WO2010018324A1 - Polysaccharides fonctionnalises par des derives du tryptophane - Google Patents

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WO2010018324A1
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polysaccharide
tryptophan
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acid
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PCT/FR2009/000993
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Rémi SOULA
Gérard Soula
Olivier Soula
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Adocia
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    • C08B37/0084—Guluromannuronans, e.g. alginic acid, i.e. D-mannuronic acid and D-guluronic acid units linked with alternating alpha- and beta-1,4-glycosidic bonds; Derivatives thereof, e.g. alginates

Definitions

  • the present invention relates to novel biocompatible polymers based on polysaccharides.
  • These polymers may be useful in particular for the administration of active principle (s) (PA) to humans or animals for therapeutic and / or prophylactic purposes.
  • PA active principle
  • Polysaccharides also called glycans or polysaccharides, are polymers formed of monosaccharide units, or osides, linked by glycosidic bonds.
  • the polysaccharides have the general formula [C x (H 2 ⁇ ) x- i)] n . These macromolecules are complex due to variations in size, branching, monosaccharide unit nature and glycosidic bond nature.
  • Homopolysaccharides consist of a single monosaccharide unit.
  • the glycosidic bond is the bond formed between the hemi-acetal group of a saccharide and the hydroxyl function of another saccharide. This bond can be alpha or beta depending on the stereochemistry of the anomeric carbon but above all it can be (1, 2), (1, 3), (1, 4) or (1, 6) depending on the hydroxyl function 2, 3, 4 or 6 saccharide involved in the binding.
  • Some polysaccharides are composed of the same units but vary by the bonds involved.
  • dextran and pullulan are both polysaccharides composed of glucose units but, in the case of dextran, the glycosidic bonds are greater than 95% (1, 6) while in the case of pullulan, they are at 67% (1, 4) and 33% (1, 6).
  • These structural differences lead to differences in physical properties. such as solubility in organic solvents, solubility in water, viscosity.
  • amphiphilic polysaccharides numerous examples have been reported.
  • Biodex in US Pat. No. 6,646,120 has described carboxymethyldextrans modified with benzylamine.
  • This polysaccharide consists predominantly of glycosidic units linked by a bond 1, 6. This sequence leads to obtaining very fluid polymer solutions.
  • Patent FR0702316 of the Applicant describes dextrans modified with hydrophobic amino acids including tryptophan.
  • dextran consists mainly of sequences 1, 6 of a lycosidic ions.
  • dextran is a singular polysaccharide because it is the only polysaccharide composed of more than 95% of bonds (1, 6) which gives it a very good solubility in water, a low viscosity in water and also a good solubility in polar organic solvents such as dimethylsulfoxide, DMSO.
  • the polysaccharides can be used as carriers or excipients in pharmaceutical formulations.
  • the low viscosity of dextran and its high solubility in water may have disadvantages such as too much diffusion from the site of administration, too rapid dilution by biological fluids.
  • polysaccharides such as hyaluronans or alginates have different physical properties.
  • Hyaluronan derivatives modified with fatty alkyl chains in C12 or C18 are described in particular in patent FR2794763.
  • derivatives of alginate modified with fatty alkyl chains are also described derivatives of alginate modified with fatty alkyl chains.
  • Akiyoski et al. J. Controlled Release 1998, 54, 313-320
  • the hydrophobic groups that are grafted do not have sufficient affinity with certain active principles such as proteins when they are used as carriers in pharmaceutical compositions.
  • the present invention relates to novel polysaccharide derivatives, predominantly comprising (1, 4), (1, 3) and / or (1, 2) glycoside linkages functionalized with at least one tryptophan derivative.
  • novel amphiphilic polysaccharides have a biocompatibility comparable to the dextran derivatives but their viscosity is higher and makes it possible to obtain vehicles for pharmaceutical compositions having a viscosity sufficient to prevent diffusion from the site of administration. Nevertheless, their hydrophobicity can easily be modulated without altering their biocompatibility.
  • the use as hydrophobic groups of tryptophan derivatives also makes it possible to obtain a good interaction with the active principles, in particular by the formation of complexes, which allows a modulation of their immobilization.
  • the polysaccharides according to the invention consist mainly of glycoside bonds of (1,4) type, and / or (1,3) and / or (1,2) they may be neutral, that is to say not be carrying acid or anionic functions and carrying acid functions. They are functionalized by at least one derivative of tryptophan, noted Trp:
  • Said tryptophan derivative being grafted or bound to the polysaccharides by coupling with an acid function, said acid function possibly being an acid function of an anionic polysaccharide and / or an acid function carried by a linker R linked to the polysaccharide by a function F, said function F resulting from the coupling between the linker R and a function -OH of the neutral or anionic polysaccharide,
  • F being either an ester, thioester, amide, carbonate, carbamate, ether, thioether or amine function
  • R being a chain comprising between 1 and 18 carbons, optionally branched and / or unsaturated comprising one or more heteroatoms, such as O, N or / and S, and having at least one acid function
  • Trp being a residue of a tryptophan derivative, L and / or D, product of the coupling between the tryptophan amine and the at least one acid carried by the R group and / or an acid carried by the anionic polysaccharide.
  • the functionalized polysaccharides may correspond to the following general formulas:
  • polysaccharide consisting mainly of glycoside bonds of (1,4) type, and / or (1,3) and / or (1,2),
  • R being a chain comprising between 1 and 18 carbons, optionally branched and / or unsaturated comprising one or more heteroatoms, such as O, N or / and S, and having at least one acid function
  • Trp being a residue of a tryptophan derivative, L and / or D, produces coupling between the amine of the tryptophan derivative and at least one acid carried by the group R and / or an acid carried by the anionic polysaccharide.
  • n represents the molar fraction of the Rs substituted by Trp and is between 0.05 and 0.7.
  • o represents the molar fraction of the acid functions of the polysaccharides substituted with Trp and is between 0.05 and 0.7.
  • i represents the mole fraction of acid functions carried by the group R per saccharide unit and is between 0 and 2
  • j represents the mole fraction of acid functional groups carried by the anionic polysaccharide per saccharide unit and is between 0 and 1
  • (i + j) represents the mole fraction of acid functions per saccharide unit and is between 0.1 and 2
  • the acid or acids of the R group are cationic carboxylates, alkali preferably as
  • polysaccharide when the polysaccharide is an anionic polysaccharide, when one or more acid functions of the polysaccharide are not substituted by Trp, then they are salified by a cation, alkaline preferably as Na or K. said polysaccharides being amphiphilic at neutral pH.
  • F is either an ester, a carbonate, a carbamate or an ether.
  • the polysaccharide consists predominantly of glycoside bonds of the type (1, 4).
  • the polysaccharide predominantly composed of glycoside bonds of type (1, 4) is selected from the group consisting of pullulan, alginate, hyaluronan, xylan, galacturonan or a cellulose soluble in the water.
  • the polysaccharide is a pullulan.
  • the polysaccharide is an alginate. In one embodiment, the polysaccharide is a hyaluronan. In one embodiment, the polysaccharide is a xylan. In one embodiment, the polysaccharide is a galacturonan.
  • the polysaccharide is a water-soluble cellulose.
  • the polysaccharide consists predominantly of glycoside bonds of (1, 3) type.
  • the polysaccharide consisting predominantly of glycoside bonds of type (1, 3) is a curdlane.
  • the polysaccharide consists mainly of glycoside bonds of (1, 2) type.
  • the polysaccharide consisting predominantly of glycoside bonds of type (1, 2) is an inulin.
  • the polysaccharide consists mainly of glycoside bonds of (1,4) and (1,3) type.
  • the polysaccharide predominantly composed of glycoside bonds of (1,4) and (1,3) type is a glucan.
