WO2010016278A1 - 非拡散植物ウイルスベクター - Google Patents

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WO2010016278A1
WO2010016278A1 PCT/JP2009/003816 JP2009003816W WO2010016278A1 WO 2010016278 A1 WO2010016278 A1 WO 2010016278A1 JP 2009003816 W JP2009003816 W JP 2009003816W WO 2010016278 A1 WO2010016278 A1 WO 2010016278A1
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cell
plant
gene
vector
cmv
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PCT/JP2009/003816
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福澤徳穂
松村健
一町田紀子
石原岳明
増田税
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独立行政法人産業技術総合研究所
ホクレン農業協同組合連合会
国立大学法人 北海道大学
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8203—Virus mediated transformation
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    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/14011—Bromoviridae
    • C12N2770/14041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2770/14043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present invention relates to a non-diffusion plant virus vector, and more specifically, a plant virus vector from which a gene related to cell-to-cell transfer of a virus is deleted, and a protein gene necessary for cell-to-cell transfer to a plant separately.
  • Non-diffusible virus vectors and plant virus vectors that cannot grow even when inoculated into a normal plant by being introduced into the plant, but can only grow in plants that express the proteins necessary for cell-to-cell transfer
  • the present invention relates to a selective and specific expression system and an expression method thereof.
  • the present invention provides a non-diffusion plant virus vector, a plant virus vector selective / specific expression system, and an expression method thereof that prevent the spread of disordered virus vectors such as soil infection, insect transmission, and contact propagation. Is.
  • RNA virus vectors have been studied using infectious clones of tobacco mosaic virus (Tobacco mosaic virus, TMV) and bromomosaic virus (BMV), which have very high growth potential in infected plants. It was. In this field, several foreign gene expression systems have been developed so far due to differences in the expression pattern of viral genes.
  • TMV tobacco mosaic virus
  • BMV bromomosaic virus
  • TMV and Potyvirus have developed vectors that express proteins in which a viral CP gene and a foreign gene are fused (see Non-Patent Documents 1 and 2).
  • a vector for expressing a foreign gene via a subgenome by introducing a subgenomic promoter of a virus closely related to TMV has been developed (see Non-Patent Document 3).
  • Non-Patent Document 4 a method of inoculating a tobacco expressing a replication enzyme gene of 1a protein and 2a protein with RNA3 having a foreign gene has been reported (Non-Patent Document 4). reference).
  • CMV has been conducting some research on viral vectors.
  • One of them is the development of a 4-segment CMV vector by complementation (see Non-Patent Document 5).
  • MP3 and CP are encoded in RNA3 of CMV, and both MP and CP are indispensable for viral intercellular transfer (see Non-Patent Document 5).
  • RNA3A in which the MP3 region is modified
  • RNA3A in which the MP region is replaced with the GFP gene
  • RNA3B without the CP gene are constructed, and a viral vector that migrates between cells by complementation has been developed.
  • RNA3B a multi-cloning site was inserted into the CP region deleted with RNA3B, and the CP gene of GUS (bacterial- ⁇ -glucuronidase) or BYMV (Bean yellow mosaic virus) was introduced into it.
  • GUS bacterial- ⁇ -glucuronidase
  • BYMV Bean yellow mosaic virus
  • Non-Patent Documents 7 to 11 various related technologies such as production of various proteins with a cucumber mosaic virus vector applicable to various different host plants have been developed.
  • Jellyfish green fluorescent protein as a reporter for virus effects Plant J (1995) 7: 1045-1053 Wang, ZD, Ueda, S, Uyeda, I, Yagihashi, H, Sekiguchi, H, Tacahashi, Y, Sato, M, Ohya, K, Sugimoto, C, Matsumura, T. et al. Positional effect of gene insertion on genetic stability of a clover yellow vein virus-based expression vector.
  • the present inventors have unsuccessfully infected host plants as in the case of conventional plant virus vectors, and unintended diffusion of recombinant virus genes.
  • intensive research aimed at developing a new non-diffusion plant virus vector that does not spread, which can reliably eliminate the problem of We succeeded in developing a new non-diffusion plant virus vector that can be infected and propagated only with a specific recombinant plant expressing the protein, and does not cause unintended spread of the virus vector.
  • the invention has been completed.
  • An object of the present invention is to provide a new non-diffusible plant viral vector that does not cause unintentional and unintended spread of viral vectors such as soil infection, insect transmission, and contact transmission.
  • the present invention provides a substance production technique using a plant by combining a specific recombinant plant that separately expresses a protein necessary for cell-to-cell transfer in the plant and the non-diffusion plant virus vector. It is intended to do.
  • the present invention is a plant that enables infection and propagation of a viral vector only in a specific recombinant plant into which a gene related to virus propagation has been introduced, thereby avoiding the unintentional spread of the recombinant virus due to insects or contact.
  • the object is to provide the first selective / specific expression system for viral vectors.
  • the present invention for solving the above-described problems comprises the following technical means.
  • a non-diffusion plant virus vector lacking a gene related to cell-to-cell transfer of a cucumber mosaic virus (CMV) genome which is selective and specific for a transformed plant into which the gene related to cell-to-cell transfer is introduced
  • the above plant virus vector is a CMV vector that does not express a 3a gene product lacking the RNA3 gene encoding the 3a protein required for cell-to-cell transfer in a plant body of cucumber mosaic virus (CMV) ( The plant virus vector according to 1).
  • Vector selective and specific expression system (6)
  • the non-diffusion plant virus vector lacking a gene related to cell-to-cell movement of the cucumber mosaic virus (CMV) genome encodes a 3a protein necessary for cell-to-cell movement in a plant body of cucumber mosaic virus (CMV).
  • the transformed plant into which the gene related to cell-to-cell transfer is introduced is a transformant into which an RNA3 gene encoding a 3a protein necessary for cell-to-cell transfer in a cucumber mosaic virus (CMV) plant is introduced.
  • CMV cucumber mosaic virus
  • the transformant into which the gene related to intercellular transfer is introduced is a transformant into which a recombinant vector into which the gene related to intercellular transfer is inserted as a foreign gene is introduced.
  • a non-diffusion plant virus vector lacking a gene related to cell-to-cell transfer of the cucumber mosaic virus (CMV) genome encodes a 3a protein necessary for cell-to-cell transfer in a plant body of cucumber mosaic virus (CMV)
  • the method for selective and specific expression of a plant virus vector according to (10) above, which is a CMV vector that does not express the 3a gene product from which the RNA3 gene to be deleted is expressed.
  • the transformed plant into which the gene related to cell-to-cell transfer is introduced is a transformant into which an RNA3 gene encoding a 3a protein necessary for cell-to-cell transfer in a plant body of cucumber mosaic virus (CMV) is introduced.
  • the transformant into which the gene related to intercellular transfer is introduced is a transformant into which a recombinant vector into which the gene related to intercellular transfer is inserted as a foreign gene is introduced.
  • a method for selective and specific expression of a plant virus vector is provided.
  • the present invention relates to a non-diffusion plant virus vector lacking a gene related to cell-to-cell movement of a cucumber mosaic virus (CMV) genome, which is selective and specific for a transformed plant into which the gene related to cell-to-cell transfer has been introduced. It has the effect
  • a gene related to cell-to-cell movement of the cucumber mosaic virus (CMV) genome refers to protoplasmic communication (an intercellular bridge connecting adjacent cells of higher plants) in order to transfer the virus genome to adjacent cells. Is a protein that can expand the exclusion molecular weight limit of (cell to cell movement protein), and is defined as a gene encoded by a plant virus genome.
  • the present invention also provides a selective and specific expression system for the above plant virus vector, and a non-diffusion plant virus vector in which a gene related to cell-to-cell movement of a cucumber mosaic virus (CMV) genome is deleted.
  • CMV cucumber mosaic virus
  • the non-diffusion plant virus vector establishes selective and specific infection and propagation to the transformed plant. It is.
  • the present invention is a method for selective and specific expression of the above plant virus vector, comprising a non-diffusion plant virus vector in which a gene related to cell-to-cell movement of the cucumber mosaic virus (CMV) genome is deleted, and
  • the non-diffusible plant virus vector is selectively and specifically infected and propagated with respect to the transformed plant body in combination with a transformed plant body into which the gene for intercellular transfer has been introduced. Is.
  • the plant virus vector is a CMV vector that does not express a 3a gene product lacking the RNA3 gene encoding the 3a protein required for cell-to-cell transfer in a plant body of cucumber mosaic virus (CMV).
  • the non-diffusion plant virus vector from which the gene related to cell-to-cell transfer of the cucumber mosaic virus (CMV) genome is deleted encodes the 3a protein necessary for cell-to-cell transfer in the plant body of cucumber mosaic virus (CMV).
  • a preferred embodiment is a CMV vector that does not express the 3a gene product lacking the RNA3 gene.
  • a transformed plant into which a gene related to cell-to-cell transfer is introduced is transformed with an RNA3 gene encoding a 3a protein necessary for cell-to-cell transfer in a plant body of cucumber mosaic virus (CMV).
  • CMV cucumber mosaic virus
  • the transformant into which the gene related to cell-cell transfer is introduced is a transformant into which a recombinant vector into which the gene related to cell-to-cell transfer is inserted as a foreign gene is introduced. It is an aspect.
  • a plant virus vector is constructed in which the genomic gene information necessary for the plant virus to move between cells in the infected plant body is deleted.
  • a recombinant plant in which the virus expresses only genes necessary for cell-to-cell transfer is produced. Only when this recombinant virus is inoculated with the plant virus vector, the virus vector is transferred to the whole body and can be propagated, but in other plants, there is no gene product necessary for cell-to-cell transfer. The vector does not propagate and propagate to other plants.
  • virus vectors infection may spread randomly from an infected plant body to another host plant body.
  • Viruses vectors lacking genes necessary for movement in infected plants cannot grow in the inoculated plants.
  • the above viral vector can be propagated in a transformed plant body into which a gene necessary for migration that has been deleted is introduced, or a plant body into which the gene is introduced with another virus vector.
  • this viral vector cannot be propagated in a normal plant body, infection does not spread in a disorderly manner like conventional viral vectors.
  • a viral vector lacking the ability of the virus to move between cells was constructed.
  • a cucumber mosaic virus vector (CMV vector) was used as a plant virus vector.
  • the gene product required for cell-to-cell movement in the plant body of this CMV virus is 3a protein encoded by RNA3, and CMV 3a protein is involved in cell-to-cell movement. Therefore, a ⁇ 3a CMV vector that does not express the 3a gene product in which the 3a gene of the CMV vector was deleted was constructed.
  • the 3a protein which is a gene product of CMV
  • enters a plant body cell it spreads the protoplasmic string to the neighboring cells and allows the virus to move between cells.
  • the CMV vector lacking the CMV 3a protein gene cannot spread the protoplasmic thread, so the virus cannot move between cells, and the virus does not spread throughout the body of the plant, spreading the virus randomly. None do. However, this will not serve as a vector.
  • the present inventors constructed a vector that expresses the CMV 3a protein with other viral vectors in order to allow the ⁇ 3a CMV vector to proliferate and transfer between cells by supplying the 3a protein from the outside.
  • a test for confirming the infection of the ⁇ 3aCMV vector by Tissue printing in the plant body was attempted.
  • 3a protein supplied from other viral vectors functions in trans, allowing systemic migration of the ⁇ 3a CMV vector and expression of the target substance (anti-Dx antibody).
  • the plant virus vector actually used is a cucumber mosaic virus vector (CMV vector).
  • CMV vector cucumber mosaic virus vector
  • the gene necessary for cell-to-cell movement of this virus is 3a protein encoded by RNA3. Therefore, a CMV vector that does not express the 3a gene product, ie, a ⁇ 3aCMV vector was constructed. It was confirmed that no infection was observed when this vector was inoculated alone into a host plant (tobacco).
  • a plant viral vector lacking a gene related to viral cell-to-cell transfer cannot be propagated alone, that is, cannot diffuse or propagate alone, but is a protein necessary for cell-to-cell transfer. It has been proved that systemic infection is possible by supplying separately, and it can function as a vector.
  • the ⁇ 3aCMV vector cannot be propagated even when inoculated into a normal plant, but it can be propagated only in a plant expressing the 3a protein. That is, the ⁇ 3aCMV vector alone is a disordered viral vector. We were able to prove that no diffusion occurred.
  • the present invention relates to a non-diffusible plant virus vector and a system for selective and specific expression of the non-diffusible plant virus vector in which a non-diffusible plant virus vector and a specific transformed plant are combined.
  • a non-diffusible plant virus vector and a specific transformed plant Similar to gene recombination technology, it is not limited to individual vectors and types of host plants, but is a general and universal technology that can be widely applied as long as it is a plant virus vector that carries insect transmission, contact propagation, etc. It is. Therefore, in the present invention, the types of plant virus vectors and host plants that perform insect transmission, contact propagation, etc. are not particularly limited.
  • an invention relating to a method for transforming a plant using a non-diffusible plant virus vector is a combination of the non-diffusible plant virus vector of the present invention and a specific transformed plant as an invention relating to the method. It provides a new technical idea to prevent plant virus vectors from randomly infecting host plants and spreading unintentional recombinant viral genes, and performs insect transmission, contact propagation, etc. It is a general technique widely applicable without being limited to the kind of individual plant virus vector and the kind of transformed plant body.
