説明書にしたがって抽出することができる。
　本実施形態の育種方法は例えば次のようにして実施することができる。まず、野生型のオオムギを、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）などの変異誘発剤で処理して変異体を得る。続いて、得られた各変異体からゲノムＤＮＡを抽出し、上記の方法によって、配列番号４に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡの第４２７５番目に対応する塩基の変異を検出し、β－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡを有するオオムギ個体を判別し、選択する。このようにして、β－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡを有するオオムギを育種することができる。あるいは、野生型のオオムギ品種と、すでにβ－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡを有することが明らかとなっているオオムギ品種を交配し、その子孫の中から上記と同様の方法によってβ－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡを有するオオムギを判別し、選択することで、β－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡを有するオオムギを育種することができる。または、野生型のオオムギにおける、配列番号４に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡの第４２７５番目に対応する塩基を、相同組換えによる遺伝子ターゲティング法などの分子生物学的手法によって、人工的にＧからＡ、Ｃ又はＴに変異させることにより、β－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡを有するオオムギを育種することができる。上記の人工的に導入する変異は、ＧからＡへの変異であることがより好ましい。
　別の態様において、本発明は、β－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡを有するオオムギの育種方法であって、オオムギの７Ｈ染色体の動原体付近に座乗する配列番号４に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡの第２３８５番目に対応する塩基が、ＧからＡに変異していた場合に、前記オオムギはβ－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡを有すると判別して選択する選択ステップを含む、育種方法を提供する。この育種方法における選択ステップにおいて、ゲノムＤＮＡの変異を検出する方法は特に制限されない。例えば、検出したいゲノムＤＮＡ上の領域をＰＣＲ増幅し、ＰＣＲ断片のダイレクトシークエンスにより、又はＰＣＲ断片をシークエンス用ベクターに挿入後、シークエンスすることにより、塩基配列決定を行い、目的の変異を持つか否かを判別しても良い。しかしながら、判別操作がより簡便であることから、制限酵素で切断されるか否かを指標として目的の変異の存在を検出することが好ましい。
　具体的には、オオムギから抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、例えば、配列番号４に記載の塩基配列の第２２１９～２５２９番目に対応する塩基配列からなるＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅し、増幅された３１１ｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素Ｆｎｕ４ＨＩで切断し、切断したＤＮＡ断片をアガロース電気泳動などにより検出する。野生型の品種では、制限酵素Ｆｎｕ４ＨＩによる消化により、この増幅断片が、３、４１、５０、５６、６２及び９９ｂｐの６個の断片に切断される。これに対し、配列番号４に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡの第２３８５番目に対応する塩基が、ＧからＡに変異していた場合、あるいはＧからＣ又はＴに変異していた場合には、１塩基置換によりＦｎｕ４ＨＩ認識部位が１箇所なくなるため、Ｆｎｕ４ＨＩで消化した場合に、上記の増幅断片が、３、４１、５０、５６及び１６１ｂｐの５個の断片に切断される。Ｆｎｕ４ＨＩ消化により生じるこれらの断片の差は、図１０に示すように電気泳動等により容易に識別可能である。この方法により、配列番号４に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡの第２３８５番目に対応する塩基における変異の有無を迅速に判別することができる。
　なお、Ｆｎｕ４ＨＩの認識配列は５’－ＧＣＮＧＣ－３’であり、Ｆｎｕ４ＨＩ消化によって、５’－ＧＣ／ＮＧＣ－３’の形に切断される。ここで、ＮはＡ、Ｔ、Ｇ又はＣを意味する。Ｆｎｕ４ＨＩと同一の塩基配列を認識し、Ｆｎｕ４ＨＩと同じ形に切断する制限酵素として、ＢｉｓＩ、ＢｓｏＦＩ、Ｆｓｐ４ＨＩ、ＩｔａＩ、ＳａｔＩなどが知られている。これらの制限酵素もＦｎｕ４ＨＩと同様に使用可能である。
　配列番号４に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡの第２３８５番目に対応する塩基の周辺には、Ｆｎｕ４ＨＩによって切断される認識配列が複数存在する。当業者は、Ｆｎｕ４ＨＩによる切断によって上記の第２３８５番目に対応する塩基の変異を判別する場合に、配列番号４に記載の塩基配列のうちの、どの領域を増幅してＤＮＡ断片を調製すれば判別可能であるかを容易に選択することができる。また、Ｆｎｕ４ＨＩ以外の使用可能な制限酵素は、当業者にとって明らかである。
