WO2010082611A1 - 蛍光寿命測定装置、蛍光寿命測定方法及びプログラム - Google Patents

蛍光寿命測定装置、蛍光寿命測定方法及びプログラム Download PDF

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afterglow
fluorescence
imaging
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中尾 勇
玉村 好司
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ソニー株式会社
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    • G02B21/367Control or image processing arrangements for digital or video microscopes providing an output produced by processing a plurality of individual source images, e.g. image tiling, montage, composite images, depth sectioning, image comparison

Definitions

  • the present invention relates to a fluorescence lifetime measuring apparatus, a fluorescence lifetime measuring method, and a program, and is suitable for a field using a technique for detecting the lifetime of light emitted by irradiation with excitation light.
  • the fluorescence lifetime measuring apparatus is large as a whole because the photomultiplier tube and the streak camera are relatively large.
  • a light source that emits pulsed excitation light is used, and it is necessary to drive a photomultiplier tube or a streak camera in accordance with the irradiation timing from the light source.
  • the process of adjusting tubes and streak cameras was complicated and took a long time.
  • the present invention has been made in consideration of the above points, and intends to propose a fluorescence lifetime measuring apparatus, a fluorescence lifetime measuring method, and a program capable of acquiring the fluorescence lifetime with a simple configuration.
  • the present invention provides a fluorescence lifetime measuring apparatus, which is arranged on a stage that moves a stage on which a phosphor to be measured is arranged, and a stage that is moved at a constant speed by the moving means.
  • Fluorescence lifetime calculation means for detecting the elapsed time and afterglow intensity at the light position and calculating the fluorescence lifetime is provided.
  • the present invention also relates to a fluorescence lifetime measurement method, which is arranged on a movement control step for moving a stage on which a phosphor to be measured is arranged, and a stage moved at a constant speed by the control in the movement control step.
  • An elapsed time and an afterglow intensity at the position are detected, and a fluorescence lifetime calculation step for calculating the fluorescence lifetime is performed.
  • the present invention is a program that the stage on which the phosphor to be measured is arranged should be moved with respect to the movement control means, and the movement control means is moved at a constant speed with respect to the irradiation means.
  • the excitation light should be irradiated to the phosphor arranged on the stage, the afterglow of the fluorescence emitted by the excitation light should be imaged to the imaging unit, and the imaging unit was imaged by the computing unit Using the image, the elapsed time and the afterglow intensity at the afterglow position to be targeted are detected from the fluorescence position, and the calculation of the fluorescence lifetime is executed.
  • the present invention captures the fluorescence lifetime as an afterglow image in the moving direction, a change in the intensity of light that occurs in a short time can be obtained with a general camera without using a photomultiplier tube or a streak camera. As a result, the fluorescence lifetime can be simplified.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing a configuration of a fluorescence lifetime measuring apparatus.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing the structure of the disk stage.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating a configuration example of the optical system.
  • FIG. 4 is a diagram schematically showing the beam shape on the light receiving surface.
  • FIG. 5 is a block diagram illustrating the configuration of the measurement unit.
  • FIG. 6 is a photograph showing an imaging result at the time of excitation light irradiation.
  • FIG. 7 is a graph showing temporal changes in afterglow intensity.
  • FIG. 8 is a flowchart showing a fluorescence lifetime measurement processing procedure.
  • Embodiment> [1-1. Configuration of fluorescence lifetime measuring device] [1-2. Specific configuration of measurement unit] [1-3. Fluorescence lifetime measurement process] [1-4. Effect] ⁇ 2. Other embodiments> ⁇ 1.
  • Embodiment> A fluorescence lifetime measuring apparatus will be described as an embodiment for carrying out the invention.
  • the fluorescence lifetime measuring apparatus 1 includes a disk-shaped stage (hereinafter also referred to as a disk stage) 2, a laser light source 3, an optical system 4, a focus control unit 5, an imaging unit 6, and a measuring unit 7. .
  • the disc stage 2 is detachably supported with respect to the rotation shaft SA through a through hole provided at the center thereof.
  • the structure of the disk stage 2 is shown in FIG.
  • the disk stage 2 has a layer structure in which a reflective film 2B and a fluorescent film 2C are sequentially formed on one surface of a disk substrate 2A.
  • the disk substrate 2A is formed of a material that is transparent to light that excites the fluorescent film 2C (hereinafter also referred to as excitation light), and has a thickness of, for example, about 1.3 [mm].
  • the reflective film 2B is made of a material capable of generating a predetermined amount of interface reflection, and is uniformly formed with a thickness of about 100 [nm], for example.
  • a specific example is titanium oxide.
  • the fluorescent film 2C is made of an organic or inorganic material to be measured for fluorescence lifetime, and is uniformly formed with a thickness of, for example, about 100 [nm].
  • the laser light source 3 is opposed to the surface of the disk substrate 2A opposite to the surface on which the reflective film 2B is formed, and irradiates excitation light to the fluorescent film 2C.
  • a laser light source 3 that emits excitation light of a wavelength 405 [nm], an output 1 [mW], and a transverse mode TEM00 is used.
  • the optical system 4 condenses the excitation light emitted from the laser light source 3 on the interface between the disk substrate 2A and the reflection film 2B, and guides the reflected light reflected at the interface to the focus control unit 5. .
