WO2010031636A1 - Verfahren und vorrichtung für das zeitgleiche, automatisierte aufschliessen von mehreren biologischen proben - Google Patents

Verfahren und vorrichtung für das zeitgleiche, automatisierte aufschliessen von mehreren biologischen proben Download PDF

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plastic
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Dennis Mertens
Andreas Schäfer
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • G01N1/286—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q involving mechanical work, e.g. chopping, disintegrating, compacting, homogenising
    • G01N2001/2866—Grinding or homogeneising

Definitions

  • the invention relates to a method and a device for the digestion of a vegetable or animal sample for processing, ie for example for the isolation of nucleic acids or proteins from the sample.
  • a vegetable or animal sample for processing ie for example for the isolation of nucleic acids or proteins from the sample.
  • Such preparations and examinations are carried out in a laboratory by a laboratory assistant or by a laboratory technician on the basis of standardized working instructions.
  • Such a working instruction includes a so-called protocol.
  • kits can be obtained commercially, for example the "UltraClean Tissue DNA Isolation Kit” of the company, depending on the sample and the desired result.
  • Qiagen www.Qiagen.com
  • a sample is processed using such a kit according to a given protocol, it must be suitably prepared.
  • test animal such as a rat
  • a test animal becomes a test animal
  • the removed organ or tissue of the animal is washed in a wash buffer solution, for example in PBS (Phosphate Buffered Saline with the following contents: Na 2 HPO 4 (dried), NaH 2 PO 4 (dried), NaCl and distilled water).
  • the wash provides the tissue of the removed part free of blood and frees it of unwanted components.
  • the collected tissue is cooled in liquid nitrogen, u, a., To stop cell activity. Otherwise, the desired information of the desired quality was not obtained after the processing.
  • tissue with a body temperature of, for example, 37 ° C is immersed in liquid nitrogen, bubbles develop. The tissue is removed again from the liquid nitrogen only when bubbling stops. Subsequently, the tissue is stored at -8O 0 C, for example with the help of dry ice.
  • RNAIater® is a viscous liquid developed by Ambion (www.ambion.com) for the preservation of fresh tissue.
  • the preservative effect is based primarily on the fact that all enzymes inactivated by dehydration in the tissue and cell activities are stopped. The viscous fluid must quickly diffuse into all cells of the tissue. The size of the fabric pieces is therefore limited to an edge length of a maximum of half a centimeter. Following the chemical treatment, the tissue thus treated is also cooled at -80 ° to store it until processing.
  • tissue For processing typically 10 to 100 mg of tissue is needed to perform the desired assay, isolation or the like. It is now separated before starting the processing, the required amount of animal tissue, for example, with a scalpel.
  • the separated sample ie the separated tissue is now open-minded, that is, the cell walls must be opened.
  • This can be done mechanically, chemically or enzymatically.
  • a mechanical digestion takes place for example with the aid of a "TissueRuptor" of the company Qi ⁇ gen, known from the TissueRuptor Handbook, July 2006 of the company Qiagen from Hilden, Germany.
  • a rotating knife with 35,000 revolutions per minute smashes cell walls of the tissue.
  • Mechanical digestions are regularly performed in a buffer to avoid damage to ingredients such as nucleic acids.
  • a sample is dipped with paraffin, cured and then cut into thin tissue layers by means of a microtome.
  • a solution of the problem comprises the features of claim 1
  • a device for carrying out the method comprises the features of the independent claim.
  • a suitably prepared sample is placed in a container made of plastic
  • the plastic container is inserted into an adapter
  • the plastic container is then closed He may have been closed by the lid of the adapter
  • the Kunststoffbehalter has its own lid, so that the Kunststoffbehalter even then is closed, if it is taken out of the adapter after digestion
  • the cleaning effort is minimized, when the plastic container is not reused, but finally disposed of
  • the adapter in turn is connected to an apparatus that automatically moves the adapter back and forth, and in particular up and down, so as to unlock the sample
  • the adapter is designed in particular so that he to be able to receive a plurality of plastic containers in order to be able to open a plurality of biological samples at the same time
  • a sample is prepared in a suitable manner prior to insertion into the plastic container by first washing the sample and then using liquid nitrogen or chemically preserved, for example with the aid of RNAIater® the US company Ambion from Foster City or with the help of AllProtect of Fa Qiagen according to the website http // www! qiagen com / products / RnaStabilizationPu ⁇ fication / AllprotectTissu eReagent aspx Especially depending on the size of the
  • Kunststoffbehalters the suitably prepared sample is completely or partially filled in the Kunststoffbehalter If only a portion of a sample is filled, this part is separated, for example, using a scalpel
  • the plastic container is preferably dimensioned so that it can only accept small samples. Therefore, for this reason, only a small sample amount of preferably not more than 50 mg, more preferably not be prepared more than 30 mg, then handling errors are improved avoided
  • the method enables automated digestion of samples in various ways.
  • the frozen or chemically preserved sample is first placed in a plastic container which is closed when inserted, thus avoiding contamination of further components of the overall device.
  • the plastic container is a low-cost disposable article , which must not be reused for another sample for cost reasons following the sample digestion Plastic container can therefore be dispensed with. Since the adapter is capable of accommodating a plurality of plastic containers with a sample contained therein, a plurality of samples can be digested at the same time
  • the adapter in turn is generally a separate apparatus from the object to the adapter suitable and easy to prepare particular, it is then easily possible to the adapter prior to insertion of the plastic container along with the sample in a temperature range of particular -2O 0 C and -80 0 C, for example, in a refrigerator or with the help of dry ice to be able to unlock a frozen sample without having to worry about thawing the sample despite the lack of active cooling
  • the claimed teachings work for both plant and animal or human tissues for both stabilized and fresh samples of plants or tissues.
  • digestion at room temperature of chemically conserved samples as well as frozen samples at low temperatures is very easy
  • the adapter comprises in one embodiment, preferably a plurality of metallic sleeves, in which the plastic containers are used.
  • the adapter consists entirely or at least predominantly of plastic Metallic sleeves have the required Heat capacity to keep the plastic container cool for a long enough time
  • the adapter is made entirely or predominantly of plastic, so that the adapter is not too heavy, which would make his handling too difficult
  • a frozen sample is placed in a cooled plastic container, which also contains at least one movable, hard body.
  • the cooled plastic container is then placed in the cooled adapter or in the metallic sleeve of the cooled Adapters used.
  • the temperature to which the adapter is cooled should be less than 0 -5o C to reliably prevent thawing of a frozen sample during the Aufschhe wears.
  • a temperature of about - 80 0 C so for example from -70 0 C to -90 ° C to choose.
  • -80 0 C or -70 ° C to -90 0 C can be provided inexpensively with the help of dry ice or in a refrigerator.
  • the movable body is then preferably a ball or a bolt with spherical ends.