  • a non-diffusible plant virus vector and a transformed plant body are selected using a plant virus vector, specifically, a cucumber mosaic virus vector (CMV vector).
  • CMV vector cucumber mosaic virus vector
  • the establishment of a specific and specific infection and propagation system was proved.
  • the present invention is applied to CMV vectors, it can be similarly applied to other plant virus vectors as a mode of use of plant virus vectors.
  • virus vectors In conventional virus vectors, unintended spread of virus vectors from the inoculated infected plant was unavoidable. Since the present invention can be infected and propagated only by a recombinant plant that expresses a protein involved in virus migration (CMV 3a protein), unintended spread of the virus vector does not occur. That is, even when used outdoors, since the viral vector does not spread, the usage range of the viral vector can be dramatically expanded.
  • CMV 3a protein protein involved in virus migration
  • the present invention has the following effects. (1) It is possible to provide a non-diffusible plant virus vector that can randomly infect host plants and avoid the risk of unintended recombinant virus spreading. (2) Since a virus vector can be propagated and propagated only in a recombinant plant into which a gene necessary for virus propagation is introduced, a new recombinant plant system capable of avoiding unintended virus spread can be provided. (3) To provide a non-diffusion plant virus vector that cannot be spread and propagated alone, but can be systematically infected by functioning as a vector by separately introducing a protein gene required for cell-to-cell transfer be able to.
  • the process of creating a vector (3a-Stop) lacking the 3a gene by substituting the CAA codon encoding the 4th amino acid glutamine of the 3a protein of pCY3 with the TAA codon which is the stop codon is shown.
  • the process of introducing a foreign gene by inserting a foreign gene (DHFR) sequence into the StuI site and MluI region of the C2-H1 vector is shown.
  • the process of introducing a foreign gene (DxscFv) into CMV-Y RNA2 by inserting the DxscFv sequence into the StuI site and MluI region of the C2-H1 vector is shown.
  • the process of inserting the intercellular migration protein (3a) into pBE2113 by inserting the sequence of the 3a protein derived from CMV-Y3a into the XbaI site and SacI region of pBE2113, which is a plant expression vector, is shown.
  • the detection results of DxscFv in wild-type benthamiana and 3a-transformed bentamiana in inoculation with Y1 / H1: DxscFv / Y3 (RNA transcript) or Y1 / H1: DxscFv / 3a-stop (RNA transcript) are shown.
  • DIECA N sodium diethyldithiocarbamate (Wako), added immediately before inoculation
  • 0.1 M phosphate buffer pH 8.0
  • the reverse transcription RNA for inoculation was synthesized by the method described later, and prepared by adding 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 8.0) in an amount equal to the total amount.
  • 0.1 M potassium phosphate buffer pH 8.0
  • the inoculum was applied to a latex finger sack and applied so that the surface of the leaf was gently stroked with a fingertip.
  • excess coarse juice and carborundum were washed from the leaf surface with light and shielded from light until the next day.
  • 0.1M potassium phosphate buffer 0.1M potassium hydrogen phosphate and 0.1M potassium dihydrogen phosphate were mixed and adjusted to pH 8.0.
  • the SOB liquid medium was mixed with Bacto TM Tryptone (Becton Dickinson) 20g: Bacto TM Yeast Extract (Becton Dickinson) 5g: 1M NaCl solution 10ml, 1M KCl solution 2.5ml, and made up to 1L. Sterilized by autoclaving. A 1M MgCl 2 solution (Nacalai) sterilized by filtration just before use and a 1M MgSO 4 solution (Nacalai) were added in an amount of 1/100.
  • TFB transformation buffer
  • TFB transformation buffer
  • CaCl 2 Wako Pure Chemical
  • MnCl 2 Nacalai
  • RbCl Nacalai
  • sucrose sucrose
  • the pH was adjusted to 5.8 with the composition of acetic acid (Wako Pure Chemical Industries), and the solution was sterilized by filtration.
  • 2% X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -D-galactopyranoside (Wako Pure Chemical Industries) is added in advance to N, N-dimethylformamide.
  • 100 ⁇ l of E. coli culture solution was seeded on the medium. The cells were cultured in an incubator at 37 ° C. for 12 to 16 hours.
  • 2YT liquid medium Bacto TM Tryptone16g, Bacto TM Yeast Extract10g, mixed NaCl10g, and filled up with distilled water and 1L, were prepared by autoclaving.
  • LB-# 038 medium Bacto TM Tryptone10g, Bacto TM Yeast Extract5g, NaCl10g, mixed Agar (Wako) 15 g, was a 1L and filled up with distilled water, autoclaved, allowed to cool to about 50 ° C. , 50 mg / ml ampicillin stock (Wako-filter sterilized) was added in an amount of 1/1000 and dispensed into a sterile petri dish before setting.
  • Plasmid extraction A colony of E. coli obtained by transformation was picked up in 2 ml of 2YT liquid medium supplemented with 2 ⁇ l of 50 mg / ml ampicillin stock with a sterilized toothpick and shaken at 37 ° C. for 12 to 14 hours. Cultured. This culture solution was put into a 1.5 ml tube and centrifuged at 10,000 rpm for 3 minutes. The supernatant was removed with an aspirator, 100 ⁇ l of the following Solution-1 was added, and completely suspended with a tube mixer. To this, 200 ⁇ l of Solution-2 was added and mixed by inversion.
  • RNase A was diluted with TE (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA (pH 8.0)) to a final concentration of 2 ⁇ g / ml, added 50 ⁇ l at a time, lightly applied to a mixer, and allowed to stand at 37 ° C. for 30 minutes. .
  • Solution-1 25 mM Tris (2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol (Wako) -HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA (ethylenediamine-N, N, N ′, N′-tetraacetic acid / Dojin) Chemistry), 50 mM glucose (Wako)
  • Solution-2 0.2N NaOH (Wako), 1% SDS (sodium lauryl sulfate-Nacalai)
  • Solution-3 5M potassium acetate solution 60ml, acetic acid 11.5ml, distilled water 28.5ml
  • Solution-4 20% PEG # 6000 (polyethylene glycol-Nacalai), 2.5M NaCl
  • Phenol chloroform extraction Add sterilized water to the sample DNA solution to make 100 ⁇ l, add 50 ⁇ l TE saturated phenol (Nippon Gene) and 50 ⁇ l chloroform (Wako), and stir for 1 minute in a tube mixer to inactivate the protein. I let you. The mixture was centrifuged at 14000 rpm for 5 minutes, and only the aqueous layer was transferred to a 1.5 ml tube.
  • the recovered DNA solution was extracted with phenol chloroform and precipitated with ethanol, and then suspended in 5 ⁇ l of sterile water.
  • DNA Ligation Kit ⁇ Mighty Mix> (TaKaRa) was used for ligation of the vector and the insert.
  • the recovered DNA solution and an equal amount of Ligation Mix solution were added and suspended. After standing at 16 ° C. for 30 minutes, 5 ⁇ l of the ligation reaction solution was added to E. coli. E. coli competent cells were transformed.
  • Template solution 3.5 ⁇ l 50 mM DTT 2 ⁇ l 0.1% BSA 2 ⁇ l 10 ⁇ T7 RNA polymerase buffer * 11 2 ⁇ l 2.5 ⁇ Cap / NTP mix * 12 8 ⁇ l RNase inhibitor * 13 0.5 ⁇ l T7 RNA polymerase 2 ⁇ l
  • transcripts were stored at -80 ° C.
  • RNA extraction (phenol-SDS method) A 0.1 g sample was ground with 500 ⁇ l RNA extraction buffer and 500 ⁇ l TE saturated phenol and transferred to a 1.5 ml tube. Vortexed for about 20 seconds and cooled and centrifuged at 14000 rpm for 5 minutes. The supernatant (aqueous layer) was transferred to another tube, and the same amount of phenol chloroform (1: 1) as the supernatant was added. The mixture was vortexed and stirred vigorously, and then cooled and centrifuged at 14000 rpm for 5 minutes. The supernatant was transferred to another tube, and phenol chloroform extraction was repeated until the white protein layer disappeared. Finally, after rinsing with an equal volume of chloroform, the aqueous layer was added, among other things, 1/10 volume of 3M sodium acetate, 3 volumes of 100% ethanol.
  • RNA extraction buffer has a composition of 25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 25 mM MgCl 2 , 25 mM KCl, 1% SDS.
  • Tissue print Two filter papers, with the smooth side up, place the leaf on top of it, and stack the two filter papers so that the smooth side is on the leaf side. was blotted onto filter paper. After the filter paper has dried, 2% Triton X-100 is added to the plastic container, shaken at room temperature for 30 minutes to remove pigment such as chlorophyll, and then PBST-skimmed milk solution (10 mM NaPO 4 (pH 7.2). ), 0.9% NaCl, 0.1% Tween 20, 3% skim milk), and the mixture was shaken at room temperature for 30 minutes to give a blocking treatment.
  • PBST-skimmed milk solution (10 mM NaPO 4 (pH 7.2).
  • 0.9% NaCl 0.1% Tween 20, 3% skim milk
  • PBST-skim milk solution in which alkaline phosphatase (AP) -labeled anti-CMV antibody was diluted 5,000 times was added and shaken at 37 ° C. for 1 hour for antibody treatment. Thereafter, the plate was washed with PBST-skim milk solution while shaking for 5 minutes, and this was repeated three times.
  • AP alkaline phosphatase
  • C-PAGEEL (registered trademark) pre-made gel for electrophoresis 12.5% (Ato Co., Ltd.) was used for electrophoresis, and after completion of the electrophoresis, it was blotted to a PVDF membrane (Millipore) using a compact blot (Ato Co., Ltd.).
  • the PVDF membrane was immersed in methanol for several minutes in advance and then immersed in the following blotting buffer. After completion of blotting, the membrane was placed in PBST skim milk, shaken for 30 minutes, 1 ⁇ l of the following primary antibody was diluted with 3 ml of PBST skim milk, and reacted in a hybrid bag for 1 hour.
  • AP-labeled anti-mouse antibody Bio-Rad, Goat Anti-Mouse (H + L) -AP conjugate
  • AP buffer containing 0.033% nitroblue tetrazolium and 0.0165% 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate.
  • HRP-labeled anti-mouse antibody (Amersham Biosciences; ECL Anti-mouse IgG, peroxidase-linked special-whole antibody (from the sheep); peroxidase conjugate)), ECL-plus (GE Healthcare) was used.
  • the primary antibody is an anti-His-Tag antibody (Novagen, His • Tag (registered trademark) Monoclonal antibody 0.2 mg / ml) for detection of DxscFv, and an anti-FLAG antibody (SIGMA, ANTI-) for the detection of DHFR. FLAG (registered trademark) M2 Monoclonal antigen) was used.
  • an anti-CMV-cp antibody Nakkosha was used.
  • 2 ⁇ sample buffer To 25 ml of 0.25 M Tris-HCl (pH 6.8), 5 ml of 2-mercaptoethanol, 2 g of SDS, 5 g of sucrose, 2 ⁇ g of Bromophenol Blue were added, and the volume was adjusted to 50 ml with distilled water. 10 ⁇ running buffer: Tris 15.14 g, Glycine 72.067 g, and SDS 5 g were added with distilled water to make 500 ml. Blotting buffer: Tris 0.604 g, Glycine 2.88 g, methanol 40 ml, distilled water was added to make 200 ml.
  • FIG. 1 shows the introduction process. Using pCY3 as a template, PCR reaction was performed with Y3-T7-5Bm primer, 3a-Stop-3 primer, 3a-Stop-5 primer and Y3-3Hind primer, respectively.
  • PCR was performed again with Y3-T7-5Bm primer and Y3-3Hind primer using 1 ⁇ l of the mixed solution as a template, and the size of the product was confirmed by electrophoresis.
  • This product was treated with BamHI and HindIII and cloned into the BamHI and HindIII sites of pCY3 to create a vector lacking the 3a gene.
  • FIG. 2 shows the process of introducing a foreign gene (DHFR) into the C2-H1 vector.
  • DHFR gene with FLAG tag and MluI site at the 3 'end of DHFR is obtained by PCR using DHFR5 primer and DHFR-3Flg primer using PROTEIOS Plumid set (Toyobo) pEU-DHFR as a template . This was treated with MluI and cloned into the StuI and MluI sites of the C2-H1 vector.
  • FIG. 3 shows the process of introducing a foreign gene (DxscFv) into CMV-Y RNA2.
  • PCR was performed using pBE2113-DxscFv as a template, and a StuI site was added to 5 ′ of the DxscFv ORF, and an MluI site was added to 3 ′.
  • the DxscFv fragment was cloned into the StuI-MluI region of the C2-H1 vector to construct H1: DxscFv.
  • 3a gene fragment having EcoRI and SalI site was obtained by PCR with YCYaGcoTTGGATTTCATGGCTTTCCAAGGGTACC and Y3aRsal primer CAGGTTGCTCAACAAGACCGTTAACCACCTG using pCY3 as a template. This was cloned into the EcoRI and SalI sites of the ClYVV vector.
  • FIG. 4 shows the results of tissue printing using ClYVV-3a / Y1 / Y2 / 3a-Stop and PVX-3a / Y1 / Y2 / 3a-Stop.