  • a specific configuration example of the optical system 4 is shown in FIG.
  • the optical system 4 guides the laser light emitted from the laser light source 3 as linearly polarized light parallel to the paper surface to the polarization beam splitter 12 as parallel light by the collimator lens 11.
  • the optical system 4 converts the laser beam transmitted through the polarizing beam splitter 12 into circularly polarized light by the quarter wavelength plate 13 and condenses it at the interface between the disk substrate 2A and the reflective film 2B by the objective lens 14. Yes.
  • excitation light reaches the fluorescent film 2C through the reflection film 2B, the fluorescent substance to be measured formed as the fluorescent film 2C is excited and emits fluorescence in a spatially isotropic manner.
  • the optical system 4 guides the reflected light reflected at the interface between the disk substrate 2A and the reflective film 2B to the quarter-wave plate 13 through the objective lens 14, and the quarter-wave plate 13 converts the reflected light into s-polarized light. To do.
  • the optical system 4 reflects the reflected light, which is s-polarized light, in the 90 [°] direction by the polarization beam splitter 12 and guides it to the focus control unit 5 (FIG. 1) via the condenser lens 15 and the cylindrical lens 16. It is made like that.
  • the focus control unit 5 includes a light receiving unit that receives light guided from the optical system 4.
  • the shape of the light guided from the optical system 4 on the light receiving surface in the light receiving section is shown in FIG.
  • the focal point is at the interface between the disk substrate 2A and the reflective film 2B, a circular shape indicated by a broken line is obtained.
  • the focus control unit 5 generates a focus control signal using a signal obtained from the light receiving unit as a photoelectric conversion result in each of the four areas. Specifically, taking FIG. 4 as an example, signals in the areas A to D are acquired, and a focus control signal is generated by calculation of (A + D) ⁇ (B + C).
  • the focus control unit 5 controls the actuator that can move in the optical axis direction in accordance with the focus control signal, so that the objective lens 14 (FIG. 3) provided in the actuator is moved between the disk substrate 2A and the reflective film 2B.
  • the focus is made to follow the interface.
  • the imaging unit 6 is provided on the side of the disk stage 2 facing the fluorescent film 2C, images fluorescence emitted from the fluorescent film 2C, and gives the imaging result to the measurement unit 7 as imaging data.
  • the measuring unit 7 calculates the fluorescence lifetime based on the imaging data given from the imaging unit 6. [1-2. Specific configuration of measurement unit] Next, the measurement unit 7 will be specifically described.
  • FIG. 5 shows a schematic configuration of the measurement unit 7.
  • the measurement unit 7 is configured by connecting various hardware via a bus 22 to a CPU (Central Processing Unit) 21.
  • a CPU Central Processing Unit
  • ROM Read Only Memory
  • RAM Random Access Memory
  • an input unit 26, a display unit 27, and a storage unit 28 for inputting commands according to user operations are also employed.
  • the ROM 23 stores a program for executing a process for measuring the fluorescence lifetime (hereinafter also referred to as a fluorescence lifetime measurement program).
  • the interface 25 is connected to the spindle motor SM (FIG. 1) attached to the rotation shaft SA, the laser light source 3, the focus control unit 5, and the imaging unit 6 (FIG. 1).
  • the CPU 21 When the instruction for measuring the fluorescence lifetime is given from the operation input unit, the CPU 21 develops the fluorescence lifetime measurement program stored in the ROM 23 in the RAM 24, and serves as the drive unit 31, the preprocessing unit 32, and the fluorescence lifetime calculation unit 33. Function.
  • the drive unit 31 drives the laser light source 3 so as to irradiate the excitation light at a predetermined period, and drives the focus control unit 5 so that the focal point is located at the interface between the disk substrate 2A and the reflective film 2B.
  • the drive unit 31 drives the spindle motor SM so as to rotate at a constant linear velocity, and drives the imaging unit 6 so as to capture images at a predetermined cycle.
  • the imaging unit 6 shows an imaging result when excitation light is instantaneously irradiated to a predetermined position on the interface between the fluorescent disk substrate 2A and the reflective film 2B at a position to be irradiated on the disk stage 2 in a rotating state.
  • the imaging unit 6 has a 14 [bit] having a lens with a focal length of 6.33 to 19 [mm] and a 1 / 2.5 inch CCD (Charge Coupled Device) having an 8.1 million pixel interlace type. A digital still camera was used.
  • the fluorescent film 2C in the rotating disk stage 2 is momentarily excited at the irradiation position, the fluorescence emitted at the irradiation position appears as afterglow in the rotation direction.
  • the preprocessing unit 32 has an end position (in FIG. 6, a black circle portion closest to the irradiation position in FIG. 6) in the image indicated by the imaging data supplied from the imaging unit 6. The intensity ratio of the black circle portion farthest from the irradiation position is calculated. Then, the preprocessing unit 32 adjusts the number of rotations of the disk stage 2 or the angle of view of the imaging unit 6 via the interface 25 so that this ratio falls within the specified range. As a result, afterglow from the irradiation position to a position having a target intensity (for example, a position immediately before disappearance) is stored in the imaging range.
  • a target intensity for example, a position immediately before disappearance
  • the fluorescence lifetime calculating unit 33 sets the intensity and elapsed time from the front end position to the end position of afterglow at a predetermined interval (in FIG. 6, a black circle portion ) And a table showing the temporal change of afterglow (hereinafter also referred to as afterglow change table) is created from the calculation result.
