WO2010087121A1 - 核酸分析デバイス、及び核酸分析装置 - Google Patents

核酸分析デバイス、及び核酸分析装置 Download PDF

Info

Publication number
WO2010087121A1
WO2010087121A1 PCT/JP2010/000214 JP2010000214W WO2010087121A1 WO 2010087121 A1 WO2010087121 A1 WO 2010087121A1 JP 2010000214 W JP2010000214 W JP 2010000214W WO 2010087121 A1 WO2010087121 A1 WO 2010087121A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acid
fine particles
substrate
analysis device
fixed
Prior art date
Application number
PCT/JP2010/000214
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
齋藤俊郎
今井一成
Original Assignee
株式会社 日立ハイテクノロジーズ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社 日立ハイテクノロジーズ filed Critical 株式会社 日立ハイテクノロジーズ
Priority to US13/147,117 priority Critical patent/US20110281320A1/en
Publication of WO2010087121A1 publication Critical patent/WO2010087121A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid analysis device and a nucleic acid analysis apparatus.
  • a cDNA fragment sample synthesized in advance by reverse transcription reaction from a DNA fragment or RNA sample for sequencing is prepared, and a dideoxy reaction is performed by a well-known Sanger method. After that, electrophoresis is performed, and the molecular weight separation development pattern is measured and analyzed.
  • Non-Patent Document 1 fine particles are used as a medium for carrying DNA fragments, and PCR is performed on the fine particles. Thereafter, fine particles carrying PCR-amplified DNA fragments are put on a plate having a large number of holes in which the hole diameter is adjusted to the size of the fine particles, and read by a pyrosequencing method.
  • Non-Patent Document 2 PCR is performed on microparticles using microparticles as a medium carrying DNA fragments. Thereafter, the microparticles are dispersed and fixed on the glass substrate, an enzyme reaction (ligation) is performed on the glass substrate, a fluorescent dye is incorporated, and the sequence information of each fragment is obtained.
  • ligation enzyme reaction
  • Non-Patent Document 3 a large number of DNA probes having the same sequence are fixed on a smooth substrate.
  • a DNA probe sequence and an adapter sequence of a complementary strand are added to the end of each DNA sample fragment.
  • the sample DNA fragments are immobilized on the substrate randomly one molecule at a time. In this case, the DNA elongation reaction does not occur on the substrate, and after loading the substrate with the fluorescent dye, the unreacted substrate is washed and the fluorescence is detected to obtain the sequence information of the sample DNA.
  • the number of DNA fragments that can be read in one assay is determined by the hole diameter of the plate. , At most 10 4 fragments / slide glass, there is a limit to improving the throughput.
  • An object of the present invention relates to improving the throughput of nucleic acid analysis by regularly arranging fine particles on which nucleic acid synthesizing enzymes and DNA probes for capturing nucleic acid sample fragments are fixed on a substrate.
  • the present invention relates to fixing a nucleic acid synthesizing enzyme, a DNA probe, or the like to a fine particle in advance, forming a metal pad pattern such as gold on a substrate, and bonding the fine particle and the pad via a chemical bond.
  • the chemical bond as used in the present invention means a bond including a covalent bond, a coordinate bond, an ionic bond, a hydrophobic bond, and the like.
  • nucleic acid fragment samples can be arranged on a substrate by being regularly arranged at high density, so that nucleic acid samples can be analyzed with high throughput. For example, if microparticles are fixed at 1 micron intervals, a high density of 10 6 nucleic acid fragments / emm 2 can be easily achieved.
  • the figure for demonstrating an example of a structure of a nucleic acid analysis device The figure for demonstrating an example of the manufacturing method of a nucleic acid analysis device.
  • the device for nucleic acid analysis in which fine particles having probe molecules capable of capturing a nucleic acid to be detected are regularly fixed on a substrate, comprising an adhesive pad at a fixed position of the fine particles on the substrate, Disclosed is a device in which fine particles and the bonding pad are bonded through a chemical bond.
  • a nucleic acid analysis device in which fine particles having probe molecules capable of capturing a nucleic acid to be detected are regularly fixed on a substrate, a nucleotide having a fluorescent dye, and a nucleic acid sample are added to the nucleic acid analysis device.
  • a nucleic acid analyzer for obtaining base sequence information of a nucleic acid sample comprising a bonding pad at a fixed position of the fine particle on a substrate, wherein the fine particle and the bonding pad are
  • An apparatus is disclosed that is coupled via a chemical bond.
  • a method for manufacturing a nucleic acid analysis device in which fine particles having probe molecules capable of capturing a nucleic acid to be detected are regularly fixed on a substrate, the fine particles on which the probe molecules are fixed in advance, Disclosed is a method for producing a nucleic acid analysis device, which is produced by fixing the fine particles at a predetermined position on the substrate by supplying the substrate on a substrate having an adhesive pad.
  • one probe molecule is fixed to one fine particle.
  • the probe molecule is a nucleic acid or a nucleic acid synthase.
  • the fine particles are made of a material selected from a semiconductor or a metal.
  • the bonding pad is made of a material selected from gold, titanium, nickel, or aluminum.
  • the adhesive pads 102 are regularly formed on the smooth substrate 101, for example, in a lattice shape as shown in FIG.
  • the adhesive pad 102 and the fine particles 103 are connected by chemical bonding via the linear molecules 105.
  • the functional group 106 at the end of the linear molecule 105 and the bonding pad 102 are bonded by chemical interaction.
  • the functional group 106 has a weak interaction with the smooth substrate 101 and a strong interaction with the adhesive pad 102.
  • quartz glass, sapphire, a silicon substrate, or the like can be used as the smooth substrate.
  • the bonding pad 102 can be made of a material selected from gold, titanium, nickel, and aluminum.
  • the functional group 106 must be selected in consideration of the combination of the smooth substrate 101 and the adhesive pad 102.
  • a sulfohydryl group, an amino group, a carboxyl group, a phosphate group, an aldehyde group, or the like can be used.
  • the linear molecule 105 plays a role of connecting the fine particles 103 and the bonding pad 102, and the length thereof is not greatly limited. However, in the case of a low molecule, a linear molecule having about 3 to 20 carbon atoms is preferable.
  • the functional group 107 at the end of the linear molecule 105 provides adhesion with the fine particles 103.
  • a polymer is used as the linear molecule 105, a polymer having a plurality of side chains and having both a side chain having a functional group 106 and a side chain having a functional group 107 can be used.
  • metal fine particles or semiconductor fine particles can be used.
  • gold fine particles having a diameter of 5 nm to 100 nm are commercially available and can be utilized.
  • semiconductor fine particles compound semiconductors such as CdSe having a diameter of about 10 nm to 20 nm are commercially available and can be utilized.
  • the functional group that can be used as the functional group 107 differs depending on the type of fine particles, but for example, when gold fine particles are used, a sulfohydryl group, an amino group, or the like is preferable.
  • semiconductor fine particles fine particles whose surface is modified with streptavidin are commercially available, and biotin can be used as the functional group 107.
  • the probe molecule 104 that captures a nucleic acid a single strand of DNA or RNA nucleic acid molecule can be used. The end of the nucleic acid molecule is modified in advance in the same manner as the functional group 107 and reacted with the fine particles 103. Moreover, a nucleic acid synthetase can also be used as the probe molecule 104 that captures nucleic acid. Reagents for introducing avidin tags into expressed proteins are commercially available. By synthesizing DNA polymerase using such reagents, for example, nucleic acid synthase can be easily applied to the surface of semiconductor fine particles whose surface is modified with commercially available streptavidin. Can be fixed.
  • a nucleic acid sample molecule having a specific complementary sequence can be captured.
  • a nucleic acid elongation reaction can be caused on the substrate by supplying a nucleic acid synthase or nucleotide.
  • a nucleic acid synthase is used as the probe molecule 104, a nonspecific nucleic acid sample molecule can be captured.
  • a nucleic acid elongation reaction can be caused on the substrate by supplying nucleotides.
  • the probe molecule 104 immobilized on one fine particle 103 is a single molecule.
  • the particle size of the fine particle 103 is preferably as small as possible.
  • the binding reaction between the fine particles 103 and the probe molecules 104 is performed in a liquid phase, and the fine particles 103 are allowed to react with the fine particles 103 while reducing the concentration of the probe molecules 104 to about 1/10 or less. Even in such a case, the probe molecule 104 fixed to one fine particle 103 can be made into one molecule.
  • the fixation density of the probe molecules 104 decreases.
  • the distance between the probes is about 1 ⁇ m in consideration of the diffraction limit. Therefore, the size of the fine particles 103 is suitably 1 ⁇ m or less.
  • a thin film process already in practical use for semiconductors can be used. For example, after forming a thin film by vapor deposition / sputtering through a mask or vapor deposition / sputtering, it can be produced by dry or wet etching. Regular arrangement can be easily realized by using a thin film process.
  • the interval between the pads can be set arbitrarily, but when optical measurement is performed as the detection means, it is preferably 500 nm or more in consideration of the diffraction limit of light detection.
  • the linear molecules 105 that connect the fine particles 103 and the adhesive pad 102 are supplied, and the linear molecules 105 are fixed on the adhesive pad 102.
  • a method of reacting a material having a strong adhesive force with the smooth substrate 101 on the smooth substrate 101 before supplying the linear molecules 105 is effective. It is.
  • a silane coupling agent can be used.
  • the nucleic acid analysis device is manufactured by supplying the microparticles 103 on which the probe molecules 104 are fixed to the surface in advance to the substrate and fixing the microparticles 103 on the adhesive pad 102.
  • the diameter D of the fine particle 103 is preferably 20 nm or less. Therefore, the diameter d of the bonding pad 102 is preferably 20 nm or less. Further, as a result of intensive studies, when the fine particle 103 has a charge on its surface, an electrostatic repulsive force acts between the fine particles, so that the diameter d of the adhesive pad 102 is larger than the diameter D of the fine particle 103.
  • the diameter d of the adhesive pad 102 is preferably smaller than the diameter D of the fine particles 103, and the surface charge of the fine particles 103 is large and the electrostatic repulsion force. It is clear that the diameter d of the adhesive pad 102 does not necessarily have to be smaller than the diameter D of the fine particles 103 when the resistance is strong.
  • a method using a fluorescence detection method is preferred from the viewpoint of sensitivity and simplicity.
  • a nucleic acid sample is supplied to the nucleic acid analysis device, and the probe molecule 104 is made to capture the nucleic acid sample.
  • a nucleotide having a fluorescent dye is supplied, and when the probe molecule 104 is a DNA probe, a nucleic acid synthase is supplied.
  • a nucleic acid elongation reaction is caused on the device, and the fluorescence of the fluorescent dye incorporated into the nucleic acid chain during the elongation reaction is measured.
  • a so-called sequential extension reaction method in which one type of nucleotide is supplied, unreacted nucleotides are washed, fluorescence observation, different types of nucleotides are supplied, and the subsequent steps are repeated can be easily realized.
  • a continuous reaction can be caused to obtain the base sequence information of the nucleic acid sample.
  • the realization of the so-called real-time reaction method is achieved by supplying the four types of nucleotides having different fluorescent dyes, causing a continuous nucleic acid extension reaction without washing, and performing continuous fluorescence observation. You can also.
  • the phosphate moiety is cleaved after the extension reaction, so that the fluorescence can be measured continuously without quenching to obtain the base sequence information of the nucleic acid sample. it can.