　本実施形態の育種方法は例えば次のようにして実施することができる。まず、野生型のオオムギを、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）などの変異誘発剤で処理して変異体を得る。続いて、得られた各変異体からゲノムＤＮＡを抽出し、上記の方法によって、配列番号４に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡの第２３８５番目に対応する塩基の変異を検出し、β－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡを有するオオムギ個体を判別し、選択する。このようにして、β－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡを有するオオムギを育種することができる。あるいは、野生型のオオムギ品種と、すでにβ－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡを有することが明らかとなっているオオムギ品種を交配し、その子孫の中から上記と同様の方法によってβ－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡを有するオオムギを判別し、選択することで、β－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡを有するオオムギを育種することができる。または、野生型のオオムギにおける、配列番号４に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡの第２３８５番目に対応する塩基を、相同組換えによる遺伝子ターゲティング法などの分子生物学的手法によって、人工的にＧからＡ、Ｃ又はＴに変異させることにより、β－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡを有するオオムギを育種することができる。上記の人工的に導入する変異は、ＧからＡへの変異であることがより好ましい。
　１つの態様において、本発明は、オオムギのβ－グルカン合成遺伝子ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡを提供する。本発明のβ－グルカン合成遺伝子ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡをオオムギなどの植物のゲノム中に導入し、コピー数を増やすなどの方法によって、β－グルカンの産生量が高い植物品種を開発することが可能である。あるいは、本発明のβ－グルカン合成遺伝子ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを、大腸菌などの原核生物や、酵母などの真核生物などの微生物に導入して、β－グルカンを工業的に大量生産することも可能である。β－グルカンは、血糖値上昇抑制や血中コレステロールの低減などの生理機能、免疫機能の増進などの効果を持つことが報告されているため、利用価値が高い。
　β－グルカン合成遺伝子を植物体に導入する場合には、まず、β－グルカン合成遺伝子の発現ベクターを構築する。発現ベクターは、植物体内で発現可能なプロモーター、β－グルカン合成遺伝子、翻訳終結配列を含む。β－グルカン合成遺伝子はゲノムＤＮＡであってもｃＤＮＡであってもよい。ここで、宿主となる植物体は、特に制限されないが、オオムギであることが好ましい。発現ベクターはまた、必要に応じて、大腸菌における複製起点、大腸菌における選択マーカー（アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子など）、植物体における選択マーカー（カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ビアラホス（ｂａｒ）耐性遺伝子など）、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列などを更に含んでもよい。
　植物体内で発現可能なプロモーターとしては、種子特異的な発現を誘導するものであってもよく、組織に関係なく構成的に発現するものであってもよい。例えばユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、Ｅｍプロモーター、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターなどが例示できる。
　オオムギへの遺伝子導入は、一般的なパーティクルボンバードメント法やアグロバクテリウム法を用いて行うことができる。例えば、金粒子にまぶしたβ－グルカン合成遺伝子の発現ベクターＤＮＡを、パーティクルボンバードメント法を用いて、オオムギ未熟種子から取り出した未熟胚に打ち込むことにより遺伝子導入する。続いて、遺伝子導入した未熟胚を、植物ホルモンであるオーキシンなどを含む培地で培養後、オーキシンの濃度を下げることにより、個体を再分化させて形質転換植物体を得ることができる。例えば、ビアホラス耐性遺伝子を含むβ－グルカン合成遺伝子の発現ベクターをオオムギに導入した場合、導入遺伝子を取り込んだ形質転換植物体は、ビアホラス耐性となるので、ビアホラスを添加した培地を用いることにより選抜することができる。あるいは、オオムギ由来のカルスをβ－グルカン合成遺伝子の発現ベクターを導入したアグロバクテリウムの溶液に浸してアグロバクテリウムに感染させることにより、β－グルカン合成遺伝子をオオムギに導入することができる。例えば、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含むβ－グルカン合成遺伝子の発現ベクターをオオムギに導入した場合、遺伝子を取り込んだ形質転換体は、ハイグロマイシン及びアグロバクテリウムを除菌するためのカルベニシリンなどの除菌剤を添加した培地で選抜することができる。その後、オーキシンを除いた再分化培地で培養して再分化させ、続いて、発根培地へと移し変えることにより、β－グルカン合成遺伝子を発現可能に保持する形質転換植物体を得ることができる。