  • the afterglow change table in FIG. 6 is shown in FIG. Incidentally, the elapsed time can be obtained from the position information of afterglow, the radius of the disk stage, and the rotational speed.
  • the fluorescence lifetime calculation part 33 is the following formula Based on the above, the fluorescence lifetime is calculated.
  • I (t) is the afterglow intensity at the position to be noticed (time change of the afterglow intensity)
  • I 0 is the intensity at the irradiation position
  • t is the position to be noticed.
  • the elapsed time at “ ⁇ ” is the fluorescence lifetime.
  • ( ⁇ t / ⁇ )” means the slope of the afterglow change table (FIG. 6).
  • the fluorescent film 2C (FIG. 2) formed on the disk stage 2 is not limited to a single excited state but may have a plurality of excited states. In the case of the fluorescent film 2C having a plurality of excited states, the afterglow change table does not exhibit the linear state shown in FIG.
  • the fluorescence lifetime calculation unit 33 determines, as the positions to which attention should be paid, from the slopes in the afterglow change table, each of which exhibits a linear portion or a curve with different inclinations, thereby having a plurality of excited states.
  • the fluorescence lifetime of 2C can be calculated. Note that the fluorescence lifetime of the fluorescent film 2C having the slope shown in FIG. 6 is 1.8 [msec] when the linear velocity of the disk stage 2 during imaging shown in FIG. 5 is 1 [m / sec]. Calculated. [1-3.
  • the fluorescence lifetime measurement processing procedure of the measurement unit 7 will be described with reference to the flowchart shown in FIG. That is, when an instruction to measure the fluorescence lifetime is given, the CPU 21 starts this fluorescence lifetime measurement processing procedure and proceeds to the first step SP1.
  • the CPU 21 drives the spindle motor SM to rotate the disk stage 2 at a constant linear velocity, and proceeds to the second step SP2.
  • the CPU 21 drives the laser light source 3 to irradiate the disk stage 2 with excitation light at a predetermined period, and proceeds to the third step SP3.
  • the CPU 21 drives the focus control unit 4 to position the focal point at the interface between the disk substrate 2A and the reflective film 2B, and proceeds to the fourth step SP4.
  • the CPU 21 drives the imaging unit 6 to start capturing an image at the time when the excitation light is irradiated onto the disk stage 2, and proceeds to the fifth step SP5.
  • the CPU 21 stores the afterglow from the irradiation position to the position having the target intensity (for example, the position immediately before the disappearance) in the imaging range in the image captured in the fourth step SP4. The process proceeds to 6 step SP6.
  • the rotational speed of the disk stage 2 or the angle of view of the imaging unit 6 is set so that the ratio of the intensity at the end position to the front end position of the fluorescence afterglow emitted at the irradiation position is within a specified range. Is adjusted.
  • the CPU 21 calculates the intensity and elapsed time from the front end position to the end position of afterglow at predetermined intervals, and proceeds to the seventh step SP7.
  • the CPU 21 creates an afterglow change table from the result calculated in the sixth step SP6, and proceeds to the eighth step SP8.
  • the CPU 21 calculates the fluorescence lifetime based on the equation (1), and then ends this fluorescence lifetime measurement processing procedure.
  • the CPU 21 fluoresces for each of the slopes shown in the afterglow change table for each linear part or curve having a different slope. The service life is calculated. [1-4. Effect]
  • the fluorescence lifetime measuring apparatus 1 irradiates the phosphor disposed on the rotating disk stage 2 with excitation light, and the afterglow of fluorescence emitted by the excitation light is imaged by the imaging unit 6.
  • the fluorescence lifetime measuring apparatus 1 detects the elapsed time and the afterglow intensity at the afterglow position to be targeted from the fluorescence position, and calculates the fluorescence lifetime using the afterglow intensity and the elapsed time. Since the fluorescence lifetime measuring apparatus 1 captures the fluorescence lifetime as an afterglow image in the rotation direction, it is possible to obtain a change in the intensity of light that occurs in a short time without using a streak camera. As a result, the fluorescence lifetime can be simplified. It can be configured. In addition, the fluorescence lifetime measuring apparatus 1 instantaneously irradiates the phosphor disposed on the rotating disk stage 2 with a laser beam in a predetermined cycle unit.
  • the configuration of the fluorescence lifetime measuring apparatus 1 can be simplified as compared with the case of using pulsed laser light.
  • the physical property change of the phosphor due to the excitation light can be suppressed as compared with the case where the pulse laser beam is continuously irradiated during the measurement, and as a result, the fluorescence lifetime of the phosphor can be measured correctly.
  • the fluorescence lifetime measuring apparatus 1 calculates the fluorescence lifetime for each portion that exhibits a linear portion or a curve having a different slope.
  • the fluorescence lifetime measuring apparatus 1 can calculate the fluorescence lifetime of the phosphor even when the phosphor has a plurality of excited states. According to the above configuration, the fluorescence lifetime measuring apparatus 1 obtains a change in the intensity of light that occurs in a short time without using a streak camera by capturing the fluorescence lifetime as an afterglow image in the rotation direction. As a result, the fluorescence lifetime can be simplified. ⁇ 2. Other embodiments> In the above-described embodiment, before calculating the fluorescence lifetime, the rotational speed of the disk stage 2 or the imaging unit 6 is set so that the ratio of the intensity at the end position to the tip position of the afterglow to be imaged is within the specified range. The angle of view has been adjusted.