  • Fluorescence can be enhanced and observed by using fine particles having a diameter of about 100 nm or less, such as gold, silver, platinum, and aluminum, that can excite localized plasmons in the visible region.
  • the phenomenon of fluorescence enhancement by surface plasmon of gold fine particles is reported, for example, in Nanotechnology, 2007, vol. 18, pp 044017-044021.
  • the fluorescence of the fluorescent dye attached to the nucleotide can be enhanced and measured, and the signal / noise can be increased.
  • a fluorescent dye can always be placed in the enhancement field created by the localized plasmon, and stable fluorescence enhancement is obtained.
  • the semiconductor fine particles are excited with light from an external light source, and the excitation energy is transferred to the fluorescent dyes associated with the incorporated nucleotides. Can also be observed.
  • the excitation light source may excite only the semiconductor fine particles, which is preferable in that one kind of light source may be used.
  • the particle size of the fine particles can be made uniform, and the particle size can be selected from a wide range of tens of nanometers to several micrometers. Further, it is preferable in that the functional group possessed by the polymer material is subjected to surface modification on the scaffold, so that the introduction amount of the functional group for the fixing reaction of the probe molecule 104 to be immobilized on the surface of the fine particles can be made uniform. In particular, when only one molecule of the probe molecule 104 is immobilized on the surface of the fine particle, the reproducibility of the immobilization rate is very high, which is preferable.
  • An electron beam positive resist 202 is applied on a smooth support substrate 201 by a spin coating method.
  • a smooth support substrate a glass substrate, a sapphire substrate, a silicon wafer or the like is used.
  • a quartz substrate or a sapphire substrate having excellent light transmittance may be used.
  • the positive resist for electron beam include polymethyl methacrylate and ZEP-520A (manufactured by Nippon Zeon Co., Ltd.).
  • a through hole in the resist After aligning using the position of the marker on the substrate, electron beam direct drawing exposure is performed to form a through hole in the resist. For example, a through hole having a diameter of 15 nm is formed.
  • Through-holes depend on the number of nucleic acid molecules that can be analyzed by parallel processing, but forming at a pitch of about 1 ⁇ m takes into account the simplicity of manufacturing, high yield, and the number of nucleic acid molecules that can be analyzed by parallel processing. Then it is suitable.
  • the through hole formation region also depends on the number of nucleic acid molecules that can be analyzed by parallel processing, but greatly depends on the position accuracy and position resolution on the detection device side.
  • reaction sites fine particles
  • 1 million reaction sites can be formed if the through-hole formation region is 1 mm ⁇ 1 mm.
  • a material constituting the bonding pad 203 for example, gold, titanium, nickel, aluminum, is formed by sputtering.
  • gold, titanium, nickel, aluminum is used as the smooth support base and gold, aluminum, or nickel is used as the bonding pad material, titanium or chrome is used to reinforce the bonding between the substrate material and the bonding pad material. It is preferable to put a thin film.
  • the linear molecule 204 is reacted with the bonding pad 203.
  • the bonding pad 203 is gold, titanium, aluminum, or nickel, it is preferable to use a sulfohydryl group, a phosphate group, a phosphate group, or a thiazole group as the functional group 205 at the end of the linear molecule, respectively.
  • a sulfohydryl group, a phosphate group, a phosphate group, or a thiazole group can be used for the functional group 206 on the opposite side of the linear molecule.
  • the non-specific adsorption preventing molecule 207 having a negatively charged functional group is coated.
  • epoxy silane is applied to the surface by spin coating, heat treatment, and then treatment with a weakly acidic solution (pH 5 to pH 6) to open the epoxy group and introduce OH group to the surface.
  • Adsorption prevention effect can be brought about.
  • the surface of the fine particles 208 is modified with avidin 209 in advance.
  • biotin-succinimide NHS-Biotin manufactured by Pierce
  • streptavidin is reacted. It can.
  • metal fine particles other than gold or platinum the surface is oxidized by heat treatment in an oxygen atmosphere, then aminosilane is reacted, and then biotin-succinimide (NHS-Biotin manufactured by Pierce) is reacted. Finally, react with streptavidin. Thereby, it is possible to easily avidin-modify the surface of the metal fine particles.
  • the fine particles When semiconductor fine particles are used as the fine particles, commercially available fine particles can be used. For example, the product name “Qdot® streptavidin label” (manufactured by Invitrogen) having a diameter of 15 to 20 nm can be used.
  • Qdot® streptavidin label manufactured by Invitrogen
  • an oligonucleotide When an oligonucleotide is used as the nucleic acid capture probe 210, it can be easily fixed on the microparticles by synthesizing the end with biotin.
  • a nucleic acid synthase When a nucleic acid synthase is used as the nucleic acid capture probe 210, an expression system is assembled in advance using an RTS AviTag E. coli biotinylation kit (manufactured by Roche Applied Science), and a nucleic acid synthase is easily prepared. Nucleic acid synthase can be immobilized on microparticles.
  • the nucleic acid analysis device of this example can be manufactured by reacting the fine particles on which the nucleic acid capture probe is immobilized with the bonding pad.
  • an example of a method for producing a nucleic acid analysis device in which only one molecule of a probe molecule is immobilized particularly a method of immobilizing one molecule of a probe molecule per fine particle will be described with reference to FIG.
  • a binding site 302 for capturing the nucleic acid sample molecule 304 is bound to the surface of the microparticle 301.
  • streptavidin can be used as the binding site, and commercially available streptavidin-coated fine particles (manufactured by Invitrogen) can be used as the fine particles.
  • the binding site 303 is modified in advance in the nucleic acid sample molecule 304.
  • As the binding site 303 one that easily binds to the binding site 302 on the surface of the fine particles 301 is selected.
  • biotin is used as the binding site 303. It is possible to easily bind the binding site 303 to the end of the nucleic acid sample molecule 304 by synthesizing a PCR reaction product using the nucleic acid sample as a template using a primer whose end is modified at the binding site 303.
  • the nucleic acid sample molecule 304 is captured by the microparticle 301 by reacting the microparticle 301 with the nucleic acid sample molecule 304.
  • the number of molecules of the nucleic acid sample molecule 304 in the unit volume is smaller than the number of the particles 301. This is because if there are more nucleic acid sample molecules 304 than fine particles 301, the number of captured nucleic acid sample molecules per fine particle 301 is likely to be larger than one molecule.
  • the nucleic acid sample molecules 304 are not captured by about 90% of the microparticles 301, and about 9 % Of the microparticles 301 captured one molecule of the nucleic acid sample molecule 304.
  • This result is in good agreement with the predicted result assuming a Poisson distribution. Therefore, if only the fine particles 301 that have captured the nucleic acid sample molecules 304 are collected, 90% or more of the collected fine particles 301 become the fine particles 301 that have captured only one molecule of the nucleic acid sample molecules 304.
  • the nucleic acid sample molecules 304 can be bound to the magnetic fine particles 307 and collected by a magnet.
  • An oligonucleotide 305 having a sequence complementary to the terminal sequence of the nucleic acid sample molecule 304 and having a binding site 306 modified at the terminal is prepared, and a binding site 308 that binds to the binding site 306 is coated on the surface of the magnetic particle 307 in advance. deep.
  • the sequence of the oligonucleotide 305 can be determined using the primer sequence used when the nucleic acid sample molecule 304 is amplified by PCR.
  • the nucleic acid sample molecules 304 that have captured one molecule can be separated and collected at a high rate of 90% or more.
  • a denature treatment high-temperature treatment
  • the isolated nucleic acid-capturing microparticle 301 can be fixed in a predetermined arrangement on a smooth substrate by using the method described in Example 1, and nucleic acid analysis in which only one nucleic acid sample molecule 304 of this example is fixed. Devices can be manufactured.
  • an electrophoresis method in order to increase the proportion of fine particles that have captured only one molecule of nucleic acid sample molecules. That is, by utilizing the fact that the amount of charge on the microparticle varies depending on the number of molecules of nucleic acid captured by the microparticle, the microparticle is migrated in a gel, such as agarose, while the nucleic acid is still captured, so Electrophoretic patterns are separated based on the number of nucleic acid molecules.
  • the fine particles in which the nucleic acid is not captured have the shortest movement distance, and the fine particles in which only one nucleic acid molecule is captured form a band at the next short movement distance. Therefore, by cutting out this band, fine particles in which only one nucleic acid molecule is captured can be obtained with high purity.
  • the nucleic acid analyzer of the present embodiment includes means for supplying a nucleotide having a fluorescent dye, a nucleic acid synthase, and a nucleic acid sample to the nucleic acid analysis device, means for irradiating the nucleic acid analysis device with light, and on the nucleic acid analysis device. And a luminescence detection means for measuring the fluorescence of the fluorescent dye incorporated into the nucleic acid chain by the nucleic acid extension reaction caused by the coexistence of the nucleotide, the nucleic acid synthase, and the nucleic acid sample.
  • the device 405 is installed in a reaction chamber composed of a cover plate 401, a detection window 402, an inlet 403 that is a solution exchange port, and an outlet 404.
  • PDMS Polydimethylsiloxane
  • the thickness of the detection window 402 is 0.17 mm.
  • the light After adjusting the two laser beams to be coaxial by 412 (reflecting 410 nm or less), the light is condensed by a lens 413 and then irradiated to the device 405 through a prism 414 at a critical angle or more.
  • the case where gold fine particles having a diameter of about 50 nm are used as fine particles will be described as an example.
  • localized surface plasmons are generated in the gold fine particles existing on the surface of the device 405 by laser irradiation, and the target substance phosphor captured by the DNA probe bound to the gold fine particles exists in the fluorescence enhancement field. become.
  • the phosphor is excited by laser light, and a part of the enhanced fluorescence is emitted through the detection window 402.
  • the fluorescence emitted from the detection window 402 is converted into a parallel light beam by the objective lens 415 ( ⁇ 60, NA 1.35, working distance 0.15 mm), and the background light and excitation light are blocked by the optical filter 416 to form an image.
  • An image is formed on the two-dimensional CCD camera 418 by the lens 417.
  • Non-patent Document 5 As a nucleotide with a fluorescent dye, a 3′-position at the position of 3′OH of ribose as disclosed in PNAS 2006, vol. 103, pp 19635-19640 (Non-patent Document 5).
  • An O-allyl group can be used as a protecting group, and it can be linked to a fluorescent dye via an allyl group at the 5-position of pyrimidine or at the 7-position of purine. Since the allyl group is cleaved by light irradiation (for example, a wavelength of 355 nm) or contact with palladium, the quenching of the dye and the control of the extension reaction can be simultaneously achieved.
  • the above-described example of the nucleic acid analyzer can be applied.
  • Qdot (R) 565 conjugate manufactured by Invitrogen
  • it can be sufficiently excited with a YAG laser light source (wavelength 532 nm, output 20 mW) 407.
  • This excitation energy emits fluorescence by moving to Alexa 633 (manufactured by Invitrogen), which is not excited by light of 532 nm.
  • Alexa 633 manufactured by Invitrogen
  • dyes associated with unreacted nucleotides are not excited, and are only captured by DNA probes and close to the semiconductor fine particles to emit light, so that the captured nucleotides can be identified by fluorescence measurement. Is possible.
  • the analysis time can be shortened and the device and the analysis device can be simplified without the need for a washing step.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