  • the former was inoculated into wild-type bentamiana using ClYVV-3a-infected leaves, and after about 3 weeks inoculation, Y1 / Y2 / 3a-Stop transcribed RNA was inoculated, and 10 days later by tissue printing. CMV was detected.
  • FIG. 5 shows PVX-3a / Y1 / H1: DHFR (or H1: DxscFv) / 3a-Stop RNA transcript mixed with wild-type Ventamiana and DHFR and DxscFv by Western blot 6-12 days later. The result of detecting is shown. Both results indicate that 3a is supplied to the trans and that the foreign protein is expressed in the upper leaf of the plant inoculated with the virus vector.
  • RNA is extracted from the upper leaves and RT-PCR is performed using Y3-T7-5Bm primer and Y3-3Hind primer.
  • a DNA fragment containing the CMV 3a gene was amplified.
  • Direct sequencing was performed with this fragment and the Y3-T7-5Bm primer, and the sequence of the site into which the mutation was introduced was examined to confirm that the stop codon was maintained.
  • FIG. 6 shows the process of introducing the cell-to-cell transfer protein (3a) into pBE2113.
  • PCR was performed using pCY3 as a template, and a PCR amplification product (about 840 bp) was introduced into pGEM-TEasy (Promega).
  • pGEM-TEasy Promega
  • the 3a fragment obtained by restriction enzyme treatment in the SpeI and SacI regions was introduced into the XbaI and SacI regions of pBE2113 to produce a plant expression vector pBE2113-3a.
  • Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 (Clontech) by a direct introduction method by freezing and thawing. Specifically, Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 is absorbed in 50 mL of LB liquid medium (1% Bacto tryptone, 0.5% Bacto Yeast Extracts, 1% sodium chloride), and the absorbance value of A600 is about 1.0. The mixture was cultured at 28 ° C. until shaking, cooled on ice, and centrifuged at 4 ° C. and centrifuged at 3000 g.
  • LB liquid medium 1% Bacto tryptone, 0.5% Bacto Yeast Extracts, 1% sodium chloride
  • the cells were suspended in 1 mL of ice-cooled 20 mM calcium chloride solution and dispensed into an Ebendorf tube every 0.1 mL. To this, 1 ⁇ g of the recombinant plasmid pBE2113-3a was added and rapidly frozen in liquid nitrogen. Next, the obtained frozen cells were lysed at 37 ° C. and allowed to stand for 5 minutes.
  • LB medium 1 mL was added, and after shaking culture at 28 ° C. for 2 to 4 hours, centrifugation was performed at about 10,000 g for 1 minute, and the cells were collected and suspended in 0.1 mL of LB medium. I let you.
  • the cells were inoculated into an LB solid medium containing rifampicin (100 ⁇ g / mL), kanamycin (25 ⁇ g / mL) and streptomycin (300 ⁇ g / mL). By culturing at 28 ° C. for 2 to 3 days, a transformed bacterium into which pBE213-3a was incorporated was obtained.
  • Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 in which pBE213-3a is incorporated is an LB liquid medium at 28 ° C. after shaking culture, centrifuged at 4 ° C., collected at 3000 g, and collected into MS liquid medium [Physiol, Plant. 15: 473 (1962)], and this was used for plant transformation.
  • the transformation operation was performed by the leaf tissue method using the above-described recombinant Agrobacterium.
  • Bentamiana leaves were sterilized with 1% sodium hypochlorite solution for 15 minutes and washed 6 times with sterile distilled water. From this leaf, a circular disc having a diameter of about 1 cm was cut out with a sterilized cork borer to obtain a leaf disk. This disc was immersed in an MS liquid medium suspension of Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 containing pBE2113-3a produced above for 15 minutes.
  • MS solid medium [containing 3% sucrose, B5 vitamin, 0.8% agar (pH 5.7), BAP (6-benzylaminopurine) 1 mg / L, NAA (naphthalene acetic acid) 0.1 mg / L]
  • MS liquid medium containing antibiotics kanamycin 50 ⁇ g / mL and carbenicillin 500 ⁇ g / mL (both manufactured by Sigma).
  • the disc after washing was subcultured every 2 weeks at 25 ° C. on MS solid medium (containing 3% sucrose) containing the above antibiotics (16 hours illumination, 8 hours dark period). At 4 to 8 weeks of culture, callus was formed on the surface of the disc, and shoots were induced by subculture.
  • the shoots were cut from the roots, transplanted onto a hormone-free MS solid medium [containing 3% sucrose, kanamycin 50 ⁇ g / mL, carbenicillin 500 ⁇ g / mL (PH 5.7)], and cultured. Plants rooted after 2 to 4 weeks were transplanted into pots containing culture soil and cultivated in a closed recombinant greenhouse to obtain next generation (T1) seeds.
  • a hormone-free MS solid medium containing 3% sucrose, kanamycin 50 ⁇ g / mL, carbenicillin 500 ⁇ g / mL (PH 5.7)
  • RNA transcript DxscFv / Y3 (RNA transcript) or Y1 / H1: DxscFv / 3a-stop (RNA transcript).
  • the present invention relates to a non-diffusible plant virus vector, and according to the present invention, it is possible to infect host plants in a disorderly manner and to avoid the risk of unintended recombinant virus spreading.
  • a spreading plant viral vector can be provided.
  • the present invention provides a new recombinant plant system that can avoid the spread of unintentional viruses because the viral vector can be propagated and propagated only in recombinant plants into which genes necessary for virus propagation have been introduced. be able to.
  • the present invention alone cannot spread and propagate, but by introducing a protein gene necessary for systemic transfer to a plant body separately, systemic infection becomes possible and can function as a vector. Plant viral vectors can be provided.
  • the present invention does not cause the spread of plant virus vectors even when used outdoors, the range of use of plant virus vectors is greatly expanded.
  • the virus vector does not propagate or propagate to other plant bodies. It is useful as something that makes it possible to achieve the above.

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Abstract

　本発明の課題は、ウイルス増殖に必要な遺伝子を導入した組換え植物においてのみ、ウイルスベクターの感染増殖が可能であり、意図せぬ組換えウイルスの拡散を回避できる新しい非拡散植物ウイルスベクター、その選択的・特異的発現システム及びその発現方法を提供することであり、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ゲノムの細胞間移行に係る遺伝子を欠落させた非拡散植物ウイルスベクターと、欠落させた当該細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換植物体とを組み合わせて、上記非拡散植物ウイルスベクターを、上記形質転換植物体に対する選択的・特異的感染及び増殖を成立させることを特徴とするものである。

Description

非拡散植物ウイルスベクター
　本発明は、非拡散植物ウイルスベクターに関するものであり、更に詳しくは、ウイルスの植物体の細胞間移行に関する遺伝子を欠落させた植物ウイルスベクターと、別に植物体への細胞間移行に必要なタンパク質遺伝子を植物体に導入することにより、通常の植物に接種しても増殖できないが、上記細胞間移行に必要なタンパクを発現する植物体でのみ増殖することが可能な非拡散ウイルスベクター、植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現システム及びその発現方法に関するものである。本発明は、土壌伝染、昆虫媒介、接触伝播等の無秩序なウイルスベクターの拡散が起きないようにした非拡散植物ウイルスベクター、植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現システム及びその発現方法を提供するものである。
　従来、植物ＲＮＡウイルスベクターの研究は、感染植物における増殖能が非常に高いタバコモザイクウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ，ＴＭＶ）とブロモモザイクウイルス（Ｂｒｏｍｏ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ，ＢＭＶ）の感染性クローンを用いて行われてきた。そして、この分野では、ウイルス遺伝子の発現様式の違いなどから、今までに、いくつかの外来遺伝子の発現方式が開発されている。
　ここで、それらを紹介すると、例えば、ＴＭＶやポティウイルス属（Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ）では、ウイルスＣＰ遺伝子と外来遺伝子が融合したタンパク質を発現するベクターが開発されている（非特許文献１～２参照）。また、ＴＭＶと近縁のウイルス（Ｏｄｏｎｔｏｇｌｏｓｓｕｍ　ｒｉｎｇｓｐｏｔ　ｖｉｒｕｓ）のサブゲノミックプロモーターを導入することにより、サブゲノムを介して外来遺伝子を発現させるベクターも開発されている（非特許文献３参照）。
　ただ、これまでは、このようなウイルスベクターの開発には、主にＴＭＶやポティウイルス属に代表される、棒状、ひも状のウイルスが使用されてきた。それは、棒状、ひも状のウイルスベクターは、球状ウイルスに比べ、挿入できる外来遺伝子の長さに物理的制限が少ないという利点があるからである。一方、球状ウイルスであるＢＭＶにおける発現ベクターの系としては、１ａタンパク質、２ａタンパク質の複製酵素遺伝子を発現するタバコに、外来遺伝子をもつＲＮＡ３を接種するという方法が報告されている（非特許文献４参照）。
