JP2000321206A - 蛍光測光方法及び蛍光測光装置 - Google Patents

蛍光測光方法及び蛍光測光装置

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 励起光源として連続発振レーザを用い、簡単
な構成で容易に高い検出精度を得る。 【解決手段】 励起光源３０からの励起光を試料１１ａ
に照射した後、試料を蛍光検出手段５０の光軸上に移動
して蛍光を検出する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、蛍光測光方法及び
蛍光測光装置に関し、特に蛍光物質で標識されたＤＮＡ
や蛋白質などの試料が平面状に配列されているバイオチ
ップの読み取りに好適な蛍光測光方法及び蛍光測光装置
に関する。
【０００２】
【従来の技術】分子生物学や生化学の分野では、既知の
配列をもつ核酸や蛋白質と試料中のターゲット分子とを
ハイブリダイズさせるハイブリダイゼーション反応を利
用して有用な遺伝子の探索や病気の診断などが行われて
いる。その際、短時間で大量の試料を処理するために表
面に多数の試料スポットを配列したバイオチップが用い
られる。バイオチップ上の各試料スポットにはそれぞれ
異なるプローブが固定されており、このバイオチップを
試料ＤＮＡと共に反応容器の中に入れ、その中でバイオ
チップの各試料スポットに結合させたプローブと蛍光標
識した試料ＤＮＡとのハイブリダイゼーションを行う。
その後、バイオチップに励起光を照射し、各試料スポッ
トから発せられる蛍光強度を蛍光測光装置で測定するこ
とによって、各プローブと試料ＤＮＡとの結合量を知
り、それを必要な情報に変換する。
【０００３】図５は、バイオチップの読み取りに使用さ
れる従来の蛍光測光装置の概略図である。この蛍光測光
装置は、バイオチップ上の各試料スポットに対して光点
走査方式で励起光照射を行い、各試料スポットから発せ
られる蛍光の取り込みを光ファイバー束により行うよう
にしたものである。
【０００４】スライドグラス等から成るバイオチップ１
００の表面には、蛍光物質により標識されたＤＮＡや蛋
白質などを含む試料スポット１０１が、例えば直径５０
μｍの微小なスポットとしてＹ方向に１００μｍ程度の
間隔で格子状に配列されている。バイオチップ１００は
チップ送りモータ１０３により矢印Ｙで示す方向に平行
移動される。レーザ１０５から発生されたレーザ光１０
７は回転ミラー１０９で反射されてバイオチップの表面
に光点となって導かれる。回転ミラー１０９はモータ１
１１により矢印Ｒ方向に回動される。従って、レーザ光
１０７はバイオチップ１００の表面を矢印Ｘ方向に直線
走査する。このように、モータ制御部１１９によってチ
ップ送りモータ１０３及びモータ１１１を制御して、Ｘ
方向にレーザ光を走査し、Ｙ方向にバイオチップを逐次
移動することで、バイオチップ１００の試料面全体を光
照射していた。
【０００５】バイオチップの各試料スポットから発生さ
れた蛍光は、光ファイバー束１１３ａ，１１３ｂによっ
て光電子増倍管（photomultiplier tube；ＰＭＴ）１１
５ａ，１１５ｂに導かれる。光ファイバー束１１３ａ，
１１３ｂの入射側はライン状に配列され、バイオチップ
１表面のレーザ光走査線に向けられている。また、光フ
ァイバー束１１３ａ，１１３ｂの他端は束ねてＰＭＴ１
１５ａ，１１５ｂに向けて配置されている。光ファイバ
ー束１１３ａ，１１３ｂとＰＭＴ１１５ａ，１１５ｂの
間には光学フィルタ１１７ａ，１１７ｂが配置されてお
り、目的の蛍光波長のみをＰＭＴ１１５ａ，１１５ｂで
読み取るようになっている。ＰＭＴ１１５ａ，１１５ｂ
の出力はデータ処理部１２１に送られてデータ処理され
る。このように透過波長域の異なる光学フィルタを備え