　本発明の目的は、核酸試料断片を捕捉する核酸合成酵素やＤＮＡプローブを固定した微粒子を基板上に規則正しく並べ、核酸分析のスループットを向上させることに関する。 　本発明は、核酸合成酵素やＤＮＡプローブなどを微粒子に予め固定しておき、微粒子の直径よりも小さな径を持つ、金などの金属パッドパターンを基板上に形成しておき、微粒子とパッドとを化学結合を介して結合させることに関する。また、微粒子が表面電荷を有する場合には、微粒子の直径と同等あるいは微粒子の直径よりも大きな径を持つ、金などの金属パッドパターンを基板上に形成しておき、微粒子とパッドとを化学結合を介して結合させることに関する。本発明により、多種類の核酸断片試料を高密度にかつ規則正しく整列させて基板上に固定できるため高スループットに核酸試料を分析できる。例えば、１ミクロン間隔で微粒子を固定すれば、１０6核酸断片／emm2という高密度が容易に達成できる。

Description

核酸分析デバイス、及び核酸分析装置
　本発明は、核酸分析デバイスや核酸分析装置に関する。
　核酸分析デバイスとして、ＤＮＡやＲＮＡの塩基配列を決定する新しい技術が開発されてきている。
　現在、通常用いられている電気泳動を利用した方法においては、予め配列決定用のＤＮＡ断片又はＲＮＡ試料から逆転写反応を行い合成したｃＤＮＡ断片試料を調製し、周知のサンガー法によるジデオキシ反応を実行した後、電気泳動を行い、分子量分離展開パターンを計測して解析する。
　これに対し、近年、基板に試料となるＤＮＡ断片を数多く固定して、パラレルに数多くの断片の配列情報を決定する方法が提案されている。
　非特許文献１では、ＤＮＡ断片を担時する媒体として微粒子を用い、微粒子上でＰＣＲを行う。その後、微粒子のサイズに穴径を合わせた数多くの穴を設けたプレートに、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断片を担持した微粒子を入れてパイロシーケンス方式で読み出している。
　また、非特許文献２では、ＤＮＡ断片を担持する媒体として微粒子を用い、微粒子上でＰＣＲを行う。その後、微粒子をガラス基板上にばら撒いて固定し、ガラス基板上で酵素反応（ライゲーション）を行い、蛍光色素付き基質を取り込ませて蛍光検出を行うことにより各断片の配列情報を得ている。
　さらに、非特許文献３では、平滑基板上に、同一配列を有する多数のＤＮＡプローブを固定しておく。また、ＤＮＡ試料を切断後、ＤＮＡプローブ配列と相補鎖のアダプター配列を各ＤＮＡ試料断片の端に付加させる。これらを基板上でハイブリダイゼーションさせることにより、基板上にランダムに一分子ずつ試料ＤＮＡ断片を固定化させている。この場合、基板上でＤＮＡ伸長反応を起こない、蛍光色素付き基質を取り込ませた後、未反応基質の洗浄，蛍光検出を行い、試料ＤＮＡの配列情報を得ている。
　以上のように、平滑基板上に、核酸断片試料を数多く固定することにより、パラレルに数多くの断片の配列情報を決定する方法が開発され、実用化されつつある。
Nature 2005, Vol. 437, pp. 376-380. Genome Research 2008, Vol. 18, pp 1051-1063. Science 2008, Vol. 320, pp. 106-109. Nanotechnology, 2007, vol. 18, pp 044017-044021. P.N.A.S. 2006, vol. 103, pp 19635-19640
　本願発明者がパラレル解析法のスループット向上について鋭意検討した結果、次のような知見を得るに至った。
　上記のようなパラレル解析法のスループットをより一層高めるためには、できるだけ高密度、且つ規則正しく、平滑な基板上に核酸試料を整列させて固定することが望まれる。あらかじめ微粒子に核酸試料を担持させておく方法は、解析するＤＮＡ断片数が莫大であることから、試料のハンドリング上非常に有利である。核酸試料を担持させた微粒子を平滑基板上にばらまいて固定させる方法は容易ではあるが、蛍光測定で配列を読み取る段になると、ＣＣＤカメラで検出したランダムに存在する微粒子画像から数値データを取得する際、膨大なデータ処理時間がかかってしまう。
　一方、多数の穴を形成したプレートをあらかじめ用意しておき、その上に核酸試料を担持した微粒子を並べる方法では、一度のアッセイで読むことのできるＤＮＡ断片数はプレートの穴径で決まってしまい、高々１０4断片／スライドガラスであり、スループットの向上には限界がある。
　本発明の目的は、核酸試料断片を捕捉する核酸合成酵素やＤＮＡプローブを固定した微粒子を基板上に規則正しく並べ、核酸分析のスループットを向上させることに関する。
　本発明は、核酸合成酵素やＤＮＡプローブなどを微粒子に予め固定しておき、金などの金属パッドパターンを基板上に形成し、微粒子とパッドとを化学結合を介して結合させることに関する。
　本発明でいう化学結合とは、共有結合，配位結合，イオン結合，疎水性結合などを含めた結合を意味する。
　本発明により、多種類の核酸断片試料を高密度にかつ規則正しく整列させて基板上に固定できるため、高スループットに核酸試料を分析できる。例えば、１ミクロン間隔で微粒子を固定すれば、１０6核酸断片／emm2という高密度が容易に達成できる。
核酸分析デバイスの構成の一例を説明するための図。 核酸分析デバイスの製造方法の一例を説明するための図。 核酸分析デバイスのプローブ分子として核酸を用いた場合のプローブ分子の微粒子への固定方法の一例を説明するための図。 核酸分析デバイスを用いた核酸分析装置の一例を説明するための図。
　実施例では、検出対象の核酸を捕捉できるプローブ分子を有する微粒子を基板上に規則的に固定した核酸分析用デバイスであって、前記基板上の前記微粒子の固定位置に接着用パッドを備え、前記微粒子と前記接着用パッドとが化学結合を介して結合しているデバイスを開示する。
　また、実施例では、検出対象の核酸を捕捉できるプローブ分子を有する微粒子を基板上に規則的に固定した核酸分析用デバイスと、核酸分析デバイスに対して、蛍光色素を有するヌクレオチド、及び核酸試料を供給する手段と、核酸分析デバイスに光を照射する手段と、核酸分析デバイス上においてヌクレオチド、核酸合成酵素、及び核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する発光検出手段と、を備え、核酸試料の塩基配列情報を取得する核酸分析装置であって、基板上の前記微粒子の固定位置に接着用パッドを備え、微粒子と接着用パッドとが化学結合を介して結合している装置を開示する。
　また、実施例では、検出対象の核酸を捕捉できるプローブ分子を有する微粒子を基板上に規則的に固定した核酸分析用デバイスの製造方法において、予め前記プローブ分子を固定しておいた前記微粒子を、接着用パッドを備えた基板上に供給することで、前記基板上の所定の位置に前記微粒子を固定することで製造することを特徴とする、核酸分析用デバイスの製造方法を開示する。
　また、実施例では、微粒子１個に対して、プローブ分子が一分子固定されていることを開示する。
　また、実施例では、プローブ分子が、核酸、又は核酸合成酵素であることを開示する。
　また、実施例では、微粒子が、半導体、又は金属から選ばれる材料からなることを開示する。
　また、実施例では、接着用パッドが、金，チタン，ニッケル、又はアルミから選ばれる材料からなることを開示する。
　以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果について、図を参照して説明する。ここでは、本発明を完全に理解してもらうため、特定の実施形態について詳細な説明を行うが、本発明はここに記した内容に限定されるものではない。
