WO2010067953A2

WO2010067953A2 - 유럽종 포도의 씨 추출물을 함유하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: WO2010067953A2
Application number: PCT/KR2009/005751
Authority: WO
Inventors: 김호연; 민준기; 조미라; 박미경; 오혜좌; 허유정; 박진실; 우윤주; 류종현; 김현규; 이근혁; 박진하; 곽은영
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단; 에이치 엘 지노믹스(주)
Priority date: 2008-12-12
Filing date: 2009-10-08
Publication date: 2010-06-17
Also published as: WO2010067953A3; KR101096574B1; KR20100067708A

Abstract

본 발명은 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

Description

유럽종 포도의 씨 추출물을 함유하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학 조성물

본 발명은 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

포도속(Vitis) 식물은 갈매나무목(Rhamnales), 포도과(Vitaceae)에 속하는 덩굴성 식물로 적도부근 및 위도 50°이상 지역을 제외한 지구상 전역에서 자생 혹은 재배되고 있다. 포도과에는 11속 700 여종이 알려져 있으며, 유럽종 포도(Vitis vinifera), 미국종 포도(Vitis labrusca), 강변 포도(Vitis riparia), 사막 포도(Vitis rupestris), 겨울 포도(Vitis berladieri), 머루(Vitis coignetiae), 왕머루(Vitis amurensis) 등이 주로 과실을 이용하기 위하여 재배되고 있다.

이 중, 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨로부터 얻어지는 추출물은 (-)에피카테킨, 프로안토시아니딘 B1 및 B2, (+)카테킨, 및 이들의 중합 유도체들의 혼합물들을 포함하며, 이들은 프로시아니돌 또는 플라보놀 올리고머로서 알려져 있다 (GB-A-1541469 및 FR-A-2092743).

상기 추출물은 주로 결합조직, 혈관, 림프, 관절 등의 글리코스아미노글리칸(glycosaminoglycan)에 선택적으로 작용하여 콜라겐, 엘라스틴, 피브로넥틴 등의 결합능에 관련하는 섬유들의 합성을 촉진하고 분해를 억제하여, 증가된 모세혈관 투과성을 억제하고 정맥의 신축성을 빠르게 회복시켜 주는 것으로 보고되고 있다[Arteres et veines Vol.5(5), 397∼401(1986); Sem-dex Hopitaux 48/47, 2009∼2013(1981)].

또한, 포도씨 추출물은 당뇨병 환자의 모세혈관 취약증, 고혈압에 관련된 망막증, 망막분리후의 잔여 망막부종에 대한 치료효과를 갖는 것이 보고된 바 있으며[Gazette Mde France Vol.88, No.14, 2035∼2038(1981)], 망막의 여러 구조를 보호함으로써 시각색소의 재생속도를 빠르게 하며, 임상시험에서 섬광에 노출된 후에 망막을 회복시키는데도 효과가 있는 것으로 보고된 바 있다[Bull. Soc. Opth. France Vol 88(2), 173-4, 177-9(1988)].

또한, 미국특허공개 제2003/0165589호는 유럽종 포도(Vitis vinifera), 바람직하게는 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 잎으로부터 얻어진 추출물이 NO-신타아제(Nitric Oxide - synthase, NO-synthase)를 억제함으로써, NO-synthase와 관련한 다양한 질환, 예를 들어 세포 분화 및/또는 증식, 상피성장의 저해 및/또는 과다증식 질환, 세포의 퇴화 및 파괴, 면역 및/또는 염증 진행 등의 억제에 사용될 수 있음을 개시한 바 있다.

한편, 미국특허공개 제2006/0280811호는 살리제닌(saligenin) 또는 살릭스 루브라(Salix rubra) 추출물; 보스웰산(boswellic acid) 또는 보스웰리아 세라타(Boswellia serrata) 추출물; 유럽종 포도(Vitis vinifera) 또는 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis)로부터 얻어진 프로시아니딘(바람직하게는 인지질과의 복합체(complex)) 또는 레인(rhein) 또는 레인의 지용성 유도체; N-아세틸-글루코스아민; 및 글루쿠론산 또는 글루쿠로노락톤을 포함하는 관절염 치료용 조성물을 개시한 바 있다. 상기 조성물에서 프로시아니딘은 살릭스(Salix) 및 보스웰리아(Boswellia) 추출물에 존재하는 시클로옥시게네이즈-2(cyclooxygenanse-2, COX-2) 저해성분과 상승적으로 작용하는 것으로 개시되어 있으나, 구체적으로 어떠한 성분이 관절염 치료의 주성분으로 작용하는지 밝히고 있지 않다. 상기 프로시아니딘은 GB-A-1541469 (및 FR-A-2092743) 또는 미국특허 제5,484,594호(대응 유럽특허 제348,781호)에 개시된 추출방법에 따라 얻어질 수 있는 것으로 개시되어 있다.