  • the polysaccharide consists predominantly of glycoside bonds of (1, 4) and (1, 3) and (1, 2) type.
  • the polysaccharide predominantly composed of glycoside bonds of (1,4) and (1,3) and (1,2) type is mannan.
  • the polysaccharide according to the invention is characterized in that the group R is chosen from the following groups:
  • the polysaccharide according to the invention is characterized in that the tryptophan derivative is selected from the group consisting of tryptophan, tryptophanol, tryptophanamide, 2-indole ethylamine and their alkaline cation salts.
  • the polysaccharide according to the invention is characterized in that the tryptophan derivative is chosen from the esters of tryptophan of formula II
  • E being a group that can be:
  • a linear or branched C1 to C8 alkyl A linear or branched C1 to C8 alkyl. "A linear or branched C 6 -C 20 alkylaryl or arylalkyl.
  • the polysaccharide may have a degree of polymerization m of between 10 and 10,000.
  • it has a degree of polymerization m of between 10 and 1000.
  • the functionalized polysaccharides are pullulans which correspond to the following general formula III:
  • R being a chain comprising between 1 and 18 carbons, optionally branched and / or unsaturated comprising one or more heteroatoms, such as O, N or / and S, and having at least one acid function; Trp being a residue of a derivative; tryptophan, L and / or D, product of the coupling between the amine of the tryptophan derivative and the at least one acid carried by the R.
  • n group represents the molar fraction of the Rs substituted by Trp and is between 0.05 and 0.7.
  • i represents the mole fraction of acid functional groups carried by the group R per saccharide unit and is between 0 and 2
  • the acid or acids of the R group are cationic carboxylates, alkali preferably as Na or K, said pullulans being amphiphilic at neutral pH.
  • F is either an ester, a carbonate, a carbamate or an ether.
  • the pullulan according to the invention is characterized in that the group R is chosen from the following groups:
  • the pullulan according to the invention is characterized in that the tryptophan derivative is chosen from the group consisting of tryptophan, tryptophanol, tryptophanamide, 2-indole ethylamine and their alkaline cation salts.
  • the pullulan according to the invention is characterized in that the tryptophan derivative is chosen from the esters of tryptophan of formula II
  • E being a group that can be:
  • a linear or branched C1 to C8 alkyl A linear or branched C1 to C8 alkyl.
  • a linear or branched C 6 -C 20 alkylaryl or arylalkyl is A linear or branched C 6 -C 20 alkylaryl or arylalkyl.
  • the pullulan may have a degree of polymerization m of between 10 and 10,000.
  • it has a degree of polymerization m of between 10 and 1000. In another embodiment, it has a degree of polymerization m of between 10 and 500.
  • the functionalized polysaccharides are galacturonans which correspond to the following general formulas:
  • linker R a function -OH of galacturonan, being either an ester, thioester, amide, carbonate, carbamate, ether, thioether or amine function
  • R being a chain comprising between 1 and 18 carbons , optionally branched and / or unsaturated comprising one or more heteroatoms, such as O, N or / and S, and having at least one acid function
  • Trp being a residue of a tryptophan derivative, L and / or D, produces a coupling between the amine of the tryptophan derivative and the at least one acid carried by the R group and / or an acid carried by galacturonan.
  • n represents the molar fraction of the Rs substituted by Trp and is between 0.05 and 0.7.
  • 0 represents the mole fraction of the acid functions of Trp-substituted galacturonans and is between 0.05 and 0.7.
  • the acid or acids of the R group are cationic carboxylates, alkali preferably as
  • galacturonan when one or more acid functions of galacturonan are not substituted by Trp, then they are salified by a cation, alkaline preferably as Na or K. said galacturonans being amphiphilic at neutral pH.
  • F is either an ester, a carbonate, a carbamate or an ether.
  • the galacturonan according to the invention is characterized in that the group R is chosen from the following groups:
  • the galacturonan according to the invention is characterized in that the tryptophan derivative is selected from the group consisting of tryptophan, tryptophanol, tryptophanamide, 2-indole ethylamine and their alkali cation salts.
  • the galacturonan according to the invention is characterized in that the tryptophan derivative is chosen from the esters of tryptophan of formula II Formula II
  • E being a group that can be:
  • a linear or branched C1 to C8 alkyl A linear or branched C 6 -C 20 alkylaryl or arylalkyl.
  • Galacturonan may have a degree of polymerization m of between 10 and 10,000.
  • it has a degree of polymerization m of between 10 and 1000.
  • it has a degree of polymerization m of between 10 and 500.
  • the functionalized polysaccharides are alginates which correspond to the following general formulas:
  • linker R an -OH function of the alginate, being either an ester, thioester, amide, carbonate, carbamate, ether, thioether or amine function
  • R being a chain comprising between 1 and 18 carbons, optionally branched and / or unsaturated comprising one or more heteroatoms, such as O, N or / and S, and having at least one acidic function
  • Trp being a residue of a tryptophan derivative, L and / or D, product of the coupling between the amine of the tryptophan derivative and the at least one acid carried by the R group and / or an acid carried by the alginate .
  • n represents the molar fraction of the Rs substituted by Trp and is between 0.05 and 0.7.
  • 0 represents the mole fraction of the acid functions of Trp-substituted alaginates and is between 0.05 and 0.7.
  • the acid or acids of the R group are cation carboxylates, alkali preferably as Na or K.
  • F is either an ester, a carbonate, a carbamate or an ether.
  • the alginate according to the invention is characterized in that the group R is chosen from the following groups:
  • the alginate according to the invention is characterized in that the tryptophan derivative is selected from the group consisting of tryptophan, tryptophanol, tryptophanamide, 2-indole ethylamine and their alkaline cation salts.
  • the alginate according to the invention is characterized in that the tryptophan derivative is chosen from the esters of tryptophan of formula II
  • E being a group that can be: • linear or branched C1 to C8 alkyl.
  • a linear or branched C 6 -C 20 alkylaryl or arylalkyl is A linear or branched C 6 -C 20 alkylaryl or arylalkyl.
  • the alginate may have a degree of polymerization m of between 10 and 10,000.
  • it has a degree of polymerization m of between 10 and 1000. In another embodiment, it has a degree of polymerization m of between 10 and 500.
  • R groups may be grafted onto the alcohols functions of the polysaccharide and grafting of the tryptophan derivative may be carried out:
  • the coupling reactions are followed by the neutralization of unreacted acid functional groups with a tryptophan derivative by salification by one of the methods well known to those skilled in the art, for obtain an alkaline cation salt, preferably Na or K.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising one of the polysaccharides according to the invention as described above and at least one active ingredient.
  • Active ingredient means a product in the form of a single chemical entity or in the form of a combination having an activity physiological.
  • Said active ingredient may be exogenous, ie it is provided by the composition according to the invention. It may also be endogenous, for example the growth factors that will be secreted in a wound during the first healing phase and that may be retained on said wound by the composition according to the invention.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition according to the invention as described above characterized in that it is administrable orally, nasally, vaginally, orally.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition according to the invention as described above, characterized in that it is obtained by drying and / or lyophilization.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition according to the invention as described above, characterized in that it is administrable in stent form, film or "coating" of implantable biomaterials implant.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition according to the invention as described above characterized in that the active ingredient is selected from the group consisting of proteins, glycoproteins, peptides and non-peptide therapeutic molecules.
  • compositions are either in liquid form (nanoparticles or microparticles suspended in water or in solvent mixtures), or in powder, implant or film form.
  • the modes of administration • considered are intravenous, subcutaneous, intradermal, intramuscular, oral, nasal, vaginal, ocular, oral, etc.
