WO2009142307A1 - 目的ペプチドの血漿中半減期延長作用を有するペプチド - Google Patents

目的ペプチドの血漿中半減期延長作用を有するペプチド Download PDF

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なおみ 若林
聖児 佐藤
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    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin

Definitions

  • the present invention improves the pharmacokinetics of the target peptide and provides therapeutic utility by imparting the pharmacokinetics suitable for the therapeutic purpose.
  • the pharmacokinetics of the peptide are improved and the target peptide has physiological activity.
  • the present invention relates to a complex peptide, a pharmaceutical composition containing the complex peptide, and a method for producing the complex peptide.
  • Non-Patent Documents 3 to 5 when a physiologically active peptide with a short half-life is to be applied as a pharmaceutical, an attempt has been made to bring the half-life of the physiologically active peptide closer to the half-life of this protein by binding to a protein with a long half-life.
  • Non-patent Document 6 The target physiologically active peptide and the protein are bound through a spacer having a binding group to serum albumin (Non-patent Document 6). Therefore, in order to put a physiologically active peptide with a short half-life into practical use, the pharmacokinetics was improved by adding a substance capable of extending the half-life, and the conventional technique could not show a therapeutic effect.
  • Bioactive peptides are expected to be applied to medicine. Attempts to modify bioactive peptides with a short half-life and apply them as pharmaceuticals have been widely made so far, and attempts have been made to stabilize peptides, to make them durable by formulation ingenuity, etc. Examples of successful conversion are also known.
  • Ghrelin is a hormone discovered from the stomach in 1999, has an amino acid sequence consisting of 28 residues, and the third amino acid from the amino terminus of this sequence is acylated with a fatty acid. It is a peptide having a structure (Non-patent Document 6, Patent Document 1). Ghrelin acts on the growth hormone secretagogue-receptor 1a (GHS-R1a) (Non-patent document 7) and enhances the secretion of growth hormone (GH) from the pituitary gland. It is a tube hormone (Non-patent Document 7). Ghrelin was isolated and purified for the first time from rats as endogenous GHS for GHS-R1a.
  • Non-Patent Document 8 ghrelin having a similar primary structure has been isolated, and their amino acid sequences are known.
  • All of the above ghrelin is a peptide having a specific structure in which the side chain hydroxyl group of the serine residue or threonine residue at position 3 is acylated with a fatty acid such as octanoic acid or decanoic acid.
  • a physiologically active peptide having a structure isolated from a living body other than ghrelin.
  • Recent studies also show that ghrelin enhances appetite, increases body weight and body fat by subcutaneous administration (Non-Patent Documents 9 to 11), and improves cardiac function.
  • Non-Patent Documents 12 to 14 ghrelin has a GH secretion promoting action and an appetite enhancing action, and the action of GH to burn fat and convert it to energy, or the anabolic action of GH to enhance muscle strengthening Therefore, it is expected to be effectively extracted (Non-patent Document 15).
  • the active center of ghrelin is an N-terminal part having an acyl group (Patent Document 1), there are many unclear points regarding the physiological significance of the C-terminal part.
  • the present invention is a peptide having an action of extending the half-life of a physiologically active peptide that was not suitable as a pharmaceutical due to its short half-life in plasma, and has an increased plasma half-life while having the physiological activity of the target peptide It aims at providing the manufacturing method of the composite peptide which can be utilized as a pharmaceutical by this, the said composite peptide, etc.
  • the present inventors have a peptide having a desired physiological activity that has had a short half-life in plasma and had to be continuously infused intravenously or subcutaneously for application as a pharmaceutical (hereinafter referred to as a target peptide).
  • a target peptide By trying to develop a peptide capable of extending plasma half-life by adding to the amino acid sequence, an amino acid sequence serving as a half-life extending motif was found at the C-terminal part of the amino acid sequence of ghrelin.
  • a peptide having an amino acid sequence capable of extending the half-life is referred to as a half-life extending peptide.
  • the half-life extending peptide by binding the half-life extending peptide to the N-terminal side, C-terminal side or both ends of the target peptide (for example, atrial natriuretic peptide (ANP), C-type natriuretic peptide (CNP), motilin, etc.) It has been found that the half-life in plasma can be extended while retaining the physiological activity of the target peptide.
  • a peptide obtained by binding a half-life extending peptide to a target peptide and retaining the physiological activity of the target peptide while having a longer half-life in plasma than the target peptide is referred to as a complex peptide. Called.
  • the amino acid sequence of the half-life extending peptide is not only based on the natural amino acid sequence, but also the reverse sequence in which the N-terminal and C-terminal are reversed, or the N-terminal and C-terminal are partially reversed. It has been found that the present invention can be used even when it is based on a sequence.
  • the complex peptide has resistance to an enzyme that degrades the target peptide (for example, Neutral Endopeptidase) and, like the natural target peptide, does not exhibit antigenicity even when it is repeatedly administered. It was found that it can be used.
  • the peptide when a natural-type target peptide and a complex peptide are administered to an individual at the same dose and usage, even if the target peptide alone does not provide sufficient target physiological effects, the peptide has a half-life. It has been found that by binding an extended peptide to extend the half-life, the target physiological action can be sufficiently exhibited in the living body. Thereby, it was shown that the suitability as a pharmaceutical can be imparted by the usage not based on continuous infusion.
  • the half-life-extending peptide according to the present invention by adding the half-life-extending peptide according to the present invention to the target peptide that had been required to be administered intravenously or subcutaneously due to its short half-life, bolus administration is possible, and the natural target peptide In comparison, it was found that the target activity can be easily obtained with the complex peptide.
  • the present invention has been completed based on the above findings and relates to the following matters.
  • Item 1 The following peptide (I) or (II) (I) represented by the formula: B, AB, BC, or ABC, wherein A, B, and C are the following ( As shown in 1), (2), and (3), when bound to another target peptide, it retains the physiological activity of the target peptide and is reduced by half in plasma compared to the target peptide.
  • Peptide (II) capable of extending the phase (I) Sequence opposite to peptide of (I), (I) represented by AB and A or B reversed, (I) represented by BC and B Or a peptide in which C is an inverted sequence, or a peptide represented by ABC in (I) and comprising A, B, C, A and B, B and C, or A and C in an inverted sequence
  • A is a peptide composed of any amino acid of 1 to 14
  • C is a peptide comprising any amino acid of 2 to 14 Item 2.
  • C comprises a 4 to 9 amino acid sequence capable of taking an ⁇ -helix structure.
  • Item 5 The peptide according to Item 4, wherein C has a Pro sequence between its terminal and an amino acid sequence capable of taking an ⁇ -helical structure.
  • A is one or more amino acid sequences of amino acid numbers 1 to 4 consecutive to B in SEQ ID NO: 34, or an amino acid in which one or several amino acids are deleted, substituted, and / or added in this amino acid sequence
  • Sequence B is an amino acid sequence of amino acid numbers 5 to 9 in SEQ ID NO: 34, or an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, and / or added in this amino acid sequence
  • C is one or more amino acid sequences of amino acid numbers 10 to 17 consecutive to B in SEQ ID NO: 34, or an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, and / or added in this amino acid sequence .
  • A is one or more amino acid sequences of amino acid numbers 1 to 8 consecutive to B in SEQ ID NO: 67, or an amino acid in which one or several amino acids are deleted, substituted, and / or added in this amino acid sequence
  • An array B is an amino acid sequence of amino acid numbers 9 to 13 in SEQ ID NO: 67, or an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, and / or added in this amino acid sequence
  • C is one or more amino acid sequences of amino acid numbers 14 to 17 consecutive to B in SEQ ID NO: 67, or an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, and / or added in this amino acid sequence .
  • Item 7 Formula: represented by B, wherein B is amino acid numbers 5 to 9 in SEQ ID NOs: 34, 36, 39 to 41, 47, 48, 50, 53 to 57; amino acid numbers 4 to 8 in SEQ ID NOs: 35, 37, 38, 42 to 46, 49, 52; And amino acid numbers 2-6 in SEQ ID NOs: 58-60, amino acid numbers 3-6 in SEQ ID NOs: 61, 62, amino acid numbers 3-7 in SEQ ID NOs: 63-65, and amino acid numbers 1-3 in SEQ ID NO: 66 Item 7.
  • Item 7. The peptide according to Item 6, represented by the formula: ABC, wherein A, B, and C are the same as Item 8.
  • B is amino acid numbers 9 to 13 in SEQ ID NOs: 67 to 87, amino acid numbers 15 to 19 in SEQ ID NO: 91, amino acid numbers 8 to 11 in SEQ ID NO: 94, amino acid numbers 8 to 12 in SEQ ID NO: 96, and amino acids in SEQ ID NO: 99 Item 7.
  • Item 7. The peptide according to Item 6, represented by the formula ABC, wherein A, B, and C are the same as Item 11.
  • Item 7 The peptide according to Item 6, which is a sequence selected from the group consisting of amino acid numbers 2 to 6 in SEQ ID NOs: 58 to 60.
  • Item 14 Formula: represented by AB or BC, wherein B is amino acid numbers 5 to 9 in SEQ ID NOs: 34, 36, 39 to 41, 47, 48, 50, 53 to 57, amino acid numbers 4 to 8 in SEQ ID NOs: 35, 37, 38, 42 to 46, 49, 52, And a sequence selected from the group consisting of amino acid numbers 2 to 6 in SEQ ID NOs: 58 to 60, A sequence comprising at least one amino acid continuous from the C-terminal side of amino acid numbers 1 to 4 in SEQ ID NOs: 34, 36, 39 to 41, 47, 48, 50, 53 to 57, SEQ ID NOs: 35, 37, 38, A sequence consisting of at least one amino acid continuous from the C-terminal side of amino acid numbers 1 to 3 in 42 to 46, 49, 52, a sequence selected from the group consisting of amino acid numbers 1 in SEQ ID NOs: 58 to 60, A sequence comprising at least one amino acid continuous from the N-terminal side of amino acid numbers 10 to 17 in SEQ ID
  • the peptide according to Item 6 which is a sequence selected from the group consisting of a sequence consisting of at least one amino acid continuous from the C-terminal side of amino acid numbers 7 to 20 in Item 15.
  • Item 15 The peptide according to Item 14, represented by the formula ABC, wherein A, B, and C are the same as Item 14.
  • B is a sequence selected from the group consisting of amino acid numbers 9 to 13 in SEQ ID NOs: 67 to 87, amino acid numbers 8 to 12 in SEQ ID NO: 90, and amino acid numbers 15 to 19 in SEQ ID NO: 91 .
  • Item 7. The peptide according to Item 6, represented by the formula ABC, wherein A, B and C are the same as Item 17.
  • Item 20 Formula: represented by AB or BC, wherein B is from the group consisting of amino acid numbers 5-9 in SEQ ID NOs: 34,36,39-41,47,48,50 and amino acid numbers 4-8 in SEQ ID NOs: 35,37,38,42-46,49,52
  • An array to be selected A sequence comprising at least one amino acid continuous from the C-terminal side of amino acid numbers 1 to 4 in SEQ ID NOs: 34, 36, 39 to 41, 47, 48, 50, and SEQ ID NOs: 35, 37, 38, 42 to 46 , 49, 52, a sequence selected from the group consisting of a sequence consisting of at least one amino acid continuous from the C-terminal side of amino acid numbers 1 to 3, A sequence consisting of at least one amino acid consecutive from the N-terminal side of amino acid numbers 10 to 17 in SEQ ID NOs: 34, 36, 39 to 41, 47, 48, 50; and SEQ ID NOs: 35, 37, 38, 42 to 46 49, 52, a peptide
  • Item 7 The peptide according to Item 6, which is represented by the formula ABC, wherein A, B and C are the same as Item 20. Item 22. Formula: represented by B, wherein Item 7. The peptide according to Item 6, wherein B is a sequence selected from the group consisting of amino acid numbers 9 to 13 in SEQ ID NOs: 67 to 85.
  • Item 23 Formula: represented by AB or BC, wherein B is a sequence selected from the group consisting of amino acid numbers 9 to 13 in SEQ ID NOs: 67 to 85; A is a sequence selected from the group consisting of a sequence consisting of at least one amino acid continuous from the C-terminal side of amino acid numbers 1 to 8 in SEQ ID NOs: 67 to 85; A sequence comprising at least one amino acid continuous from the N-terminal side of amino acid numbers 14 to 17 in SEQ ID NOs: 67, 69, 72 to 74, 80, 81, 83, SEQ ID NOs: 68, 70, 71, 75 to 79, Item 8.
  • Item 7. The peptide according to Item 6, represented by the formula ABC, wherein A, B, and C are the same as Item 23.
  • Item 25. Represented by B, Item 7.
  • Item 29 Formula: represented by AB or BC, wherein B is the sequence of amino acid numbers 9 to 13 in SEQ ID NO: 67; A is a sequence consisting of at least one amino acid continuous from the C-terminal side of amino acid numbers 1 to 8 in SEQ ID NO: 67; Item 7. The peptide according to Item 6, wherein C is a sequence consisting of at least one amino acid continuous from the N-terminal side of amino acid numbers 14 to 17 in SEQ ID NO: 67. Item 30. Item 7. The peptide according to Item 6, which is represented by the formula ABC, wherein A, B and C are the same as Item 29.
  • Item 31 A peptide selected from the group consisting of the peptides according to any one of Items 1 to 30 binds to the N-terminal, C-terminal, or both ends of the target peptide and retains the physiological activity of the target peptide, Compared to complex peptides, which have a longer half-life in plasma.
  • Item 32. The complex peptide according to Item 31, wherein a peptide selected from the group consisting of the peptides according to any one of Items 1 to 30 is bound to the N-terminus of the target peptide.
  • Item 33 Item 32.
  • the complex peptide according to Item 31 wherein a peptide selected from the group consisting of the peptides according to any one of Items 1 to 30 is bound to the C-terminus of the target peptide.
  • Item 32. The complex peptide according to Item 31, wherein a peptide selected from the group consisting of the peptides according to any one of Items 1 to 30 is bound to both ends of the target peptide.
  • the complex peptide according to any one of Items 31 to 34, wherein the target peptide is an atrial natriuretic peptide, a C-type natriuretic peptide or motilin, or a derivative thereof.
  • Item 36 36.
  • a pharmaceutical composition comprising the complex peptide according to any one of items 31 to 35 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • Item 40 For the disease selected from acute heart failure, chronic heart failure, obstructive arteriosclerosis, ischemic heart disease, hypertension, edematous disease, cardiomyopathy, nephritis, diabetic nephropathy, nephrosclerosis and myocardial infarction Pharmaceutical composition.
  • Item 38 The pharmaceutical composition according to Item 37, wherein the target peptide in the complex peptide is a C-type natriuretic peptide or a derivative thereof.
  • Atypical dysplasia prevention of restenosis after PTCA after coronary stenosis, pulmonary hypertension, peripheral arterial occlusive disease, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, pulmonary fibrosis, liver fibrosis, renal fibrosis, myocardium
  • the pharmaceutical composition according to Item 40 which is used for treatment of a disease selected from infarction and myocarditis.
  • Item 38. The pharmaceutical composition according to Item 37, wherein the target peptide in the complex peptide is motilin or a derivative thereof.
  • Item 42 is for the treatment of a disease selected from functional dyspepsia, reflux esophagitis, diabetic gastric motility paralysis, constipation irritable bowel syndrome, chronic pseudo bowel obstruction, postoperative ileus, chronic gastritis and atrophic gastritis
  • a disease selected from functional dyspepsia, reflux esophagitis, diabetic gastric motility paralysis, constipation irritable bowel syndrome, chronic pseudo bowel obstruction, postoperative ileus, chronic gastritis and atrophic gastritis
  • the pharmaceutical composition as described.
  • Item 44 Item 33. A plasma half-life compared to a target peptide, wherein a peptide selected from the group consisting of the peptides according to any one of Items 1 to 30 is bound to the N-terminal, C-terminal, or both ends of the target peptide. Is a method for producing a complex peptide having a physiological activity of the target peptide. Item 45. Item 45. The method according to Item 44, wherein a peptide selected from the group consisting of the peptides according to any one of Items 1 to 30 is bound to the N-terminus of the target peptide. Item 46. Item 45.