  • the diameter of the ball or the bolt is slightly smaller than the diameter of the interior of the plastic container, so as to ensure the mobility.
  • the movable body is made of a hard, preferably heavy material such as metal, in order to be able to crush the sample.
  • the sample is preferably introduced into the plastic container so that it is located between a hollow spherical end of the plastic container and the ball or the bolt.
  • the diameter of the ball or the bolt is preferably at least 5 mm, more preferably at least 8 mm.
  • the diameter of the plastic vessel preferably does not exceed 1 5 mm, preferably up to 10 mm.
  • the Kunststoffbehalter is placed vertically during unlocking and the hollow spherical end is located below. Due to gravity, the sample material then remains primarily in the lower region, so that only one (lower) hollow spherical end is sufficient to be able to reliably crush with the aid of a ball.
  • an at least -5O 0 C cold sample is placed in the plastic vessel.
  • the vessel is then shaken in particular for 1 to 200 seconds with the aid of the apparatus such that the movable body is tossed back and forth, preferably up and down, preferably with a frequency of 10 to 10 Hz, in particular with one frequency of at least 30 Hz. Shaking too long or moving back and forth threatens to thaw the sample.
  • the thus crushed sample can be removed from the plastic vessel and the desired amount processed using a kit according to a protocol.
  • the sample is not removed and stored in another vessel, but immediately in the plastic vessel, which contains the moving body It thus also serves as Auf gleichgeflub and Aufbewahrungsbehalter
  • the desired amount of sample for processing can be provided precisely and easily. Homogeneous tissue distribution is achieved. Even stabilized tissue, leaves and seeds of plants can be prepared for further processing in this way. For skin and bones and comparable har te or viscous samples, however, this method is not suitable
  • the processing in the cooled, closed adapter does not take much time, it is not necessary to interrupt the Schuttelvorgang and cool the adapter in between again to suitably low temperatures This is especially true if the adapter sleeves of metal with sufficiently thick walls
  • the thickness of the wall in one embodiment is at least 0.5 mm in order to provide a sufficient heat capacity, preferably at least one millimeter. In order not to be too heavy, the wall amounts to one Version not more than 4mm
  • the sample is in powder form after crushing, it advantageously has a particularly large surface area to which subsequently used chemicals can attack.
  • a desired amount of powder can be provided particularly easily for subsequent steps, for example by weighing or even by appropriately sized Measuring vessels like a measuring spoon
  • the adapter is suitable even for opening an uncooled sample in the un-cooled state.
  • the sample is then disrupted using a lysis buffer which is in the plastic container along with the sample during beating. Emulsification of the sample may also occur if the adapter is used uncooled. This creates a solution between buffer and tissue.
  • Suitable lysis buffers are buffers comprising complexing agents and surfactants for the digestion of DNA such as the lysis buffer ATL, commercially available from Qiagen GmbH of Hilden, Germany, or buffers comprising comprehensively chaotropic substance for the digestion of RNA such as Lysis buffer RLT, commercially available from QIAGEN GmbH.
  • a buffer is added, d. H.
  • the powder is converted into solution.
  • relatively large metallic mobile bodies are preferably used for unlocking, which are located in the plastic containers.
  • the movable, relatively small body consists in particular of glass (so-called glass beads). Glass beads are small in diameter and are like sand. As a result, the friction is much stronger. These properties are needed to break up bacteria, metal beads are regularly too large, so that the distance between the individual balls was too large space to open up in order to unlock bacteria,
  • non-metallic material may be chosen instead of the mentioned plastic, in particular if this is comparable to plastic.
  • Plastic is particularly preferable.
  • FIG. 1 shows a lateral section through an adapter 1.
  • the adapter 1 comprises a container-shaped main body 2, which has been closed with a lid 3.
  • a total of twelve sleeves 4 made of aluminum (seen in plan view) are arranged in a circle around a central axis of the adapter.
  • the wall thickness of the sleeves 4 is 1 mm.
  • the sleeves 4 have one or more in an upper region
  • FIG. 1 shows a plastic container 6 provided with a lid, which is inserted into a metal sleeve 4.
  • the plastic container ⁇ is clamped by two elastic, annular discs 7 made of foamed silicone, which are arranged below and above the plastic container 6.
  • the upper annular disc is held by the lid 3 by lateral grooves which are arranged on the underside of the lid 3.
  • the lower annular disc 7 is held at the bottom of the body 2 by lateral grooves.
  • the elastic discs 7 stabilize the container during the digestion so that it can not be damaged.
  • the elastic discs 7 also act sound-absorbing.
  • the bottom of the plastic container 6 is hollow spherical, in the container 6 is a steel ball 8. Between the steel ball 8 and the hollow spherical base of the plastic container 6, a biological sample 9 is introduced. It is sufficient that only the bottom and not the lid portion of the plastic container 6 is hollow spherical, since the sample will already at least predominantly remain due to gravity in the lower region, so that the sample is crushed in the bottom area.
  • the basic body 2 is provided in the upper half with a threaded insert 1 made of steel, in which a fastening screw 1 1 of the lid 3 is screwed in to close the Grundkorper with the lid. Preferably, a quarter turn is sufficient to secure the lid.
  • the downwardly projecting part of the thread of the screw 1 3 is used for releasably securing the adapter 1 with the apparatus, with which the adapter is moved up and down in an oscillating manner, so as to crush a sample 9 with a ball 8 and unlock.
  • the Grundkorper 2 also consists of plastic and that of polyoxymethylene. This plastic resists low temperatures of around -80 0 C and common cleaning solutions.
  • the consisting of polyoxymethylene, annular insert 2a is stored in the upper region of the Grundkorpers 2 by O-R ⁇ nge 1 5 made of silicone with a hardness of 50 Shore and beyond held by the lid 3 by clamping.
  • the upper area of the metallic sleeves is clamped in the insert 2a.
  • the rings made of silicone thus serve as the noise dam. It is also possible to choose other plastics which are able to cope with the stated requirements.
  • the lid 3 and the insert 2a may be separated from each other by an elastic intermediate layer so as to further insulate noise during the digestion.
  • the intermediate layer can also be a silicone ring.
  • the insert 2a has an upwardly projecting, centrally arranged handle portion 1 6 to the insert 1 4 together with the sleeves and the to be able to take out suspended plastic containers.
  • they In order to hang the Kunststoffbehalter suitable, they have in the upper part of a wider edge, which is wider than the In nen pressmesser the sleeve 4.
  • the diameter of the basic body shown in FIG. 1 is approximately 80 mm.
  • the basic body is approx. 50 mm high.
  • the inner diameter of a metallic Huise 4 is 1 1 mm.
  • Such a sleeve 4 is 35 mm high.
  • Suitably dimensioned Kunststoffbehalter 6 are expediently standardized filled with about 25 mg of sample material in order to unlock standardized.
  • FIG. 2 shows a stander onto which the insert 2a together with the hinged plastic containers 6 together with the sleeves can be placed.