  • the invention also relates to the use of the functionalized polysaccharides according to the invention for the preparation of pharmaceutical compositions as described above.
  • the invention is illustrated by the following examples.
  • the sodium pullulanemethylcarboxylate solution is passed through a Purolite resin (anionic) to obtain the acidic pullulanemethylcarboxylic acid which is then lyophilized for 18 hours.
  • the solution of sodium pullulanesucciniccarboxylate is passed through a Purolite resin (anionic) to obtain the acidic pullulanesucciniccarboxylic acid which is then lyophilized for 18 hours.
  • the solution is purified by dialysis on an 8 kD regenerated cellulose membrane in 3 times 8 liters of 0.9% NaCl solution and then twice 8 liters of water.
  • the purified solution is lyophilized entirely.
  • the lyophilizate is analyzed by 1 H NMR in D 2 O NaOD to determine the DS in grafted tryptophan.
  • the lyophilizate is analyzed by 1 H NMR in D 2 O NaOD to determine the degree of substitution, DS, of tryptophan grafted per saccharide unit. According to 1 H NMR, the DS in tryptophan per saccharide unit is 0.25.
  • the molar mass distribution of the final polymer is analyzed by Steric Exclusion Chromatography. The chromatogram makes it possible to validate the absence of a secondary reaction such as the coupling of chains or the breaking of chains.
  • Example 4 Synthesis of Galacturonate Modified with Sodium Tryptophan
  • RCOONa 9% RCOOMe, SigmaAIdrich P9135
  • RCOONa 9% RCOOMe, SigmaAIdrich P9135
  • the solution obtained is cooled to 4 ° C.
  • 4.72 g (25 mmol) of N- (3-dimethylaminopropyl) -N'-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC, Fluka 03450) are added.
  • EDC N- (3-dimethylaminopropyl) -N'-ethylcarbodiimide hydrochloride
  • TrpOEt.HCl tryptophan ethyl ester hydrochloride
  • reaction medium After stirring for 30 minutes at 4 ° C., the reaction medium is brought to 25 ° C. and stirring is maintained for 24 hours. The reaction medium is then diluted in a sodium hydroxide solution such that the pH of the mixture is greater than 12. The mixture which has become clear is purified by ultrafiltration on a 50 KD cutoff membrane against 9 volumes of water and concentrated. A solids content of 17 mg / g is obtained.
  • the DS in tryptophan per saccharide unit is 0.15.
  • a fraction of the solution is lyophilized and then analyzed by NMR
  • This polymer is a comparative example.
  • the polymer 5 is a sodium dextranmethylcarboxylate modified with the sodium salt of L-tryptophan obtained from a dextran with a weight average molecular mass of 40 kg / mol (Pharmacosmos) according to the process described in the patent application FR07. 02316.
  • the molar fraction of sodium methylcarboxylate, modified or not with tryptophan, per saccharide unit is 1.03.
  • the molar fraction of tryptophan-modified sodium methylcarboxylates per saccharide unit is 0.36.
  • Counterexample 1 Synthesis of a sodium pullulanemethylcarboxylate, polymer 6
  • This polymer is obtained according to the process described in the first part of Example 1. The acidification and grafting steps of tryptophan are not carried out.
  • the degree of substitution of the hydroxyl functions by methylcarboxylate functions is 1.17 per saccharide unit. This polymer serves as a counterexample to this invention.
  • Preparation of the 1/500 protein / polymer complex 1 5 ⁇ g of protein are added to 750 ⁇ g of polymer, to 15 ⁇ l of 10X migration buffer (tris acetate pH 7). The solution is completed at 150 ⁇ l with hbO. This solution is incubated at room temperature for 20 minutes. 5 ⁇ l of this second solution containing 50 ng of protein and 25 ⁇ g of polymer are diluted in 5 .mu.l of 1X migration buffer. Similar solutions containing only the protein or polymer are prepared as a control.
  • the protein / polymer solution (10 ⁇ l) is mixed with 3 ⁇ l of loading buffer (glycerol, tris-acetate and bromophenol blue in water). These 13 .mu.l containing 50 ng of protein and 25 .mu.g of polymer are deposited in a well of a 0.8% agarose gel. Control solutions (protein or polymer alone) are deposited in a similar manner.
  • the electrophoresis tank is closed and the generator is set at 30V. The migration lasts
  • the gel is transferred to a PVDF membrane by capillarity with an Apelex system for 2 hours at room temperature.
  • the membrane is then saturated with skimmed milk for 1 hour at room temperature and then incubated with rabbit primary antibodies. directed against the protein (overnight at 4 0 C) and finally incubated with secondary antibodies rabbit anti goat HRP (1 hour at room temperature).
  • the revelation is by reaction of I 1 HRP on Opti-4CN. The revelation is stopped by rinsing in water when the coloration is sufficient since the reaction product absorbs in the visible.
  • the protein When the protein is alone or does not complex with the polymer, it can migrate if it is anionic or remain at the deposition site if it is cationic. The protein is then detected either at the loading wells or in the form of a single spot 0.3-0.4 cm from the deposit. When the protein forms a complex with the polymer, the complex is driven more strongly by the charges of the polymer and moves towards the anode. It is detected as a single spot 0.7 cm from the deposit. The intensity of this spot varies according to the amount of protein entrained by the polymer. The analysis is considered semi-quantitative since there is a link between spot intensity and the importance of affinity.
  • the viscosity of the precursor polysaccharides was studied using a TA AR2000ex rheometer.
  • the precursor pullulan of polymer 1 has a viscosity of 14 mPa.s at a concentration of 77 mg / mL.
  • the precursor dextran of the polymer has a viscosity of 15 mPa.s at a concentration of 164 mg / mL.
  • the pullulan used is about twice as viscous as the dextran used.

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Abstract

La présente invention concerne de nouveaux dérivés de polysaccharides, comportant majoritairement des liaisons glycosidiques de type (1,4), (1,3) et/ou (1,2), fonctionnalisés par au moins un dérivé du tryptophane. Elle concerne également leurs procédés de synthèse, leur utilisations en tant qu'excipient pharmaceutique et les compositions pharmaceutiques les comprenant.

Description

POLYSACCHARIDES FONCTIONNALISES PAR DES DERIVES DU
TRYPTOPHANE
La présente invention concerne de nouveaux polymères biocompatibles à base de polysaccharides.
Ces polymères peuvent être utiles notamment pour l'administration de principe(s) actif(s) (PA) aux hommes ou aux animaux dans un but thérapeutique et/ou prophylactique.
Les polysaccharides, également appelés glycanes ou polyosides, sont des polymères formés d'unités monosaccharidiques, ou osides, liées par des liaisons glycosidiques. En général, les polysaccharides ont pour formule générale [Cx(H2θ)x-i)]n. Ces macromolécules sont complexes de par les variations de taille, de ramification, de nature d'unité monosaccharidique, de nature de liaison glycosidique. On distingue deux catégories de polysaccharides :
• les homopolysaccharides constitués d'une seule unité monosaccharidique.
• les hétéropolysaccharides formés de plusieurs unités monosaccharidiques. Les homopolysaccharides sont en général distingués par la nature de l'unité saccharidique et la liaison glycosidique. La liaison glycosidique est la liaison formée entre le groupe hémi-acétal d'un saccharide et la fonction hydroxyle d'un autre saccharide. Cette liaison peut être alpha ou béta suivant la stéréochimie du carbone anomérique mais surtout elle peut être (1 ,2), (1 ,3), (1 ,4) ou (1 ,6) suivant la fonction hydroxyle 2, 3, 4 ou 6 du saccharide impliquée dans la liaison. Certains polysaccharides sont composés des mêmes unités mais varient de par les liaisons impliquées. Par exemple, le dextrane et le pullulane sont tous deux des polysaccharides composés d'unités glucose mais, dans le cas du dextrane, les liaisons glycosidiques sont à plus de 95% (1 ,6) alors que dans le cas du pullulane, elles sont à 67% (1 ,4) et à 33% (1 ,6). Ces différences de structure conduisent à des différences de propriétés physico- chimiques telles que la solubilité dans les solvants organiques, la solubilité dans l'eau, la viscosité.