  • the method according to Item 48, wherein the target peptide is an atrial natriuretic peptide or a derivative thereof.
  • Item 52. 44. A method for treating a disease capable of being treated with a target peptide contained in the pharmaceutical composition, comprising administering to the individual a pharmaceutical composition selected from the pharmaceutical compositions according to any of items 36 to 43.
  • Item 53. The method according to Item 52, wherein the pharmaceutical composition is the pharmaceutical composition according to Item 37.
  • the treatment method according to Item 53, wherein the pharmaceutical composition is the pharmaceutical composition according to Item 38.
  • the disease is selected from acute heart failure, chronic heart failure, obstructive arteriosclerosis, ischemic heart disease, hypertension, edematous disease, cardiomyopathy, nephritis, diabetic nephropathy, nephrosclerosis and myocardial infarction 55.
  • a treatment method according to item 54. Item 56. 54. The treatment method according to item 53, wherein the pharmaceutical composition is the pharmaceutical composition according to item 40.
  • Item 57 is selected from acute heart failure, chronic heart failure, obstructive arteriosclerosis, ischemic heart disease, hypertension, edematous disease, cardiomyopathy, nephritis, diabetic nephropathy, nephrosclerosis and myocardial infarction 55.
  • the above diseases are atypical cartilage dysplasia, restenosis prevention after PTCA after coronary stenosis, pulmonary hypertension, peripheral arterial occlusive disease, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, pulmonary fibrosis, liver fibrosis, Item 57.
  • the method according to Item 56 which is a disease selected from renal fibrosis, myocardial infarction and myocarditis.
  • the treatment method according to item 53, wherein the pharmaceutical composition is the pharmaceutical composition according to item 42.
  • the disease is a disease selected from functional dyspepsia, reflux esophagitis, diabetic gastric motility paralysis, constipation irritable bowel syndrome, chronic pseudointestinal obstruction, postoperative ileus, chronic gastritis and atrophic gastritis.
  • Item 60 A peptide selected from the group consisting of the peptides according to any one of Items 1 to 30 is bound to the N-terminal, C-terminal, or both terminals of the target peptide, and the plasma half-life of the target peptide is extended how to.
  • Item 61. The method according to Item 60, wherein a peptide selected from the group consisting of the peptides according to any one of Items 1 to 30 is bound to the N-terminus of the target peptide.
  • Item 60 wherein a peptide selected from the group consisting of the peptides according to any one of Items 1 to 30 is bound to the C-terminus of the target peptide.
  • Item 61. The method according to Item 60, wherein a peptide selected from the group consisting of the peptides according to any one of Items 1 to 30 is bound to both ends of the target peptide.
  • Item 64. The method according to any one of 60 to 63, wherein the target peptide is a natriuretic peptide, motilin, or a derivative thereof.
  • Item 65 Item 65.
  • the method according to Item 64, wherein the target peptide is an atrial natriuretic peptide or a derivative thereof.
  • the half-life extending peptide according to the present invention By adding the half-life extending peptide according to the present invention to the target peptide having a short half-life, the pharmacokinetics is improved and the drug has a practical half-life. Since the antigenicity is almost the same as that of a natural target peptide, it is excellent in safety and exhibits resistance to an enzyme that degrades a physiologically active peptide in the body. By using the half-life extending peptide, it is possible to greatly reduce the cost and time required to develop a bioactive peptide with improved pharmacokinetics. In addition, it is expected that the administration method of a physiologically active peptide treated by continuous intravenous or continuous subcutaneous administration can be administered as a single bolus, thereby improving the compliance of individuals (patients) and medical sites.
  • FIG. 3 is a graph showing changes in plasma ANP immunoreactivity when ANP and its combined ANP (AC) (0.1 mg / kg) were intravenously or subcutaneously administered to male rats. It is a figure which shows the plasma CNP immune activity transition when natural type CNP-22 and its composite CNP (A, B) (0.1 mg / kg) are administered to a male rat once intravenously or subcutaneously. It is a figure which shows the plasma CNP immunoactivity concentration and plasma cGMP density
  • FIG. 3 is a graph showing changes in plasma motilin immunoreactivity concentration when motilin and its complex motilin (AM) (10 nmol / kg) were intravenously administered to male rats.
  • FIG. 3 is a graph showing changes in plasma CNP immunoreactivity when natural CNP-22 and its combined CNP (C to I) (10 nmol / kg) were intravenously administered to male rats.
  • FIG. 3 is a graph showing changes in plasma CNP immunoreactivity when intravenous administration of complex motilin (N to V, X to Z, I to XIII) (10 nmol / kg). It is a figure which shows the plasma CNP immunoreactivity density
  • the half-life extending peptide of this invention is represented by B, AB, BC, ABC, and A, B, and C are the following (1) (3) is a peptide that, when bound to another target peptide (bioactive peptide), can increase the half-life in plasma compared to the target peptide while retaining the physiological activity of the target peptide. is there.
  • A is the amino acid sequence at positions 1-14 (14 amino acids: Table 5), C-terminal fragment of frog ghrelin (SEQ ID NO: 91), complex motilins (A to F, and G to K) (refer to Table 14).
  • MG-d12 / 14 (Table 16), composite CNP (J) and composite CNP (K) (Table 17) may not be present or a sequence of any number of amino acids may be present.
  • a sequence of about 1 to 14 amino acids can be selected, preferably 3 to 10 amino acids, more preferably 3 amino acids.
  • Specific examples include VQQ and AGSVDHKGKQ.
  • B is a portion corresponding to a structure (core sequence: RKESKK sequence portion) necessary for the half-life extending action of the peptide of the present invention derived from human ghrelin, which will be described later. The following matters are derived.
  • the following specific peptides are listed in Table 16 and Table 17.
  • E (Glu) in RKESKK is a necessary amino acid as shown by composite motilin (T) (MG-17E / N), (U) (MG-17E / Q) and (W) (MG-dES). Yes, and may be D (Asp) as shown by composite motilin (V) (MG-ES / DS), (X) (MG-17E / D), composite CNP (J) and composite CNP (K) . That is, the amino acid at position E (Glu) may be an acidic amino acid, and is preferably Glu.
  • an amino acid having any side chain structure such as an aromatic amino acid, a hydrophobic amino acid, and a polar uncharged amino acid can be substituted. That is, the amino acid at the position of S (Ser) may be any amino acid having a side chain structure, preferably Ser, Pro, Leu, Phe or Ala, more preferably Ser, Thr, Pro, Ala, Furthermore, Ser is most desirable.
  • RKESKK is characterized by containing a basic amino acid cluster (consecutive sequence of two basic amino acids) and an acidic amino acid, but the distance between the clusters is complex motilin (Z) (MG-i17G), (I) (MG -i19G), (II) (MG-i17G2) and (III) (MG-i17G2-i19G) can be expanded by insertion of any amino acid.
  • the distance between the basic amino acid clusters is desirably such that 1 to 5 amino acids are present, as shown by the peptides described in Table 16, Table 17, and the like.
  • complex motilin (Z) (MG-i17G), (I) (MG-i19G), (II) (MG-i17G2), (III ) (MG-i17G2-19iG), (IV) (MG-dPP), (V) (MG-dPPH1), (VI) (MG-H1), (VII) (MG-H3), (VIII) (MGH4 ), (XI) (MG-d12 / 14), (XII) (MGP1), (XIII) (MGP) 2, etc., and complex CNP (K), any amino acid may be present.
  • G, A, Y, S, P and / or V between basic amino acid cluster (RK equivalent site) and E, and S, H and / or V between E and basic amino acids are present, as shown by the peptides described in Table 16,
  • structure B (core sequence: RKESKK part for human) necessary for the half-life extending action according to the present invention first has a sequence represented by the following formula 2.
  • Formula 2 Wk-Xl-Y-Zm-Wn
  • W is a basic amino acid
  • X and Z are arbitrary amino acids
  • Y is an acidic amino acid.
  • K, l, m, n are 0 or a natural number
  • k 1 or 2
  • N 1 or 2.
  • RKESKKs may be reversed (KKSEKR) as shown by composite motilin (Y) (MG-BR).
  • KKSEKR composite motilin
  • Y composite motilin
  • XII composite motilins
  • MGP1 composite motilins
  • XIII XIII
  • a compound having a plurality of core sequences in the molecule as represented by the following general formula is also an effective means in the half-life extending action.
  • Formula 1 (Wk-Xl-Y-Zm-Wn) + (Wo-Xp-Y-Zq-Wr) s
  • the acidic amino acid Y is E (Glu) or D (Asp), preferably E (Glu).
  • X and Z which are arbitrary amino acids, X and Z may be the same or different from each other, and when there are a plurality of them, they may be the same or different from each other.
  • X and Z are preferably Ser, Pro, Leu, Phe or Ala, more preferably Ser, Thr, Pro and Ala, and most preferably Ser.
  • W is preferably R (Arg) or K (Lys).
  • Equation 1 s is preferably 1, o, p, q is 0, and r is 2.
  • C is the amino acid sequence of positions 22-23 in the composite motilin (J) (2 amino acids: Table 14). The amino acid sequence of positions 7-20 (14 amino acids: Table 5)
  • Well-known secondary structure prediction methods for example, Chou-Fasman method: Biochemistry. 1974 Jan 15; 13 (2): 222-45 Prediction of protein conformation.
  • any sequence consisting of 3 to 11 amino acids capable of forming an ⁇ -helix structure more preferably KKPPAKLQPR (sequence consisting of amino acids 22 to 29 from the N-terminus in the composite motilin (C)), or PPAELAALEA (A sequence consisting of amino acids 22 to 31 from the N-terminus in the complex motilin (VII) (MG-H3)), and more preferably PPAELAALEA.
  • KKPPAKLQPR sequence consisting of amino acids 22 to 29 from the N-terminus in the composite motilin (C)
  • PPAELAALEA A sequence consisting of amino acids 22 to 31 from the N-terminus in the complex motilin (VII) (MG-H3)
  • any arrangement that can form a sheet structure by the above-described prediction method can be used.
  • the composite CNP containing the sequence corresponding to B (core sequence) in the general formula of the half-life extending peptide according to the present invention also showed a half-life extending action. From the above, when the requirements of A and C of the general formula of the half-life extending peptide according to the present invention derived from the comparison of the half-lives of the composite motilin are applied to the composite CNP, the same half-life extending effect can be obtained. It can be easily predicted by a contractor.
  • A, B and C may be independently forward or reverse, and AB, BC and ABC may be forward or reverse as a whole.
  • the forward direction and the reverse direction mean that the arrangement direction from the N-terminal to the C-terminal is reversed.
  • the peptide of the present invention is B alone, the case where a sequence satisfying the requirements of A and / or C exists on the target peptide side is included.
  • Preferable half-life extending peptides of the present invention are the following peptides (1) or (2).
  • A is one or more amino acid sequences of amino acid numbers 1 to 4 consecutive to B in SEQ ID NO: 34, or an amino acid in which one or several amino acids are deleted, substituted, and / or added in this amino acid sequence
  • Sequence B is an amino acid sequence of amino acid numbers 5 to 9 in SEQ ID NO: 34, or an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, and / or added in this amino acid sequence
  • C is one or more amino acid sequences of amino acid numbers 10 to 17 consecutive to B in SEQ ID NO: 34, or an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, and / or added in this amino acid sequence .
  • A is one or more amino acid sequences of amino acid numbers 1 to 8 consecutive to B in SEQ ID NO: 67, or an amino acid in which one or several amino acids are deleted, substituted, and / or added in this amino acid sequence
  • An array B is an amino acid sequence of amino acid numbers 9 to 13 in SEQ ID NO: 67, or an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, and / or added in this amino acid sequence
  • C is one or more amino acid sequences of amino acid numbers 14 to 17 consecutive to B in SEQ ID NO: 67, or an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, and / or added in this amino acid sequence .
  • SEQ ID NO: 67 is the reverse sequence of SEQ ID NO: 34.
  • the half-life extending peptide of the present invention comprises the amino acid sequence of amino acid numbers 5 to 9 in SEQ ID NO: 34 or the amino acid sequence of amino acid numbers 9 to 13 in SEQ ID NO: 67 related to the reverse sequence, and a maximum of 17 amino acids.
  • the “one or several” in this case is, for example, 1 to 35, preferably 1 to 15, more preferably 1 to 10, more preferably 1 to 8, more preferably 1 to 6, more preferably Is 1 to 5, more preferably 1 to 4, more preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2.
  • the half-life extending peptides of the present invention include mammals such as humans, monkeys, cows, horses, pigs, dogs, deer, sheep, goats, cats, rabbits, mice, sunks (whale mice), whales; turkeys, chickens Such as birds; reptiles like turtles; amphibians like frogs; half-life extending peptides consisting of C-terminal partial sequences of ghrelin such as eels, catfish, sharks and other fish.
  • amino acid sequences of each of A, B, and C of SEQ ID NO: 34 or SEQ ID NO: 67 comparison of amino acid sequences derived from various sources A person skilled in the art can appropriately select an appropriate amino acid position and type for performing the modification.
  • the full length of sequence C that may be present in is shown in Tables 1 to 7 below.
  • the amino acid sequences of ghrelin derived from each organism in Tables 1 to 7 are shown below.
  • the underlined portion corresponds to the half-life extending peptide.
  • the amino acid sequences of the half-life extending peptides (positive sequences) derived from each organism in Tables 1 to 7 are shown below.
  • the underlined portion is a portion corresponding to the core sequence B
  • the N-terminal side of the core sequence B is a portion corresponding to the sequence A
  • the C-terminal side of the core sequence B is a portion corresponding to the sequence C.
  • the amino acid sequences of the half-life extending peptides (reverse sequences) derived from each organism in Tables 1 to 7 are shown below.
  • the underlined portion is a portion corresponding to the core sequence B
  • the N-terminal side of the core sequence B is a portion corresponding to the sequence A
  • the C-terminal side of the core sequence B is a portion corresponding to the sequence C.
  • half-life extending peptides are preferably used for individuals of the species from which they are derived.
  • the C-terminal sequence of human-derived ghrelin is preferably used.
  • the half-life extending peptide is composed of AB, BC or ABC sequences, it is preferable to use sequences A, B and C derived from the same species, but sequences A and B derived from different species.
  • C may be a chimeric peptide.
  • the chimeric peptide preferably combines sequences derived from mammals, birds, reptiles, and amphibians, more preferably combines sequences derived from mammals, and even more preferably combines sequences derived from humans.
  • maintaining the physiological activity when bound to the target peptide means that the activity is 1% or more of the target peptide activity when bound to any of the N-terminal, C-terminal, or both ends of the target peptide. It means that it is maintained.
  • extending the half-life of the target peptide means that the half-life is extended as much as possible compared to the target peptide, regardless of whether it is bound to the N-terminal, C-terminal or both ends of the target peptide. .
  • a and / or C to a side chain of an amino acid contained in B, for example, an amino group of a lysine residue, a carboxyl group of glutamic acid or aspartic acid, and the like is also an embodiment of the present invention.
  • the target peptide is a natural physiologically active peptide or a peptide having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted and / or added in the amino acid sequence of the peptide and having the physiological activity of the peptide. Certain derivatives can be used.
  • the number of amino acids to be substituted when “one or several are substituted, deleted, inserted and / or added” with respect to amino acids is a peptide comprising the amino acid sequence.
  • the derivative is not particularly limited as long as the derivative has a desired function, but it is, for example, about 1 to 4, or about 1 to 2, and a plurality of positions can be selected. If it is a substitution with an amino acid having similar properties (charge and / or polarity), etc., it is considered that the desired function is not lost even if a large number of amino acids are substituted.
  • amino acid includes all amino acids such as L-amino acid, D-amino acid, ⁇ -amino acid, ⁇ -amino acid, ⁇ -amino acid, natural amino acid, synthetic amino acid and the like.
