WO2010034514A9 - Neue regulatoren des angeborenen immunsystems - Google Patents

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WO2010034514A9
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Christina Skerka
Reinhard Wallich
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Definitions

  • the present invention relates to the identification of novel regulators of the innate immune system, in particular the complement system. More particularly, the present invention relates to specific inhibitors of C5 convertase. These new inhibitors are particularly useful for the treatment of inflammatory diseases involving the complement system.
  • the present invention is directed to the use of CFHR proteins and functional fragments or functional derivatives thereof for the prophylaxis of inflammatory responses.
  • the present invention is directed to the use of CFHR proteins to inactivate complement activation during transplantation, dialysis, and for coating devices in contact with blood or body fluids, particularly implants.
  • the invention further provides a pharmaceutical composition comprising functional CFHR protein in combination with functional factor H.
  • the present invention is directed to the provision of monoclonal antibodies that specifically detect CFHR proteins and their use in methods for the determination of CFHR in body fluids. These methods are particularly suitable for the diagnosis of inflammatory diseases.
  • the complement system is an important element for innate and acquired immunity and is essential for eliciting a protective immune response to a foreign invader.
  • the alternative pathway of the complement system is activated spontaneously and involves the formation of the C3 convertase (C3bBb), which cleaves the central component of the complement system, C3. This cleavage generates the anaphylactic peptide C3a and the active protein or activation product C3b, which can attach to a surface.
  • C3b attached to foreign or altered surfaces, binds factor B and forms the C3 convertase (C3bBb). This enhances further complement activation, which eventually leads to opsonization and phagocytosis of invading objects such as microbes.
  • C3bBbC3b The binding of a second C3b molecule to the C3 convertase leads to the formation of the C5- Convertase (C3bBbC3b) of the alternative route.
  • the C5 convertase cleaves C5 and generates the potent chemoattractant C5a and the peptide C5b.
  • This peptide C5b initiates the formation of the terminal membrane-attacking complex (MAC).
  • C5b immediately binds to C6 and C7 in an enzyme-independent manner due to conformational changes.
  • This formed C5b67 complex dissolves from the convertase and attaches to lipid bilayers.
  • C8 and C9 the complete terminal membrane-attacking complex is formed which results in lysis of the pathogen and cells.
  • this defense system is tightly regulated at the surface of host cells by both membrane-anchored and soluble regulators, which attach in both the liquid phase and the surface. To ensure no negative effects against own tissue and own cells, this strict regulation is necessary.
  • Single mutations in genes encoding the appropriate regulators of the host cells and resulting in defective protein functions are predisposing to various immune deficiency and autoimmune diseases as well as renal and retinal diseases, e.g. hemolytic uremic syndrome (HUS), membran proliferative glomerulonephritis type II (MPGN II) or age-related macular degeneration (AMD).
  • HUS hemolytic uremic syndrome
  • MPGN II membran proliferative glomerulonephritis type II
  • AMD age-related macular degeneration
  • Endothelial cells as well as platelets.
  • CFHR proteins The family of CFHR proteins currently comprises five members in humans, CFHR1, CFHR2, CFHR3, CFHR4 and CFHR5. CFHR genes and proteins also occur in other species. In the mouse and rat these are e.g. designated CFHR-A, CFHR-B, CFHR-C, etc.
  • Proteins have no cofactor activity and decay activity.
  • the CFHR proteins also have a high sequence homology to the complement factor H (CFH).
  • C-terminal region e.g. CFHR1 with its three SCR (short complement regulator) domains has a high homology varying from almost 100% to a low, approximately 65% identity with the corresponding SCR domains at the C-terminal end of the complement factor H on.
  • the CFHR1 plasma protein is composed of 5 of these SCR domains and has been identified in two glycosylated forms in human plasma.
  • CFHR1-beta has two and CFHR1-alpha has an attached sugar side chain.
  • CFHR4 and CFHR5 are unknown. So far it has been speculated that the molecules could have the following functions: binding to C3b and to heparin and a modulating influence on the regulatory function of factor H.
  • the C5 convertase is an essential target for the
  • Anaphylatoxin C5a is necessary for triggering a local inflammatory response in an infection, as well as the resulting peptide C5b, which together with C6 attack the initial complex for the formation of the terminal membrane
  • Inhibitors that specifically inhibit this enzyme are not previously known and therefore are particularly suited to inhibit the corresponding subsequent alternative complement activation.
  • An object of the present invention is to provide specific inhibitors of C5 convertase so as to provide the alternative route, i. the
  • Inhibiting complement activation including the formation of terminal membrane-attacking complexes, as well as inhibiting the formation of effective anaphylactic, and possibly antimicrobial, peptides
  • C5a This specific inhibition of C5 convertase should preferably not affect the classical pathway or lectin pathway of complement activation.
  • terminal complement activation in the form of the formation and assembly of the terminal complement complex (MAC, membrane attack complex or TCC) and its incorporation into the lipid bilayer membrane is of great interest.
  • MAC terminal complement complex
  • TCC membrane attack complex
  • two terminal complement pathway inhibitors are known, clusterin and vitronectin.
  • the specificity of these regulators is not very high, so it makes sense to use more specific inhibitors.
  • Another object of the present invention is to provide
  • Detecting agents in particular antibodies that specifically allow the detection of CFHR molecules.
  • Invention is the provision of agents for the treatment of inflammation as well
  • the present invention provides the use of CFHR proteins, in particular CFHR1 proteins, or functional fragments or functional derivatives thereof for the treatment or prophylaxis of autoimmune diseases or inflammatory reactions.
  • CFHR proteins are specific inhibitors of C5 convertase. By specifically inhibiting the C5 convertase, both the formation of the anaphylatoxin C5a and the formation of the terminal membrane-attacking complex can be inhibited.
  • the CFHR proteins are specific C5 convertase inhibitors that are not C3 convertase, in contrast to known C3 / C5 convertase inhibitors such as CFH, inhibit. That is, for the first time, a C5 convertase-specific inhibitor will be described. These specific inhibitors allow modulation of the alternative pathway of complement activation without significantly affecting, eg blocking, the classical pathway.
  • the present invention is directed to the use of these functional CFHR proteins and their functional fragments and derivatives to inactivate complement activation, particularly in transplantation or dialysis.
  • these functional CFHR proteins can be used to coat surfaces that may come in contact with blood and body fluid, such as implant surfaces.
  • the present invention is directed to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising functional CFHR protein in combination with functional factor H.
  • a monoclonal antibody which specifically recognizes CFHR proteins.
  • this monoclonal antibody allows the specific recognition of CFHR protein, such as CFHR1 protein compared to complement factor H.
  • Body fluids especially in blood and blood plasma, comprising the use of the antibody of the invention, in particular for the diagnosis of hemolytic uremic syndrome, age-related macular degeneration or membranoproliferative glomerulonephritis but also atherosclerosis and other autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus.
  • Figure 1 shows the ability of CFHR1 to bind C3b, C3d, heparin and human cells.
  • Figure 1a shows the construction of CFHR1 compared to complement factor H.
  • the first two SCHRs of CFHR1 show 42 and 34% sequence identity, respectively, with SCHs 6 and 7 of CFH.
  • the three C-terminal SCRs of CFHR1 show 100, 100 and 98% sequence identity, respectively, to SCHs 18 to 20 of CFH.
  • Figure 1b shows that equimolar concentrations of CFHR1 and CFH bind to immobilized C3b.
  • the data shows the average values plus minus Standard deviations from one of three independent experiments.
  • A490 absorbance at 490 nm.
  • Co control.
  • FIG. 1c shows the binding of CFHR1 or CFH to immobilized heparin.
  • the control represents the background binding of the antibodies in the presence of the buffer.
  • Figure 1d shows the CFHR1 binding to HUVEC cells, with the CFHR1 protein being obtained from plasma. The cells were incubated in human plasma and bound CFHR1 was detected by flow cytometry using the monoclonal antibody JHD10. The control cells were treated with secondary antibodies alone.
  • Figure 1e shows the binding (10 ⁇ g / ml) of recombinant CFHR1 to HUVEC cells and to retinal pigment epithelial cells; the line means a size of 20 microns. Similarly, the CFHR1 binding was studied in rabbit erythrocytes pretreated with C3b.
  • Figure 2 shows the CFHR1 staining on tissue sections of the kidney and choroid. I shows the staining in the kidney, Il in the eye. The counterstain is with propidium iodide.
  • Figure 3 illustrates the specificity of the monoclonal antibody JHD10 described herein, which specifically recognizes CFHR1 in human serum and does not cross-react with CFH.
  • Figure 3a shows the specificity of the monoclonal antibody. Lane 1 normal human serum, lane 2 CFH, lane 3 normal human serum, lane 4 CFH. While the CFH-specific antibody detects CFH, the monoclonal antibody JHD10 shows reactivity only to the CFHR1 molecules.
  • Figure 3b shows silver staining of the purified recombinant CFHR1 (lane 1) and CFHR fragments CFHR1 / 1-2 (lane 2) and CFHR1 / 3-5 (lane 3).
  • FIG. 3c shows recombinant CFHR1 and native CFHR1 obtained from plasma (lanes 1 and 3 or 2 and 4). The right side shows an immunoblot using the specific CFHR1 antibody, the left side showed silver staining.
  • Figure 4 it is demonstrated that CFHR1 competes with factor H for binding to the binding partners.
  • Figure 4a shows immunofluorescent images showing that CFH and CFHR1 colocalize (yellow signal resulting from green fluorescence for CFH and red fluorescence for CFHR1).
  • Figure 4b shows the competition of CFHR1 with factor H for C3 binding. The data represent averages of three separate experiments plus minus standard deviations.
  • Figure 4c shows the competitive binding of CFHR1 with factor H in heparin. Shown is the mobility of the alpha 'and beta chain as well as the degradation fragments.
  • FIG. 5 shows the results for the regulation of the alternative complement pathway by CFHR1.
  • Figure 5a shows the hemolysis of sheep erythrocytes in the presence of CFHR1 and CFH depleted normal human serum (HP ⁇ CFH-CFHR1). For comparison, the results with vitronectin, CFH and HSA. A dose-dependent reduction in lysis was shown by the addition of CFHR1.
  • FIG. 5b shows the inhibition of the alternative complement pathway by CFHR1. Using an ELISA, each of the three complement pathways was induced separately.
  • AP alternative route CP classical route, LP lectin route; A440: absorption at 440 nm.
  • A440 absorption at 440 nm.
  • a dose-dependent effect could be shown for CFH R1 (squares).
  • FIG. 5c shows that CFHR1 does not affect the formation of C3a, unlike CFH.
  • FIG. 5d shows the protective effect of CFHR1 and the inhibition of C5bC6 generation.
  • Rabbit erythrocytes were incubated with human complement active CF7 depleted CFHR1 / CFHR3 deficient human plasma. CFHR1 was then added in appropriate concentration. Lysis was carried out using chicken erythrocytes to which sub-lytic amounts of human plasma as a source of C7 were added. The erythrocyte lysis was determined after 15 minutes of incubation.
  • FIG. 6 shows that CFHR1 regulates and binds C5 convertase activity to C5 and C5b6, as well as inhibiting the binding of C5b6 to cell surfaces and thus the formation of the MAC and the enzymatic activity of the MAC.
  • FIG. 6a shows the effect of CFHR1 on the lysis of sheep erythrocytes and the formation of C3a and C5a in the supernatant of the sample. The data represent averages of three separate experiments and their standard deviations. * : P ⁇ 0.05, ** : p ⁇ 0.005 compared to the control.
  • Figure 6b the effect of CFHR1 on the deposition of C3b and C5b on the surface of sheep erythrocytes is determined.
  • FIG. 7 shows the binding of CFHR1 to C5 or C5b6 and the inhibition of the terminal complement pathway.
  • FIG. 7a shows the binding of CFHR1 to immobilized C5 or C5b6.
  • FIG. 7b shows that the binding of C5 or C5b6 takes place via the N-terminal region of CFHR1. ** p ⁇ 0.001 versus the binding of C5 or C5b6 to C18-mediated CFHR1 immobilization.
  • FIG. 7c chicken erythrocytes were incubated with C5b6 complexes (5 ng / ml), increasing concentrations of CFHR1 and non-lytic HP were added. There is a dose-dependent inhibition of lysis on addition of CFHR1, while CFH and HSA controls do not limit lysis.
  • Figure 7d shows the inhibition of CFHR1 lysis of sheep erythrocytes compared to CFH and BSA. Similar values were found for the known inhibitor vitronectin (Vitro). The data represent mean values plus minus standard deviations of 2 separate experiments.
  • the present invention relates, in a first aspect, to the use of functional CFHR proteins for the treatment or prophylaxis of autoimmune diseases and inflammatory reactions.
  • CFHR functional proteins means both the CFHR protein itself and functional fragments of this protein, as well as functional derivatives of the CFHR protein which, in their function of inhibiting the C5 convertase, as shown herein, the overall
  • the term CFHR protein hereby includes the human CFHR proteins CFHR1, CFHR2, CFHR3, CFHR4 and CFHR5, the individual proteins having the following accession numbers: CFHR1 NM 002113 gi 118442838, CFHR2 NM 005666 gi49574530, CFHR3 NM 021023 gi 118421081, CFHR4 NM 006684 gi 117320517, CFHR5 NM 030787 gi 164607154.
  • the term "functional CFHR protein” is understood to mean both the protein and the functional derivatives and functional fragments, if stated differently. However, preference is given to the use of the mature CFHR protein. "Functional” here means that the CFHR molecules, in particular the CFHR proteins but also the fragments or derivatives of the CFHR proteins have an inhibitory effect on the C5 convertase and optionally inhibits the formation and activity of the MAC without the C3 convertase of the complement system
  • the functional fragment preferably has at least 60%, such as 70%, in particular 80%, preferably 90%, activity with respect to the inhibitory effect on the C5 convertase in comparison to the total -CFHR protein, especially the CFHR1 protein.