  • the cylindrical recesses 1 8 of the stand serve the
  • Drilling pins 1 9 are used to eject the plastic containers out of the sleeves in order to be able to easily remove the plastic containers.
  • the upwardly projecting handle 20 of the stator 1 7 is pushed through the central opening of the insert 2 a to turn off the insert 2 a on the stator 1 7.
  • the adapter was thus moved up and down by the apparatus with a frequency of 50 Hz.
  • the samples were then taken and zent ⁇ fugiert down with a small table centrifuge In this bench centrifuge, the adapter was clamped after digestion Subsequently, the centrifuge was briefly turned on, what a sufficient to get all the components back to the bottom of the adapter
  • the liver tissue gave an average of 34.08 ⁇ g DNA and a standard deviation of 1 0.97. When the liver tissue was disrupted, it showed that the boil worked very well.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren für das Aufschließen einer biologischen Probe (9) mit den Schritten: die Probe (9) wird in einen insbesondere aus Kunststoff bestehenden Behälter (6) gefüllt, der Behälter (6) wird in einen Adapter (2, 2a) eingesetzt, der Adapter mit dem darin befindlichen, verschlossenen Behälter wird mit einer Apparatur verbunden, die den Adapter automatisiert hin- und her bewegt und zwar insbesondere nach oben. Dieses Verfahren ermöglicht ein automatisiertes Aufschließen von biologischen Proben und zwar sowohl bei Raumtemperatur als auch von gefrorenen Proben. Die Erfindung betrifft ferner eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens umfassend einen überwiegend aus Kunststoff bestehenden Adapter (2, 2a) mit aus Metall bestehenden Hülsen (4) für die Aufnahme von insbesondere aus Kunststoff bestehenden Behältern (6).

Description

Verfahren und Vorrichtung für das zeitgleiche, automatisierte Aufschließen von mehreren biologischen Proben
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung für das Aufschließen einer pflanzlichen oder tierischen Probe für eine Prozessierung, also beispielsweise für die Isolierung von Nukleinsäuren oder Proteinen aus der Probe. Solche Vorbereitungen und Untersuchungen werden in einem Labor von einer Laborantin oder von einem Laboranten anhand von standardisierten Arbeitsanleitungen durchgeführt, Zu einer solchen Arbeitsanleitung gehört ein sogenanntes Protokoll. Ein Beispiel für ein solches Protokoll zur Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli, geht aus der Druckschrift DE 1 01 53 957 Al hervor.
Um eine Probe in gewünschter Weise zu prozessieren, also beispielsweise die Nukleinsäuren oder Proteine zu isolieren, können in Abhängigkeit von der Probe und vom gewünschten Ergebnis sogenannte „Kits" kommerziell erhalten werden, so zum Beispiel das „UltraClean Tissue DNA Isolation Kit" der Fa. Qiagen (www.Qiagen.com). Bevor eine Probe mit Hilfe eines solchen Kits gemäß einem vorgegebenen Protokoll prozessiert wird, muss diese geeignet vorbereitet werden.
Nachfolgend werden solche aus dem Stand der Technik bekannte typische Vorbereitungen beschrieben.
Einem Versuchstier, so zum Beispiel einer Ratte, wird beispielsweise ein
Organ entnommen . Es hangt von der Zielsetzung ab, welches Organ eines Tieres ausgewählt wird. Das entnommene Organ bzw. Gewebe des Tieres wird in einer Waschpufferlosung gewaschen, so zum Beispiel in PBS (Phosphate Buffered Saline mit folgendem Inhalt: Na2HPO4 (getrocknet), NaH2PO4 (getrocknet), NaCI und destilliertes Wasser). Durch die Waschung wird das Gewebe des entnommenen Teils blutfrei bereitgestellt und von unerwünschten Bestandteilen befreit. Im Anschluss daran wird das entnommene Gewebe im flussigen Stickstoff gekühlt und zwar u, a ., um Zellaktivitaten zu stoppen. Andernfalls wurde nicht die gewünschte Information in der gewünschten Qualität im Anschluss an die Prozessierung erhalten . Typischerweise wird dabei Gewebe mit einer Korpertemperatur von beispielsweise 37°C in flussigen Stickstoff eingetaucht, Es entwickeln sich Blasen. Das Gewebe wird erst wieder dem flussigen Stickstoff entnommen, wenn die Blasenbildung stoppt. Im Anschluss daran wird das Gewebe bei -8O0C beispielsweise mit Hilfe von Trockeneis gelagert.
Soll der Kuhlschritt in Flussigstickstoff vermieden werden, so wird alternativ im Anschluss an die Waschung das entnommene Gewebe chemisch konserviert und zwar über Stabilisierungsreagenzien wie z, B. RNAIater®. RNAIater® ist eine viskose Flüssigkeit, die von der Firma Ambion (www.ambion.com) zur Konservierung von Frischgewebe entwickelt wurde. Die Konservierungswirkung beruht vor allem darauf, dass alle Enzyme durch Wasserentzug im Gewebe inaktiviert und Zellaktivitaten gestoppt werden . Die viskose Flüssigkeit muss schnell in alle Zellen des Gewebes hinein diffundieren. Die Große der Gewebestucke ist daher auf eine Kantenlange von maximal einem halben Zentimeter zu beschranken. Im Anschluss an die chemische Behandlung wird auch das so behandelte Gewebe bei -80° gekühlt, um es so bis zur Prozessierung zu lagern .
Für eine Prozessierung werden typischerweise 1 0 bis 1 00 mg an Gewebe benotigt, um die gewünschte Untersuchung, Isolierung oder dergleichen durchzufuhren . Es wird nun vor Beginn der Prozessierung die benotigte Menge an tierischem Gewebe beispielsweise mit einem Skalpell abgetrennt.
Die bisher genannten Schritte der Probenvorbereitung können einzeln oder in Kombination Merkmale der unten beschriebenen Erfindung sein.
Die abgetrennte Probe, also das abgetrennte Gewebe wird nun aufgeschlossen, das heißt, die Zellwande müssen geöffnet werden . Dies kann mechanisch, chemisch oder enzymatisch erfolgen. Ein mechanischer Aufschluss erfolgt beispielsweise mit Hilfe eines „TissueRuptor" der Firma Qiαgen, bekannt aus dem TissueRuptor Handbook, Juli 2006 der Firma Qiagen aus Hilden, Deutschland . Dabei zerschlagt ein drehendes Messer mit 35.000 Umdrehungen pro Minute Zellwande des Gewebes. Mechanische Aufschlüsse werden regelmäßig in einem Puffer durchgeführt, um Schädigungen der Inhaltsstoffe wie zum Beispiel Nukleinsäuren zu vermeiden.
Ein in einem Behalter unter Anwesenheit eines Puffers, also eines chemischen Stoffes durchgeführter mechanischer Aufschluss ist aus der Druckschrift EP 1 57701 1 A2 bekannt.
