WO2010044464A1 - 改変アミロイドβペプチド - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a method for enhancing the immune response inducing ability of amyloid ⁇ (hereinafter, A ⁇ ) peptide.
- a ⁇ amyloid ⁇
- the present invention relates to a prophylactic / therapeutic agent for Alzheimer's disease characterized by adding or inserting cysteine or a similar substance into a peptide derived from A ⁇ which is a causative agent of Alzheimer's disease or a part thereof.
- Alzheimer's disease is a type of demented disease whose main symptoms are a decline in cognitive function and personality as the brain gradually shrinks. With the advent of an aging society, the number of patients with Alzheimer's disease continues to increase. In Japan, the United States, and Europe, the number of patients is expected to increase from 5.6 million in 2004 to 7.3 million in 2014. Has been. Therefore, early development of preventive and therapeutic drugs for Alzheimer's disease is strongly demanded.
- Alzheimer's disease has three major characteristics: neuronal atrophy / dropout, senile plaque formation due to A ⁇ aggregation / deposition, and neurofibrillary tangles composed of abnormal tau protein.
- Alzheimer's disease is broadly classified into familial Alzheimer's disease and sporadic Alzheimer's disease. In the former, the causative gene mutation was identified, and its phenotype was clarified, which revealed that the increase in the production of amyloid ⁇ peptide (especially A ⁇ 1-42 consisting of 42 amino acids) in the brain is the root cause. It was done.
- familial Alzheimer's disease is diagnosed in less than 1% of all Alzheimer's patients, and the most urgent elucidation is sporadic Alzheimer's disease, which accounts for more than 99% of patients. is there.
- Sporadic Alzheimer's disease may be caused by duplication of unidentified genetic risk factors, the presence of recessive genes, the presence of environmental risk factors, and so on.
- the pathogenesis of sporadic Alzheimer's disease that undergoes a similar pathological pathology based on the fact that the genetic mutations in familial Alzheimer's disease described above are consistent in that it results in an increase in highly cohesive A ⁇ 42. Is also considered to be mainly caused by an increase in A ⁇ 42.
- amyloid hypothesis Such an idea is called the amyloid hypothesis, and research on treatments for this hypothesis is now widely conducted.
- a ⁇ is excised from the precursor protein by membrane-bound aspartic protease and produced. ⁇ -secretase cuts the N-terminal side of A ⁇ and ⁇ -secretase cuts the C-terminal side. The excised A ⁇ is eventually secreted out of the cell depending on the synaptic activity. A ⁇ rapidly self-aggregates, and monomer A ⁇ forms a protofibular body that is a prefibrous structure via dimers and trimers through soluble multimers (oligomers), and then forms insoluble amyloid fibrils. Accumulate. The idea that the negative action of aggregated soluble A ⁇ oligomers on nerves is an important part of the pathology in Alzheimer's disease is now mainstream.
- a ⁇ oligomers that inhibit neurotransmission have been reported, including dimers, trimers, amylospheroids (53 kDa aggregates), A ⁇ 56 (56 kDa aggregates) and ⁇ 40 amino acid long aggregates. It is done.
- a ⁇ clearance by anti-A ⁇ antibodies includes phagocytosis by microglia via antibody Fc receptor, promotion of dissolution of fibrotic A ⁇ , inhibition of aggregation, and binding of A ⁇ in blood to excretion of soluble A ⁇ from the brain.
- T cell epitopes present in the A ⁇ sequence itself The cause of AN1792 causing meningitis is thought to be the result of using a powerful adjuvant, QS21, and inducing cellular immunity by T cell epitopes present in the A ⁇ sequence itself.
- an object of the present invention is to provide a safer peptide for vaccine therapy of Alzheimer's disease by devising the shape of the A ⁇ peptide.
- cysteine which is the minimum unit constituting a protein and is also a constituent amino acid of the living body
- the molecule is found to have an immune response enhancing activity by directly adding or inserting the molecule into the target immunogenic peptide, and adding or adding a cysteine molecule to a partial sequence of the A ⁇ peptide without using the full-length sequence of the A ⁇ peptide
- an immune response enhancing activity against A ⁇ can be obtained by insertion (PCT / JP2008 / 057612).
- the inventors have found a method for obtaining an immune response enhancing activity against A ⁇ and a novel addition form of a cysteine molecule to a A ⁇ peptide expected to reduce cellular immunity induction.
- the present invention is a novel method for enhancing immune response, specifically, characterized in that cysteine is added or inserted into an immunogenic peptide, and includes the following inventions.
- a cysteine or cysteine analog is added or inserted into a part of amyloid ⁇ peptide or a sequence derived from amyloid ⁇ peptide selected from any of the following (A) to (F): Peptides to: (A) (a) a peptide consisting of 1 to 18th from the N-terminal of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a peptide consisting of a part thereof; and (b) 28th to 42nd from the N-terminal of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
- a peptide comprising 9 or more amino acid residues including the 28th to 36th amino acid residues, and further having cysteine or a cysteine analog bound to the C-terminus thereof;
- a cysteine or cysteine analog is inserted between the 18th and 19th amino acid residues from the N-terminal of the peptide consisting of the 1st to 26th or the 1st to 27th from the N terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
- cysteine or cysteine analog is inserted between the 18th and 19th amino acid residues from the N-terminus of the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a part thereof, and cysteine is also added to the C-terminus Or a peptide conjugated with a cysteine analog;
- cysteine or a cysteine analog is bound to the C-terminal of the peptide consisting of 1 to 18th from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a peptide consisting of a part thereof, and the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
- E a peptide having a cysteine analog bound to the C-terminus of
- the peptide of (a) in (A) above is 1 to 10, 2 to 10, 3 to 10, 1 to 9, 2 to 9, from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
- the peptide according to (1) above which is selected from peptides consisting of 28th to 40th, 28th to 41st, and 28th to 42nd.
- the peptide of (C) above is a cysteine or cysteine analog between the 18th and 19th amino acid residues from the N-terminus of the peptide consisting of the 1st to 28th amino acids from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
- the peptide according to (1) above, which is a peptide in which is inserted and cysteine or a cysteine analog is bound to the C-terminus.
- the peptide of (D) above is a peptide consisting of cysteine or a cysteine analog bound to the C-terminal of the peptide consisting of the 1st to 18th amino acids from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and the 28th to 37th peptides
- the peptide according to (1) above which is a peptide to which is bound, or optionally a peptide having cysteine or a cysteine analog further bound to the C-terminus thereof.
- the peptide of (F) above comprises two or more peptides obtained by binding cysteine or a cysteine analog to the C-terminus of the peptide consisting of 1 to 28 from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 Or the peptide as described in said (1) which is a peptide connected by the disulfide bond of the cysteine analog.
- the peptide is ⁇ A peptide of any one of SEQ ID NOs: 2 to 19 ⁇ A peptide consisting of two peptides consisting of SEQ ID NO: 20 linked by a disulfide bond and a peptide consisting of SEQ ID NO: 20 and a peptide consisting of SEQ ID NO: 21 bound by a disulfide bond A peptide selected from the group consisting of a peptide obtained by binding two peptides consisting of the peptide SEQ ID NO: 21 by a disulfide bond and a peptide consisting of a plurality of peptides consisting of the SEQ ID NO: 21 linked by a disulfide bond ( The peptide according to any one of 1) to (7).
- a preventive or therapeutic agent for Alzheimer's disease comprising the peptide according to any one of (1) to (8) above as an active ingredient.
- a DNA vaccine effective for the prevention or treatment of Alzheimer's disease comprising a gene fragment encoding the amino acid sequence of the peptide according to any one of (1) to (8) above.
- the present invention further includes a method for preventing or treating Alzheimer's disease in a mammal, comprising administering a pharmaceutically effective amount of the peptide of the present invention to the mammal, and a pharmaceutically effective amount of the mammal. Also provided is a method for preventing or treating Alzheimer's disease in a mammal, comprising administering a gene fragment encoding the amino acid sequence of the peptide of the present invention.
- the present invention also relates to the use of the peptide of the present invention for producing a prophylactic or therapeutic agent for Alzheimer's disease, and a gene encoding the amino acid sequence of the peptide of the present invention for producing a prophylactic or therapeutic agent for Alzheimer's disease. It also provides for the use of fragments.
- the present invention provides an immunogenic peptide with an enhanced immune response capable of obtaining a sufficient immune response against A ⁇ peptide even when used alone without an adjuvant.
- induction of antibody production by an immunogenic peptide can be enhanced only by adding or inserting a cysteine molecule or an analog thereof into a peptide of a part of the A ⁇ peptide or a sequence derived therefrom. Therefore, since there is no restriction by adding a conventional adjuvant, it is easy to design a formulation.
- specific antibodies against A ⁇ peptide can be induced in blood early and in large quantities by administering to the living body an immunogenic peptide having an enhanced immune response according to the present invention.
- Cysteine and its related substances are known to have an anti-toxic effect in vivo, and thus the immunogenic peptide with enhanced immune response according to the present invention is in vivo. It can be used very safely.
- the immunogenic peptide with enhanced immune response according to the present invention can be obtained by a non-biological method by chemical synthesis, and can be stably and uniformly produced as compared with conventional component vaccines. is there. In addition, it is possible to provide a safe vaccine with the lowest risk of toxicity, infectivity, and quality degradation due to contaminants.