Parmi les polysaccharides amphiphiles, de nombreux exemples ont été rapportés.
Biodex dans le brevet US6,646,120 a décrit des carboxymethyldextranes modifiés par la benzylamine. Ce polysaccharide est constitué majoritairement d'unités glycosidiques liées par une liaison 1 ,6. Cet enchaînement conduit à l'obtention de solutions de polymères très fluides.
Le brevet FR0702316 de la demanderesse décrit des dextranes modifiés par des acide-aminés hydrophobes dont le tryptophane. Comme précédemment, le dextrane est constitué majoritairement d'enchaînements 1 ,6 d'un ités g lycosid iq ues .
Cependant, le dextrane est un polysaccharide singulier car il est le seul polyoside composé à plus de 95% de liaisons (1 ,6) ce qui lui confère une très bonne solubilité dans l'eau, une faible viscosité dans l'eau et également une bonne solubilté dans des solvants organiques polaires tels que le diméthylsulfoxyde, DMSO.
Les polysaccharides peuvent être utilisés comme véhicules ou excipients dans des formulations pharmaceutiques. Pour certaines formulations, la faible viscosité du dextrane et sa grande solubilité dans l'eau peuvent présenter des inconvénients tels qu'une trop grande diffusion à partir du site d'administration, une trop rapide dilution par les fluides biologiques.
Les autres polysaccharides comme les hyaluronanes ou les alginates présentent des propriétés physiques différentes. Des dérivés du hyaluronane modifiés par des chaînes alkyles grasses en C12 ou C18 sont décrits notamment dans le brevet FR2794763. Dans ce document sont également décrits des dérivés de l'alginate modifiés par des chaînes alkyles grasses. Les travaux d'Akiyoski et al. (J. Controlled Release 1998, 54, 313- 320) décrivent des pullulanes modifiés par du cholestérol. Néanmoins, si les polysaccharides utilisés ont une viscosité supérieure à celle du dextrane les groupements hydrophobes greffés ne présentent pas une affinité suffisante avec certains principes actifs tels que des protéines lorsqu'ils sont utilisés comme véhicules dans des compositions pharmaceutiques.
La présente invention concerne de nouveaux dérivés de polysaccharides, comportant majoritairement des liaisons glycosidiques de type (1 ,4), (1 ,3) et/ou (1 ,2), fonctionnalisés par au moins un dérivé du tryptophane. Ces nouveaux polysaccharides amphiphiles ont une biocompatibilité comparable aux dérivés du dextrane mais leur viscosité est supérieure et permet d'obtenir des véhicules pour des compositions pharmaceutiques présentant une viscosité suffisante pour éviter une diffusion à partir du site d'administration. Néanmoins, leur hydrophobicité reste facilement modulable sans altérer leur biocompatibilité. L'utilisation comme groupements hydrophobes de dérivés du tryptophane permet également d'obtenir une bonne interaction avec les principes actifs, notamment par la formation de complexes, ce qui permet une modulation de leur immobilisation.
Les polysaccharides selon l'invention sont constitués en majorité de liaisons glycosidiques de type (1 ,4), et/ou (1 ,3) et/ou (1 ,2) ils peuvent être neutres, c'est-à-dire ne pas être porteur de fonctions acides ou anioniques et porteurs de fonctions acides. Ils sont fonctionnalisés par au moins un dérivé du tryptophane, noté Trp :
• ledit dérivé du tryptophane étant greffé ou lié aux polysaccharides par couplage avec une fonction acide, ladite fonction acide pouvant être une fonction acide d'un polysaccharide anionique et/ou une fonction acide portée par un bras de liaison R lié au polysaccharide par une fonction F, ladite fonction F résultant du couplage entre le bras de liaison R et une fonction -OH du polysaccharide neutre ou anionique,
- F étant soit une fonction ester, thioester, amide, carbonate, carbamate, éther, thioéther ou aminé, - R étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, et ayant au moins une fonction acide,
Trp étant un reste d'un dérivé du tryptophane, L et/ou D, produit du couplage entre Famine du tryptophane et le au moins un acide porté par le groupement R et/ou un acide porté par le polysaccharide anionique.
Selon l'invention les polysaccharides fonctionnalisés peuvent répondre aux formules générales suivantes :
Figure imgf000005_0001
Formule I
le polysaccharide étant constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1 ,4), et/ou (1 ,3) et/ou (1 ,2),
F résultant du couplage entre le bras de liaison R et une fonction -OH du polysaccharide neutre ou anionique, étant soit une fonction ester, thioester, amide, carbonate, carbamate, éther, thioéther ou aminé,
R étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, et ayant au moins une fonction acide
Trp étant un reste d'un dérivé du tryptophane, L et/ou D, produit du couplage entre l'aminé du dérivé du tryptophane et au moins un acide porté par le groupement R et/ou un acide porté par le polysaccharide anionique. n représente la fraction molaire des R substitués par Trp et est comprise entre 0,05 et 0,7. o représente la fraction molaire des fonctions acides des polysaccharides substituées par Trp et est comprise entre 0,05 et 0,7. i représente la fraction molaire de fonctions acides portées par le groupement R par unité saccharidique et est comprise entre 0 et 2, j représente la fraction molaire de fonctions acides portées par le polysaccharide anionique par unité saccharidique et est comprise entre 0 et 1 ,
(i + j) représente la fraction molaire de fonctions acides par unité saccharidique et est comprise entre 0,1 et 2,
- lorsque R n'est pas substitué par Trp, alors le ou les acides du groupement R sont des carboxylates de cation, alcalin de préférence comme
Na ou K.
- lorsque le polysaccharide est un polysaccharide anionique, lorsqu'une ou des fonctions acides du polysaccharide ne sont pas substituées par Trp, alors elles sont salifiées par un cation, alcalin de préférence comme Na ou K. lesdits polysaccharides étant amphiphiles à pH neutre.
Dans un mode de réalisation, F est soit un ester, un carbonate, un carbamate ou un éther.
Dans un mode de réalisation le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1 ,4).
Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1 ,4) est choisi dans le groupe constitué par le pullulane, l'alginate, le hyaluronane, le xylane, le galacturonane ou une cellulose soluble dans l'eau.
Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un pullulane.
Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un alginate. Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un hyaluronane. Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un xylane. Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un galacturonane.
Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est une cellulose soluble dans l'eau.
Dans un mode de réalisation le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1 ,3).
Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1 ,3) est un curdlane.
Dans un mode de réalisation le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1 ,2).
Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1 ,2) est une inuline.
Dans un mode de réalisation le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1 ,4) et (1 ,3)
Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1 ,4) et (1 ,3) est un glucane.
Dans un mode de réalisation le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1 ,4), et (1 ,3) et (1 ,2).
Dans un mode de réalisation le polysaccharide constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1 ,4), et (1 ,3) et (1 ,2) est le mannane.
Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon l'invention est caractérisé en ce que le groupe R est choisi dans les groupes suivants :
Figure imgf000007_0001
ou leurs sels de cations alcalins. Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon l'invention est caractérisé en ce que le dérivé du tryptophane est choisi dans le groupe constitué par le tryptophane, le tryptophanol, le tryptophanamide, le 2-indole éthylamine et leurs sels de cation alcalin.
Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon l'invention est caractérisé en ce que le dérivé du tryptophane est choisi parmi les esters du tryptophane de formule II
Figure imgf000008_0001
Formule II
E étant un groupement pouvant être :
• un alkyle linéaire ou ramifié en C1 à C8. « un alkylaryle ou un arylalkyle linéaire ou ramifié en C6 à C20.
Le polysaccharide peut avoir un degré de polymérisation m compris entre 10 et 10000.
Dans un mode de réalisation, il a un degré de polymérisation m compris entre 10 et 1000.
Dans un autre mode de réalisation, il a un degré de polymérisation m compris entre 10 et 500. Dans un mode de réalisation les polysaccharides fonctionnalisés sont des pullulanes qui répondent à la formule générale III suivante :
PULLULANE
F
[ Trp ] n
Formule
• F résultant du couplage entre le bras de liaison R et une fonction -OH d'une unité glucose, étant soit une fonction ester, thioester, amide, carbonate, carbamate, éther, thioéther ou aminé,
• R étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, et ayant au moins une fonction acide • Trp étant un reste d'un dérivé du tryptophane, L et/ou D, produit du couplage entre l'aminé du dérivé du tryptophane et le au moins un acide porté par le groupement R. n représente la fraction molaire des R substitués par Trp et est comprise entre 0,05 et 0,7. i représente la fraction molaire de fonctions acides portées par le groupement R par unité saccharidique et est comprise entre 0 et 2,
- lorsque R n'est pas substitué par Trp, alors le ou les acides du groupement R sont des carboxylates de cation, alcalin de préférence comme Na ou K, lesdits pullulanes étant amphiphiles à pH neutre. Dans un mode de réalisation, F est soit un ester, un carbonate, un carbamate ou un éther.
Dans un mode de réalisation, le pullulane selon l'invention est caractérisé en ce que le groupe R est choisi dans les groupes suivants :
Figure imgf000010_0001
ou leurs sels de cations alcalins.
Dans un mode de réalisation, le pullulane selon l'invention est caractérisé en ce que le dérivé du tryptophane est choisi dans le groupe constitué par le tryptophane, le tryptophanol, le tryptophanamide, le 2-indole éthylamine et leurs sels de cation alcalin.
Dans un mode de réalisation, le pullulane selon l'invention est caractérisé en ce que le dérivé du tryptophane est choisi parmi les esters du tryptophane de formule II
Figure imgf000010_0002
Formule II
E étant un groupement pouvant être :
• un alkyle linéaire ou ramifié en C1 à C8.
• un alkylaryle ou un arylalkyle linéaire ou ramifié en C6 à C20.
Le pullulane peut avoir un degré de polymérisation m compris entre 10 et 10000.
Dans un mode de réalisation, il a un degré de polymérisation m compris entre 10 et 1000. Dans un autre mode de réalisation, il a un degré de polymérisation m compris entre 10 et 500.
Selon l'invention les polysaccharides fonctionnalisés sont des galacturonanes qui répondent aux formules générales suivantes :
Figure imgf000011_0001
Formule IV
• F résultant du couplage entre le bras de liaison R et une fonction -OH du galacturonane, étant soit une fonction ester, thioester, amide, carbonate, carbamate, éther, thioéther ou aminé, • R étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, et ayant au moins une fonction acide
• Trp étant un reste d'un dérivé du tryptophane, L et/ou D, produit du couplage entre l'aminé du dérivé du tryptophane et le au moins un acide porté par le groupement R et/ou un acide porté par le galacturonane. n représente la fraction molaire des R substitués par Trp et est comprise entre 0,05 et 0,7.
0 représente la fraction molaire des fonctions acides des galacturonanes substituées par Trp et est comprise entre 0,05 et 0,7.
1 représente la fraction molaire de fonctions acides portées par le groupement R par unité saccharidique et est comprise entre 0 et 2, j représente la fraction molaire de fonctions acides portées par le galacturonane par unité saccharidique et est comprise entre 0 et 1 , (i + j) représente la fraction molaire de fonctions acides par unité saccharidique et est comprise entre 0,1 et 2,
- lorsque R n'est pas substitué par Trp, alors le ou les acides du groupement R sont des carboxylates de cation, alcalin de préférence comme
Na ou K.
- lorsqu'une ou des fonctions acides du galacturonane ne sont pas substituées par Trp, alors elles sont salifiées par un cation, alcalin de préférence comme Na ou K. lesdits galacturonanes étant amphiphiles à pH neutre.
Dans un mode de réalisation, F est soit un ester, un carbonate, un carbamate ou un éther.
Dans un mode de réalisation, le galacturonane selon l'invention est caractérisé en ce que le groupe R est choisi dans les groupes suivants :
Figure imgf000012_0001
ou leurs sels de cations alcalins.
Dans un mode de réalisation, le galacturonane selon l'invention est caractérisé en ce que le dérivé du tryptophane est choisi dans le groupe constitué par le tryptophane, le tryptophanol, le tryptophanamide, le 2-indole éthylamine et leurs sels de cation alcalin.
Dans un mode de réalisation, le galacturonane selon l'invention est caractérisé en ce que le dérivé du tryptophane est choisi parmi les esters du tryptophane de formule II
Figure imgf000013_0001
Formule II
E étant un groupement pouvant être :
• un alkyle linéaire ou ramifié en C1 à C8. • un alkylaryle ou un arylalkyle linéaire ou ramifié en C6 à C20.
Le galacturonane peut avoir un degré de polymérisation m compris entre 10 et 10000.
Dans un mode de réalisation, il a un degré de polymérisation m compris entre 10 et 1000.
Dans un autre mode de réalisation, il a un degré de polymérisation m compris entre 10 et 500.
Selon l'invention les polysaccharides fonctionnalisés sont des alginates qui répond aux formules générales suivantes :
Figure imgf000013_0002
Formule V
• F résultant du couplage entre le bras de liaison R et une fonction -OH de l'alginate, étant soit une fonction ester, thioester, amide, carbonate, carbamate, éther, thioéther ou aminé, • R étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, et ayant au moins une fonction acide
• Trp étant un reste d'un dérivé du tryptophane, L et/ou D, produit du couplage entre l'aminé du dérivé du tryptophane et le au moins un acide porté par le groupement R et/ou un acide porté par l'alginate. n représente la fraction molaire des R substitués par Trp et est comprise entre 0,05 et 0,7.
0 représente la fraction molaire des fonctions acides des alaginates substituées par Trp et est comprise entre 0,05 et 0,7.
1 représente la fraction molaire de fonctions acides portées par le groupement R par unité saccharidique et est comprise entre 0 et 2, j représente la fraction molaire de fonctions acides portées par l'alginate par unité saccharidique et est comprise entre 0 et 1 , (i + j) représente la fraction molaire de fonctions acides par unité saccharidique et est comprise entre 0,1 et 2,
- lorsque R n'est pas substitué par Trp, alors le ou les acides du groupement R sont des carboxylates de cation, alcalin de préférence comme Na ou K.
- lorsqu'une ou des fonctions acides du polysaccharide ne sont pas substituées par Trp, alors elles sont salifiées par un cation, alcalin de préférence comme Na ou K. lesdits alginates étant amphiphiles à pH neutre.
Dans un mode de réalisation, F est soit un ester, un carbonate, un carbamate ou un éther. Dans un mode de réalisation, l'alginate selon l'invention est caractérisé en ce que le groupe R est choisi dans les groupes suivants :
Figure imgf000015_0001
ou leurs sels de cations alcalins.
Dans un mode de réalisation, l'alginate selon l'invention est caractérisé en ce que le dérivé du tryptophane est choisi dans le groupe constitué par le tryptophane, le tryptophanol, le tryptophanamide, le 2-indole éthylamine et leurs sels de cation alcalin.