　また、ＣＭＶにおいても、ウイルスベクターについて、幾つかの研究がなされている。その一つは、ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ　による４分節ＣＭＶベクターの開発である（非特許文献５参照）。ＣＭＶのＲＮＡ３にはＭＰとＣＰがコードされており、ウイルスの細胞間移行にはＭＰとＣＰの両方が必須である（非特許文献５参照）。
　そこで、これまでに、本発明者らは、ＲＮＡ３分子を改変し、ＭＰ領域をＧＦＰ遺伝子に置換したＲＮＡ３ＡとＣＰ遺伝子を持たないＲＮＡ３Ｂを構築し、ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ　により細胞間移行するウイルスベクターを開発した。これを、ＲＮＡ１、ＲＮＡ２、ＲＮＡ３Ａ、及びＲＮＡ３Ｂの４分節のウイルスゲノムを持つＣＭＶとして、ベンタミアーナに接種したところ、接種葉のｍｉｎｏｒ　ｖｅｉｎでＧＦＰ蛍光が観察された。
　また、ＲＮＡ３Ｂで欠失させたＣＰ領域にマルチクローニングサイトを挿入し、そこに、ＧＵＳ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ－β－ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）遺伝子やＢＹＭＶ（Ｂｅａｎ　ｙｅｌｌｏｗ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ）のＣＰ遺伝子を導入したところ、接種葉のｍｉｎｏｒ　ｖｅｉｎにおいて、ＧＵＳ活性やＢＹＭＶ－ＣＰが検出された。しかし、このＲＮＡ３Ａ、ＲＮＡ３Ｂが、互いにｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ＲＮＡ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎを起こし、上葉では、導入遺伝子の発現は見られなかった。
　その他に、先行技術として、種々の異なった宿主植物に適用可能なキュウリモザイクウイルスベクターで各種タンパク質を生産すること等、各種の関連技術が開発されている（非特許文献７～１１）。
Ｓｕｇｉｙａｍａ，Ｙ．，Ｈａｍａｍｏｔｏ，Ｈ．，Ｔａｋｅｍｏｔｏ，Ｓ．，Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｙ．ａｎｄ　Ｏｋａｄａ，Ｙ．，Ｓｙｓｔｅｍｉｃ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｏｒｅｉｇｎ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｐａｒｔｉｃｌｅ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｏｆ　Ｔｏｂａｃｃｏ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ，ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　３５９，２４７－２５０（１９９５） Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ－Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｍ．Ｒ．，Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｔｏｒｒｅｃｕａｄｒａｄａ，Ｊ．Ｌ．，Ｃａｓａｌ，Ｊ．Ｉ．ａｎｄ　Ｇａｒｃｉａ，Ｊ．Ａ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｎ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｐｌｕｍ　ｐｏｘ　ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ，ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　４２７，２２９－２３５（１９９８） Ｄｏｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｙｓｔｅｍｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｇｅｎｅ　ｂｙ　ａ　ｔａｂａｃｃｏ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ－ｂａｓｅｄ　ｖｅｃｔｏｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８８：７２０４－７２０８（１９９１） Ｍｏｒｉ，Ｍ．，Ｋａｉｄｏ，Ｍ．，Ｏｋｕｎｏ，Ｔ．ａｎｄ　Ｆｕｒｕｓａｗａ，Ｉ．，ｍＲＮＡ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｂｙ　ｖｉｒａｌ　ｒｅｐｌｉｃａｓｅ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ，ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．３３６，１７１－１７４（１９９３） Ｚｈａｏ，Ｙ，，Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｊ．Ｔｏｕｓｉｇｎａｎｔ，Ｍ．Ｅ．ａｎｄ　Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｒ．Ｗ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｇｅｎｅ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｓｙｓｔｅｍ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　Ｃｕｃｕｍｂｅｒ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ，　Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１４５，２２８５－２２９５（２０００） Ｃａｎｔｏ，Ｔ．，Ｐｒｉｏｒ，Ｄ．Ａ．，Ｈｅｌｌｗａｒｄ　Ｋ．Ｈ．，Ｏｐａｒｋａ，Ｋ．Ｊ．，Ｐａｌｕｋａｉｔｉｓ，Ｐ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｕｃｕｍｂｅｒ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ．ＩＶ．Ｍｏｖｅｍｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　ｃｏａｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｒｅ　ｂｏｔｈ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｆｏｒ　ｃｅｌｌ－ｔｏ－ｃｅｌｌ　ｍｏｖｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｃｕｃｕｍｂｅｒ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２３７，２３７－２４８（１９９７） Ｍａｔｓｕｏ，Ｋ，Ｈｏｎｇ，ＪＳ，Ｔａｂａｙａｓｈｉ，Ｎ，Ｉｔｏ，Ａ，Ｍａｓｕｔａ，Ｃ，Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｃｕｃｕｍｂｅｒ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ　ａｓ　ａ　ｖｅｃｔｏｒ　ｍｏｄｉｆｉａｂｌｅ　ｆｏｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｈｏｓｔ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｔｏ　ｐｒｏｄｕｃｅ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｐｌａｎｔａ（２００７）２２５：２７７－２８６ Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ，ＤＣ，Ｃｈａｐｍａｎ，Ｓ，Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ，Ｓ．Ｊｅｌｌｙｆｉｓｈ　ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓ　ａ　ｒｅｐｏｒｔｅｒ　ｆｏｒ　ｖｉｒｕｓ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ｐｌａｎｔ　Ｊ（１９９５）７：１０４５－１０５３ Ｗａｎｇ，ＺＤ，Ｕｅｄａ，Ｓ，Ｕｙｅｄａ，Ｉ，Ｙａｇｉｈａｓｈｉ，Ｈ，Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ，Ｈ，Ｔａｃａｈａｓｈｉ，Ｙ，Ｓａｔｏ，Ｍ，Ｏｈｙａ，Ｋ，Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｃ，Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｔ．Ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ　ｏｎ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ａ　ｃｌｏｖｅｒ　ｙｅｌｌｏｗ　ｖｅｉｎ　ｖｉｒｕｓ－ｂａｓｅｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ．Ｊ　Ｇｅｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｐａｔｈｏｌ（２００３）６９：３２７－３３４ Ｍｉｔｓｕｈａｒａ，Ｉ，Ｕｇａｋｉ，Ｍ，Ｈｉｒｏｃｈｉｋａ，Ｈ，Ｏｈｓｈｉｍａ，Ｍ，Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｔ，Ｇｏｔｏｈ，Ｙ，Ｋａｔａｙｏｓｅ，Ｙ，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｓ，Ｈｏｎｋｕｒａ，Ｒ，Ｎｉｓｈｉｍｉｙａ，Ｓ，Ｕｅｎｏ，Ｋ，Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ，Ａ，Ｔａｎｉｍｏｔｏ，Ｈ，Ｔｓｕｇａｗａ，Ｈ，Ｏｔｓｕｋｉ，Ｙ，Ｏｈａｓｈｉ，Ｙ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｃａｓｓｅｔｔｅｓ　ｆｏｒ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｆｏｒｅｉｇｎ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ｄｉｃｏｔｙｌｅｄｏｎｏｕｓ　ａｎｄ　ｍｏｎｏｃｏｔｙｌｅｄｏｎｏｕｓ　ｐｌａｎｔｓ．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ（１９９６）３７：４９－５９ Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，Ｔ，Ｓｋｏｏｇ，Ｆ．Ａ　ｒｅｖｉｓｅｄ　ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　ｒａｐｉｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｂｉｏ　ａｓｓａｙｓ　ｗｉｔｈ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｐｌａｎｔａｒｕｍ（１９６２）：１５４７３－１５４９７
　このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、従来の植物ウイルスベクターのように、無秩序に宿主植物に感染が成立し、意図せぬ組換えウイルスの遺伝子の拡散が引き起こされる、という問題を確実に解消することが可能な、拡散しない新しい非拡散植物ウイルスベクターを開発することを目標として鋭意研究を積み重ねた結果、ウイルスの植物体での細胞間移行に関与するタンパク質を発現させた特定の組換え植物体のみで感染、及び増殖が可能で、意図せぬウイルスベクターの無秩序な感染拡大が起こらない、新しい非拡散植物ウイルスベクターを開発することに成功し、本発明を完成させるに至った。本発明は、土壌伝染、昆虫媒介、接触伝播等の意図せぬウイルスベクターの無秩序な感染拡大が起こらない、新しい非拡散植物ウイルスベクターを提供することを目的とするものである。また、本発明は、植物体での細胞間移行に必要なタンパク質を別に発現させた特定の組換え植物体と、上記非拡散植物ウイルスベクターとを組み合わせて、植物を利用した物質生産技術を提供することを目的とするものである。
　従来のすべての植物ウイルスベクターは、無秩序に宿主植物に感染が成立し、意図せぬ組換えウイルス遺伝子の拡散が引き起こされ、特に昆虫によって伝播されるものによってはその危険度が高い。本発明は、ウイルス増殖に係る遺伝子を導入した特定の組換え植物体においてのみ、ウイルスベクターの感染、増殖を可能にして、昆虫や接触による意図せぬ組換えウイルスの拡散を回避可能にした植物ウイルスベクターの初めての選択的・特異的発現システムを提供することを目的とするものである。
　上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ゲノムの細胞間移行に係る遺伝子を欠落させた非拡散植物ウイルスベクターであって、上記細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換植物体に対する選択的・特異的感染及び増殖を成立させる作用を有することを特徴とする植物ウイルスベクター。
（２）上記植物ウイルスベクターが、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の植物体での細胞間移行に必要な３ａタンパク質をコードするＲＮＡ３遺伝子を欠落させた３ａ遺伝子産物を発現しないＣＭＶベクターである、前記（１）に記載の植物ウイルスベクター。
（３）上記細胞間移行に係る遺伝子を外来遺伝子として導入していない植物体では、感染及び増殖が成立しない、前記（１）又は（２）に記載の植物ウイルスベクター。
（４）キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ゲノムの細胞間移行に係る遺伝子を欠落させた非拡散植物ウイルスベクターと、欠落させた当該細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換植物体とを組み合わせて、上記非拡散植物ウイルスベクターを、上記形質転換植物体に対する選択的・特異的感染及び増殖を成立させることを特徴とする植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現システム。
（５）上記細胞間移行に係る遺伝子が、植物体の細胞間の原形質連絡糸の拡大あるいはウイルスゲノムとの結合によりウイルスの移行に関与する遺伝子である、前記（４）に記載の植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現システム。
（６）上記キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ゲノムの細胞間移行に係る遺伝子を欠落させた非拡散植物ウイルスベクターが、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の植物体での細胞間移行に必要な３ａタンパク質をコードするＲＮＡ３遺伝子を欠落させた３ａ遺伝子産物を発現しないＣＭＶベクターである、前記（４）又は（５）に記載の植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現システム。
（７）上記細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換植物が、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の植物体での細胞間移行に必要な３ａタンパク質をコードするＲＮＡ３遺伝子を導入した形質転換体である、前記（４）に記載の植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現システム。