　本実施例のデバイスの構成を、図１を用いて説明する。平滑基板１０１の上に接着パッド１０２が規則正しく、例えば図１に示すように格子状に形成されている。接着パッド１０２と微粒子１０３は、線状分子１０５を介して化学結合により結ばれている。線状分子１０５の末端の官能基１０６と、接着パッド１０２とは化学的相互作用により結合していることが好ましい。その際、官能基１０６は、平滑基板１０１との相互作用が弱く、接着パッド１０２との相互作用が強いことが好ましい。このような観点から、平滑基板としては、石英ガラス，サファイア，シリコン基板などを用いることができる。また、接着パッド１０２には、金，チタン，ニッケル，アルミから選ばれる材料で構成することができる。官能基１０６には、平滑基板１０１と接着パッド１０２との組合せを考えて選択せねばならないが、例えば、スルホヒドリル基，アミノ基，カルボキシル基，リン酸基，アルデヒド基等を用いることができる。線状分子１０５は、微粒子１０３と接着パッド１０２を結ぶ役割を果たし、長さに大きな限定はないが、低分子の場合には炭素数にして３から２０程度の直鎖状分子が好ましい。線状分子１０５の末端の官能基１０７は、微粒子１０３との接着性をもたらす。また、線状分子１０５として高分子を用いる場合には、複数の側鎖を有し、官能基１０６を有する側鎖と官能基１０７を持つ側鎖を併せ持つものを用いることができる。
　微粒子１０３としては、金属微粒子や半導体微粒子を用いることができる。例えば、金の微粒子として、直径５ｎｍ～１００ｎｍのものが市販されており、活用することができる。また、半導体微粒子としては、直径が１０ｎｍ～２０ｎｍ程度のＣｄＳｅ等の化合物半導体が市販されており、活用することができる。官能基１０７として用いることができる官能基は、微粒子の種類によって異なるが、例えば金微粒子を用いた場合にはスルホヒドリル基，アミノ基等が好ましい。半導体微粒子を用いる場合には、ストレプトアビジンで表面が修飾された微粒子が市販されており、官能基１０７としてビオチンを用いることができる。核酸を捕捉するプローブ分子１０４には、ＤＮＡやＲＮＡの核酸分子の一本鎖を用いることができる。核酸分子の末端を官能基１０７と同様に予め修飾しておき、微粒子１０３と反応させておく。また、核酸を捕捉するプローブ分子１０４として核酸合成酵素を用いることもできる。発現タンパク質にアビジンタグを導入する試薬が市販されており、このような試薬を用いてＤＮＡポリメラーゼを合成することにより、例えば、市販のストレプトアビジンで表面が修飾された半導体微粒子表面に容易に核酸合成酵素を固定できる。核酸を捕捉するプローブ分子１０４として核酸分子の一本鎖を用いた場合には、特定の相補配列を有する核酸試料分子を捕捉することができる。捕捉後に、核酸合成酵素やヌクレオチドを供給することにより、基板上で核酸伸張反応を起こすこともできる。また、プローブ分子１０４として核酸合成酵素を用いた場合には、非特定の核酸試料分子を捕捉できる。この場合も、ヌクレオチドを供給することにより基板上で核酸伸長反応を起こすことができる。
　一つの微粒子１０３に固定するプローブ分子１０４は、一分子であることが好ましい。一つの微粒子１０３に一分子のプローブ分子１０４を固定するためには、微粒子１０３の粒径が小さいほど好ましい。一つの核酸捕捉プローブ分子が微粒子表面に固定されると、微粒子上の電荷の状態が変化して、他の未固定の核酸捕捉プローブ分子の固定反応を阻害する効果が生じる。微粒子サイズが小さくなると、この効果が大きくなるからである。発明者らが鋭意検討した結果、微粒子サイズとして約２０ｎｍ以下が好ましいことが判明している。また、微粒子１０３とプローブ分子１０４との結合反応を液相で行い、かつ、微粒子１０３に対してプローブ分子１０４の濃度を約１／１０以下に下げて反応させることで、微粒子１０３の直径が１μｍ程度であっても、一つの微粒子１０３に固定するプローブ分子１０４を一分子とすることができる。一方、微粒子１０３のサイズが大きくなるに従い、プローブ分子１０４の固定密度が低下してしまう。簡便な蛍光検出でプローブを識別する場合回折限界を考慮するとプローブ間が１μｍ程度離れていることが好ましい。したがって、微粒子１０３のサイズは１μｍ以下であることが適している。
　接着パッド１０２を平滑基板１０１上に形成する方法としては、半導体で既に実用化されている薄膜プロセスを活用することができる。例えば、マスクを通した蒸着・スパッタリング、あるいは蒸着・スパッタリングにより薄膜を形成した後、ドライあるいはウエットエッチングにより製造することができる。規則正しく配置することは、薄膜プロセスを用いることで容易に実現できる。パッド間の間隔は任意に設定できるが、検出手段として光計測を行う場合、光検出の回折限界を考えると５００ｎｍ以上が好ましい。
　接着パッド１０２を平滑基板１０１上に形成した後、微粒子１０３と接着パッド１０２を結ぶ線状分子１０５を供給し、接着パッド１０２上に線状分子１０５を固定する。この際、平滑基板１０１上での非特異的吸着を防止する目的で、線状分子１０５を供給する前に、平滑基板１０１との接着力の強い材料を平滑基板１０１上に反応させる方法が有効である。例えば、シランカップリング剤等が利用できる。
　次に、予めプローブ分子１０４を表面に固定させた微粒子１０３を基板上に供給して、微粒子１０３を接着パッド１０２上に固定させることにより、核酸分析用デバイスを作製する。
　接着パッド１０２上に微粒子１０３を固定させる際、一つの接着パッド１０２に複数個の微粒子１０３が固定される可能性がある。複数個が固定されてしまうと、種類の違う核酸断片の情報が重なり合ってしまい、正確な核酸分析ができなくなってしまう。そのため、一つの接着パッド１０２には、１個の微粒子１０３を固定させねばならない。そこで、発明者らは、種々の条件での固定実験を繰り返し、鋭意検討した結果、接着パッド１０２の直径ｄが微粒子１０３の直径Ｄに比べて小さい、という条件が成り立てば、一つの接着パッド１０２に１個の微粒子１０３を固定できることを見出した。接着パッド１０２に比べて同等以上の大きさの微粒子１０３が固定されると、未反応の線状分子が固定された微粒子に覆い隠されてしまい、別の微粒子と反応できなくなってしまうものと説明される。１個の微粒子１０３にプローブ分子１０４を一分子固定するには、微粒子１０３の直径Ｄが２０ｎｍ以下であることが好ましいことから、接着パッド１０２の直径ｄは２０ｎｍ以下であることが好ましい。さらに、鋭意検討を続けた結果、微粒子１０３がその表面に電荷を有する場合には、微粒子間に静電的な反発力が働くため、接着パッド１０２の直径ｄが微粒子１０３の直径Ｄに比べて大きい場合にも接着パッドあたりの固定微粒子数が１個になることが判明した。したがって、微粒子１０３の表面電荷が小さく静電反発力が弱い場合には、接着パッド１０２の直径ｄが微粒子１０３の直径Ｄに比べて小さいことが好ましく、微粒子１０３の表面電荷が大きく静電反発力が強い場合には、接着パッド１０２の直径ｄは必ずしも微粒子１０３の直径Ｄよりも小さくなくても良いことが明らかとなった。