る受光系を複数設置することで、多色の読取りを可能に
していた。
【０００６】
【本発明が解決しようとする課題】上記した従来の蛍光
測光装置は、受光系に試料からの蛍光だけでなく、試料
面で反射あるいは散乱された励起レーザ光が入ってい
た。試料が微量なこともあって、受光系に入射する励起
光の光量は蛍光の光量より数桁も大きい。従って、励起
光を除去するために光学フィルタとして透過波長帯域が
狭いものを用いる必要があり、検出すべき蛍光も光学フ
ィルタによってカットされることがあった。また、蛍光
の取り込みに用いる光ファイバー束は、光走査方向に少
なくとも試料の個数に等しい本数の光ファイバーが必要
でコスト面で不利になる上、光ファイバーの光軸合わせ
に精密な機構と調整を要していた。
【０００７】また、光ファイバーは受光角が小さく試料
から取り込める蛍光が少ないために、Ｓ／Ｎ比が低くな
る傾向がある。Ｓ／Ｎ比をあげるためにパルスレーザや
音響光学変調器（acoustooptic modulator；ＡＯＭ）を
用い、試料を励起した直後に励起レーザ光の強度を減衰
させて試料の蛍光だけを受光する試みもあるが、パルス
レーザは高価であり、ＡＯＭはレーザ光の強度を約１／
１０００に減衰させるだけで、完全に励起レーザ光の混
入を防げるものではなかった。
【０００８】本発明は、上述した従来技術における問題
点を解決し、励起光源として連続発振レーザ（continuo
us-wave laser ；ＣＷレーザ）などの比較的安価なレー
ザを用い、簡単な構成で容易に高い検出精度を得ること
のできる蛍光測光方法及び蛍光測光装置を提供すること
を目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明では、励起光照射
部と蛍光検出部を空間的に離して設定し、励起光照射部
で励起光が照射された試料を励起光照射部から蛍光検出
部に移動し、蛍光検出部で励起光の影響が全くない状態
で蛍光検出を行うことでＳ／Ｎ比を向上し、前記目的を
達成する。
【００１０】すなわち、本発明による蛍光測光方法は、
励起光源からの励起光を試料に照射するステップと、励
起光を照射された試料を蛍光検出手段の光軸上に移動す
るステップと、蛍光検出手段に入射した蛍光を検出する
ステップとを含むことを特徴とする。試料は、蛍光物質
で標識された生体高分子を含む試料とすることができ
る。
【００１１】この方法では、励起光を照射された試料
を、試料から発生される蛍光の寿命に比較して短い時間
内に、励起光照射位置と異なる位置に向けられた蛍光検
出手段の光軸上に移動して蛍光検出を行う。従って、励
起光照射位置において試料から反射あるいは散乱した励
起光が蛍光検出手段に入射することがないため、蛍光の
みを高感度で検出することができる。
【００１２】本発明による蛍光測光装置は、励起光源
と、励起光源からの励起光を試料に照射するための励起
光照射手段と、励起光照射手段の光軸と試料上で交差し
ない光軸を有し、励起光照射によって試料から発せられ
た蛍光を検出するための蛍光検出手段と、励起光照射手
段によって励起光を照射された試料を蛍光検出手段の光
軸上に移動するための試料移動手段とを備えることを特
徴とする。
【００１３】この蛍光測光装置は、励起光照射手段の光
軸と蛍光検出手段の光軸が試料上で交差していない。そ
のため、励起光照射手段の下方に位置する試料に対して
蛍光測光を行うことはできないが、蛍光寿命に比較して
短い時間内に試料を蛍光検出手段の下方に移動して蛍光
検出を行う。このように蛍光照射位置と蛍光検出位置を
空間的に異なる位置に設定することにより、励起光照射
位置において試料から反射あるいは散乱した励起光が蛍
光検出手段に入射することがないため、蛍光のみを高感
度で検出することが可能となる。