  • Fragments include those derived from the CFHR protein polypeptides having at least one deletion, mutation or addition of an amino acid.
  • Derivatives of the CFHR protein are polypeptides obtained by post-translational modification of the CFHR protein or CFHR fragment, e.g. Glycosylation, acetylation, phosphorylation and the like. These derivatives further include those polypeptides in which one or more analogs of amino acids, including non-naturally occurring amino acids, polypeptides having substituted linkages such as PNA polypeptides, and other modifications occur naturally or non-naturally.
  • complement activation refers on the one hand to the formation of the terminal membrane attacking complex, hereinafter also referred to as MAC (membrane attacking complex)
  • MAC membrane attacking complex
  • complement activation encompasses the generation of inflammation-promoting peptides, in particular anaphylatoxins, such as C5a.
  • body fluids refers to fluids of the body including blood, blood plasma, lymph, cerebrospinal fluid, cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc.
  • the CFHR protein is preferably the CFHR1 protein. It was shown that functional CFHR proteins show an inhibitory effect specific to the C5 convertase.
  • the C5 convertase cleaves the complement C5 into the peptide components C5a and C5b.
  • C5a acts as an inflammatory-mediating anaphylatoxin that locally induces or enhances inflammatory responses.
  • a C5b molecule binds to a C6 molecule and this C5b, 6 complex then attaches to a molecule of C7. This reaction leads to a confirmation change in the molecules involved, with a hydro site on C7 becoming accessible. This hydrophobic domain of C7 pushes into the lipid bilayer.
  • C8 and C9 Hydrophobic sites are similarly exposed to later components C8 and C9 when they bind to the complex; this also allows them to penetrate into the lipid bilayer.
  • the next step is the attachment of a C8 molecule to the membrane-associated C5b67 complex.
  • C8 is a complex of two proteins: C ⁇ beta, which binds to C5b, and C ⁇ alpha-gamma, which penetrates into the lipid bilayer.
  • C ⁇ alpha-gamma induces the polymerization of 10 to 16 C9 molecules into an annular structure called a terminal membrane-attacking complex. So the cell or the pathogen can be destroyed eventually.
  • CFHR protein in particular the CFHR1 protein, can inhibit the activity of the C5 convertase and furthermore the formation of C5a and C5b. Furthermore, it was found that the CFHD protein according to the invention does not inhibit the activity of C3 convertase. Finally, the CFHR protein inhibits the formation of the C5Bb6 (7) complex and thus the formation of the MAC. This feature allows the use of the functional CFHR protein for the treatment or prophylaxis of inflammatory reactions.
  • the inflammatory reactions are preferably inflammatory reactions in the context of an autoimmune disease
  • autoimmune diseases which may include autoantibodies, are particularly those such as rheumatoid arthritis, lupus erythematosus, hemolytic uremic syndrome, atherosclerosis, renal diseases such as glomerulonephritis and others.
  • proteinuria-related diseases can be treated, such as proteinuria in kidney disease.
  • the inflammatory reactions to be treated are particularly preferably those in the context of sepsis, rheumatoid arthritis, Alzheimer's disease, atherosclerosis, lupus erythematosus, antiphospholipid syndrome, preclampsia, multiple sclerosis, myocarditis, asthma, recurrent pregnancy loss syndrome.
  • the CFHR proteins are useful for inactivating complement activation, and in particular for inactivating the complement Complement activation in transplantation or dialysis. Since the deficiency of CFHR1 leads to kidney damage, and in a transplantation the activated complement system plays an essential role in graft acceptance, specific inhibitors that allow for specific inhibition of complement activation are therapeutically desirable.
  • CFHR protein involves the coating of devices and surfaces associated with bodily fluids, and particularly blood or blood plasma. By coating the devices, complement activation in the body fluid can be prevented by these devices.
  • another aspect of the present invention is directed to a coating of a device in contact with body fluids, particularly blood or blood plasma, characterized in that the surface is coated with CFHR functional proteins.
  • This coating is particularly suitable for implantable
  • this implantable device is intended for use on the body of an individual.
  • Another aspect of the present invention is directed to such devices that come into contact with body fluids, such as blood or blood plasma in particular.
  • This device which is in particular an implantable device, is characterized in that functional CFHR protein has been applied to the surface.
  • CFHR1 as an example of CFHR proteins shows an inhibitory effect on the complement activation of the alternative pathway. It turned out that this effect is not due to inhibition of C3 convertase, although CFHR1 competes with complement factor H (CFH) for binding to C3b and can partially replace CFH. On the contrary, inhibition of C3 convertase is not observed. Experiments showed that CFHR1 is able to specifically regulate the activation of the alternative complement pathway. It could be a CFHR1 dose-dependent inhibitory effect on the
  • CFHR1 can inhibit the alternative pathway but also the classical and the lectin pathway via the C5 convertase and the MAC.
  • CFHR proteins show an activity profile different from CFH, acting only as an inhibitor of C5 convertase, while CFH acts on the cascade C3 convertase and C5 convertase.
  • CFHR1 can bind to C5 and the C5b6 complex. This inhibits the formation of the MAC and prevents lysis of cells or microbes.
  • CFHR1 was shown to be the alternative pathway by inhibiting the
  • Another aspect of the present invention is directed to supplementing CFH therapy with CFHR proteins.
  • the two proteins are important regulators of the complement cascade, leading to different procedures in the complement system.
  • Another aspect of the present invention is thus directed to a pharmaceutical composition comprising functional CFHR protein.
  • the pharmaceutical composition further comprises the functional complement factor H, i.
  • the pharmaceutical composition is a broadly functional CFHR protein in
  • Composition also optionally contains conventional pharmaceutically acceptable diluents, carriers and excipients, as are well known to those skilled in the art.
  • CFH and CFHR protein have different effects, and accordingly, a combination of these two classes of proteins in a pharmaceutical composition is useful to exploit the various effects of these molecules described herein. Consequently In contrast to the teaching in WO2006 / 088950, CFH can not be replaced by CFHR, since it is alleged that they have the same effect; rather, a combination of these two classes of molecules leads to an improved effect since they show different effects on the complement system.
  • the pharmaceutical formulations may further comprise conventional pharmaceutically acceptable adjuvants, as well known to those skilled in the art. These pharmaceutical formulations can be administered by the usual routes and include effective amounts of the active ingredients, namely CFHR functional protein optionally in combination with functional complement factor H.
  • Functional CFHR proteins and functional complement factor H can be obtained from natural sources such as human plasma or serum or recombinantly.
  • the person skilled in the art is aware of methods for the isolation of natural CFHR protein or factor H protein and genetic engineering methods for the recombinant production of the functional CFHR proteins and functional factor H proteins.
  • the pharmaceutical formulations may be provided as in lysed or stabilized soluble form.
  • the routes of administration include systemic routes of administration, such as parenteral routes of administration, e.g. intravenous, subcutaneous, intramuscular, intraperitoneal, intercerebral, intrapulmonary, intranasal or transdermal routes or enteral routes, such as oral, vaginal or rectal routes.
  • parenteral routes of administration e.g. intravenous, subcutaneous, intramuscular, intraperitoneal, intercerebral, intrapulmonary, intranasal or transdermal routes or enteral routes, such as oral, vaginal or rectal routes.
  • the therapeutically effective amount of functional CFHR protein or functional factor H protein may depend on many factors including the indication, the formulation, the route of administration, and the age and condition of the individual. The skilled person can determine the effective dose taking into account these parameters.
  • compositions according to the present invention may be used alone or in combination with other therapeutic agents be administered, which may optionally be incorporated into a pharmaceutical formulation.
  • the present invention is directed to monoclonal antibodies that specifically detect CFHR protein immunohistochemically and immunochemically.
  • these monoclonal antibodies allow a distinction between CFHR protein and CFH protein.
  • this monoclonal antibody is one which specifically binds to human CFHR, in particular CFHR1 protein, wherein the monoclonal antibody may have the same properties as the monoclonal antibody of hybridoma cell line JHD-7. 10. 1 deposited under the Budapest Treaty at the DSMZ, Braunschweig. This monoclonal antibody binds in the N-terminal region of the CFHR-1 protein.
  • the present invention is directed to a monoclonal antibody capable of specific binding to human CFHR protein, wherein the monoclonal antibody reacts with the same epitope of the human CFHR protein as the monoclonal antibody derived from the hybridoma cell line JHD-7. 10. 1 deposited under the Budapest Treaty at the DSMZ, Brunswick, DSM ACC 2978.
  • Another embodiment of the present invention relates to a hybridoma cell line expressing a monoclonal antibody of the invention.
  • this hybridoma cell line is the
  • Body fluids such as blood, especially plasma or serum without CFH
  • This inventive method comprises the
  • This method can be a qualitative or (semi) -quantitative method.
  • Such diagnostic methods are particularly suitable for determining the content of CFHR1 protein in body fluids, such as the blood, and especially the plasma, of individuals suffering from hemolytic uremic syndrome, age-related macular degeneration or on membranoproliferative glomerulonephritis and other inflammatory kidney diseases, as well as other autoimmune diseases.
  • body fluids such as the blood, and especially the plasma
  • the deficiency of CFHR1 as well as CFHR3 in plasma represents a risk factor for the development of, for example, HUS.
  • an antibody according to the invention for the detection of CFHR1 in plasma is suitable for determining this risk and for detecting deficiency and, above all, adolescent patients with HUS therapeutic benefit, as the deficiency correlates with the presence of autoantibodies, which initiates a different mode of treatment for this patient, namely the reduction of the antibodies and the complementation of the CFHR proteins.
  • the present invention is directed to a method for the diagnosis of HUS comprising the steps of determining CFHR protein using the antibody of the invention in combination with the determination of autoantibodies.
  • the diagnostic methods according to the invention may include conventional methods such as e.g. ELISA, Western blotting, immunological rapid tests, and protein-based microarrays,
  • AMD age-related macular degeneration
  • CFHR1 and deletion mutants of CFHR1 SCRS1-2 (CFHR1 / 1-2) and CFHR1 SCR3-5 (CFHR1 / 3-5) were expressed according to known methods.
  • the proteins were expressed in Pichia pastoris and purified by means of nickel chelate affinity chromatography.
  • Vitronectin was from BD Biosciences (Belgium).
  • C3b, C3d, C5, C5bC6, Factor H and Factor I were obtained from Merck Biosciences (Schwalbach, Germany) and CT 1 C8 and C9 from Comptech (Taylor, USA). Purification of natural CFHR1 CFHR1 protein was determined by hepatic chromatography (HiTrap Heparin
  • CFH and CFHR1 used.
  • the monoclonal antibody JHD10 from the hybridoma cell line JHD-7. 10. 1 deposited under the Budapest Treaty at DSMZ, Braunschweig, DSM ACC 2978. This antibody is directed against purified CFHR1-SCR1-2 fragment, thus binding in the N-terminal region of CFHR1. At higher concentrations of this antibody, CFHR5 and CFHR2 are also detected. Anti C5, anti C6, anti C7 were obtained from Comptech (USA).
  • CFHR1 Normal human serum was obtained from healthy volunteers. Blood was collected from healthy volunteers and stored at -80 0 C until use. Six patients with atypical HUS were also studied. Deficiency of CFHR1 was determined by Western blot analysis and verified by genetic analysis as known. CFH autoantibodies were identified by ELISA against CFH-specific antibodies as described. For CFH depletion, 150 ⁇ l of protein A Sepharose were used as matrix (GE-HealthCare, Freiburg, Germany). This was incubated overnight at 4 ° C with 300 ⁇ g / ml monoclonal antibody C18 (Alexis, USA) and 150 ⁇ g / ml monoclonal antibody B22, from own working group, incubated.
  • Human umbilical cord endothelial cells (HUVEC, ATCCF, CRL-1730) and retinal pigment epithelial cells (ARPE-19, ATCC CRL-2302) were cultured according to known procedures. For binding experiments, cells were incubated for 24 hours in serum-free medium by means Kirinkubation in 0.02% Accutase (PAA, parching, Germany) and incubated at 37 0 C and detached in PBS supplemented with 1% BSA. Sheep, rabbit and chicken erythrocytes were obtained from Rockland (USA).
  • HUVEC and ARPE-18 cells grew on coverslips (Nunc) and were washed with PBS and non-specific binding sites were blocked with PBS spiked with 1% BSA. The cells were then incubated for 60 minutes with CFHR1 or CFH (100 ⁇ g / ml) or normal human plasma (NHP, 5%). The binding of CFHR1 was performed using the monoclonal antibody JHD10 with a secondary anti-mouse antibody labeled Alexa 647 and CFH with a polyclonal antiserum specific for the N-terminal domain of CFH (anti SCR1-4) (Alexis, USA) visualized with a secondary goat anti-rabbit antibody labeled with Alexa 488.
  • the samples were washed with 1% BSA / PBS, counterstained with DAPI and wheat germ agglutinin Texas red-595 and assayed using a laser scanning microscope LSM 510 META (Zeiss, Jena, Germany).
  • the rabbit erythrocytes were incubated with 3b (10 ⁇ g / ml) before addition of CFHR1 (100 ⁇ g / ml), immobilized on a coverslip and stained with the monoclonal antibody JHD10. Unspecific binding of the antibodies to the cells was excluded and no signals were detected in the absence of CFHR1 or CFH.
  • Immunohistochemistry was performed with two human donor eyes that had no clinical documentation for early AMD and no documentation for morphological evidence of eye disease.
  • the donor eyes were obtained at autopsy and were processed within 15 hours of death.
  • normal kidney tissue was obtained from two human adult donor kidneys that were not used for transplantation.
  • Posterior ocular preparations and parts of the decapsulated kidney were embedded in OCT compound and frozen in isopentane-cooled liquid nitrogen.