　本実施例の核酸分析デバイスから核酸試料に関する情報を検出するやり方にはいくつかの方式が考えられるが、感度や簡便性の観点から蛍光検出法を用いる方式が好ましい。まず、核酸分析デバイスに対して核酸試料を供給し、プローブ分子１０４に核酸試料を捕捉させる。次に、蛍光色素を有するヌクレオチドを供給し、プローブ分子１０４がＤＮＡプローブである場合には、核酸合成酵素を供給する。デバイス上で核酸伸長反応を起こし、伸長反応中に核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光測定を行う。この場合、ヌクレオチドの一種類を供給，未反応ヌクレオチドの洗浄，蛍光観察，違う種類のヌクレオチドの供給、以降を繰り返し行う、いわゆる逐次伸長反応方式は容易に実現できる。蛍光観察後に蛍光色素を消光するか、蛍光色素がリン酸部位に付いたヌクレオチドを用いることにより、連続的な反応を起こし、核酸試料の塩基配列情報を得ることができる。一方、４種類のヌクレオチドが各々異なる蛍光色素を有するものを供給し、洗浄することなく、連続的な核酸伸長反応を起こし、連続的に蛍光観察を行うことで、いわゆるリアルタイム反応方式を実現することもできる。この場合、蛍光色素がリン酸部位に付いたヌクレオチドを用いると、伸長反応後リン酸部位が切断されるため、消光することなく連続的に蛍光測定して核酸試料の塩基配列情報を得ることができる。
　微粒子として、可視域で局在プラズモンを励起することが可能な、金，銀，白金，アルミニウム等の直径が１００ｎｍ程度以下の微粒子を用いることにより、蛍光を増強して観察することができる。金微粒子の表面プラズモンによる蛍光増強の現象については、例えば、Nanotechnology, 2007, vol. 18, pp 044017-044021.（非特許文献４）に報告されている。ヌクレオチドに付いた蛍光色素の蛍光を増強させて測定することができ、信号／ノイズを高くすることができる。特に、プローブ分子１０４として核酸合成酵素を用いた場合には、局在プラズモンが作る増強場内に常に蛍光色素を入れることができ、安定した蛍光増強が得られ好ましい。
　微粒子として、半導体微粒子を用いた場合には、半導体微粒子を外部光源の光で励起しておき、取り込まれたヌクレオチドに付随する蛍光色素にその励起エネルギーを移動させることにより、個々の蛍光色素の蛍光を観察することもできる。この場合、励起光源は半導体微粒子のみを励起すればよく、一種類の光源でよい点で好ましい。
　微粒子として、高分子材料からなる微粒子を用いた場合には、微粒子の粒径を揃えることができ、粒径の大きさも数十ｎｍから数μｍまで幅広く選択することができる。また、高分子材料が有する官能基を足場に表面修飾を施すことで、微粒子表面に固定するプローブ分子１０４の固定反応のための官能基の導入量を均一にすることができるという点で好ましい。特に、プローブ分子１０４を一分子だけ微粒子表面に固定する場合、固定率の再現性が非常に高く、好ましい。
　核酸分析デバイスの製造方法の一例を、図２を用いて説明する。平滑な支持基体２０１上に電子線用ポジ型レジスト２０２をスピンコート法により塗工する。平滑な支持基体としては、ガラス基板，サファイア基板，シリコンウエハ等が用いられる。デバイスとしたときに、微粒子を配列した面と反対側の裏面より励起光を照射する必要がある場合には、光透過性に優れた石英基板やサファイア基板を用いればよい。電子線用ポジ型レジストとしては、例えば、ポリメチルメタクリレートやＺＥＰ－５２０Ａ（日本ゼオン社製）を挙げることができる。基板上のマーカーの位置を用いて位置合わせを行ったうえ電子線直描露光を行って、レジストにスルーホールを形成する。例えば、直径１５ｎｍのスルーホールを形成する。スルーホールは並行処理で解析できる核酸の分子数に依存するが、１μｍ程度のピッチで形成することが、製造上の簡便さ，歩留まりの高さ、及び並行処理で解析できる核酸の分子数を勘案すると適している。スルーホール形成領域も、並行処理で解析できる核酸の分子数によるが、検出装置側の位置精度や位置分解能にも大きく依存する。例えば、１μｍピッチで反応サイト（微粒子）を構成した場合、スルーホール形成領域を１mm×１mmとすると、１００万反応サイトを形成できる。スルーホールを形成後、接着用パッド２０３を構成する材料、例えば、金，チタン，ニッケル，アルミ、をスパッタリングで製膜する。平滑な支持基体としてガラス基板，サファイア基板を用い、接着用パッド材料として金，アルミ，ニッケルを用いる場合には、基板材料と接着用パッド材料との間に接着を補強する意味でチタンやクロムの薄膜を入れることが好ましい。次に、接着用パッド２０３に線状分子２０４を反応させる。接着用パッド２０３が金，チタン，アルミ，ニッケルの場合には、線状分子末端の官能基２０５としては、各々、スルホヒドニル基，リン酸基，リン酸基，チアゾール基を用いることが好ましい。線状分子の反対側の官能基２０６には、例えばビオチンを用いることができる。線状分子を接着用パッドと反応させた後、レジストを剥離する。レジストを剥離後、接着用パッドを形成した以外の平滑基板表面に非特異吸着防止処理を施す。蛍光色素付きヌクレオチドに対する吸着防止を実現するには負の電荷を帯びた官能基を有する非特異吸着防止用分子２０７でコートする。例えば、エポキシシランを表面にスピンコートで塗工し、加熱処理後、弱酸性溶液（ｐＨ５～ｐＨ６程度）で処理することにより、エポキシ基を開環させＯＨ基を表面に導入することで非特異吸着防止効果をもたらすことができる。
　微粒子２０８表面には、予めアビジン２０９を修飾しておくことが好ましい。金または白金微粒子を用いる場合には、アミノチオールを反応させた後、ビオチン－スクシンイミド（Pierce社製ＮＨＳ－Biotin）を反応させ、最後にストレプトアビジンを反応させることにより、アビジン修飾することが容易にできる。金または白金以外の金属微粒子を用いる場合には、酸素雰囲気中で加熱処理することにより表面を酸化処理した後、アミノシランを反応させ、次にビオチン－スクシンイミド（Pierce社製ＮＨＳ－Biotin）を反応させ、最後にストレプトアビジンを反応させる。これにより、金属微粒子表面をアビジン修飾することが容易にできる。微粒子として、半導体微粒子を用いる場合には、市販の微粒子を用いることができる。例えば、直径が１５～２０ｎｍである製品名「Ｑｄｏｔ(Ｒ)ストレプトアビジン標識」（インビトロジェン社製）を利用することができる。核酸捕捉プローブ２１０としてオリゴヌクレオチドを用いる場合には、末端をビオチン修飾して合成しておくことにより、容易に微粒子上に固定できる。核酸捕捉プローブ２１０として核酸合成酵素を用いる場合には、予め、RTS AviTag E. coliビオチン化キット（ロッシュアプライドサイエンス社製）を用いて発現系を組み、核酸合成酵素を作ることにより、容易に、核酸合成酵素を微粒子上に固定できる。
　核酸捕捉プローブを固定した微粒子を接着用パッドと反応させることにより、本実施例の核酸分析デバイスを製造することができる。
　本実施例では、プローブ分子を一分子だけ固定した核酸分析デバイスの製造方法の一例を、特に、微粒子一個につき一分子のプローブ分子を固定する方法を図３を用いて説明する。本実施例ではプローブ分子として核酸を用いた場合について記載するが、核酸合成酵素などの他のプローブ分子の場合にも同様に行うことができる。微粒子３０１の表面に核酸試料分子３０４を捕捉するための結合サイト３０２を結合させておく。例えば、結合サイトとしてストレプトアビジンを用いることができ、市販のストレプトアビジンコート微粒子（インビトロジェン社製）を微粒子として用いることができる。核酸試料分子３０４には予め、結合サイト３０３を修飾しておく。結合サイト３０３には微粒子３０１表面の結合サイト３０２と容易に結合するものを選択する。例えば、結合サイト３０２として前記のストレプトアビジンを用いた場合には結合サイト３０３としてビオチンを用いる。結合サイト３０３を末端修飾したプライマーを用い、核酸試料をテンプレートとしたＰＣＲ反応産物を合成することで核酸試料分子３０４の末端に結合サイト３０３を結合することは容易にできる。次に、微粒子３０１と核酸試料分子３０４を反応させることで、核酸試料分子３０４を微粒子３０１に捕捉する。