【００１４】蛍光検出手段は、ＰＭＴ等の光検出手段
と、光検出手段の光検出面と試料面とが共役になった共
焦点光学系を備えるのが好ましい。また、試料移動手段
は試料を回転移動させる手段とすることができ、異なる
波長の蛍光を検出するために前記励起光源と励起光照射
手段と蛍光検出手段の組を複数組備えることができる。
【００１５】本発明に用いる蛍光物質は蛍光寿命の長い
ものが好ましく、Ｅｕ（ユーロピウム）錯体の蛍光物質
である４，４’−bis（1",1",1",2",2",3",3"−heptafl
uoro−4",6"−hexanedion-6"−yl）chlorosulfo-o-terp
henyl（略称：BHHCT）、ローダミン、ＦＩＴＣ、Ｃｙ
３、Ｃｙ５などが好適である。例えばＢＨＨＣＴは、波
長３４０ｎｍで励起されて波長６１５ｎｍの蛍光を出す
蛍光物質で、蛍光の半減期が１００〜２００μｓｅｃと
従来の蛍光物質の半減期（数十ｎｓｅｃ）に比べ、非常
に長い。この特性を利用すると、励起光照射した試料を
移動してから蛍光検出しても蛍光量を多く得ることがで
き、Ｓ／Ｎ比を飛躍的に向上することができる。
【００１６】
【発明の実施の形態】以下、図面を参照して本発明の実
施の形態を説明する。図１は、本発明による蛍光測光装
置の一例を示す概略図である。この装置は、円形のバイ
オチップの読み取りに好適な蛍光測光装置である。同心
円状又は螺旋状に多数の試料スポット１１が配置されて
いる円形のバイオチップ１０は、試料台１２上に保持さ
れており、試料台１２は回転モータ１３によって矢印Ｒ
の方向に回転駆動される。バイオチップ１０の上方に
は、励起光源３０と、励起光照射光学系４０と、蛍光検
出光学系５０とを備える光学ヘッド２０が配置されてい
る。例えば直径５０μｍの微小なスポットである試料ス
ポット１１上には、蛍光物質により標識されたＤＮＡや
蛋白質などの生体高分子がプローブＤＮＡ等とハイブリ
ダイズしている。
【００１７】励起光源３０としては、例えばＣＷレーザ
が用いられる。励起光源３０から発生されたレーザ光は
励起光照射光学系４０に入射し、ミラー４１で反射さ
れ、対物レンズ４２で収束されてバイオチップ１０上の
試料スポットに照射される。蛍光検出光学系５０は、受
光レンズ５１、集光レンズ５２、蛍光選択フィルタ５
３、スリット５４、光検出器５５としての光電子増倍管
を備え、試料スポットから発生された蛍光を検出する。
【００１８】光学ヘッド２０はヘッド送りモータ１４に
よってバイオチップ１０の半径方向に移動・位置決めさ
れる。バイオチップ１０上に試料スポットが１１同心円
状に配置されている場合には、ヘッド送りモータ１４は
光学ヘッド２０を試料スポットの各同心円に対してステ
ップ的に位置決めし、バイオチップ１０上に試料スポッ
ト１１が螺旋状に配置されている場合には、ヘッド送り
モータ１４は螺旋状の試料スポット１１を追跡するよう
に光学ヘッド２０を連続的に移動させる。モータ制御部
１５は回転モータ１３とヘッド送りモータ１４を制御
し、光学ヘッド２０の下方位置における試料スポット１
１の移動速度が常に一定となるように、バイオチップ１
０上における光学ヘッド２０の半径位置に応じて回転モ
ータ１３の回転速度を可変制御する。
【００１９】図２は、励起光照射光学系と蛍光検出光学
系の位置関係を説明する模式図である。図２（ａ）は、
回転しているバイオチップ１０上の１つの試料スポット
１１ａに励起光源（ＣＷレーザ）３０から発生された励
起光が励起光照射光学系４０を介して照射され、試料ス
ポット１１ａ中の蛍光物質が励起されている状態を示し
ている。この後、図２（ｂ）に示すように、励起光が照
射された試料スポット１１ａはバイオチップ１０の回転
と共に移動し、蛍光検出光学系５０の真下にくる。この