  • the amino acid sequence thereof is 70% or more, preferably 80 or more, more preferably 90% or more, particularly preferably 95 or more compared to the natural amino acid sequence. Most preferably, it is desirable to have a homology of 97% or more.
  • Suitable target peptides include, for example, natriuretic peptide, desirably atrial natriuretic peptide (ANP: not limited to, but human ANP of SEQ ID NO: 100, for example), brain natriuretic peptide (BNP: not limited to origin)
  • ANP atrial natriuretic peptide
  • BNP brain natriuretic peptide
  • C-type natriuretic peptide CNP-22 of SEQ ID NO: 101
  • motilin the origin is not limited, for example, human motilin of SEQ ID NO: 102
  • GLP-1 origin is not limited, eg, human GLP-1 (7-36) amide of SEQ ID NO: 103
  • parathyroid hormone PTH: origin is not limited, eg
  • the derivative can be selected by measuring an indicator substance in a culture solution after acting on a cultured cell expressing a receptor related to the original physiologically active peptide.
  • ANP or CNP can be selected by measuring cyclic GMP in the culture solution after acting on cultured cells expressing their receptors GC-A or GC-B.
  • signal transduction system activation such as measurement of intracellular calcium and measurement of cyclic AMP in the culture solution can be measured. You can choose.
  • the present invention also includes salts of complex peptides. Any salt may be used as long as it is non-toxic, but a pharmaceutically acceptable salt is preferable.
  • a salt with an inorganic base a salt with an organic base, a salt with an inorganic acid, a salt with an organic acid, basic or Examples include salts with acidic amino acids.
  • the salt with an inorganic base include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt; alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt; and salts such as aluminum salt and ammonium salt.
  • salts with an organic base include salts with trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, dicyclohexylamine, N, N′-dibenzylethylenediamine and the like.
  • salts with inorganic acid include salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid and the like.
  • salts with organic acid include formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, malic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p -Salts with toluenesulfonic acid and the like.
  • salts with basic amino acids include salts with arginine, lysine, ornithine and the like
  • salts with acidic amino acids include salts with aspartic acid, glutamic acid and the like. It is done. Among these salts, salts with inorganic bases are preferable, and sodium salts and potassium salts are most preferable.
  • a complex peptide with ANP and BNP as the target peptide or a pharmaceutically acceptable salt thereof is effective in the treatment of acute heart failure and acute exacerbation of chronic heart failure based on the physiological action via NPRA (GCA), which is the receptor for ANP and BNP.
  • GCA NPRA
  • a very high effect has been recognized in improving the prognosis after myocardial infarction. Including these, it can be used as an active ingredient of therapeutic agents for obstructive arteriosclerosis, ischemic heart disease, hypertension, edema disease, cardiomyopathy, nephritis, diabetic nephropathy, nephrosclerosis, myocardial infarction, etc. .
  • a complex peptide or a pharmaceutically acceptable salt thereof with CNP as the target peptide can be recovered after PTCA after atypical cartilage dysplasia or coronary artery stenosis based on physiological actions via NPRB (GCB), a CNP receptor. It is effective for prevention of stenosis, pulmonary hypertension and peripheral arterial occlusive disease, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, pulmonary fibrosis, liver fibrosis, renal fibrosis, myocardial infarction and myocarditis. It can be used as an active ingredient of a therapeutic agent.
  • NPRB NPRB
  • the complex peptide or its pharmaceutically acceptable salt with motilin as the target peptide is functional dyspepsia, reflux esophagitis, diabetic gastric motility paralysis, constipation type based on motilin-R physiological receptor
  • Application to irritable bowel syndrome, chronic pseudointestinal obstruction, postoperative ileus, chronic gastritis, atrophic gastritis, etc. is effective, and it can be used as an active ingredient of these therapeutic agents.
  • a complex peptide having GLP-1 as a target peptide or a pharmaceutically acceptable salt thereof is effective for application to diabetes and the like, and can be used as an active ingredient of these therapeutic agents.
  • a complex peptide having PTH as a target peptide or a pharmaceutically acceptable salt thereof is effective for application to parathyroid gland hypofunction and the like, and can be used as an active ingredient of these therapeutic agents.
  • the half-life in plasma is extended by binding the half-life extending peptide of the present invention described above to the N-terminal side, C-terminal side, or both terminal sides of the target peptide, and A method for producing a complex peptide having physiological activity of the target peptide is also included.
  • the complex peptide according to the present invention can be obtained by a conventional method (see, for example, J. Med. Chem., 43, pp. 4370-4376, 2000). For example, it can be produced by recombinant DNA technology and / or chemical synthesis.
  • a host cell transformed with an expression vector having a DNA encoding the complex peptide according to the present invention is cultured, and the target peptide is collected from the culture.
  • a complex peptide according to the invention can be obtained.
  • the vector into which the gene is incorporated include E. coli vectors (pBR322, pUC18, pUC19, etc.), Bacillus subtilis vectors (pUB110, pTP5, pC194, etc.), yeast vectors (Yep type, YRp type, Yip type), or animal cells.
  • vectors retrovirus, vaccinia virus, etc.
  • any other vector can be used as long as it can stably hold the target gene in the host cell.
  • the vector is introduced into a suitable host cell.
  • the method described in Molecular Cloning can be used as a method for incorporating a target gene into a plasmid or a method for introducing it into a host cell.
  • a promoter is connected upstream of the gene so as to function.
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host cell used for expression of the target gene.
  • the host cell to be transformed is Escherichia, lac promoter, trp promoter, lpp promoter, ⁇ PL promoter, recA promoter, etc. can be used, and if it is Bacillus, SPO1 promoter, SPO2 promoter, etc. can be used.
  • yeast GAP promoter, PHO5 promoter, ADH promoter and the like can be used, and in the case of animal cells, SV40-derived promoter, retrovirus-derived promoter and the like can be used.
  • Host cells are transformed with the vector containing the gene of interest obtained as described above.
  • bacteria for example, Escherichia genus, Bacillus genus, etc.
  • yeast Sacharomyces genus, Pichia genus, Candida genus, etc.
  • animal cells CHO cells, COS cells, etc.
  • a liquid medium is suitable as a medium for culturing, and it is particularly preferable that the medium contains a carbon source, a nitrogen source, and the like necessary for the growth of transformed cells to be cultured. If desired, vitamins, growth promoting factors, serum and the like can be added to the medium.
  • the complex peptide according to the present invention is separated and purified from the culture by a conventional method.
  • the cells or cells are collected after culturing, suspended in a buffer solution containing a protein denaturant (eg, guanidine hydrochloride), and then the cells by ultrasound. Alternatively, the cells are disrupted and then centrifuged.
  • a protein denaturant eg, guanidine hydrochloride
  • the cells are disrupted and then centrifuged.
  • gel filtration, ultrafiltration, dialysis, SDS-PAGE various chromatographies are performed in consideration of the molecular weight, solubility, charge (isoelectric point), affinity, etc. of the target substance. Separation and purification methods such as chromatography can be appropriately combined.
  • the complex peptide according to the present invention can be chemically synthesized by a conventional method. For example, it can be obtained by condensing an amino acid having a protecting group by a liquid phase method and / or a solid phase method, extending the peptide chain, removing all protecting groups with an acid, and purifying the resulting crude product.
  • Various methods have already been known as methods that can be used for the production of complex peptides, and the production of complex peptides as substances according to the present invention can also be easily produced according to known methods. For example, classical peptide synthesis methods Or can be easily produced according to a solid phase method.
  • a method using a combination of recombinant DNA technology and chemical synthesis may be used, such as a side chain in the amino acid related to the target peptide, such as an amino group of a lysine residue, a carboxyl group of glutamic acid or aspartic acid, etc.
  • it can be produced by chemical synthesis, and other parts can be produced using recombinant DNA technology, and then each fragment can be fused.
  • This method is understood as a method of extending the plasma half-life of the target peptide by binding the half-life extending peptide of the present invention described above to the N-terminal side, C-terminal side, or both terminal sides of the target peptide. You can also.
  • the composite peptide of the present invention can be used as a pharmaceutical for animals (individuals) including humans.
  • the composite peptide of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof can be blended with a pharmaceutically acceptable carrier to form a pharmaceutical composition (pharmaceutical preparation).
  • the dosage form is not particularly limited, and is used as, for example, a solid preparation for internal use for oral administration, a liquid preparation for internal use, or an injection for parenteral administration.
  • examples of the solid preparation for internal use for oral administration include tablets, pills, capsules, powders or granules, and examples of the liquid preparation for internal use include syrups.
  • the pharmaceutically acceptable carrier various organic or inorganic carrier substances commonly used as pharmaceutical materials are used.
  • Excipients lubricants, binders, disintegrants in solid preparations; solvents, dissolution aids in liquid preparations , Suspending agents, isotonic agents, buffers, soothing agents and the like. If necessary, preparation additives such as preservatives, antioxidants, colorants, sweeteners and the like can also be used.
  • Preferable examples of the excipient include lactose, sucrose, D-mannitol, starch, crystalline cellulose, light anhydrous silicic acid and the like.
  • Preferable examples of the lubricant include magnesium stearate, calcium stearate, talc, colloidal silica and the like.
  • binder examples include crystalline cellulose, sucrose, D-mannitol, dextrin, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinylpyrrolidone and the like.
  • disintegrant examples include starch, carboxymethyl cellulose, carboxymethyl cellulose calcium, croscarmellose sodium, carboxymethyl starch sodium and the like.
  • solvent examples include water for injection, alcohol, propylene glycol, macrogol, sesame oil, corn oil and the like.
  • solubilizer examples include polyethylene glycol, propylene glycol, D-mannitol, benzyl benzoate, ethanol, trisaminomethane, cholesterol, triethanolamine, sodium carbonate, sodium citrate and the like.
  • Suitable examples of the suspending agent include surfactants such as stearyltriethanolamine, sodium lauryl sulfate, laurylaminopropionic acid, lecithin, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, and glyceryl monostearate; Examples thereof include hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone, sodium carboxymethylcellulose, methylcellulose, hydroxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose, and hydroxypropylcellulose.
  • Preferable examples of the isotonic agent include sodium chloride, glycerin, D-mannitol and the like.
  • Preferable examples of the buffer include buffers such as phosphate, acetate, carbonate, citrate and the like.
  • Preferable examples of the soothing agent include benzyl alcohol.
  • Preferable examples of the preservative include paraoxybenzoates, chlorobutanol, benzyl alcohol, phenethyl alcohol, dehydroacetic acid, sorbic acid and the like.
  • Preferable examples of the antioxidant include sulfite and ascorbic acid.
  • the pharmaceutical dosage form of the present invention is preferably a dosage form suitable for parenteral administration.
  • the dosage form suitable for parenteral administration include injection for intravenous administration, intradermal administration, subcutaneous administration or intramuscular administration.
  • Agents, infusions, suppositories, transdermal absorption agents, transmucosal absorption agents, inhalants, etc. but the above-mentioned injection preparations are preferred, especially when the individual is a human adult and is treated at home.
  • preparation forms such as transmucosal absorbents, inhalants, suppositories and the like. These formulation forms are variously known to those skilled in the art.
  • a formulation form suitable for a desired administration route and if necessary, add one or more formulation additives available in the art. It can be used to produce a preparation in the form of a pharmaceutical composition.
  • pharmaceuticals in the form of injections or infusions are suitable buffers, sugar solutions, isotonic agents, pH regulators, soothing agents, preservatives, etc., together with complex peptides with a long half-life that are active ingredients
  • additives include sugars such as glucose, mannitol, xylitol, and lactose, hydrophilic polymers such as polyethylene glycol, alcohols such as glycerol, amino acids such as glycine, proteins such as serum albumin, NaCl, and sodium citrate. Salts such as acetic acid, tartaric acid, ascorbic acid and hyaluronic acid, surfactants such as Tween 80, reducing agents such as sodium sulfite, and the like can be used. Such a preparation can be used as an injection or an instillation by adding and dissolving distilled water for injection or physiological saline at the time of use.
  • intranasal administration agents such as nasal sprays and intranasal sprays are suitable, and inhalation agents are also suitable for transpulmonary administration.
  • the content of the complex peptide or pharmaceutically acceptable salt in the preparation varies depending on the dosage form, but may be, for example, about 0.001 to 1000 mg, preferably about 0.01 to 100 mg, more preferably about 0.1 to 100 mg. Particularly preferably, it may be about 1 to 100 mg.
  • the above dose is preferably administered 1 to 3 times a day or 1 to 7 times a week.
  • the administration period varies depending on the type of the target peptide and is not particularly limited.
  • the present invention includes a method for treating a disease capable of being treated with a target peptide contained in the pharmaceutical composition, comprising administering the above-described pharmaceutical composition of the present invention to an individual.
  • Example 1 Changes in plasma ANP immunoreactivity concentration were examined when natural ANP and a complex peptide obtained by adding a half-life extending peptide to natural ANP (complex ANP) were intravenously administered to rats.
  • the experiment was performed under Nembutal anesthesia conditions using rats in which a polyethylene tube (PE-50, manufactured by Clay Adams) was previously inserted into the femoral artery.
  • a polyethylene tube PE-50, manufactured by Clay Adams
  • 7-week-old male SD rats (Nippon Charles River Co., Ltd.) were subjected to the experiment as 3 mice per group.
  • Rats were administered natural ANP ( ⁇ -hANP: SEQ ID NO: 100) or complex ANP (A, B, and C) at a dose of 0.1 mg / kg intravenously or subcutaneously at the back, 90 minutes after administration.
  • blood up to 180 minutes was collected over time from a polyethylene tube inserted into the femoral artery.
  • EDTA manufactured by Dojindo Laboratories
  • aprotinin manufactured by Bayer Co., Ltd.
  • RIA method competitive radioimmunoassay
  • the amino acid sequences of the composite ANP are as follows, and all retained human guanylate cyclase receptor A (GC-A receptor) agonist activity.
  • the pharmacokinetic parameters were calculated from the transition of the plasma immune activity concentration obtained.
  • T1 / 2 was calculated by the method of least squares from the slope of a straight line connecting several points in the elimination phase of plasma immunoreactivity concentration.
  • the maximum plasma concentration (Cmax; ng / mL) and the maximum plasma concentration arrival time (Tmax; min) were determined without determining C0.
  • Cmax was set to the highest value among plasma immunoreactive concentrations at each time of blood collection, and Tmax was the blood collection time of plasma showing Cmax. The results are shown in Table 8 and Table 9 below.
  • conjugated ANP (A, B and C) was administered intravenously
  • the plasma concentration of any derivative increased compared to that of natural ANP, indicating persistence.
  • the composite ANP (A, B and C) was administered subcutaneously
  • the plasma concentration of any derivative was increased compared to the natural ANP, indicating a persistence.
  • Example 2 Changes in plasma CNP immunoreactivity levels of natural CNP-22 and a complex peptide (complex CNP) obtained by adding a half-life extending peptide to CNP were examined.
  • the experiment was carried out under Nembutal anesthesia conditions using rats with a polyethylene tube inserted in the femoral artery in the same manner as in Example 1, and 7-week-old male SD rats (made by Charles River, Japan) were grouped in 3 groups. The animals were used for experiments.
  • Rats were administered natural CNP-22 (SEQ ID NO: 101) or composite CNP A and B at a dose of 0.1 mg / kg, respectively, in the tail vein or subcutaneously at the back, 90 minutes or 180 minutes before and after administration.
  • the blood was collected from a polyethylene tube inserted into the femoral artery.
  • EDTA manufactured by Dojindo Laboratories
  • aprotinin manufactured by Bayer
  • Plasma concentration was measured by competitive RIA method.
  • a and B of the composite CNP are as follows, and both retained human guanylate cyclase receptor B (GC-B receptor) agonist activity.
  • the results are shown in FIG. 2 and Table 10 and Table 11 below.
  • Example 3 Peptide degrading enzyme resistance of natural CNP-22 and complex CNP
  • the residual rate of unchanged natural CNP-22 in the sample decreased to 16.7% of the initial value.