기타, 미국특허 제4,963,527호는 유럽종 포도(Vitis vinifera) 추출물의 인지질 복합체를 함유하는 화장료 조성물을 개시하고 있으며, 상기 추출물도 FR-A-2092743(즉, GB-A-1541469)에 따라 얻어진 것을 사용하고 있다.

또한, 본 발명자들은 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물의 개선된 제조방법을 개발한 바 있다 (국제특허공개 제WO2009/031826호).

본 발명자들은 개선된 추출방법으로 얻어진 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물에 대하여 약리활성을 검색하던 중, 놀랍게도 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물이 골다공증에 대한 우수한 예방 및 치료효과를 갖는다는 것을 발견하였다. 이는 유럽종 포도(Vitis vinifera)로부터 얻어진 추출물이 골다공증에 관련된다는 직접적인 보고가 없다는 것을 감안할 때, 매우 놀라운 것이다.

따라서, 본 발명은 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 태양에 따라, 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.

상기 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물은 80 ∼ 130 의 프로시아니돌릭 값(Procyanidolic value, PCV); 30 % 이하의 (+)카테킨 및 (-)에피카테킨의 함량; 및 95 ∼ 105 %의 프로안토시아디딘 함량을 갖는 것이 바람직하다.

또한, 상기 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물은 (a) 분쇄된 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨를 아세톤 및 물의 부피비가 1 : 1 내지 2인 아세톤과 물의 혼합용매로 실온에서 추출하고, 여과하는 단계; (b) 단계(a)에서 얻어진 여액을 증류하여 아세톤을 제거한 다음, 염화나트륨을 포화시키고, 여과하는 단계; (c) 단계(b)에서 얻어진 여액을 에틸 아세테이트로 추출하고, 농축시키는 단계; 및 (d) 단계(c)에서 얻어진 농축물에 클로로포름을 가하고, 여과하여 침전물을 얻는 단계를 포함하는 제조방법으로 얻어질 수 있다.

또한, 선택적으로, 상기 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물은 (1) (i) 분쇄된 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨를 아세톤 및 물의 부피비가 3 ∼ 5 : 1인 아세톤과 물의 혼합용매로 추출하고, 여과하는 단계; (ii) 단계(i)에서 얻어진 여액을 농축하여 아세톤을 제거하고, 여과하는 단계; (iii) 단계(ii)에서 얻어진 여액을 에틸 아세테이트로 추출하는 단계; (iv) 단계(iii)에서 얻어진 추출물을 건조하여 제1 추출물을 얻는 단계; (2) (p) 분쇄된 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨를 물로 추출하고, 여과하는 단계; (q) 단계(p)에서 얻어진 여액을 에탄올로 추출하고, 여과하는 단계; (r) 단계(q)에서 얻어진 여액을 건조하여 제2 추출물을 얻는 단계; 및 (3) 상기 제1 추출물 및 제2 추출물을 혼합하는 단계를 포함하는 제조방법으로 얻어질 수 있다.

본 발명에 의해 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물이 파골세포의 분화를 억제함으로써 우수한 골다공증의 예방 및 치료 활성을 갖는다는 것이 밝혀졌다. 또한, 특정한 프로시아니돌릭 값, (+)카테킨 및 (-)에피카테킨의 함량, 및 95 ∼ 105 %의 프로안토시아디딘 함량을 갖는 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물이 특히 우수한 골다공증의 예방 및 치료 활성을 갖는다는 것이 밝혀졌으며, 상기 특정한 추출물은 본 발명자들이 개발한 개선된 제조방법에 의해 얻을 수 있다.

도 1은 파골세포의 분화 시스템에서 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물의 첨가에 따른 파골세포의 분화정도를 TRAP 염색법으로 측정한 결과를 나타낸다. 도 1에서 M30은 M-CSF(Macrophage-colony stimulating factor) 30ng/ml 을 나타내고, R100은 RANKL(Receptor activator of NF-κB ligand) 100ng/ml 을 나타내고, "추출물"은 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 나타낸다.

도 2는 파골세포의 분화 시스템에서 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물의 첨가에 따른 TRAP 양성인 세포수를 측정한 결과를 나타낸다.

도 3은 파골세포의 분화 시스템에서 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물의 첨가에 따른 골 흡수 시험(bone resorption assay) 결과로서, lacunae 형성을 측정한 결과이다. 도 3에서 M30은 M-CSF(Macrophage-colony stimulating factor) 30ng/ml 을 나타내고, R100은 RANKL(Receptor activator of NF-κB ligand) 100ng/ml 을 나타내고, "추출물"은 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 나타낸다.