　大腸菌などの原核生物や、酵母などの真核生物に例示される微生物も、β－グルカン合成遺伝子の発現ベクターを導入する宿主に用いることができる。大腸菌としては、例えばＫ１２株などが好ましく用いられ、ベクターとしては、一般にｐＢＲ３２２やｐＵＣ系のプラスミドが用いられるが、これらに限定されない。大腸菌用のプロモーターとしては、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ラクトース（ｌａｃ）プロモーターなどが使用可能である。酵母としては、例えばサッカロミセス属酵母、例えばパン酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅや石油酵母Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓを利用できる。酵母用のプロモーターとしては、例えば、アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーターや酸性フォスファターゼ遺伝子のプロモーターなどが使用可能である。
　１つの態様において、本発明は、配列番号４に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、転写・翻訳された時にβ－グルカン合成活性を有するタンパク質が生成されるＤＮＡであるβ－グルカン合成遺伝子ゲノムＤＮＡ、又は配列番号４に記載の塩基配列からなるβ－グルカン合成遺伝子ゲノムＤＮＡの発現を抑制するステップを含む、オオムギ穀粒のβ－グルカンを減少又は欠失させる方法を提供する。
　１つの態様において、本発明は、配列番号１５に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、転写・翻訳された時にβ－グルカン合成活性を有するタンパク質が生成されるＤＮＡであるβ－グルカン合成遺伝子ゲノムＤＮＡ、又は配列番号１５に記載の塩基配列からなるβ－グルカン合成遺伝子ゲノムＤＮＡの発現を抑制するステップを含む、オオムギ穀粒のβ－グルカンを減少又は欠失させる方法を提供する。
　ＤＮＡの発現を抑制する方法としては、ｓｉＲＮＡやアンチセンス核酸を細胞内に導入する公知の方法を用いることができる。具体的には、例えば、β－グルカン合成遺伝子ゲノムＤＮＡを標的としたｓｉＲＮＡを発現するベクターや、β－グルカン合成遺伝子ゲノムＤＮＡを標的としたアンチセンスＲＮＡを発現するベクターを、上記と同様にパーティクルボンバードメント法やアグロバクテリウム法を用いてオオムギに導入するとよい。この方法によれば、β－グルカン合成遺伝子ゲノムＤＮＡの発現を抑制することにより、穀粒中のβ－グルカンを減少又は完全に欠失したオオムギを得ることができる。
　以下、本発明の実施例を示して、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲での種々の変更が可能である。
（オオムギ品種ニシノホシの準同質遺伝子系統の作出）
　発明者らは、オオムギ品種（系統）ＯＵＭ１２５がβ－グルカンを欠失していることを見出し、これに基づいてβ－グルカンを欠失する遺伝子を同定し、本発明を完成させるに至った。ＯＵＭ１２５は、岡山大学において、裸性の六条オオムギ品種である赤神力を、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）処理することにより作出された、半矮性突然変異体である。本実施例で使用したＯＵＭ１２５の種子は、岡山大学資源生物科学研究所　大麦・野生植物資源研究センターの佐藤和広博士により提供された。
　ニシノホシは、優良形質を持つ二条オオムギ品種である。泉系Ａ４１は、西海皮５５号とＯＵＭ１２５の子孫と、西海皮５４号（ニシノホシの開発名）との交配によって、１９９７年に九州農業試験場において作出された系統であり、β－グルカン欠失性及び裸性の表現型を持つ。発明者らは、泉系Ａ４１を１回親に、ニシノホシを反復親に用いて交配を行い、β－グルカン欠失性及び皮性であるニシノホシの準同質遺伝子系統を作出した。
（β－グルカン欠失性の解析）
　個々の穀粒を横方向に切断し、胚から遠い部分をペンチを用いて破砕した。β－グルカン欠失性は、破砕した穀粒をリケナーゼ及びβ－グルコシダーゼで処理し、グルコースアッセイキット（グルコースＣ－ＩＩテスト、和光純薬工業株式会社）でグルコースを発色させることにより判定した。β－グルカン欠失性の穀粒においては、反応液が無色又は薄いピンク色となるのに対し、野性型の穀粒においては、反応液が深赤色となった。
（β－グルカン欠失性と皮裸性の連鎖解析）
　ニシノホシとその準同質遺伝子系統の交配によって得られた２２８個体において、β－グルカン欠失性及び皮裸性についての連鎖解析を行った。連鎖解析の結果を表１に示す。β－グルカン欠失型及び野生型の分離比は１：３であった。したがって、β－グルカン欠失性は単因子劣勢の遺伝子によるものであると考えられた。この遺伝子をβ－グルカン欠失遺伝子（（１－３，１－４）－β－Ｄ－グルカンレス、ｂｇｌ）と命名した。β－グルカン欠失遺伝子と皮裸性遺伝子（ｎｕｄ）との間には、有意な連鎖が検出された。これらの遺伝子間の組換え価は、Ａｌｌａｒｄ（Ｈｉｌｇａｒｄｉａ　２４：２３５－２７８、１９５６年）の最尤法により、１４．４％±２．５％と計算された。ｎｕｄ遺伝子は７Ｈ染色体の長腕に存在することが知られているため、β－グルカン欠失遺伝子も７Ｈ染色体上に座乗していると考えられた。
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（マッピング）