（８）上記細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換体が、上記細胞間移行に係る遺伝子を外来遺伝子として挿入した組換えベクターを導入した形質転換体である、前記（４）に記載の植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現システム。
（９）上記非拡散植物ウイルスベクターが、上記細胞間移行に係る遺伝子を外来遺伝子として導入していない植物体では感染及び増殖が成立しない、前記（４）に記載の植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現システム。
（１０）キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ゲノムの細胞間移行に係る遺伝子を欠落させた非拡散植物ウイルスベクターと、欠落させた当該細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換植物体とを組み合わせて、上記非拡散植物ウイルスベクターを、上記形質転換植物体に対して選択的・特異的に感染及び増殖させることを特徴とする植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現方法。
（１１）上記キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ゲノムの細胞間移行に係る遺伝子を欠落させた非拡散植物ウイルスベクターが、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の植物体での細胞間移行に必要な３ａタンパク質をコードするＲＮＡ３遺伝子を欠落させた３ａ遺伝子産物を発現しないＣＭＶベクターである、前記（１０）に記載の植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現方法。
（１２）上記細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換植物が、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の植物体での細胞間移行に必要な３ａタンパク質をコードするＲＮＡ３遺伝子を導入した形質転換体である、前記（１０）に記載の植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現方法。
（１３）上記細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換体が、上記細胞間移行に係る遺伝子を外来遺伝子として挿入した組換えベクターを導入した形質転換体である、前記（１０）に記載の植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現方法。
（１４）上記非拡散植物ウイルスベクターが、上記細胞間移行に係る遺伝子を外来遺伝子として導入していない植物体では感染及び増殖が成立しない、前記（１０）に記載の植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現方法。
　次に、本発明について更に詳細に説明する。
　本発明は、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ゲノムの細胞間移行に係る遺伝子を欠落させた非拡散植物ウイルスベクターであって、上記細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換植物体に対する選択的・特異的感染及び増殖を成立させる作用を有することを特徴とするものである。本発明において、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ゲノムの細胞間移行に係る遺伝子とは、ウイルスゲノムを隣接細胞に移行させるために、原形質連絡（高等植物の隣接細胞同士をつなげている細胞間橋）の排除分子量限界を拡大することのできる蛋白質（ｃｅｌｌ　ｔｏ　ｃｅｌｌ　ｍｏｖｅｍｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ）で、植物ウイルスゲノムにコードされる遺伝子として定義される。
　また、本発明は、上記植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現システムであって、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ゲノムの細胞間移行に係る遺伝子を欠落させた非拡散植物ウイルスベクターと、欠落させた当該細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換植物体とを組み合わせて、上記非拡散植物ウイルスベクターを、上記形質転換植物体に対する選択的・特異的感染及び増殖を成立させることを特徴とするものである。
　更に、本発明は、上記植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現方法であって、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ゲノムの細胞間移行に係る遺伝子を欠落させた非拡散植物ウイルスベクターと、欠落させた当該細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換植物体とを組み合わせて、上記非拡散植物ウイルスベクターを、上記形質転換植物体に対して選択的・特異的に感染及び増殖させることを特徴とするものである。
　本発明では、上記植物ウイルスベクターが、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の植物体での細胞間移行に必要な３ａタンパク質をコードするＲＮＡ３遺伝子を欠落させた３ａ遺伝子産物を発現しないＣＭＶベクターであること、また、上記キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ゲノムの細胞間移行に係る遺伝子を欠落させた非拡散植物ウイルスベクターが、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の植物体での細胞間移行に必要な３ａタンパク質をコードするＲＮＡ３遺伝子を欠落させた３ａ遺伝子産物を発現しないＣＭＶベクターであること、を好ましい実施の態様としている。
　また、本発明では、上記細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換植物が、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の植物体での細胞間移行に必要な３ａタンパク質をコードするＲＮＡ３遺伝子を導入した形質転換体であること、上記細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換体が、上記細胞間移行に係る遺伝子を外来遺伝子として挿入した組換えベクターを導入した形質転換体であること、を好ましい実施の態様としている。
　本発明では、植物ウイルスが感染植物体内で細胞間移行するのに必要なゲノム遺伝子情報を欠落させた植物ウイルスベクターを構築する。一方で、当該ウイルスが細胞間移行に必要な遺伝子だけを発現させた組換え植物体を作出する。この組換え体に、当該植物ウイルスベクターを接種したときのみ、ウイルスベクターが全身に移行し、増殖可能となるが、他の植物体においては、細胞間移行に必要な遺伝子産物がないため、ウイルスベクターの増殖及び他植物体への伝播が起きない。
　従来のウイルスベクターは、接種、感染植物体から他の宿主植物体へ無秩序に感染が拡大する可能性がある。感染植物体内で移動するのに必要な遺伝子を欠落させたウイルス（ベクター）は、接種した植物では増殖ができない。欠失させた移動に必要な遺伝子を導入した形質転換植物体、あるいは、当該遺伝子を他のウイルスベクターで導入した植物体では、上記のウイルスベクターが増殖可能になる。しかし、このウイルスベクターは、普通の植物体では、増殖ができないため、従来のウイルスベクターのように、無秩序に感染が拡大することはない。
　本発明では、ウイルスの細胞間移行能力を欠失したウイルスベクターを構築した。植物ウイルスベクターとして、キュウリモザイクウイルスベクター（ＣＭＶベクター）を用いた。このＣＭＶウイルスの植物体での細胞間移行に必要な遺伝子産物は、ＲＮＡ３にコードされている３ａタンパク質であり、ＣＭＶの３ａタンパク質が、細胞間移行に関与している。そこで、ＣＭＶベクターの３ａ遺伝子を欠失させた３ａ遺伝子産物を発現しない△３ａＣＭＶベクターを構築した。
　ＣＭＶの遺伝子産物である３ａタンパク質は、植物体細胞に侵入すると、となりの細胞に対して原形質連絡糸を拡げ、ウイルスの細胞間移行を可能にする。ＣＭＶの３ａタンパク質遺伝子を欠失させたＣＭＶベクターは、原形質連絡糸を拡げられないので、ウイルスの細胞間移行ができないことになり、ウイルスが植物体の全身に広がらず、無秩序にウイルスが拡散することはない。しかし、このままでは、ベクターとして役立たないことになる。
　そこで、本発明者らは、３ａタンパク質を外から供給することで、△３ａＣＭＶベクターの増殖、細胞間移行を可能にするために、他のウイルスベクターでＣＭＶの３ａタンパク質を発現させるベクターを構築し、植物体におけるＴｉｓｓｕｅ　ｐｒｉｎｔｉｎｇによる△３ａＣＭＶベクターの感染の確認テストを試みた。その結果、他のウイルスベクターから供給された３ａタンパク質がトランスに機能して、△３ａＣＭＶベクターの全身移行及び目的物質（抗Ｄｘ抗体）の発現を可能にすることが分かった。
　次に、３ａタンパク質遺伝子を欠失させたベクター（△３ａ）でも、細胞間移行可能なＣＭＶ（△３ａ）用組換え植物を開発するために、ＣＭＶの３ａ遺伝子を組み込んだ他のベクターと、△３ａＣＭＶベクターをタバコに混合接種することを試みた。その結果、３ａ形質転換タバコでは、△３ａＣＭＶベクターが植物体全身に移行可能になることが分かった。その結果、ウイルスの細胞間移行に関する遺伝子を欠落させた植物ウイルスベクターは、単独では増殖できず、拡散、伝播できないか、別に細胞間移行可能なタンパク質を導入することで、△３ａＣＭＶベクターの全身感染が可能になり、ベクターとして機能させることができることが分かった。
　実際に用いた植物ウイルスベクターは、キュウリモザイクウイルスベクター（ＣＭＶベクター）である。このウイルスの細胞間移行に必要な遺伝子は、ＲＮＡ３にコードされている３ａタンパク質である。そこで、３ａ遺伝子産物を発現しないＣＭＶベクター、即ち、△３ａＣＭＶベクターを構築した。このベクターを単独で宿主植物（タバコ）に接種しても感染が認められないことを確認した。
　一方、ＣＭＶの３ａ遺伝子を、他のウイルスベクターに組み込み、このベクターと△３ａＣＭＶベクターをタバコに混合接種すると、全身感染が認められた。具体的には、ＣＭＶの３ａ遺伝子をクローバー葉脈黄化ウイルスベクター（ＣｌＹＶＶベクター）等に組み込み、このベクターと△３ａＣＭＶベクターをタバコに混合接種すると、全身感染が認められた。即ち、ＣＭＶとは異なるウイルスベクターからＣＭＶの３ａタンパク質が接種植物体内でトランスに供給されることにより、△３ａＣＭＶベクターが細胞間移行して全身感染が成立したためである。
　この結果から、本発明の技術思想、即ち、ウイルスの細胞間移行に関する遺伝子を欠落させた植物ウイルスベクターは、単独では増殖できない、即ち、単独では拡散、伝播できないが、細胞間移行に必要なタンパク質を別途供給することで、全身感染が可能になり、ベクターとして機能させることができることが証明された。
　更に、３ａタンパク質遺伝子を導入した組換えタバコを作出し、これに△３ａＣＭＶベクターを接種した場合、ウイルスベクターの細胞間移行、更には全身感染が確認できた。これらの結果から、△３ａＣＭＶベクターは、通常の植物に接種しても増殖できないが、３ａタンパク質を発現する植物体でのみ増殖可能であること、即ち、△３ａＣＭＶベクター単独での無秩序なウイルスベクターの拡散は起きないこと、を証明できた。
　本発明は、非拡散植物ウイルスベクター、及び非拡散植物ウイルスベクターと特定の形質転換植物体とを組み合わせた当該非拡散植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現システムに係るものであり、本発明は、遺伝子組換え技術と同様に、個別的なベクター及び宿主植物体の種類に制限されず、昆虫媒介、接触伝播等を行う植物ウイルスベクターであれば、広く適用可能な一般的、普遍的な技術である。したがって、本発明においては、昆虫媒介、接触伝播等を行う植物ウイルスベクター及び宿主植物体の種類は、特に制限されるものではない。
　本発明において、特に、非拡散植物ウイルスベクターを利用した植物体の形質転換方法に係る発明は、方法に係る発明として、本発明の非拡散植物ウイルスベクターと、特定の形質転換植物体を組み合わせることで、植物ウイルスベクターが無秩序に宿主植物に感染が成立し、意図せぬ組換えウイルス遺伝子が拡散することを抑制するための新しい技術思想を提供するものであり、昆虫媒介、接触伝播等を行う個別な植物ウイルスベクターの種類、及び形質転換植物体の種類に制限されることなく、広く適用可能な一般的技術である。尚、後記する実施例に示したように、本発明では、植物ウイルスベクターとして、具体的には、キュウリモザイクウイルスベクター（ＣＭＶベクター）を用いて、非拡散植物ウイルスベクター及び形質転換植物体の選択的・特異的感染及び増殖系の成立を証明した。本発明は、ＣＭＶベクターに適用されるが、植物ウイルスベクターの使用の態様として、他の植物ウイルスベクターの場合についても同様に適用可能である。
　従来のウイルスベクターは、接種した感染植物体から意図せぬウイルスベクターの感染拡大は避けられなかった。本発明は、ウイルス移行に関与するタンパク質（ＣＭＶ　３ａタンパク質）を発現する組換え植物のみで、感染・増殖が可能であるため、意図せぬウイルスベクターの感染拡大が起こらない。即ち、野外等で使用しても、ウイルスベクターの拡散が起こらないため、ウイルスベクターの使用範囲を飛躍的に拡大することが可能になる。
　本発明は、次のような効果を奏するものである。
（１）無秩序に宿主植物に感染し、意図せぬ組換えウイルスの拡散リスクを回避することができる非拡散植物ウイルスベクターを提供することができる。
（２）ウイルス増殖に必要な遺伝子を導入した組換え植物においてのみ、ウイルスベクターの感染増殖が可能なため、意図せぬウイルスの拡散を回避できる新しい組換え植物のシステムを提供することができる。
（３）単独では、拡散、伝播できないが、細胞間移行に必要なタンパク質遺伝子を別に導入することで、全身感染が可能になり、ベクターとして機能させることができる、非拡散植物ウイルスベクターを提供することができる。
（４）野外等で使用しても、植物ウイルスベクターの拡散が起こらないため、植物ウイルスベクターの利用範囲が飛躍的に拡大する。
（５）本発明の植物ウイルスベクターを使用して組換え植物体を作出しても、ウイルスベクターの増殖、他の植物体への伝播は起きないことから、安全性を確保して、植物ウイルスベクターの利用を図ることが可能となる。
ｐＣＹ３の３ａタンパク質の４番目のアミノ酸グルタミンをコードするＣＡＡコドンを終止コドンであるＴＡＡコドンに置換することにより、３ａ遺伝子を欠くベクター（３ａ－Ｓｔｏｐ）を作出するプロセスを示す。 Ｃ２－Ｈ１ベクターのＳｔｕＩサイトとＭｌｕＩ領域に外来遺伝子（ＤＨＦＲ）の配列を挿入して、外来遺伝子を導入するプロセスを示す。 Ｃ２－Ｈ１ベクターのＳｔｕＩサイトとＭｌｕＩ領域に、ＤｘｓｃＦｖの配列を挿入して、ＣＭＶ－Ｙ　ＲＮＡ２へ、外来遺伝子（ＤｘｓｃＦｖ）を導入するプロセスを示す。 ＣｌＹＶＶ－３ａ／Ｙ１／Ｙ２／３ａ－Ｓｔｏｐ及びＰＶＸ－３ａ／Ｙ１／Ｙ２／３ａ－Ｓｔｏｐを用いたティッシュプリントの結果を示す。 ＰＶＸ－３ａ／Ｙ１／Ｈ１：ＤＨＦＲ（あるいはＨ１：ＤｘｓｃＦｖ）／３ａ―ＳｔｏｐのＲＮＡ転写産物を野生型ベンタミアーナに混合接種し、６～１２日後にウエスタンブロットにより、ＤＨＦＲ及びＤｘｓｃＦｖを検出した結果を示す。 植物発現用ベクターであるｐＢＥ２１１３のＸｂａＩサイトとＳａｃＩ領域にＣＭＶ－Ｙ３ａ由来の３ａタンパク質の配列を挿入し、ｐＢＥ２１１３への細胞間移行タンパク質（３ａ）を導入するプロセスを示す。 Ｙ１／Ｈ１：ＤｘｓｃＦｖ／Ｙ３（ＲＮＡ転写産物）又はＹ１／Ｈ１：ＤｘｓｃＦｖ／３ａ－ｓｔｏｐ（ＲＮＡ転写産物）の接種における野生型ベンタミアーナ及び３ａ形質転換ベンタミアーナでのＤｘｓｃＦｖの検出結果を示す。
　次に、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