微粒子３０１一個につき一分子の核酸試料分子３０４を固定するには、単位体積中の核酸試料分子３０４の分子数を微粒子３０１の個数よりも小さくすることが好ましい。微粒子３０１よりも核酸試料分子３０４が過剰にあると微粒子３０１一個当たりの捕捉核酸試料分子数が一分子よりも多くなる可能性が高いからである。発明者らが検討した結果では、微粒子３０１の数を核酸試料分子３０４の数よりも１０倍多くして反応させると、凡そ９０％の微粒子３０１には核酸試料分子３０４は捕捉されず、約９％の微粒子３０１には核酸試料分子３０４が一分子捕捉されていた。この結果は、ポアソン分布を仮定した場合の予測結果と良く一致している。したがって、核酸試料分子３０４を捕捉した微粒子３０１のみを捕集すれば、捕集した微粒子３０１のうち９０％以上は核酸試料分子３０４を一分子のみ捕捉した微粒子３０１となる。捕集方法として、例えば、磁気微粒子３０７に核酸試料分子３０４を結合させて磁石で捕集することができる。核酸試料分子３０４の末端配列と相補な配列を持ち末端に結合サイト３０６が修飾されたオリゴヌクレオチド３０５を用意し、結合サイト３０６と結合する結合サイト３０８を予め、磁気微粒子３０７の表面にコートしておく。核酸試料分子３０４をＰＣＲで増幅する際に用いたプライマー配列を利用してオリゴヌクレオチド３０５の配列を決めることができる。こうして作製した磁気微粒子３０７を用いることで核酸試料分子３０４を一分子を捕捉した微粒子３０１を９０％以上と高い割合で分離，収集することができる。磁気微粒子３０７から核酸捕捉微粒子３０１を単離するには、例えば、核酸試料分子３０４とオリゴヌクレオチド３０５の二本鎖を分離するディネイチャー処理（高温処理）を用いることができる。単離した核酸捕捉微粒子３０１は実施例１に記載した方法を用いることで、平滑基板上の所定の配置に固定することができ、本実施例の核酸試料分子３０４を一分子だけ固定した核酸分析デバイスを製造することができる。
　さらに、核酸試料分子を一分子だけ捕捉した微粒子の割合を高めるには、電気泳動法を用いることが有効である。すなわち、微粒子に捕捉された核酸の分子数により、微粒子上の電荷量が異なることを利用し、核酸を捕捉したままの状態で微粒子をゲル、例えばアガロース中を泳動させることで、電荷量すなわち捕捉された核酸分子数の違いにより泳動パターンを分離させる。核酸が捕捉されない微粒子は移動距離がもっとも短く、核酸分子が一分子だけ捕捉された微粒子が次に移動距離の短いところにバンドを形成する。したがって、このバンドを切り出すことで、核酸分子が一分子だけ捕捉された微粒子を純度高く、得ることができる。
　本実施例では、核酸分析デバイスを用いた核酸分析装置の好ましい構成の一例について図４を参照しながら説明する。
　本実施例の核酸分析装置は、核酸分析デバイスに対して、蛍光色素を有するヌクレオチド，核酸合成酵素、及び核酸試料を供給する手段と、核酸分析デバイスに光を照射する手段と、核酸分析デバイス上においてヌクレオチド，核酸合成酵素、及び核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する発光検出手段と、を備える。より具体的には、カバープレート４０１と検出窓４０２と溶液交換用口である注入口４０３と排出口４０４から構成される反応チャンバに前記のデバイス４０５を設置する。なお、カバープレート４０１と検出窓４０２の材質として、ＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）を使用する。また、検出窓４０２の厚さは０.１７mmとする。ＹＡＧレーザ光源（波長５３２ｎｍ，出力２０ｍＷ）４０７およびＹＡＧレーザ光源（波長３５５ｎｍ，出力２０ｍＷ）４０８から発振するレーザ光４０９および４１０を、レーザ光４０９のみをλ／４板４１１によって円偏光し、ダイクロイックミラー４１２（４１０ｎｍ以下を反射）によって、前記２つのレーザ光を同軸になるよう調整した後、レンズ４１３によって集光し、その後、プリズム４１４を介してデバイス４０５へ臨界角以上で照射する。
　以下、微粒子として直径５０ｎｍ程度の金微粒子を用いた場合を例にとり、説明する。この場合、レーザ照射により、デバイス４０５表面上に存在する金微粒子において局在型表面プラズモンが発生し、金微粒子に結合したＤＮＡプローブにより捕捉された標的物質の蛍光体は蛍光増強場内に存在することになる。蛍光体はレーザ光で励起され、その増強された蛍光の一部は検出窓４０２を介して出射される。また、検出窓４０２より出射される蛍光は、対物レンズ４１５（×６０，ＮＡ１.３５，作動距離０.１５mm）により平行光束とされ、光学フィルタ４１６により背景光及び励起光が遮断され、結像レンズ４１７により２次元ＣＣＤカメラ４１８上に結像される。
　逐次反応方式の場合には、蛍光色素付きヌクレオチドとして、P.N.A.S. 2006, vol. 103, pp 19635-19640（非特許文献５）に開示されているような、リボースの３′ＯＨの位置に３′－Ｏ－アリル基を保護基として入れ、また、ピリミジンの５位の位置にあるいはプリンの７位の位置にアリル基を介して蛍光色素と結びつけたものが使用できる。アリル基は光照射（例えば波長３５５ｎｍ）あるいはパラジウムと接触することで切断されるため、色素の消光と伸長反応の制御を同時に達成することができる。逐次反応でも、未反応のヌクレオチドを洗浄で除去する必要はない。さらに、洗浄工程が必要ないことからリアルタイムで伸長反応を計測することも可能である。この場合には、前記ヌクレオチドにおいて、リボースの３′ＯＨの位置に３′－Ｏ－アリル基を保護基として入れる必要は無く、光照射（例えば波長３５５ｎｍ）で切断可能な官能基を介して色素と結びついているヌクレオチドを用いれば良い。
　微粒子として、半導体微粒子を用いた場合にも、上述の核酸分析装置の例は適用可能である。例えば、半導体微粒子としてＱｄｏｔ(Ｒ)565 conjugate（インビトロジェン社製）を用いると、ＹＡＧレーザ光源（波長５３２ｎｍ，出力２０ｍＷ）４０７で十分に励起できる。この励起エネルギーは５３２ｎｍの光では励起されないアレクサ６３３（インビトロジェン社製）へ移動することにより蛍光を発するようになる。つまり、未反応のヌクレオチドに付随する色素は励起されることはなく、ＤＮＡプローブに捕捉され半導体微粒子に近接しエネルギー移動が起きてはじめて発光するので、捕捉されたヌクレオチドを蛍光測定で識別することが可能である。
　上記のように、本実施例の核酸分析デバイスを用いて核酸分析装置を組上げることにより、洗浄工程を入れることなく、解析時間の短縮化，デバイス及び分析装置の簡便化が図れ、逐次反応方式のみならず、リアルタイムで塩基の伸長反応を計測することも可能となり、従来技術に対して大幅なスループットの改善が図れる。
１０１　平滑基板
１０２　接着パッド
１０３，２０８，３０１　微粒子
１０４　プローブ分子
１０５，２０４　線状分子
１０６，１０７，２０５，２０６　線状分子末端の官能基
２０１　平滑な支持基体
２０２　電子線用ポジ型レジスト
２０３　接着用パッド
２０７　非特異吸着防止用分子
２０９　アビジン
２１０　核酸捕捉プローブ
３０２，３０３，３０６，３０８　結合サイト
３０４　核酸試料分子
３０５　オリゴヌクレオチド
３０７　磁気微粒子
４０１　カバープレート
４０２　検出窓
４０３　注入口
４０４　排出口
４０５　デバイス
４０６　流路
４０７，４０８　ＹＡＧレーザ光源
４０９，４１０　レーザ光
４１１　λ／４板
４１２　ダイクロイックミラー
４１３　レンズ
４１４　プリズム
４１５　対物レンズ
４１６　光学フィルタ
４１７　結像レンズ
４１８　２次元ＣＣＤカメラ