  • Cryostat sections (6 ⁇ m) were fixed in cold acetone, blocked with 10% normal goat serum and incubated with a monoclonal mouse antibody to CFHR1 (JHD10) diluted 1: 100 in PBS overnight at 4 ° C.
  • Antibody binding was detected using a Alexa 488-conjugated secondary antibody (Molecular Probes, Eugene, USA). Nuclear counterstaining was carried out with propidium iodide. For the preabsorption experiments, the primary antibody was treated with either CFHR1 or CFH for one hour. Binding of CFHR1 to heparin, C3b, C5 and C5bC6
  • CFHR1 (at various concentrations of 10 to 90 ⁇ g / ml) or CFH (75 ⁇ g / ml) were dissolved in binding buffer B (10 mM Na 2 HP 4 , 27 mM KCl, 1, 4 M NaCl, 2% BSA, pH 7, 4) was added to each plate and bound CFHR1 was incubated with monoclonal antibody C18 and bound CFH with the antiserum of SCRs 1-4 in combination with the corresponding HRP-conjugated rabbit anti-goat and anti-mouse IgG (Dako , Denmark, 1: 4000 dilution). As a control, buffer B was added directly in the absence of the primary protein.
  • binding buffer B (10 mM Na 2 HP 4 , 27 mM KCl, 1, 4 M NaCl, 2% BSA, pH 7, 4) was added to each plate and bound CFHR1 was incubated with monoclonal antibody C18 and bound CFH with the antiserum of
  • JHD10 or mAb C18 (15 ⁇ g / ml) were incubated in a microtiter plate and used to capture CFHR1 (30 ⁇ g / ml). After washing, C5 or C5bC6 (5 ⁇ g / ml) was added in gelatin veronal buffer (Sigma, Germany) and bound proteins were identified using a monoclonal C5 antibody (Merck Biosciences, Germany). CFHR1-specific antiserum was used to confirm the binding of CFHR1 to the immobilized monoclonal antibodies.
  • C3b (10 ⁇ g / ml) was immobilized in a microtiter plate (Nunc, Germany) and constant amounts of CFH (5 ⁇ g / ml) were added. Furthermore, increasing amounts of CFHR1 (1.3 to 26.6 ⁇ g / ml) dissolved in Buffer B were added and bound CFHR1 and CFH were detected with monoclonal antibodies JHD10 or polyclonal antiserum against SCRs 1-4 of CFH.
  • Cofactor Assays The cofactor activity of heparin-bound CFH was measured by measuring factor I-mediated degradation of C3b by Western blot analysis.
  • heparin (Fluka, Buchs, Switzerland) (5 ⁇ g / ml) was immobilized in a microtiter plate (EprarEx TM, Piasso) overnight at room temperature and nonspecific binding was performed with 1% BSA in blocking buffer (20 mmol HEPES, 130 mmol NaCl, 0.05% Tween) for two hours at room temperature.
  • CFH was incubated with increasing amounts of CFHR1 (0.13 micrograms to 13.3 micrograms), followed by incubation at 37 0 C for 15 minutes with 2 ug and 0.28 ug C3b CFI in a total volume of 50 ul.
  • the samples were removed from the microtiter plates and incubated with sample buffer containing beta-2-mercaptoethanol and boiled for 5 minutes at 95 ° C.
  • the proteins were separated on a 10% SDS-PAGE, blotted onto a nitrocellulose membrane, and blotted with goat anti-human C3 (Calbiochem, 1: 1000) and HRP-conjugated rabbit anti-goat Ig (Dako, 1: 1000). developed according to general methods.
  • the presence of the ⁇ '43 degradant of C3b was determined by densitometry.
  • CFHR1 To determine whether CFHR1 has effects on complement activation, the activity of CFHR1 was examined for each of the three complement pathways using WiELISA (Wieslab, Lund, Sweden).
  • CFH and CFHR1 dejected NHS 1% classical and lectin and 20% alternative route
  • Equal amounts of DPBS were added to each sample to eliminate buffering effects. After incubation, the samples were treated according to the manufacturer's instructions.
  • C3 convertase was determined by incubation of C3b (2 ⁇ g / ml) and C3 (80 ⁇ g / ml) with factor D (4 ⁇ g / ml) and factor B (40 ⁇ g / ml) in activation buffer (20 mM Hepes, 144 mM NaCl, 7 mM MgCl 2 , 10 mM EGTA, pH 7.4).
  • C3 convertase The activity of C3 convertase was determined after incubation of constant amounts of C3 (18 ⁇ g / ml) and increasing amounts of CFHR1 (25 and 50 ⁇ g / ml) or CFH (50 ⁇ g / ml) or 25 ⁇ g / ml human serum albumin (HSA ) determined by C3a formation.
  • C3a concentrations were determined by ELISA (Quidel, USA) according to the manufacturer's instructions.
  • Erythrocyte lysing assay Sheep erythrocytes were incubated with 30% v / v CFH and CFHR1 deputed human plasma in AP buffer (20 mM Hepes, 144 mM NaCl, 7 mM MgCl 2 , 10 mM EGTA, pH 7.4). The deputed plasma was tested for hemolysis of the sheep erythrocytes prior to the experiment. Hemolytic experiments were tested in HEPES / EGTA buffer (20 mM Hepes, 144 mM NaCl, 7 mM MgCl 2 , 10 mM EGTA, pH 7.4).
  • CFHR1 CFHR1
  • CFHR1 CFHR1
  • Increasing concentrations of CFHR1 10 7 sheep red blood cells at 37 0 C for 15 minutes with about 2 x. After incubation, the mixture was clarified by centrifugation and the absorbance was measured at 415 nm in the supernatant. Furthermore, dejected plasma samples were incubated with equal amounts of CFH, vitronectin or BSA. In one experiment, the formation of complement activation products C3a and C5a was determined by ELISA.
  • HP deficient in CFHR1 and CFHR3 was depleted by the complement component C7 to inhibit formation of the terminal membrane attacking complex (MAC).
  • Polyclonal C7 antiserum (Comtech, USA) was coupled in 1 ml of protein A Sepharose column and incubated with CFHR1 and CFHR3 deficient plasma.
  • 25 ⁇ g / ml or 50 ⁇ g / ml recombinant CFHR1 was added and incubated with 2 ⁇ 10 7 rabbit erythrocytes in Hepes / EGTA buffer for a period of 5 to 30 minutes to activate the alternative complement pathway. Every 2.5 minutes, aliquots were taken from this activated plasma, the complement activation was with the help of a
  • Protease inhibitors (Complete, Roche, Germany) stopped and on the hemolytic activity by incubation with a small amount of deficient HP (1
  • Complement inactivated (20 mM Hepes, 144 mM NaCl, 10 mM EDTA, pH 7.4) HP with constant concentrations of C5b6 (5 ng / ml) protein complexes and increasing amounts of CFHR1 (25 to 100 ⁇ g / ml).
  • the deficient plasma was incubated with C5b6 and CFHR1 for 15 minutes at 37 0 C, and the lysis of chicken erythrocytes was determined by assaying the supernatant at 415 nm.
  • deficient serum was incubated in parallel with equal amounts of CFH or BSA in the presence of C5b6.
  • Plasma-derived CFHR1 activity was examined in the same hemolytic assay.
  • C5b6 complexes (5 ng / ml) were mixed with either plasma-derived CFHR1 (0.75 ⁇ g / ml) or recombinant CFHR1 (5 ⁇ g / ml) in 20 mM Hepes, 144 mM NaCl, 10 mM EDTA, pH 7.4 pre-incubated for 5 minutes at 20 0 C.
  • Sheep red blood cells (2 x 10 7) were added and after 10 minutes at 20 0 C, the terminal moieties C7 (final concentration 1 ug / ml), and C9 added to C8 (0.2 ug / ml) (1 ug / ml).
  • Flow cytometry Flow cytometry was used to examine the effect of CFHR1 on C5 deposition on erythrocytes during complement activation. In order to allow complement activation, but to prevent hemolysis, CFHR1 / CFHR3 deficient plasma was treated by immunoaffinity chromatography to remove CFH and C7 (defHP ⁇ CFH ⁇ C7 ).
  • C5 was detected using a mouse monoclonal anti-C5 antibody (Quidel, USA).
  • the erythrocytes were measured by means of a B & D LSR II with suitable laser and filter settings. 50000 events were routinely counted.
  • Binding of serum-derived CFHR1 to HUVEC cells was assayed by incubating the HUVEC cells, which were kept serum-free for 3 days, in 25% normal human serum for 30 minutes. The cells were washed and binding of CFHR1 was determined with the monoclonal antibody JHD10. Coating surfaces with CFHR1
  • CFHR1 can be used either as a recombinant protein or after purification from plasma on surfaces according to standard procedures, e.g. in ELISA approaches. For this purpose, CFHR1 is incubated with the material in a buffer solution and then washed intensively with a physiological buffer. Alternatively, directed immobilization via monoclonal antibodies, e.g. the CFHR1 specific mAB JHD 10 or also C18 or polyclonal ancesters are possible. Another way of attachment is to coat the surface with CFHR1 ligands, e.g. with heparin. Since CFHR1 binds to heparin and other ligands, it is possible to coat the surface with CFHR1.
  • CFHR1 ligands e.g. with heparin. Since CFHR1 binds to heparin and other ligands, it is possible to coat the surface with CFHR1.
  • CFHR1 uses the C-terminus for both C3b and heparin binding since only the SCRs3-5 deletion mutants bind the immobilized C3b and heparin to the SCRsI-2 deletion mutants. Furthermore, it was shown that CFHR1 binds to cell surfaces, see Figures 1d to e.
  • FIG. 2 CFHR1 staining is shown on tissue sections of kidney and retinal tissue and hereby the new monoclonal antibody disclosed herein was obtained Antibody JHD10 is used, which recognizes an N-terminal epitope of CFHR1 protein, see Figure 2. The specificity of the antibody is set forth in FIG.
  • CFHR1 competes with CFH for the same binding sites. As shown in Figure 4, the two molecules compete for binding to C3b and CFHR1 can replace CFH and reduce CFH-mediated activity.
  • CFHR1 has a dose-dependent inhibitory effect on complement-mediated lysis. That is, CFHR1 has an impact on the formation and activity of the MAC.
  • the CFHR1 regulates the C5 convertase of the alternative path.
  • the molecule has an inhibitory effect on the formation of C5b, but not on C3b, and may also inhibit C5a generation in a dose-dependent manner, see Figure 6a.
  • Figure 7 shows that CFHR1 binds to C5 and C5b6 with the N-terminal region of the molecule. CFHR1 prevents the formation of the MAC, see Figure 7c. To confirm that this effect can not be attributed to recombinant artifacts, native purified

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Identifizierung von neuen Regulatoren des angeborenen Immunsystems, insbesondere des Komplementsystems. Genauer betrifft die vorliegende Erfindung spezifische Inhibitoren der C5-Konvertase. Diese neuen Inhibitoren sind insbesondere nützlich zur Behandlung von Entzündungserkrankungen, in die das Komplementsystem involviert ist. In einem ersten Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung von CFHR- Proteinen und funktionalen Fragmenten oder funktionalen Derivaten davon zur Prophylaxe von Entzündungsreaktionen. In einem weiteren Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung der CFHR-Proteine zur Inaktivierung der Komplementaktivierung bei Transplantation, Dialyse sowie zur Beschichtung von Vorrichtungen, die in Kontakt mit Blut oder Körperflüssigkeiten kommen, insbesondere Implantaten. Erfindungsgemäß wird weiterhin eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend funktionales CFHR-Protein in Kombination mit funktionalem Faktor H bereitgestellt. In einem weiteren Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf die Bereitstellung von monoklonalen Antikörpern, die spezifisch CFHR-Proteine detektieren und deren Verwendung in Verfahren zur Bestimmung von CFHR in Körperflüssigkeiten. Diese Verfahren eignen sich insbesondere zur Diagnose von entzündlichen Erkrankungen.

Description

Neue Regulatoren des angeborenen Immunsystems
Die vorliegende Erfindung betrifft die Identifizierung von neuen Regulatoren des angeborenen Immunsystems, insbesondere des Komplementsystems. Genauer betrifft die vorliegende Erfindung spezifische Inhibitoren der C5-Konvertase. Diese neuen Inhibitoren sind insbesondere nützlich zur Behandlung von Entzündungserkrankungen, in die das Komplementsystem involviert ist. In einem ersten Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung von CFHR- Proteinen und funktionalen Fragmenten oder funktionalen Derivaten davon zur Prophylaxe von Entzündungsreaktionen. In einem weiteren Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung der CFHR-Proteine zur Inaktivierung der Komplementaktivierung bei Transplantation, Dialyse sowie zur Beschichtung von Vorrichtungen, die in Kontakt mit Blut oder Körperflüssigkeiten kommen, insbesondere Implantaten. Erfindungsgemäß wird weiterhin eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend funktionales CFHR-Protein in Kombination mit funktionalem Faktor H bereitgestellt. In einem weiteren Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf die Bereitstellung von monoklonalen Antikörpern, die spezifisch CFHR-Proteine detektieren und deren Verwendung in Verfahren zur Bestimmung von CFHR in Körperflüssigkeiten. Diese Verfahren eignen sich insbesondere zur Diagnose von entzündlichen Erkrankungen.