- Peptide preparations containing immunogenic peptides with enhanced immune response to A ⁇ peptides according to the present invention can be administered not only by injection such as subcutaneous and intramuscular administration, but also by oral, nasal and transdermal administration methods. It is. According to these methods, it is possible to prevent stress due to injection and medical accidents.
- cysteine molecule or an analog thereof is added or inserted directly into a peptide, or a sequence expressing cysteine is added or inserted into a DNA or RNA sequence.
- the addition or insertion position of cysteine is not particularly limited as long as it has an effect of enhancing immune response to A ⁇ peptide.
- One or more cysteine molecules may be introduced, and a plurality of cysteine molecules may be introduced either continuously or discontinuously.
- the simplest structure is a structure in which one cysteine is linked to the N-terminus or C-terminus of a partial sequence of A ⁇ peptide.
- cysteine As a peptide effective for the prevention or treatment of Alzheimer's disease of the present invention, cysteine (Cys) or a peptide derived from a part of the A ⁇ peptide (DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA: SEQ ID NO: 1) consisting of the amino acid sequence from 1 to 42 The thing to which the analog was added is mentioned.
- Examples of such peptides include the following.
- the cysteine analogs shown here mean cysteine precursors and metabolites, and a preferred example is homocysteine.
- (A) (a) a peptide consisting of 1 to 18th from the N-terminal of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a peptide consisting of a part thereof; and (b) 28th to 42nd from the N-terminal of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
- a peptide consisting of 9 or more amino acid residues including the 28th to 36th amino acid residues, and a cysteine or cysteine analog bound to the C terminus (1) A peptide in which the 28th to 42nd sequences are connected to the C terminus of the 1st to 10th sequences from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a cysteine is added to the C terminus (1-10 ⁇ 28 -42AACys): N end-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVIA C (SEQ ID NO: 2) (2) A peptide in which the 28th to 41st sequences are connected to the C terminus of the 1st to 10th sequence from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and cysteine is added to the C terminus (1-10 ⁇ 28 -41AACys): N end-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVI C (SEQ ID NO: 3) (3) A peptide in which the
- a cysteine or cysteine analog is inserted between the 18th and 19th amino acid residues from the N-terminal of the peptide consisting of the 1st to 26th or the 1st to 27th from the N terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
- Peptide (1) Peptide (1-18Cys19-27AA) in which a cysteine is inserted between positions 18 and 19 of the peptide consisting of 1 to 27 from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (hereinafter referred to as 27 amino acid A ⁇ peptide): N end-DAEFRHDSGYEVHHQKLV C FFAEDVGSN (SEQ ID NO: 14) (2) Peptide (1-18Cys19-26AA) in which a cysteine is inserted between positions 18 and 19 of the peptide consisting of 1 to 26 from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (hereinafter referred to as 26 amino acid A ⁇ peptide): N end-DAEFRHDSGYEVHHQKLV C FFAEDVGS (SEQ ID NO: 15)
- a cysteine or cysteine analog is inserted between the 18th and 19th amino acid residues from the N-terminus of the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a part thereof, and cysteine is also added to the C-terminus Or peptides with cysteine analogs attached
- a peptide in which a cysteine is inserted between the 18th and 19th positions of a peptide consisting of the 1st to 28th amino acids from the N-terminal of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 hereinafter referred to as a 28 amino acid A ⁇ peptide
- cysteine is connected to the C terminus ( 1-18Cys19-28AACys) N end-DAEFRHDSGYEVHHQKLV C FFAEDVGSNK C (SEQ ID NO: 16)
- cysteine or a cysteine analog is bound to the C-terminal of the peptide consisting of 1 to 18th from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a peptide consisting of a part thereof, and the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
- a ⁇ peptides to which cysteine has been added or inserted 1-10 ⁇ 28-42AACys (SEQ ID NO: 2), 1-10 ⁇ 28-41AACys (SEQ ID NO: 2), in which cysteine is added to a peptide in which a part of the amino acids of the A ⁇ peptide has been deleted SEQ ID NO: 3), 1-10 / 28-40AACys (SEQ ID NO: 4), 1-10 / 28-39AACys (SEQ ID NO: 5), 1-10 / 28-38AACys (SEQ ID NO: 6), 1-10 / 28- 37AACys (SEQ ID NO: 7), 1-10 ⁇ 28-36AACys (SEQ ID NO: 8), 1-9 ⁇ 28-37AACys (SEQ ID NO: 9), 2-10 ⁇ 28-37AACys (SEQ ID NO: 10) and 1-18 ⁇ Peptide 28-42AACys (SEQ ID NO: 2), in which cysteine
- the present invention it is possible to prepare a peptide with enhanced immune response by adding or inserting cysteine or a cysteine analog into a part of A ⁇ peptide or a sequence derived from A ⁇ peptide. Whether or not the peptide obtained after addition or insertion has an immune response enhancing effect is confirmed by immunizing a mouse or the like according to a conventional method using the obtained peptide and then measuring the anti-A ⁇ IgG antibody titer in blood be able to. Therefore, the present invention further provides a method for enhancing immune response, characterized by using a peptide obtained by adding or inserting cysteine or a cysteine analog into a part of A ⁇ peptide or a sequence derived from A ⁇ peptide. .
- the peptide preparation with cysteine added according to the present invention can be administered by any method such as subcutaneous, intramuscular injection, oral and nasal administration.
- the most preferred method is subcutaneous or intramuscular administration.
- the cysteine-added immunogenic peptide in the present invention can give a sufficient immunostimulating effect even when administered alone without an adjuvant, but it is possible to obtain a larger immunostimulating effect by adding an adjuvant.
- the adjuvant used preferably activates humoral immunity and does not stimulate cellular immunity, and representative examples thereof include aluminum salts.
- each immunogenic peptide with an enhanced immune response obtained by adding or inserting cysteine or a cysteine analog to a part of the A ⁇ peptide according to the present invention or a sequence derived from the A ⁇ peptide specifically listed above.
- a vector containing the encoded gene fragment can be used as a DNA vaccine effective for the prevention and treatment of Alzheimer's disease.
- the base sequence encoding cysteine include tgt, but are not particularly limited as long as it is a sequence encoding cysteine.
- the gene fragment encoding the A ⁇ peptide consisting of the 42 amino acid residues is as follows.
- sequences shown below are typical A ⁇ peptide gene sequences, and there are no particular limitations on the gene sequences as long as they encode the same amino acid.
- gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgttcttt gcagaagatg tgggttcaaa caaaggtgca atcattggac tcatggtggg cggtgttgtc atagcg SEQ ID NO: 22
- Examples of the gene fragment encoding a peptide in which cysteine (Cys) is added or inserted into the above A ⁇ peptide or a peptide derived from a part or sequence include the following. However, the sequences shown below are representative gene sequences encoding the above peptides, and the gene sequences are not particularly limited as long as they encode the same amino acids.
- Example 1 Comparison of antibody inducing ability of peptides obtained by linking various C-terminal peptides to the 1st to 10th sequences of A ⁇ peptide and adding cysteine to the C-terminal >> (1) Preparation of cysteine-added A ⁇ peptide • Cysteine addition 1 to 10 + 30 to 42 amino acids A ⁇ peptide (1-10 ⁇ 30-42AACys): N end-DAEFRHDSGYAIIGLMVGGVVIA C (SEQ ID NO: 40) Cysteine addition 1 to 10 + 29 to 42 amino acid A ⁇ peptide (1-10 ⁇ 29-42AACys): N end-DAEFRHDSGYGAIIGLMVGGVVIA C (SEQ ID NO: 41) Cysteine addition 1 to 10 + 28 to 42 amino acids A ⁇ peptide (1-10 ⁇ 28-42AACys): N end-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVIA C (SEQ ID NO: 2) 1 to 10 + 28 to 42 amino acid A ⁇ peptide (1
- mice are divided into 4 groups of 4 mice, 1st group: 1-10 / 30-42AACys administration group, 2nd group: 1-10 / 29-42AACys administration group, 3rd group : 1-10 / 28-42AACys administration group, Group 4: 1-10 / 28-42AA administration group.
- mice were bled from the abdominal vena cava under anesthesia with pentobarbital sodium (Kyoritsu Seiyaku, Somnopentyl) on the seventh day after the final immunization.
- pentobarbital sodium Kelvinu Seiyaku, Somnopentyl
- the collected blood was transferred to Microtina (Becton Dickinson), sufficiently coagulated at room temperature, and then centrifuged at 5,000 rpm for 10 minutes. Separated sera were dispensed into two 0.5 mL tubes and stored at ⁇ 80 ° C. until measurement.
- each well was washed three times with 300 ⁇ L of 0.05% Tween20-containing PBS (PBST), 10 mM ethanolamine was added in an amount of 300 ⁇ L / well, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour.
- PBST 0.05% Tween20-containing PBS
- the labeled antibody dilution is discarded, washed twice with 300 ⁇ L / well of PBST and twice with the same amount of distilled water, added with 100 ⁇ L / well of chromogenic substrate solution TMB + (Dako), and protected from light at room temperature for 30 minutes. Reacted for 1 minute. Thereafter, 100 ⁇ L / well of 1N sulfuric acid was added to stop the color development, and the absorbance at 450 nm (OD450 value) was measured.