  • the residual rates of the composite CNP (A, B) were 84.3% and 83.8%, respectively, and it was confirmed that both showed metabolic resistance to hNEP compared to natural CNP-22.
  • the in vivo NEP resistance of natural CNP-22 and complex CNP (B) was evaluated using the combined effect of NEP inhibitors on the transition of plasma CNP immunoreactivity after intravenous administration as an index.
  • the administration time was from 10 minutes before administration of natural CNP-22 or complex CNP (B) to 60 minutes after completion of blood collection.
  • Natural CNP-22 and complex CNP (B) are administered via the tail vein at a dose of 20 ⁇ g / kg, before the start of NEP inhibitor administration (-10 minutes), before CNP administration (0 minutes), and up to 60 minutes after administration.
  • Blood was collected from the femoral artery cannula. The collected blood was added with a stabilizer and an anticoagulant and then turned into plasma after centrifugation, and the plasma immunoreactive concentration was measured by the competitive RIA method described above. Pharmacokinetic analysis was performed in the same manner as in Example 1. The results are shown in FIG. 4 and Table 13 below.
  • the plasma CNP immunoreactivity concentration when natural CNP-22 was administered intravenously was significantly increased by the combined use of NEP inhibitors.
  • the AUC when NEP inhibitor was used in combination was about 3.7 times that in the non-combination case, and the half-life was about 5 times.
  • the transition of plasma CNP immunoreactivity after administration of complex CNP did not change even when NEP inhibitor was used in combination, and complex CNP (B) was less degraded to NEP than natural CNP-22 in the rat body (Table 13).
  • Example 4 (Elongation promoting action of natural CNP-22 and composite CNP) (1) The elongation promoting action of natural CNP-22 and composite CNP was examined using mice.
  • female S / VAF Crlj: CD1 (ICR) mice of 3 weeks old were used (manufactured by Charles River, Japan), and a total of 30 mice were used for the experiment.
  • the animals were purchased together with 3 mother mice at 2 weeks of age, and 10 mother mice were attached to 1 mother mouse, and the animals were weaned for 1 week, and 5 animals in each group during the administration period. Grouped in a see-through cage with ⁇ 2 cages.
  • the tap water was freely consumed as the water, and the solid feed (CRF-1, manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd.) was freely consumed as the feed.
  • Medium, natural CNP-22 or complex CNP (B) (structure previously described) are administered subcutaneously in the dorsal skin twice a day for 29 days at doses of 10 mL / kg, 0.25 mg / kg and 0.25 mg / kg, respectively. Height, tail length and weight during the period were measured. The results are shown in FIG. As shown in FIG.
  • mice repeatedly administered subcutaneously with a composite CNP (B) in which a half-life extending peptide was bound to CNP was significantly increased as compared to the vehicle administration group, but the natural CNP-22 administration group The height was not different from the vehicle administration group. On the other hand, there was no difference in body weight among all the administration groups.
  • Example 5 (antigenicity of natural CNP-22 and complex CNP)
  • Example 4 in order to examine whether antibodies against natural CNP-22 or complex CNP (B) were produced using sera collected from mice after completion of repeated administration for 4 weeks, indirect ELISA was used. Antigenicity was evaluated. 100 ⁇ L of peptide solution adjusted to 1.0 ng / ⁇ L with 50 mM NaHCO 3, pH 8.5 was added to a maxi-soap-treated 96-well plate (Nalge Nunc International, Denmark), and coating operation was performed at 4 ° C. overnight. Blocking was performed at room temperature for 1 hour using a 2.0% Block Ace (manufactured by Snow Brand Milk Products Co., Ltd.) solution.
  • Example 6 (plasma half-life of natural and complex motilin) (1) Half-life extending peptides of various lengths consisting of 5 to 22 amino acid residues are added to the amino acid sequence of amino acids 1 to 12 of SEQ ID NO: 102, which is the active center of natural motilin (SEQ ID NO: 102) and natural motilin. Changes in plasma motilin immunoreactivity concentrations were examined when 13 combined complex motilins A to M (SEQ ID NOs: 111 to 123) were intravenously administered. The experiment was performed under Nembutal anesthesia conditions using rats in which a polyethylene tube (PE-50, manufactured by Clay Adams) was previously inserted into the femoral artery.
  • PE-50 polyethylene tube
  • Rats were administered human motilin or derivative at a dose of 10 nmol / kg into the tail vein, and blood before and 60 minutes after administration was collected from a polyethylene tube inserted into the femoral artery.
  • EDTA manufactured by Dojindo Laboratories
  • aprotinin manufactured by Bayer
  • Plasma motilin immunoreactive concentration was measured by competitive radioimmunoassay (RIA method) (FIG. 6).
  • a rabbit polyclonal antibody (# 870623) that specifically recognizes amino acid numbers 1 to 12 of the natural type motilin shown in SEQ ID NO: 102 is used as the antibody, and 125 I- [Tyr 7 ] human type motilin is used as the labeled compound.
  • Table 14 below shows the amino acid sequences, molecular weights, and elimination half-lives from plasma of natural and complex motilins (A to M).
  • Example 7 (plasma half-life of natural CNP-22 and complex CNP) (1) 17 amino acids at the N-terminal, C-terminal or both ends of the peptide consisting of the amino acid sequence at positions 6 to 22 from the N-terminal in the natural CNP-22 shown in SEQ ID NO: 101 and the active center of the natural CNP-22 in SEQ ID NO: 101
  • the transition of plasma CNP immunoreactivity when 7 complex CNPs (C to I) (SEQ ID NOs: 124 to 130) to which half-life extending peptides consisting of residues were bound was administered intravenously.
  • the experiment was performed under Nembutal anesthesia conditions using rats in which a polyethylene tube (PE-50, manufactured by Clay Adams) was previously inserted into the femoral artery.
  • PE-50 polyethylene tube
  • Rats were administered natural CNP-22 or complex CNP into the tail vein at a dose of 10 nmol / kg, respectively, and blood was collected from polyethylene tubes inserted into the femoral artery before administration and up to 60 minutes after administration.
  • EDTA Diojindo Laboratories
  • aprotinin manufactured by Bayer
  • Plasma CNP immunoreactivity was measured by competitive radioimmunoassay (RIA method).
  • a rabbit polyclonal antibody (# 2) that specifically recognizes the ring structure of natural CNP-22 was used as the antibody, and 125 I- [Tyr 0 ] CNP was used as the labeled compound.
  • Table 15 shows the amino acid sequence, molecular weight, and elimination half-life from plasma of the complex CNP.
  • Example 8 (plasma half-life of natural and complex motilin) (2) Natural-type motilin (SEQ ID NO: 102) and amino acid sequences of amino acids 1-12 of SEQ ID NO: 102, which is the active center of natural motilin, were combined with half-length extending peptides of various lengths consisting of 14-22 amino acid residues.
  • the transition of plasma motilin immune activity was examined when 26 kinds of complex motilins (N to Z and I to XIII) (SEQ ID NOs: 131 to 156) were intravenously administered.
  • the experiment was performed under Nembutal anesthesia conditions using rats in which a polyethylene tube (PE-50, manufactured by Clay Adams) was previously inserted into the femoral artery.
  • PE-50 polyethylene tube
  • Rats were administered human motilin or derivative at a dose of 10 nmol / kg into the tail vein, and blood was collected over time from a polyethylene tube inserted into the femoral artery before administration and up to 60 minutes after administration.
  • EDTA manufactured by Dojindo Laboratories
  • aprotinin manufactured by Bayer
  • Plasma motilin immunoreactivity concentration was measured by competitive radioimmunoassay (RIA method) (FIG. 8).
  • a rabbit polyclonal antibody (# 870623) that specifically recognizes amino acid numbers 1 to 12 of the natural type motilin shown in SEQ ID NO: 102 is used as the antibody, and 125 I- [Tyr 7 ] human type motilin is used as the labeled compound.
  • the amino acid sequences, molecular weights, and elimination half-lives from plasma of natural and complex motilins (NZ and I-XIII) are shown in Table 16 below and FIG.
  • the distance between the basic amino acid clusters was 1 to 5 amino acids from the results of each composite peptide described in Table 16. From the result of composite motilin (Y) (MG-BR), it was shown that the reverse direction (KKSEKR) may be used for the arrangement of RKESKK. In addition, the results of composite motilin (XII) (MGP1) and (XIII) (MGP2) show that the half-life extending action is enhanced even when two sequences corresponding to the core sequence are arranged in tandem. Having multiple core sequences within was also shown to be an effective means to achieve longer blood half-life extension.
  • Example 9 Pla half-life of natural CNP-22 and complex CNP (2) From the 17- or 20-amino acid residue at the C-terminal of the peptide consisting of the amino acid sequence at positions 6 to 22 from the N-terminal in the natural CNP-22 shown in SEQ ID NO: 101 and the active center of the natural CNP-22, SEQ ID NO: 101 Of CNP immunoreactive concentration in plasma when intravenously administered composite CNP (D, J, K) to which a half-life extending peptide is bound (J of composite CNP is SEQ ID NO: 157 and K of composite CNP is SEQ ID NO: 158) The transition was examined.
  • the experiment was performed under Nembutal anesthesia conditions using rats in which a polyethylene tube (PE-50, manufactured by Clay Adams) was previously inserted into the femoral artery.
  • a polyethylene tube PE-50, manufactured by Clay Adams
  • 7-week-old male SD rats manufactured by Charles River Japan Co., Ltd.
  • Rats were administered natural CNP-22 or complex CNP into the tail vein at a dose of 20 nmol / kg, respectively, and blood was collected from polyethylene tubes inserted into the femoral artery before administration and up to 90 minutes after administration.
  • a specific amino acid sequence is not particularly required for the portion related to A in the general formula of the half-life extending peptide according to the present invention, and any amino acid may be used.
  • the number of amino acids in the portion related to A should be 10 or less.
  • Example 10 (Elongation promoting action of composite CNP) (2) The dose dependence of the elongation promoting action of the composite CNP (D, J) was examined using mice.
  • female S / VAF Crlj: CD1 (ICR) mice of 3 weeks old were used (manufactured by Charles River, Japan), and a total of 30 mice were used for the experiment.
  • the animals were purchased together with 3 mother mice at 2 weeks of age, and 10 mother mice were attached to 1 mother mouse, and the animals were weaned for 1 week, and 5 animals in each group during the administration period. Grouped in a see-through cage with ⁇ 2 cages.
  • the tap water was freely consumed as the water, and the solid feed (CRF-1, manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd.) was freely consumed as the feed.
  • Medium or complex CNP (D, J) (structure previously described) is administered subcutaneously at the doses of 5 mL / kg, 50 nmol / kg and 200 nmol / kg once a day for 56 days subcutaneously on the back, and height and tail length during the administration period. And body weight was measured.
  • the results are shown in FIG. 10, and a whole body photograph of the mouse the day after the completion of administration of the composite CNPJ is shown in FIG.
  • repeated subcutaneous administration of a complex CNP (D, J) conjugated with a natural CNP-22 and a half-life extending peptide significantly increased the height and tail length of mice depending on the dose. .
  • Example 11 (Elongation promoting action of composite CNP) (3) The elongation promoting action of the composite CNP was examined using rats. The experiment was conducted using 3 weeks old female SD (IGS) rats (Nippon Charles River Co., Ltd.), and 5 mice per group were used for the experiment. The animals were purchased at the age of 17 days, and were weaned after pre-bred with 10 pups per mother rat. During the administration period, each group was raised in an aluminum hanging cage. The tap water was freely consumed as the water, and the solid feed (CRF-1, manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd.) was freely consumed as the feed.
  • IGS 3 weeks old female SD
  • mice per group were used for the experiment. The animals were purchased at the age of 17 days, and were weaned after pre-bred with 10 pups per mother rat. During the administration period, each group was raised in an aluminum hanging cage. The tap water was freely consumed as the water, and the solid feed (CRF-1, manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd.)
  • Medium or complex CNP (D) (structure previously described) is administered subcutaneously in the dorsal region once daily for 5 days at doses of 5 mL / kg, 50 nmol / kg and 200 nmol / kg, and the height, tail length and weight during the administration period are determined. It was measured. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 12, the height of rats repeatedly administered subcutaneously at a dose of 12.5, 50, and 200 nmol / 1 mL / kg with complex CNP (D) conjugated with a natural CNP-22 and a half-life extending peptide is the vehicle administration group Significantly increased.
  • Example 12 Comparison of plasma half-life of natural CNP and CNP-53 and complex CNP
  • Transition of plasma CNP immunoreactivity when natural CNP-22 shown in SEQ ID NO: 101 was administered alone or in combination with a neutral endopeptidase (NEP) inhibitor was measured, and natural CNP-53 (SEQ ID NO: 159 ) And complex CNP (D) (structures described above) were compared with changes in plasma CNP immunoreactivity concentration when administered intravenously.
  • the experiment was performed under Nembutal anesthesia conditions using rats in which a polyethylene tube (PE-50, manufactured by Clay Adams) was previously inserted into the femoral artery.
  • PE-50 polyethylene tube
  • a polyethylene tube (PE-10, manufactured by Clay Adams) was also inserted into the femoral vein.
  • P-10 polyethylene tube
  • 7-week-old male SD rats (Nippon Charles River Co., Ltd.) were used for the experiment as 3 mice per group.
  • DL-Thiorphan (manufactured by Sigma) is used as an NEP inhibitor, 5% mannitol (100 ⁇ L / min / body) or NEP inhibition from 10 minutes before the start of natural CNP-22 dosing until 60 minutes after the start of blood sampling
  • the agent (30 ⁇ g / 100 ⁇ L / min / body) was intravenously administered at a constant rate for 70 minutes using an Infusion Pump (CFV2100, manufactured by Nihon Kohden Co., Ltd.). Rats were administered natural CNP-22, natural CNP-53 or complex CNP (D) into the tail vein at a dose of 20 nmol / kg, respectively, and blood before and 60 minutes after administration to the femoral artery.
  • the sample was collected from the inserted polyethylene tube.
  • EDTA Densilaba Laboratories
  • aprotinin manufactured by Bayer
  • Plasma CNP immunoreactivity was measured by competitive radioimmunoassay (RIA method).
  • RIA method competitive radioimmunoassay
  • a rabbit polyclonal antibody (# 2) that specifically recognizes a ring partial structure that is a common structure of natural CNP-22 and natural CNP-53 is used as an antibody, and 125 I- [Tyr is used as a labeled compound. 0 ] CNP-22 was used.
  • Table 18 and FIG. 13 show the amino acid sequences, molecular weights, and elimination half-lives from plasma of natural CNP-22, natural CNP-53 and complex CNP (D).
  • composite CNP (D) has a longer half-life than any of natural CNP-22, natural CNP-22 + NEP inhibitor and natural CNP-53. Since natural CNP-53 is resistant to NEP, its half-life is longer than that of natural CNP-22. An amino acid sequence that confers NEP resistance is considered to exist within positions 1-21 of natural CNP-53. In addition, a sequence similar to the general formula B (corresponding to the core sequence) according to the present invention exists in positions 1 to 21 of natural CNP-53 (RKYKGANKK). Compound CNP (D) showed a better pharmacokinetic pattern than natural CNP-53, so it was longer that acidic amino acids were placed between basic amino acid clusters represented by general formula B It has been shown to be necessary to have half-life characteristics.
  • the half-life extending peptide according to the present invention By adding the half-life extending peptide according to the present invention to a target peptide having a short half-life, the pharmacokinetics is improved and the drug has a practical half-life.