Stand der Technik
Das Komplementsystem stellt ein für die angeborene und erworbene Immunität wichtiges Element dar und ist essentiell um eine schützende Immunantwort gegenüber einem fremden Eindringling hervorzurufen. Der alternative Weg des Komplementssystems wird spontan aktiviert und umfasst die Bildung der C3-Konvertase (C3bBb), das die zentrale Komponente des Komplementsystems, C3, spaltet. Diese Spaltung generiert das anaphylaktische Peptid C3a und das aktive Protein oder Aktivierungsprodukt C3b, das sich an einer Oberfläche anlagern kann. C3b, das an fremden oder veränderten Oberflächen angeheftet vorliegt, bindet den Faktor B und daraus wird die C3-Konvertase (C3bBb) ausgebildet. Diese verstärkt die weitere Komplementaktivierung, die schließlich zur Opsonisierung und Phagozytose der eindringenden Gegenstände, wie Mikroben, führen. Das Binden eines zweiten C3b-Moleküls an die C3-Konvertase führt zur Ausbildung der C5- Konvertase (C3bBbC3b) des alternativen Weges. Die C5 Konvertase spaltet C5 und generiert den potenten Chemoattraktor C5a und das Peptid C5b. Dieses Peptid C5b initiiert die Ausbildung des terminalen Membran-angreifenden Komplexes (MAC). C5b bindet sofort an C6 und C7 in enzymunabhängiger Weise aufgrund von Konformationsänderungen. Dieser ausgebildete C5b67-Komplex löst sich von der Konvertase und haftet an Lipiddoppelschichten an. Nach Binden von C8 und C9 wird der vollständige terminale Membran-angreifende Komplex ausgebildet, der zu einer Lyse des Pathogen und Zellen führt.
Einmal aktiviert wird dieses Abwehrsystem an der Oberfläche von Wirtszellen durch sowohl Membran-verankerte als auch lösliche Regulatoren, die sowohl in der Flüssigphase als auch an der Oberfläche anheften, streng reguliert. Um keine negativen Wirkungen gegen eigenes Gewebe und eigene Zellen sicherzustellen, ist diese strenge Regulierung notwendig. Einzelne Mutationen in Genen, die für die entsprechenden Regulatoren der Wirtszellen kodieren und zu defekten Proteinfunktionen führen, sind prädispositiv für verschiedene Immundefekt- und Autoimmunerkrankungen sowie renale und Retina-Erkrankungen, z.B. hämolytisches urämisches Syndrom (HUS), membranproliferative Glomerulonephritis Typ Il (MPGN II) oder altersbedingte Makuladegeneration (AMD).
Es ist bekannt, dass diese unterschiedlichen Erkrankungen durch defekte lokale Komplementregulationen hervorgerufen werden und mit Genvariationen und Mutationen in Komplementkomponenten und Regulatoren, wie dem CFH (Komplementfaktor H), assoziiert sind. So wurde gezeigt, dass eine Deletion eines 84 kb genomischen Fragments auf dem humanen Chromosomen 1 , das zu einem Verlust der Komplementfaktor H verwandten Gene 1 und 3 (Komplementfaktor H related genes 1 and 3 (CFHR1 , CFHR3)) führt, mit sowohl HUS als AMD assoziiert sind (Zipfel PF. et al., PLoS .3:E41 (2007), Hughes A. E. et al.; Nat. Genet. 38, 1173- 1177 (2006)). Allerdings zeigten diese chromosomalen Deletionen gegensätzliche Effekte, so führte bei HUS die Deletion zu einem erhöhten Risiko für die Erkrankung, während bei der AMD eine protektive Wirkung beschrieben wird. Die Abwesenheit dieser beiden Plasmaproteine CFHR1 und CFH3 korrelieren des Weiteren mit dem Vorhandensein von Autoantikörpern gegenüber CFH (Jozsi, M. et al., Blood, 111 , 1512-1514 (2008). Diese identifizierten Autoantikörper binden an das C-terminale Ende von CFH. Dieser Bereich bildet ein Schwerpunkt der HUS- Mutationen und führt zu einer reduzierten Anheftung von CFH an die Oberfläche. Eine entsprechende Autoantikörperbindung an CFH führt somit zur Hemmung der
Anhaftung von CFH an die Oberfläche und daraus resultieren Schädigungen von
Endothelzellen, genauso wie von Blutplättchen.
Die Familie der CFHR-Proteine umfasst derzeit beim Menschen fünf Mitglieder, CFHR1 , CFHR2, CFHR3, CFHR4 und CFHR5. Auch in anderen Spezies kommen CFHR Gene und Proteine vor. Bei der Maus und bei der Ratte werden diese z.B. als CFHR-A, CFHR-B, CFHR-C etc bezeichnet.
Diese Mitglieder der CFHR-Protein Familie zeichnen sich alle durch eine sehr ähnliche Struktur, im Aufbau ähnliche Module und eine hohe Sequenzhomologie zwischen den einzelnen Modulen zu einander aus. Allerdings wird jedes CFHR
Protein von einem spezifischen eigenständigen Gen kodiert. Die Funktion der einzelnen CFHR Proteine ist nicht bekannt. Es ist lediglich gezeigt, dass die CFHR
Proteine keine Kofaktoraktivität and Decay Aktivität aufweisen.
Die CFHR-Proteine weisen auch zum Komplementfaktor H (CFH) eine hohe Sequenzhomologie auf. Insbesondere im C-terminalen Bereich zeigt z.B. CFHR1 mit seinen drei SCR (short complement regulator)-Domainen eine hohe Homologie, die von einer fast 100%igen bis zu einer geringen, ca. 65 %igen Identität variiert, mit den entsprechenden SCR-Domainen am C-terminalen Ende des Komplementfaktors H auf. Das CFHR1 -Plasmaprotein setzt sich aus 5 dieser SCR-Domainen zusammen und wurde in zwei glykosylierten Formen im menschlichen Plasma identifiziert.
CFHR1-beta hat zwei und CFHR1 -alpha hat eine angeheftete Zuckerseitenkette.
Die Funktion von CFHR-1 und den verwandten Molekülen CFHR2, CFHR3,
CFHR4 und CFHR5 ist unbekannt. Bisher wurde spekuliert, dass die Moleküle die folgenden Funktionen haben könnten: Bindung an C3b und an Heparin und einen modulierenden Einfluss auf die regulative Funktion von Faktor H.
Wie oben ausgeführt, stellt die C5-Konvertase ein wesentliches Ziel für die
Hemmung der Komplementaktivierung dar, da sowohl das aus dem C5 entstehende
Anaphylatoxin C5a für das Auslösen einer lokalen Entzündungsantwort bei einer Infektion notwendig ist, als auch das entstehende Peptid C5b, das zusammen mit C6 den Ausgangskomplex für die Ausbildung des terminalen Membran-angreifenden
Komplexes ausbildet. Inhibitoren, die dieses Enzym spezifisch hemmen, sind bisher nicht bekannt und sind daher besonders geeignet, die entsprechende sich anschließende alternative Komplementaktivierung zu hemmen.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von spezifischen Inhibitoren der C5-Konvertase, um so den alternativen Weg, d.h. die
Komplementaktivierung einschließlich der Ausbildung von terminalen Membran angreifenden Komplexen zu hemmen, sowie ein Hemmen der Ausbildung von wirksamen anaphylaktischen, und möglicherweise antimikrobiellen Peptiden, nämlich
C5a. Diese spezifische Hemmung der C5 Konvertase sollte bevorzug nicht den klassischen Weg oder den Lektinweg der Komplementaktiverung beinflußen.
Zusätzlich ist eine Inhibierung der terminalen Komplementaktivierung in Form der Bildung und Assemblierung des terminalen Komplement Komplexes (MAC, Membranangriffskomplex oder TCC) und dessen Einlagerung in die Lipidbilayer Membran von großem Interesse. Gegenwärtig sind zwei Inhibitoren des terminalen Komplementweges bekannt, Clusterin und Vitronektin. Allerdings ist die Spezifität dieser Regulatoren nicht sehr hoch, so dass es sinnvoll ist, weitere spezifischere Inhibitoren einzusetzen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von
Detektionsmitteln, insbesondere Antikörpern, die spezifisch den Nachweis von CFHR-Molekülen erlauben. Schließlich ist ein weiteres Ziel der vorliegenden
Erfindung ist die Bereitstellung von Mitteln zur Behandlung von Entzündungen sowie
Verfahren hierfür.
Zusammenfassung der vorliegenden Erfindung Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung von CFHR-Proteinen, insbesondere von CFHR1 -Proteinen, oder funktionalen Fragmenten oder funktionalen Derivaten hiervon zur Behandlung oder Prophylaxe von Autoimmunerkrankungen oder Entzündungsreaktionen bereit.
Es wurde vorliegend festgestellt, dass CFHR-Proteine spezifische Inhibitoren der C5-Konvertase sind. Durch spezifisches Hemmen der C5-Konvertase können sowohl die Bildung des Anaphylatoxins C5a als auch die Ausbildung des terminalen Membran-angreifenden Komplexes gehemmt werden. Dabei handelt es sich bei den CFHR-Proteinen um spezifische C5-Konvertase-Inhibitoren, die nicht die C3- Konvertase, im Gegensatz zu bekannten C3/C5-Konvertase-Inhibitoren wie CFH, hemmen. D.h. vorliegend wird zum ersten Mal ein C5-Konvertase spezifischer Inhibitor beschrieben. Diese spezifischen Inhibitoren erlauben eine Modulation des alternativen Wegs der Komplementaktivierung ohne den klassischen Weg signifikant zu beeinflussen, z.B. zu blockieren. In einem Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung dieser funktionalen CFHR-Proteine und deren funktionalen Fragmente und Derivate zur Inaktivierung der Komplementaktivierung, insbesondere bei Transplantation oder Dialyse. In einem weiteren Aspekt können diese funktionalen CFHR-Proteine zur Beschichtung von Oberflächen, die in Kontakt mit Blut und Körperflüssigkeit gelangen können, wie Implantatoberflächen, verwendet werden.
In einem weiteren Aspekt werden entsprechende Beschichtungen und Vorrichtungen bereitgestellt.
Des Weiteren richtet sich die vorliegende Erfindung auf eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend funktionales CFHR-Protein in Kombination mit funktionalem Faktor H.
Schließlich wird ein monoklonaler Antikörper bereitgestellt, der spezifisch CFHR-Proteine erkennt. Insbesondere erlaubt dieser monoklonale Antikörper die spezifische Erkennung von CFHR-Protein, wie CFHR1-Protein im Vergleich zum Komplementfaktor H. Schließlich werden Verfahren zur Bestimmung von CFHR in
Körperflüssigkeiten, insbesondere im Blut und Blutplasma, bereitgestellt, umfassend die Verwendung des erfindungsgemäßen Antikörpers, insbesondere zur Diagnose von hämolytisch-urämischem Syndrom, altersabhängige Makuladegeneration oder membranoproliferativer Glomerulonephritis aber auch Atheriosklerose und andere Autoimmunerkrankungen wie Systemischer Lupus erythematosus.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
Figur 1 : Figur 1 zeigt die Fähigkeit von CFHR1 an C3b, C3d, Heparin und an humane Zellen zu binden. Figur 1a zeigt den Aufbau von CFHR1 im Vergleich zum Komplementfaktor H. Dabei zeigen die ersten beiden SCRs von CFHR1 42 bzw. 34 %ige Sequenzidentität mit den SCRs 6 und 7 von CFH. Die drei C-terminalen SCRs des CFHR1 zeigen eine 100, 100 bzw. 98%ige Sequenzidentität zu den SCRs 18 bis 20 von CFH. Figur 1b zeigt, dass äquimolare Konzentrationen von CFHR1 und CFH an immobilisiertes C3b binden. Die Daten zeigen die Durchschnittswerte plus minus Standardabweichungen von einem von drei unabhängigen Experimenten. A490: Absorption bei 490 nm. Co: Kontrolle. Figur 1c zeigt die Bindung von CFHR1 bzw. CFH an immobilisiertes Heparin. Die Kontrolle stellt die Hintergrundbindung der Antikörper in Anwesenheit des Puffers dar. Figur 1d zeigt die CFHR1 -Bindung an HUVEC-Zellen, wobei das CFHR1 -Protein aus Plasma erhalten wurde. Die Zellen wurden im humanen Plasma inkubiert und gebundenes CFHR1 wurde mit Hilfe des monoklonalen Antikörpers JHD10 mit der Durchflusscytometrie nachgewiesen. Die Kontrollzellen wurden mit sekundären Antikörpern alleine behandelt. Figur 1e zeigt die Bindung (10 μg/ml) von rekombinantem CFHR1 an HUVEC-Zellen und an retinale Pigmentepithelzellen; die Linie bedeutet dabei eine Größe von 20 μm. In ähnlicher weise wurde die CFHR1 -Bindung bei Kaninchenerythrozyten vorbehandelt mit C3b untersucht .
Die Figur 2 zeigt die CFHR1 -Färbung an Gewebeschnitten der Niere und der Choroidea. I zeigt die Färbung in der Niere, Il im Auge. Die Gegenfärbung ist mit Propidiumiodid.
In der Figur 3 wird die Spezifität des hierin beschriebenen monoklonalen Antikörpers JHD10, der spezifisch CFHR1 in humanem Serum erkennt und nicht mit CFH kreuzreagiert, dargestellt. In Figur 3a wird die Spezifität des monoklonalen Antikörpers gezeigt. Spur 1 normales Humanserum, Spur 2 CFH, Spur 3 normales Humanserum, Spur 4 CFH. Während der CFH-spezifische Antikörper CFH detektiert zeigt der monoklonale Antikörper JHD10 nur gegenüber den CFHR1-Molekülen eine Reaktivität. In der Figur 3b ist eine Silberfärbung vom aufgereinigten rekombinanten CFHR1 (Spur 1) und CFHR-Fragmenten CFHR1/1-2 (Spur 2) und CFHR1/3-5 (Spur 3) gezeigt. In der Figur 3c werden rekombinantes CFHR1 und aus Plasma erhaltenes natives CFHR1 (Spuren 1 und 3 bzw. 2 und 4) dargestellt. Die rechte Seite zeigt einen Immunoblot unter Verwendung des spezifischen CFHR1- Antikörpers, die linke Seite zeigte eine Silberfärbung.