- Standard serum was diluted with PBST to 0.156, 0.3125, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10 ng / mL to prepare a standard for antibody titer measurement. Simultaneously with the measurement of anti-A ⁇ IgG antibody in each test mouse serum, the OD450 value of each diluted specimen was measured. The anti-A ⁇ IgG antibody titer of each mouse serum was calculated from the standard units obtained and the standard line of OD450 values. Table 1 shows the anti-A ⁇ antibody titers in mouse sera calculated for each immunization group.
- Example 2 1st to 10th sequence of A ⁇ peptide, 28th to 42nd, 28th to 41st, 28th to 40th, 28th to 39th, 28th to 38th, 28th to 37th sequence, 28th Comparison of antibody-inducing ability of peptides with a cysteine added to the C-terminal from the 36th, 28th to 35th and 28th to 34th (1) Preparation of cysteine-added A ⁇ peptide • Cysteine addition 1 to 10 + 28 to 42 amino acids A ⁇ peptide (1-10 ⁇ 28-42AACys): N end-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVIA C (SEQ ID NO: 2) Cysteine addition 1 to 10 + 28 to 41 amino acid A ⁇ peptide (1-10 ⁇ 28-41AACys): N end-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVI C (SEQ ID NO: 3) Cysteine addition 1 to 10 + 28 to 40 amino acids A ⁇ peptide (1-10 / 28-40A
- mice were divided into 8 groups of 4 mice, 1st group: 1-10 / 28-42AACys administration group, 2nd group: 1-10 / 28-41AACys administration group, 3rd group : 1-10 / 28-40AACys administration group, group 4: 1-10 / 28-39AACys administration group, group 5: 1-10 / 28-38AACys administration group, group 6: 1-10 / 28-37AACys Administration group, Group 7: 1-10 / 28-36AACys administration group, Group 7: 1-10 / 28-35AACys administration group and Group 8: 1-10 / 28-34AACys administration group.
- mice were bled from the abdominal vena cava under anesthesia with pentobarbital sodium (Kyoritsu Seiyaku, Somnopentyl) on the seventh day after the final immunization.
- pentobarbital sodium Kelvinu Seiyaku, Somnopentyl
- the collected blood was transferred to Microtina (Becton Dickinson), sufficiently coagulated at room temperature, and then centrifuged at 5,000 rpm for 10 minutes. Separated sera were dispensed into two 0.5 mL tubes and stored at ⁇ 80 ° C. until measurement.
- Anti-A ⁇ IgG antibody was measured in the same manner as described above.
- Table 2 shows the anti-A ⁇ antibody titers in the mouse sera calculated for each immunization group. As shown in Table 2, 1-10 / 28-42AACys, 1-10 / 28-41AACys, 1-10 / 28-40AACys, 1-10 / 28-39AACys, 1-10 / 28-38AACys, 1-10 • High antibody titers against A ⁇ were obtained with 28-37AACys and 1-10 / 28-36AACys peptides.
- mice are divided into 3 groups of 4 mice, 1st group: 1-9 / 28-37AACys administration group, 2nd group: 1-8 / 28-37AACys administration group and 3rd group : 1-7 / 28-37 AACys administration group.
- mice were bled from the abdominal vena cava under anesthesia with pentobarbital sodium (Kyoritsu Seiyaku, Somnopentyl) on the seventh day after the final immunization.
- pentobarbital sodium Kelvinu Seiyaku, Somnopentyl
- the collected blood was transferred to Microtina (Becton Dickinson), sufficiently coagulated at room temperature, and then centrifuged at 5,000 rpm for 10 minutes. Separated sera were dispensed into two 0.5 mL tubes and stored at ⁇ 80 ° C. until measurement.
- Anti-A ⁇ IgG antibody was measured in the same manner as described above. Table 3 shows the anti-A ⁇ antibody titer in the mouse serum in each immunization group calculated. As shown in Table 3, induction of antibodies against A ⁇ was observed with the peptides 1-9 and 28-37AACys.
- mice are divided into 4 groups of 4 mice, group 1: 2-10 / 28-37AACys administration group, group 2: 3-10 / 28-37AACys administration group, group 3 : 4-10 ⁇ 28-37AACys administration group and Group 4: 2-9 ⁇ 28-37AACys administration group.
- mice were bled from the abdominal vena cava under anesthesia with pentobarbital sodium (Kyoritsu Seiyaku, Somnopentyl) on the seventh day after the final immunization.
- pentobarbital sodium Kelvinu Seiyaku, Somnopentyl
- the collected blood was transferred to Microtina (Becton Dickinson), sufficiently coagulated at room temperature, and then centrifuged at 5,000 rpm for 10 minutes. Separated sera were dispensed into two 0.5 mL tubes and stored at ⁇ 80 ° C. until measurement.
- Anti-A ⁇ IgG antibody was measured in the same manner as described above.
- Table 4 shows the anti-A ⁇ antibody titer in the mouse serum in each immunization group calculated. As shown in Table 4, induction of antibodies against A ⁇ was observed with peptides 2-10 ⁇ 28-37AACys, 3-10 ⁇ 28-37AACys and 2-9 ⁇ 28-37AACys.
- Example 5 A peptide in which the 28th to 42nd positions are connected to the 1st to 10th sequences of the A ⁇ peptide and cysteine is added to the C terminus; and the 28th to 42nd positions are connected to the 1st to 18th sequences in the C terminus.
- mice were divided into two groups of 4 mice, and the first group was a 1-18 / 28-42AACys administration group and the second group was a 1-10 / 28-42AACys administration group.
- mice were bled from the abdominal vena cava under anesthesia with pentobarbital sodium (Kyoritsu Seiyaku, Somnopentyl) on the seventh day after the final immunization.
- pentobarbital sodium Kelvinu Seiyaku, Somnopentyl
- the collected blood was transferred to Microtina (Becton Dickinson), sufficiently coagulated at room temperature, and then centrifuged at 5,000 rpm for 10 minutes. Separated sera were dispensed into two 0.5 mL tubes and stored at ⁇ 80 ° C. until measurement.
- Anti-A ⁇ IgG antibody was measured in the same manner as described above.
- Table 5 shows the anti-A ⁇ antibody titers in the mouse sera calculated for each immunization group. As shown in Table 5, similar induction of antibody against A ⁇ was observed in both the 1-18 ⁇ 28-42AACys administration group and the 1-10 ⁇ 28-42AACys administration group.
- mice were bled from the abdominal vena cava under anesthesia with pentobarbital sodium (Kyoritsu Seiyaku, Somnopentyl) on the seventh day after the final immunization.
- pentobarbital sodium Kelvinu Seiyaku, Somnopentyl
- the collected blood was transferred to Microtina (Becton Dickinson), sufficiently coagulated at room temperature, and then centrifuged at 5,000 rpm for 10 minutes. Separated sera were dispensed into two 0.5 mL tubes and stored at ⁇ 80 ° C. until measurement.
- Anti-A ⁇ IgG antibody was measured in the same manner as described above.
- Table 7 shows the anti-A ⁇ antibody titer in the mouse serum in each immunization group calculated. As shown in Table 7, the induction of the same level of antibody against A ⁇ was observed in both the 1-18Cys19-28AA administration group and the 1-18Cys19-28AACys administration group.
- mice were divided into 3 groups of 4 mice, 1st group: 1-18Cys19-27AACys administration group, 2nd group: 1-18Cys19-26AA administration group and 3rd group 1-18Cys19- The 25AA administration group was used.
- mice were bled from the abdominal vena cava under anesthesia with pentobarbital sodium (Kyoritsu Seiyaku, Somnopentyl) on the seventh day after the final immunization.
- pentobarbital sodium Kelvinu Seiyaku, Somnopentyl
- the collected blood was transferred to Microtina (Becton Dickinson), sufficiently coagulated at room temperature, and then centrifuged at 5,000 rpm for 10 minutes. Separated sera were dispensed into two 0.5 mL tubes and stored at ⁇ 80 ° C. until measurement.
- Example 8 Examination of antibody induction of a peptide in which cysteine was added to the connection of the 28th to 37th sequences to the 1st to 18th sequences of A ⁇ peptide >> (1) Preparation of cysteine-added A ⁇ peptide • A peptide in which cysteine is linked to the C-terminal of the 1st to 18th sequence of A ⁇ peptide, followed by 28th to 37th sequence (1-18Cys28-37AA ) N end-DAEFRHDSGYEVHHQKLV C KGAIIGLMVG (SEQ ID NO: 17) A peptide in which a cysteine is linked to the C-terminus of the 1st to 18th sequences of the A ⁇ peptide, followed by a 28th to 37th sequence and a cysteine added to the C-terminus (1-18Cys28-37AACys): N end-DAEFRHDSGYEVHHQKLV C KGAIIGLMVG C (SEQ ID NO: 18)
- Immune group composition 16 mice are divided into 4 groups of 4 mice, 1st group: 1-18Cys28-37AA administration group, 2nd group: 1-18Cys28-37CysAA administration group, 3rd group: 1-18 -28-37AACys administration group and the 4th group: It was set as 1-18 and 28-37AA.