　ニシノホシ、その準同質遺伝子系統及びこれらの交配によって得られた２２８個体それぞれからＣＴＡＢ法によりゲノムＤＮＡを抽出した。Ｒａｍｓａｙら（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１５６：１９９７－２００５、２０００年）に報告されたＳＳＲマーカーを用いて、これらのゲノムＤＮＡを解析し、β－グルカン欠失遺伝子ををマッピングした。両親の間で多型を示した７Ｈ染色体のＳＳＲマーカーを選択し、ＰＣＲ解析した。各マーカーの染色体上の位置は、コムギのオオムギ染色体添加系統（Ｉｓｌａｍ、Ｓａｋａｍｏｔｏ，Ｓ．編　Ｐｒｏｃ．　６ｔｈ　Ｉｎｔ．　Ｗｈｅａｔ　Ｇｅｎｅｔ．　Ｓｙｍｐ．　Ｍａｒｕｚｅｎ　Ｋｙｏｔｏ．　ｐｐ．２３３－２３８、１９８３年）を用いた解析によって決定した。組換え価はＭＡＰＭＡＫＥＲ　ｖｅｒｓｉｏｎ　２．０（Ｌａｎｄｅｒら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　１：１７４－１８１、１９８７年）を用いて計算した。遺伝的距離はＫｏｓａｍｂｉ関数（Ｋｏｓａｍｂｉ、Ａｎｎ．　Ｅｕｇｅｎ．　１２：１７２－１７５、１９４４）を用いて計算した。
　図１にマッピングの結果を示す。β－グルカン欠失遺伝子は、Ｂｍａｃ０１６２から３．４ｃＭの位置にマッピングされ、Ｂｍａｇ０３２１、Ｂｍａｇ０３５９、Ｂｍａｃ０１６７及びＨｖＣｓｌＦ６遺伝子と共局在していることが明らかとなった。ＨｖＣｓｌＦ６遺伝子は、セルロース合成酵素様遺伝子のサブファミリーの一つである。β－グルカン欠失遺伝子は７Ｈ染色体動原体付近に座乗することが明らかとなった。
　さらに、ＨｖＣｓｌＦ６遺伝子上に、制限酵素ＢａｎＩによって検出することができる１塩基多型（ＳＮＰ）が存在し、β－グルカン欠失性の表現型とＨｖＣｓｌＦ６遺伝子座の遺伝子型が完全に一致することが明らかとなった。すなわち、図２に示すように、ＨｖＣｓｌＦ６遺伝子の塩基配列の４２７５番目の塩基がＧからＡに置換したものがβ－グルカン欠失遺伝子であり、β－グルカン欠失遺伝子をホモで保有すると、穀粒のβ－グルカンが完全に欠失する。図２に示すように、推定されるアミノ酸は、野生型の品種ではグリシンであるのに対し、β－グルカン欠失遺伝子を有する品種ではアスパラギン酸となる。
（ＣＡＰＳ解析）
　β－グルカン欠失遺伝子の有無は、共優性のＣＡＰＳ（ｃｌｅａｖｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ）マーカーによって明瞭に判別可能である。ここで、共優性マーカーとは、ヘテロ型のパターンが両親のいずれのホモ型とも区別可能なマーカーを意味する。β－グルカン欠失遺伝子のＣＡＰＳ解析を行うために、以下のプライマー（ＣＡＰＳマーカー）５’－ＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＴＡＣＧＡＧＡＡＧＣ－３’（Ｆｏｒｗａｒｄ、配列番号１１）及び５’－ＴＧＴＴＣＴＴＧＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＣＧ－３’（Ｒｅｖｅｒｓｅ、配列番号１２）を作成した。
　これらのプライマーを用いてオオムギのゲノムＤＮＡをＰＣＲすることにより、４６９ｂｐの増幅断片が得られる。野生型の品種では、制限酵素ＢａｎＩによる消化により、この増幅断片が３８２ｂｐと８７ｂｐに切断される。これに対し、β－グルカン欠失遺伝子を有する品種では、１塩基置換によりＢａｎＩ認識部位が存在しないため、制限酵素ＢａｎＩで消化しても切断されない。なお、ＢａｎＩの認識配列は５’－ＧＧＹＲＣＣ－３’であり、ＢａｎＩ消化によって、５’－Ｇ／ＧＹＲＣＣ－３’の形に切断される。ここで、ＹはＣ又はＴを意味し、ＲはＡ又はＧを意味する。
　図３に、ＣＡＰＳ解析によってβ－グルカン欠失遺伝子の有無を判別した結果を示す。ゲノムＤＮＡを上記のプライマーでＰＣＲ増幅後、増幅断片を制限酵素ＢａｎＩで切断し、アガロースゲル電気泳動した。レーンＡ～Ｆは、それぞれＯＵＭ１２５（β－グルカン欠失性）、赤神力（野生型）、ＯＵＭ１２５と赤神力のＦ１（ヘテロ型）、ニシノホシの準同質遺伝子系統（β－グルカン欠失性及び裸性）、ニシノホシ（野生型）、ニシノホシの準同質遺伝子系統（β－グルカン欠失性及び裸性）とニシノホシのＦ１（ヘテロ型）のゲノムＤＮＡを解析した結果である。
（デンプン、β－グルカン及びアラビノキシラン含有量の測定）
　ニシノホシ（ｂｇｌ）及びニシノホシを育てて収穫した。ここで、ニシノホシ（ｂｇｌ）とは、β－グルカン欠失性及び皮性である、ニシノホシの準同質遺伝子系統を意味する。収穫後、粉砕し、０．５ｍｍのふるいを透過させた、成熟全粒サンプル中のβ－グルカン及びアラビノキシラン含有量を測定した。β－グルカン含有量は、Ｍｉｘｅｄ　ｌｉｎｋａｇｅ　β－グルカン　アッセイキット（Ｍｅｇａｚｙｍｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、アイルランド）を用いて酵素学的な方法（ＭｃＣｌｅａｒｙ及びＣｏｄｄ、１９９１年）により測定した。アラビノキシラン含有量は、Ｓｅｋｉｗａら（２００３年）の方法にしたがって、サンプルを硫酸で加水分解した後に、アラビノース及びキシロース含有量を別々に測定することにより決定した。アラビノース含有量は「Ａｒａｂｉｎａｎ　ａｓｓａｙ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｒｅｌａｎｄ　２００２）」に記載された酵素学的な方法によって測定した。キシロース含有量は、Ｄ－キシロース　アッセイキット（Ｍｅｇａｚｙｍｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、アイルランド）を用いて測定した。β－グルカン及びアラビノキシラン含有量の測定前に、８０％エタノール処理によって、粉砕したサンプル中の遊離低分子糖を除去した。結果を表２に示す。
　ニシノホシ（ｂｇｌ）の穀粒中にはβ－グルカンが検出されなかったのに対し、ニシノホシの穀粒中には３．２質量％のβ－グルカンが含まれていた。アラビノキシラン含有量はニシノホシの穀粒中で６．３質量％であったのに対し、ニシノホシ（ｂｇｌ）の穀粒中では７．２質量％であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（光学顕微鏡観察）