（１）野生型供試植物の育成
　ベンタミアーナ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の育成を、以下の方法により行った。Ｊｉｆｆｙ－７（サカタのタネ）を吸水させた後、１ポットにつき２－３粒程度の種子を播種し、高温条件を保った。植物体の生育ステージをそろえるために、間引きを行い、植物体は、１２時間明条件（８，０００ｌｕｘ）、１２時間暗条件で生育させ、気温２８℃で育てた。その後は、植物体の成長に合わせて施肥した。
（２）ベクターの増殖に用いる植物の育成
　ＣｌＹＶＶベクターの増殖に用いるソラマメの育成には、培養土（三共）を用いた。４号鉢に土を入れ、十分に水を含ませ、種子を１粒播種した。出芽後、１０日たった植物体を、接種に用いた。
（３）接種試験
　接種には、播種後３－４週間ほど経過し、本葉が３－５枚展開したベンタミアーナ個体を使用した。接種源には、モザイクや縮葉などのウイルス病徴が見られる植物体の上葉の粗汁液、あるいは逆転写ＲＮＡを使用した。接種ステージに達した植物において、接種する葉全体にカーボランダム（Ｎａｃａｌａｉ－メッシュ６００－乾熱済み）を薄くふりかけた。ウイルス接種用粗汁液は、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）１ｍｌに、ＤＩＥＣＡ（Ｎ，Ｎジエチルジチオカルバミド酸ナトリウム（Ｗａｋｏ）、接種直前に添加）を終濃度１０ｍＭになるように加えて、接種源となる感染葉０．１ｇとともに、乳鉢で磨砕して調製した。
　接種用逆転写ＲＮＡは、後述する方法で合成し、その総量と等量の０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を加えて調製した。いずれの接種においても、ラテックス製指サックに接種液を塗布し、指先で葉の表面を軽くなでるように塗布した。接種後は、直ちに葉面から余分な粗汁液とカーボランダムを水洗し、翌日まで遮光した。０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液は、０．１Ｍリン酸水素カリウムと０．１Ｍリン酸二水素カリウムを混合し、ｐＨ８．０に調整したものを用いた。
（４）コンピテントセルの調製
　下記のＳＯＢ液体培地２ｍｌに、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株（ＴａＫａＲａ）を入れ、３７℃で１２～１４時間振盪培養した。ＳＯＢ液体培地５０ｍｌに、前培養液を０．５ｍｌ接種し、３７℃で約１時間半（ＯＤ５５０＝０．４～０．８）振盪培養した。氷上に１０分間静置した後、チューブに移し、３５００ｒｐｍ、４℃、１０分遠心した後、上清を捨て、氷冷した下記のＴＦＢ１７ｍｌで穏やかに懸濁した。
　氷上で２０分間静置した後、再び３５００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心した。上清を捨て、氷冷したＴＦＢ２ｍｌを加え、液面で沈殿を穏やかに懸濁した。氷上で３０分間静置した後、ＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド－Ｎａｃａｌａｉ）１５０μｌを一滴ずつゆっくり加え、再度、氷上で１０分間静置した。先太チップで、１．５ｍｌチューブに１００μｌずつ分注し、－８０℃で凍結保存した。
　ＳＯＢ液体培地は、ＢａｃｔｏＴＭ　Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）２０ｇ：ＢａｃｔｏＴＭ　Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）５ｇ：１Ｍ　ＮａＣｌ溶液１０ｍｌ、１Ｍ　ＫＣｌ溶液２．５ｍｌを混合し、蒸留水でメスアップし、１Ｌとした後、オートクレーブにより滅菌した。使用直前に濾過滅菌した１Ｍ　ＭｇＣｌ２　溶液（Ｎａｃａｌａｉ）と、１Ｍ　ＭｇＳＯ４　溶液（Ｎａｃａｌａｉ）を１／１００量加えて調製した。
　また、ＴＦＢ（形質転換緩衝液）は、３５ｍＭ酢酸カリウム（Ｎａｃａｌａｉ）、５０ｍＭ　ＣａＣｌ２（和光純薬）、４５ｍＭ　ＭｎＣｌ２（Ｎａｃａｌａｉ）、１００ｍＭ　ＲｂＣｌ（Ｎａｃａｌａｉ）、１５％　ショ糖（和光純薬）－酢酸（和光純薬）の組成でｐＨ５．８に調整し、濾過滅菌して調製した。
（５）形質転換
　緩やかに溶かしたコンピテントセル１００μｌに、プラスミド１μｌ（ライゲーション反応液の場合５μｌ程度）を加え、氷上で３０分間静置して混合した。４２℃のウォーターバスに４５秒間入れ、ヒートショックを行った後、直ちに氷冷し、大腸菌内に組換えプラスミドを導入した。下記の２ＹＴ液体培地を加え、３７℃で３０分間静置培養した。その後、３７℃で１時間振盪培養を行った。このうち、１００μｌを、下記のＬＢ－ａｍｐ培地に広げた。
　ブルーホワイトセレクションをする場合には、あらかじめ、２％Ｘ－ｇａｌ（５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（和光純薬）を、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（Ｎａｃａｌａｉ）で２％濃度に溶解）５０μｌ、１００ｍＭ　ＩＰＴＧ（イソプロピル－β－Ｄ（－）－チオガラクトピラノシド溶液（和光純薬）－濾過滅菌）１０μｌを、ＬＢ培地上に塗布した後、大腸菌培養液１００μｌを培地に播いた。１２～１６時間、３７℃のインキュベーター内で培養した。
　２ＹＴ液体培地は、ＢａｃｔｏＴＭ　Ｔｒｙｐｔｏｎｅ１６ｇ、ＢａｃｔｏＴＭ　Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ１０ｇ、ＮａＣｌ１０ｇを混合し、蒸留水でメスアップして１Ｌとし、オートクレーブして調製した。また、ＬＢ－ａｍｐ培地は、ＢａｃｔｏＴＭ　Ｔｒｙｐｔｏｎｅ１０ｇ、ＢａｃｔｏＴＭ　Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ５ｇ、ＮａＣｌ１０ｇ、Ａｇａｒ（Ｗａｋｏ）１５ｇを混合し、蒸留水でメスアップして１Ｌとした後、オートクレーブし、５０℃ぐらいに冷ましてから、５０ｍｇ／ｍｌアンピシリンストック（Ｗａｋｏ－濾過滅菌済み）を１／１０００量加え、固まる前に、滅菌シャーレに分注して調製した。
（６）プラスミド抽出
　濃度５０ｍｇ／ｍｌアンピシリンストック２μｌを加えた２ＹＴ液体培地２ｍｌの中に、形質転換によって得られた大腸菌のコロニーを、滅菌済み爪楊枝で、拾い入れ、３７℃で１２～１４時間振盪培養した。この培養液を１．５ｍｌチューブに入れ、１００００ｒｐｍで３分間遠心した。アスピレーターで、上清を取り除き、下記のＳｏｌｕｔｉｏｎ－１を１００μｌずつ加え、チューブミキサーで完全に懸濁した。これに、下記にＳｏｌｕｔｉｏｎ－２を２００μｌずつ加え、転倒混和した。
　次に、下記のＳｏｌｕｔｉｏｎ－３を、１５０μｌずつ加え、再び、転倒混和した。これを、１４０００ｒｐｍで４℃、５分間遠心し、上清をとってチューブに移し、もう一度遠心（１４０００ｒｐｍ　５分間）にかけ、タンパクを完全に除去した。上清を移し、回収した上清と同量のイソプロピルアルコール（Ｗａｋｏ）を加え、転倒混和した。１４０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨てた。８０％エタノール（Ｎａｃａｌａｉ）を５００μｌ加え、１４０００ｒｐｍ、５分間遠心し、上清を捨てた。ＲＮａｓｅＡを、ＴＥ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））で終濃度２μｇ／ｍｌに希釈して、５０μｌずつ加え、軽くミキサーにかけ、３７℃で３０分間静置した。
　これに、下記のＳｏｌｕｔｉｏｎ－４を、３０μｌ加え、ボルテックスミキサーで撹拌して、氷上で４５分間静置した。１４０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を捨てた。８０％エタノールを５００μｌ加え、１４０００ｒｐｍ、５分間遠心した。上清を捨て、５～１０分間減圧乾燥し、滅菌水３０μｌで懸濁した。このプラスミドサンプルは、－３０℃で保存した。
ａ）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ－１：
　２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ（２－アミノ－２－ヒドロキシメチル－１，３－プロパンジオール（Ｗａｋｏ）－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ（エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラアセティックアシッド／同仁化学）、５０ｍＭグルコース（Ｗａｋｏ）
ｂ）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ－２：
　０．２Ｎ　ＮａＯＨ（Ｗａｋｏ）、１％　ＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム－Ｎａｃａｌａｉ）
ｃ）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ－３：
　５Ｍ　酢酸カリウム溶液６０ｍｌ、酢酸１１．５ｍｌ、蒸留水２８．５ｍｌ
ｄ）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ－４：
　２０％ＰＥＧ＃６０００（ポリエチレングリコール－Ｎａｃａｌａｉ）、２．５Ｍ　ＮａＣｌ
（７）基本的な遺伝子操作の方法
１）制限酵素処理
　各メーカーの制限酵素０．５μｌと、その添付バッファーを使用し、１０μｌの反応系で、指定の温度下において、１時間以上静置した。
２）電気泳動
　目的のＤＮＡの長さに適した濃度のＴＢＥ（８９ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ｂａｓｅ、８９ｍＭホウ酸（Ｗａｋｏ）、２ｍＭ　ＥＤＴＡ）アガロース（Ｇｅｎｅ　ｐｕｒｅ（登録商標）ＬＥ　ＡＧＡＲＯＳＥ－ＢＭ）ゲルを用い、ＴＢＥを泳動緩衝液として、泳動を行なった。泳動後、エチジウムブロマイド溶液（終濃度０．５μｇ／ｍｌ）で染色した。
３）フェノールクロロホルム抽出
　サンプルＤＮＡ液に滅菌水を加え、１００μｌにし、５０μｌのＴＥ飽和フェノール（ニッポンジーン）と、５０μｌのクロロホルム（Ｗａｋｏ）を加え、チューブミキサーにかけて、１分撹拌して、タンパクを失活させた。１４０００ｒｐｍで、５分間遠心し、１．５ｍｌチューブに水層だけを移した。
４）エタノール沈殿
　サンプルＤＮＡ液１００μｌに、３Ｍ酢酸ナトリウム（ニッポンジーン）１０μｌ、１００％エタノール２５０μｌを加えて、撹拌して、１４０００ｒｐｍで、１０分間遠心し、上清を取り除いた。５００μｌの８０％エタノールを加え、１４０００ｒｐｍで、５分間遠心した。上清を取り除き、減圧風乾した。
５）クローニング
　ゲルからＤＮＡを回収する場合、ＳｅａＫｅｍ（登録商標）ＧＴＣ（登録商標）ａｇａｒｏｓｅ（ＢＭＡ）を使い、直接、ＥｔＢｒを終濃度０．５μｇ／ｍｌで入れたアガロースゲルを使用し、電気泳動を行った。目的のバンドを含むゲル片を切り出し、ＱＩＡＥＸ（登録商標）ＩＩ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ　１５０（ＱＩＡＧＥＮ）でＤＮＡを回収した。
　回収したＤＮＡ溶液を、フェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿した後、５μｌの滅菌水に懸濁した。ベクターとインサートのライゲーションには、ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　＜Ｍｉｇｈｔｙ　Ｍｉｘ＞（ＴａＫａＲａ）を使用した。回収したＤＮＡ溶液と、等量のＬｉｇａｔｉｏｎ　Ｍｉｘ液を加えて、懸濁した。１６℃で、３０分間静置した後、ライゲーション反応液５μｌを、Ｅ．ｃｏｌｉのコンピテントセルに形質転換した。
（８）感染性クローンのｉｎ　ｖｉｔｒｏ　転写
　アルカリ－ＳＤＳ法で抽出した感染性クローン４μｌを、ｒｕｎ－ｏｆｆ転写に用いる制限酵素で線状化し、フェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿をした後、得られたペレットを３．５μｌの滅菌水に懸濁した。転写反応液を、以下のように混合した。
（転写反応液）
テンプレート溶液　３．５μｌ
５０ｍＭ　ＤＴＴ　２μｌ
０．１％　ＢＳＡ　２μｌ
１０×Ｔ７　ＲＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｂｕｆｆｅｒ＊１１　２μｌ
２．５×Ｃａｐ／ＮＴＰ　ｍｉｘ＊１２　８μｌ
ＲＮａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ＊１３　０．５μｌ
Ｔ７　ＲＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　２μｌ
＊１１・・・Ｔ７　ＲＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）に添付
＊１２・・・２．５×Ｃａｐ／ＮＴＰ　ｍｉｘ（５ｍＭ　ｍ７　Ｇ（５’）ｐｐｐ　（５’）　Ｇ　ＲＮＡ　Ｃａｐｐｉｎｇ　Ａｎａｌｏｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、３．８ｍＭ　ＡＴＰ、３．８ｍＭ　ＣＴＰ、３．８ｍＭ　ＵＴＰ、０．８ｍＭ　ＧＴＰ－Ｒｏｃｈｅ）
＊１３・・・Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，ｓｏｌｎ（Ｗａｋｏ）
　３７℃で、２時間静置した。ＲＮＡの転写は、電気泳動で確認した。すぐに接種しない場合、転写産物は－８０℃で保存した。
（９）ＲＮＡ抽出
（フェノール－ＳＤＳ法）
　ＲＮＡ抽出バッファー５００μｌと、ＴＥ飽和フェノール５００μｌで、試料０．１ｇを磨砕して、１．５ｍｌチューブに移した。２０秒ほど、ボルテックスミキサーにかけ、１４０００ｒｐｍで、５分間冷却遠心した。上清（水層）を別のチューブに移し、上清と等量のフェノールクロロホルム（１：１）を加え、ボルテックスミキサーにかけて、激しく撹拌した後、１４０００ｒｐｍで、５分間冷却遠心した。上清を別のチューブに移し、白いタンパクの層がなくなるまで繰り返し、フェノールクロロホルム抽出を行った。最後に、等量のクロロホルムでリンスした後、水層をとりわけ、１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム、３倍量の１００％エタノールを加えた。
　ボルテックスをかけ、１４０００ｒｐｍで、５分間冷却遠心した。上清を捨て、８０％エタノール５００μｌを加え、１４０００ｒｐｍで、５分間冷却、遠心した。５～１０分間減圧乾燥後、ＲＮＡ用滅菌水５０μｌで懸濁し、１４０００ｒｐｍで、１分間ほど、遠心した。沈殿があった場合は、上清だけを、別のチューブに移しかえた。ＲＮＡ抽出バッファーは、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ　ＫＣｌ、１％　ＳＤＳの組成である。
（１０）ＲＴ－ＰＣＲ
１）逆転写反応
　以下に示す反応溶液を調製した。
ＲＮａｓｅ　Ｆｒｅｅ　ｄＨ２　Ｏ＊１５　７．５μｌ
２５ｍＭ　ＭｇＣｌ２　＊１５　４μｌ
ｅａｃｈ　１０ｍＭ　ｄＮＴＰ　Ｍｉｘｔｕｒｅ＊１５　２μｌ
１０×ＲＮＡ　ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ＊１５　２μｌ
ＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　０．５μｌ
３’プライマー　１μｌ
サンプルＲＮＡ　２μｌ
ＡＭＶ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　ＸＬ（ＴａＫａＲａ
）０．５μｌ
＊１５・・・ＲＮＡ　ＰＣＲＴＭ　ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．２．１（ＴａＫａＲ
ａ）に添付
　これを、４５℃で１時間静置した。その後、逆転写酵素を不活性化するため、これを、５分間ボイルし、５分間急冷した。
２）ＰＣＲ反応
　以下のようなＰＣＲミックスを調製した。
滅菌水　８．４μｌ
２５ｍＭ　ＭｇＣｌ２　＊１６　２μｌ
１０×ＬＡ　ＰＣＲＴＭ　ＢｕｆｆｅｒＩＩ（Ｍｇ２＋ｆｒｅｅ）＊１６　２μｌ
ｅａｃｈ　１０ｍＭ　ｄＮＴＰ　Ｍｉｘｔｕｒｅ　２μｌ
５’プライマー　０．２μｌ
３’プライマー　０．２μｌ
＊１６・・・ＴａＫａＲａ　ＬＡ　ＴａｑＴＭに添付