- mice were bled from the abdominal vena cava under anesthesia with pentobarbital sodium (Kyoritsu Seiyaku, Somnopentyl) on the seventh day after the final immunization.
- pentobarbital sodium Kelvinu Seiyaku, Somnopentyl
- the collected blood was transferred to Microtina (Becton Dickinson), sufficiently coagulated at room temperature, and then centrifuged at 5,000 rpm for 10 minutes. Separated sera were dispensed into two 0.5 mL tubes and stored at ⁇ 80 ° C. until measurement.
- Anti-A ⁇ IgG antibody was measured in the same manner as described above.
- Table 8 shows the anti-A ⁇ antibody titer in the mouse serum in each immunization group calculated. As shown in Table 8, induction of antibodies against A ⁇ was observed in the 1-18Cys28-37AA administration group and the 1-18Cys28-37CysAA administration group.
- Example 9 Examination of antibody induction of peptide obtained by adding homocysteine which is a precursor of cysteine or glutathione which is a metabolite to 28 amino acid A ⁇ peptide >> (1) Preparation of A ⁇ peptide added with cysteine precursor or metabolite • Peptide with 28-amino acid A ⁇ peptide added with homocysteine (28AA-homocysteine): N end-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK- Homocysteine (SEQ ID NO: 19) Peptide with 28 amino acid A ⁇ peptide and glutathione added (28AA-glutathione): N end-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK- Glutathione (SEQ ID NO: 53) The above peptide was synthesized (Sigma Aldrich Japan Co., Ltd.), adjusted to 5 mg / mL with physiological saline, used as a stock solution, and stored at ⁇
- mice were bled from the abdominal vena cava under anesthesia with pentobarbital sodium (Kyoritsu Seiyaku, Somnopentyl) on the seventh day after the final immunization.
- pentobarbital sodium Kelvinu Seiyaku, Somnopentyl
- the collected blood was transferred to Microtina (Becton Dickinson), sufficiently coagulated at room temperature, and then centrifuged at 5,000 rpm for 10 minutes. Separated sera were dispensed into two 0.5 mL tubes and stored at ⁇ 80 ° C. until measurement.
- Anti-A ⁇ IgG antibody was measured in the same manner as described above.
- Table 9 shows the anti-A ⁇ antibody titers in the mouse sera calculated for each immunization group. As shown in Table 9, induction of antibodies against A ⁇ was observed in the 28AA-homocysteine administration group.
- Example 10 Examination of antibody induction of disulfide-bonded cysteine-added 28 amino acid A ⁇ peptide >> (1) Preparation of A ⁇ peptide with cysteine added • Peptide with cysteine added to 28 amino acid A ⁇ peptide (28AAC) N end-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK- C (SEQ ID NO: 20) ⁇ Peptide with 28 cysteine added to 28 amino acid A ⁇ peptide (28AACC) N end -DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK- CC (SEQ ID NO: 21)
- mice were divided into two groups of 4 mice, and the first group: 28AAC disulfide 28AAC administration group and the second group: 228AAC disulfide 28AACC administration group.
- mice were bled from the abdominal vena cava under anesthesia with pentobarbital sodium (Kyoritsu Seiyaku, Somnopentyl) on the seventh day after the final immunization.
- pentobarbital sodium Kelvinu Seiyaku, Somnopentyl
- the collected blood was transferred to Microtina (Becton Dickinson), sufficiently coagulated at room temperature, and then centrifuged at 5,000 rpm for 10 minutes. Separated sera were dispensed into two 0.5 mL tubes and stored at ⁇ 80 ° C. until measurement.
- Anti-A ⁇ IgG antibody was measured in the same manner as described above.
- Table 10 shows the anti-A ⁇ antibody titers in the mouse sera calculated for each immunization group. As shown in Table 10, induction of antibodies against A ⁇ was observed in both the 28AAC disulfide 28AAC administration group and the 228AAC disulfide 28AACC administration group in the cysteine-added cysteine-added 28 amino acid A ⁇ peptide subjected to disulfide bonding.
- the method for enhancing immune response using a peptide prepared by adding or inserting cysteine or a similar substance into A ⁇ peptide or a sequence derived therefrom according to the present invention is a peptide vaccine or DNA for the prevention and treatment of Alzheimer's disease. It can be expected as a safe and simple immunostimulation method for vaccines and the like.
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Abstract
Description
(A)(a)配列番号1のアミノ酸配列のN末から1~18番目からなるペプチドまたはその一部からなるペプチドと、(b)配列番号1のアミノ酸配列のN末から28~42番目のうち、28~36番目のアミノ酸残基を含む9個以上のアミノ酸残基からなるペプチドを結合させ、さらにそのC末端にシステインまたはシステイン類似体を結合させたペプチド;
(B)配列番号1のアミノ酸配列のN末から1~26番目または1~27番目からなるペプチドの、N末から18番目と19番目のアミノ酸残基の間にシステインまたはシステイン類似体を挿入させたペプチド;
(C)配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドまたはその一部からなるペプチドの、N末から18番目と19番目のアミノ酸残基の間にシステインまたはシステイン類似体を挿入し、さらにC末端にシステインまたはシステイン類似体を結合させたペプチド;
(D)配列番号1のアミノ酸配列のN末から1~18番目からなるペプチドまたはその一部からなるペプチドのC末端にシステインまたはシステイン類似体を結合させ、さらに配列番号1のアミノ酸配列のN末から28~42番目からなるペプチドまたはその一部からなるペプチドを結合させたペプチド、または選択的にさらにそのC末端にシステインまたはシステイン類似体を結合させたペプチド;
(E)配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドまたはその一部からなるペプチドのC末端にシステイン類似体を結合させたペプチド;
(F)配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドまたはその一部からなるペプチドのC末端にシステインまたはシステイン類似体を結合させた2個以上のペプチドを、当該システインまたはシステイン類似体のジスルフィド結合により連結させたペプチド。
・配列番号2から19のいずれか一つのペプチド
・配列番号20からなる2個のペプチドをジスルフィド結合により結合させたペプチド
配列番号20からなるペプチドと配列番号21からなるペプチドをジスルフィド結合により結合させたペプチド
・配列番号21からなる2個のペプチドをジスルフィド結合により結合させたペプチド
並びに
・配列番号21からなる複数個のペプチドをジスルフィド結合により結合させたペプチド
からなる群より選択されるペプチドである上記(1)から(7)のいずれかに記載のペプチド。
(1) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から1番目~10番目の配列のC末端に、28番目~42番目の配列を繋ぎ、そのC末端にシステインを付加したペプチド(1-10・28-42AACys):
N末-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVIAC(配列番号2)
(2) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から1番目~10番目の配列のC末端に、28番目~41番目の配列を繋ぎ、そのC末端にシステインを付加したペプチド(1-10・28-41AACys):
N末-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVIC(配列番号3)
(3) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から1番目~10番目の配列のC末端に、28番目~40番目の配列を繋ぎ、そのC末端にシステインを付加したペプチド(1-10・28-40AACys):