Claims (18)

  1. 　検出対象の核酸を捕捉できるプローブ分子を有する微粒子を基板上に規則的に固定した核酸分析用デバイスであって、
    　前記基板上の前記微粒子の固定位置に接着用パッドを備え、前記微粒子と前記接着用パッドとが化学結合を介して結合しているデバイス。
  2. 　検出対象の核酸を捕捉できるプローブ分子を有する微粒子を基板上に規則的に固定した核酸分析用デバイスであって、
    　前記基板上の前記微粒子の固定位置に接着用パッドを備え、前記微粒子と前記接着用パッドとが化学結合を介して結合しており、前記接着用パッドの直径が前記微粒子の直径以下の大きさであるデバイス。
  3. 　検出対象の核酸を捕捉できるプローブ分子を有する微粒子を基板上に規則的に固定した核酸分析用デバイスであって、
    　前記微粒子は表面に電荷を帯びており、前記基板上の前記微粒子の固定位置に接着用パッドを備え、前記微粒子と前記接着用パッドとが化学結合を介して結合しており、前記接着用パッドの直径が前記微粒子の直径と同等あるいは前記微粒子の直径以上の大きさであるデバイス。
  4. 　請求項１あるいは請求項２あるいは請求項３記載の核酸分析用デバイスにおいて、
    　前記微粒子１個に対して、前記プローブ分子が一分子固定されていることを特徴とするデバイス。
  5. 　請求項１あるいは請求項２あるいは請求項３記載の核酸分析用デバイスにおいて、
    　前記プローブ分子が、核酸、又は核酸合成酵素であることを特徴とするデバイス。
  6. 　請求項１あるいは請求項２あるいは請求項３記載の核酸分析用デバイスにおいて、
    　前記微粒子が、半導体、又は金属から選ばれる材料からなることを特徴とするデバイス。
  7. 　請求項１あるいは請求項２あるいは請求項３記載の核酸分析用デバイスにおいて、
    　前記微粒子が、高分子材料からなることを特徴とするデバイス。
  8. 　請求項１あるいは請求項２あるいは請求項３記載の核酸分析用デバイスにおいて、
    　前記接着用パッドが、金，チタン，ニッケル、又はアルミから選ばれる材料からなることを特徴とするデバイス。
  9. 　検出対象の核酸を捕捉できる核酸分子を有する微粒子を基板上に規則的に固定した核酸分析用デバイスと、
    　前記核酸分析デバイスに対して、蛍光色素を有するヌクレオチド、及び核酸試料を供給する手段と、
    　前記核酸分析デバイスに光を照射する手段と、
    　前記核酸分析デバイス上において前記ヌクレオチド，前記核酸合成酵素、及び前記核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する発光検出手段と、を備え、
    　前記核酸試料の塩基配列情報を取得する核酸分析装置であって、
    　前記基板上の前記微粒子の固定位置に接着用パッドを備え、前記微粒子と前記接着用パッドとが化学結合を介して結合している装置。
  10. 　検出対象の核酸を捕捉できるプローブ分子を有する微粒子を基板上に規則的に固定した核酸分析用デバイスと、
    　前記核酸分析デバイスに対して、蛍光色素を有するヌクレオチド、及び核酸試料を供給する手段と、
    　前記核酸分析デバイスに光を照射する手段と、
    　前記核酸分析デバイス上において前記ヌクレオチド，前記核酸合成酵素、及び前記核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する発光検出手段と、を備え、
    　前記核酸試料の塩基配列情報を取得する核酸分析装置であって、
    　前記基板上の前記微粒子の固定位置に接着用パッドを備え、前記微粒子と前記接着用パッドとが化学結合を介して結合しており、前記接着用パッドの直径が前記微粒子の直径以下の大きさである装置。
  11. 　検出対象の核酸を捕捉できる核酸分子を有する微粒子を基板上に規則的に固定した核酸分析用デバイスと、
    　前記核酸分析デバイスに対して、蛍光色素を有するヌクレオチド、及び核酸試料を供給する手段と、
    　前記核酸分析デバイスに光を照射する手段と、
    　前記核酸分析デバイス上において前記ヌクレオチド，前記核酸合成酵素、及び前記核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する発光検出手段と、を備え、
    　前記核酸試料の塩基配列情報を取得する核酸分析装置であって、
    　前記微粒子は表面に電荷を帯びており、前記基板上の前記微粒子の固定位置に接着用パッドを備え、前記微粒子と前記接着用パッドとが化学結合を介して結合しており、前記接着用パッドの直径が前記微粒子の直径以上の大きさである装置。
  12. 　請求項９あるいは請求項１０あるいは請求項１１記載の核酸分析装置において、
    　前記微粒子１個に対して、前記プローブ分子が一分子固定されていることを特徴とする装置。
  13. 　請求項９あるいは請求項１０あるいは請求項１１記載の核酸分析装置において、
    　前記プローブ分子が、核酸、又は核酸合成酵素であることを特徴とする装置。
  14. 　請求項９あるいは請求項１０あるいは請求項１１記載の核酸分析装置において、
    　前記微粒子が、半導体、又は金属から選ばれる材料からなることを特徴とする装置。
  15. 　請求項９あるいは請求項１０あるいは請求項１１記載の核酸分析装置において、
    　前記微粒子が、高分子材料からなることを特徴とする装置。
  16. 　請求項９あるいは請求項１０あるいは請求項１１記載の核酸分析装置において、
    　前記接着用パッドが、金，チタン，ニッケル、又はアルミから選ばれる材料からなることを特徴とする装置。
  17. 　検出対象の核酸を捕捉できるプローブ分子を有する微粒子を基板上に規則的に固定した核酸分析用デバイスの製造方法において、予め前記プローブ分子を固定しておいた前記微粒子を、接着用パッドを備えた基板上に供給することで、前記基板上の所定の位置に前記微粒子を固定することで製造することを特徴とする、核酸分析用デバイスの製造方法。
  18. 　請求項１７記載の核酸分析用デバイスの製造方法において、
    　前記微粒子１個に対して、前記プローブ分子が一分子固定されていることを特徴とする核酸分析用デバイスの製造方法。
PCT/JP2010/000214 2009-01-30 2010-01-18 核酸分析デバイス、及び核酸分析装置 WO2010087121A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13/147,117 US20110281320A1 (en) 2009-01-30 2010-01-18 Device for analyzing nucleic acids and apparatus for analyzing nucleic acids