　これに、逆転写反応液５μｌを加え、更に、ＴａＫａＲａ　ＬＡ　ＴａｑＴＭ０．２μｌを加え、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を、１％アガロースゲルで電気泳動し、目的の断片が増幅されているのを確認した。
（１１）シークエンス
　プラスミドを鋳型に配列を確認する際には、アルカリ－ＳＤＳ法で抽出したサンプル１００ｎｇをシークエンス反応に用いた。また、ダイレクトシークエンスの際には、ゲル片から回収した目的のＤＮＡ１０ｎｇを、シークエンス反応に用いた。テンプレートＤＮＡに、プライマー１ｐｍｏｌ、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ１．１　Ｃｙｃｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を１．３μｌ、添付のバッファーを３．４μｌ加え、蒸留水で２０μｌとしたサンプルをシークエンス反応液とし、下の条件でＰＣＲをかけた。
９６℃　１分　　１サイクル
９６℃　１０秒
５０℃　５秒
６０℃　４分　　（９６℃　１０秒　→　６０℃　４分：３０サイクル）
１０℃　∞
　ＰＣＲ反応後、１００％エタノール６４μｌ、蒸留水１６μｌ加え、室温で１５分静置し、１４０００ｒｐｍで、１５分間遠心した。上清を取り除き、８０％エタノール２５０μｌ加え、１４０００ｒｐｍで、１０分間遠心した。上清を取り除き、減圧風乾した。ＨｉＤｉホルムアミド（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）２５μｌ加え、溶解した後、９５℃で３分間変成させ、急冷した。このサンプルを、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０　Ｇｅｎｉｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にセットし、配列を解析した。
（１２）ティシュプリント
　ろ紙を２枚平滑な面を上にし、その上に葉を置き、更に、平滑な面が葉側になるように、２枚ろ紙を重ね、ハンマーで叩き、葉の内容物をろ紙にブロットした。ろ紙が乾燥してから、プラスチック容器中に２％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を加えて、３０分間室温で振とうして、クロロフィルなどの色素を落とし、その後、ＰＢＳＴ－スキムミルク液（１０ｍＭ　ＮａＰＯ４（ｐＨ７．２）、０．９％　ＮａＣｌ、０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０、３％スキムミルク）を加えて、室温で３０分間振とうすることで、ブロッキング処理を施した。
　そのろ紙に、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）標識抗ＣＭＶ抗体を、５，０００倍希釈したＰＢＳＴ－スキムミルク液を加えて、３７℃で、１時間振とうして、抗体処理を行った。その後、ＰＢＳＴ－スキムミルク液で、５分間振とうしながら、洗浄し、それを、３回繰り返した。
　ＡＰバッファー（０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、０．１Ｍ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２）で、５分間振とうし、ろ紙にしみ込んだＰＢＳＴ－スキムミルク液を除き、更に、ＡＰバッファーを加えて、３０分間振とうして、緩衝液の交換が確実に行われるようにした。０．０３３％ニトロブルーテトラゾリウム（Ｗａｋｏ）と０．０１６５％　５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルリン酸（Ｗａｋｏ）を含むＡＰバッファー１０ｍｌを加えて、室温で振とうさせて発色させた。
（１３）ウエスタンブロット法
　葉重量の５倍量のＰＢＳ（１０ｍＭ　ＮａＰＯ４（ｐＨ７．２）、０．９％　ＮａＣｌ）で磨砕し、１２０００ｒｐｍで、５分間遠心し、上清を、別のチューブに分注して、下記の２×サンプルバッファーを、等量加えた。これを、５分間９５℃で、変性した後、５分間、室温で放置したサンプルを、泳動に用いた。泳動には、コンパクトＰＡＧＥ（アトー株式会社）を用いた。下記の１０×ランニングバッファー１０ｍｌに、蒸留水を９０ｍｌ加えたものを、泳動バッファーとして用いた。
　ｃ－ＰＡＧＥＬ（登録商標）電気泳動用既製ゲル１２．５％（アトー株式会社）で、泳動し、泳動終了後、コンパクトブロット（アトー株式会社）を使い、ＰＶＤＦメンブレン（ミリポア）へブロッティングした。ＰＶＤＦメンブレンは、事前にメタノールに数分浸した後、下記のブロッティングバッファーに浸しておいた。ブロッティング終了後、メンブレンをＰＢＳＴスキムミルクに入れ、３０分振とう後、ＰＢＳＴスキムミルク３ｍｌで下記の１次抗体１μｌを希釈し、１時間ハイブリバッグで反応させた。
　ＰＢＳＴスキムミルクで、３回洗浄し、ＰＢＳＴスキムミルク３ｍｌで、ＡＰ標識抗マウス抗体（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｇｏａｔ　Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ（Ｈ＋Ｌ）－ＡＰ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）１μｌを希釈し、１時間ハイブリバッグで反応させた。ＰＢＳＴスキムミルクで、２回、ＡＰバッファーで２回、洗浄後、０．０３３％ニトロブルーテトラゾリウムと０．０１６５％　５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルリン酸を含むＡＰバッファーにより、検出した。また、２次抗体にＨＲＰ標識抗マウス抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；ＥＣＬ　Ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ，ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ｌｉｎｋｅｄ　ｓｐｅｃｉｅｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｗｈｏｌｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　（ｆｒｏｍ　ｓｈｅｅｐ））又は、ＨＲＰ標識ウサギ抗体（Ｓｉｇｍａ；ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ（Ｗｈｏｌｅ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ））を用いる際には、ＥＣＬ－ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア）を使用した。
　１次抗体は、ＤｘｓｃＦｖの検出には、抗Ｈｉｓ－Ｔａｇ抗体（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｈｉｓ・Ｔａｇ（登録商標）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　０．２ｍｇ／ｍｌ）を、ＤＨＦＲの検出には、抗ＦＬＡＧ抗体（ＳＩＧＭＡ、ＡＮＴＩ－ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）を用いた。ＣＭＶの検出には、抗ＣＭＶ－ｃｐ抗体（日植防）を用いた。
　２×サンプルバッファー：０．２５Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）２５ｍｌに２－メルカプトエタノール５ｍｌ、ＳＤＳ２ｇ、Ｓｕｃｒｏｓｅ５ｇ、Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ　Ｂｌｕｅ２μｇ加え、蒸留水で５０ｍｌとした。１０×ランニングバッファー：Ｔｒｉｓ１５．１４ｇ、Ｇｌｙｃｉｎｅ７２．０６７ｇ、ＳＤＳ５ｇに、蒸留水を加え、５００ｍｌとした。ブロッティングバッファー：Ｔｒｉｓ０．６０４ｇ、Ｇｌｙｃｉｎｅ２．８８ｇ、メタノール４０ｍｌに、蒸留水を加え、２００ｍｌとした。
（１４）ＣＭＶ－Ｙ　３ａタンパク質の非発現ウイルスの作出　
　３ａ遺伝子を欠くベクター（３ａ－Ｓｔｏｐ）を作出するために、ｐＣＹ３の３ａタンパク質の４番目のアミノ酸グルタミンをコードするＣＡＡコドンを、終止コドンであるＴＡＡコドンに置換した。図１に、導入のプロセスを示す。ｐＣＹ３を鋳型として、Ｙ３－Ｔ７－５Ｂｍプライマーと３ａ－Ｓｔｏｐ－３プライマー、３ａ－Ｓｔｏｐ－５プライマーとＹ３－３Ｈｉｎｄプライマーで、それぞれ、ＰＣＲ反応を行った。
　両ＰＣＲ産物の増幅を確認後、１μｌずつ混合した液を鋳型として、Ｙ３－Ｔ７－５Ｂｍプライマーと、Ｙ３－３Ｈｉｎｄプライマーで、再度、ＰＣＲし、産物のサイズを、泳動で確認した。この産物を、ＢａｍＨＩ，ＨｉｎｄＩＩＩで処理し、ｐＣＹ３のＢａｍＨＩ，ＨｉｎｄＩＩＩサイトにクローニングすることで、３ａ遺伝子を欠くベクターを作出した。
（１５）ＣＭＶ－Ｙ　ＲＮＡ２への外来遺伝子ＤＨＦＲの導入
　Ｃ２－Ｈ１ベクター（Ｐｌａｎｔａ　ｖｏｌ．２２５　２７７－２８６，２００７）のＳｔｕＩサイトとＭｌｕＩ領域に、ＤＨＦＲの配列を挿入した。図２に、Ｃ２－Ｈ１ベクターへの外来遺伝子（ＤＨＦＲ）の導入のプロセスを示す。ＰＲＯＴＥＩＯＳ　Ｐｌａｍｉｄ　ｓｅｔ（東洋紡）のｐＥＵ－ＤＨＦＲを鋳型として、ＤＨＦＲ５プライマーと、ＤＨＦＲ－３Ｆｌｇプライマーを用いて、ＰＣＲすることで、ＤＨＦＲの３‘末端に、ＦＬＡＧタグとＭｌｕＩサイトを有するＤＨＦＲ遺伝子が得られる。これを、ＭｌｕＩで処理し、Ｃ２－Ｈ１ベクターのＳｔｕＩサイトとＭｌｕＩサイトへ、クローニングした。
（１６）ＣＭＶ－Ｙ　ＲＮＡ２への外来遺伝子ＤｘｓｃＦｖの導入
　Ｃ２－Ｈ１ベクターのＳｔｕＩサイトとＭｌｕＩ領域に、ＤｘｓｃＦｖの配列を挿入した。図３に、ＣＭＶ－Ｙ　ＲＮＡ２への外来遺伝子（ＤｘｓｃＦｖ）の導入のプロセスを示す。ｐＢＥ２１１３－ＤｘｓｃＦｖをテンプレートとして、ＰＣＲを行い、ＤｘｓｃＦｖ　ＯＲＦの５′にＳｔｕＩサイトを、３′にＭｌｕＩサイトを付加した。次に、Ｃ２－Ｈ１ベクターのＳｔｕＩ－ＭｌｕＩ領域に、ＤｘｓｃＦｖ断片をクローニングし、Ｈ１：ＤｘｓｃＦｖを構築した。
（１６）ＰＶＸ－３ａベクター及びＣｌＹＶＶ－３ａベクターによる３ａタンパク質の供給
　ＰＶＸベクター（Ｐｌａｎｔ　Ｊ　ｖｏｌ．７　１０４５－１０５３，１９９５）のＣｌａＩサイトとＳａｌＩサイト領域に、ＣＭＶ－Ｙ由来の３ａタンパク質配列を挿入した。ｐＣＹ３を鋳型に、Ｙ３ａ－５ＣｌプライマーＧＣＡＴＣＧＡＴＡＴＧＧＣＴＴＴＣＣＡＡＧＧＴＡＣＣＡＧと、Ｙ３ａ－３ＸｈプライマーＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＴＡＡＡＧＡＣＣＧＴＴＡＡＣＣＡＣＣＴでＰＣＲすることで、ＣｌａＩとＸｈｏＩサイトを有する３ａ遺伝子断片を得た。
　これを、ＣｌａＩ，ＸｈｏＩで処理し、ＰＶＸベクターのＣｌａＩ，ＸｈｏＩサイトへクローニングした。得られたプラスミドを、ＳｐｅＩで処理し線状化し、ＣＭＶのクローンと同様に転写して、接種に用いた。また、ＣｌＹＶＶベクター（Ｊ　Ｇｅｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｐａｔｈｏｌ　ｖｏｌ．６９　３２７－３３４，２００３）のＥｃｏＲＩサイトとＳａｌＩサイト領域に、ＣＭＶ－Ｙ３ａ由来の３ａタンパク質配列を挿入した。
　ｐＣＹ３を鋳型に、Ｙ３ａＬｅｃｏプライマーＧＧＣＴＴＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＴＴＴＣＣＡＡＧＧＴＡＣＣと、Ｙ３ａＲｓａｌプライマーＣＡＧＧＴＴＧＴＣＧＡＣＡＡＧＡＣＣＧＴＴＡＡＣＣＡＣＣＴＧでＰＣＲすることで、ＥｃｏＲＩとＳａｌＩサイトを有する３ａ遺伝子断片を得た。これを、ＣｌＹＶＶベクターのＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩサイトへクローニングした。
　このＣｌＹＶＶベクターは、３５Ｓプロモーターを有することから、接種は、プラスミドを直接ソラマメの葉にカーボランダムでこすりつけることで行った。ウイルスの病徴が確認された上位葉を、接種源として用いた。
　図４に、ＣｌＹＶＶ－３ａ／Ｙ１／Ｙ２／３ａ－Ｓｔｏｐ及びＰＶＸ－３ａ／Ｙ１／Ｙ２／３ａ―Ｓｔｏｐを用いたティッシュプリントの結果を示す。前者は、ＣｌＹＶＶ－３ａの感染葉を用いて、野生型ベンタミアーナに接種し、接種３週間程度経過してから、Ｙ１／Ｙ２／３ａ－Ｓｔｏｐの転写ＲＮＡを接種し、１０日後に、ティッシュプリントにより、ＣＭＶを検出した。
　後者は、それぞれの転写ＲＮＡを混合接種し、５日後に、ティッシュプリントにより、ＣＭＶを検出した。また、図５に、ＰＶＸ－３ａ／Ｙ１／Ｈ１：ＤＨＦＲ（あるいはＨ１：ＤｘｓｃＦｖ）／３ａ―ＳｔｏｐのＲＮＡ転写産物を野生型ベンタミアーナに混合接種し、６～１２日後にウエスタンブロットにより、ＤＨＦＲ及びＤｘｓｃＦｖを検出した結果を示す。いずれの結果からも、３ａがトランスに供給されて、外来タンパク質が、ウイルスベクター接種植物体の上葉において、発現することを示している。
　３ａ遺伝子を欠くＣＭＶが、再び３ａを獲得していないことを確認するために、上位葉からＲＮＡを抽出し、Ｙ３－Ｔ７－５Ｂｍプライマーと、Ｙ３－３Ｈｉｎｄプライマーを用いて、ＲＴ－ＰＣＲを行うことで、ＣＭＶの３ａ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。この断片とＹ３－Ｔ７－５Ｂｍプライマーでダイレクトシークエンスを行い、変異を導入した部位の配列を調べ、終止コドンが維持されていることを確認した。
（１７）３ａタンパク質形質転換ベンサミアーナの作出
　植物発現用ベクターであるｐＢＥ２１１３（ｐｌａｎｔ　ｃｅｌｌ　ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　ｖｏｌ．３７　４９－５９，　１９９６）のＸｂａＩサイトとＳａｃＩ領域にＣＭＶ－Ｙ３ａ由来の３ａタンパク質配列を挿入した。図６に、ｐＢＥ２１１３への細胞間移行タンパク質（３ａ）の導入のプロセスを示す。
　ｐＣＹ３をテンプレートとして、ＰＣＲを行い、ＰＣＲ増幅産物（約８４０ｂｐ）を、ｐＧＥＭ－ＴＥａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に導入した。次に、ＳｐｅＩ及びＳａｃＩ領域で、制限酵素処理を行って得られた３ａ断片を、ｐＢＥ２１１３のＸｂａＩ及びＳａｃＩ領域に導入して、植物発現用ベクターｐＢＥ２１１３－３ａを作出した。
　これを、凍結溶解による直接導入法によって、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＬＢＡ　４４０４（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に導入した。具体的には、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＬＢＡ　４４０４を、５０ｍＬのＬＢ液体培地中（１％　Ｂａｃｔｏ　ｔｒｙｐｔｏｎｅ　，０．５％　Ｂａｃｔｏ　Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔｓ，１％塩化ナトリウム）で、Ａ６００の吸光値が、約１．０になるまで、２８℃で、振盪培養した後、氷上で冷却して、４℃で、３０００ｇの遠心分離を行い、集菌した。
　菌体は、１ｍＬの氷冷した２０ｍＭ塩化カルシウム溶液に浮遊させ、これを、０．１ｍＬ毎にエッベンドルフチューブに分注した。これに、組換えプラスミドｐＢＥ２１１３－３ａを、１μｇを加え、液体窒素中で、急速に凍結した。次に、得られた凍結細胞を、３７℃で溶解した後、５分間静置した。
　これに、１ｍＬのＬＢ培地を加え、２８℃で、２～４時間振盪培養を行った後、約１００００ｇで、１分間、遠心分離を行い、集菌して、０．１ｍＬのＬＢ培地に浮遊させた。リファンピシン（１００μｇ／ｍＬ）、カナマイシン（２５μｇ／ｍＬ）及びストレプトマイシン（３００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ固形培地に、菌体を接種した。２～３日間、２８℃で培養して、ｐＢＥ２１１３－３ａが組み込まれた形質転換菌を得た。
　ｐＢＥ２１１３－３ａを組み込んだＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＬＢＡ　４４０４は、ＬＢ液体培地で、２８℃下で、振盪培養後、４℃で、３０００ｇの遠心分離を行い、集菌して、ＭＳ液体培地〔Ｐｈｙｓｉｏｌ，Ｐｌａｎｔ．１５：４７３（１９６２）〕中に浮遊させ、これを、植物の形質転換操作に用いた。形質転換操作は、上述した組換えアグロバクテリウムを用いて、リーフティスク法により行った。