도 4 및 도 5는 파골세포의 분화 시스템에서 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물의 첨가에 따른 파골 세포 표지자 Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) 및 Calcitonin receptor (CTR)의 mRNA 발현 변화를 Real-Time PCR (Polymerase Chain Reaction)로 측정한 결과이다. 도 4 및 도 5에서 rhM-CSF는 재조합 인간 M-CSF(Macrophage-colony stimulating factor)를 나타내고, rhRANKL은 재조합 인간 RANKL(Receptor activator of NF-κB ligand)를 나타내고, "추출물"은 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 나타낸다.

유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물은 파골세포의 분화를 효과적으로 억제함으로써 우수한 골다공증의 예방 및 치료효과를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 즉, 마우스의 골수 세포를 RANKL 과 M-CSF로 처리하여 파골세포의 분화를 유도하는 조건에서 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 처리하였을 때, 다핵성 파골 세포의 분화가 억제되는 것이 밝혀졌다 (도 1). 상기 파골세포의 분화억제는 농도-의존적으로 억제되었으며, 20 ug/ml의 농도에서는 다핵성의 파골 세포가 전혀 관찰되지 않았다(도 2). RANKL과 M-CSF의 자극에 의해 형성된 파골 세포는 골 흡수 부위(lacunae)의 형성을 통해 골 흡수능을 보였으며 동일 조건에 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 처리한 경우에 골 흡수 부위(lacunae)의 형성이 유의성 있게 감소하였고, 20 ug/ml 의 농도에서는 골 흡수 양상이 전혀 관찰되지 않았다 (도 3). 따라서, 이러한 시험결과로부터, 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물은 파골세포의 분화 및 골 흡수능을 억제함으로써 골다공증에 대한 우수한 치료 효과를 보일 것으로 기대된다.

상기 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물은 80 ∼ 130의 프로시아니돌릭 값(Procyanidolic value, PCV); 30 % 이하의 (+)카테킨 및 (-)에피카테킨의 함량; 및 95 ∼ 105 %의 프로안토시아디딘 함량을 갖는 것이 특히 바람직하다.

본 명세서에서 상기 "프로시아니돌릭 값(Procyanidolic value, 이하 'PCV'라 칭함)"은 다음 방법 및 식에 의해서 계산된 값을 의미한다.

① 표준액의 조제

유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물 표준품 100 mg을 정밀히 달아 이소프로판올을 가해 50 ml로 한다. 이 액 10 ml를 취하여 3M 염산 10 ml를 가하고 이소프로판올을 가해 50 ml로 한 액을 표준액으로 한다.

② 검액 조제

샘플 100mg을 정밀히 달아, 표준액과 동일하게 조작하여 검액으로 한다.

③ 조작

검액 및 표준액 10 ml 씩 각각 5개의 시험관에 넣고 마개를 한 다음, 100℃ 수욕중에서 45분간 가열한다. 가열 후 시험관을 냉수에 넣어 냉각시키고, 각 시험관의 액 2 ml를 취한 후 이소프로판올 20 ml를 가한다. 반응시킨 검액, 표준액을 가지고 이소프로판올을 대조액으로 하여 550 nm에서 흡광도를 측정하고 각 5개의 평균 흡광도를 구한다.

④ 계산식

PCV = 105 X [A(t) X Mt X (100-Et)] / [A(s) X M X (100-E)]

A(t): 반응시킨 검액의 평균 흡광도

A(s): 반응시킨 표준액의 평균 흡광동

Mt: 표준품 취한 량(mg)

M: 검체 취한 량(mg)

Et: 표준품의 수분 함량(%)

E: 검체의 수분함량(%)

상기 (+)카테킨 및 (-)에피카테킨의 함량은 다음과 같이 정량된 값을 의미한다.

① 표준액의 조제

(+)카테킨 표준품, (-)에피카테킨 표준품 각각 50 mg을 정밀하게 달아 아세토니트릴·묽은 인산 혼합액(5:95)에 녹여 100ml로 한 액을 표준액으로 한다.

② 검액 조제

샘플 50mg을 정밀하게 달아, 아세토니트릴·묽은 인산 혼합액(5:95)에 녹여 10ml로 한 액을 검액으로 한다.

③ 분석조건

- 컬럼: 옥타데실실릴화한 실리카겔을 충진한 컬럼 (0.46 X 25 cm, 5 um)

- 이동상 (표 1)

표 1

시간(분)	이동상A	이동상 B
0	95	5
50	85	15
60	20	80
70	95	5

이동상 A: 묽은 인산 (묽은 인산: 0.3%, V/V 수용액)

이동상 B: 아세토니트릴

- 유속: 0.7 ml/분

- 검출기: 자외부흡광도측정 (측정파장: 278 nm)

- 주입량: 10 ul

④ 계산식

에피카테킨으로서 카테킨의 함량(%)

= [A1 X Me X 100 X 100] / [Ae X M1 X (100-E) X 10]

에피카테킨의 함량(%)

= [A2 X Me X 100 X 100] / [Ae X M1 X (100-E) X 10]

A1: 검액 중 카테킨의 피크면적

A2: 검액 중 에피카테킨의 피크면적

Ae: 표준액 중 에피카테킨의 피크면적

Me: 표준액 중 에피카테킨의 양(mg)

M1: 검액 중 추출물의 양(mg)

E: 추출물중 수분(%)

또한, 상기 "프로안토시아디딘 함량"이라 함은 다음 방법 및 식에 의해서 계산된 값을 의미한다.