In der Figur 4 wird dargelegt, dass CFHR1 mit Faktor H um die Bindung an die Bindungspartner konkurriert. Figur 4a zeigt Immunfluoreszenzaufnahmen, aus denen deutlich wird, dass CFH und CFHR1 kolokalisieren (gelbes Signal, ergebend aus der grünen Fluoreszenz für CFH und roter Fluoreszenz für CFHR1). Figur 4b zeigt die Kompetition von CFHR1 mit Faktor H um die C3-Bindung. Die Daten stellen Durchschnittswerte aus drei separaten Experimenten plus minus Standardabweichungen dar. A490: Absorption bei 490 nm; *p<0,05 gegenüber Bindung von CFHR1 : CFH (0:1). Figur 4c zeigt die kompetitive Bindung von CFHR1 mit Faktor H bei Heparin. Dargestellt wird die Mobilität der alpha' und beta-Kette sowie der Degradationsfragmente.
Die Figur 5 zeigt die Ergebnisse zur Regulation des alternativen Komplementweges durch CFHR1. In der Figur 5a ist die Hämolyse von Schaferythrozyten in Anwesenheit von CFHR1 und CFH deputiertem normalen Humanserum (HPΔCFH-CFHR1) dargestellt. Zum Vergleich die Ergebnisse mit Vitronectin, CFH und HSA. Eine Dosis-abhängige Reduktion der Lyse konnte durch Zugabe von CFHR1 gezeigt werden. In der Figur 5b wird die Hemmung des alternativen Komplementweges durch CFHR1 dargestellt. Unter Zuhilfenahme eines ELISA's wurde jeder der drei Komplementwege separat induziert. AP alternativer Weg, CP klassischer Weg, LP Lectinweg; A440: Absorption bei 440 nm. Für den alternativen Weg konnte für CFH R1 eine Dosis-abhängige Wirkung dargestellt werden (Quadrate). Figur 5c zeigt, dass CFHR1 nicht die Bildung von C3a beeinflusst, im Gegensatz zu CFH. In der Figur 5d wird die protektive Wirkung von CFHR1 sowie die Hemmung der C5bC6-Generierung dargestellt. Dazu wurden Kaninchenerythrozyten mit humanem Komplement aktiven, C7 deputierten CFHR1/CFHR3 defizienten humanen Plasma inkubiert. CFHR1 wurde dann in entsprechender Konzentration hinzugefügt. Die Lyse wurde mit Hilfe von Huhnerythrozyten, zu denen sublytische Mengen an humanem Plasma als Quelle für C7 hinzugegeben wurden. Die Erythrozytenlyse wurde nach 15 Minuten Inkubation bestimmt.
In der Figur 6 wird dargestellt, dass CFHR1 die C5-Konvertaseaktivität reguliert und an C5 und C5b6 binden kann sowie die Bindung von C5b6 an Zelloberflächen und somit die Bildung des MAC und die enzymatische Aktivität des MAC hemmt. In der Figur 6a ist die Wirkung von CFHR1 auf die Lyse von Schaferythrozyten sowie die Bildung von C3a und C5a im Überstand der Probe dargestellt. Die Daten stellen Durchschnittswerte von drei getrennten Experimenten und deren Standardabweichungen dar. *:p<0,05, **:p<0,005 im Vergleich zur Kontrolle. In der Figur 6b wird die Wirkung von CFHR1 auf die Ablagerung von C3b und C5b auf die Oberfläche von Schaferythrozyten bestimmt. In der Figur 6c sind Immunfluoreszenzaufnahmen dargestellt, aus denen deutlich wird, dass CFHR1 die Anlagerung von C5b auf Zelloberflächen hemmt, während CFH die Anlagerung von sowohl C3b als auch C5b hemmt. In der Figur 7 wird die Bindung von CFHR1 an C5 bzw. C5b6 und die Hemmung des terminalen Komplementweges aufgezeigt. In der Figur 7a wird die Bindung von CFHR1 an immobilisiertes C5 bzw. C5b6 dargelegt. Als Kontrolle wurde die Bindung des Antikörpers JHD10 an C5 oder C5b6 alleine bestimmt. Figur 7b zeigt, dass die Bindung von C5 bzw. C5b6 über den N-terminalen Bereich von CFHR1 erfolgt. **p<0,001 gegenüber der Bindung von C5 oder C5b6 an C18 vermittelter CFHR1 -Immobilisierung. In der Figur 7c wurden Huhnerythrozyten mit C5b6-Komplexen (5 ng/ml) inkubiert, zunehmende Konzentrationen von CFHR1 und nicht lytischem HP wurden hinzugefügt. Es ist eine Dosis-abhängige Hemmung der Lyse bei Zugabe von CFHR1 zu erkennen, während CFH und HSA als Kontrollen die Lyse nicht einschränken. Figur 7d zeigt die Hemmung der Lyse durch CFHR1 von Schaferythrozyten im Vergleich zu CFH und BSA. Ähnliche Werte wurden für den bekannten Inhibitor Vitronectin (Vitro) gefunden. Die Daten stellen Durchschnittswerte plus minus Standardabweichungen von 2 separaten Experimenten dar.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft in einem ersten Aspekt die Verwendung von funktionalen CFHR-Proteinen zur Behandlung oder Prophylaxe von Autoimmunerkrankungen und Entzündungsreaktionen.
In diesem Zusammenhang bedeutet der Ausdruck „funktionale CFHR- Proteine" sowohl das CFHR-Protein selbst als auch funktionale Fragmente dieses Proteins und auch funktionale Derivate des CFHR-Proteins, die in ihrer Funktion der Hemmung der C5-Konvertase, wie hierin gezeigt, dem Gesamt-CFHR-Protein gleichen. Der Ausdruck CFHR-Protein schließt hierbei die humanen CFHR-Proteine CFHR1 , CFHR2, CFHR3, CFHR4 und CFHR5 ein, wobei die einzelnen Proteine, die folgenden Hinterlegungsnummern haben: CFHR1 NM 002113 gi 118442838, CFHR2 NM 005666 gi49574530, CFHR3 NM 021023 gi 118421081 , CFHR4 NM 006684 gi 117320517, CFHR5 NM 030787 gi 164607154. Im Folgenden wird unter dem Ausdruck „funktionales CFHR-Protein" sowohl das Protein als auch die funktionalen Derivate und funktionalen Fragmente verstanden, soweit anders ausgeführt. Bevorzugt ist aber die Verwendung des reifen CFHR-Proteins. „Funktional" bedeutet hierbei, dass die CFHR-Moleküle, insbesondere die CFHR-Proteine aber auch die Fragmente oder Derivate der CFHR-Proteine inhibitorisch auf die C5-Konvertase wirken und gegebenenfalls die Bildung und Aktivität des MAC hemmt ohne die C3 Konvertase des Komplementsystems zu hemmen, wie vorliegend für CFHR-1 gezeigt. Bevorzugt weist dabei das funktionale Fragment eine mindestens 60%ige, wie 70%ige, insbesondere 80%ige, bevorzugt 90%ige Aktivität bezüglich der hemmenden Wirkung gegenüber der C5-Konvertase im Vergleich zum Gesamt-CFHR-Protein, insbesondere dem CFHR1 -Protein, auf.
Fragmente schließen dabei solche von dem CFHR-Protein abgeleitete Polypeptide ein, die wenigstens eine Deletion, Mutation oder Addition einer Aminosäure aufweisen.
Derivate des CFHR-Proteins sind Polypeptide, die durch posttranslationaler Modifikation des CFHR-Proteins bzw CFHR-Fragments, wie z.B. Glykosilierung, Acetylierung, Phosphorylierung und dergleichen, verändert wurden. Diese Derivate schließen weiterhin solche Polypeptide ein, in denen ein oder mehrere Analoga von Aminosäuren einschließlich nicht natürlich vorkommender Aminosäuren, Polypeptide mit substituierten Verknüpfungen, wie PNA-Polypeptide sowie weiterer Modifikation, wie sie natürlich oder nicht natürlich vorkommen.
Soweit nicht anders ausgeführt, wird unter dem Ausdruck „Komplementaktivierung" einerseits die Ausbildung des terminalen Membranangreifenden Komplexes, im Folgenden auch MAC (membrane attacking complex) verstanden. Andererseits umfasst der Ausdruck „Komplementaktivierung" die Generierung von entzündungsvermittelnden Peptiden, insbesondere Anaphylatoxinen, wie C5a. Unter dem Ausdruck „Körperflüssigkeiten" werden Flüssigkeiten des Körpers verstanden einschließlich Blut, Blutplasma, Lymphe, Cerebrospinal Flüssigkeit, Liquor, Synovial Flüssigkeit etc.
Bevorzugt handelt es sich erfindungsgemäß bei dem CFHR-Protein um das CFHR1 -Protein. Es zeigte sich, dass funktionale CFHR-Proteine eine hemmende Wirkung spezifisch auf die C5-Konvertase aufzeigen. Die C5-Konvertase spaltet das Komplement C5 in die Peptidbestandteile C5a und C5b. C5a wirkt als entzündungsvermittelndes Anaphylatoxin, die lokal die Entzündungsreaktionen induzieren bzw. verstärken. Ein C5b-Molekül bindet an ein C6-Molekül und dieser C5b,6-Komplex lagert sich dann an einem Moleküle von C7 an. Diese Reaktion führt zu einer Konfirmationsänderung bei den beteiligten Molekülen, wobei eine hydrobe Stelle auf C7 zugänglich wird. Diese hydrophobe Domaine von C7 schiebt sich in die Lipiddoppelschicht. Hydrophobe Stellen werden auf ähnliche Weise bei den späteren Komponenten C8 und C9 exponiert, wenn sie sich an den Komplex binden; diese erlaubt es ihnen ebenfalls in die Lipiddoppelschicht einzudringen. Der nächste Schritt ist die Anlagerung eines C8-Moleküls an dem Membran assoziierten C5b67- Komplex. C8 ist ein Komplex aus zwei Proteinen: Cδbeta, das an C5b bindet, und Cδalpha-gamma, das in die Lipiddoppelschicht eindringt. Schließlich induziert Cδalpha-gamma die Polymerisierung von 10 bis 16 C9-Molekülen zu einer ringförmigen Struktur, die als terminaler Membran-angreifender Komplex bezeichnet wird. So kann die Zelle bzw. das Pathogen schließlich zerstört werden.
Vorliegend zeigt sich nun, dass CFHR-Protein, insbesondere das CFHR1- Protein, die Aktivität der C5-Konvertase und des Weiteren die Bildung von C5a und C5b inhibieren kann. Weiterhin zeigte es sich, daß das CFHD-Protein erfindungsgemäß nicht die Aktivität der C3 Konvertase hemmt. Schließlich ermöglicht das CFHR-Protein eine Hemmung der Bildung des C5Bb6(7) Komplexes und somit der Ausbildung des MAC. Diese Eigenschaft erlaubt die Verwendung des funktionalen CFHR-Proteins zur Behandlung oder Prophylaxe von Entzündungsreaktionen. Bevorzugt handelt es sich bei den Entzündungsreaktionen um Entzündungsreaktionen im Rahmen einer Autoimmunerkrankung
Bei diesen Autoimmunerkrankungen, bei denen gegebenenfalls Autoantikörper vorliegen, handelt es sich insbesondere um solche, wie rheumatoide Arthritis, Lupus Erythematosus, hämolytisch-urämische Syndrom, Atheriosklerose, Nierenerkankungen, wie Glomerulonephritis und andere.
Des Weiteren können mit Proteinurie in Verbindung stehende Krankheitsbilder behandelt werden, wie Proteinurie bei Nierenerkrankungen.
Besonders bevorzugt handelt es sich bei den zu behandelnden Entzündungsreaktionen um solche im Rahmen einer Sepsis, rheumatoider Arthritis, Alzheimer-Erkrankung, Atheriosklerose, Lupus Erythematosus, Antiphospholipid- Syndrom, Preclampsie, Multiple Sklerose, Myocarditis, Asthma, rekurrierendes Schwangerschaftverlust Syndrom.
In einem weiteren Aspekt eignen sich die CFHR-Proteine zur Inaktivierung der Komplementaktivierung und hier insbesondere zur Inaktivierung der Komplementaktivierung bei Transplantation oder Dialyse. Da die Defizienz von CFHR1 zu Schädigungen der Niere führt und bei einer Transplantation das aktivierte Komplementsytem eine wesentliche Rolle bei der Annahme des Transplantats spielt sind spezifische Inhibitioren, die eine spezifische Inhibition der Komplementaktivierung ermöglichen, therapeutisch wünschenswert.
Schließlich betrifft eine weitere Verwendung des CFHR-Proteins die Beschichtung von Vorrichtungen und Oberflächen, die mit Körperflüssigkeiten und insbesondere Blut oder Blutplasma in Verbindung kommen. Durch Beschichtung der Vorrichtungen kann eine Komplementaktivierung in der Körperflüssigkeit durch diese Vorrichtungen verhindert werden.
Daher richtet sich ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung auf eine Beschichtung einer Vorrichtung, die in Kontakt mit Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut oder Blutplasma, kommt, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche mit funktionalen CFHR-Proteinen beschichtet ist. Diese Beschichtung eignet sich insbesondere für implantierbare
Vorrichtungen, wobei diese implantierbare Vorrichtung zur Verwendung am Körper eines Individuums vorgesehen ist.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung richtet sich auf solche Vorrichtungen, die in Kontakt mit Körperflüssigkeiten, wie insbesondere Blut oder Blutplasma, kommen. Diese Vorrichtung, bei der es sich um insbesondere um implantierbare Vorrichtungen handelt, zeichnet sich dadurch aus, dass auf der Oberfläche funktionales CFHR-Protein aufgebracht wurde.