N末-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVC(配列番号4)
(4) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から1番目~10番目の配列のC末端に、28番目~39番目の配列を繋ぎ、そのC末端にシステインを付加したペプチド(1-10・28-39AACys):
N末-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVC(配列番号5)
(5) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から1番目~10番目の配列のC末端に、28番目~38番目の配列を繋ぎ、そのC末端にシステインを付加したペプチド(1-10・28-38AACys):
N末-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGC(配列番号6)
(6) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から1番目~10番目の配列のC末端に、28番目~37番目の配列を繋ぎ、そのC末端にシステインを付加したペプチド(1-10・28-37AACys):
N末-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGC(配列番号7)
(7) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から1番目~10番目の配列のC末端に、28番目~36番目の配列を繋ぎ、そのC末端にシステインを付加したペプチド(1-10・28-36AACys):
N末-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVC(配列番号8)
(8) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から1番目~9番目の配列のC末端に、28番目~37番目の配列を繋ぎ、そのC末端にシステインを付加したペプチド(1-9・28-37AACys):
N末-DAEFRHDSGKGAIIGLMVGC(配列番号9)
(9) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から2番目~10番目の配列のC末端に、28番目~37番目の配列を繋ぎ、そのC末端にシステインを付加したペプチド(2-10・28-37AACys):
N末-AEFRHDSGYKGAIIGLMVGC(配列番号10)
(10) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から3番目~10番目の配列のC末端に、28番目~37番目の配列を繋ぎ、そのC末端にシステインを付加したペプチド(3-10・28-37AACys):
N末-EFRHDSGYKGAIIGLMVGC(配列番号11)
(11) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から2番目~9番目の配列のC末端に、28番目~37番目の配列を繋ぎ、そのC末端にシステインを付加したペプチド(2-9・28-37AACys):
N末-AEFRHDSGKGAIIGLMVGC(配列番号12)
(12) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から1番目~18番目の配列のC末端に、28番目~42番目の配列を繋ぎ、そのC末端にシステインを付加したペプチド(1-18・28-42AACys):
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVKGAIIGLMVGGVVIAC(配列番号13)
(1) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から1~27番目からなるペプチド(以下、27アミノ酸Aβペプチド)の18番目と19番目の間にシステイン挿入したペプチド(1-18Cys19-27AA):
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCFFAEDVGSN(配列番号14)
(2) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から1~26番目からなるペプチド(以下、26アミノ酸Aβペプチド)の18番目と19番目の間にシステイン挿入したペプチド(1-18Cys19-26AA):
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCFFAEDVGS(配列番号15)
(1) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から1~28番目からなるペプチド(以下、28アミノ酸Aβペプチド)の18番目と19番目の間にシステイン挿入し更にC末端にシステインを繋いだペプチド(1-18Cys19-28AACys)
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCFFAEDVGSNKC(配列番号16)
(1) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から1番目~18番目の配列のC末端にシステインを繋ぎさらにその後ろに28番目~37番目の配列を繋いだペプチド(1-18Cys28-37AA):
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCKGAIIGLMVG(配列番号17)
(2) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から1番目~18番目の配列のC末端にシステインを繋ぎさらにその後ろに28番目~37番目の配列を繋ぎそのC末端にシステインを付加したペプチド(1-18Cys28-37AACys):
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCKGAIIGLMVGC (配列番号18)
(1) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から1番目~28番目の配列のC末端にホモシステインを付加したペプチド(28AA-ホモシステイン)
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKX(配列番号19)(X:ホモシステイン)
(1) 28アミノ酸Aβペプチドにシステインを付加したペプチド(28AAC)
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKC(配列番号20)
(2) 28アミノ酸Aβペプチドにシステインを2個付加したペプチド(28AACC)
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKCC(配列番号21)
上記28AACと28AACをジスルフィド結合により連結したもの(28AACジスルフィド28AAC)、28AACと28AACCをジスルフィド結合により連結したもの(28AACジスルフィド28AACC)、28AACCと28AACCをジスルフィド結合により連結したもの(28AACCジスルフィド28AACC;N末側のシステイン同士がジスルフィド結合したもの、C末側のシステイン同士がジスルフィド結合したもの、C末側とN末側のシステインがジスルフィド結合したもの、C末側同士とN末側同士のシステインがジスルフィド結合したもの、および、それぞれC末側とN末側のシステインがジスルフィド結合したものを含む)、および複数の28AACCをジスルフィド結合により連結したもの(28AACC(28AAC)の結合体)で、その構造を図1に示した。
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgttcttt gcagaagatg tgggttcaaa caaaggtgca atcattggac tcatggtggg cggtgttgtc atagcg (配列番号22)
・1-10・28-42AACysをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgggc ggtgttgtca tagcgtgt (配列番号23)
・1-10・28-41AACysをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgggc ggtgttgtca tatgt (配列番号24)
・1-10・28-40AACysをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgggc ggtgttgtct gt (配列番号25)
・1-10・28-39AACysをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgggc ggtgtttgt (配列番号26)
・1-10・28-38AACysをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgggc ggttgt (配列番号27)
・1-10・28-37AACysをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgggc tgt (配列番号28)
・1-10・28-36AACysをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgtgt (配列番号29)
・1-9・28-37AACysをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggaaaa ggtgcaatca ttggactcat ggtgggctgt (配列番号30)
・2-10・28-37AACysをコードする遺伝子断片:
gcagaattcc gacatgactc aggatataaa ggtgcaatca ttggactcat ggtgggctgt (配列番号31)
・3-10・28-37AACysをコードする遺伝子断片:
gaattccgac atgactcagg atataaaggt gcaatcattg gactcatggt gggctgt (配列番号32)
・2-9・28-37AACysをコードする遺伝子断片:
gcagaattcc gacatgactc aggaaaaggt gcaatcattg gactcatggt gggctgt (配列番号33)
・1-18・28-42AACysをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgaaaggt gcaatcattg gactcatggt gggcggtgtt gtcatagcgt gt (配列番号34)
・1-18Cys19-27AAをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgtgtttc tttgcagaag atgtgggttc aaac (配列番号35)
・1-18Cys19-26AAをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgtgtttc tttgcagaag atgtgggttc a (配列番号36)
・1-18Cys19-28AACysをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgtgtttc tttgcagaag atgtgggttc aaacaaatgt (配列番号37)
・1-18Cys28-37AAをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgtgtaaa ggtgcaatca ttggactcat ggtgggc (配列番号38)
・1-18Cys28-37AACysをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgtgtaaa ggtgcaatca ttggactcat ggtgggctgt (配列番号39)
(1)システインを付加したAβペプチドの調製
・システイン付加1から10+30から42アミノ酸Aβペプチド(1-10・30-42AACys):
N末- DAEFRHDSGYAIIGLMVGGVVIAC(配列番号40)
・システイン付加1から10+29から42アミノ酸Aβペプチド(1-10・29-42AACys):
N末- DAEFRHDSGYGAIIGLMVGGVVIAC(配列番号41)
・システイン付加1から10+28から42アミノ酸Aβペプチド(1-10・28-42AACys):
N末- DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVIAC(配列番号2)
・1から10+28から42アミノ酸Aβペプチド(1-10・28-42AA):
N末- DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVIA(配列番号42)