① 내부표준액의 조제

2,6-디-tert-부틸-4-메틸페놀(2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol, BHT) 30.0 mg을 정밀하게 달아 100 ml 용량플라스크에 넣고 이동상으로 표선을 맞추어 내부표준액으로 한다.

② 검액 1의 조제

샘플 10 mg을 정밀하게 달아 10 ml 용량플라스크에 넣고 5 ml 내부표준액 용액에 녹인 후, 내부표준액으로 표선을 맞추어 검액으로 한다.

③ 검액 2의 조제

④ 표준액의 검량선 조제

- 표준액 1: 프로안토시아니딘 표준품 8 mg을 정밀하게 달아 10 ml 용량플라스크에 넣고 5 ml 내부표준액에 녹인 후, 내부표준액으로 표선을 맞추어 표준액 1로 한다.

- 표준액 2: 프로안토시니딘 표준품 10 mg을 정밀하게 달아 10 ml 용량플라스크에 넣고 5 ml 내부표준액에 녹인 후, 내부표준액으로 표선을 맞추어 표준액 2로 한다.

- 표준액 3: 프로안토시아니딘 표준품 12 mg을 정밀하게 달아 10 ml 용량플라스크에 넣고 5 ml 내부표준액에 녹인 후, 내부표준액으로 표선을 맞추어 표준액 3으로 한다.

⑤ 조작조건

- 컬럼: PL Gel Column (7.6 X 300 mm, 5 um) 또는 그와 유사한 컬럼

- 검출기: 자외부흡광광도계 (측정파장: 280 nm)

- 이동상: 테트라히드로퓨란과 리튬 브로마이드 수용액의 혼합용매(95:5)

* 리튬 브로마이드 수용액: 리튬 브로마이드 1.04g을 정밀하게 취하여 1000 ml 용량플라스크에 넣고 물로 표선을 맞춘다.

- 유속: 1.0 ml/min

- 주입량: 10 uL

- 측정시간: 15분

⑥ 조작방법

표준액 1, 2, 3 및 검액 1, 2를 아래의 액체크로마토그래피법으로 각각 2회씩 분석한다. 단 표준액의 농도와 그에 상응하는 주피크 대 IS피크 면적비(A_{proanthocyanidin}/A_BHT)로 표준액의 검량선을 작성하고 아래의 식에 따라 계산한다.

⑦ 계산식

- Ti% = {[(A_{proanthocyanidin}/A_BHT)_test - a] / b} x (1 / C_test) x 100

A_{proanthocyanidin}= 검액에서 프로안토시아니딘의 피크면적

A_BHT= 검액에서 BHT의 피크면적

a = 표준액 검량선의 Y 절편값

b = 표준액 검량선의 기울기값

C_test = 검액의 농도(mg/ml)

- 프로안토시아니딘 함량(%) = Ti% x [(100-KF_std)/(100-KF_test)]

KF_std = 표준품 수분보정

KF_test = 검체 수분보정

또한, 상기 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물은 본 발명자들에 의해 개발된 개선된 제조방법(즉, 국제특허공개 제WO2009/031826호)에 의해 제조된 것을 바람직하게 사용할 수 있다.

즉, 상기 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물은 (a) 분쇄된 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨를 아세톤 및 물의 부피비가 1 : 1 내지 2인 아세톤과 물의 혼합용매로 실온에서 추출하고, 여과하는 단계; (b) 단계(a)에서 얻어진 여액을 증류하여 아세톤을 제거한 다음, 염화나트륨을 포화시키고, 여과하는 단계; (c) 단계(b)에서 얻어진 여액을 에틸 아세테이트로 추출하고, 농축시키는 단계; 및 (d) 단계(c)에서 얻어진 농축물에 클로로포름을 가하고, 여과하여 침전물을 얻는 단계를 포함하는 제조방법에 의해 얻어질 수 있다.

분쇄된 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨는 유럽종 포도(Vitis vinifera)를 압착하여 얻어진 껍질, 씨, 가지를 물에 세척하고 오븐 등을 사용하여 건조시킨 후, 씨를 분리하고, 이를 통상의 방법으로 분쇄함으로써 얻을 수 있다.