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Abstract

以下の（Ｉ）又は（ＩＩ）のペプチド （Ｉ）　式：Ｂ、Ａ－Ｂ、Ｂ－Ｃ、又はＡ－Ｂ－Ｃで表され、式中、Ａ、Ｂ及びＣが、それぞれ以下の（１）、（２）、及び（３）に示されるものであり、他の目的ペプチドに結合させた場合に、当該目的ペプチドの生理活性を保持しつつ、当該目的ペプチドに比べて血漿中の半減期を延長できるペプチド （ＩＩ）　（Ｉ）のペプチドとは逆向きの配列、（Ｉ）においてＡ－Ｂで表されＡ若しくはＢが逆向きの配列、（Ｉ）においてＢ－Ｃで表されＢ若しくはＣが逆向きの配列、又は（Ｉ）においてＡ－Ｂ－Ｃで表されＡ、Ｂ、Ｃ、Ａ及びＢ、Ｂ及びＣ、若しくはＡ及びＣが逆向きの配列からなるペプチド （１）Ａは、1～14の任意のアミノ酸からなるペプチド （２）Ｂは、式1：(Wk-Xl-Y-Zm-Wn)-(Wo-Xp-Y-Zq-Wr）sで表されるペプチド （式1中、Wは塩基性アミノ酸であり、X及びZは任意のアミノ酸であり、Yは酸性アミノ酸である。k=1又は2、4≧l≧0の整数、2≧m≧0の整数、4≧l+m≧０、n=1又は2である。o=1又は2、4≧p≧0の整数、2≧q≧0の整数、4≧p+q≧0、r=1又は2である。s=0又は1である。） （３）Ｃは、2～14の任意のアミノ酸からなるペプチド

Description

目的ペプチドの血漿中半減期延長作用を有するペプチド
　本発明は、目的ペプチドの体内動態を改善し、治療目的に適った体内動態を付与することにより治療上の有用性を与えることができるペプチド、体内動態が改善され且つ目的ペプチドの生理活性を有する複合ペプチド、この複合ペプチドを含む医薬組成物、及びこの複合ペプチドの製造方法に関する。
　医薬として応用可能な生理活性ペプチドが存在していても、当該ペプチド中には血漿中半減期が短いものがあり、治療目的への応用には静脈内や皮下への持続的な投与、又は持続放出型DDS製剤の投与などによって実現を図る必要がある。このため、実際の応用には長期間に亘る多大な時間と費用を費やすことが必要である。
　例えば、生理活性ペプチドの血漿中半減期を延長させて医薬として開発した例として、Glucagon-like Peptide-1の事例が知られている（非特許文献１）。生理活性ペプチドの作用を明確にするための臨床研究は持続静脈内投与が多く用いられたが（非特許文献２）、２型糖尿病治療のためにはボーラス皮下投与が可能な半減期を延長させたペプチドが創製された。このように、実際の治療薬として開発するためには半減期を延長させた誘導体の開発が必要である事例があり、その事例では、生理活性ペプチド誘導体が化学合成され、又は異種の天然のペプチドであっても半減期の長いものが開発されてきた（非特許文献３～５）。
　また、半減期の短い生理活性ペプチドを医薬として応用しようとするとき、半減期の長いタンパク質に結合させることにより、生理活性ペプチドの半減期をこのタンパク質の半減期に近づける試みがなされており、例えば血清アルブミンに結合基を持つスペーサーを介して目的の生理活性ペプチドと当該タンパク質とを結合させること等が試験段階にある（非特許文献６）。
　従って、半減期の短い生理活性ペプチドを実用に供するために、当該半減期を延長させることができる物質を付加することで体内動態を改善し、従来の技術では治療効果を示すことができなかった生理活性ペプチドを医療に応用することが期待されている。
　短半減期の生理活性ペプチドを改変し、医薬として応用する試みはこれまでに幅広くなされてきており、ペプチドを安定化すること、製剤的な工夫により持続性を持たせること等が試みられ、実用化に成功した例も知られている。
　一方、グレリン(Ghrelin)は1999年に胃から発見されたホルモンであり、２８残基からなるアミノ酸配列を有し、当該配列のアミノ末端から3番目のアミノ酸が脂肪酸でアシル化された極めて珍しい化学構造を有するペプチドである（非特許文献6、特許文献1）。グレリンは成長ホルモン分泌促進因子レセプター１ａ（Growth Hormone Secretagogue-Receptor 1a：GHS-R1a）に働き（非特許文献７）、下垂体からの成長ホルモン(GH)の分泌を亢進させる内因性の脳－消化管ホルモンである（非特許文献7）。
　また、グレリンはGHS-R1aに対する内因性のGHSとして、ラットから初めて単離精製され、ラット以外の脊椎動物、例えばヒト、マウス、ブタ、ニワトリ、ウナギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、カエル、ニジマス、イヌ等からも、類似した一次構造を有するグレリンが単離され、それらのアミノ酸配列が知られている（特許文献1、非特許文献8）。上記グレリンはいずれも、３位のセリン残基又はスレオニン残基の側鎖水酸基がオクタン酸、デカン酸などの脂肪酸によりアシル化された特異的な構造を有するペプチドであり、このような疎水性修飾構造を有する生理活性ペプチドは、グレリン以外に生体から単離された例はない。
　最近の研究では、グレリンが食欲を亢進させること、皮下投与することにより体重及び体脂肪が増加すること（非特許文献9～11）、及び心機能を改善する等などの作用を有することも明らかにされている（非特許文献12～14）。更にグレリンはGH分泌促進作用や食欲亢進作用を持ち、GHの作用を介して脂肪を燃焼してエネルギーに変換する作用、あるいはGHのアナボリックな作用を発現して筋肉を増強させる効果を、食欲亢進によって更に、有効に引き出せることが期待されている（非特許文献15）。
　但し、グレリンの活性中心はアシル基を有するＮ末端部分であることが示されているが（特許文献１）、Ｃ末端部分の生理学的意義については不明な点が多いのが現状である。
WO01/07475
Mojsov S, Weir GC, Habener JF.　J Clin Invest. 1987, 79(2):616-619. Nauck MA, Heimesaat MM, Orskov C, Holst JJ, Ebert R, Creutzfeldt W., J Clin Invest. 1993, 91(1):301-307. O'Harte FP, Mooney MH, Lawlor A, Flatt PR., Biochim Biophys Acta. 2000, 6;1474(1):13-22. Madsbad S, Schmitz O, Ranstam J, Jakobsen G, Matthews DR, .Diabetes Care. 2004, 27(6):1335-1342. DeFronzo RA, Ratner RE, Han J, Kim DD, Fineman MS, Baron AD.、Diabetes Care. 2005, 28(5):1092-1100. Kim JG, Baggio LL, Bridon DP, Castaigne JP, Robitaille MF, Jette L, Benquet C, Drucker DJ., Diabetes. 2003, ;52(3):751-759. Kojima M, Hosoda H, Date Y, Nakazato M, Matsuo H, Kangawa K., 1: Nature. 1999, 9;402(6762):656-660. 児島 将康, 寒川 賢治, 生化学, 第79巻, 第9号, pp.853-867, 2007年 Choi K, Roh SG, Hong YH, Shrestha YB, Hishikawa D, Chen C, Kojima M, Kangawa K, Sasaki S., Endocrinology. 2003, 144(3):754-9. Neary NM, Small CJ, Wren AM, Lee JL, Druce MR, Palmieri C, Frost GS, Ghatei MA, Coombes RC, Bloom SR.,J Clin Endocrinol Metab. 2004, 89(6):2832-6 Akamizu T, Iwakura H, Ariyasu H, Hosoda H, Murayama T, Yokode M, Teramukai S, Seno H, Chiba T, Noma S, Nakai Y, Fukunaga M, Nakai Y, Kangawa K, FD Clinical Study Team . Eur J Endocrinol. 2008, 158(4):491-8 Nagaya N, Kojima M, Uematsu M, Yamagishi M, Hosoda H, Oya H, Hayashi Y, Kangawa K., Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2001, 80(5):R1483-7. Nagaya N, Miyatake K, Uematsu M, Oya H, Shimizu W, Hosoda H, Kojima M, Nakanishi N, Mori H, Kangawa K., 1: J Clin Endocrinol Metab. 2001, 86(12):5854-5859. Nagaya N, Uematsu M, Kojima M, Ikeda Y, Yoshihara F, Shimizu W, Hosoda H, Hirota Y, Ishida H, Mori H, Kangawa K., Circulation. 2001, 18;104(12):1430-1435 Korbonits M, Goldstone AP, Gueorquiev M, Grossman AB, Front Neuroendocrinol., 2004, 25:27-68
　本発明は、血漿中の半減期が短いために医薬品として適さなかった生理活性ペプチドの半減期を延長する作用を有するペプチド、目的ペプチドの生理活性を有しながら血漿中半減期が延長されていることにより医薬品として実用できる複合ペプチド、及び当該複合ペプチドの製造方法等を提供することを目的とする。
　本発明者らは、血漿中の半減期が短く医薬品として応用するためには静脈内や皮下に持続注入する等しなければならなかった目的の生理活性を有するペプチド（以下、目的ペプチドと称する）に付加することにより、血漿中半減期を延長することができるペプチドを開発することを試み、グレリンのアミノ酸配列のＣ末端部分に半減期延長モチーフとなるアミノ酸配列を見出した。当該半減期を延長させることができるアミノ酸配列を有するペプチドを、本発明では半減期延長ペプチドと称する。
　即ち、当該半減期延長ペプチドを目的ペプチド（例えば、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ANP）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（CNP）、モチリン等）のＮ末端側、Ｃ末端側又は両端に結合させることにより、当該目的ペプチドの生理活性を保持しつつ、血漿中の半減期を延長させることができることを見出した。本発明では半減期延長ペプチドを目的ペプチドに結合させることにより得られ、当該目的ペプチドの生理活性を保持しつつ、当該目的ペプチドに比べて血漿中の半減期が延長されたペプチドを、複合ペプチドと称する。
　また、半減期延長ペプチドに係るアミノ酸配列は、天然のアミノ酸配列に基づく場合のみならず、そのＮ末端とＣ末端が逆に入れ替わった逆配列や、部分的にＮ末端とＣ末端が逆に入れ替わった配列に基づく場合でも用いることができることを見出した。
　また、複合ペプチドは、目的ペプチドを分解する酵素（例えば、Neutral Endopeptidase）に対して抵抗性を有することや、天然型の目的ペプチドと同様に、反復投与を行なっても抗原性を示さず安全に用いることが可能であることを見出した。
　更に、天然型の目的ペプチドと複合ペプチドを、個体に対して同じ用量及び用法で投与したところ、目的ペプチドのみでは十分な目的の生理作用が得られない用量であっても、当該ペプチドに半減期延長ペプチドを結合させて半減期を延長することにより、生体において十分な目的の生理作用を示すことができることを見出した。これにより、持続注入によらない用法で医薬品としての適性を付与できることが示された。即ち、短半減期であるために静脈内又は皮下への持続投与が必要であった目的ペプチドに本発明に係る半減期延長ペプチドを付加することによりボーラス投与が可能となり、且つ天然の目的ペプチドに比べて複合ペプチドでは目的の活性が容易に得られることを見出した。
　本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、以下の事項に関する。
項１．
　以下の（Ｉ）又は（ＩＩ）のペプチド
（Ｉ）　式：Ｂ、Ａ－Ｂ、Ｂ－Ｃ、又はＡ－Ｂ－Ｃで表され、式中、Ａ、Ｂ及びＣが、それぞれ以下の（１）、（２）、及び（３）に示されるものであり、他の目的ペプチドに結合させた場合に、当該目的ペプチドの生理活性を保持しつつ、当該目的ペプチドに比べて血漿中の半減期を延長できるペプチド
（ＩＩ）　（Ｉ）のペプチドとは逆向きの配列、（Ｉ）においてＡ－Ｂで表されＡ若しくはＢが逆向きの配列、（Ｉ）においてＢ－Ｃで表されＢ若しくはＣが逆向きの配列、又は（Ｉ）においてＡ－Ｂ－Ｃで表されＡ、Ｂ、Ｃ、Ａ及びＢ、Ｂ及びＣ、若しくはＡ及びＣが逆向きの配列からなるペプチド
（１）Ａは、1～14の任意のアミノ酸からなるペプチド
（２）Ｂは、式1：(Wk-Xl-Y-Zm-Wn)-(Wo-Xp-Y-Zq-Wr）sで表されるペプチド
（式1中、Wは塩基性アミノ酸であり、X及びZは任意のアミノ酸であり、Yは酸性アミノ酸である。k=1又は2、4≧l≧0の整数、2≧m≧0の整数、4≧l+m≧０、n=1又は2である。o=1又は2、4≧p≧0の整数、2≧q≧0の整数、4≧p+q≧0、r=1又は2である。s=0又は1である。）
（３）Ｃは、2～14の任意のアミノ酸からなるペプチド
項２．
　Ｂが式1においてs=1のペプチドである項１に記載のペプチド。
項３．
　上記式1において、o＝0、ｐ=0、ｑ=0、ｒ=２である項２に記載のペプチド。
項４．
　Ｃが、αヘリックス構造を取り得る4～9個のアミノ酸配列を含む、項１に記載のペプチド。
項５．
　Ｃが、その末端とαヘリックス構造を取り得るアミノ酸配列との間にPro配列を有する、項４に記載のペプチド。
項６．
　式：Ｂ、Ａ－Ｂ、Ｂ－Ｃ、又はＡ－Ｂ－Ｃで表され、式中、Ａ、Ｂ、及びＣが以下の(1)又は(2)であり、他のペプチドに結合させた場合にその生理活性を保持しつつ、その半減期を延長できるペプチド。
(1)　Ａは、配列番号34においてＢに連続するアミノ酸番号1～4の1以上のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列
　　Ｂは、配列番号34におけるアミノ酸番号5～9のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列であり、
　　Ｃは、配列番号34においてＢに連続するアミノ酸番号10～17の1以上のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列である。
(2)　Ａは、配列番号67においてＢに連続するアミノ酸番号1～8の1以上のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列であり、
　　Ｂは、配列番号67におけるアミノ酸番号9～13のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列であり、
　　Ｃは、配列番号67においてＢに連続するアミノ酸番号14～17の1以上のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列である。
項７．
　式：Ｂで表され、式中、
　Ｂが配列番号34,36,39～41,47,48,50,53～57におけるアミノ酸番号5～9、配列番号35,37,38,42～46,49,52におけるアミノ酸番号4～8、及び配列番号58～60におけるアミノ酸番号2～6、配列番号61,62におけるアミノ酸番号3～6、配列番号63～65におけるアミノ酸番号3～7、及び配列番号66におけるアミノ酸番号1～3から成る群から選択される配列である項６に記載のペプチド。
項８．
　式：Ａ－Ｂ又はＢ－Ｃで表され、式中、
　Ｂが配列番号34,36,39～41,47,48,50,53～57におけるアミノ酸番号5～9、配列番号35,37,38,42～46,49,52におけるアミノ酸番号4～8、及び配列番号58～60におけるアミノ酸番号2～6、配列番号61,62におけるアミノ酸番号3～6、配列番号63～65におけるアミノ酸番号3～7、及び配列番号66におけるアミノ酸番号1～3から成る群から選択される配列であり、
　Ａが配列番号34,36,39～41,47,48,50,52～57におけるアミノ酸番号1～4のＣ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、配列番号35,37,38,42～46,49,52におけるアミノ酸番号1～3のＣ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、配列番号58～60におけるアミノ酸番号1の配列、及び配列番号61～65におけるアミノ酸番号1～2のＣ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列から成る群から選択される配列であり、
　Ｃが配列番号34,36,39～41,47,48,50,53～54におけるアミノ酸番号10～17のＮ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、配列番号35,37,38,42～46,49,52におけるアミノ酸番号9～16のＮ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、配列番号57におけるアミノ酸番号10～16のＮ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、及び配列番号58におけるアミノ酸番号7～20のＮ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、配列番号61におけるアミノ酸番号7～13のＮ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、配列番号63におけるアミノ酸番号8～14のＮ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、及び配列番号66におけるアミノ酸番号4～18のＮ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列から成る群から選択される配列である項６に記載のペプチド。