  • the angle of view of the imaging unit 6 may be fixed so that the entire disk stage 2 is within the imaging range.
  • the fluorescence lifetime can be calculated in the same manner as in the above-described embodiment, while maintaining the ratio between the fluorescence intensity and the afterglow intensity in the imaging range without making the above adjustment.
  • the above-described embodiment in which the rotational speed of the disk stage 2 or the angle of view of the imaging unit 6 is adjusted is preferable.
  • the spindle motor SM that is rotated is applied as the moving means that moves the stage on which the phosphor to be measured is arranged.
  • the moving means is not limited to one that rotates and moves.
  • the phosphor to be measured is disposed as a film on the entire disk stage 2.
  • the arrangement position is not limited to the entire stage, and may be arranged in a form other than the film.
  • the present invention can be used in the bio-industry such as genetic experiments, creation of medicines or patient follow-up.
  • SYMBOLS 1 Fluorescence lifetime measuring apparatus, 2 ... Disc stage, 2A ... Disc substrate, 2B ... Reflective film, 2C ... Fluorescent film, 3 ... Laser light source, 4 ... Optical system, 5 ... Focus control part , 6 ... Imaging unit, 7 ... Measuring unit, 21 ... CPU, 22 ... Bus, 23 ... ROM, 24 ... RAM, 31 ... Drive unit, 32 ... Pre-processing unit, 33 ... Fluorescence Life calculator, SM ... spindle motor, SA ... rotary shaft

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Abstract

 簡易な構成で蛍光寿命を取得し得る蛍光寿命測定装置、蛍光寿命測定方法及びプログラムを提案する。  測定対象の蛍光体が配されるステージを移動させ、一定の速度で移動されるステージに配される蛍光体に対して励起光を照射し、励起光により発する蛍光の残光を撮像し、撮像された画像を用いて、対象とすべき残光位置における蛍光位置からの経過時間と、残光強度とを検出し、蛍光寿命を算出する。

Description

蛍光寿命測定装置、蛍光寿命測定方法及びプログラム
 本発明は蛍光寿命測定装置、蛍光寿命測定方法及びプログラムに関し、励起光の照射により発する光の寿命を検出する技術を用いる分野に好適なものである。
 従来、セルに保持される試料に対してパルス状の励起光を照射し、該励起光により発する蛍光の時間波形を光電子増倍管やストリークカメラを用いて測定し、当該測定結果から蛍光寿命を得る蛍光寿命測定装置が提案されている(例えば特許文献1参照)。
特開2001−349833公報
 ところがかかる蛍光寿命測定装置は、光電子増倍管やストリークカメラ自体が比較的大型なものであるため全体として大型となる。またこの蛍光寿命測定装置では、パルス状の励起光を照射する光源が用いれられ、該光源からの照射タイミングに合わせて、光電子増倍管やストリークカメラを駆動ことが必要となるため、光電子増倍管やストリークカメラの調整過程が複雑かつ長時間を要していた。
 本発明は以上の点を考慮してなされたもので、簡易な構成で蛍光寿命を取得し得る蛍光寿命測定装置、蛍光寿命測定方法及びプログラムを提案しようとするものである。
 上記の課題を解決するために本発明は、蛍光寿命測定装置であって、測定対象の蛍光体が配されるステージを移動させる移動手段と、移動手段により一定の速度で移動されるステージに配される蛍光体に対して励起光を照射する照射手段と、励起光により発する蛍光の残光を撮像する撮像手段と、撮像部が撮像した画像を用いて、蛍光位置から、対象とすべき残光位置における経過時間と残光強度を検出し、蛍光寿命を算出する蛍光寿命算出手段とを設ける。