상기 제조방법은 종래의 추출방법(예를 들어, GB-A-1541469)에 비하여 아세톤 함량이 낮은 물-아세톤 혼합용매를 1차 추출용매로 사용하고, 별도의 가온 없이 실온(약 25 ℃)에서 1차 추출공정을 수행한다. 상기 제조방법에서 사용하는 물-아세톤 혼합용매로는 아세톤 및 물의 부피비가 1 : 1 내지 2, 바람직하게는 약 1 : 1.5인 혼합용매를 사용할 수 있다. 상기 1차 추출은 단회 또는 반복적으로 수행할 수 있으며, 2 내지 3 회 반복 수행하는 것이 더욱 바람직하다. 단계(a)의 상기 여과는 통상의 방법으로 수행할 수 있으며, 다음 단계의 수행을 위하여 여액을 회수한다.

단계(a)에서 얻어진 여액을 증류하여 아세톤을 제거한 다음, 염화나트륨을 포화시키고, 여과하는 단계[단계(b)]에 있어서, 상기 증류에 의하여 상대적으로 비등점이 낮은 아세톤이 제거되게 되며, 아세톤에 용해되어 있는 불순물들이 침전되게 된다. 상기 증류는 통상의 증류 방법에 따라 수행될 수 있으며, 예를 들어 감압 조건에서 증류하여 수행될 수 있다. 바람직하게는 약 50 ℃ 이하의 감압 조건에서 수행되는 것이 바람직하다. 증류 과정을 거쳐 얻어진 추출액은 별도의 유기용매 추출과정 없이, 곧바로 염화나트륨 포화 및 여과 과정이 수행된다. 상기 추출액(즉, 아세톤이 증류된 추출액)을 염화나트륨으로 포화시키면, 탄닌 성분 등의 불순물이 침전되게 되며, 이는 여과 과정을 통하여 제거되게 된다. 상기 염화나트륨 포화 및 여과에 의한 불순물 침전은 염화나트륨을 포화시킨 다음, 2 내지 3 시간 동안 방치한 후, 여과하는 것이 바람직하다. 상기 여과는 통상의 방법으로 수행할 수 있으며, 다음 단계의 수행을 위하여 여액을 회수한다.

단계(b)에서 얻어진 여액을 에틸 아세테이트로 추출하고, 농축시키는 단계[단계(c)]에 있어서, 상기 에틸 아세테이트를 이용한 추출(2차 추출)은 단회 또는 반복적으로 수행할 수 있으며, 바람직하게는 2 내지 3 회 반복 수행하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 농축은 단계(b)에서 얻어진 추출액(즉, 여액) 총 부피에 대하여 0.4 내지 0.7 배로 농축되도록 수행되는 것이 바람직하다.

단계(c)에서 얻어진 농축물에 클로로포름을 가하고, 여과하여 침전물을 얻는 단계[단계(d)]에 있어서, 상기 클로로포름을 가할 경우, 클로로포름에 용해되지 않는 올리고머를 포함한 유효성분들이 침전되게 되며, 생성된 침전물은 간단히 여과함으로써 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 간단히 분리해낼 수 있다. 여과하여 얻어진 침전물은 통상의 방법에 따라 건조함으로써, 건조 분말 형태로 얻을 수 있으며, 상기 건조는 감압 조건, 예를 들어 50 ℃ 이하의 감압 조건에서 건조함으로써 수행될 수 있다.

선택적으로, 본 발명의 약학 조성물에 유효성분으로 함유되는 상기 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물은 (1) (i) 분쇄된 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨를 아세톤 및 물의 부피비가 3 ∼ 5 : 1인 아세톤과 물의 혼합용매로 추출하고, 여과하는 단계; (ii) 단계(i)에서 얻어진 여액을 농축하여 아세톤을 제거하고, 여과하는 단계; (iii) 단계(ii)에서 얻어진 여액을 에틸 아세테이트로 추출하는 단계; (iv) 단계(iii)에서 얻어진 추출물을 건조하여 제1 추출물을 얻는 단계; (2) (p) 분쇄된 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨를 물로 추출하고, 여과하는 단계; (q) 단계(p)에서 얻어진 여액을 에탄올로 추출하고, 여과하는 단계; (r) 단계(q)에서 얻어진 여액을 건조하여 제2 추출물을 얻는 단계; 및 (3) 상기 제1 추출물 및 제2 추출물을 혼합하는 단계를 포함하는 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물의 제조방법에 의해 얻어질 수 있다.

상기 제조방법은 제1 추출물 및 제2 추출물을 별도로 제조하고, 이들을 혼합하여 추출물을 얻음으로써 수행된다. 따라서, 상기 제조방법은 전체적으로 아세톤의 사용량을 줄일 수 있을 뿐만 아니라, 염화나트륨 포화공정 및 클로로포름 추출공정을 결여하므로, 추출이 간단하고 유기용매 사용으로 인한 환경오염의 문제도 최소화할 수 있다. 또한, 얻어지는 추출물의 수율을 약 10배 정도로 크게 높일 수 있다.