　ベンタミアーナ葉を、１％次亜塩素酸ナトリウム溶液で、１５分間殺菌し、滅菌蒸留水で、６回洗浄した。この葉から、殺菌したコルクボーラーで直径約１ｃｍの円形状にくり抜き、リーフディスクとした。このディスクを、上記で作出したｐＢＥ２１１３－３ａを保有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＬＢＡ　４４０４のＭＳ液体培地懸濁液に１５分間浸した。
　この後、ＭＳ固形培地〔３％蔗糖、Ｂ５ビタミン、０．８％寒天を含む（ｐＨ５．７）、ＢＡＰ（６－ベンジルアミノプリン）１ｍｇ／Ｌ、ＮＡＡ（ナフタレン酢酸）０．１ｍｇ／Ｌ〕上で、２８℃で３日間培養後、ディスクを、抗生物質カナマイシン５０μｇ／ｍＬ及びカーベニシリン５００μｇ／ｍＬ（いずれもシグマ社製）を含むＭＳ液体培地で洗浄した。洗浄後のディスクは、上記抗生物質を含むＭＳ固形培地（３％　蔗糖を含む）上で、２５℃下、２週間毎に継代培養した（１６時間照明、８時間暗期）。培養４～８週間目に、ディスク表面上に、カルスが形成され、更に、継代培養することにより、シュートが誘導された。
　このシュートを根本から切り取り、ホルモンを含まないＭＳ固形培地〔３％蔗糖、カナマイシン５０μｇ／ｍＬ、カーベニシリン５００μｇ／ｍＬを含む（ＰＨ５．７）〕上に移植し、培養した。２～４週間後に発根してきた植物体は、培養土を入れたポットに移植し、閉鎖系組換え温室の中で、栽培して、次世代（Ｔ１）種子を得た。
（１８）供試形質転換植物の育成
　上記で得た３ａ形質転換植物体のＴ１種子を、滅菌水で給水し、４日間４℃で低温処理を行った後、０．０２％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を添加した１．５％の次亜塩素酸ナトリウム溶液で、５分間、種子表面を滅菌した後、１２５ｍｇ／ｍｌカナマイシンを含む１／２ＭＳ培地〔１％蔗糖、Ｂ５ビタミン、１％寒天を含む（ｐＨ５．７）〕に無菌播種を行い、２２℃で７－１０日間培養後、カナマイシン耐性を示す芽生えを選抜して、Ｊｉｆｆｙ－７に移植し、閉鎖系組換え温室の中で栽培した。
（１９）３ａタンパク質形質転換ベンタミアーナからの３ａタンパク質の供給によるＤｘｓｃＦｖの発現
　プラスミドＨ１：ＤｘｓｃＦｖを鋳型にｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写し、ｐＣＹ１、ｐＣＹ３あるいは３ａ－ＳｔｏｐのＲＮＡ転写産物とともに、野生型ベンタミアーナあるいは３ａトランスジェニックベンタミアーナに接種し、接種５日後の接種葉及び１３日後の接種葉及び上葉のＤｘｓｃＦｖ発現をウエスタンブロット法を用いて検出した。図７に、Ｙ１／Ｈ１：ＤｘｓｃＦｖ／Ｙ３（ＲＮＡ転写産物）、又はＹ１／Ｈ１：ＤｘｓｃＦｖ／３ａ－ｓｔｏｐ（ＲＮＡ転写産物）の接種における野生型ベンタミアーナ及び３ａ形質転換ベンタミアーナでのＤｘｓｃＦｖ検出結果を示す。
（２０）結果
　接種後５日目の接種葉及び１３日目の接種葉及び上葉のＤｘｓｃＦｖの発現を、ウエスタンブロット法で検出した結果、Ｙ１／Ｈ１：ＤｘｓｃＦｖ／３ａ－ｓｔｏｐ（ＲＮＡ転写産物）を接種した３ａ形質転換体において、接種葉では、わずかに発現が認められ、上葉では、非常に高い発現量のＤｘｓｃＦｖが検出された。
　以上詳述したように、本発明は、非拡散植物ウイルスベクターに係るものであり、本発明により、無秩序に宿主植物に感染し、意図せぬ組換えウイルスの拡散リスクを回避することができる非拡散植物ウイルスベクターを提供することができる。また、本発明は、ウイルス増殖に必要な遺伝子を導入した組換え植物においてのみ、ウイルスベクターの感染増殖が可能であるため、意図せぬウイルスの拡散を回避できる新しい組換え植物のシステムを提供することができる。また、本発明は、単独では、拡散、伝播できないが、植物体への全身移行に必要なタンパク質遺伝子を別に導入することで、全身感染が可能になり、ベクターとして機能させることができる、非拡散植物ウイルスベクターを提供することができる。また、本発明は、野外等で使用しても、植物ウイルスベクターの拡散が起こらないため、植物ウイルスベクターの利用範囲が飛躍的に拡大する。本発明は、植物ウイルスベクターを使用して組換え植物体を作出しても、ウイルスベクターの増殖、他植物体への伝播は起きないことから、安全性を確保して、植物ウイルスベクターの利用を図ることを実現可能にするものとして有用である。

Claims (14)

  1. 　キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ゲノムの細胞間移行に係る遺伝子を欠落させた非拡散植物ウイルスベクターであって、上記細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換植物体に対する選択的・特異的感染及び増殖を成立させる作用を有することを特徴とする植物ウイルスベクター。
  2. 　上記植物ウイルスベクターが、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の植物体での細胞間移行に必要な３ａタンパク質をコードするＲＮＡ３遺伝子を欠落させた３ａ遺伝子産物を発現しないＣＭＶベクターである、請求項１に記載の植物ウイルスベクター。
  3. 　上記細胞間移行に係る遺伝子を外来遺伝子として導入していない植物体では、感染及び増殖が成立しない、請求項１又は２に記載の植物ウイルスベクター。
  4. 　キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ゲノムの細胞間移行に係る遺伝子を欠落させた非拡散植物ウイルスベクターと、欠落させた当該細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換植物体とを組み合わせて、上記非拡散植物ウイルスベクターを、上記形質転換植物体に対する選択的・特異的感染及び増殖を成立させることを特徴とする植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現システム。
  5. 　上記細胞間移行に係る遺伝子が、植物体の細胞間の原形質連絡糸の拡大あるいはウイルスゲノムとの結合によりウイルスの移行に関与する遺伝子である、請求項４に記載の植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現システム。
  6. 　上記キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ゲノムの細胞間移行に係る遺伝子を欠落させた非拡散植物ウイルスベクターが、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の植物体での細胞間移行に必要な３ａタンパク質をコードするＲＮＡ３遺伝子を欠落させた３ａ遺伝子産物を発現しないＣＭＶベクターである、請求項４又は５に記載の植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現システム。
  7. 　上記細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換植物が、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の植物体での細胞間移行に必要な３ａタンパク質をコードするＲＮＡ３遺伝子を導入した形質転換体である、請求項４に記載の植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現システム。
  8. 　上記細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換体が、上記細胞間移行に係る遺伝子を外来遺伝子として挿入した組換えベクターを導入した形質転換体である、請求項４に記載の植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現システム。
  9. 　上記非拡散植物ウイルスベクターが、上記細胞間移行に係る遺伝子を外来遺伝子として導入していない植物体では感染及び増殖が成立しない、請求項４に記載の植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現システム。
  10. 　キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ゲノムの細胞間移行に係る遺伝子を欠落させた非拡散植物ウイルスベクターと、欠落させた当該細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換植物体とを組み合わせて、上記非拡散植物ウイルスベクターを、上記形質転換植物体に対して選択的・特異的に感染及び増殖させることを特徴とする植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現方法。
  11. 　上記キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ゲノムの細胞間移行に係る遺伝子を欠落させた非拡散植物ウイルスベクターが、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の植物体での細胞間移行に必要な３ａタンパク質をコードするＲＮＡ３遺伝子を欠落させた３ａ遺伝子産物を発現しないＣＭＶベクターである、請求項１０に記載の植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現方法。
  12. 　上記細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換植物が、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の植物体での細胞間移行に必要な３ａタンパク質をコードするＲＮＡ３遺伝子を導入した形質転換体である、請求項１０に記載の植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現方法。
  13. 　上記細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換体が、上記細胞間移行に係る遺伝子を外来遺伝子として挿入した組換えベクターを導入した形質転換体である、請求項１０に記載の植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現方法。
  14. 　上記非拡散植物ウイルスベクターが、上記細胞間移行に係る遺伝子を外来遺伝子として導入していない植物体では感染及び増殖が成立しない、請求項１０に記載の植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現方法。
     
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005001102A1 (ja) * 2003-06-27 2005-01-06 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology 植物ウィルスベクター

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR0108711A (pt) * 2000-02-28 2004-06-22 Chiron Spa Expressão heteróloga de proteìnas de neisseria
JP4152320B2 (ja) * 2001-09-28 2008-09-17 協和醗酵工業株式会社 アミノ酸の製造法
ES2531125T3 (es) 2003-02-03 2015-03-10 Ibio Inc Sistema para la expresión de genes en plantas
JP4501526B2 (ja) * 2004-05-14 2010-07-14 住友化学株式会社 高熱伝導性樹脂組成物
EP1616959A1 (en) 2004-07-07 2006-01-18 Icon Genetics AG Biological safe transient protein expression in plants

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005001102A1 (ja) * 2003-06-27 2005-01-06 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology 植物ウィルスベクター

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
COOPER, B. ET AL.: "Cell-to-cell transport of movement-defective cucumber mosaic and tobacco mosaic viruses in transgenic plants expressing heterologous movement protein genes", VIROLOGY, vol. 216, 1996, pages 208 - 213, XP008144009 *
MATSUO, K. ET AL.: "Development of Cucumber mosaic virus as a vector modifiable for different host species to produce therapeutic proteins", PLANTA, vol. 225, 2007, pages 277 - 286, XP019460700 *
MITSUGU HOTTA ET AL.: "Virus Vector o Mochiita Kokoritsu Hatsugen System no Kaihatsu", PREPRINTS OF BIOTECHNOLOGY SYMPOSIUM, vol. 25, - 6 November 2007 (2007-11-06), pages 95 - 96, XP008143974 *
NAGANO, H. ET AL.: "Conversion in the requirement of coat protein in cell-to-cell movement mediated by the cucumber mosaic virus movement protein", J.VIROL., vol. 75, no. 17, 2001, pages 8045 - 8053, XP008143941 *
NAGANO, H. ET AL.: "Deletion of the C-terminal 33 amino acids of cucumber mosaic virus movement protein enables a chimeric brome mosaic virus to move from cell to cell", J.VIROL., vol. 71, no. 3, 1997, pages 2270 - 2276, XP008143949 *
NAGANO, H. ET AL.: "The cognate coat protein is required for cell-to-cell movement of a chimeric brome mosaic virus mediated by the cucumber mosaic virus movement protein", VIROLOGY, vol. 265, 1999, pages 226 - 234, XP004439664 *
See also references of EP2316938A4 *
SUZUKI, M. ET AL.: "Functional analysis of deletion mutants of cucumber mosaic virus RNA3 using an in vitor transcription system", VIROLOGY, vol. 183, 1991, pages 106 - 113, XP026368703 *
ZHAO, Y. ET AL.: "Development and evaluation of a complementation-dependent gene delivery system based on cucumber mosaic virus", ARCH. VIROL., vol. 145, 2000, pages 2285 - 2295, XP001098612 *

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