Es ist auch bekannt (siehe zum Beispiel http //www. Ia borpraxis.de/fac ha rtikel/lp_fachartιkel_n h_2384859.htm I, Stand
1 2. März 2007), Proben in einer Kryomuhle vorzubereiten. Bei dieser aktiv gekühlten Mühle wird die Probe bei der Temperatur von flussigem Stickstoff gemahlen . Die Probe bleibt wahrend des gesamten Mahlvorgangs tiefgekühlt, ohne mit dem Stickstoff in Kontakt zu kommen . Dieses technisch recht aufwendige Verfahren kann bei solchen Proben durchgeführt werden, bei denen das vorgenannte Verfahren versagt, so zum Beispiel bei sehr harten Materialien wie Knochen oder bei klollagenhaltigen Materialien wie Haut, Soll ein Knochen vorbereitet werden, so ist auch bekannt, diesen in ein mit flussigem Stickstoff gefülltes Gefäß zu bringen und mit Hilfe eines Metallbolzens zu zerstoßen. Der Knochen liegt anschließend in Pulverform vor.
Sollen histologische Untersuchungen mittels eines Mikroskops durchgeführt werden, so wird eine Probe mit Parafin getrankt, ausgehartet und dann mittels Mikrotom in dünne Gewebeschichten geschnitten.
Sollen pflanzliche Proben prozessiert werden, ist ein Zurechtschneiden mittels
Skalpell nur bei weichen Materialien wie zum Beispiel Blattern, weichen Bohnen usw. möglich. Bei getrockneten oder gefrorenen Pflanzenproben werden diese in flussigem Stickstoff eingefroren und in einem mit flussigem Stickstoff aktiv gekühlten Morser mit Hilfe eines Stoßeis zermahlen . Die deutsche Patentschrift 738 286 lehrt, Zellen zusammen mit einer Dispersionsflussigkeit einzufrieren und zu vermählen, um Zellen so zu zerkleinern
Aus den Druckschriften DE 602005001 256 T2 sowie WO 2004/082837 Al gehen jeweils eine Zerstoß-/Mιschvorrιchtung für Nahrungsmittel wie Gewürze hervor Die Vorrichtung umfasst einen Hohlkörper mit einer darin befindlichen Kugel, mit der Nahrungsmittel zerstoßen werden sollen
Die Druckschriften US 2004/01 44874 Al , JP 2006051 505 A, JP 2002-066 366 A sowie JP 03- 1 86 360 A offenbaren weitere Beispiele für Ballmuhlen und damit vergleichbare Vorrichtungen E in Verfahren für das Aufschließen einer biologischen Probe ist diesen Druckschriften nicht zu entnehmen.
Mit einer Probenvorbereitung der vorgenannten Art wird das Ziel verfolgt, im Anschluss an d ie Prozessierung ein möglichst gutes gesuchtes Resultat zu erhalten In Übereinstimmung hiermit ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine biologische Probe geeignet und einfach aufzuschließen
Eine Losung der Aufgabe umfasst die Merkmale von Anspruch 1 Eine Vorrichtung zur Durchfuhrung des Verfahrens umfasst die Merkmale des Nebenanspruchs Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den Unteranspruchen
Eine geeignet vorbereitete Probe wird in einen aus Kunststoff bestehenden Behalter eingesetzt Der Kunststoffbehalter wird in einen Adapter eingesetzt Der Kunststoffbehalter ist dann verschlossen Er kann durch den Deckel des Adapters verschlossen worden sein Bevorzugt weist der Kunststoffbehalter jedoch einen eigenen Deckel auf, damit der Kunststoffbehalter auch dann noch verschlossen ist, wenn er aus dem Adapter nach dem Aufschluss herausgenommen wird Außerdem wird so der Reinigungsaufwand minimiert, wenn der Kunststoffbehαlter nicht wieder verwendet, sondern schließlich entsorgt wird Der Adapter wiederum wird mit einer Apparatur verbunden, die den Adapter automatisiert hin und her bewegt und zwar insbesondere nach oben und unten , um so die Probe aufzuschließen Der Adapter ist insbesondere so gestaltet, dass er eine Mehrzahl von Kunststoffbehaltern aufzunehmen vermag, um eine Mehrzahl von biologischen Proben zeitgleich aufschließen zu können
Eine Probe wird vor dem Einsetzen in den Kunststoffbehalter insbesondere geeignet vorbereitet, indem die Probe zunächst gewaschen und anschließend mit Hilfe von flussigem Stickstoff oder chemisch konserviert wird, also zum Beispiel mit Hilfe von RNAIater® der US-Firma Ambion aus Foster City oder mit Hilfe von AllProtect der Fa Qiagen gemäß der Internetseite http //www! qiagen com/products/RnaStabilizationPuπfication/AllprotectTissu eReagent aspx Vor allem in Abhängigkeit von der Große des
Kunststoffbehalters wird die geeignet vorbereitete Probe ganz oder teilweise in den Kunststoffbehalter gefüllt Wird nur ein Teil einer Probe eingefüllt, so wird dieser Teil beispielsweise mit Hilfe eines Skalpells abgetrennt
Da im Fall einer chemischen Konservierung eine zu konservierende Probe klein sein muss, wird vorzugsweise der Kunststoffbehalter so dimensioniert, dass er nur kleine Proben aufzunehmen vermag Wenn also aus diesem Grund stets nur eine kleine Probenmenge von vorzugsweise nicht mehr als 50 mg, besonders bevorzugt von nicht mehr als 30 mg vorzubereiten sind, dann werden so Handhabungsfehler verbessert vermieden
Das Verfahren ermöglicht einen automatisierten Aufschluss von Proben und zwar auf verschiedene Weisen Indem die gefrorene oder chemisch konservierte Probe zunächst in einen Kunststoffbehalter gebracht wird, der im eingesetzten Zustand verschlossen ist, wird so eine Kontamination von weiteren Bestandteilen der Gesamtvorrichtung vermieden Der Kunststoffbehalter ist ein preiswerter Wegwerfartikel, der im Anschluss an das Aufschließen der Probe nicht für eine weitere Probe aus Kostengrunden wieder verwendet werden muss Eine Reinigung des benutzen Kunststoffbehαlters kann daher entfallen Da der Adapter eine Mehrzahl von Kunststoffbehaltern mit einer darin befindlichen Probe aufzunehmen vermag, können eine Mehrzahl von Proben zeitgleich aufgeschlossen werden