Dans un mode de réalisation, l'alginate selon l'invention est caractérisé en ce que le dérivé du tryptophane est choisi parmi les esters du tryptophane de formule II
Figure imgf000015_0002
Formule II
E étant un groupement pouvant être : • un alkyle linéaire ou ramifié en C1 à C8.
• un alkylaryle ou un arylalkyle linéaire ou ramifié en C6 à C20.
L'alginate peut avoir un degré de polymérisation m compris entre 10 et 10000.
Dans un mode de réalisation, il a un degré de polymérisation m compris entre 10 et 1000. Dans un autre mode de réalisation, il a un degré de polymérisation m compris entre 10 et 500.
Dans un autre mode de réalisation les polysaccharides selon l'invention sont obtenus par greffage d'un dérivé du tryptophane tel que précédemment défini sur un polysaccharide neutre, par couplage entre la fonction aminé du dérivé du tryptophane et une fonction acide obtenue par greffage d'un groupement R portant au moins une fonction acide tel que précédemment défini sur une fonction alcool du polysaccharide, pour obtenir des polysaccharides de formule I1 dans laquelle j=0.
Dans un mode de réalisation, les polysaccharides selon l'invention sont obtenus par greffage d'un dérivé du tryptophane tel que précédemment défini sur une fonction acide d'un polysaccharide anionique, par couplage entre la fonction aminé du dérivé du tryptophane et une fonction acide portée par le polysaccharide anionique, pour obtenir des polysaccharides de formule I, dans laquelle i=0.
Dans un mode de réalisation lorsque le polysaccharide est un polysaccharide anionique, des groupements R, peuvent être greffés sur les fonctions alcools du polysaccharide et le greffage du dérivé du tryptophane peut être effectué :
- soit sélectivement sur les fonctions acides des groupements R, pour obtenir des polysaccharides de formule I1 dans laquelle o=0, par des réactions de protection déprotection bien connues de l'homme de l'art ou
- conjointement sur les deux types de fonctions acides, pour obtenir des polysaccharides de formule I, dans laquelle n>0 et o>0.
Dans tous les modes de réalisation ci-dessus décrits les réactions de couplage sont suivies de la neutralisation des fonctions acides n'ayant pas réagies avec un dérivé du tryptophane par salification par une des méthodes bien connues de l'homme de l'art, pour obtenir un sel de cation alcalin de préférence Na ou K.
L'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant l'un des polysaccharides selon l'invention tel que décrit précédemment et au moins un principe actif.
On entend par principe actif un produit sous forme d'entité chimique unique ou sous forme d'une combinaison ayant une activité physiologique. Ledit principe actif peut être exogène c'est à dire qu'il est apporté par la composition selon l'invention. Il peut également être endogène, par exemple les facteurs de croissance qui vont être sécrétés dans une plaie pendant la première phase de cicatrisation et qui pourront être retenus sur ladite plaie par la composition selon l'invention.
L'invention concerne également une composition pharmaceutique selon l'invention telle que décrite précédemment caractérisée en ce qu'elle est administrable par voie orale, nasale, vaginale, buccale.
L'invention concerne également une composition pharmaceutique selon l'invention telle que décrite précédemment, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par séchage et/ou lyophilisation.
L'invention concerne également une composition pharmaceutique selon l'invention telle que décrite précédemment, caractérisée en ce qu'elle est administrable sous forme de stent, de film ou « coating » de biomatériaux implantables, d'implant.
L'invention concerne également une composition pharmaceutique selon l'invention telle que décrite précédemment caractérisée en ce que le principe actif est choisi dans le groupe constitué par les protéines, les glycoprotéines, les peptides et les molécules thérapeutiques non-peptidiques.
Les compositions pharmaceutiques possibles sont soit sous forme liquide (nanoparticules ou microparticules en suspension dans l'eau ou dans des mélanges de solvants), soit sous forme de poudre, d'implant ou de film.
Dans le cas des libérations locale et systémique, les modes d'administration • envisagés sont par voie intraveineuse, sous-cutanée, intradermique, intramusculaire, orale, nasale, vaginale, oculaire, buccale, etc.
L'invention concerne également l'utilisation des polysaccharides fonctionnalisés selon l'invention pour la préparation de compositions pharmaceutiques telles que décrites précédemment. L'invention est illustrée par les exemples suivants.
Exemple 1 : synthèse d'un pullulaneméthylcarboxylate de sodium modifié par le sel de sodium du tryptophane, polymère 1
8 g (soit 148 mmol de fonctions hydroxyles) de Pullulane de masse molaire moyenne en poids d'environ 100 kg/mol (Fluka) sont solubilisés dans de l'eau à 42 g/L. A cette solution sont ajoutés 15 ml_ de NaOH 10 N (148 mmol NaOH). Le mélange est porté à 35°C puis 23 g (198 mmol) de chloroacétate de sodium sont ajoutés. La température du milieu réactionnel est portée à 600C à 0.5°C/min puis maintenue à 6O0C pendant 100 minutes. Le milieu réactionnel est dilué avec 200 mL d'eau, neutralisé à l'acide acétique et purifié par ultrafiltration sur membrane PES de 5 kD contre 6 volumes d'eau. La solution finale est dosée par extrait sec pour déterminer la concentration en polymère ; puis dosée par dosage acide/base dans H2O 50 / Acétone 50 (V/V) pour déterminer le degré de substitution en carboxyméthylates.
D'après l'extrait sec : [polymère] = 31 ,5 mg/g D'après le dosage acide/base : Le degré de substitution des fonctions hydroxyles par des fonctions méthylcarboxylates est de 1 ,17 par motif saccharidique.
La solution de pullulaneméthylcarboxylate de sodium est passée sur une résine Purolite (anionique) pour obtenir le pullulaneméthylcarboxylique acide qui est ensuite lyophilisé pendant 18 heures.
3,51 g de pullulaneméthylcarboxylique acide (soit 18 mmol fonctions acide carboxyméthyl) sont solubilisés dans le DMF à 57 g/L puis refroidis à 0°C. 1 ,81 g (18 mmol) de NMM et 1 ,94 g (18 mmol) de EtOCOCI sont ensuite ajoutés. Après 10 min de réaction, 1 ,40 g (7 mmol) de TrpOH sont ajoutés. Le milieu est ensuite chauffé à 100C et maintenu à cette température pendant 30 minutes. Une solution d'imidazole (2,43 g, 36 mmol) à 340 g/L dans l'eau est ensuite ajoutée, le milieu réactionnel est brièvement chauffé à 300C. Le milieu réactionnel est ensuite dilué avec 70 mL d'eau, puis filtré sur verre fritte porosité 1 puis sur verre fritte porosité 3, il est alors limpide. La solution est ultrafiltrée sur membrane PES 10 kD contre 10 volumes de solution NaCI 0,9% puis 6 volumes d'eau. La concentration de la solution de polymère est déterminée par extrait sec. Une fraction de solution est lyophilisée et analysée par RMN 1H dans D2O pour déterminer le DS en tryptophane greffé.
D'après la RMN 1H : La fraction molaire des acides modifiés par le tryptophane est de 0,4.
Exemple 2 : synthèse d'un pullulanesucciniccarboxylate de sodium modifié par le sel de sodium du tryptophane
10 g de Pullulane de masse molaire moyenne en poids d'environ 100 000 g/mol (Fluka) est solubilisé dans le DMSO à 400 mg/g à 6O0C. Cette solution est chauffée à 400C puis deux solutions de 9,27 g d'anhydride succinique (371 mg/mL dans le DMF) et de 9,37 g de NMM (375 mg/mL dans le DMF) sont ajoutées à la solution de polymère. Le temps de réaction est de 240 min à partir de l'ajout de la solution de NMM. La solution ainsi obtenue est diluée dans 1 L d'eau et ultrafiltrée sur membrane en PES de 10 kD. La solution finale est dosée par extrait sec pour déterminer la concentration en polymère ; puis dosée par RMN 1H dans D2O NaOD pour déterminer le DS en succinate greffé.