項９．
　式：Ａ－Ｂ－Ｃで表され、式中Ａ，Ｂ，Ｃは項８と同じである項６に記載のペプチド。
項１０．
　式：Ｂで表され、式中、
　Ｂが配列番号67～87におけるアミノ酸番号9～13、配列番号91におけるアミノ酸番号15～19、配列番号94におけるアミノ酸番号8～11、配列番号96におけるアミノ酸番号8～12、及び配列番号99におけるアミノ酸番号16～18から成る群から選択される配列である項６に記載のペプチド。
項１１．
　式：Ａ－Ｂ又はＢ－Ｃで表され、式中、
　Ｂが配列番号67～87におけるアミノ酸番号9～13、配列番号90におけるアミノ酸番号8～12、配列番号91におけるアミノ酸番号15～19、配列番号94におけるアミノ酸番号8～11、配列番号96におけるアミノ酸番号8～12、及び配列番号99におけるアミノ酸番号16～18から成る群から選択される配列であり、
　Ａが配列番号67～87におけるアミノ酸番号1～8のＣ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、配列番号90におけるアミノ酸番号1～7のＣ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、配列番号91におけるアミノ酸番号1～14のＣ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、配列番号94,96におけるアミノ酸番号1～7のＣ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、配列番号99におけるアミノ酸番号1～15のＣ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列であり、
　Ｃが配列番号67,69,72～74,80,81,83,86～87におけるアミノ酸番号14～17のＮ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、配列番号68,70,71,75～79,82,85におけるアミノ酸番号14～16のＮ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、配列番号90におけるアミノ酸番号13～16のＮ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、配列番号91におけるアミノ酸番号20、配列番号94におけるアミノ酸番号12～13のＮ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、配列番号96におけるアミノ酸番号13～14のＮ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、から成る群から選択される配列である項６に記載のペプチド。
項１２．
　式：Ａ－Ｂ－Ｃで表され、式中、Ａ、Ｂ、Ｃは項１１と同じである項６に記載のペプチド。
項１３．
　式：Ｂで表され、式中、
　Ｂが配列番号34,36,39～41,47,48,50,53～57におけるアミノ酸番号5～9、配列番号35,37,38,42～46,49,52におけるアミノ酸番号4～8、及び配列番号58～60におけるアミノ酸番号2～6から成る群から選択される配列である項６に記載のペプチド。
項１４．
　式：Ａ－Ｂ又はＢ－Ｃで表され、式中、
Ｂが配列番号34,36,39～41,47,48,50,53～57におけるアミノ酸番号5～9、配列番号35,37,38,42～46,49,52におけるアミノ酸番号4～8、及び配列番号58～60におけるアミノ酸番号2～6から成る群から選択される配列であり、
　Ａが配列番号34,36,39～41,47,48,50,53～57におけるアミノ酸番号1～4のＣ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、配列番号35,37,38,42～46,49,52におけるアミノ酸番号1～3のＣ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、配列番号58～60におけるアミノ酸番号1から成る群から選択される配列であり、
　Ｃが配列番号34,36,39～41,47,48,50,53～54におけるアミノ酸番号10～17のＮ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、配列番号35,37,38,42～46,49,52におけるアミノ酸番号9～16のＣ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、配列番号57におけるのＣ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、配列番号58におけるアミノ酸番号7～20のＣ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列から成る群から選択される配列である項６に記載のペプチド。
項１５．
　式：Ａ－Ｂ－Ｃで表され、式中、Ａ、Ｂ、Ｃが項１４と同じである項１４に記載のペプチド。
項１６．
　式：Ｂで表され、式中、
　Ｂが配列番号67～87におけるアミノ酸番号9～13、配列番号90におけるアミノ酸番号8～12、及び配列番号91におけるアミノ酸番号15～19から成る群から選択される配列である項６に記載のペプチド。
項１７．
　式：Ａ－Ｂ又はＢ－Ｃで表され、式中、
　Ｂが配列番号67～87におけるアミノ酸番号9～13、配列番号90におけるアミノ酸番号8～12、及び配列番号91におけるアミノ酸番号15～19から成る群から選択される配列であり、
　Ａが配列番号67～87におけるアミノ酸番号1～8のＣ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、配列番号90におけるアミノ酸番号1～7のＣ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、及び配列番号91におけるアミノ酸番号1～14のＣ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列から成る群から選択される配列の場合であり、
　Ｃが配列番号67,68,72～74,80,81,83,86～87におけるアミノ酸番号14～17のＮ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、配列番号68,70,71,75～79,82,85におけるアミノ酸番号14～16のＮ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、配列番号90におけるアミノ酸番号13～16のＮ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、及び配列番号91におけるアミノ酸番号20から成る群から選択される配列である項６に記載のペプチド。
項１８．
　式：Ａ－Ｂ－Ｃで表され、式中、Ａ、Ｂ、Ｃが項１７と同じである項６に記載のペプチド。
項１９．
　式：Ｂで表され、式中、
　Ｂが配列番号34,36,39～41,47,48,50におけるアミノ酸番号5～9、及び配列番号35,37,38,42～46,49,52におけるアミノ酸番号4～8から成る群から選択される配列である項６に記載のペプチド。
項２０．
　式：Ａ－Ｂ又はＢ－Ｃで表され、式中、
　Ｂが配列番号34,36,39～41,47,48,50におけるアミノ酸番号5～9、及び配列番号35,37,38,42～46,49,52におけるアミノ酸番号4～8から成る群から選択される配列であり、
　Ａが配列番号34,36,39～41,47,48,50におけるアミノ酸番号1～4のＣ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、及び配列番号35,37,38,42～46,49,52におけるアミノ酸番号1～3のＣ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列から成る群から選択される配列であり、
　Ｃが配列番号34,36,39～41,47,48,50におけるアミノ酸番号10～17のＮ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、及び配列番号35,37,38,42～46,49,52におけるアミノ酸番号9～16のＮ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列から成る群から選択される配列である項６に記載のペプチド。
項２１．
　式：Ａ－Ｂ－Ｃで表され、式中、Ａ、Ｂ、Ｃが項２０と同じである項６に記載のペプチド。
項２２．
　式：Ｂで表され、式中、
　Ｂが配列番号67～85におけるアミノ酸番号9～13からなる群から選択される配列である項６に記載のペプチド。
項２３．
　式：Ａ－Ｂ又はＢ－Ｃで表され、式中、
　Ｂが配列番号67～85におけるアミノ酸番号9～13からなる群から選択される配列であり、
　Ａが配列番号67～85におけるアミノ酸番号1～8のＣ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列から成る群から選択される配列であり、
　Ｃが配列番号67,69,72～74,80,81,83におけるアミノ酸番号14～17のＮ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列、配列番号68,70,71,75～79,82,85におけるアミノ酸番号14～16のＮ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列から成る群から選択される配列である項６に記載のペプチド。
項２４．
　式：Ａ－Ｂ－Ｃで表され、式中、Ａ、Ｂ、Ｃが項２３と同じである項６に記載のペプチド。
項２５．
　Ｂで表され、式中、
　式：Ｂが配列番号34におけるアミノ酸番号5～9の配列である項６に記載のペプチド。
項２６．
　式：Ａ－Ｂ又はＢ－Ｃで表され、式中、
　Ｂが配列番号34におけるアミノ酸番号5～9の配列であり、
　Ａが配列番号34における1～4のＣ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列であり、
　Ｃが配列番号34におけるアミノ酸番号10～17のＮ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列である項６に記載のペプチド。
項２７．
　式：Ａ－Ｂ－Ｃで表され、式中、Ａ、Ｂ、Ｃが項２６と同じである項６に記載のペプチド。
項２８．
　式：Ｂで表され、式中、
　Ｂが配列番号67におけるアミノ酸番号9～13の配列である項６に記載のペプチド。
項２９．
　式：Ａ－Ｂ又はＢ－Ｃで表され、式中、
　Ｂが配列番号67におけるアミノ酸番号9～13の配列であり、
　Ａが配列番号67におけるアミノ酸番号1～8のＣ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列であり、
　Ｃが配列番号67におけるアミノ酸番号14～17のＮ末端側から連続した少なくとも１つのアミノ酸からなる配列である項６に記載のペプチド。
項３０．
　式：Ａ－Ｂ－Ｃで表され、式中、Ａ、Ｂ、Ｃが項２９と同じである項６に記載のペプチド。
項３１．
　項１～３０のいずれかに記載のペプチドからなる群より選ばれるペプチドが、目的ペプチドのＮ末端、Ｃ末端又は両末端に結合し、当該目的ペプチドの生理活性を保持しつつ、当該目的ペプチドに比べて血漿中の半減期が延長している複合ペプチド。
項３２．
　項１～３０のいずれかに記載のペプチドからなる群より選ばれるペプチドが、目的ペプチドのＮ末端に結合した項３１に記載の複合ペプチド。
項３３．
　項１～３０のいずれかに記載のペプチドからなる群より選ばれるペプチドが、目的ペプチドのＣ末端に結合した項３１に記載の複合ペプチド。
項３４．
　項１～３０のいずれかに記載のペプチドからなる群より選ばれるペプチドが、目的ペプチドの両末端に結合した項３１に記載の複合ペプチド。
項３５．
　目的ペプチドが、心房性ナトリウム利尿ペプチド、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド若しくはモチリン、又はこれらの誘導体である項３１～３４のいずれか１項に記載の複合ペプチド。
項３６．
　項３１～３５のいずれか１項に記載の複合ペプチド又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする医薬組成物。
項３７．
　複合ペプチドが、項３５に記載のペプチドである項３６に記載の医薬組成物。
項３８．
　複合ペプチド中の目的ペプチドが、心房性ナトリウム利尿ペプチド又はその誘導体である項３７に記載の医薬組成物。
項３９．
　急性心不全、慢性心不全、閉塞性動脈硬化症、虚血性心疾患、高血圧症、浮腫性疾患、心筋症、腎炎、糖尿病性腎症、腎硬化症及び心筋梗塞から選択される疾患に対する項３８に記載の医薬組成物。
項４０．
　複合ペプチド中の目的ペプチドが、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド又はその誘導体である項３７に記載の医薬組成物。
項４１．
　異型軟骨形成不全症、冠状動脈狭窄後のPTCA後の再狭窄予防、肺性高血圧症、末梢動脈閉塞性疾患、変形性関節症、関節リウマチ、肺線維症、肝線維症、腎線維症、心筋梗塞及び心筋炎から選択される疾患の治療用である項４０に記載の医薬組成物。
項４２．
　複合ペプチド中の目的ペプチドが、モチリン又はその誘導体である項３７に記載の医薬組成物。
項４３．
　機能性ディスペプシア、逆流性食道炎、糖尿病性胃運動麻痺、便秘型過敏性腸症候群、慢性偽性腸閉塞、術後イレウス、慢性胃炎及び萎縮性胃炎から選択される疾患の治療用である項４２に記載の医薬組成物。
項４４．
　項１～３０のいずれかに記載のペプチドからなる群より選ばれるペプチドを、目的ペプチドのＮ末端、Ｃ末端又は両末端に結合させることを特徴とする、目的ペプチドに比べて血漿中の半減期が延長され且つ当該目的ペプチドの生理活性を有する複合ペプチドの製造方法。
項４５．
　項１～３０のいずれかに記載のペプチドからなる群より選ばれるペプチドを、目的ペプチドのＮ末端に結合させる項４４に記載の方法。
項４６．
　項１～３０のいずれかに記載のペプチドからなる群より選ばれるペプチドを、目的ペプチドのＣ末端に結合させる項４４に記載の方法。
項４７．
　項１～３０のいずれかに記載のペプチドからなる群より選ばれるペプチドを、目的ペプチドの両末端に結合させる項４４に記載の方法。
項４８．
　目的ペプチドが、ナトリウム利尿ペプチド若しくはモチリン、又はこれらの誘導体である４４～４７のいずれか１項に記載の方法。
項４９．
　目的ペプチドが、心房性ナトリウム利尿ペプチド又はその誘導体である項４８に記載の方法。
項５０．
　目的ペプチドが、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド又はその誘導体である項４８に記載の方法。
項５１．
　目的ペプチドが、モチリン又はその誘導体である項４８に記載の方法。
項５２．
　項３６～４３のいずれかに記載の医薬組成物から選択される医薬組成物を個体に投与することを含む、当該医薬組成物に含まれる目的ペプチドによる治療が可能な疾患の治療方法。
項５３．
　医薬組成物が、項３７に記載の医薬組成物である項５２に記載の治療方法。
項５４．
　医薬組成物が、項３８に記載の医薬組成物である項５３に記載の治療方法。
項５５．
　上記疾患が、急性心不全、慢性心不全、閉塞性動脈硬化症、虚血性心疾患、高血圧症、浮腫性疾患、心筋症、腎炎、糖尿病性腎症、腎硬化症及び心筋梗塞から選択される疾患である項５４に記載の治療方法。
項５６．
　医薬組成物が、項４０に記載の医薬組成物である項５３に記載の治療方法。
項５７．
　上記疾患が、異型軟骨形成不全症、冠状動脈狭窄後のPTCA後等の再狭窄予防、肺性高血圧症、末梢動脈閉塞性疾患、変形性関節症、関節リウマチ、肺線維症、肝線維症、腎線維症、心筋梗塞及び心筋炎から選択される疾患である項５６に記載の治療方法。
項５８．
　医薬組成物が、項４２に記載の医薬組成物である項５３に記載の治療方法。
項５９．
　上記疾患が、機能性ディスペプシア、逆流性食道炎、糖尿病性胃運動麻痺、便秘型過敏性腸症候群、慢性偽性腸閉塞、術後イレウス、慢性胃炎及び萎縮性胃炎から選択される疾患である項５８に記載の治療方法。
項６０．
　項１～３０のいずれかに記載のペプチドからなる群より選ばれるペプチドを、目的ペプチドのＮ末端、Ｃ末端又は両末端に結合させることを特徴とする、目的ペプチドの血漿中の半減期を延長する方法。
項６１．
　項１～３０のいずれかに記載のペプチドからなる群より選ばれるペプチドを、目的ペプチドのＮ末端に結合させる項６０に記載の方法。
項６２．
　項１～３０のいずれかに記載のペプチドからなる群より選ばれるペプチドを、目的ペプチドのＣ末端に結合させる項６０に記載の方法。
項６３．
　項１～３０のいずれかに記載のペプチドからなる群より選ばれるペプチドを、目的ペプチドの両末端に結合させる項６０に記載の方法。
項６４．
　目的ペプチドが、ナトリウム利尿ペプチド、若しくはモチリン、又はこれらの誘導体である６０～６３のいずれか１項に記載の方法。
項６５．
　目的ペプチドが、心房性ナトリウム利尿ペプチド又はその誘導体である項６４に記載の方法。
項６６．
　目的ペプチドが、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド又はその誘導体である項６４に記載の方法。
項６７．
　目的ペプチドが、モチリン又はその誘導体である項６４に記載の方法。