位置で、試料スポット１１ａから発生された蛍光が蛍光
検出光学系５０に入射し、検出される。
【００２０】図３は、本発明による蛍光検出の原理を説
明する模式図である。図３（ａ）は、移動しているバイ
オチップ上１０の試料スポット１１ａにＣＷレーザ３０
からの励起光が照射されている状態を示す。試料スポッ
ト１１ａに標識蛍光物質が含まれていれば、励起光を照
射された試料スポット１１ａから蛍光が発せられる。励
起光照射光学系４０の下方位置を通過して励起光照射を
受けた試料スポットは、励起光照射ののち一定時間経過
後に、図３（ｂ）に示すように、蛍光検出光学系５０の
下方位置に達する。蛍光検出光学系５０の受光レンズ５
１と集光レンズ５２は共焦点光学系を構成している。試
料スポット１１ａから発せられた蛍光は全方位に広がる
が、共焦点光学系を構成する受光ンズ５１に入射した蛍
光は集光レンズ５２によって収束され、光学フィルタ５
３とスリット５４を通ることでノイズを除去され、光検
出器（ＰＭＴ）５５に入射して検出される。こうして励
起光の影響を受けずに蛍光測定を行うことが可能とな
る。なお、図３には、励起光照射光学系４０の光軸と蛍
光検出光学系５０の光軸が平行になるように図示してあ
るが、２つの光学系４０，５０の光軸は必ずしも平行で
ある必要はない。
【００２１】図４は、本発明による蛍光測光装置の他の
例を説明する概略図である。この蛍光測光装置は２個の
光学ヘッド２０ａ，２０ｂを備え、試料スポットに含ま
れる２種類の標識蛍光物質から発せられる蛍光を識別し
て検出する。光学ヘッド２０ａは励起光源（ＣＷレー
ザ）３０ａ、励起光照射光学系４０ａ、蛍光検出光学系
５０ａを備え、光学ヘッド２０ｂは励起光源（ＣＷレー
ザ）３０ｂ、励起光照射光学系４０ｂ、蛍光検出光学系
５０ｂを備える。励起光照射光学系４０ａ，４０ｂの詳
細構成、及び蛍光検出光学系５０ａ，５０ｂの詳細構成
は、図１に示した励起光照射光学系４０及び蛍光検出光
学系５０の詳細構成と同じであるため、ここでは説明を
省略する。
【００２２】ただし、励起光源３０ａ，３０ｂは、それ
ぞれ異なる蛍光物質を効率よく励起できるように励起波
長が選択され、蛍光検出光学系５０ａ，５０ｂは、それ
ぞれ異なる蛍光物質からの蛍光を効率よく検出できるよ
うに透過波長帯域が選択された光学フィルタを備える。
こうして、一方の光学ヘッド２０ａは、励起光照射光学
系４０ａによって試料スポット１１ｂに励起光源３０ａ
からの励起光を照射し、一定時間後に蛍光検出光学系５
０ａによって試料スポット１１ｂから発生される蛍光を
励起光に邪魔されることなく測光して、例えば試料スポ
ット１１ｂに含まれるＣｙ３を選択的に検出する。ま
た、他方の光学ヘッド２０ｂは、励起光照射光学系４０
ｂによって試料スポット１１ｃに励起光源３０ｂからの
励起光を照射し、一定時間後に蛍光検出光学系５０ｂに
よって試料スポット１１ｃから発生される蛍光を励起光
に邪魔されることなく測光して、例えば試料スポット１
１ｃに含まれるＣｙ５を選択的に検出する。
【００２３】２つの光学ヘッド２０ａ，２０ｂはヘッド
送りモータ１４ａ，１４ｂによってバイオチップ１０の
半径方向に移動され、ほぼ同じ半径位置に位置決めされ
る。バイオチップ１０上に試料スポットが１１同心円状
に配置されている場合には、ヘッド送りモータ１４ａ，
１４ｂは光学ヘッド２０ａ，２０ｂを試料スポットの各
同心円に対してステップ的に位置決めし、バイオチップ
１０上に試料スポット１１が螺旋状に配置されている場
合には、ヘッド送りモータ１４ａ，１４ｂは螺旋状の試
料スポット１１を追跡するように光学ヘッド２０ａ，２
０ｂを連続的に移動させる。モータ制御部１５は回転モ
ータ１３とヘッド送りモータ１４ａ，１４ｂを制御し、
光学ヘッド２０ａ，２０ｂの下方位置における試料スポ