上記のペプチドを合成し(シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社)、生理食塩液で5mg/mLに調製しこれを原液とし、原液100μLに生理食塩液900μLを加え0.5mg/mLの濃度とし1.5mLチューブに分注した(免疫物)。使用時まで-80℃以下で保存した。
雄のC57BL/6(7週齢、SPF)を日本チャールスリバー社より購入し、SPF環境下で飼育した。
16匹のマウスを4匹ずつ4群に分け、第1群:1-10・30-42AACys投与群、第2群:1-10・29-42AACys投与群、第3群:1-10・28-42AACys投与群、第4群:1-10・28-42AA投与群とした。
各免疫物をマウス1匹あたり200μLずつ1mLツベルクリン用注射器(テルモ、SS-01T2613S)を用いた腹部皮内もしくは皮下内に投与した(一個体あたりの投与量:100μg)。マウスへの免疫は2週間隔で3回の免疫を行った。
最終免疫から7日目にすべてのマウスをペントバルビタールナトリウム(共立製薬、ソムノペンチル)麻酔下腹部大静脈より採血した。採取した血液はマイクロティナ(ベクトン ディッキンソン社)に移し、室温にて十分に凝固させた後、5,000回転、10分間遠心分離した。分離した血清は各々0.5mLチューブ2本に分注し、測定まで-80℃にて保存した。
Aβペプチド(1-40のアミノ酸配列: N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV (配列番号43)、北海道システム・サイエンス社合成)を0.1Mカルボネートバッファー、 pH9.6で10μg/mLに希釈し8ウェル ストリップス(ナルジェ ヌンク社、イモビライザーアミノ)に100μL/ウェル加え、4℃で一夜静置して固相化した。翌日、各ウェルを300μLの0.05%Tween20含有PBS(PBST)で3回洗浄し、10mM エタノールアミンを300μL/ウェルずつ添加して、室温で1時間静置した。
算出した各免疫群におけるマウス血清中の抗Aβ抗体価を表1に示した。表1に示すように、1-10・28-42AACys投与群及び1-10・28-42AA投与群でAβに対する抗体誘導が認められた。またシステインを付加していないペプチド(1-10・28-42AA)で免疫した場合より、システインを付加したペプチド(1-10・28-42AACys)で免疫した場合がAβに対する高い抗体価を示した。
(1)システインを付加したAβペプチドの調製
・システイン付加1から10+28から42アミノ酸Aβペプチド(1-10・28-42AACys):
N末- DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVIAC(配列番号2)
・システイン付加1から10+28から41アミノ酸Aβペプチド(1-10・28-41AACys):
N末- DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVIC(配列番号3)
・システイン付加1から10+28から40アミノ酸Aβペプチド(1-10・28-40AACys):
N末- DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVC(配列番号4)
・システイン付加1から10+28から39アミノ酸Aβペプチド(1-10・28-39AACys):
N末- DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVC(配列番号5)
・システイン付加1から10+28から38アミノ酸Aβペプチド(1-10・28-38AACys):
N末- DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGC(配列番号6)
・システイン付加1から10+28から37アミノ酸Aβペプチド(1-10・28-37AACys):
N末- DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGC(配列番号7)
・システイン付加1から10+28から36アミノ酸Aβペプチド(1-10・28-36AACys):
N末- DAEFRHDSGYKGAIIGLMVC(配列番号8)
・システイン付加1から10+28から35アミノ酸Aβペプチド(1-10・28-35AACys):
N末- DAEFRHDSGYKGAIIGLMC(配列番号44)
・システイン付加1から10+28から34アミノ酸Aβペプチド(1-10・28-34AACys):
N末- DAEFRHDSGYKGAIIGLC(配列番号45)
上記のペプチドを合成し(シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社)、生理食塩液で5mg/mLに調製しこれを原液とし、原液100μLに生理食塩液900μLを加え0.5mg/mLの濃度とし1.5mLチューブに分注した(免疫物)。使用時まで-80℃以下で保存した。
雄のC57BL/6(7週齢、SPF)を日本チャールスリバー社より購入し、SPF環境下で飼育した。
32匹のマウスを4匹ずつ8群に分け、第1群:1-10・28-42AACys投与群、第2群:1-10・28-41AACys投与群、第3群:1-10・28-40AACys投与群、第4群:1-10・28-39AACys投与群、第5群:1-10・28-38AACys投与群、第6群:1-10・28-37AACys投与群、第7群:1-10・28-36AACys投与群、第7群:1-10・28-35AACys投与群及び第8群:1-10・28-34AACys投与群とした。
各免疫物をマウス1匹あたり200μLずつ1mLツベルクリン用注射器(テルモ、SS-01T2613S)を用いた腹部皮内もしくは皮下内に投与した(一個体あたりの投与量:100μg)。マウスへの免疫は2週間隔で3回の免疫を行った。
最終免疫から7日目にすべてのマウスをペントバルビタールナトリウム(共立製薬、ソムノペンチル)麻酔下腹部大静脈より採血した。採取した血液はマイクロティナ(ベクトン ディッキンソン社)に移し、室温にて十分に凝固させた後、5,000回転、10分間遠心分離した。分離した血清は各々0.5mLチューブ2本に分注し、測定まで-80℃にて保存した。
抗AβIgG抗体の測定は既述と同様に実施した。算出した各免疫群におけるマウス血清中の抗Aβ抗体価を表2に示した。表2に示すように、1-10・28-42AACys、1-10・28-41AACys、1-10・28-40AACys、1-10・28-39AACys、1-10・28-38AACys、1-10・28-37AACysおよび1-10・28-36AACysのペプチドでAβに対する高い抗体価を示した。
(1)システインを付加したAβペプチドの調製
・システイン付加1から9+28から37アミノ酸Aβペプチド(1-9・28-37AACys):
N末- DAEFRHDSGKGAIIGLMVGC(配列番号9)
・システイン付加1から8+28から37アミノ酸Aβペプチド(1-8・28-37AACys):
N末- DAEFRHDSKGAIIGLMVGC(配列番号46)
・システイン付加1から7+28から37アミノ酸Aβペプチド(1-7・28-37AACys):
N末- DAEFRHDKGAIIGLMVGC(配列番号47)
上記のペプチドを合成し(シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社)、生理食塩液で5mg/mLに調製しこれを原液とし、原液100μLに生理食塩液900μLを加え0.5mg/mLの濃度とし1.5mLチューブに分注した(免疫物)。使用時まで-80℃以下で保存した。
雄のC57BL/6(7週齢、SPF)を日本チャールスリバー社より購入し、SPF環境下で飼育した。
12匹のマウスを4匹ずつ3群に分け、第1群:1-9・28-37AACys投与群、第2群:1-8・28-37AACys投与群及び第3群:1-7・28-37AACys投与群とした。
各免疫物をマウス1匹あたり200μLずつ1mLツベルクリン用注射器(テルモ、SS-01T2613S)を用いた腹部皮内もしくは皮下内に投与した(一個体あたりの投与量:100μg)。マウスへの免疫は2週間隔で3回の免疫を行った。
最終免疫から7日目にすべてのマウスをペントバルビタールナトリウム(共立製薬、ソムノペンチル)麻酔下腹部大静脈より採血した。採取した血液はマイクロティナ(ベクトン ディッキンソン社)に移し、室温にて十分に凝固させた後、5,000回転、10分間遠心分離した。分離した血清は各々0.5mLチューブ2本に分注し、測定まで-80℃にて保存した。
抗AβIgG抗体の測定は既述と同様に実施した。算出した各免疫群におけるマウス血清中の抗Aβ抗体価を表3に示した。表3に示すように、1-9・28-37AACysのペプチドでAβに対する抗体の誘導が認められた。
(1)システインを付加したAβペプチドの調製
・システイン付加2から10+28から37アミノ酸Aβペプチド(2-10・28-37AACys):
N末- AEFRHDSGYKGAIIGLMVGC(配列番号10)
・システイン付加3から10+28から37アミノ酸Aβペプチド(3-10・28-37AACys):
N末- EFRHDSGYKGAIIGLMVGC(配列番号11)
・システイン付加4から10+28から37アミノ酸Aβペプチド(4-10・28-37AACys):
N末- FRHDSGYKGAIIGLMVGC(配列番号48)
・システイン付加2から9+28から37アミノ酸Aβペプチド(2-9・28-37AACys):
N末- AEFRHDSGKGAIIGLMVGC(配列番号12)
上記のペプチドを合成し(シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社)、生理食塩液で5mg/mLに調製しこれを原液とし、原液100μLに生理食塩液900μLを加え0.5mg/mLの濃度とし1.5mLチューブに分注した(免疫物)。使用時まで-80℃以下で保存した。
雄のC57BL/6(7週齢、SPF)を日本チャールスリバー社より購入し、SPF環境下で飼育した。
16匹のマウスを4匹ずつ4群に分け、第1群:2-10・28-37AACys投与群、第2群:3-10・28-37AACys投与群、第3群:4-10・28-37AACys投与群及び第4群:2-9・28-37AACys投与群とした。
各免疫物をマウス1匹あたり200μLずつ1mLツベルクリン用注射器(テルモ、SS-01T2613S)を用いた腹部皮内もしくは皮下内に投与した(一個体あたりの投与量:100μg)。マウスへの免疫は2週間隔で3回の免疫を行った。
最終免疫から7日目にすべてのマウスをペントバルビタールナトリウム(共立製薬、ソムノペンチル)麻酔下腹部大静脈より採血した。採取した血液はマイクロティナ(ベクトン ディッキンソン社)に移し、室温にて十分に凝固させた後、5,000回転、10分間遠心分離した。分離した血清は各々0.5mLチューブ2本に分注し、測定まで-80℃にて保存した。
抗AβIgG抗体の測定は既述と同様に実施した。算出した各免疫群におけるマウス血清中の抗Aβ抗体価を表4に示した。表4に示すように、2-10・28-37AACys、3-10・28-37AACysおよび2-9・28-37AACysのペプチドでAβに対する抗体の誘導が認められた。
(1)システインを付加したAβペプチドの調製
・システイン付加1から18+28から42アミノ酸Aβペプチド(1-18・28-42AACys):
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVKGAIIGLMVGGVVIAC(配列番号13)
・システイン付加1から10+28から42アミノ酸Aβペプチド(1-10・28-42AACys):
N末-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVIAC(配列番号2)
雄のC57BL/6(7週齢、SPF)を日本チャールスリバー社より購入し、SPF環境下で飼育した。
8匹のマウスを4匹ずつ2群に分け、第1群:1-18・28-42AACys投与群及び第2群:1-10・28-42AACys投与群とした。
各免疫物をマウス1匹あたり200μLずつ1mLツベルクリン用注射器(テルモ、SS-01T2613S)を用いた腹部皮内もしくは皮下内に投与した(一個体あたりの投与量:100μg)。マウスへの免疫は2週間隔で3回の免疫を行った。
最終免疫から7日目にすべてのマウスをペントバルビタールナトリウム(共立製薬、ソムノペンチル)麻酔下腹部大静脈より採血した。採取した血液はマイクロティナ(ベクトン ディッキンソン社)に移し、室温にて十分に凝固させた後、5,000回転、10分間遠心分離した。分離した血清は各々0.5mLチューブ2本に分注し、測定まで-80℃にて保存した。
抗AβIgG抗体の測定は既述と同様に実施した。算出した各免疫群におけるマウス血清中の抗Aβ抗体価を表5に示した。表5に示すように、1-18・28-42AACys投与群及び1-10・28-42AACys投与群共にAβに対する同程度の抗体の誘導が認められた。
・28アミノ酸Aβペプチドの18番目と19番目の間にシステイン挿入したペプチド(1-18Cys19-28AA):
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCFFAEDVGSNK(配列番号49)
・28アミノ酸Aβペプチドの18番目と19番目の間にシステイン挿入し更にC末端にシステインを繋いだペプチド(1-18Cys19-28AACys):