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2009018936A JP5260339B2 (ja) 2009-01-30 2009-01-30 核酸分析デバイス、及び核酸分析装置
JP2009-018936 2009-01-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2010087121A1 true WO2010087121A1 (ja) 2010-08-05

Family

ID=42395387

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2010/000214 WO2010087121A1 (ja) 2009-01-30 2010-01-18 核酸分析デバイス、及び核酸分析装置

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20110281320A1 (ja)
JP (1) JP5260339B2 (ja)
WO (1) WO2010087121A1 (ja)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012077756A1 (ja) * 2010-12-08 2012-06-14 公立大学法人大阪府立大学 金属ナノ粒子集積構造体を利用した被検出物質の検出装置および方法
WO2013024821A1 (ja) * 2011-08-12 2013-02-21 国立大学法人筑波大学 並列反応用懸濁液、並列反応方法およびスクリーニング方法
WO2013051651A1 (ja) 2011-10-05 2013-04-11 株式会社日立ハイテクノロジーズ 生体分子分析方法及び生体分子分析装置
US20130338041A1 (en) * 2011-03-15 2013-12-19 Hitachi High-Technologies Corporation Nucleic acid analysis device and nucleic acid analyzer
WO2014021020A1 (ja) * 2012-08-03 2014-02-06 株式会社 日立ハイテクノロジーズ 免疫分析方法及び免疫分析装置
EP2735618A4 (en) * 2011-07-19 2015-01-21 Hitachi High Tech Corp NUCLEIC ACID ANALYSIS METHOD AND ANALYSIS DEVICE

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8945938B2 (en) * 2009-10-30 2015-02-03 Medtech Detect, Llc Composition, device and method for colorimetric detection of an analyte using imprinted polymers and photochromic switch molecules
JP5309092B2 (ja) * 2010-07-20 2013-10-09 株式会社日立ハイテクノロジーズ 核酸分析用デバイス，核酸分析装置、及び核酸分析用デバイスの製造方法
JP5372876B2 (ja) * 2010-09-10 2013-12-18 株式会社日立ハイテクノロジーズ 核酸分析デバイス，核酸分析装置、及び核酸分析方法
JP5651485B2 (ja) * 2011-01-14 2015-01-14 株式会社日立ハイテクノロジーズ 核酸分析装置
JP2013029369A (ja) * 2011-07-27 2013-02-07 Konica Minolta Holdings Inc イオン性官能基で修飾された局在場光センサーチップおよびリガンド担持荷電微粒子を使用するアナライトの検出方法
AU2016200047A1 (en) * 2015-01-07 2016-07-21 Personal Genomics, Inc. Oriented Loading Systems And Method For Orienting A Particle Loaded In A Well
JP6727062B2 (ja) 2015-09-30 2020-07-22 シスメックス株式会社 検出方法および検出装置
CN112345799B (zh) * 2020-11-04 2023-11-14 浙江师范大学 一种基于单分子电学检测的pH测量方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10160737A (ja) * 1996-12-03 1998-06-19 Dainippon Printing Co Ltd 光学的分析装置用測定チップ及びその製造方法
JP2005077284A (ja) * 2003-09-01 2005-03-24 Seiko Epson Corp 粒子アレイの製造装置及び製造方法と標的物質の検出方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3380744B2 (ja) * 1998-05-19 2003-02-24 株式会社日立製作所 センサおよびこれを利用した測定装置
US20050250094A1 (en) * 2003-05-30 2005-11-10 Nanosphere, Inc. Method for detecting analytes based on evanescent illumination and scatter-based detection of nanoparticle probe complexes
JP2005219152A (ja) * 2004-02-04 2005-08-18 Ebara Corp ドレッサおよびその製造方法
EP1870478A1 (en) * 2006-06-20 2007-12-26 Hitachi, Ltd. Biosensor element and method for manufacturing the same
JP5001019B2 (ja) * 2007-02-02 2012-08-15 株式会社日立ハイテクノロジーズ 生体分子検出素子、生体分子検出素子の製造方法及び生体分子検出方法
KR100891096B1 (ko) * 2007-02-13 2009-03-31 삼성전자주식회사 올리고머 프로브 어레이 및 이의 제조 방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10160737A (ja) * 1996-12-03 1998-06-19 Dainippon Printing Co Ltd 光学的分析装置用測定チップ及びその製造方法
JP2005077284A (ja) * 2003-09-01 2005-03-24 Seiko Epson Corp 粒子アレイの製造装置及び製造方法と標的物質の検出方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TIMOTHY D. HARRIS ET AL.: "Single-Molecule DNA Sequencing of a Viral Genome", SCIENCE, vol. 320, 4 April 2008 (2008-04-04), pages 106 - 109 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012077756A1 (ja) * 2010-12-08 2012-06-14 公立大学法人大阪府立大学 金属ナノ粒子集積構造体を利用した被検出物質の検出装置および方法
US9797842B2 (en) 2010-12-08 2017-10-24 Osaka Prefecture University Public Corporation Device and method utilizing a metallic nanoparticle assembly structure for detecting a target substance
US20130338041A1 (en) * 2011-03-15 2013-12-19 Hitachi High-Technologies Corporation Nucleic acid analysis device and nucleic acid analyzer
US9957562B2 (en) * 2011-03-15 2018-05-01 Hitachi High-Technologies Corporation Nucleic acid analysis device and nucleic acid analyzer
EP2735618A4 (en) * 2011-07-19 2015-01-21 Hitachi High Tech Corp NUCLEIC ACID ANALYSIS METHOD AND ANALYSIS DEVICE
WO2013024821A1 (ja) * 2011-08-12 2013-02-21 国立大学法人筑波大学 並列反応用懸濁液、並列反応方法およびスクリーニング方法
WO2013051651A1 (ja) 2011-10-05 2013-04-11 株式会社日立ハイテクノロジーズ 生体分子分析方法及び生体分子分析装置
US20140295430A1 (en) * 2011-10-05 2014-10-02 Hitachi High-Technologies Corporation Method for analyzing biomolecules and biomolecule analyzer
US9822399B2 (en) * 2011-10-05 2017-11-21 Hitachi High-Technologies Corporation Method for analyzing biomolecules and biomolecule analyzer
WO2014021020A1 (ja) * 2012-08-03 2014-02-06 株式会社 日立ハイテクノロジーズ 免疫分析方法及び免疫分析装置
JP2014032101A (ja) * 2012-08-03 2014-02-20 Hitachi High-Technologies Corp 免疫分析方法及び免疫分析装置

Also Published As

Publication number Publication date
US20110281320A1 (en) 2011-11-17
JP2010172271A (ja) 2010-08-12
JP5260339B2 (ja) 2013-08-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5260339B2 (ja) 核酸分析デバイス、及び核酸分析装置
JP5816291B2 (ja) 生体分子分析方法及び生体分子分析装置
JP5663008B2 (ja) 核酸分析デバイスの製造方法
JP5587816B2 (ja) 核酸分析デバイス、及び核酸分析装置
WO2005043109A2 (en) Sers diagnostic platforms, methods and systems including microarrays, biosensors and biochips
JP5822929B2 (ja) 核酸分析装置
JP4997181B2 (ja) 核酸分析デバイス及び核酸分析装置
JP5635130B2 (ja) 単分子プローブ核酸付き微粒子及びその製造方法、並びに核酸分析方法
JP5309092B2 (ja) 核酸分析用デバイス，核酸分析装置、及び核酸分析用デバイスの製造方法
JP5097495B2 (ja) 生体分子検出素子及び生体分子検出素子の製造方法
JP5651485B2 (ja) 核酸分析装置
JP5026359B2 (ja) 核酸分析デバイス、核酸分析装置及び核酸分析方法
JP2007178439A (ja) 生化学反応体の検出方法とバイオチップ
JP2005017233A (ja) 生化学反応体の検出方法とバイオチップ
JP2003329676A (ja) 生化学検体の検出方法と検出チップ
JP4022400B2 (ja) 生化学検体の検出方法
JP2012058114A (ja) 核酸分析デバイス，核酸分析装置、及び核酸分析方法
JP4017420B2 (ja) 生体成分検出方法
JP2003202340A (ja) 生化学検体の検出方法と検出チップ

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10735593

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13147117

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 10735593

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1