 また本発明は、蛍光寿命測定方法であって、測定対象の蛍光体が配されるステージを移動させる移動制御ステップと、移動制御ステップでの制御により一定の速度で移動されるステージに配される蛍光体に対して励起光を照射する照射ステップと、励起光により発する蛍光の残光を撮像する撮像ステップと、撮像ステップで撮像された画像を用いて、蛍光位置から、対象とすべき残光位置における経過時間と残光強度を検出し、蛍光寿命を算出する蛍光寿命算出ステップとを経る。
 また本発明は、プログラムであって、移動制御手段に対して、測定対象の蛍光体が配されるステージを移動すべきこと、照射手段に対して、移動制御手段により一定の速度で移動されるステージに配される蛍光体に対して励起光を照射すべきこと、撮像手段に対して、励起光により発する蛍光の残光を撮像すべきこと、演算部に対して、撮像手段で撮像された画像を用いて、蛍光位置から、対象とすべき残光位置における経過時間と残光強度を検出し、蛍光寿命を算出すべきことを実行させる。
 本発明は、蛍光寿命を、移動方向における残光像として捉えるため、短時間に生じる光の強度変化を、光電子増倍管やストリークカメラを用いずに一般的なカメラによって得ることができ、この結果、蛍光寿命を簡易な構成とすることができる。
 図1は、蛍光寿命測定装置の構成を概略的に示す図である。
 図2は、ディスクステージの構造を概略的に示す図である。
 図3は、光学系の構成例を示す図である。
 図4は、受光面でのビーム形状を概略的に示す図である。
 図5は、測定部の構成を示すブロック図である。
 図6は、励起光の照射時における撮像結果を示す写真である。
 図7は、残光強度の時間変化を示すグラフである。
 図8は、蛍光寿命測定処理手順を示すフローチャートである。
 以下、本発明を実施するための形態について説明する。なお、説明は以下の順序とする。
<1.実施の形態>
[1−1.蛍光寿命測定装置の構成]
[1−2.測定部の具体的な構成]
[1−3.蛍光寿命測定処理手順]
[1−4.効果等]
<2.他の実施の形態>
<1.実施の形態>
 発明を実施するための形態として蛍光寿命測定装置を説明する。
[1−1.蛍光寿命測定装置の構成]
 図1において、蛍光寿命測定装置1の概略的な構成を示す。この蛍光寿命測定装置1は、円盤状のステージ(以下、これをディスクステージとも呼ぶ)2、レーザ光源3、光学系4、フォーカス制御部5、撮像部6及び測定部7を含む構成とされる。
 ディスクステージ2は、その中心に設けられる貫通孔を介して、回転軸SAに対して着脱可能に支持される。このディスクステージ2の構造を図2に示す。ディスクステージ2は、ディスク基板2Aの一方の面に対して、反射膜2Bと、蛍光膜2Cとを順に成膜した層構造でなる。
 ディスク基板2Aは、蛍光膜2Cを励起する光(以下、これを励起光とも呼ぶ)に対して透明となる材料により形成され、例えば1.3[mm]程度の厚みとされる。具体的な材料として例えば石英が用いられる。
 反射膜2Bは、所定量の界面反射を発生させ得る材料が用いられ、例えば100[nm]程度の厚みで均一に成膜される。具体例として酸化チタンがあり、該酸化チタンでは、励起光の波長を405[nm]とし、ディスク基板2Aを石英とした場合、20[%]程度の界面反射が発生する。
 蛍光膜2Cは、蛍光寿命を測定すべき有機又は無機の被測定材料でなり、例えば100[nm]程度の厚みで均一に成膜される。
 レーザ光源3は、ディスク基板2Aのうち反射膜2Bが成膜される面とは逆側の面に対向され、蛍光膜2Cに対する励起光を照射するようになされている。この実施の形態では、波長が405[nm]、出力が1[mW]、横モードTEM00の励起光を照射するレーザ光源3が用いられる。
 光学系4は、レーザ光源3から照射される励起光を、ディスク基板2Aと反射膜2Bとの界面に集光し、該界面において反射する反射光をフォーカス制御部5に導くようになされている。この光学系4の具体的な構成例を図3に示す。
 光学系4は、紙面に対して平行となる直線偏光としてレーザ光源3から出射されるレーザ光を、コリメータレンズ11により平行光として、偏光ビームスプリッタ12に導く。光学系4は、この偏光ビームスプリッタ12を透過するレーザ光を、1/4波長板13により円偏光とし、対物レンズ14によりディスク基板2Aと反射膜2Bとの界面に集光するようになされている。
 この反射膜2Bを透過して蛍光膜2Cに励起光が達した場合、蛍光膜2Cとして成膜される被測定蛍光体は励起して空間的に等方に蛍光を放出することとなる。
 一方、光学系4は、ディスク基板2Aと反射膜2Bとの界面で反射する反射光を、対物レンズ14を介して1/4波長板13に導き、該1/4波長板13によりs偏光とする。光学系4は、このs偏光とされる反射光を、偏光ビームスプリッタ12により90[°]方向に反射させ、集光レンズ15及びシリンドリカルレンズ16を介してフォーカス制御部5(図1)に導くようになされている。
 フォーカス制御部5は、光学系4から導かれる光を受光する受光部を有する。ここで、受光部における受光面での、光学系4から導かれる光の形状を図4に示す。ディスク基板2Aと反射膜2Bとの界面に焦点がある場合には、破線で示す円形となる。一方、界面から焦点がずれた場合、シリンドリカルレンズ16で発生する収差により、一点鎖線で示す楕円形状となる。具体的には、ディスク基板2Aと反射膜2Bとの界面に対して焦点が手前であるか奥であるかに応じて、楕円形状の長軸短軸が入れ替わる。
 フォーカス制御部5は、4分割される各領域での光電変換結果として受光部から得られる信号を用いてフォーカス制御信号を生成する。具体的には図4を例にすると、A~Dの領域の信号を取得し、(A+D)−(B+C)の演算によりフォーカス制御信号を生成する。
 フォーカス制御部5は、このフォーカス制御信号に応じて光軸方向に移動可能なアクチュエーターを制御することで、該アクチュエーターに設けられる対物レンズ14(図3)を、ディスク基板2Aと反射膜2Bとの界面に焦点が位置するよう追従させる。