　ニシノホシ（ｂｇｌ）及びニシノホシの穀粒をスライスし、グルタルアルデヒド中で固定し、一連のエタノール処理によって脱水し、低温重合樹脂Ｔｅｃｈｎｏｖｉｔ７１００（Ｈｅｒａｅｕｓ　Ｋｕｌｚｅｒ、ドイツ）中に包埋した。７μｍ厚の切片を０．５％のＦａｓｔ　Ｇｒｅｅｎ　ＦＣＦ（シグマアルドリッチ社、米国）及び０．０１％Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒ（和光純薬工業株式会社）で２重染色した。切片を、ＵＶフィルターを装着した光学顕微鏡（Ａｘｉｏｐｈｏｔ、カールツァイス、ドイツ）により、倍率２００倍で観察した。Ｆａｓｔ　Ｇｒｅｅｎ　ＦＣＦによって細胞壁、細胞質及び核が染色され、Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒによってβ－グルカンが染色される。図４に結果を示す。観察倍率は２００倍であった。図４において、Ａは、明視野観察画像を示し、Ｂは、紫外光照射画像を示す。図４中、ａは穀皮、ｂは種皮及び果皮、ｃは糊粉層、ｄは胚乳を指す。ニシノホシのサンプルにおいては、糊粉及び胚乳細胞壁に蛍光が観察されたのに対し、ニシノホシ（ｂｇｌ）においてはこれらの蛍光は観察されなかった。この結果は、β－グルカン欠失遺伝子を有する系統が、糊粉層と胚乳の両方において、β－グルカンを完全に欠失していることを示す。
（電子顕微鏡観察）
　ニシノホシ（ｂｇｌ）及びニシノホシの穀粒の水平方向の切片を、走査型電子顕微鏡（Ｎ－３４００、日立）により、観察倍率５０００倍で観察した。結果を図５に示す。図５において、Ａは光学顕微鏡による明視野観察画像（観察倍率２００倍）を示し、Ｂは電子顕微鏡観察画像（観察倍率５０００倍）を示す。ニシノホシの胚乳細胞壁が厚いのに対し、ニシノホシ（ｂｇｌ）は顕著に薄い胚乳細胞壁を有していることが明らかとなった。糊粉細胞の細胞壁の厚さには、両者に違いは見られなかった。
（幼苗の葉のβ－グルカン含有量の測定）
　ニシノホシ（ｂｇｌ）及びニシノホシの茎が伸長する前のロゼット状態の幼植物を圃場より採取し、凍結乾燥した。続いて葉身及び葉鞘のβ－グルカン含有量を、Ｍｉｘｅｄ　ｌｉｎｋａｇｅ　β－グルカン　アッセイキット（Ｍｅｇａｚｙｍｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、アイルランド）を用いて測定した。β－グルカン含有量の測定前に、８０％熱エタノール処理によって、遊離低分子糖を除去した。結果を表３に示す。
　ニシノホシ（ｂｇｌ）の葉にはβ－グルカンがほとんど検出されなかったのに対し、ニシノホシの葉には１３．５ｍｇ／ｇのβ－グルカンが含まれていた。以上の結果は、ニシノホシ（ｂｇｌ）が、穀粒だけでなく栄養器官においてもβ－グルカンを欠失していることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（穀粒硬度の測定）
　ニシノホシ（ｂｇｌ）及びニシノホシの穀粒の穀粒硬度を測定した。穀粒硬度は単粒硬度計（ＳＫＣＳ－４１００、Ｐｅｒｔｅｎ　Ｉｎｃ．、スウェーデン）を用いて、それぞれ３００粒の穀粒について測定した。搗精時間は、試験用搗精機（ＴＭ－０５、サタケ、東広島市）を用いて、穀粒（原麦）１８０ｇを５５％歩留まで搗精するのに要する時間とし、砕粒率は搗精麦１０ｇ中の砕粒及び欠損粒の質量比で求めた。結果を表４に示す。
　ニシノホシ（ｂｇｌ）の穀粒はニシノホシの穀粒と比較して顕著に柔らかくかつ脆くなっていることが示された。この結果は、β－グルカン欠失により胚乳細胞壁が薄くなったことに由来すると考えられる。穀粒が柔らかく脆いという特性は、動物用飼料の製造において破砕しやすく、グリッツに加工しやすいという有用性を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（ＨｖＣｓｌＦ６遺伝子のプロモーター領域における多型）
　オオムギ系統ＴＲ２５１及びＣＤＣ－Ｂｏｌｄは、β－グルカンの産生量に差があることが知られている（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｅｒｅａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　４８：６４７－６５５、２００８）。ＴＲ２５１はβ－グルカン高産生系統であり、ＣＤＣ－Ｂｏｌｄはβ－グルカン低産生系統である。発明者らは、これらの系統間のβ－グルカンの産生量の差は、ＨｖＣｓｌＦ６遺伝子の塩基配列の変異によるのではないかと考え、これらのオオムギ系統のＨｖＣｓｌＦ６遺伝子領域のゲノムの塩基配列を決定した。ＴＲ２５１は、Ｄｒ．Ｗ．Ｇ．Ｌｅｇｇｅ（Ｂｒａｎｄｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｒｅ、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ａｇｒｉ－Ｆｏｏｄ　Ｃａｎａｄａ、Ｃａｎａｄａ）より分与された。ＣＤＣ－Ｂｏｌｄは、Ｄｒ．Ｂ．Ｇ．Ｒｏｓｓｎａｇｅｌ（Ｃｒｏｐ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｃｅｎｔｒｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｓａｓｋａｔｃｈｅｗａｎ、Ｃａｎａｄａ）より分与された。
　これらのオオムギ系統からＣＴＡＢ法によりゲノムＤＮＡを抽出し、ＨｖＣｓｌＦ６遺伝子のプロモーター領域を含む、ＨｖＣｓｌＦ６遺伝子の開始コドンの上流約２ｋｂのゲノムの塩基配列（以下、「プロモーター配列」という。）を決定した。ＴＲ２５１及びＣＤＣ－ＢｏｌｄのＨｖＣｓｌＦ６遺伝子のプロモーター配列を、それぞれ配列番号１３及び１４に示す。
　図６及び７に示すように、これらの塩基配列を比較した結果、ＴＲ２５１のプロモーター配列（配列番号１３）において、配列番号１４（ＣＤＣ－Ｂｏｌｄのプロモーター配列）の塩基配列の第１０番目、第４５番目、第６１４番目及び第２００２番目に対応する塩基が、それぞれＡからＴ、ＡからＧ、ＧからＡ及びＣからＡに変異していることが明らかとなった。さらに、配列番号１４の塩基配列の第６７８番目と第６７９番目に対応する塩基の間に５’－ＴＣＴＣＴＣＡＡ－３’の８塩基対の挿入が見られた。図中、各変異箇所を白抜き文字で示す。これらの塩基配列の相違により、ＴＲ２５１がβ－グルカンを高生産するという表現型を示すことが示された。