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCFFAEDVGSNKC(配列番号16)
上記のペプチドを合成し(シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社)、生理食塩液で5mg/mLに調製しこれを原液とし、原液100μLに生理食塩液900μLを加え0.5mg/mLの濃度とし1.5mLチューブに分注した(免疫物)。使用時まで-80℃以下で保存した。
雄のC57BL/6(7週齢、SPF)を日本チャールスリバー社より購入し、SPF環境下で飼育した。
8匹のマウスを4匹ずつ2群に分け、第1群:1-18Cys19-28AA投与群及び第2群:1-18Cys19-28AACys投与群とした。
各免疫物をマウス1匹あたり200μLずつ1mLツベルクリン用注射器(テルモ、SS-01T2613S)を用いた腹部皮内もしくは皮下内に投与した(一個体あたりの投与量:100μg)。マウスへの免疫は2週間隔で3回の免疫を行った。
最終免疫から7日目にすべてのマウスをペントバルビタールナトリウム(共立製薬、ソムノペンチル)麻酔下腹部大静脈より採血した。採取した血液はマイクロティナ(ベクトン ディッキンソン社)に移し、室温にて十分に凝固させた後、5,000回転、10分間遠心分離した。分離した血清は各々0.5mLチューブ2本に分注し、測定まで-80℃にて保存した。
抗AβIgG抗体の測定は既述と同様に実施した。算出した各免疫群におけるマウス血清中の抗Aβ抗体価を表7に示した。表7に示すように、1-18Cys19-28AA投与群及び1-18Cys19-28AACys投与群共にAβに対する同程度の抗体の誘導が認められた。
(1)システインを付加したAβペプチドの調製
・27アミノ酸Aβペプチドの18番目と19番目の間にシステイン挿入したペプチド(1-18Cys19-27AA):
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCFFAEDVGSN(配列番号14)
・26アミノ酸Aβペプチドの18番目と19番目の間にシステイン挿入したペプチド(1-18Cys19-26AA):
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCFFAEDVGS(配列番号15)
・25アミノ酸Aβペプチドの18番目と19番目の間にシステイン挿入したペプチド(1-18Cys19-25AA):
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCFFAEDVG(配列番号50)
上記のペプチドを合成し(シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社)、生理食塩液で5mg/mLに調製しこれを原液とし、原液100μLに生理食塩液900μLを加え0.5mg/mLの濃度とし1.5mLチューブに分注した(免疫物)。使用時まで-80℃以下で保存した。
雄のC57BL/6(7週齢、SPF)を日本チャールスリバー社より購入し、SPF環境下で飼育した。
12匹のマウスを4匹ずつ3群に分け、第1群:1-18Cys19-27AACys投与群、第2群: 1-18Cys19-26AA投与群及び第3群1-18Cys19-25AA投与群とした。
各免疫物をマウス1匹あたり200μLずつ1mLツベルクリン用注射器(テルモ、SS-01T2613S)を用いた腹部皮内もしくは皮下内に投与した(一個体あたりの投与量:100μg)。マウスへの免疫は2週間隔で3回の免疫を行った。
最終免疫から7日目にすべてのマウスをペントバルビタールナトリウム(共立製薬、ソムノペンチル)麻酔下腹部大静脈より採血した。採取した血液はマイクロティナ(ベクトン ディッキンソン社)に移し、室温にて十分に凝固させた後、5,000回転、10分間遠心分離した。分離した血清は各々0.5mLチューブ2本に分注し、測定まで-80℃にて保存した。
抗AβIgG抗体の測定は既述と同様に実施した。算出した各免疫群におけるマウス血清中の抗Aβ抗体価を表7に示した。表7に示すように、1-18Cys19-27AACys投与群及び1-18Cys19-26AA投与群にAβに対する抗体の誘導が認められた。また1-18Cys19-25AA投与群は4例中1例にAβに対する抗体の誘導が認められた。
(1)システインを付加したAβペプチドの調製
・Aβペプチドの1番目から18番目の配列のC末端にシステインを繋ぎさらにその後ろに28番目から37番目の配列を繋いだペプチド(1-18Cys28-37AA)
N末- DAEFRHDSGYEVHHQKLVCKGAIIGLMVG(配列番号17)
・Aβペプチドの1番目から18番目の配列のC末端にシステインを繋ぎさらにその後ろに28番目から37番目の配列を繋ぎそのC末端にシステインを付加したペプチド(1-18Cys28-37AACys):
N末- DAEFRHDSGYEVHHQKLVCKGAIIGLMVGC(配列番号18)
・Aβペプチドの1番目から18番目の配列のC末端に28番目から37番目の配列を繋ぎそのC末端にシステインを付加したペプチド(1-18・28-37AACys)
N末- DAEFRHDSGYEVHHQKLVKGAIIGLMVGC(配列番号51)
・Aβペプチドの1番目から18番目の配列のC末端に28番目から37番目の配列を繋いだペプチド(1-18・28-37AA)
N末- DAEFRHDSGYEVHHQKLVKGAIIGLMVGC(配列番号52)
上記のペプチドを合成し(シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社)、生理食塩液で5mg/mLに調製しこれを原液とし、原液100μLに生理食塩液900μLを加え0.5mg/mLの濃度とし1.5mLチューブに分注した(免疫物)。使用時まで-80℃以下で保存した。
雄のC57BL/6(7週齢、SPF)を日本チャールスリバー社より購入し、SPF環境下で飼育した。
16匹のマウスを4匹ずつ4群に分け、第1群:1-18Cys28-37AA投与群、第2群: 1-18Cys28-37CysAA投与群、第3群:1-18・28-37AACys投与群及び第4群:1-18・28-37AAとした。
各免疫物をマウス1匹あたり200μLずつ1mLツベルクリン用注射器(テルモ、SS-01T2613S)を用いた腹部皮内もしくは皮下内に投与した(一個体あたりの投与量:100μg)。マウスへの免疫は2週間隔で3回の免疫を行った。
最終免疫から7日目にすべてのマウスをペントバルビタールナトリウム(共立製薬、ソムノペンチル)麻酔下腹部大静脈より採血した。採取した血液はマイクロティナ(ベクトン ディッキンソン社)に移し、室温にて十分に凝固させた後、5,000回転、10分間遠心分離した。分離した血清は各々0.5mLチューブ2本に分注し、測定まで-80℃にて保存した。
抗AβIgG抗体の測定は既述と同様に実施した。算出した各免疫群におけるマウス血清中の抗Aβ抗体価を表8に示した。表8に示すように、1-18Cys28-37AA投与群及び1-18Cys28-37CysAA投与群にAβに対する抗体の誘導が認められた。
(1)システインの前駆体または代謝産物を付加したAβペプチドの調製
・28アミノ酸Aβペプチドにホモシステインを付加したペプチ(28AA-ホモシステイン):
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK-Homocysteine(配列番号19)
・28アミノ酸Aβペプチドにグルタチオンを付加したペプチ(28AA-グルタチオン):
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK-Glutathione(配列番号53)
上記のペプチドを合成し(シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社)、生理食塩液で5mg/mLに調製しこれを原液とし、使用時まで-80℃以下で保存した。
雄のC57BL/6(7週齢、SPF)を日本チャールスリバー社より購入し、SPF環境下で飼育した。
8匹のマウスを4匹ずつ2群に分け、第1群:28AA-ホモシステイン投与群及び第2群:28AA-グルタチオン投与群とした。
各免疫物をマウス1匹あたり200μLずつ1mLツベルクリン用注射器(テルモ、SS-01T2613S)を用いた腹部皮内もしくは皮下内に投与した(一個体あたりの投与量:100μg)。マウスへの免疫は2週間隔で3回の免疫を行った。
最終免疫から7日目にすべてのマウスをペントバルビタールナトリウム(共立製薬、ソムノペンチル)麻酔下腹部大静脈より採血した。採取した血液はマイクロティナ(ベクトン ディッキンソン社)に移し、室温にて十分に凝固させた後、5,000回転、10分間遠心分離した。分離した血清は各々0.5mLチューブ2本に分注し、測定まで-80℃にて保存した。
抗AβIgG抗体の測定は既述と同様に実施した。算出した各免疫群におけるマウス血清中の抗Aβ抗体価を表9に示した。表9に示すように、28AA-ホモシステイン投与群ではAβに対する抗体の誘導が認められた。
(1)システインを付加したAβペプチドの調製
・28アミノ酸Aβペプチドにシステインを付加したペプチド(28AAC)
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK-C(配列番号20)
・28アミノ酸Aβペプチドにシステインを2つ付加したペプチド(28AACC)
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK-CC(配列番号21)
28AACと28AACをジスルフィド結合したもの(28AACジスルフィド28AAC)、および28AACと28AACCをジスルフィド結合したもの(28AACジスルフィド28AACC)を調製した。得られるペプチドの構造は、2個のペプチドがC末端のシステインを介したジスルフィド結合により連結される構造の他、N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK-CCを含む二量体に更にジスルフィド結合し三量体、多量体化したものが考えられる(図1)。
雄のC57BL/6(7週齢、SPF)を日本チャールスリバー社より購入し、SPF環境下で飼育した。
8匹のマウスを4匹ずつ2群に分け、第1群:28AACジスルフィド28AAC投与群及び第2群:228AACジスルフィド28AACC投与群とした。
各免疫物をマウス1匹あたり200μLずつ1mLツベルクリン用注射器(テルモ、SS-01T2613S)を用いた腹部皮内もしくは皮下内に投与した(一個体あたりの投与量:100μg)。マウスへの免疫は2週間隔で3回の免疫を行った。
最終免疫から7日目にすべてのマウスをペントバルビタールナトリウム(共立製薬、ソムノペンチル)麻酔下腹部大静脈より採血した。採取した血液はマイクロティナ(ベクトン ディッキンソン社)に移し、室温にて十分に凝固させた後、5,000回転、10分間遠心分離した。分離した血清は各々0.5mLチューブ2本に分注し、測定まで-80℃にて保存した。
抗AβIgG抗体の測定は既述と同様に実施した。算出した各免疫群におけるマウス血清中の抗Aβ抗体価を表10に示した。表10に示すように、ジスルフィド結合させたシステイン付加28アミノ酸Aβペプチドは、28AACジスルフィド28AAC投与群及び228AACジスルフィド28AACC投与群両方とも、Aβに対する抗体の誘導が認められた。
Claims (11)
- 以下の(A)~(F)のいずれかから選択される、アミロイドβペプチドの一部またはアミロイドβペプチドに由来する配列にシステインまたはシステイン類似体が付加または挿入されることを特徴とするペプチド:
(A)(a)配列番号1のアミノ酸配列のN末から1~18番目からなるペプチドまたはその一部からなるペプチドと、(b)配列番号1のアミノ酸配列のN末から28~42番目のうち、28~36番目のアミノ酸残基を含む9個以上のアミノ酸残基からなるペプチドを結合させ、さらにそのC末端にシステインまたはシステイン類似体を結合させたペプチド;
(B)配列番号1のアミノ酸配列のN末から1~26番目または1~27番目からなるペプチドの、N末から18番目と19番目のアミノ酸残基の間にシステインまたはシステイン類似体を挿入させたペプチド;
(C)配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドまたはその一部からなるペプチドの、N末から18番目と19番目のアミノ酸残基の間にシステインまたはシステイン類似体を挿入し、さらにC末端にシステインまたはシステイン類似体を結合させたペプチド;
(D)配列番号1のアミノ酸配列のN末から1~18番目からなるペプチドまたはその一部からなるペプチドのC末端にシステインまたはシステイン類似体を結合させ、さらに配列番号1のアミノ酸配列のN末から28~42番目からなるペプチドまたはその一部からなるペプチドを結合させたペプチド、または選択的にさらにそのC末端にシステインまたはシステイン類似体を結合させたペプチド;
(E)配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドまたはその一部からなるペプチドのC末端にシステイン類似体を結合させたペプチド;