Der Adapter wiederum ist grundsätzlich ein von der Apparatur getrennter Gegenstand, um den Adapter geeignet und einfach präparieren zu können Insbesondere ist es dann leicht möglich, den Adapter vor dem Einsetzen der Kunststoffbehalter nebst Proben in einem Temperaturbereich von insbesondere -2O0C bis -800C beispielsweise in einem Kühlschrank oder mit Hilfe von Trockeneis zu kühlen, um so eine gefrorene Probe aufschließen zu können, ohne ein Auftauen der Probe trotz fehlender aktiver Kühlung befurchten zu müssen
Die anspruchsgemaße Lehre funktioniert sowohl für pflanzliches als auch für tierisches oder menschliches Gewebe und zwar sowohl für stabilisierte als auch für frische Proben von Pflanzen oder Geweben Außerdem ist ein Aufschließen sowohl bei Raumtemperatur von chemisch konservierten Proben als auch von gefrorenen Proben bei tiefen Temperaturen sehr einfach möglich
Um eine gefrorene Probe wahrend des Aufschließens zuverlässig geeignet kühl halten zu können, umfasst der Adapter in einer Ausfuhrungsform eine, vorzugsweise mehrere metallische Hülsen, in die die Kunststoffbehalter eingesetzt werden Darüber hinaus besteht der Adapter ganz oder zumindest überwiegend aus Kunststoff Metallische Hülsen verfugen über die erforderliche Wärmekapazität, um den Kunststoffbehalter hinreichend lange kühl zu halten Darüber hinaus besteht der Adapter ganz oder überwiegend aus Kunststoff, damit der Adapter nicht zu schwer wird, was seine Handhabung zu sehr erschweren wurde
In einer Ausfuhrungsform der Erfindung wird eine tiefgekühlte Probe in einen gekühlten Kunststoffbehalter gegeben, der außerdem wenigstens einen beweglichen, harten Korper enthalt Der gekühlte Kunststoffbehalter wird dann in den gekühlten Adapter bzw in die metallische Hülse des gekühlten Adapters eingesetzt. Die Temperatur, auf die der Adapter in einer Ausfuhrungsform gekühlt wird, sollte weniger als -5O0C betragen , um ein Auftauen einer gefrorenen Probe wahrend des Aufschheßens zuverlässig zu vermeiden . Vorzugsweise ist eine Temperatur von ca. - 80 0C, so zum Beispiel von -700C bis -90°C zu wählen. -800C bzw. -70°C bis -900C können mit Hilfe von Trockeneis oder in einem Kühlschrank preiswert bereitgestellt werden . Es hat sich gezeigt, dass sich durch eine Kühlung auf ca. -8O0C besonders gute Ergebnisse erzielen lassen . Tiefere Temperaturen als -800C sind bis zu einem gewissen Grad möglich. Zu beachten ist allerdings, dass der Adapter für die Durchfuhrung eines Aufschlusses nicht zu stark abgekühlt werden darf. So hat sich eine Temperatur von flussigem Stickstoff, also von - 1 96 0C als zu tief herausgestellt, um zu guten Resultaten zu gelangen . Der Adapter wird dann nach dem Einsetzen in die Apparatur durch diese schnell hin- und her bewegt, so dass der bewegliche Korper relativ zum Kunststoffbehalter derart geschüttelt wird, dass die tiefgekühlte Probe durch den beweglichen Korper zerstoßen und aufgeschlossen wird . Eine zusatzliche aktive Kühlung des Adapters beispielsweise mit Hilfe von Stickstoff hat sich als nicht erforderlich herausgestellt und ist daher vorzugsweise nicht vorhanden . Dies vereinfacht die Handhabung erheblich im Vergleich zu einem Stand der Technik, der eine aktive Kühlung wahrend des Aufschlusses erfordert.
Besonders geeignet ist ein zylinderförmiger Innenraum des Kunststoffbehalters mit wenigstens einem hohlkugelformigen Ende. Der bewegliche Korper ist dann bevorzugt eine Kugel oder aber ein Bolzen mit kugelförmigen Enden. Der Durchmesser der Kugel oder des Bolzens ist etwas kleiner als der Durchmesser des Innenraums des Kunststoffbehalters, um so die Beweglichkeit zu gewährleisten. Der bewegliche Korper besteht aus einem harten, vorzugsweise schweren Material wie Metall, um die Probe zerstoßen zu können . Die Probe wird vorzugsweise so in den Kunststoffbehalter eingebracht, dass diese sich zwischen einem hohlkugelformigen Ende des Kunststoffbehalters und der Kugel bzw. dem Bolzen befindet. Der Durchmesser der Kugel bzw. des Bolzens betragt vorzugsweise wenigstens 5 mm, besonders bevorzugt wenigstens 8 mm. Der Durchmesser des Kunststoffgefαßes betrogt vorzugsweise nicht mehr als 1 5 mm, bevorzugt bis zu 1 0 mm. Vorzugsweise wird der Kunststoffbehalter wahrend des Aufschließen senkrecht angeordnet und das hohlkugelformige Ende befindet sich unten. Schwerkraftbedingt verbleibt das Probenmateπal dann in erster Linie im unteren Bereich, so dass nur ein (unteres) hohlkugelformiges Ende genügt, um mit Hilfe einer Kugel zuverlässig zerstoßen zu können.
Insbesondere wird eine wenigstens -5O0C kalte Probe in das Kunststoffgefaß gegeben. Anschließend wird das Gefäß insbesondere 1 0 bis 200 Sekunden so mit Hilfe der Apparatur geschüttelt, dass der bewegliche Korper hin- und her, bevorzugt hoch und runter geschleudert wird und zwar vorzugsweise mit einer Frequenz von 1 0 bis 1 00 Hz, insbesondere mit einer Frequenz von wenigstens 30 Hz . Wird zu lange geschüttelt bzw. hin und her bewegt, so droht ein Auftauen der Probe. Um innerhalb der zur Verfugung stehenden Zeit die Probe zuverlässig aufschließen zu können, muss genügend lange sowie mit einer hinreichend hohen Frequenz hm- und her bewegt werden. Im Anschluss daran kann die so zerstoßene Probe aus dem Kunststoffgefaß entnommen und die gewünschte Menge mit Hilfe eines Kits gemäß einem Protokoll prozessiert werden . Grundsatzlich befinden sich dann in dem Kunststoffgefaß außer der gefrorenen Probe und einem oder mehreren beweglichen harten Korpern keine weiteren Substanzen und zwar insbesondere auch kein Kuhlmittel wie flussiger Stickstoff oder aber beispielsweise Pufferlosungen. Diese wurden zumindest in der Regel lediglich das gewünschte Ergebnis verschlechtern.