CFHR1 als Beispiel für CFHR-Proteine zeigt eine hemmende Wirkung auf die Komplementaktivierung des alternativen Wegs. Dabei stellte sich heraus, dass diese Wirkung nicht darauf beruht, dass die C3-Konvertase gehemmt wird, obwohl CFHR1 mit dem Komplementfaktor H (CFH) um die Bindung an C3b konkurriert und CFH teilweise ersetzen kann. Im Gegenteil, eine Hemmung der C3 Konvertase wird nicht beobachtet. Versuche zeigten, dass CFHR1 im wesentlichen spezifisch die Aktivierung des alternativen Komplementweges regulieren kann. Es konnte ein CFHR1 -Dosis-abhängiger inhibierender Effekt auf die
Komplement vermittelte Lyse durch Ausbildung des terminalen Komplexes und MAC- Bildung aus gezeigt werden. D.h. das erfindungsgemäße CFHR-Molekül kann die Bildung und die Aktivität von MAC hemmen. Schließlich zeigte sich, dass CFHR1 über die C5-Konvertase und dem MAC vor allem den alternativen Weg aber gegebenenfalls auch den klassischen und den Lektin Weg hemmen kann.
Die Gabe von CFHR1 führte zu einer Herunterregulierung der Entstehung von C5a- Peptiden und C5b-Proteinen, die Generierung von C3a und C3b wurde dagegen nicht beeinflusst. Im Gegensatz dazu die Wirkung von CFH1 das sowohl die
C3-Konvertase als auch die C5-Konvertase hemmt und damit sowohl die
Generierung von C3a und C3b als auch von C5a und C5b hemmt. Das heißt, die
CFHR-Proteine zeigen ein sich vom CFH unterscheidenes Aktivitätsprofil, indem sie nur hemmend auf die C5 Konvertase wirken, während CFH auf die in der Kaskade vorstehende C3 Konvertase und auf die C5 Konvertase einwirkt.
Tatsächlich kann CFHR1 an C5 und an den C5b6-Komplex binden. Dadurch wird das Ausbilden des MACs gehemmt und eine Lyse von Zellen bzw. Mikroben verhindert. Es zeigte sich somit, dass CFHR1 den alternativen Weg durch Hemmung der
C5-Konvertase-Aktivität, des Zusammengehens des MAC und durch Verhindern der Oberflächenbindung reguliert.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung richtet sich auf die Ergänzung einer CFH-Therapie mit CFHR-Proteinen. Die beiden Proteine stellen wichtige Regulatoren der Komplementkaskade dar, die zu unterschiedlichen Eingriffen in das Komplementsystem führen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung richtet sich somit auf eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend funktionales CFHR-Protein.
Bevorzugt umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung weiterhin den funktionalen Komplementfaktor H, d.h. in einer bevorzugten Ausführungsform ist die pharmazeutische Zusammensetzung eine umfassend funktionales CFHR-Protein in
Kombination mit funktionalem Komplementfaktor H. Die pharmazeutische
Zusammensetzung enthält weiterhin gegebenenfalls übliche pharmazeutisch annehmbare Diluenten, Träger und Excipienten, wie sie dem Fachmann wohl bekannt sind.
Im Gegensatz zu der bisherigen Auffassung haben CFH und CFHR-Protein unterschiedliche Wirkungen und entsprechend ist eine Kombination dieser beiden Klassen von Proteine in einer pharmazeutischen Zusammensetzung sinnvoll, um die hierin beschriebenen unterschiedlichen Effekte dieser Moleküle zu nutzen. Somit kann im Gegensatz zu der Lehre in der WO2006/088950 CFH nicht durch CFHR ersetzt werden, da sich angeblich gleichwirkend seien, vielmehr führt eine Kombination dieser beiden Molekülklassen zu einer verbesserten Wirkung, da sie unterschiedliche Wirkungen auf das Komplementsystem zeigen. Die pharmazeutischen Formulierungen können weiterhin übliche pharmazeutisch annehmbare Hilfsmittel umfassen, wie sie dem Fachmann wohl bekannt sind. Diese pharmazeutischen Formulierungen können über die üblichen Wege verabreicht werden und umfassen wirksame Mengen der aktiven Inhaltsstoffe, nämlich funktionalem CFHR-Protein gegebenenfalls in Kombination mit funktionalem Komplementfaktor H.
Funktionale CFHR-Proteine und funktionaler Komplementfaktor H können aus natürlichen Quellen, wie humanem Plasma oder Serum oder rekombinant erhalten werden. Dem Fachmann sind Verfahren zur Isolierung von natürlichem CFHR- Protein bzw. Faktor H-Protein und gentechnischen Verfahren zur rekombinanten Herstellung der funktionalen CFHR-Proteine und funktionalen Faktor H-Proteine bekannt.
Annehmbare pharmazeutische Träger und Excipienten, genauso wie geeignete pharmazeutische Formulierungen sind allgemein bekannt, siehe z.B. pharmaceutical formulation development of peptides or proteins, Frokjaer et al. Taylor & Francis (2000) or Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Edition,
Kibbe et al., Pharmaceutical Press (2000).
Zum Beispiel können die pharmazeutischen Formulierungen als in lysierter oder stabilisierter löslicher Form bereitgestellt werden.
Die Verabreichungswege umfassen systemische Verabreichungswege, wie parenterale Verabreichungswege, z.B. intravenöse, subkutane, intramuskuläre, intraperitonale, intercerebrale, intrapulmonale, intranasale oder transdermale Wege oder enterale Wege, wie orale, vaginale oder rektale Wege.
Die therapeutisch wirksame Menge an funktionalem CFHR-Protein bzw. funktionalen Faktor H-Protein kann von vielen Faktoren abhängen einschließlich der Indikation, der Formulierung, dem Verabreichungsweg und dem Alter und Zustand des Individuums. Der Fachmann kann unter Berücksichtigung dieser Parameter die wirksame Dosis bestimmen.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung können alleine oder in Verbindung mit anderen therapeutischen Mitteln verabreicht werden, die gegebenenfalls in eine pharmazeutische Formulierung eingefügt werden können.
Schließlich richtet sich in einem weiteren Aspekt die vorliegende Erfindung auf monoklonale Antikörper, die spezifisch CFHR-Protein immunhistologisch und immunbiochemisch nachweisen. Insbesondere erlauben diese monoklonalen Antikörper eine Unterscheidung zwischen CFHR-Protein und CFH-Protein.
Dieser monoklonale Antikörper ist insbesondere einer, der spezifisch eine Bindung an humanem CFHR, insbesondere CFHR1 -Protein aufzeigt, wobei der monoklonale Antikörper gegebenenfalls die gleichen Eigenschaften wie der monoklonale Antikörper der Hybridomzelllinie JHD-7 . 10 . 1 hinterlegt gemäß Budapester Vertrag bei der DSMZ, Braunschweig aufzeigt. Dieser monoklonale Antikörper bindet im N-terminalen Bereich des CFHR-1 Proteins.
In einer bevorzugten Ausführungsform richtet sich die vorliegend Erfindung daher auf einen monoklonalen Antikörper, der zu einer spezifischen Bindung an menschlichem CFHR-Protein fähig ist, wobei der monoklonale Antikörper mit dem selben Epitop vom menschlichen CFHR-Protein reagiert, wie der monoklonale Antikörper, der von der Hybridomzelllinie JHD-7 . 10. 1 hinterlegt gemäß Budapester Vertrag bei der DSMZ, Braunschweig erhältlich ist, DSM ACC 2978.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft eine Hybridomzelllinie, die einen erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper exprimiert.
Besonders bevorzugt handelt es sich bei dieser Hybridomzelllinie um die
Hybridomzelllinie JHD-7 . 10. 1 hinterlegt gemäß Budapester Vertrag bei der DSMZ,
Braunschweig, DSM ACC 2978.
Diese monoklonalen Antikörper ermöglichen Verfahren zur spezifischen Bestimmung von CFHR-Protein, insbesondere CFHR1 -Protein, in
Körperflüssigkeiten, wie Blut, insbesondere Plasma oder Serum ohne daß CFH
Proteine bestimmt werden. Dieses erfindungsgemäße Verfahren umfasst dabei den
Schritt des Inkubierens einer zu testenden Probe mit einem erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper und Bestimmen der monoklonalen Antikörper gebunden an CFHR, insbesondere CFHR1 -Protein. Dieses Verfahren kann dabei ein qualitatives oder (semi)-quantitatives Verfahren sein.
Solche diagnostischen Verfahren sind insbesondere geeignet, den Gehalt an CFHR1 -Protein in Körperflüssigkeiten, wie dem Blut und insbesondere dem Plasma von Individuen zu bestimmen, die auf hämolytisch-urämisches Syndrom, altersabhängige Makuladegeneration oder auf membranoproliferative Glomerulonephritis und anderen entzündungsbasierten Nierenerkrankungen, sowie weiteren Autoimmunerkrankungen untersucht werden. Die Deffizienz von CFHR1 aber auch CFHR3 im Plasma stellt ein Risikofaktor zur Entwicklung von z.B. HUS dar. Deshalb ist ein erfindungsgemäßer Antikörper zur Detektion von CFHR1 im Plasma geeignet, dieses Risiko zu bestimmen und bei Feststellung der Deffizienz und vor allem jugendlichen Patienten mit HUS ist von therapeutischem Nutzen, da die Deffizienz mit dem Vorkommen von Autoantikörpern korreliert, die eine andere Art der Behandlung dieses Patienten initiiert, nämliche die Reduktion der Antikörper und die Komplementierung der CFHR-Proteine.
In einer bevorzugten Ausführungsform richtet sich daher die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Diagnose von HUS umfassend die Schritte der Bestimmung von CFHR-Protein mit Hilfe des erfindungsgemäßen Antikörpers in Kombination mit der Bestimmung von Autoantikörpern. Die erfindungsgemäßen Diagnoseverfahren können dabei übliche Verfahren beinhalten, wie z.B. ELISA, Western Blot Verfahren, immunologische Schnelltests, und proteinbasierende Microarrays,
Auch bei der altersabhängigen Makuladegeneration (AMD) ist die Anwesenheit von CFHR1 im Plasma von Bedeutung und die Entwicklung von AMD korreliert mit dem Vorhandensein von CFHR1 -Protein. Ein entsprechendes diagnostisches Verfahren erleichtert daher die Erkennung und Prognose von AMD.
Weitere Aspekte der Erfindung richten sich auf Verfahren zur Behandlung von Entzündungsreaktionen mit funktionalen CFHR-Proteinen aber auch mit dafür codierende Nukleinsäuren. Im Folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen unter Verwendung von CFHR1 -Protein weiter dargestellt. Die Erfindung ist aber nicht auf die folgenden Beispiele eingeschränkt.
Verfahren Proteine und Antikörper
Rekombinantes CFHR1 und Deletionsmutanten von CFHR1 SCRS1 - 2 (CFHR1/1-2) und CFHR1 SCR3-5 (CFHR1/3-5) wurden gemäß bekannten Verfahren exprimiert. Die Proteine wurden dabei in Pichia pastoris exprimiert und mit Hilfe der Nickel-Chelat Affinitätschromatographie aufgereinigt. Vitronectin wurde von BD Biosciences (Belgien) erhalten. C3b, C3d, C5, C5bC6, Faktor H und Faktor I wurden von Merck Biosciences (Schwalbach, Germany) und CT1 C8 und C9 von Comptech (Taylor, USA) erhalten. Aufreinigung von natürlichem CFHR1 CFHR1 -Protein wurde mit Hilfe von Hepahnchromatographie (HiTrap Heparin
HP-Säule, GE Healthcare, München, Deutschland) verdünnt mit Sterofundin (Braun Melsungen, Deutschland) aufgereinigt. Die Proteine wurden mit einem 3-Schritt- Gradienten von NaCI (100, 200 und 300 mM) gelöst in Sterofundin eluiert. Die gepoolten Eluatfraktionen von 100 und 200 mM NaCI-Gradienten wurden einkonzentriert (Superdex 2000, Satohus, Deutschland), und die Proteine wurden mit 1 x PBS auf einen pH-Wert von 4,7 eingestellt. Die Proben wurden mittels SDS PAGE aufgetrennt und die CFHR1 enthaltende Bande wurde aufgrund der Mobilität der Größenmarker identifiziert, die entsprechende Region wurde ausgeschnitten und CFHR1 wurde eluiert, konzentriert und 6x gegenüber PBS pH 4,7 dialysiert. Der Maus-monoklonale Antikörper C18 (Alexis, Lausen, Schweiz) wurde zum
Nachweis des C-Terminus von CFH und CFHR1 eingesetzt. Zum spezifischen Nachweis von CFHR1 wurde der monoklonale Antikörper JHD10 aus der Hybridomzelllinie JHD-7 . 10. 1 hinterlegt gemäß Budapester Vertrag bei der DSMZ, Braunschweig, DSM ACC 2978, eingesetzt. Dieser Antikörper richtet sich gegen aufgereinigtes CFHR1-SCR1-2 Fragment, bindet also im N-terminalen Bereich von CFHR1. Bei höherer Konzentration dieses Antikörpers werden ebenfalls CFHR5 und CFHR2 nachgewiesen. Anti C5, anti C6, anti C7 wurden von Comptech (USA) erhalten.