제1 추출물 제조에 있어서, 단계(i)는 분쇄된 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨를 아세톤 및 물의 부피비가 3 ∼ 5 : 1, 더욱 바람직하게는 4 : 1인 아세톤과 물의 혼합용매로 추출하고, 여과함으로써 수행된다. 상기 1차 추출은 단회 또는 반복적으로 수행할 수 있으며, 2 내지 3 회 반복 수행하는 것이 더욱 바람직하다. 단계(i)의 상기 여과는 통상의 방법으로 수행할 수 있으며, 다음 단계의 수행을 위하여 여액을 회수한다.

제1 추출물 제조에 있어서, 단계(ii)는 단계(i)에서 얻어진 여액을 농축하여 아세톤을 제거하고, 여과함으로써 수행된다. 상기 농축에 의하여 상대적으로 비등점이 낮은 아세톤이 제거되게 되며, 아세톤에 용해되어 있는 불순물들이 침전되게 된다. 상기 농축은 통상의 감압 농축(또는 감압 증류)에 의해 수행될 수 있으며, 예를 들어 감압 조건에서 증류하여 수행될 수 있다. 농축 과정을 거친 후 여과에 의해 침전물을 제거하고 여액을 회수한다.

제1 추출물 제조에 있어서, 단계(iii)은 단계(ii)에서 얻어진 여액을 에틸 아세테이트로 추출함으로써 수행된다. 상기 에틸 아세테이트를 이용한 추출(2차 추출)은 단회 또는 반복적으로 수행할 수 있으며, 바람직하게는 2 내지 3 회 반복 수행하는 것이 바람직하다. 또한, 단계(iii)은 상기 에틸 아세테이트를 이용한 추출공정 수행 후, 무수 황산나트륨 등을 이용한 탈수 공정을 추가로 포함할 수 있다.

제1 추출물 제조에 있어서, 단계(iv)는 단계(iii)에서 얻어진 추출물을 건조함으로써 수행된다. 상기 건조는 통상의 방법, 예를 들어 50 ℃ 이하의 감압 조건에서의 건조에 의해 수행될 수 있다. 더욱 바람직하게는 단계(iii)에서 얻어진 추출물을 농축하여 에틸 아세테이트를 제거하고, 얻어진 농축물을 물에 용해시킨 후, 분무건조함으로써 수행될 수 있다.

제2 추출물 제조에 있어서, 단계(p)는 분쇄된 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨를 물로 추출하고, 여과함으로써 수행할 수 있고; 단계(q)는 단계(p)에서 얻어진 여액을 에탄올로 추출하고, 여과함으로써 수행할 수 있다. 단계(q)의 상기 추출은 단회 또는 반복적으로 수행할 수 있으며, 바람직하게는 2 내지 3 회 반복 수행하는 것이 바람직하다.

또한, 제2 추출물 제조에 있어서, 단계(r)은 단계(q)에서 얻어진 여액을 건조함으로써 수행할 수 있다. 단계(r)의 상기 건조는 단계(q)에서 얻어진 여액을 분무건조함으로써 수행되거나; 단계(q)에서 얻어진 여액을 농축한 후, 얻어진 농축액을 분무건조함으로써 수행되는 것이 바람직하다. 상기 농축은 단계(q)에서 얻어진 여액 총 부피에 대하여 0.4 내지 0.7 배로 농축될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기와 같이 얻어진 제1 추출물 및 제2 추출물의 혼합은 단순히 추출물들을 혼합함으로써 수행될 수 있으며, 상기 제1 추출물 및 상기 제2 추출물의 혼합비는 1 : 0.5∼1.5 의 중량비일 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하며, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화될 수 있으며, 바람직하게는 정체 형태로 제제화될 수 있다. 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한다. 또한, 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 포함한다. 경구용 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 포함할 수 있으며, 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제 등을 포함할 수 있다. 경구용 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 포함하며, 물, 리퀴드 파라핀 등의 희석제, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다. 비경구용 제제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제를 포함하며, 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르류 등을 포함한다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학조성물에 함유되는 상기 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 상기 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물은 1일 1 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 5 내지 50 mg/kg의 용량, 더욱 바람직하게는 약 5 내지 10 mg/kg의 용량으로 투여할 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다. 본 발명의 약학 조성물은 단독으로 투여되거나 다른 골다공증 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 병용하여 투여할 경우 다른 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 단독 투여 또는 병용 투여 시 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 바람직하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학조성물은 랫트, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하 주사에 의해 투여될 수 있으며, 바람직하게는 경구로 투여될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 시험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 시험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 시험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물의 제조