　これらのプロモーター領域における多型を指標として、β－グルカンを高産生又は低産生するオオムギ品種の育種を効率よく行うことができる。
　また、配列番号１４（ＣＤＣ－Ｂｏｌｄのプロモーター配列）の塩基配列の第１７５５～第１７５８番目（ＨｖＣｓｌＦ６遺伝子の開始コドンの約３５０ｂｐ上流）、及びＴＲ２５１のプロモーター配列（配列番号１３）における、これに対応する位置に、典型的なＴＡＴＡボックスが見出された。図７中、ＴＡＴＡボックスを白抜き文字で示す。また、ＨｖＣｓｌＦ６遺伝子の開始コドンを四角で囲み、コード領域を下線で示す。
（ＨｖＣｓｌＦ６遺伝子のコード領域における多型）
　ＴＲ２５１のＨｖＣｓｌＦ６遺伝子のコード領域のゲノムＤＮＡの塩基配列を配列番号２３に、ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号２４に、推定アミノ酸配列を配列番号２５に示す。また、ＣＤＣ－ＢｏｌｄのＨｖＣｓｌＦ６遺伝子のコード領域のゲノムＤＮＡの塩基配列を配列番号２６に、ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号２７に、推定アミノ酸配列を配列番号２８に示す。ＴＲ２５１のＨｖＣｓｌＦ６遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列（配列番号２４）において、赤神力（野生型）のＨｖＣｓｌＦ６遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列（配列番号６）の第１７４番目、第１７６８番目及び第２５０５番目に対応する塩基がそれぞれ、ＧからＡ、ＧからＡ及びＴからＧに変異していることが明らかとなった。また、これらの変異のうち、第１７６８番目の塩基における変異によって、ＴＲ２５１のＨｖＣｓｌＦ６タンパクのアミノ酸配列（配列番号２５）において、赤神力（野生型）のＨｖＣｓｌＦ６タンパクのアミノ酸配列（配列番号５）の第５９０番目に対応するアミノ酸がアラニンからトレオニンに変異していることが明らかとなった。これらの変異も、ＴＲ２５１がβ－グルカン高産生系統であることと関係がある可能性が考えられる。
（新たなβ－グルカン欠失変異体の取得）
　発明者らは、オオムギ品種サチホゴールデン（ＴＮ５）（野生型）の新たなβ－グルカン欠失変異体を発見し、この変異体をＫＭ２７と命名した。そこで、サチホゴールデン及びＫＭ２７のＨｖＣｓｌＦ６遺伝子の塩基配列を決定した。以下、ＫＭ２７のＨｖＣｓｌＦ６遺伝子をβ－グルカン欠失遺伝子と呼ぶ。サチホゴールデンのＨｖＣｓｌＦ６遺伝子のゲノムの塩基配列を配列番号１５に、ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１６に、推定アミノ酸配列を配列番号１７に示す。また、ＫＭ２７のβ－グルカン欠失遺伝子のゲノムの塩基配列を配列番号１８に、ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１９に、推定アミノ酸配列を配列番号２０に示す。
　図８に示すように、配列番号１８に示すＫＭ２７のβ－グルカン欠失遺伝子のゲノムの塩基配列の第２３８５番目の塩基が、この塩基に対応するサチホゴールデンのＨｖＣｓｌＦ６遺伝子の塩基であるＧからＡに変異していることが明らかとなった。配列番号１８の第２３８５番目の塩基は、配列番号１９（ＫＭ２７のβ－グルカン欠失遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列）においては、第７５８番目に対応する。また、この変異によって、配列番号２０に示すＫＭ２７のβ－グルカン欠失遺伝子がコードするアミノ酸配列の第２５３番目のアミノ酸が、このアミノ酸に対応する、サチホゴールデンのＨｖＣｓｌＦ６タンパク上のアミノ酸残基であるシステインからチロシンに変異していることが明らかとなった。この変異は、ＯＵＭ１２５及びニシノホシ（ｂｇｌ）のβ－グルカン欠失遺伝子において同定された変異とは異なるものである。
　β－グルカン欠失性を示す、ＨｖＣｓｌＦ６遺伝子に変異を有する異なる２つの変異体が取得されたことは、ＨｖＣｓｌＦ６遺伝子がβ－グルカン合成遺伝子であることのより強固な証拠である。
（ＨｖＣｓｌＦ６の立体構造の予測）
　タンパク質立体構造予測ソフトのＳＯＳＵＩ（フリーウエア、ｈｔｔｐ：／／ｂｐ．ｎｕａｐ．ｎａｇｏｙａ－ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｓｏｓｕｉ／）を用いて、ＨｖＣｓｌＦ６タンパク質の立体構造を予測した。図９に結果を示す。図９中、ＫＭ２７において、システインがチロシンに変異した部位を（ｉ）で示し、ＯＵＭ１２５において、グリシンがアスパラギン酸に変異した部位を（ｉｉ）で示す。また、Ｄモチーフ及びＱｘｘＲＷモチーフの位置をそれぞれＤ及びＱｘｘＲＷとして示す。
（ＣＡＰＳ解析）
　ＫＭ２７と同じβ－グルカン欠失遺伝子のＣＡＰＳ解析を行うために、以下のプライマー（ＣＡＰＳマーカー）５’－ＡＴＣＡＡＧＧＡＧＣＣＣＡＴＣＣＴＣＴＣ－３’（ＨｖＣＳＬＦ６＿ＭＰＰ２－１Ｆ、配列番号２１）及び５’－ＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＣＴＴＧＡＡＣＴＣ－３’（ＨｖＣＳＬＦ６＿ＭＰＰ２－１Ｒ、配列番号２２）を作成した。
　これらのプライマーを用いてオオムギのゲノムＤＮＡをＰＣＲすることにより、３１１ｂｐの増幅断片が得られる。野生型の品種では、制限酵素Ｆｎｕ４ＨＩによる消化により、この増幅断片が、３、４１、５０、５６、６２及び９９ｂｐの６個の断片に切断される。これに対し、ＫＭ２７と同じβ－グルカン欠失遺伝子を有する品種では、１塩基置換によりＦｎｕ４ＨＩ認識部位が１箇所なくなるため、Ｆｎｕ４ＨＩで消化した場合に、上記の増幅断片が、３、４１、５０、５６及び１６１ｂｐの５個の断片に切断される。Ｆｎｕ４ＨＩ消化により生じるこれらの断片の差は電気泳動等により容易に識別可能である。なお、Ｆｎｕ４ＨＩの認識配列は５’－ＧＣＮＧＣ－３’であり、Ｆｎｕ４ＨＩ消化によって、５’－ＧＣ／ＮＧＣ－３’の形に切断される。ここで、ＮはＡ、Ｔ、Ｇ又はＣを意味する。Ｆｎｕ４ＨＩと同一の塩基配列を認識し、Ｆｎｕ４ＨＩと同じ形に切断する制限酵素として、ＢｉｓＩ、ＢｓｏＦＩ、Ｆｓｐ４ＨＩ、ＩｔａＩ、ＳａｔＩなどが知られている。これらの制限酵素もＦｎｕ４ＨＩと同様に使用可能である。