(F)配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドまたはその一部からなるペプチドのC末端にシステインまたはシステイン類似体を結合させた2個以上のペプチドを、当該システインまたはシステイン類似体のジスルフィド結合により連結させたペプチド。 - 上記(A)の(a)のペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列のN末から1~10番目、2~10番目、3~10番目、1~9番目、2~9番目、1~18番目からなるペプチドより選択され、上記Aのb)のペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列のN末から28~36番目、28~37番目、28~38番目、28~39番目、28~40番目、28~41番目、28~42番目からなるペプチドより選択される、請求項1に記載のペプチド。
- 上記(C)のペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列のN末から1~28番目からなるペプチドの、N末から18番目と19番目のアミノ酸残基の間にシステインまたはシステイン類似体を挿入し、さらにC末端にシステインまたはシステイン類似体を結合させたペプチドである、請求項1に記載のペプチド。
- 上記(D)のペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列のN末から1~18番目からなるペプチドのC末端にシステインまたはシステイン類似体を結合させ、さらに28番目から37番目からなるペプチドを結合させたペプチド、または選択的にさらにそのC末端にシステインまたはシステイン類似体を結合させたペプチドである、請求項1に記載のペプチド。
- 上記(E)のペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列のN末から1~28番目からなるペプチドのC末端にシステイン類似体を結合させたペプチドである、請求項1に記載のペプチド。
- 上記(F)のペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列のN末から1~28番目からなるペプチドのC末端にシステインまたはシステイン類似体を結合させた2個以上のペプチドを、当該システインまたはシステイン類似体のジスルフィド結合により連結させたペプチドである、請求項1に記載のペプチド。
- 当該システイン類似体がホモシステインである請求項1から6のいずれかに記載のペプチド。
- 当該ペプチドが、
・配列番号2から19のいずれか一つのペプチド
・配列番号20からなる2個のペプチドをジスルフィド結合により結合させたペプチド
・配列番号20からなるペプチドと配列番号21からなるペプチドをジスルフィド結合により結合させたペプチド
・配列番号21からなる2個のペプチドをジスルフィド結合により結合させたペプチド
並びに
・配列番号21からなる複数個のペプチドをジスルフィド結合により結合させたペプチド
からなる群より選択されるペプチドである請求項1から7のいずれかに記載のペプチド。 - 請求項1から8のいずれかに記載のペプチドを用いることを特徴とするアミロイドβに対する免疫応答増強方法。
- 請求項1から8のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含有することを特徴とするアルツハイマー病の予防または治療薬。
- 請求項1から8のいずれかに記載のペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子断片を含有することを特徴とするアルツハイマー病の予防または治療に有効なDNAワクチン。
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Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011029920A1 (en) | 2009-09-11 | 2011-03-17 | Probiodrug Ag | Heterocylcic derivatives as inhibitors of glutaminyl cyclase |
JP2014040396A (ja) * | 2012-08-23 | 2014-03-06 | Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | 脂質異常症治療薬を含有するアジュバント組成物 |
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JPWO2015060317A1 (ja) * | 2013-10-22 | 2017-04-06 | 長谷川 亨 | 神経変性疾患の検査方法 |
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Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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CN103450347A (zh) * | 2012-05-29 | 2013-12-18 | 四川百利药业有限责任公司 | 一种用于治疗阿尔兹海默症的多肽及基因疫苗 |
CN117700525B (zh) * | 2024-02-05 | 2024-06-18 | 上海良润生物医药科技有限公司 | 一种多肽改造体及其应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005506311A (ja) * | 2001-05-25 | 2005-03-03 | ユナイテッド・バイオメディカル・インコーポレーテッド | アルツハイマー病の予防用及び処置用免疫原性ペプチド組成物 |
JP2008057612A (ja) | 2006-08-30 | 2008-03-13 | Aisin Seiki Co Ltd | クラッチ用アクチュエータ |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5589154A (en) * | 1994-11-22 | 1996-12-31 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Methods for the prevention or treatment of vascular hemorrhaging and Alzheimer's disease |
EP1003539A4 (en) * | 1997-08-14 | 2002-09-11 | Univ California | AMYLOID beta-FLUORESCENT PEPTIDES AND USE THEREOF |
DE19916417A1 (de) * | 1999-04-01 | 2000-10-19 | Schering Ag | Amyloidspezifisches Aptamer |
US20060018918A1 (en) | 2000-12-27 | 2006-01-26 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Production of stabilized conformational isomers of disease associated proteins |
MY144532A (en) * | 2001-08-20 | 2011-09-30 | Lundbeck & Co As H | Novel method for down-regulation of amyloid |
WO2003040183A2 (en) * | 2001-11-09 | 2003-05-15 | The Genetics Company, Inc | Compounds for the diagnosis/prevention/treatment of alzheimer's disease |
CN1934127B (zh) | 2003-12-17 | 2015-08-19 | 杨森阿尔茨海默氏症免疫治疗公司 | Αβ免疫原性肽载体-偶联物及其生产方法 |
EP1787998A4 (en) * | 2004-08-11 | 2008-08-27 | Mitsubishi Chem Corp | ANTIBODIES AND USE RELATING THERETO |
EP1948688A2 (en) | 2005-11-14 | 2008-07-30 | Psma Development Company, L.L.C. | Compositions of and methods of using stabilized psma dimers |
WO2008133208A1 (ja) | 2007-04-20 | 2008-11-06 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | ペプチド免疫応答増強方法 |
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Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005506311A (ja) * | 2001-05-25 | 2005-03-03 | ユナイテッド・バイオメディカル・インコーポレーテッド | アルツハイマー病の予防用及び処置用免疫原性ペプチド組成物 |
JP2008057612A (ja) | 2006-08-30 | 2008-03-13 | Aisin Seiki Co Ltd | クラッチ用アクチュエータ |
Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
BARD F, BARBOUR R, CANNON C, CARRETTO R, FOX M ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 100, 2003, pages 2023 - 2028 |
GILMAN S, KOLLER M, BLACK RS, JENKINS L ET AL., NEUROLOGY, vol. 64, 2005, pages 1553 - 1562 |
MICHAEL G, AGADJANYAN MG ET AL., JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 174, 2005, pages 1580 - 1586 |
RZEPCZYK C.M. ET AL.: "Synthetic peptide immunogens eliciting antibodies to Plasmodium falciparum sporozoite and merozoite surface antigens in H-2b and H-2k mice.", J. IMMUNOL., vol. 145, no. 8, 1990, pages 2691 - 2696, XP008136822 * |
TAKAHASHI H. ET AL.: "Monoclonal antibody to beta peptide, recognizing amyloid deposits, neuronal cells and lipofuscin pigments in systemic organs.", ACTA NEUROPATHOL., vol. 85, no. 2, 1993, pages 159 - 166, XP008137222 * |
WANGA CY ET AL., VACCINE, vol. 25, 2007, pages 3041 - 3052 |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011029920A1 (en) | 2009-09-11 | 2011-03-17 | Probiodrug Ag | Heterocylcic derivatives as inhibitors of glutaminyl cyclase |
JP2014040396A (ja) * | 2012-08-23 | 2014-03-06 | Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | 脂質異常症治療薬を含有するアジュバント組成物 |
WO2014103608A1 (ja) | 2012-12-25 | 2014-07-03 | 一般財団法人化学及血清療法研究所 | HPV/HBsキメラタンパク質を有効成分とするHPV感染症及び/又はB型肝炎用ワクチン |
JPWO2015060317A1 (ja) * | 2013-10-22 | 2017-04-06 | 長谷川 亨 | 神経変性疾患の検査方法 |
EP3461819A1 (en) | 2017-09-29 | 2019-04-03 | Probiodrug AG | Inhibitors of glutaminyl cyclase |
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Publication number | Publication date |
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