ット１１の移動速度が常にほぼ一定となるように、バイ
オチップ１０上における光学ヘッド２０，２０ｂの半径
位置に応じて回転モータ１３の回転速度を可変制御す
る。
【００２４】
【発明の効果】本発明によると、励起光の影響を受ける
ことなく試料スポットに含まれる蛍光物質からの蛍光を
高感度に計測することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による蛍光測光装置の一例を示す概略
図。
【図２】励起光照射光学系と蛍光検出光学系の位置関係
を説明する模式図。
【図３】本発明による蛍光検出の原理を説明する模式
図。
【図４】本発明による蛍光測光装置の他の例を説明する
概略図。
【図５】従来の蛍光測光装置の概略図。
【符号の説明】 １０…バイオチップ、１１，１１ａ，１１ｂ，１１ｃ…
試料スポット、１２…試料台、１３…回転モータ、１
４，１４ａ，１４ｂ…ヘッド送りモータ、１５…モータ
制御部、２０，２０ａ，２０ｂ…光学ヘッド、３０，３
０ａ，３０ｂ…励起光源、４０，４０ａ，４０ｂ…励起
光照射光学系、４１…ミラー、４２…対物レンズ、５
０，５０ａ，５０ｂ…蛍光検出光学系、５１…受光レン
ズ５１、５２…集光レンズ、５３…蛍光選択フィルタ、
５４…スリット、５５…光検出器、１００…バイオチッ
プ、１０１…試料スポット、１０３…チップ送りモー
タ、１０５…レーザ、１０７…レーザ光、１０９…回転
ミラー、１１１…モータ、１１３ａ，１１３ｂ…光ファ
イバー束、１１５ａ，１１５ｂ…光電子増倍管、１１７
ａ，１１７ｂ…光学フィルタ、１１９…モータ制御部、
１２１…データ処理部
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 山本 顕次 神奈川県横浜市中区尾上町６丁目81番地 日立ソフトウエアエンジニアリング株式会 社内 (72)発明者 宍戸 健太郎 神奈川県横浜市中区尾上町６丁目81番地 日立ソフトウエアエンジニアリング株式会 社内 Ｆターム(参考） 2G043 AA04 BA16 CA03 DA05 EA01 FA01 FA06 GA01 GB01 GB19 KA09 2G054 AA08 AB10 CA22 CA23 EA03 EB02 FB02 FB03 GA05 JA02

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 励起光源からの励起光を試料に照射する
    ステップと、 励起光を照射された試料を蛍光検出手段の光軸上に移動
    するステップと、 前記蛍光検出手段に入射した蛍光を検出するステップと
    を含むことを特徴とする蛍光測光方法。
  2. 【請求項２】 請求項１記載の蛍光測光方法において、
    試料は蛍光物質で標識された生体高分子を含むことを特
    徴とする蛍光測光方法。
  3. 【請求項３】 励起光源と、前記励起光源からの励起光
    を試料に照射するための励起光照射手段と、前記励起光
    照射手段の光軸と試料上で交差しない光軸を有し、励起
    光照射によって試料から発せられた蛍光を検出するため
    の蛍光検出手段と、前記励起光照射手段によって励起光
    を照射された試料を前記蛍光検出手段の光軸上に移動す
    るための試料移動手段とを備えることを特徴とする蛍光
    測光装置。
  4. 【請求項４】 請求項３記載の蛍光測光装置において、
    前記試料移動手段は試料を回転移動させる手段であり、
    異なる波長の蛍光を検出するために前記励起光源と励起
    光照射手段と蛍光検出手段の組を複数組備えることを特
    徴とする蛍光測光装置。
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