유럽종 포도(Vitis vinifera)를 압착하여 껍질, 씨, 가지를 모아 물에 세척하고 회전 오븐에서 건조시킨 후, 씨를 분리하였다. 얻어진 씨 1 kg을 분쇄한 다음, 정제수 300 ml 및 아세톤 200 ml로 이루어진 아세톤 수용액 500 ml를 가하여, 실온에서 추출하였다. 상기 추출 과정을 3회 반복하고, 얻어진 추출액을 모두 합하여 여과하였다. 얻어진 여액을 50 ℃ 이하의 감압하에서 증류하여 아세톤을 제거한 다음, 염화나트륨을 포화시킨 후, 약 3 시간 동안 실온에서 방치한 다음 여과하였다. 얻어진 여액을 에틸 아세테이트 250 ml을 사용하여 3회 추출한 다음, 무수 황산나트륨으로 탈수하였다. 얻어진 추출액을 부피가 약 125 ml로 줄어들 때까지 감압 농축시켰다. 얻어진 농축액에 클로로포름 약 600 ml를 가하여 침전물을 생성시킨 후, 여과하였다. 여과하여 얻어진 침전물을 50 ℃ 이하의 진공 오븐에서 건조하여 약 3.5 g의 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 갈색 분말 상으로 얻었다. 얻어진 추출물을 희산성 용액에서 가열하여 가수분해한 다음, 프로시아니돌릭 올리고머의 함량을 정량하여 PCV (Procyanidolic value)를 측정한 결과, 약 105의 높은 값을 나타내었다. 또한, 상기한 바와 같이 프로안토시아디딘 함량을 측정한 결과 103 % 이었다. 따라서 상기 추출물은 (+)카테킨 및 (-)에피카테킨의 모노머가 2개 이상 중합된 올리고머류를 다량으로 함유한다.

실시예 2. 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물의 제조

유럽종 포도(Vitis vinifera)를 압착하여 껍질, 씨, 가지를 모아 물에 세척하고 회전 오븐에서 건조시킨 후, 씨를 분리하였다. 얻어진 씨 1 kg을 분쇄한 다음, 아세톤 수용액 (아세톤/물 = 8/2, v/v) 500 ml를 가하여 추출하였다. 상기 추출 과정을 3회 반복하고, 얻어진 추출액을 모두 합하여 여과하였다. 얻어진 여액을 감압농축하여 아세톤을 제거한 후, 여과하였다. 얻어진 여액을 에틸 아세테이트 250 ml을 사용하여 3회 추출한 다음, 무수 황산나트륨으로 탈수하였다. 얻어진 추출액을 감압농축하여 에틸 아세테이트를 제거하고, 얻어진 농축물을 물 500 ml에 용해시킨 후, 분무건조하여 분말상의 추출물(제1 추출물) 약 20 g을 얻었다.

유럽종 포도(Vitis vinifera)를 압착하여 껍질, 씨, 가지를 모아 물에 세척하고 회전 오븐에서 건조시킨 후, 씨를 분리하였다. 얻어진 씨 1 kg을 분쇄한 다음, 정제수 500 ml를 가하여 추출하였다. 상기 추출 과정을 3회 반복하고, 얻어진 추출액을 모두 합하여 여과하였다. 얻어진 여액을 에탄올 250 ml을 사용하여 3회 추출한 다음, 여과하였다. 얻어진 여액을 감압농축한 후, 얻어진 농축액을 분무건조하여 분말상의 추출물(제2 추출물) 약 15 g을 얻었다.

상기 제1 추출물 및 제2 추출물을 혼합하여 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물 약 35 g을 얻었다. 얻어진 추출물을 희산성 용액에서 가열하여 가수분해한 다음, 프로시아니돌릭 올리고머의 함량을 정량하여 PCV (Procyanidolic value)를 측정한 결과, 약 98 의 높은 값을 나타내었다. 또한, 상기한 바와 같이 프로안토시아디딘 함량을 측정한 결과 98.5 % 이었다. 따라서 상기 추출물은 (+)카테킨 및 (-)에피카테킨의 모노머가 2개 이상 중합된 올리고머류를 다량으로 함유한다.

시험예.

정상 마우스의 골수 세포에서 파골 세포의 분화는 다음과 같이 유도하였다: 시험동물은 6∼7 주령의 수컷 DBA-1 계 마우스를 사용하였다. 골수세포에서 파골세포의 분화를 monoculture system 에서 관찰하였다. 마우스의 경골(tibia)과 비골(femur)에서 골수세포를 분리한 다음, 분리한 세포의 RBC를 용해시키고 24 웰 플레이트에 10% Minimum α-MEM 에 희석하여 2 x 10⁵ cells/well 로 접종한 후, 12 시간 동안 배양하였다. 부착성 세포(adherent cell)를 제거한 후 macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) 자극을 준 후 3일간 배양한 다음, M-CSF 30 ng/ml 과 receptor activator of NF-κB ligand (RANKL) 100ng/ml 및 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물 0.2, 2, 10, 또는 20 ug/ml 을 각각 처리하여 2일 동안 배양하였다. 2일 후 배지를 교환하고 동일하게 재처리한 후 2일 동안 배양하였다.