　図１０に、ＣＡＰＳ解析によってＫＭ２７と同じβ－グルカン欠失遺伝子の有無を判別した結果を示す。ゲノムＤＮＡを上記のプライマーでＰＣＲ増幅後、増幅断片を制限酵素Ｆｎｕ４ＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動した。レーンＡ～Ｆは、それぞれ、サチホゴールデン（野生型）、ＫＭ２７（β－グルカン欠失性）、サチホゴールデンとＫＭ２７のＦ１（ヘテロ型）、ＫＭ２７（β－グルカン欠失性）、ニシノホシ（ｂｇｌ）（β－グルカン欠失性）、サチホゴールデンとＫＭ２７のＦ１（ヘテロ型）のゲノムＤＮＡを解析した結果である。
　本発明の利用により、生命科学分野における植物のβ－グルカン合成に関わる遺伝子の解明が可能となる。β－グルカン合成に関わる遺伝子が解明されれば、その結果を利用して、育種におけるβ－グルカン含量の遺伝的制御が可能になると期待される。また、農業分野におけるβ－グルカンを含まない醸造用・飼料用オオムギの品種育成が可能となる。またアラビノキシランの機能性を利用する食品への応用が可能となる。

Claims (16)

  1. 　以下の（ａ）～（ｈ）のＤＮＡ：
    　（ａ）配列番号１に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、転写・翻訳された時にβ－グルカン合成活性を欠失したタンパク質が生成されるＤＮＡ；
    　（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、転写・翻訳された時にβ－グルカン合成活性を欠失したタンパク質が生成されるＤＮＡであって、当該タンパク質が、配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の第６６０番目に対応するアミノ酸がグリシン以外のアミノ酸であるＤＮＡ；
    　（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、転写・翻訳された時にβ－グルカン合成活性を欠失したタンパク質が生成されるＤＮＡであって、当該タンパク質が、配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の第６６０番目に対応するアミノ酸がアスパラギン酸であるＤＮＡ；及び
    　（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
    　（ｅ）配列番号１８に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、転写・翻訳された時にβ－グルカン合成活性を欠失したタンパク質が生成されるＤＮＡ；
    　（ｆ）配列番号１８に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、転写・翻訳された時にβ－グルカン合成活性を欠失したタンパク質が生成されるＤＮＡであって、当該タンパク質が、配列番号２０に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号２０のアミノ酸配列の第２５３番目に対応するアミノ酸がシステイン以外のアミノ酸であるＤＮＡ；
    　（ｇ）配列番号１８に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、転写・翻訳された時にβ－グルカン合成活性を欠失したタンパク質が生成されるＤＮＡであって、当該タンパク質が、配列番号２０に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号２０のアミノ酸配列の第２５３番目に対応するアミノ酸がチロシンであるＤＮＡ；及び
    　（ｈ）配列番号１８に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
    　からなる群から選択される、β－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡ。
  2. 　以下の（ａ）～（ｆ）のＤＮＡ：
    　（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の第６６０番目に対応するアミノ酸がグリシン以外のアミノ酸である、β－グルカン合成活性を欠失したタンパク質をコードするＤＮＡ；
    　（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の第６６０番目に対応するアミノ酸がアスパラギン酸である、β－グルカン合成活性を欠失したタンパク質をコードするＤＮＡ；及び
    　（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
    　（ｄ）配列番号２０に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号２０のアミノ酸配列の第２５３番目に対応するアミノ酸がシステイン以外のアミノ酸である、β－グルカン合成活性を欠失したタンパク質をコードするＤＮＡ；
    　（ｅ）配列番号２０に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の第２５３番目に対応するアミノ酸がチロシンである、β－グルカン合成活性を欠失したタンパク質をコードするＤＮＡ；及び
    　（ｆ）配列番号１９に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