D'après l'extrait sec : [polymère] = 15,8 mg/g
D'après la RMN 1H : La fraction molaire des alcools modifiés par le succinate de sodium est de 1 ,35.
La solution de pullulanesucciniccarboxylate de sodium est passée sur une résine Purolite (anionique) pour obtenir le pullulanesucciniccarboxylique acide qui est ensuite lyophilisé pendant 18 heures.
5,88 g de pullulanesucciniccarboxylique acide (soit 27 mmol fonctions SA) sont solubilisés dans le DMF à 45 g/L puis refroidie à O0C. 0,90 g (8,9 mmol) de NMM et 0,97 g (8,9 mmol) de EtOCOCI sont ensuite ajoutés. Après 10 min de réaction, 5,46 g (27 mmol) de TrpOH sont ajoutés. Le milieu est ensuite chauffé à 300C et maintenu à cette température pendant 3 heures. Une solution d'imidazole (1 ,82 g, 27 mmol) à 340 g/L dans l'eau est ensuite ajoutée. Le milieu réactionnel est ensuite dilué avec 75 ml_ d'eau, il est alors limpide. La solution est purifiée en dialyse sur membrane cellulose régénérée 8 kD dans 3 fois 8 litres de solution NaCI 0,9% puis 2 fois 8 litres d'eau. La solution purifiée est lyophilisée entièrement. Le lyophilisât est analysé par RMN 1H dans D2O NaOD pour déterminer le DS en tryptophane greffé.
D'après la RMN 1H : La fraction molaire des acides modifiés par le tryptophane est de 0,4.
Exemple 3 : synthèse de l'alginate de sodium modifié par le tryptophane de sodium
5 g (25 mmol de fonctions carboxylates) d'alginate de sodium (Fluka 71238) sont solubilisés (50 mmol/L en fonctions carboxylates) dans une solution aqueuse HCI 0,001 N. La solution obtenue est refroidie à 4°C et le pH est abaissé à 4 par ajout de HCI 1N. Puis, 4,84 g (25 mmol) de chlorhydrate de N-(3-Diméthylaminopropyl)-N'-éthylcarbodiimide (EDC, Fluka 03450) sont ajoutés. Lorsque le pH du mélange est stabilisé, 13,6 g (50 mmol) de chlorhydrate de l'ester éthylique du tryptophane (TrpOEt.HCI, Bachem E-2510) sont ajoutés. Après 30 minutes sous agitation à 40C, le milieu réactionnel est porté à 25°C et l'agitation est maintenue pendant 24 heures. Le milieu réactionnel est ensuite dilué dans une solution de soude telle que le pH du mélange soit supérieur à 12. Le mélange devenu limpide est purifié par dialyse sur membrane de 8 KD contre une solution NaCI 0,9% puis contre de l'eau. La solution purifiée de polymère est enfin lyophilisée.
Le lyophilisât est analysé par RMN 1H dans D2O NaOD pour déterminer le degré de substitution, DS, en tryptophane greffé par unité saccharidique. D'après la RMN 1H, le DS en tryptophane par unité saccharidique est de 0,25. La distribution des masses molaires du polymère final est analysée par Chromatographie d'Exclusion Stérique. Le chromatogramme permet de valider l'absence de réaction secondaire telle que le couplage de chaînes ou la coupure de chaînes. Exemple 4 : Synthèse du galacturonate modifié par le tryptophane de sodium
4,8 g (25 mmol de fonctions carboxylates) de pectine (91%
RCOONa, 9% RCOOMe, SigmaAIdrich P9135) sont solubilisés (50 mmol/L en fonctions carboxylates) dans une solution aqueuse HCI 0,001 N. La solution obtenue est refroidie à 4°C. Puis, 4,72 g (25 mmol) de chlorhydrate de N-(3- Diméthylaminopropyl)-N'-éthylcarbodiimide (EDC, Fluka 03450) sont ajoutés. Lorsque le pH du mélange est stabilisé, 13,2 g (50 mmol) de chlorhydrate de l'ester éthylique du tryptophane (TrpOEt.HCI, Bachem E-2510) sont ajoutés. Après 30 minutes sous agitation à 4°C, le milieu réactionnel est porté à 25°C et l'agitation est maintenue pendant 24 heures. Le milieu réactionnel est ensuite dilué dans une solution de soude telle que le pH du mélange soit supérieur à 12. Le mélange devenu limpide est purifié par ultrafiltration sur membrane de seuil de coupure 50 KD contre 9 volumes d'eau et concentré. On obtient une solution d'extrait sec 17 mg/g.
D'après le dosage par spectromètrie UV, le DS en tryptophane par unité saccharidique est de 0,15. Une fraction de la solution est lyophilisée puis analysée par RMN
1H en D2O. D'après cette analyse, le DS en tryptophane par unité saccharidique est de 0,17 environ.
Exemple 5 : Préparation d'un dextraneméthylcarboxylate de sodium fonctionnalisé par le tryptophane
Ce polymère est un exemple comparatif.
Le polymère 5 est un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par le sel de sodium du L-tryptophane obtenu à partir d'un dextrane de masse moiaire moyenne en poids de 40 kg/mol (Pharmacosmos) selon le procédé décrit dans la demande de brevet FR07.02316. La fraction molaire de méthylcarboxylate de sodium, modifiés ou non par le tryptophane, par unité saccharidique est de 1 ,03. La fraction molaire de méthylcarboxylates de sodium modifiés par le tryptophane par unité saccharidique est de 0,36. Contre-exemple 1 : synthèse d'un pullulaneméthylcarboxylate de sodium, polymère 6
Ce polymère est obtenu selon le procédé décrit dans la première partie de l'exemple 1. Les étapes d'acidification et de greffage du tryptophane ne sont pas réalisées.
Le degré de substitution des fonctions hydroxyles par des fonctions méthylcarboxylates est de 1 ,17 par motif saccharidique. Ce polymère sert de contre-exemple à cet invention.
Exemple 6 : Mise en évidence de l'affinité d'un polymère pour une protéine se liant à l'héparine par co-électrophorèse
Préparation du complexe protéine/polymère au ratio 1/500 1 ,5 μg de protéine sont ajoutés à 750 μg de polymère, à 15 μl de tampon de migration 10X (tris acétate pH 7). La solution est complétée à 150μl par de l'hbO. Cette solution est incubée à température ambiante pendant 20 minutes. 5 μl de cette seconde solution contenant 50 ng de protéine et 25 μg de polymère sont dilués dans 5 μl de tampon de migration 1X. Des solutions similaires contenant uniquement la protéine ou le polymère sont préparées à titre de contrôle.
Mise en évidence du complexe entre la protéine et le polymère
La solution de protéine/polymère (10 μl) est mélangée à 3 μl de tampon de charge (glycérol, tris-acétate et bleu de bromophénol dans de l'eau). Ces 13 μl contenant 50 ng de protéine et 25 μg de polymère sont déposés dans un puits d'un gel d'agarose 0.8%. Les solutions de contrôle (protéine ou polymère seuls) sont déposées de façon similaire. La cuve d'électrophorèse est fermée et le générateur est réglé à 30V. La migration dure
1 heure.