　本発明に係る半減期延長ペプチドを短半減期である目的ペプチドに付加することにより、体内動態が改善されて医薬として実用的な半減期を有するものとなる。抗原性が天然型の目的ペプチドとほぼ同様であるため安全性に優れ、また体内で生理活性ペプチドを分解する酵素に対して抵抗性を示す。当該半減期延長ペプチドを用いることにより、これまで体内動態が改善された生理活性ペプチドの開発にかかってきたコストや時間を大きく削減することが可能となる。また、持続静脈内又は持続皮下投与によって治療されている生理活性ペプチドの投与方法を、単回ボーラス投与することが可能となり個体（患者）や医療現場のコンプライアンスを改善できることも期待される。
雄性ラットにANP及びその複合ANP(A～C)（0.1mg/kg）を静脈内又は皮下投与したときの血漿中ANP免疫活性濃度推移を示す図である。 雄性ラットにに天然型CNP-22及びその複合CNP(A、B)（0.1mg/kg）を単回静脈内又は皮下投与したときの血漿中CNP免疫活性濃度推移を示す図である。 雄性ラットに天然型CNP-22及びその複合CNP(B)（0.1mg/kg）を皮下投与したときの血漿中CNP免疫活性濃度及び血漿中cGMP濃度推移を示す図である。 雄性ラットに天然型CNP-22及びその複合CNP(B)（0.02mg/kg）を静脈内投与したときの血漿中CNP免疫活性濃度推移に及ぼすNEP幅害剤の影響を示す図である。 雌性マウスに天然型CNP-22及びその複合CNP(B)（0.25mg/kg）を１日２回、２９日間反復皮下投与したときの身長、尾長及び体重推移を示す図である。 雄性ラットにモチリン及びその複合モチリン(A～M)(10nmol/kg)を静脈内投与したときの血漿中モチリン免疫活性濃度推移を示す図である。 雄性ラットに天然型CNP-22及びその複合CNP(C～I)(10nmol/kg)を静脈内投与したときの血漿中CNP免疫活性濃度推移を示す図である。 複合モチリン(N～V、X～Z、I～XIII)(10nmol/kg)を静脈内投与したときの血漿中CNP免疫活性濃度推移を示す図である。 雄性ラットに天然型CNP-22及びその複合CNP(D、J及びK）(20nmol/kg)を静脈内投与したときの血漿中CNP免疫活性濃度推移を示す図である。 雌性マウスに複合CNP(D及びJ)(50及び200nmol/kg)を１日１回、５６日間反復皮下投与したときの身長、尾長及び体重推移を示す図である。 雌性マウスに複合CNP(J)(50及び200nmol/kg)を１日１回、５６日間反復皮下投与した後の全身像である。 雌性ラットに複合CNP(D)(12.5、50及び200nmol/kg)を１日１回、２８日間反復皮下投与したときの身長、尾長及び体重推移を示す図である。 天然型CNP-22及びCNP-53並びに複合CNP(D)(10nmol/kg)を静脈内投与したときの血漿中CNP免疫活性濃度推移を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
（１）半減期延長ペプチド
　本発明の半減期延長ペプチドは、Ｂ、Ａ－Ｂ、Ｂ－Ｃ、Ａ－Ｂ－Ｃで表され、式中、Ａ、Ｂ、及びＣが以下の（１）～(３)であり、他の目的ペプチド（生理活性ペプチド）に結合させた場合に、当該目的ペプチドの生理活性を保持しつつ、当該目的ペプチドに比べて血漿中の半減期を延長できるペプチドである。
（１）Ａは、カエルグレリン由来Ｃ末端フラグメント（配列番号91）における1-14位のアミノ酸配列（14アミノ酸：表5）、複合モチリン(A～F，及びG～K)（以上、表14）、MG-d12/14(表16)、複合CNP(J)及び複合CNP(K) (表17)が示すとおり、存在しなくてもよく又は任意のアミノ酸数の配列が存在してもよい。当該配列が存在する場合の長さは1～14アミノ酸程度の配列を選択することができ、望ましくは3～10アミノ酸、より望ましくは3アミノ酸である。具体的には、VQQやAGSVDHKGKQを挙げることができる。
（２）　Bは、後述するヒトグレリン由来の本発明ペプチドの半減期延長作用に必要な構造（コア配列：RKESKK配列部分）に対応する部分であり、ヒトグレリン由来の本発明ペプチドのBについて例示すれば以下の事項が導かれる。下記の具体的なペプチドは表16及び表17に記載されている。
　RKESKK中のE(Glu)については、複合モチリン(T)(MG-17E/N)、(U)(MG-17E/Q)及び(W)(MG-dES)が示すとおり、必要なアミノ酸であり、また複合モチリン(V)(MG-ES/DS)、(X)(MG-17E/D)、複合CNP(J) 及び複合CNP(K)が示すとおりD(Asp)であってもよい。即ち、上記E(Glu)の位置のアミノ酸は酸性アミノ酸であればよく、望ましくはGluである。
　RKESKK中のS(Ser)については、複合モチリン(O)(MG-18S/F)、(P)(MG-18S/T)、(Q)(MG-18S/P)、(R)(MG-18S/L)及び(S)(MG-18S/A)が示すとおり、芳香族アミノ酸、疎水性アミノ酸、及び極性無電荷アミノ酸等のいずれの側鎖構造をもつアミノ酸でも置換可能である。即ち、上記S(Ser)の位置のアミノ酸はいずれの側鎖構造をもつアミノ酸でもよく、望ましくはSer,Pro,Leu,Phe又はAlaであり、より望ましくはSer,Thr,Pro,Alaであり、更に最も望ましくはSerである。またはペプチドMG-dSが示すとおり、上記S(ser)の位置のアミノ酸は無くても良い。
　RKESKK中のR(Arg)及びK(Lys)については、複合モチリン(X)(MG-17E/D)が示すとおり、塩基性アミノ酸であれば置換可能である。
　RKESKKは、塩基性アミノ酸クラスター（塩基性アミノ酸２個の連続配列）と酸性アミノ酸を含むことを特徴とするが、クラスター間の距離は複合モチリン(Z)(MG-i17G)、(I)(MG-i19G)、(II)(MG-i17G2)及び(III)(MG-i17G2-i19G)が示すとおり任意のアミノ酸の挿入により拡張可能である。
　塩基性アミノ酸クラスター間の距離は、表16や表17等に記載された各ペプチドが示すように、1～５アミノ酸が存在する程度が望ましい。
　更に、RKESKK中の塩基性アミノ酸クラスターとE(Glu）の間には、複合モチリン(Z)(MG-i17G)、(I)(MG-i19G)、(II)(MG-i17G2)、(III)(MG-i17G2-19iG)、(IV)(MG-dPP)、 (V)(MG-dPPH1)、(VI)(MG-H1)、(VII)(MG-H3)、(VIII)(MGH4)、(XI)(MG-d12/14)、(XII)(MGP1)、(XIII)(MGP)2等や複合CNP（K）が示すとおり、任意のアミノ酸が存在していてもよい。例えば、塩基性アミノ酸クラスター（RK相当部位）とEの間にG,A,Y,S,P及び／又はVを、Eと塩基性アミノ酸クラスター（KK相当部位）の間にS,H及び／又はPを存在させることもできる。
　以上のことより、本願発明に係る半減期延長作用に必要な構造B（コア配列：ヒトについてはRKESKK部分）は、先ずは次の式2で表される配列を有する。
　式2: Wk-Xl-Y-Zm-Wn
　ここで、Wは塩基性アミノ酸であり、X及び Zは任意のアミノ酸であり、Yは酸性アミノ酸である。また、k, l, m, nは0又は自然数であり、ｋ=1又は2、4≧l≧0、2≧m≧0（但し、lとmは4≧l+m≧0である）、n=1又は2である。
　更に、RKESKKの並び方については、複合モチリン(Y)(MG-BR)が示すとおり、逆向き（KKSEKR）でもよい。
　また、複合モチリン(XII)(MGP1)及び(XIII)(MGP2)が示すとおり、コア配列を２個タンデムに配置した場合（例えばKKAYSPDK+ERK）、半減期延長作用が増強されることから、より長い半減期延長を達成するために、次の一般式で表されるように分子内に複数のコア配列を有する場合も半減期延長作用において有効な手段である。
　よって、本願発明に係る半減期延長作用に必要な構造（コア配列：RKESKK部分）は、次の式1で表される。
　式1：（Wk-Xl-Y-Zm-Wn）＋（Wo-Xp-Y-Zq-Wr）s
　ここで、W,X,Y,Z,k,l,m,nは上記式2に係る定義と同じであり、s＝0又は 1である。また、o, p, q, rは0又は自然数であり、2≧o≧0、4≧p≧0、2≧q≧0（但し、pとqは4≧p+q≧0である）、r=1又は2である。
　酸性アミノ酸Yは、E(Glu)又はD(Asp)であり、好ましくはE(Glu)である。任意のアミノ酸であるX,Zは、XとZとが互いに同一又は異なっていてよく、又、複数ある場合はそれらが互いに同一又は異なっていてよい。X,Zは、望ましくはSer,Pro,Leu,Phe又はAlaであり、より望ましくはSer,Thr,Pro,Alaであり、更に最も望ましくはSerである。塩基性アミノ酸Wは、両Wが互いに同一又は異なっていてよく、又、複数ある場合はそれらが互いに同一又は異なっていてよい。Wは、望ましくはR(Arg)又はK(Lys)である。
　また、式1において、望ましくは、sは1であり、o,p,qは0であり、rは2である。
　Ｃは、複合モチリン(J)における22-23位のアミノ酸配列（2アミノ酸：表14）カエルグレリン由来Ｃ末端フラグメント（配列番号58）における7－20位のアミノ酸配列（14アミノ酸：表5）や、公知の二次構造予測法（例えば、Chou-Fasman法：Biochemistry. 1974 Jan 15;13(2):222-45　Prediction of protein conformation.　Chou PY, Fasman GDや、Garnier法： J Mol Biol. 1978 Mar 25;120(1):97-120.　Analysis of the accuracy and implications of simple methods for predicting the secondary structure of globular proteins.　Garnier J, Osguthorpe DJ, Robson B.等）によりαヘリックス構造を形成すると予測されうる配列（例えば、AK(orE)LAALK(orE)A）を配置した複合モチリン(VI)(MG-H1)、(VII)(MG-H3)、(VIII)(MG-H4)が示すとおり、2～14アミノ酸程度の任意のアミノ酸数の配列を選択することができる。
　望ましくはαヘリックス構造を形成しうる3～11アミノ酸からなる任意の配列であり、より望ましくは、KKPPAKLQPR（複合モチリン(C)におけるＮ末端から22位～29位のアミノ酸からなる配列）、又はPPAELAALEA (複合モチリン(VII)(MG-H3)におけるＮ末端から22位～31位のアミノ酸からなる配列）であり、更に望ましくはPPAELAALEAである。また、前述の予測法によりシート構造を形成しうる任意の配列を用いることもできる。
　更に、複合モチリン(IV)(MG-dPP)と複合モチリン(D)との比較、複合モチリン(V)(MG-dPPH1)と複合モチリン(VI)(MG-H1)との比較，複合モチリン(IX)(MG-dPPS)と複合モチリン(X)(MG-S)との比較が示すとおり、本願発明に係る半減期延長ペプチドの式Ｃに相当するアミノ酸配列と式Bに相当するアミノ酸配列の間にProが存在しない場合は、当該式Ｃに相当するアミノ酸配列の末端部位にPro配列（Ｃのアミノ酸数が2～14となる範囲のPro数、望ましくは、Pro- Pro）を配置することが望ましい。
　なお、複合CNP(J)及び(K)が示すように、本願発明に係る半減期延長ペプチドの一般式のＢ（コア配列）に相当する配列を含む複合CNPも半減期延長作用を示したことから、複合モチリンの半減期の比較から導かれる本願発明に係る半減期延長ペプチドの一般式のＡ及びＣの要件を複合CNPに適用した場合に同様の半減期延長作用効果が得られることは当業者であれば容易に予測できることである。反対に複合CNPの半減期の比較から導かれる本願発明に係る半減期延長ペプチドの一般式のＢ及びＣの要件を複合モチリンに適用した場合に同様の半減期延長作用効果が得られることは当業者であれば容易に予測できることである。
　またその他の目的ペプチドとの複合体においても本願発明に係る半減期延長ペプチドの一般式のＡ、Ｂ及びＣの要件を適用した場合に同様の半減期延長作用効果が得られることは当業者であれば容易に予測できることである。
　Ａ、Ｂ及び／又はＣは各々が順方向又は逆方向であっても良い。即ち、Ａ、Ｂ及びＣは各々独立して順方向又は逆方向であっても良く、Ａ－Ｂ、Ｂ－Ｃ及びＡ－Ｂ－Ｃが全体として順方向又は逆方向であっても良い。ここで順方向と逆方向とは、Ｎ末端からＣ末端の配列方向が逆になっていることを意味する。
　本発明のペプチドがB単独である場合には、目的ペプチド側にＡ及び／又はＣの要件を満たす配列が存在する場合が含まれる。
　本発明の半減期延長ペプチドの好ましいものは、以下の(1)又は(2)のペプチドである。
(1)　Ａは、配列番号34においてＢに連続するアミノ酸番号1～4の1以上のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列
　　Ｂは、配列番号34におけるアミノ酸番号5～9のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列であり、
　　Ｃは、配列番号34においてＢに連続するアミノ酸番号10～17の1以上のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列である。
(2)　Ａは、配列番号67においてＢに連続するアミノ酸番号1～8の1以上のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列であり、
　Ｂは、配列番号67におけるアミノ酸番号9～13のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列であり、
　Ｃは、配列番号67においてＢに連続するアミノ酸番号14～17の1以上のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列である。
　配列番号67は配列番号34の逆配列である。
　Ｂは必須のコア配列である。
　換言すれば、本発明の半減期延長ペプチドは、配列番号34においてアミノ酸番号5～9のアミノ酸配列又はその逆配列に係る配列番号67においてアミノ酸番号9～13のアミノ酸配列を含み最大17アミノ酸のアミノ酸配列からなるペプチド、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドである。この場合の「１若しくは数個」は、例えば1～35個、好ましくは1～15個、より好ましくは1～10個、より好ましくは1～8個、より好ましくは1～6個、より好ましくは1～5個、より好ましくは1～4個、より好ましくは1～3個、より好ましくは1～2個である。
　本発明の半減期延長ペプチドには、ヒト、サル、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、シカ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、ウサギ、ネズミ、スンクス（ジャコウネズミ）、クジラのような哺乳類；シチメンチョウ、ニワトリのような鳥類；カメのような爬虫類；カエルのような両生類；ウナギ、ナマズ、サメのような魚類などのグレリンのＣ末端部分配列からなる半減期延長ペプチドが含まれる。
　上記配列番号34又は配列番号67の各Ａ、Ｂ、Ｃのアミノ酸配列におけるアミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは付加については、各種由来のアミノ酸配列の比較から、当業者であれば適宜当該修飾を行なうための適切なアミノ酸の位置及び種類を選択することができる。
　各種生物由来のグレリンのアミノ酸配列と、そのＣ末端部分の半減期延長ペプチド、コア配列Ｂの全長、コア配列のＮ末端側に存在することがある配列Ａの全長、及びコア配列のＣ末端側に存在することがある配列Ｃの全長を以下の表１～表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002



Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表１～表７中の各生物由来のグレリンのアミノ酸配列を以下に示す。下線部が半減期延長ペプチドに相当する部分である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
　また、表１～表７中の各生物由来の半減期延長ペプチド（正配列）のアミノ酸配列を以下に示す。下線部がコア配列Ｂに相当する部分であり、コア配列ＢのＮ末端側が配列Ａに相当する部分であり、コア配列ＢのＣ末端側が配列Ｃに相当する部分である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
　また、表１～表７中の各生物由来の半減期延長ペプチド（逆配列）のアミノ酸配列を以下に示す。下線部がコア配列Ｂに相当する部分であり、コア配列ＢのＮ末端側が配列Ａに相当する部分であり、コア配列ＢのＣ末端側が配列Ｃに相当する部分である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010
　これらの半減期延長ペプチドは、それが由来する種の個体に対して用いることが望ましく、例えばヒトに対してはヒト由来グレリンのＣ末端配列を用いることが望ましい。また、半減期延長ペプチドが、ＡＢ、ＢＣ、又はＡＢＣの配列からなる場合は、配列Ａ、Ｂ、Ｃは同一生物種由来のものを用いることが好ましいが、互いに異なる種由来の配列Ａ、Ｂ、Ｃを組み合わせたキメラペプチドであってもよい。キメラペプチドは、哺乳類、鳥類、爬虫類、及び両生類由来の配列を組み合わせることが好ましく、哺乳類由来の配列を組み合わせることがより好ましく、ヒト由来の配列を組み合わせることがさらにより好ましい。
　本発明において、目的ペプチドに結合させた場合にその生理活性を保持するとは、目的ペプチドのＮ末端、Ｃ末端又は両末端の何れに結合させた場合でも、目的ペプチドの活性の１％ 以上の活性を維持していることを指す。また、目的ペプチドの半減期を延長するとは、目的ペプチドのＮ末端、Ｃ末端又は両末端の何れに結合させた場合でも、当該目的ペプチドに比べて半減期が少しでも延長していることを指す。
（２）複合ペプチド
　生理活性を有するペプチドに、上記説明した本発明の半減期延長ペプチドをＮ末端側、Ｃ末端側又は両末端側に結合させることにより、体内動態が改善された本発明の複合ペプチドが得られる。両末端に半減期延長ペプチドを結合させる場合は、両方のペプチドは同じでもよく異なっていてもよい。