 撮像部6は、ディスクステージ2の蛍光膜2Cと対向する側に設けられ、該蛍光膜2Cから発する蛍光を撮像し、該撮像結果を撮像データとして測定部7に与えるようになされている。
 測定部7は、撮像部6から与えられる撮像データに基づいて蛍光寿命を算出するようになされている。
[1−2.測定部の具体的な構成]
 次に、測定部7について具体的に説明する。図5において、測定部7の概略的な構成を示す。この測定部7は、CPU(Central Processing Unit)21に対して各種ハードウェアをバス22を介して接続することにより構成される。
 ハードウェアとして、ROM(Read Only Memory)23、CPU21のワークメモリとなるRAM(Random Access Memory)24及びインターフェイス25が少なくとも採用される。この実施の形態では、ユーザの操作に応じた命令を入力する入力部26、表示部27及び記憶部28も採用される。
 ROM23には、蛍光寿命を測定する処理を実行するためのプログラム(以下、これを蛍光寿命測定プログラムとも呼ぶ)が格納される。インターフェイス25には、回転軸SAに取り付けられるスピンドルモータSM(図1)と、レーザ光源3、フォーカス制御部5及び撮像部6(図1)とが接続される。
 CPU21は、操作入力部から、蛍光寿命を測定する命令が与えられた場合、ROM23に格納される蛍光寿命測定プログラムをRAM24に展開し、駆動部31、前処理部32及び蛍光寿命算出部33として機能する。
 駆動部31は、励起光を所定周期で照射するようレーザ光源3を駆動させるとともに、ディスク基板2Aと反射膜2Bとの界面に焦点が位置するようフォーカス制御部5を駆動させる。また駆動部31は、線速度一定に回転するようスピンドルモータSMを駆動させるとともに、所定周期で撮像するよう撮像部6を駆動させる。
 ここで、回転状態のディスクステージ2において照射すべき位置での蛍光ディスク基板2Aと反射膜2Bとの界面の所定位置に励起光を瞬間的に照射したときの撮像結果を図6に示す。なお、この図6では撮像部6として、焦点距離が6.33~19[mm]のレンズ、810万画素インターレース型でなる1/2.5インチのCCD(Charge Coupled Device)を有する14[bit]のデジタルスチルカメラが用いられた。
 この図6からも明らかなように、回転状態のディスクステージ2における蛍光膜2Cを照射位置で瞬間的に励起させた場合、該照射位置で発する蛍光が回転方向に残光として映ることとなる。
 前処理部32は、撮像部6から与えられる撮像データに示される画像において、照射位置で発する蛍光の残光の先端位置(図6では照射位置に最も近い黒丸部分)に対する末端位置(図6では照射位置から最も離れた黒丸部分)の強度の割合を算出する。
 そして前処理部32は、この割合が規定範囲内となるよう、インターフェイス25を介してディスクステージ2の回転数又は撮像部6の画角を調整する。この結果、照射位置から目的とすべき強度をもつ位置(例えば消失直前の位置)までの残光が撮像範囲に納められることとなる。
 蛍光寿命算出部33は、ディスクステージ2の回転数又は撮像部6の画角が調整された場合、残光の先端位置から末端位置までの強度と経過時間とを所定間隔(図6では黒丸部分)ごとに算出し、当該算出結果から残光の時間変化を示す表(以下、これを残光変化表とも呼ぶ)を作成する。なお、図6における残光変化表を図7に示す。
 ちなみに、経過時間は、残光の位置情報、ディスクステージの半径及び回転数から求めることができる。
 そして蛍光寿命算出部33は、次式
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
に基づいて蛍光寿命を算出する。この(1)式における「I(t)」は着目すべき位置での残光強度(残光強度の時間変化)、「I」は照射位置での強度、「t」は着目すべき位置での経過時間、「τ」は蛍光寿命である。また「(−t/τ)」は、残光変化表(図6)の傾きを意味する。
 ところで、ディスクステージ2に成膜される蛍光膜2C(図2)は、単一の励起状態に限らず、複数の励起状態を有するものもある。複数の励起状態を有する蛍光膜2Cである場合、残光変化表は、図7に示される直線状態を呈することはなく、該励起状態の数に応じた直線が混合した状態を呈することになる。
 この場合、蛍光寿命算出部33は、残光変化表におけるスロープのうち、傾斜の異なる直線部分や曲線を呈する部分を、着目すべき位置としてそれぞれ決定することで、複数の励起状態を有する蛍光膜2Cの蛍光寿命を算出することができる。
 なお、図6に示されるスロープを呈した蛍光膜2Cの蛍光寿命は、図5に示す撮像時のディスクステージ2の線速度が1[m/sec]である場合、1.8[msec]として算出される。
[1−3.蛍光寿命測定処理手順]
 次に、測定部7の蛍光寿命測定処理手順について、図8に示すフローチャートを用いて説明する。
 すなわちCPU21は、蛍光寿命を測定する命令が与えられた場合、この蛍光寿命測定処理手順を開始して第1ステップSP1に移行する。CPU21は、この第1ステップSP1では、スピンドルモータSMを駆動してディスクステージ2を線速度一定に回転させ、第2ステップSP2に移行する。
 CPU21は、この第2ステップSP2では、レーザ光源3を駆動してディスクステージ2に対して励起光を所定周期で照射させ、第3ステップSP3に移行する。CPU21は、この第3ステップSP3では、フォーカス制御部4を駆動してディスク基板2Aと反射膜2Bとの界面に焦点を位置させ、第4ステップSP4に移行する。
 CPU21は、この第4ステップSP4では、撮像部6を駆動して、ディスクステージ2に対して励起光が照射された時点の画像の取り込みを開始し、第5ステップSP5に移行する。