Après migration, le gel est transféré sur une membrane de PVDF par capillarité avec un système Apelex pendant 2h à température ambiante. La membrane est ensuite saturée avec du lait écrémé pendant 1 heure à température ambiante puis incubée avec des anticorps primaires de lapin dirigés contre la protéine (une nuit à 40C) et enfin incubée avec des anticorps secondaires, rabbit anti goat HRP (1 heure à température ambiante). La révélation se fait par réaction de I1HRP sur le Opti-4CN. La révélation est stoppée par rinçage dans de l'eau lorsque la coloration est suffisante puisque le produit de la réaction absorbe dans le visible.
Lorsque la protéine est seule ou ne forme pas de complexe avec le polymère, elle peut migrer si elle est anionique ou rester à l'endroit du dépôt si elle est cationique. La protéine est alors détectée soit au niveau des puits de chargement, soit sous la forme d'un spot unique vers 0,3-0,4 cm du dépôt. Lorsque la protéine forme un complexe avec le polymère, le complexe est entraîné plus fortement par les charges du polymère et se déplace vers l'anode. Il est détecté sous forme d'un spot unique à 0,7 cm du dépôt. L'intensité de ce spot varie suivant la quantité de protéine entraînée par le polymère. L'analyse est considérée comme semi-quantitative puisqu'il y a un lien entre l'intensité du spot et l'importance de l'affinité. Ainsi, l'affinité d'un polymère pour une protéine est notée « - » lorsqu'il n'y a pas de spot détecté à 0.7 cm du dépôt, « + » lorsqu'il y a un spot visible d'intensité moyenne à 0.7 cm du dépôt et « ++ » lorsque ce spot à 0.7 cm du dépôt est d'intensité très forte démontrant une affinité importante. Les résultats obtenus avec le polymère 1 , obtenu à l'exemple 1 , le polymère 5, obtenu à l'exemple 5, et des protéines choisies dans les groupes des molécules d'adhésion cellulaire, des protéines de coagulation, des facteurs de croissance liant l'héparine, des protéines se liant aux facteurs de croissance, des cytokines et des protéines du métabolisme des lipides sont rassemblés dans le tableau I1 ci-dessous.
TABLEAU I
Figure imgf000024_0001
Les résultats obtenus montrent que le greffage du tryptophane sur un polysaccharide tel que le pullulaneméthylcarboxylate permet de conférer à ce polymère une propriété d'interaction avec les protéines étudiées (résultats avec le polymère 1) que le pullulaneméthylcarboxylate n'a pas (résultats avec le polymère 6).
Les résultats obtenus montrent que le pullulaneméthylcarboxylate substitué par du tryptophane, polymère 1 (exemple 1) a une affinité supérieure à celle du dextranméthylcarboxylate substitué par du tryptophane, polymère 5 (exemple 5) pour les 6 premières protéines du tableau I. En revanche, cette amélioration de l'affinité n'est pas systématique puisque dans le cas du PDGF-BB par exemple, l'affinité du polymère 5 est supérieure à celle du polymère 1.
Exemple 7 : Viscosité des polysaccharides
La viscosité des polysaccharides précurseurs a été étudiée à l'aide d'un rhéomètre TA AR2000ex. Le pullulane précurseur du polymère 1 a une viscosité de 14 mPa.s à une concentration de 77 mg/mL.
Le dextrane précurseur du polymère 5 a une viscosité de 15 mPa.s à une concentration de 164 mg/mL.
Le pullulane employé est environ deux fois plus visqueux que le dextrane employé.

Claims

Revendications
1. Polysaccharide fonctionnalisé choisi dans le groupe constitué par les polysaccharides de formule générale I :
Polysaccharide
F [ Trp 1
[ Trp ],
Formule I
• le polysaccharide étant constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1 ,4), et/ou (1 ,3) et/ou (1 ,2),
• F résultant du couplage entre le bras de liaison R et une fonction -OH du polysaccharide neutre ou anionique, étant soit une fonction ester, thioester, amide, carbonate, carbamate, éther, thioéther ou aminé,
• R étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, et ayant au moins une fonction acide
• Trp étant un reste d'un dérivé du tryptophane, L et/ou D, produit du couplage entre l'aminé du dérivé du tryptophane et le au moins un acide porté par le groupement R et/ou un acide porté par le polysaccharide anionique. n représente la fraction molaire des R substitués par Trp et est comprise entre 0,05 et 0,7.
0 représente la fraction molaire des fonctions acides des polysaccharides substituées par Trp et est comprise entre 0,05 et 0,7.
1 représente la fraction molaire de fonctions acides portées par le groupement R par unité saccharidique et est comprise entre 0 et 2, j représente la fraction molaire de fonctions acides portées par le polysaccharide anionique par unité saccharidique et est comprise entre 0 et 1 ,
(i + j) représente la fraction molaire de fonctions acides par unité saccharidique et est comprise entre 0,1 et 2,
- lorsque R n'est pas substitué par Trp, alors le ou les acides du groupement R sont des carboxylates de cation, alcalin de préférence comme Na ou K.
- lorsque le polysaccharide est un polysaccharide anionique, lorsqu'une ou des fonctions acides du polysaccharide ne sont pas substituées par Trp, alors elles sont salifiées par un cation, alcalin de préférence comme Na ou K. lesdits polysaccharides étant amphiphiles à pH neutre.
2. Polysaccharide selon la revendication 1 , caractérisé en ce que F est soit un ester, un carbonate, un carbamate ou un éther.
3. Polysaccharide selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1 ,4).
4. Polysaccharide selon la revendication 3, caractérisé en ce que le polysaccharide constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1 ,4) est choisi dans le groupe constitué par le pullulane, Palginate, le hyaluronane, le xylane, le galacturonane ou une cellulose soluble dans l'eau.
5. Polysaccharide selon l'une des revendications 1 à 2 caractérisé en ce que le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1 ,3).
6. Polysaccharide selon la revendication 5, caractérisé en ce que le polysaccharide constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1 ,3)est un curdlane.
7. Polysaccharide selon l'une des revendications 1 à 2 caractérisé en ce que le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1 ,2).
8. Polysaccharide selon la revendication 7, caractérisé en ce que le polysaccharide constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1 ,2)est une inuline.
9. Polysaccharide selon l'une des revendications 1 à 2 caractérisé en ce que le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4) et (1 ,3)
10. Polysaccharide selon la revendication 9, caractérisé en ce que le polysaccharide constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1 ,4) et (1 ,3) est un glucane.
11. Polysaccharide selon l'une des revendications 1 à 2 caractérisé en ce que le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1 ,4), et (1 ,3) et (1 ,2).
12. Polysaccharide selon la revendication 11 , caractérisé en ce que le polysaccharide constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1 ,4), et (1 ,3) et (1 ,2) est le mannane.
13. Polysaccharide selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le groupe R est choisi dans les groupes suivants :
Figure imgf000028_0001
ou leurs sels de cations alcalins.
14. Polysaccharide selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le dérivé du tryptophane est choisi dans le groupe constitué par le tryptophane, le tryptophanol, le tryptophanamide, le 2-indole éthylamine et leurs sels de cation alcalin.
15. Polysaccharide selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que le dérivé du tryptophane est choisi parmi les esters du tryptophane de formule II
Figure imgf000029_0001
Formule II
E étant un groupement pouvant être :
• un alkyle linéaire ou ramifié en C1 à C8.
• un alkylaryle ou un arylalkyle linéaire ou ramifié en C6 à C20.
16. Composition pharmaceutique comprenant l'un des polysaccharides selon l'une des revendications précédentes et au moins un principe actif.
17. Utilisation d'un polysaccharides fonctionnalisés selon selon l'une des revendications 1 à 15 pour la préparation de compositions pharmaceutiques telles que décrites précédemment.
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