Es hat sich überraschend gezeigt, dass bei dieser Form des Aufschließens einer gefrorenen Probe sehr gute Ergebnisse im Vergleich zu den aus dem Stand der Technik bekannten Probenvorbereitungen erzielt werden, obwohl kein großer technischer Aufwand betrieben wird und die Handhabung einfach ist. Ein Aufschluss in beispielsweise einem TissueRupter kann entfallen bzw. entfal lt, da dieser zusatzliche Aufschluss grundsatzlich nicht erforderlich ist. Die so vorbereitete Probe kann also sofort prozessiert werden und dies mit besonders guten Endergebnissen Der technische Aufwand ist nicht groß, da das Gefäß mit dem darin befindlichen, beweglichen Korper nebst Adapter lediglich beispielsweise in einem Kühlschrank auf eine Temperatur von beispielsweise -5O0C bis -8O0C gekühlt wird Nach dem Zerstoßen der Probe kann diese entnommen und beispielsweise erst einmal wieder beispielsweise gekühlt in einem weiteren Gefäß gelagert werden Alternativ wird die Probe nicht entnommen und in einem weiteren Gefäß gelagert, sondern sofort in dem Kunststoffgefaß, welches den beweglichen Korper enthalt Es dient also dann zugleich als Aufschlussgefaß und Aufbewahrungsbehalter Die gewünschte Probenmenge für die Prozessierung kann genau und einfach bereitgestellt werden Auch wird dabei eine homogene Gewebeverteilung erreicht Selbst stabilisiertes Gewebe, Blatter und Samen von Pflanzen können in dieser Weise für die weitere Prozessierung vorbereitet werden Für Haut und Knochen und vergleichbar harte bzw viskose Proben ist allerdings dieses Verfahren nicht geeignet
Da die Bearbeitung im gekühlten, geschlossenen Adapter nicht sehr viel Zeit in Anspruch nimmt, ist es nicht erforderlich, den Schuttelvorgang zu unterbrechen und den Adapter zwischendurch wieder auf geeignet tiefe Temperaturen abzukühlen Dies gilt vor allem, wenn der Adapter Hülsen aus Metall mit hinreichend dicken Wandungen aufweist Eine Wandung von wenigen Millimeter Dicke genügt in der Regel bereits Die Dicke der Wandung hegt in einer Ausfuhrungsform bei wenigstens 0,5 mm, um eine hinreichende Wärmekapazität bereitzustellen, vorzugsweise bei wenigstens einem Millimeter Um nicht zu schwer zu werden, betragt die Wandung in einer Ausfuhrungsform nicht mehr als 4mm
Da die Probe nach dem Zerstoßen in Pulverform vorliegt, weist diese vorteilhaft eine besonders große Oberflache auf, an der nachfolgend eingesetzte Chemikalien angreifen können Eine gewünschte Menge an Pulver kann für nachfolgende Schritte besonders einfach bereitgestellt werden, so zum Beispiel durch Wiegen oder sogar durch entsprechend dimensionierte Messgefaße wie ein Messloffel Der Adapter eignet sich selbst für das Aufschließen einer ungekuhlten Probe im ungekuhlten Zustand. Allerdings wird die Probe dann mit Hilfe eines Lysepuffers aufgeschlossen, der sich wahrend des Aufschheßens zusammen mit der Probe im Kunststoffbehalter befindet, Em Zerstoßen der Probe kann auch stattfinden, wenn der Adapter ungekuhlt benutzt wird. Hier entsteht eine Losung zwischen Puffer und Gewebe. Geeignete Lysepuffer sind Puffer umfassend Komplexbildner und oberflächenaktive Substanz für das Aufschließen von DNA wie zum Beispiel der Lysepuffer ATL, kommerziell erhaltlich bei der Fa. Qiagen GmbH aus Hilden, Deutschland, oder aber Puffer umfassend umfassend chaotrope Substanz für das Aufschließen von RNA wie zum Beispiel der Lysepuffer RLT, kommerziell erhaltlich bei der QIAGEN GmbH.
Nachdem im gekühlten Zustand das zuvor eingewogene Gewebestucken zu Pulver verarbeitet worden ist, wird in einer Ausfuhrungsform ein Puffer hinzugegeben, d. h. das Pulver wird in Losung überfuhrt. So werden Schwierigkeiten vermieden, um sehr kleine Probenmengen von zum 1 0 mg Gewebepulver wieder zu entnehmen.
Wird Gewebe aufgeschlossen, so werden vorzugsweise relativ große metallische bewegliche Korper für das Aufschließen verwendet, die sich in den Kunststoffbehaltern befinden. Werden Bakterien aufgeschlossen, so bestehen die beweglichen, relativ kleinen Korper insbesondere aus Glas (sogenannte Glasbeads) . Glasbeads haben einen geringen Durchmesser und sind wie Sand. Hierdurch wird die Reibung sehr viel starker. Diese Eigenschaften werden benotigt, um Bakterien aufschließen zu können, Metalbeads sind regelmäßig zu groß, so dass der Abstand der einzelnen Kugeln zu große Freiraume bieten wurde, um damit Bakterien aufschließen zu können,
Anstelle des genannten Kunststoffes kann grundsätzlich auch ein anderes nicht metallisches Material gewählt werden, insbesondere wenn dieses mit Kunststoff vergleichbar ist. Kunststoff ist allerdings besonders zu bevorzugen. n
Weitere Vorteile und Ausgestaltungen ergeben sich aus den nachfolgenden Versuchsbeschreibungen.
Figur 1 zeigt einen seitlichen Schnitt durch einen Adapter 1 . Der Adapter 1 umfasst einen behälterförmigen Grundkörper 2, der mit einem Deckel 3 verschlossen worden ist. Im Grundkörper sind insgesamt zwölf aus Aluminium bestehende Hülsen 4 (in Aufsicht gesehen) kreisförmig um eine zentrale Achse des Adapters herum angeordnet. Die Wandstärke der Hülsen 4 beträgt 1 mm. Die Hülsen 4 weisen in einem oberen Bereich ein oder mehrere
Schütze 5 auf. Der obere Bereich mit dem Schlitz wird klemmend in einem Einsatz 2a, der sich im Grundkörper 2 befindet, gehalten. Die Hülsen 4 können daher zu Reinigungszwecken aus dem Grundkörper 2 herausgenommen werden und zwar besonders leicht zusammen mit dem Einsatz 2a.
In Figur 1 wird ein mit einem Deckel versehener Kunststoffbehälter 6 gezeigt, der in eine Metallhülse 4 eingesetzt ist. Der Kunststoffbehälter ό wird von zwei elastischen, ringförmigen Scheiben 7 aus geschäumten Silikon eingeklemmt, die unterhalb und oberhalb des Kunststoffbehälters 6 angeordnet sind. Die obere ringförmige Scheibe wird vom Deckel 3 durch seitliche Nuten gehalten , die an der Unterseite des Deckels 3 angeordnet sind. Die untere ringförmige Scheibe 7 wird am Boden des Grundkörpers 2 durch seitliche Nuten gehalten. Die elastischen Scheiben 7 stabilisieren den Behälter während des Aufschließens, so dass dieser nicht beschädigt werden kann . Die elastischen Scheiben 7 wirken darüber hinaus geräuschdämmend.