 CPU21は、この第5ステップSP5では、第4ステップSP4で取り込んだ画像において、照射位置から目的とすべき強度をもつ位置(例えば消失直前の位置)までの残光を撮像範囲に納めて、第6ステップSP6に移行する。具体的には、上述したように、照射位置で発する蛍光の残光の先端位置に対する末端位置での強度の割合が規定範囲内となるよう、ディスクステージ2の回転数又は撮像部6の画角が調整される。
 CPU21は、この第6ステップSP6では、残光の先端位置から末端位置までの強度と経過時間とを所定間隔ごとに算出し、第7ステップSP7に移行する。CPU21は、この第7ステップSP7では、第6ステップSP6で算出した結果から残光変化表を作成し、第8ステップSP8に移行する。
 CPU21は、この第8ステップSP8では、(1)式に基づいて蛍光寿命を算出した後、この蛍光寿命測定処理手順を終了する。なお、第7ステップSP7で作成したスロープが非直線となる場合、CPU21は、第8ステップSP8において、残光変化表に示されるスロープのうち、傾きの異なる直線部分や曲線を呈する部分ごとに蛍光寿命を算出するようになされている。
[1−4.効果等]
 以上の構成において、この蛍光寿命測定装置1は、回転するディスクステージ2に配される蛍光体に対して励起光を照射し、該励起光により発する蛍光の残光を撮像部6で撮像する。そして蛍光寿命測定装置1は、蛍光位置から、対象とすべき残光位置における経過時間と残光強度を検出し、該残光強度及び経過時間を用いて蛍光寿命を算出する。
 この蛍光寿命測定装置1は、蛍光寿命を、回転方向における残光像として捉えるため、ストリークカメラを用いることなく短時間に生じる光の強度変化を得ることができ、この結果、蛍光寿命を簡易な構成とすることができる。
 またこの蛍光寿命測定装置1は、回転するディスクステージ2に配される蛍光体に対して、所定周期単位で瞬間的にレーザ光を照射する。したがってこの蛍光寿命測定装置1は、パルスレーザ光を用いる場合に比してその構成を簡易化することができる。また、測定中にパルスレーザ光を照射し続ける場合に比して、励起光による蛍光体の物性変化を抑えることができ、この結果、該蛍光体の蛍光寿命を正しく測定することが可能となる。
 またこの蛍光寿命測定装置1は、残光強度の時間変化を示す線が非直線となる場合、該線のうち、傾きの異なる直線部分乃至曲線を呈する部分ごとに蛍光寿命を算出する。
 したがってこの蛍光寿命測定装置1は、蛍光体が複数の励起状態を有する場合であっても、該蛍光体の蛍光寿命を算出することができる。
 以上の構成によれば、この蛍光寿命測定装置1は、蛍光寿命を、回転方向における残光像として捉えるようにしたことにより、ストリークカメラを用いることなく短時間に生じる光の強度変化を得ることができ、この結果、蛍光寿命を簡易な構成とすることができる。
<2.他の実施の形態>
 上述の実施の形態では、蛍光寿命を算出する前に、撮像される残光の先端位置に対する末端位置での強度の割合が規定範囲内となるよう、ディスクステージ2の回転数又は撮像部6の画角が調整された。
 この実施の形態に代えて、ディスクステージ2全体が撮像範囲内に納まるよう撮像部6の画角を固定としてもよい。このようにすれば、上記調整をしなくとも、撮像範囲での蛍光強度と残光強度との割合を一定にしつつ、上述の実施の形態と同様にして蛍光寿命を算出することができる。ただし、残光感度の観点では、ディスクステージ2の回転数又は撮像部6の画角を調整する上述の実施の形態のほうが好ましい。
 また上述の実施の形態では、測定対象の蛍光体が配されるステージを移動させる移動手段として、回転移動させるスピンドルモータSMが適用された。しかしながら移動手段は、回転移動させるものに限定されるものではない。例えば、直線移動させるものを適用することができる。要は、一定の移動速度を、全体として又はある過程において実現可能な移動手段であればよい。
 また上述の実施の形態では、測定すべき蛍光体が、ディスクステージ2全体に膜として配置された。しかしながら配置位置はステージ全体に限定されるものではなく、また膜以外の態様で配するようにしてもよい。
 本発明は、遺伝子実験、医薬の創製又は患者の経過観察などのバイオ産業上において利用することができる。
 1……蛍光寿命測定装置、2……ディスクステージ、2A……ディスク基板、2B……反射膜、2C……蛍光膜、3……レーザ光源、4……光学系、5……フォーカス制御部、6……撮像部、7……測定部、21……CPU、22……バス、23……ROM、24……RAM、31……駆動部、32……前処理部、33……蛍光寿命算出部、SM……スピンドルモータ、SA……回転軸

Claims (6)

  1.  測定対象の蛍光体が配されるステージを移動させる移動手段と、
     上記移動手段により一定の速度で移動されるステージに配される蛍光体に対して励起光を照射する照射手段と、
     上記励起光により発する蛍光の残光を撮像する撮像手段と、
     上記撮像部が撮像した画像を用いて、対象とすべき残光位置における蛍光位置からの経過時間と、残光強度とを検出し、蛍光寿命を算出する蛍光寿命算出手段と
     を有する蛍光寿命測定装置。
  2.  上記蛍光寿命算出手段は、
     残光強度の時間変化を示す線が非直線となる場合、該線のうち、傾きの異なる直線部分乃至曲線を呈する部分ごとに蛍光寿命を算出する、請求項1に記載の蛍光寿命測定装置。
  3.  撮像される残光の先端位置に対する末端位置での強度の割合が規定範囲内となるよう、上記移動手段の移動速度又は上記撮像手段の画角を調整する調整手段をさらに有し、
     上記蛍光寿命算出手段は、
     上記調整手段が調整した以降の画像を用いて、上記蛍光寿命を算出する、請求項2に記載の蛍光寿命測定装置。