시험예 1. 파골 세포 분화능에 미치는 영향 평가

(1) TRAP 염색을 통한 파골세포의 분화능 평가

최종 배양 7일 후, 부착된 세포를 제조사의 프로토콜에 따라 leukocyte acid phosphase Kit (387-A,Sigma, St.Louis, MO,USA) 로 파골세포의 지표효소의 TRAP 염색을 실시하였다. TRAP 양성세포(red color) 중 5개 이상의 핵을 가진 세포를 파골세포로 간주하였다. 양성 대조군인 RANKL과 M-CSF 를 처리한 경우에는 다핵성의 파골 세포가 유의성 있게 증가하였고 이러한 조건에 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 처리한 경우에 TRAP 양성인 세포가 추출물의 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다 (도 1).

(2) TRAP 양성 세포의 개수 차이 평가

TRAP 양성세포 (red color) 중 5개 이상의 핵을 가진 세포를 파골세포로 간주하여 그 세포 수를 측정하였다. 핵이 5개 이상인 TRAP 양성인 파골 세포의 개수는 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 처리한 경우에 RANKL과 M-CSF 를 처리한 경우와 비교시 유의성 있게 감소하였으며 20ug/ml 의 농도에서는 TRAP 양성 세포가 전혀 관찰되지 않았다 (도 2).

시험예 2. 파골 세포의 골 흡수능 측정(bone resorption assay)

최종 배양 7일 후, 세포를 5% sodium hypochlorite 용액을 사용하여 제거한 후, 헤마톡실린(Hematoxylin)으로 염색하여 파골세포의 골 흡수 작용에 의하여 생성된 골 흡수 부위 (lacunae) 를 촬영하였다. RANKL과 M-CSF를 처리하였을 때 lacunae 형성이 관찰되었으나, 동일 조건에서 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 처리한 경우에 lacunae 형성이 유의성 있게 감소하였고, 20ug/ml 의 농도에서는 골 흡수 양상이 전혀 관찰되지 않았다 (도 3).

시험예 3: 파골 세포의 표지자 확인

Monoculture system에서 얻은 파골 세포에서 파골 세포의 표지자인 Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) 및 Calcitonin receptor (CTR)의 mRNA 발현 정도를 Real-Time PCR(Polymerase Chain Reaction)를 이용하여 측정하였으며, 그 결과는 도 4 및 도 5와 같다.

도 4 및 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 처리한 경우, 파골 세포 표지자들의 mRNA 발현이 유의성 있게 감소하였음을 알 수 있다.

Claims

유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물이 80 ∼ 130의 프로시아니돌릭 값(Procyanidolic value, PCV); 30 % 이하의 (+)카테킨 및 (-)에피카테킨의 함량; 및 95 ∼ 105 %의 프로안토시아디딘 함량을 갖는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물이 (a) 분쇄된 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨를 아세톤 및 물의 부피비가 1 : 1 내지 2인 아세톤과 물의 혼합용매로 실온에서 추출하고, 여과하는 단계; (b) 단계(a)에서 얻어진 여액을 증류하여 아세톤을 제거한 다음, 염화나트륨을 포화시키고, 여과하는 단계; (c) 단계(b)에서 얻어진 여액을 에틸 아세테이트로 추출하고, 농축시키는 단계; 및 (d) 단계(c)에서 얻어진 농축물에 클로로포름을 가하고, 여과하여 침전물을 얻는 단계를 포함하는 제조방법으로 얻어진 추출물임을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물이 (1) (i) 분쇄된 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨를 아세톤 및 물의 부피비가 3 ∼ 5 : 1인 아세톤과 물의 혼합용매로 추출하고, 여과하는 단계; (ii) 단계(i)에서 얻어진 여액을 농축하여 아세톤을 제거하고, 여과하는 단계; (iii) 단계(ii)에서 얻어진 여액을 에틸 아세테이트로 추출하는 단계; (iv) 단계(iii)에서 얻어진 추출물을 건조하여 제1 추출물을 얻는 단계; (2) (p) 분쇄된 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨를 물로 추출하고, 여과하는 단계; (q) 단계(p)에서 얻어진 여액을 에탄올로 추출하고, 여과하는 단계; (r) 단계(q)에서 얻어진 여액을 건조하여 제2 추출물을 얻는 단계; 및 (3) 상기 제1 추출물 및 제2 추출물을 혼합하는 단계를 포함하는 제조방법으로 얻어진 추출물임을 특징으로 하는 약학 조성물.