Der Boden des aus Kunststoff bestehenden Behälters 6 ist hohlkugelförmig, Im Behälter 6 befindet sich eine aus Stahl bestehende Kugel 8. Zwischen der Stahlkugel 8 und dem hohlkugelförmigen Grund des Kunststoffbehälters 6 ist eine biologische Probe 9 eingebracht. Es genügt, dass nur der Boden und nicht auch der Deckelbereich des Kunststoffbehälters 6 hohlkugelförmig ist, da die Probe bereits schwerkraftbedingt zumindest überwiegend im unteren Bereich verbleiben wird, so dass die Probe im Bodenbereich zerstoßen wird . Der Grundkorper 2 ist in der oberen Hälfte mit einem aus Stahl bestehenden Gewindeeinsatz 1 0 versehen, in den eine Befestigungsschraube 1 1 des Deckels 3 hinein geschraubt wird, um den Grundkorper mit dem Deckel zu verschließen. Vorzugsweise genügt eine Vierteldrehung, um den Deckel zu befestigen. In der unteren Hälfte gibt es eine weitere, aus Stah l bestehende Gewindebuchse 1 2, in die eine Schraube 1 3 hineingedreht worden ist, so dass das Gewinde der Schraube 1 3 gegenüber dem Bodenbereich des Behalters 2 hervorsteht. Die Schraube 1 3 ist darüber hinaus eingeklebt und mit einer Mutter 1 4 gekontert, damit diese sich zuverlässig aus dieser Befestigung nicht lost.
Der nach unten vorstehende Teil des Gewindes der Schraube 1 3 dient zur losbaren Befestigung des Adapters 1 mit der Apparatur, mit der der Adapter nach oben und unten oszillierend bewegt wird, um so eine Probe 9 mit einer Kugel 8 zu zerstoßen und aufzuschließen.
Der Grundkorper 2 besteht darüber hinaus aus Kunststoff und zwar aus Polyoxymethylen . Dieser Kunststoff widersteht tiefen Temperaturen von um die -800C sowie gangigen Reinigungslosungen . Der aus Polyoxymethylen bestehender, ringförmiger Einsatz 2a wird im oberen Bereich des Grundkorpers 2 durch O-Rιnge 1 5 aus Silikon mit einer Harte von 50 Shore gelagert und darüber hinaus durch den Deckel 3 klemmend gehalten . Der obere Bereich der metallischen Hülsen ist im Einsatz 2a eingeklemmt, Die aus Silikon bestehenden Ringe dienen so der Gerauschdammung, Es können auch andere Kunststoffe gewählt werden, die den genannten Anforderungen gewachsen sind,
Der Deckel 3 und der Einsatz 2a kann durch eine elastische Zwischenlage voneinander getrennt sein, um so Geräusche wahrend des Aufschließens weiter zu dämmen. Die Zwischenlage kann ebenfalls ein Silikonring sein.
Der Einsatz 2a weist einen nach oben vorstehenden, mittig angeordneten Griffbereich 1 6 auf, um den Einsatz 1 4 zusammen mit den Hülsen und den darin eingehängten Kunststoffbehaltern herausnehmen zu können. Um die Kunststoffbehalter geeignet einhangen zu können, weisen diese im oberen Bereich einen breiteren Rand auf, der breiter ist als der In nendurchmesser der Hülse 4. Im gezeigten Ausfuhrungsbeispiel gibt es einen oberen Bereich der Hülse mit verbreitertem Innendurchmesser, um einen verbreiterten Rand eines Kunststoffbehalters aufnehmen zu können. Wird der Einsatz 2a zusammen mit den Kunststoffbehaltern 6 herausgenommen, so gelangt der breitere obere Rand des Kunststoffbehalters in die entsprechende obere Ausnehmung der Huise mit dem vergrößerten Innendurchmesser und wird dann wahrend des Transports besonders sicher gehalten.
Der Durchmesser des in Figur 1 dargestellten Grundkorpers betragt ca. 80 mm , Der Grundkorper ist ca . 50 mm hoch. Der Innendurchmesser einer metallischen Huise 4 betragt 1 1 mm . Eine solche Hülse 4 ist 35 mm hoch. Entsprechend dimensionierte Kunststoffbehalter 6 werden zweckmaßigerweise standardisiert mit ca. 25 mg Probenmaterial gefüllt, um standardisiert aufschließen zu können.
Die genannten Maße und Materialien des Adapters sind lediglich zweckmäßig und müssen nicht zwingend gewählt werden. Entsprechendes gilt für die gezeigte Konstruktion des Adapters.
In Figur 2 wird ein Stander gezeigt, auf den der Einsatz 2a zusammen mit den eingehängten Kunststoffbehaltern 6 nebst Hülsen abgestellt werden kann. Die zylinderförmigen Vertiefungen 1 8 des Standers dienen der
Aufnahme der Hülsen 4 nebst Kunststoffbehaltern 6. Bohrkegel 1 9 dienen dem Herausdrucken der Kunststoffgefaße aus den Hülsen, um die Kunststoffgefaße leicht entnehmen zu können. Der nach oben vorstehende Griff 20 des Standers 1 7 wird durch die zentrale Öffnung des Einsatzes 2a hindurch geschoben, um den Einsatz 2a auf dem Stander 1 7 abzustellen.
Mit dem in Figur 1 gezeigten Adapter wurden die nachfolgenden Versuche durchgeführt, 1 DNA Isolation aus frischer Rattenleber und frischem Rattenherz
Jeweils 1 2 Proben (25 mg) frischer Rattenleber und -herz wurden mit 1 80 μl ATL, also einem Puffer umfassend Komplexbildner und oberflächenaktive Substanz, kommerziell erhaltlich von QIAGEN GmbH , Hilden, Deutschland, (siehe Internetseite http //wwwl qiagen com/Products/Accessoπes/Buffers/BufferATL aspx ), l O μl DX (siehe Internetseite http //wwwl qiagen com/Products/ReagentDX aspx ) und zwei metallischen Edelstahlkugeln (auch „Beads" genannt) mit einem Durchmesser von 5 mm versetzt und bei 50 Hz für 1 ,5 min aufgeschlossen Versuche zeigten, dass bei zwei Beads die Turbulenzen großer sind, was zu einer höheren Zermahlung des Gewebes fuhrt Der Adapter wurde also von der Apparatur mit einer Frequenz von 50 Hz nach oben und unten bewegt Im Anschluss wurden die Proben entnommen und herunter zentπfugiert und zwar mit einer kleinen Tischzentrifuge In diese Tischzentrifuge wurde der Adapter nach dem Aufschluss eingespannt Im Anschluss wurde die Zentrifuge kurz eingeschaltet, was ausreicht, um alle Bestandteile wieder auf den Boden des Adapters zu bekommen
Danach wurden jeweils 20 μl Proteinase K hinzugegeben, gevortext und die Losung für 1 h bei 56 0C inkubiert Nach der Inkubation wurde die Probe mit 4μl RNAse A ( 1 00 mg/ml) versetzt und für 5 min inkubiert Weitere Schritte erfolgten nach dem DNeasy Protokoll (siehe Internetseite http //wwwl qiagen com/Products/GenomicDnaStabilizationPuπfication/DNea syTissueSystem/DNeasyBIoodTissueKit aspx)
Ergebnisse Herz
Das Herzgewebe ergab einen Mittelwert von 5,83 μg DNA sowie eine Standardabweichung von 1 ,07 Die isolierte Menge an DNA hatte etwas hoher ausfallen können, ansonsten gab es keine Beanstandungen Leber:
Das Lebergewebe ergab einen Mittelwert von 34,08 μg DNA sowie eine Standardabweichung von 1 0,97 , Beim Aufschluss des Lebergewebes zeigte sich, dass der Aufschiuss sehr gut funktioniert.