  4.  上記移動手段は、測定対象の蛍光体が配されるステージを回転移動させる、請求項3に記載の蛍光寿命測定装置。
  5.  測定対象の蛍光体が配されるステージを移動させる移動制御ステップと、
     上記移動制御ステップでの制御により一定の速度で移動されるステージに配される蛍光体に対して励起光を照射する照射ステップと、
     上記励起光により発する蛍光の残光を撮像する撮像ステップと、
     上記撮像ステップで撮像された画像を用いて、対象とすべき残光位置における蛍光位置からの経過時間と、残光強度とを検出し、蛍光寿命を算出する蛍光寿命算出ステップと
     を有する蛍光寿命測定方法。
  6.  移動制御手段に対して、測定対象の蛍光体が配されるステージを移動すべきこと、
     照射手段に対して、上記移動制御手段により一定の速度で移動されるステージに配される蛍光体に対して励起光を照射すべきこと、
     撮像手段に対して、上記励起光により発する蛍光の残光を撮像すべきこと、
     演算部に対して、上記撮像手段で撮像された画像を用いて、対象とすべき残光位置における蛍光位置からの経過時間と、残光強度とを検出し、蛍光寿命を算出すべきこと
     を実行させるプログラム。
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012132742A (ja) * 2010-12-21 2012-07-12 Fujifilm Corp 時間分解蛍光測定装置、及び方法
CN103592277B (zh) * 2013-11-20 2017-01-11 中国科学技术大学 一种高精度荧光寿命测量装置
CN105300949B (zh) * 2015-11-26 2019-06-11 浙江大学 一种荧光寿命测量方法及装置
CN107860756A (zh) * 2017-11-12 2018-03-30 武汉能斯特科技有限公司 一种测量荧光寿命的方法和装置
CN109100021A (zh) * 2018-02-27 2018-12-28 武汉能斯特科技有限公司 一种时间分辨的光谱和寿命测量模块及装置
CN110632039A (zh) * 2018-06-22 2019-12-31 武汉能斯特科技有限公司 一种高通量测量荧光磷光寿命的转盘和装置
CN112714866A (zh) 2018-09-18 2021-04-27 国立大学法人东京大学 物质确定装置、物质确定方法以及物质确定程序
JP7345939B2 (ja) * 2020-03-17 2023-09-19 国立大学法人 東京大学 状態特定装置、状態特定方法、および状態特定プログラム

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61241639A (ja) * 1985-04-19 1986-10-27 Hitachi Ltd 反応試料分析装置
JPH063461A (ja) * 1992-06-24 1994-01-11 Toshiba Corp 蛍光体の検出装置
JP2000304698A (ja) * 1999-04-16 2000-11-02 Canon Inc 蛍光測定方法と装置及びそれに適した基板
JP2000321206A (ja) * 1999-05-11 2000-11-24 Hitachi Software Eng Co Ltd 蛍光測光方法及び蛍光測光装置
JP2001349833A (ja) 2000-06-08 2001-12-21 Hamamatsu Photonics Kk 蛍光測定方法、蛍光測定装置及びそれを用いた試料評価装置
JP2007033170A (ja) * 2005-07-26 2007-02-08 Fujifilm Corp 蛍光検出方法および蛍光検出システム

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4074136B2 (ja) * 2002-05-29 2008-04-09 浜松ホトニクス株式会社 蛍光寿命分布画像測定装置およびその測定方法
JP2008122297A (ja) * 2006-11-14 2008-05-29 Fujitsu Ltd 蛍光検出装置および蛍光検出方法
JP5208801B2 (ja) * 2009-02-20 2013-06-12 株式会社東芝 光検出装置、及びこの光検出装置を備える紙葉類処理装置

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61241639A (ja) * 1985-04-19 1986-10-27 Hitachi Ltd 反応試料分析装置
JPH063461A (ja) * 1992-06-24 1994-01-11 Toshiba Corp 蛍光体の検出装置
JP2000304698A (ja) * 1999-04-16 2000-11-02 Canon Inc 蛍光測定方法と装置及びそれに適した基板
JP2000321206A (ja) * 1999-05-11 2000-11-24 Hitachi Software Eng Co Ltd 蛍光測光方法及び蛍光測光装置
JP2001349833A (ja) 2000-06-08 2001-12-21 Hamamatsu Photonics Kk 蛍光測定方法、蛍光測定装置及びそれを用いた試料評価装置
JP2007033170A (ja) * 2005-07-26 2007-02-08 Fujifilm Corp 蛍光検出方法および蛍光検出システム

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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