Sekundäre Antikörper wurden von Dako (Glostrup, Dänemark) erhalten. Serumproben
Humanes Normalserum wurde von gesunden Freiwilligen erhalten. Blut wurde von den gesunden Freiwilligen abgenommen und bei -800C bis zur Nutzung gelagert. Sechs Patienten mit atypischer HUS wurden ebenfalls untersucht. Die Deffizienz an CFHR1 wurde mit Hilfe der Westernblot-Analyse bestimmt und durch genetische Analyse, wie bekannt, verifiziert. CFH-Autoantikörper wurden mittels ELISA gegen CFH-spezifische Antikörper, wie beschrieben, identifiziert. Für die CFH-Depletion wurden 150 μl Protein-A-Sepharose als Matrix verwendet (GE-HealthCare, Freiburg, Deutschland). Diese wurde über Nacht bei 4°C mit 300 μg/ml monoklonaler Antikörper C18 (Alexis, USA) und 150 μg/ml monoklonaler Antikörper B22, aus der eigenen Arbeitsgruppe, inkubiert. Die Depletion des Serums wurde mit Hilfe von Westerblot-Analyse verifiziert. Für die C7-Depletion wurden 150 μl polyklonaler Ziege-anti-C7 (Quidel, USA) verwendet, und die Depletion wurde durchgeführt wie für CFH beschrieben. Die folgenden Seren wurden verwendet: humanes Komplement aktives
Plasma (HP), Komplement aktives HP, worin CFH und CFHR1 entfernt wurden (HPΔCFH), Komplement aktives HP, wobei CFH, CFHR1 und C7 entfernt wurden (HPΔCFHΔC7), Komplement aktives Plasma von CFHR1/CFHR3-Deffizienten gesunder Personen (defHP), Komplement aktives defHP, in denen CFH und C7 entfernt wurden (defHPΔCFHΔC7),
Zellkultur und Confocalmikroskopie
Endothelzellen von humaner Nabelschnur (HUVEC, ATCCF, CRL-1730) und retinale Pigmentepithelzellen (ARPE-19, ATCC CRL-2302) wurden gemäß bekannten Verfahren kultiviert. Für die Bindungsexperimente wurden die Zellen für 24 Stunden im serumfreien Medium inkubiert, mittels Kurzinkubation in 0,02 % Accutase (PAA, Parching, Deutschland) bei 37 0C abgelöst und in PBS versetzt mit 1 % BSA resuspendiert. Schaf-, Kaninchen- und Huhn-Erythrozyten wurden von Rockland (USA) erhalten. Für die Confocalmikroskopie wuchsen die HUVEC und ARPE-18-Zellen auf Deckgläschen (Nunc) und wurden mit PBS gewaschen und unspezifische Bindungsstellen wurden mit PBS versetzt mit 1 % BSA blockiert. Die Zellen wurden dann für 60 Minuten mit CFHR1 oder CFH (100 μg/ml) oder normalem humanen Plasma (NHP, 5 %) inkubiert. Die Bindung von CFHR1 wurde mit Hilfe des monoklonalen Antikörpers JHD10 mit einem sekundären anti-Maus-Antikörper markiert mit Alexa 647 und CFH mit einem polyklonalen Antiserum spezifisch für die N-terminale Domaine von CFH (anti SCR1-4) (Alexis, USA) zusammen mit einem sekundären Ziege-anti-Kaninchen-Antikörper markiert mit Alexa 488 visualisiert. Die Proben wurde mit 1 % BSA/PBS gewaschen, mit DAPI und Weizenkeim-Agglutinin Texas rot-595 gegengefärbt und mit Hilfe eines Lasers-Scanning-Mikroskop LSM 510 META (Zeiss, Jena, Deutschland) untersucht. Die Kaninchenerythrozyten wurden mit 3b (10 μg/ml) vor Zugabe von CFHR1 (100 μg/ml) inkubiert, auf einem Deckgläschen immobilisiert und mit dem monoklonalen Antikörper JHD10 gefärbt. Unspezifische Bindung der Antikörper an die Zellen wurde ausgeschlossen und keine Signale wurden in Abwesenheit von CFHR1 oder CFH detektiert. lmmunhistochemie
Immunhistochemie wurde mit zwei humanen Spenderaugen, bei denen keine klinischen Dokumentationen für frühe AMD und keine Dokumentation für morphologische Beweise von Augenerkrankungen vorlag, durchgeführt. Die Spenderaugen wurden bei der Autopsie erhalten und wurden innerhalb von 15 Stunden nach dem Tod bearbeitet. Weiterhin wurde normales Nierengewebe von zwei humanen erwachsenen Spendernieren erhalten, die nicht zur Transplantation verwendet wurden. Posteriore Augenpräparate und Teile der entkapselten Niere wurden in OCT-Verbindung eingebettet und in Isopentan-gekühltem, flüssigen Stickstoff eingefroren. Cryostat-Schnitte (6 μm) wurden im kalten Aceton fixiert, mit 10 % normalem Ziegenserum blockiert und mit einem monoklonalen Maus- Antikörper gegen CFHR1 (JHD10), verdünnt 1 :100 in PBS, über Nacht bei 4 °C inkubiert. Antikörperbindung wurde mit Hilfe eines Alexa 488-konjugierten sekundären Antikörpers (Molecular Probes, Eugene, USA) nachgewiesen. Die nukleare Gegenfärbung wurde mit Propidiumiodid durchgeführt. Für die Preabsorptionsexperimente wurde der primäre Antikörper für eine Stunde entweder mit CFHR1 oder CFH behandelt. Bindung von CFHR1 an Heparin, C3b, C5 und C5bC6
MaxiSorp Plastikplatten (Nunc) wurden mit Heparin (Heparinnatriumsalz; Sigma, Deutschland) 500 Einheiten/Platte oder C3b, C3d (Merck Biosciences, Deutschland) (10 μg/ml), C5 oder C5bC6 (Merck Biosciences, Deutschland) (5 μg/ml) beschichtet und unspezifische Bindungsstellen wurden mit 2 % BSA in PBS blockiert. CFHR1 (bei verschiedenen Konzentrationen von 10 bis 90 μg/ml) oder CFH (75 μg/ml) wurden im Bindungspuffer B (10 mM Na2HP4, 27 mM KCl, 1 ,4 M NaCI, 2 % BSA, pH 7,4) gelöst, zu jeder Platte hinzugefügt und gebundenes CFHR1 wurde mit dem monoklonalen Antikörper C18 und gebundenes CFH mit dem Antiserum der SCRs 1-4 in Kombination mit den entsprechenden sekundären HRP- konjugierten Kaninchen-anti-Ziege bzw. anti-Maus IgG (Dako, Dänemark, 1 :4000 Verdünnung) detektiert. Als Kontrolle wurde der Puffer B direkt in Abwesenheit des primären Proteins hinzugefügt. Parallel wurden JHD10 oder mAk C18 (15 μg/ml) in einer Mikrotiterplatte inkubiert und zum Fangen von CFHR1 (30 μg/ml) verwendet. Nach Waschen wurde C5 oder C5bC6 (5 μg/ml) in Gelatine Veronalpuffer (Sigma, Deutschland) hinzugegeben und gebundene Proteine wurden unter Verwendung eines monoklonalen C5-Antikörpers (Merck Biosciences, Deutschland) identifiziert. CFHR1 spezifisches Antiserum wurde zur Bestätigung der Bindung von CFHR1 an die immobilisierten monoklonalen Antikörper eingesetzt. Für die Kompetitionsexperimente wurde C3b (10 μg/ml) in einer Mikrotiterplatte (Nunc, Deutschland) immobilisiert und konstante Mengen an CFH (5 μg/ml) wurden hinzugefügt. Weiterhin wurden zunehmende Mengen an CFHR1 (1 ,3 bis 26,6 μg/ml), gelöst in Puffer B, hinzugefügt und gebundenes CFHR1 und CFH wurden mit monoklonalen Antikörpern JHD10 oder polyklonalem Antiserum gegen die SCRs 1-4 von CFH, detektiert. Cofaktorassays Die Cofaktoraktivität von Heparin gebundenem CFH wurde durch Messung des durch Faktor I vermittelten Abbaus von C3b mit Hilfe von Westernblot-Analyse gemessen. In kurz: Heparin (Fluka, Buchs, Schweiz) (5 μg/ml) wurde in einer Mikrotiterplatte (EprarEx™, Piasso) über Nacht bei Raumtemperatur immobilisiert und eine unspezifische Bindung wurde mit 1 % BSA in Blockingpuffer (20 mMol HEPES, 130 mMol NaCI, 0,05 % Tween) für zwei Stunden bei Raumtemperatur blockiert. Für die Kompetitionsanalysen wurde immobilisiertes CFH mit ansteigenden Mengen an CFHR1 (0,13 μg bis 13,3 μg) inkubiert, gefolgt von einer Inkubation bei 37 0C für 15 Minuten mit 2 μg C3b und 0,28 μg CFI in einem Gesamtvolumen von 50 μl. Die Proben wurden aus den Mikrotiterplatten entfernt und mit Probenpuffer inkubiert, enthaltend beta-2-Mercaptoethanol und für 5 Minuten bei 95 0C gekocht. Die Proteine wurden auf eine 10 % SDS-Page aufgetrennt, auf eine Nitrocellulosemembran geblottet und mit Hilfe von Ziege-anti-human C3 (Calbiochem, 1 :1000) und HRP-konjugiertem Kaninchen-anti-Ziege Ig (Dako, 1 :1000) gemäß allgemeinen Verfahren entwickelt. Das Vorhandensein der α'43-Abbaubande von C3b wurde mit Hilfe der Densitometrie bestimmt. ELISA
Um zu bestimmen, ob CFHR1 Effekte auf die Komplementaktivierung hat, wurde die Aktivität von CFHR1 auf jede der drei Komplementwege mit Hilfe von WiELISA (Wieslab, Lund, Schweden) untersucht. CFH und CFHR1 deputiertes NHS (1 % klassisch und Lectin und 20 % alternativer Weg) wurden mit ansteigenden Konzentrationen an CFHR1 (20 bis 80 μg/ml) für 10 Minuten auf Eis inkubiert. Gleiche Mengen an DPBS wurden zu jeder Probe hinzugefügt, um Puffereffekte auszuschließen. Nach der Inkubation wurden die Proben gemäß den Anweisungen des Herstellers behandelt. Um die CFHR1 -Regulation der C3-Konvertase zu untersuchen, wurde die C3- Konvertase durch Inkubation von C3b (2 μg/ml) und C3 (80 μg/ml) mit Faktor D (4 μg/ml) und Faktor B (40 μg/ml) in Aktivierungspuffer (20 mM Hepes, 144 mM NaCI, 7 mM MgCI2, 10 mM EGTA, pH 7,4) generiert. Die Aktivität der C3-Konvertase wurde nach Inkubation von konstanten Mengen an C3 (18 μg/ml) und zunehmenden Mengen an CFHR1 (25 und 50 μg/ml) oder CFH (50 μg/ml) oder 25 μg/ml humanes Serumalbumin (HSA) durch C3a-Bildung bestimmt. C3a-Konzentrationen wurden mit Hilfe von ELISA (Quidel, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Erythrozytenlysis-Assay Schaferythrozyten wurden mit 30 % v/v CFH und CFHR1 deputierten humanem Plasma in AP-Puffer (20 mM Hepes, 144 mM NaCI, 7 mM MgCI2, 10 mM EGTA, pH 7,4) inkubiert. Das deputierte Plasma wurde auf Hämolyse der Schaferythrozyten vor dem Experiment getestet. Hämolytische Experimente wurden in HEPES/EGTA-Puffer (20 mM Hepes, 144 mM NaCI, 7 mM MgCI2, 10 mM EGTA, pH 7,4) getestet. Zunehmende Konzentrationen an CFHR1 (5 bis 160 μg/ml) wurden zu dem Plasma hinzugefügt und bei 37 0C für 15 Minuten mit ca. 2 x 107 Schaferythrozyten inkubiert. Nach Inkubation wurde die Mischung durch Zentrifugation geklärt und die Absorption wurde bei 415 nm im Überstand gemessen. Weiterhin wurden deputierte Plasmaproben mit gleichen Mengen an CFH, Vitronectin oder BSA inkubiert. In einem Experiment wurde die Bildung von Komplementaktivierungsprodukten C3a und C5a mit Hilfe von ELISA bestimmt. Ein Aliquot jeder Probe wurde aus dem Hämolyseassay genommen und sofort in eiskaltem Hepes/EGTA-Puffer verdünnt (C3a: 1 :4000, C5a: 1 :100) und auf Eis gelagert. Die C3a- und C5a-Konzentrationen wurden mit kommerziell erhältlichen ELISAs gemäß den Anweisungen des Herstellers (C3a: Quidel, USA, C5a: DRG Diagnostics, Marburg, Deutschland) gemessen.
HP defizient an CFHR1 und CFHR3 wurde von der Komplementkomponenten C7 depletiert, um die Ausbildung der terminalen Membran angreifenden Komplexes (MAC) zu hemmen. Polyklonales C7-Antiserum (Comtech, USA) wurde in 1 ml Protein-A-Sepharose-Säule gekoppelt und mit CFHR1 und CFHR3-Defizientplasma inkubiert. Zu diesem Depletionsserum wurden 25 μg/ml oder 50 μg/ml rekombinantes CFHR1 hinzugefügt und für einen Zeitraum von 5 bis 30 Minuten mit 2 x 107 Kaninchenerythrozyten in Hepes/EGTA-Puffer inkubiert, um den alternativen Komplementweg zu aktivieren. Alle 2,5 Minuten wurden Aliquots aus diesem aktivierten Plasma genommen, die Komplementaktivierung wurde mit Hilfe eines
Protease-Inhibitors (Complete, Roche, Deutschland) gestoppt und auf die hämolytische Aktivität durch Inkubation mit einer kleiner Menge an defizientem HP (1
%) als Quelle für C7-C9 und 2 x 107 Huhnerythrozyten bestimmt. Hämolyse wurde für jeden Aktivierungszeitpunkt durch Messung der Absorption bei 415 nm bestimmt.