    　からなる群から選択される、β－グルカン欠失遺伝子ｃＤＮＡ。
  3. 　以下の（ａ）～（ｄ）のＤＮＡ：
    　（ａ）配列番号４に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、転写・翻訳された時にβ－グルカン合成活性を有するタンパク質が生成されるＤＮＡ；
    　（ｂ）配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
    　（ｃ）配列番号１５に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、転写・翻訳された時にβ－グルカン合成活性を有するタンパク質が生成されるＤＮＡ；及び
    　（ｄ）配列番号１５に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
    　からなる群から選択される、β－グルカン合成遺伝子ゲノムＤＮＡ。
  4. 　（ａ）配列番号６に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、β－グルカン合成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は（ｂ）配列番号６に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、からなるβ－グルカン合成遺伝子ｃＤＮＡ。
  5. 　β－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡを有するオオムギの育種方法であって、
    　オオムギの７Ｈ染色体の動原体付近に座乗する配列番号４に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡの第４２７５番目に対応する塩基が、ＧからＡに変異していた場合に、前記オオムギはβ－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡを有すると判別して選択する選択ステップ、又は
    　オオムギの７Ｈ染色体の動原体付近に座乗する配列番号４に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡの第２３８５番目に対応する塩基が、ＧからＡに変異していた場合に、前記オオムギはβ－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡを有すると判別して選択する選択ステップ
    　を含む、育種方法。
  6. 　β－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡを有するオオムギの育種方法であって、
    　オオムギから抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号４に記載の塩基配列の第４２７５番目に対応する塩基を含むＤＮＡ断片を増幅する増幅ステップと、
    　増幅ステップで増幅されたＤＮＡ断片を、ＴａｑＩ、ＢａｎＩ及びＮｌａＩＶからなる群から選択される制限酵素で切断し、切断したＤＮＡ断片を検出する検出ステップと、
    　検出ステップにおいて、ＤＮＡ断片が制限酵素ＴａｑＩで切断された場合、又は制限酵素ＢａｎＩ若しくはＮｌａＩＶで切断されなかった場合に、前記オオムギはβ－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡを有すると判別して選択する選択ステップと
    　を含む、育種方法。
  7. 　β－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡを有するオオムギの育種方法であって、
    　オオムギから抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号４に記載の塩基配列の第２３８５番目に対応する塩基を含むＤＮＡ断片を増幅する増幅ステップと、
    　増幅ステップで増幅されたＤＮＡ断片を、制限酵素Ｆｎｕ４ＨＩで切断し、切断したＤＮＡ断片を検出する検出ステップと、
    　検出ステップにおいて、ＤＮＡ断片が、配列番号４に記載の塩基配列の第２３８６番目に対応する塩基と第２３８７番目に対応する塩基の間で切断されなかった場合に、前記オオムギはβ－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡを有すると判別して選択する選択ステップと
    　を含む、育種方法。
  8. 　請求項３に記載のβ－グルカン合成遺伝子ゲノムＤＮＡの発現を抑制するステップを含む、オオムギ穀粒のβ－グルカンを減少又は欠失させる方法。
  9. 　請求項８の方法によって得ることのできる、穀粒中のβ－グルカンを減少又は欠失したオオムギ。
  10. 　請求項５～７のいずれか一項に記載の育種方法によって育種された、請求項１に記載のβ－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡを有するオオムギ。
  11. 　請求項５～７のいずれか一項に記載の育種方法によって育種された、請求項１に記載のβ－グルカン欠失遺伝子ゲノムＤＮＡをホモで有するオオムギ。
  12. 　請求項３に記載のβ－グルカン合成遺伝子ゲノムＤＮＡを含むベクターを発現可能に保持する、形質転換体。
  13. 　請求項４に記載のβ－グルカン合成遺伝子ｃＤＮＡを含むベクターを発現可能に保持する、形質転換体。
  14. 　請求項９～１１のいずれか一項に記載のオオムギ由来の穀粒を発酵させるステップを含む、アルコールの製造方法。
  15. 　請求項９～１１のいずれか一項に記載のオオムギ由来の穀粒を発酵させるステップを含む、発酵食品の製造方法。
  16. 　請求項９～１１のいずれか一項に記載のオオムギ由来の穀粒を含む、動物用飼料組成物。
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