2, DNA Isolation aus frischer Rinderleber
Jeweils 1 2 Proben (25 mg) frischer Rinderleber wurden mit 1 80 μl ATL, 6 μl DX und 2 beads versetzt und bei 50 Hz für 2 Minuten aufgeschlossen. Im Anschluss wurden die Proben entnommen und runterzentrifugiert. Danach wurden jeweils 20 μl Proteinase K hinzugegeben, gevortext und die Losung für 1 ,5 h bei 56 0C inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Probe mit 4μl RNAse A (100 mg/ml) versetzt und für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Weitere Schritte erfolgten nach dem Tissue and rodent tail Protokoll auf dem QIAcube der Fa. Qiagen aus Hilden, Deutschland . Das Tissue and rodent tail Protokoll wird zusammen mit dem QIAcube ausgeliefert.
Ergebnisse:
Leber1
Das Lebergewebe ergab einen Mittelwert von 44,38 μg DNA sowie eine Standardabweichung von 1 2, 84. Beim Aufschluss des Lebergewebes zeigte sich erneut, dass der Aufschluss sehr gut funktioniert. Die DNA war wiederum bereits als weißes Knäuel sichtbar und konnte nur mit Problemen mittels Pipette in ein neues MRV (MRV = Micro reaction vessel = Microreaktionsgefaß oder auch kurz „Eppi" genannt) überfuhrt werden.
In der Regel werden 20 μg an DNA erwartet. Der hohe Mittelwert von 44,38 μg DNA deutete auf eine voranschreitende Degradation der DNA hin. Kleine Fragmente fuhren bei der Messung zu einem höheren Signal, was fälschlicherweise als höhere Konzentration angegeben wird.

Claims

Ansprüche
1 Verfahren für das Aufschließen einer biologischen Probe (9) mit den Schritten • die Probe (9) wird in einen nicht metallischen Behalter (6) gefüllt,
• der Behalter (6) wird in einen Adapter (2, 2a) eingesetzt,
• der Adapter mit dem darin befindlichen, verschlossenen Behalter (6) wird mit einer Apparatur verbunden, die den Adapter automatisiert hin - und her bewegt und zwar insbesondere nach oben
2 Verfahren nach Anspruch 1 , bei dem in den Adapter eine Mehrzahl von Behaltern (6) mit darin befindlichen biologischen Proben (9) eingesetzt werden, die zeitgleich durch das automatisierte Hin- und Herbewegen mittels Adapter aufgeschlossen werden
3 Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Probe (9) zunächst gewaschen und anschließend mit flussigem Stickstoff eingefroren oder chemisch konserviert wird und die so vorbereitete Probe in den Behalter (6) gefüllt wird
4 Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem der Adapter aus Metall bestehenden Hülsen (4) umfasst, in die Behalter (6) nebst darin befindlichen biologischen Proben eingesetzt werden
5 Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, bei dem die Behalter
(6), Proben (9) und Adapter (2, 2a) zunächst auf unter -2O0C, vorzugsweise auf unter -5O0C gekühlt werden und im Anschluss daran die Probe durch Hin - und Herbewegen des Adapters aufgeschlossen wird
ό Verfahren nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, bei dem der Adapter (2, 2a) nicht unter -8O0C gekühlt wird
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem wenigstens ein beweglicher, harter Korper (8), vorzugsweise zwei bewegliche harte Korper in den Behälter eingefüllt werden, wobei die Korper insbesondere aus Metall oder Glas bestehen .
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem vor dem Aufschließen ein Lysepuffer in den Behalter (6) gefüllt wird, insbesondere ein Puffer umfassend Komplexbildner und oberflächenaktive Substanz für das Aufschließen von DNA, vorzugsweise ATL oder ein Puffer umfassend chaotrope Substanz für das Aufschließen von R NA, insbesondere RLT.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem der Adapter (2, 2a) mit einer Frequenz von wenigstens 1 0 Hz, vorzugsweise von wenigstens 30 Hz hin und her bewegt wird .
1 0. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das Gewicht einer in einen Behalter (6) eingefüllten Probe nicht mehr als 50 mg, vorzugsweise nicht mehr als 30 mg betragt.
1 1 . Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem der Behalter (6) aus Kunststoff besteht.
1 2. Vorrichtung zur Durchfuhrung eines Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche umfassend einen insbesondere überwiegend aus Kunststoff bestehenden Adapter (2, 2a) mit aus Metall bestehenden H ülsen (4) für die Aufnahme von nicht- metallischen, vorzugsweise aus Kunststoff bestehenden Behaltern (6) .
1 3. Vorrichtung nach dem vorhergehenden Vorrichtungsanspruch, bei dem der Adapter (2, 2a) losbar, insbesondere abschraubbar mit einer Apparatur verbunden ist, die den Adapter parallel zu den Hülsen automatisiert hin und her bewegen kann .
1 4. Vorrichtung nach dem vorhergehenden Anspruch, bei dem die Apparatur so ausgelegt ist, dass diese den Adapter mit einer Frequenz von wenigstens 1 0 Hz, vorzugsweise von wenigstens 30 Hz hin und her zu bewegen vermag,
1 5. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Vorrichtungsanspruche mit in den Hülsen eingesetzten Behaltern (6), in denen sich eine biologische Probe (9) sowie zusätzlich ein beweglicher harter Korper (8) befindet, der insbesondere aus Metall oder Glas besteht.
1 6. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Vorrichtungsanspruche mit einem inneren Hulsendurchmesser der metallischen Hülsen (4) von nicht mehr als 1 ό mm, vorzugsweise von nicht mehr als 1 2 mm .
1 7. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche mit wenigstens sechs metallischen Hülsen (4), vorzugsweise mit wenigstens zwölf metallischen Hülsen (4) für die Aufnahme von Behaltern (6) .
1 8. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Hülsen (4) von einem aus dem Adapter herausnehmbaren Einsatz (2a) gehalten werden ,
1 9. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche mit in Aufsicht ringförmig angeordneten Hülsen (4) .
20. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche mit einem Deckel (3), der mit dem Adapter (2, 2a) fest verbindbar ist.
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