Die Hämolyse der Huhnerythrozyten wurde in CFHR1/CFHR3-Defizienten,
Komplement inaktivierten (20 mM Hepes, 144 mM NaCI, 10 mM EDTA, pH 7,4) HP mit konstanten Konzentrationen an C5b6 (5 ng/ml) Proteinkomplexen und zunehmenden Mengen an CFHR1 (25 bis 100 μg/ml) bestimmt. Das defiziente Plasma wurde mit C5b6 und CFHR1 für 15 Minuten bei 37 0C inkubiert und die Lyse der Huhnerythrozyten wurde durch Untersuchen des Überstandes bei 415 nm bestimmt. Um die Spezifität der CFHR1 -Funktion zu zeigen, wurde defizientes Serum in parallel mit gleichen Mengen an CFH oder BSA in Anwesenheit von C5b6 inkubiert. Die Aktivität vom Plasma stammenden CFHR1 wurde in dem gleichen hämolytischen Test untersucht. C5b6-Komplexe (5 ng/ml) wurden entweder mit vom Plasma stammenden CFHR1 (0,75 μg/ml) oder rekombinantem CFHR1 (5 μg/ml) in 20 mM Hepes, 144 mM NaCI, 10 mM EDTA, pH 7,4 für 5 Minuten bei 20 0C vorinkubiert. Schaferythrozyten (2 x 107) wurden hinzugefügt und nach 10 Minuten bei 20 0C wurden die terminalen Komponenten C7 (Endkonzentration 1 μg/ml), C8 (0,2 μg/ml) und C9 (1 μg/ml) hinzugefügt. Nach Inkubation für 30 Minuten bei 37 0C wurde die Freisetzung von Hämoglobin bei 415 nm gemessen. In gleicher Weise wurde die Wirkung des Inhibitors des terminalen Weges, Vitronectin (1 ,25 μg/ml) und von BSA (1 ,25 μg/ml) untersucht. Durchflusscytometrie Die Durchflusscytometrie wurde verwendet, um die Wirkung von CFHR1 auf die C5-Ablagerung auf Erythrozyten während der Komplementaktivierung zu untersuchen. Um die Komplementaktivierung zu ermögliche, aber die Hämolyse zu verhindern wurde CFHR1/CFHR3 defizientes Plasma zur Entfernung von CFH und C7 (defHPΔCFHΔC7) durch Immunaffinitätschromatographie behandelt. Für jeden Zeitpunkt wurden Schaf- und Kaninchenerythrozyten in 30 % v/v defHPΔcFHΔC7 in Anwesen- oder Abwesenheit von 50 μg/ml CFHR1 inkubiert. Um einen zu schnellen Abbau des C3/C5-Konvertasekomplexes zu verhindern, wurde Natriumchlorid im Puffer mittels Manitol ersetzt (20 mM Hepes, 250 mM Manitol, 8 mM MgCI2, 10 mM EGTA, pH 7,4) substituiert. Zu jedem Zeitpunkt wurde die Probe in eiskaltem modifiziertem Puffer mit 1 % w/v BSA transferiert. Um Komplementaktivierung zu hemmen, enthielt der Puffer eine Protease-Inhibitormischung (Complete Inhibitor Mix, Roche, Deutschland). C5 wurde unter Verwendung eines monoklonalen Maus- anti-C5-Antikörper (Quidel, USA) detektiert. Die Erythrozyten wurden mittels eines B&D LSR Il mit geeignetem Laser- und Filtereinstellungen gemessen. 50000 Ereignisse wurden routinemäßig gezählt. Das Binden des vom Serum stammenden CFHR1 an HUVEC-Zellen wurde durch Inkubation der HUVEC-Zellen untersucht, diese wurden serumfrei für 3 Tage gehalten, in 25 % normalem Humanserum für 30 Minuten. Die Zellen wurden gewaschen und Bindung von CFHR1 wurde mit dem monoklonalen Antikörper JHD10 bestimmt. Beschichtung von Oberflächen mit CFHR1
CFHR1 kann entweder als rekombinantes Protein oder nach Aufreinigung aus Plasma an Oberflächen nach Standardverfahren, wie z.B. in ELISA Ansätzen, gebunden werden. Dazu wird CFHR1 in einer Pufferlösung mit dem Material inkubiert und anschließend intensiv mit einem physioloigschen Puffer gewaschen. Alternativ ist eine gerichtete Immobilisierung über monoklonale Antikörper, wie z.B. der CFHR1 spezifische mAB JHD 10 oder auch C18 oder polyklonale Anitseren möglich. Ein weiterer Weg der Anheftung ist die Beschichtung der Oberfläche mit CFHR1 Liganden, wie z.B. mit Heparin. Da CFHR1 an Heparin und weitere Liganden bindet, ist so eine Beschichtung der Oberfläche mit CFHR1 möglich. Statistische Analyse
Die Statistik wurde mit Hilfe des Studenten-T-Testes durchgeführt. P-Werte kleiner 0,05 wurden als signifikant angesehen.
Ergebnisse
Die Experimente zeigten, dass CFHR1 an C3b, C3d, Heparin an humanen Zellen bindet, wie in der Figur 1 dargestellt.
CFHR1 nutzt dabei den C-Terminus für sowohl die C3b als auch die Heparin- Bindung, da nur die SCRs3-5-Deletionsmutanten nicht aber die SCRsI -2 Deletionsmutanten an immobilisiertem C3b und Heparin binden. Des Weiteren zeigte sich, dass CFHR1 an Zelloberflächen bindet, siehe Figuren 1d bis e.
In der Figur 2 wird die CFHR1 -Färbung an Gewebeschnitten von Niere und Retinalgewebe dargestellt und hierbei wurde der hierin offenbarte neue monoklonale Antikörper JHD10 eingesetzt, der ein N-terminales Epitop von CFHR1 -Protein erkennt, siehe Figur 2. Die Spezifität des Antikörpers wird in der Figur 3 dargelegt.
CFHR1 steht mit CFH im Wettbewerb um die gleichen Bindungsstellen. Wie in der Figur 4 dargelegt, kompetieren die beiden Moleküle um die Bindung an C3b und CFHR1 kann CFH ersetzen und die CFH vermittelte Aktivität reduzieren.
In der Figur 4 wird die Eigenschaft von CFHR1 dargelegt, die Aktivierung des alternativen Komplementweges zu regulieren. CFHR1 und der bekannte Komplementinhibitor Vitronectin zeigten ähnliche inhibitorische Wirkungen. Im Gegensatz zu CFH. Eine Wirkung auf den klassischen oder den Lektinweg zeigte sich dagegen nicht. CFHR1 wirkt dabei nicht auf die C3-Konvertase, siehe Abbildung 5. Hingegen wurde für CFHR1 eine Dosis abhängige inhibitorische Wirkung auf die Komplement vermittelte Lysis gefunden. D.h., CFHR1 hat einen Einfluss auf die Ausbildung und die Aktivität des MAC.
Wie in der Figur 6 dargelegt, reguliert die CFHR1 die C5-Konvertase des alternativen Weges. Das Molekül hat eine hemmende Wirkung auf die Ausbildung von C5b, aber nicht auf C3b und kann ebenfalls in Dosis abhängiger Art und Weise die C5a-Generierung hemmen, siehe Figur 6a.
In der Figur 7 ist dargelegt, dass CFHR1 an C5 und C5b6 bindet, und zwar mit dem N-terminalen Bereich des Moleküls. CFHR1 verhindert dabei die Ausbildung des MAC, siehe Figur 7c. Um zu bestätigen, dass diese Wirkung nicht auf rekombinante Artefakte zurückgeführt werden kann, wurde natives aufgereinigtes
CFHR1-Protein eingesetzt, um die Effekte zu bestätigen, siehe Figur 7d.
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ANGABEN ZU EINEM HINTERLEGTEN MIKROORGANISMUS ODER AJSDEREM BIOLOGISCHEN MATERIAL
(Regel \3bis PCT)
A. Die nachstehenden Angaben betreffen den hinterlegten Mikroorganismus oder anderes biologisches Material, das in der Beschreibung genannt ist auf Seite ] β Zeile 15-23
B. KENNZEICHNUNG DER HINTERLEGUNG Weitere Hinterlegungen sind auf einem zusätzlichen Blatt gekennzeichnet
Name der Hinterlegungsstelle DSMZ
Anschrift der Hinterlegungsstelle (einschließlich Postleitzahl und Land)
Inhoffenstr. 7B 38124 Braunschweig
Datum der Hinterlegung Eingangsnummer
23. September 2008 DSM ACC2978
C. WEITERE ANGABEN (falls nicht zutreffend, bitte frei lassen) Die Angaben werden auf einem gesonderten Blatt fortgesetzt
D. BESTIMMUNGSSTAATEN, FUR DIE ANGABEN GEMACHT WERDEN
(falls die Angaben nicht für alle Bestimmungsstaaten gelten)
E. NACHREICHUNG VON ANGABEN (falls nicht zutreffend, bitte freilassen)
Die nachstehenden Angaben werden später beim Internationalen Büro eingereicht (bitte Art der Angaben nennen, z.B. „Eingangsnummer der Hinterlegung")
Vom Anmeldeamt auszufüllen — Vom Internationalen Büro auszufüllen
Dieses Blatt ist eingegangen mit der internationalen Dieses Blatt ist beim Internationalen Büro Anmeldung eingegangen am:
Bevollmächtigter Bediensteter Bevollmächtigter Bediensteter Wallentin, Marko
Formblatt PCT/RO/134 (Juli 1998, Nachdruck Januar 2004)

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung eines CFHR-Moleküles, insbesondere eines CFHR-Proteins, oder eines funktionalen Fragments oder funktionalen Derivats hiervon, wobei dieses das Enzym C5-Konvertase hemmt, zur Behandlung oder Prophylaxe von Autoimmunerkrankungen und Entzündungsreaktionen.
2. Verwendung nach Anspruch 1 , wobei die Entzündungsreaktion eine Entzündungsreaktion im Rahmen einer Autoimmunerkrankung ist.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Entzündungsreaktion eine im Rahmen einer Sepsis, rheumatoider Arthritis, Alzheimer-Erkrankung, Atherosklerose, Lupus Erythematosus oder Antiphospholipid Syndrom induzierte Reaktion darstellt.
4. Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das CFHR-Protein oder ein funktionales Fragment oder ein funktionales Derivat hiervon das Ausbilden des terminalen Membran-angreifenden Komplexes verhindert.
5. Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei der alternative Weg der Komplementaktivierung beeinflußt, insbesondere gehemmt wird.
6. Verwendung eines CFHR-Proteins oder eines funktionalen Derivats oder eines funktionalen Fragments davon zur Inaktivierung der Komplementaktivierung, insbesondere bei einer Transplantation oder Dialyse.
7. Verwendung von CFHR-Protein oder eines funktionalen Fragments oder eines funktionalen Derivats hiervon zur Beschichtung von Implantaten und Oberflächen, die in Kontakt mit Körperflüssigkeiten kommen können.
8. Verwendung nach einen der vorherigen Ansprüche, wobei das CFHR-Protein das CFHR1 -Protein ist.
9. Beschichtung für Vorrichtungen, die in Kontakt mit Körperflüssigkeiten, insbesondere Plasma oder Blut kommen, dadurch gekennzeichnet, dass diese an der Oberfläche CFHR-Protein, funktionalen Fragment oder funktionalen Derivat hiervon aufweist.
10. Beschichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass diese eine für eine implantierbare Vorrichtung ist, wobei diese implantierbare Vorrichtung zur Verwendung im Körper eines Individuums vorgesehen ist.
11. Vorrichtung, die in Kontakt mit Körperflüssigkeiten und insbesondere Blut kommt, insbesondere implantierbare Vorrichtung, dadurch gekennzeichnet, dass auf der Oberfläche CFHR-Protein, funktionales Derivat oder funktionales Fragment hiervon aufgebracht wurde.
12. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend funktionales CFHR-Protein in Kombination mit funktionalem Faktor H und gegebenenfalls mit weiteren pharmazeutisch annehmbaren Diluenten, Trägern und Exzipienten.
13. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 12 umfassend funktionales CFHR1 -Protein.
14. Monokloner Antikörper, der spezifisch ein CFHR-Protein immunhistologisch und immunbiochemisch nachweist und zu einer spezifischen Bindung an humanen CFHR, insbesondere CFHR1 -Protein fähig ist, wobei der monoklonale Antikörper die gleichen Eigenschaften wie der monoklonale
Antikörper der Hybridomzelllinie JHD-7 . 10 . 1 hinterlegt gemäß Budapester Vertrag bei der DSMZ, Braunschweig, Deutschland, DSM ACC 2978, aufweist.
15. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 14, der zu einer spezifischen Bindung an menschlichen CFHR-Protein fähig ist, wobei der monoklonale Antiköprper mit demselben Epitop vom menschlichen CFHR-Protein reagiert, wie der monoklonale Antikörper, der von der Hybridomzelllinie JHD-7 . 10 . 1 hinterlegt gemäß Budapester Vertrag bei der DSMZ1 Braunschweig, DSM ACC 2978, erhältlich ist.
16. Monoklonaler Antikörper nach einem der Ansprüche 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass dieser nicht mit dem Komplementfaktor H reagiert.
17. Hybridomzellinie, die einen monoklonalen Antikörper gemäß einem der Ansprüche 14 bis 16 exprimiert.
18. Verfahren zur Bestimmung von CFHR-Molekülen, insbesondere von CFHR1- Protein, in Körperflüssigkeiten, umfasssend den Schritt des Inkubierens einer zu testenden Probe mit einem monoklonalen Antikörper gemäß einem der Ansprüche 14 bis 16 und Bestimmung von an den Antikörper gebundenen CFHR-Molekülen.
19. Verfahren nach Anspruch 18 zur Bestimmung des Gehalts an CFHR1 in einer Körperflüssigkeit eines Individuums zur Diagnose von hämolytischen urämischen Syndrom, einer altersbedingten Makuladegeneration oder auf membranproliferative Glomerulonephritis und anderer entzündungsbasierten Nierenerkrankungen.
20. Verfahren nach Anspruch 20 zur Diagnose von hämolytisch urämischen Syndrom weiterhin umfassend den Schritt der Bestimmung von Autoantikörpern in einer Körperflüssigkeit des Individuums.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei die Körperflüssigkeit Blut, Plasma oder Serum ist.
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