　Ａ及び／又はＣは目的ペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端にペプチド結合していてよい。或いは、Ａ及び／又はＣをＢに含まれるアミノ酸の側鎖、例えばリジン残基のアミノ基、グルタミン酸やアスパラギン酸のカルボキシル基等に付加することも本発明の一態様である。付加する場合の態様は、ペプチド結合又は所望により適宜他の適切な結合方法を選択することも可能である。
　目的ペプチドとしては、天然の生理活性ペプチド又は当該ペプチドに係るアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し且つ当該ペプチドの生理活性を有するペプチドである誘導体を用いることができる。本明細書において、特に言及しない限り、アミノ酸に関し「１若しくは数個が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された」というときの置換等されるアミノ酸の個数は、そのアミノ酸配列からなるペプチド又はその誘導体が所望の機能を有する限り特に限定されないが、例えば１～４個、又は１～２個程度であり、さらには複数箇所の選択も可能である。性質（電荷及び／又は極性）の似たアミノ酸への置換等であれば、多数のアミノ酸が置換されていても、所望の機能を消失しないと考えられる。また、本明細書中において、「アミノ酸」には、Ｌ－アミノ酸、Ｄ－アミノ酸、α－アミノ酸、β－アミノ酸、γ－アミノ酸、天然アミノ酸、合成アミノ酸等あらゆるアミノ酸が含まれる。
　更に、目的ペプチドが天然の生理活性ペプチドの誘導体である場合、そのアミノ酸配列としては、天然型のアミノ酸配列と比較して70％以上、好ましく80以上、より好ましくは90％以上、特に好ましく95以上、最も好ましくは97％以上の相同性を有することが望ましい。
　半減期延長ペプチドが結合する側の目的ペプチドの構造がA又は／及びCの構造要因を満たすものであればBが単独で結合しても良い。
　好適な目的ペプチドとしては、例えば、ナトリウム利尿ペプチド、望ましくは、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ANP：由来は限定されないが、例えば配列番号100のヒトANP）、脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP：由来は限定されないが、例えば配列番号160のヒトBNP)、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（CNP：由来は限定されないが、例えば配列番号101のCNP-22）、モチリン（由来は限定されないが、例えば配列番号102のヒトモチリン）、グルカゴン様ペプチド－１（GLP-1：由来は限定されないが、例えば配列番号103のヒトGLP-1(7-36)アミド）、副甲状腺ホルモン（PTH：由来は限定されないが、例えば配列番号104のヒトPTH（1-34））、カルシトニン（CT：由来は限定されないが、例えば配列番号105のヒトCT）等の短い半減期を示す生理活性ペプチド又はそれらの誘導体が挙げられる。
　当該誘導体は、元の生理活性ペプチドに係るレセプターを発現している培養細胞に作用させた後に培養液中の指標物質を測定することにより選択することができる。例えば、ANPやCNPにおいては、それらのレセプターであるGC-A又はGC-Bを発現している培養細胞に作用させた後に培養液中cyclic GMPを測定することにより選択することができる。また、GLP-1やモチリンのようなGPC-Rを発現している細胞に作用する活性ペプチドでは、細胞内カルシウム測定や培養液中のcyclic AMP測定等のシグナル伝達系活性化を測定することにより選択することができる。
　本発明には、複合ペプチドの塩も含まれる。塩は毒性がないものであればよいが、薬学的に許容される塩が好ましく、例えば無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性又は酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。
　無機塩基との塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩；並びにアルミニウム塩、アンモニウム塩などの塩が挙げられる。
　有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。
　無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。
　有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマール酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。
　塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
　以上の塩の中でも無機塩基との塩が好ましく、ナトリウム塩、カリウム塩が最も好ましい。
　ANP及びBNPを目的ペプチドとする複合ペプチド又はその薬学的に許容される塩は、ANP及びBNPのレセプターであるNPRA（GCA）を介する生理作用に基づく急性心不全及び慢性心不全の急性増悪の治療に有効であり、また近年では心筋梗塞後の予後の改善に非常に高い効果が認められている。これらを含め、閉塞性動脈硬化症、虚血性心疾患、高血圧症、浮腫性疾患、心筋症、腎炎、糖尿病性腎症、腎硬化症及び心筋梗塞等の治療剤の有効成分として用いることができる。
　CNPを目的ペプチドとする複合ペプチド又はその薬学的に許容される塩は、CNPのレセプターであるNPRB（GCB）を介する生理作用に基づく異型軟骨形成不全症や冠状動脈狭窄後のPTCA後等の再狭窄予防、肺性高血圧症や末梢動脈閉塞性疾患、変形性関節症、関節リウマチ、肺線維症、肝線維症、腎線維症、心筋梗塞及び心筋炎等への適用が有効であり、これらの治療剤の有効成分として用いることができる。
　モチリンを目的ペプチドとする複合ペプチド又はその薬学的に許容される塩は、モチリンのレセプターであるmotilin-Rを介する生理作用に基づく機能性ディスペプシア、逆流性食道炎、糖尿病性胃運動麻痺、便秘型過敏性腸症候群、慢性偽性腸閉塞、術後イレウス、慢性胃炎及び萎縮性胃炎等への適用が有効であり、これらの治療剤の有効成分として用いることができる。
　GLP-1を目的ペプチドとする複合ペプチド又はその薬学的に許容される塩は、糖尿病等への適用が有効であり、これらの治療剤の有効成分として用いることができる。また、PTHを目的ペプチドとする複合ペプチド又はその薬学的に許容される塩は、副甲状腺機能低下等への適用が有効であり、これらの治療剤の有効成分として用いることができる。
（３）複合ペプチドの製造方法
　本発明は、上記説明した本発明の半減期延長ペプチドを目的ペプチドのＮ末端側、Ｃ末端側、又は両末端側に結合させる、血漿中半減期が延長しかつ目的ペプチドの生理活性を有する複合ペプチドの製造方法も包含する。
　本発明に係る複合ペプチドは常法により得ることができる（例えば、J.Med.Chem.,43,pp.4370-4376,2000参照）。例えば、組換えDNA技術及び／又は化学的合成によって製造することができる。例えば組換えDNA技術を用いた製法においては、本発明に係る複合ペプチドをコードするDNAを有する発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を培養し、当該培養物から目的のペプチドを採取することにより本発明に係る複合ペプチドを得ることができる。
　遺伝子を組み込むベクターとしては、例えば大腸菌のベクター（pBR322、pUC18、pUC19等）、枯草菌のベクター（pUB110、pTP5、pC194等）、酵母のベクター（Yep型、YRp型、Yip型）、又は動物細胞のベクター（レトロウィルス、ワクシニアウィルス等）等が挙げられるが、その他のものであっても、宿主細胞内で安定に目的遺伝子を保持できるものであれば、いずれをも用いることができる。当該ベクターは、適当な宿主細胞に導入される。目的の遺伝子をプラスミドに組み込む方法や宿主細胞への導入方法としては、例えば、Molecular Cloning (Sambrook et al.,1989)に記載された方法が利用できる。
　上記プラスミドにおいて複合ペプチド遺伝子を発現させるために、当該遺伝子の上流にはプロモーターを機能するように接続させる。
　本発明において用いられるプロモーターとしては、目的遺伝子の発現に用いる宿主細胞に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、形質転換する宿主細胞がEscherichia属の場合はlacプロモーター、trpプロモーター、lppプロモーター、λPLプロモーター、recAプロモーター等を用いることができ、Bacillus属の場合はSPO1プロモーター、SPO2プロモーター等を用いることができ、酵母の場合はGAPプロモーター，PHO5プロモーター、ADHプロモーター等を用いることができ、動物細胞の場合は、SV40由来プロモーター、レトロウィルス由来プロモーター等を用いることができる。
　上記のようにして得られた目的とする遺伝子を含有するベクターを用いて宿主細胞を形質転換する。宿主細胞としては細菌（例えば、Escherichia属、Bacillus属等）、酵母（Saccharomyces属、Pichia属、Candida属等）、動物細胞（CHO細胞、COS細胞等）等を用いることができる。培養時の培地としては液体培地が適当であり、当該培地中には培養する形質転換細胞の生育に必要な炭素源、窒素源等が含まれることが特に好ましい。所望により培地にビタミン類、成長促進因子、血清などを添加することができる。
　培養後、培養物から本発明に係る複合ペプチドを常法により分離精製する。例えば、培養菌体又は細胞から目的物質を抽出するには、培養後、菌体又は細胞を集め、これをタンパク質変性剤（塩酸グアニジンなど）を含む緩衝液に懸濁し、超音波などにより菌体又は細胞を破砕した後、遠心分離を行う。次に上清から目的物質を精製するには、目的物質の分子量、溶解度、荷電（等電点）、親和性等を考慮して、ゲル濾過、限外濾過、透析、SDS-PAGE、各種クロマトグラフィーなどの分離精製方法を適宜組み合わせて行うことができる。
　また、本発明に係る複合ペプチドは常法により化学合成することができる。例えば、保護基の付いたアミノ酸を液相法及び／又は固相法により縮合、ペプチド鎖を延長させ、酸で全保護基を除去し、得られた粗生成物を精製することにより得られる。複合ペプチドの製造に用いることができる方法は従来既に種々の方法が知られており、本発明に係る物質としての複合ペプチドの製造も公知の方法に従って容易に製造でき、例えば古典的なペプチド合成法に従ってもよいし、固相法に従っても容易に製造できる。
　更に、組換えDNA技術と化学合成を併用した製法を用いてもよく、半減期延長ペプチドを目的ペプチドに係るアミノ酸中の側鎖、例えばリジン残基のアミノ基、グルタミン酸やアスパラギン酸のカルボキシル基等に付加する場合は化学合成により製造し、それ以外の部分については組換えDNA技術を用いて製造し、その後各々のフラグメントを融合させる方法でも製造することができる。
　この方法は、上記説明した本発明の半減期延長ペプチドを目的ペプチドのＮ末端側、Ｃ末端側、又は両末端側に結合させて、目的ペプチドの血漿中半減期を延長する方法と把握することもできる。
（４）製剤
　本発明の複合ペプチドはヒトを含む動物(個体)の医薬として使用できる。本発明の複合ペプチド又はその薬学的に許容される塩を薬学的に許容される担体とともに配合して、医薬組成物（医薬製剤）にすることができる。剤形は、特に限定されず、例えば経口投与のための内服用固形剤、内服用液剤、又は非経口投与のための注射剤などとして用いられる。
　経口投与のための内服用固形剤としては、例えば錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤又は顆粒剤等が挙げられ、内服用液剤としては、シロップ剤などが挙げられる。
　薬学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等が挙げられる。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加物を用いることもできる。
賦形剤の好適な例としては、例えば乳糖、白糖、D-マンニトール、デンプン、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸などが挙げられる。
　滑沢剤の好適な例としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカなどが挙げられる。
　結合剤の好適な例としては、例えば結晶セルロース、白糖、D-マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
　崩壊剤の好適な例としては、例えばデンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウムなどが挙げられる。
　溶剤の好適な例としては、例えば注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油などが挙げられる。
　溶解補助剤の好適な例としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、D-マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。
懸濁化剤の好適な例としては、例えばステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤；例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子などが挙げられる。
　等張化剤の好適な例としては、例えば塩化ナトリウム、グリセリン、D-マンニトールなどが挙げられる。
　緩衝剤の好適な例としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。
　無痛化剤の好適な例としては、例えばベンジルアルコールなどが挙げられる。
　防腐剤の好適な例としては、例えばパラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。
　抗酸化剤の好適な例としては、例えば亜硫酸塩、アスコルビン酸などが挙げられる。
　本発明の医薬の製剤形態としては非経口投与に適する製剤形態が好ましく、非経口投与に適する製剤形態としては、例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、又は筋肉内投与用等の注射剤、点滴剤、坐剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤又は吸入剤などを挙げることができるが、上記注射剤の製剤形態が好ましく、特に個体がヒト成人であり在宅治療の場合には経粘膜吸収剤、吸入剤、坐剤等の製剤形態も好ましい。これらの製剤形態は当業者に種々知られており、当業者は所望の投与経路に適する製剤形態を適宜選択し、必要に応じて当業界で利用可能な１又は２以上の製剤用添加物を用いて医薬用組成物の形態の製剤を製造することが可能である。
　例えば、注射剤又は点滴剤の形態の医薬は、有効成分である長い半減期を付与した複合ペプチドと共に適切な緩衝液、糖溶液、等張化剤、ｐＨ調節剤、無痛化剤、防腐剤などの１又は２以上の製剤用添加物を注射用蒸留水に溶解して滅菌（フィルター）濾過後にアンプル又はバイアル詰めするか、滅菌濾過した溶液を凍結乾燥して凍結乾燥製剤とすることにより調製し提供することができる。添加剤としては、例えばグルコース、マンニトール、キシリトール、ラクトースなどの糖類、ポリエチレングリコールなどの親水性ポリマー類、グリセロールなどのアルコール類、グリシンなどのアミノ酸類、血清アルブミンなどのタンパク類、NaCl、クエン酸ナトリウムなどの塩類、酢酸、酒石酸、アスコルビン酸、ヒアルロン酸などの酸類、Tween80などの界面活性剤、亜硫酸ナトリウムなどの還元剤などを使用することができる。このような製剤は、用時に注射用蒸留水や生理食塩水などを添加して溶解することにより注射剤又は点滴剤として使用できる。また、経粘膜投与には、点鼻剤や鼻腔内スプレー剤などの鼻腔内投与剤（経鼻投与剤）等も好適であり、経肺投与には吸入剤等も好適である。
　製剤中の複合ペプチド又はその薬学的に許容される塩の含量は、剤形によって異なるが、例えば0.001～1000 mg程度とすればよく、好ましくは0.01～100 mg程度、より好ましくは0.1～100mg程度、特に好ましくは1～100mg程度とすればよい。
　上記の投与量を1日1～3回、又は1週1～7回投与することが好ましく、投与期間は、目的ペプチドの種類によって異なり、特に限定されない。
　本発明の複合ペプチド又はその薬学的に許容される塩の使用量は、目的ペプチドの種類や、複合ペプチドの半減期によって適宜決定できる。
　このように、本発明は、上記説明した本発明の医薬組成物を個体に投与することを含む、当該医薬組成物に含まれる目的ペプチドによる治療が可能な疾患の治療方法を包含する。
　以下に、実施例を示して本発明をより詳細に説明する。
実施例１（天然型ANP、及び複合ANPの血漿中濃度推移）
　天然型ANP、及び天然型ANPに半減期延長ペプチドを付加した複合ペプチド（複合ANP）をラットの静脈内に投与したときの血漿中ANP免疫活性濃度の推移を検討した。
　実験は、予め大腿動脈にポリエチレンチューブ（PE-50、クレイ・アダムス社製）を挿入したラットを用いてネンブタール麻酔条件下で実施した。試験系として、7週齢の雄性SD系ラット（日本チャールズ・リバー社製）を１群３匹として実験に供した。ラットに、天然型ANP（α-hANP：配列番号100）又は複合ANP(A,B及びC)をそれぞれ0.1mg/kgの用量で静脈内又は背部皮下に投与し、投与前から投与後90分又は180分までの血液を大腿動脈に挿入したポリエチレンチューブより経時的に採取した。採取した血液に安定化剤及び抗凝固剤としてEDTA（同仁化学研究所製）及びアプロチニン（バイエル株式会社製）を加え、遠心分離により血漿を分離し、血漿中濃度を競合ラジオイムノアッセイ法（RIA法）により測定した（図1）。その際、抗体としてはANPのリング部分を認識するウサギポリクローナル抗体（＃8）を用い、標識化合物には１２５I-［Tyr28］α-hANPを用いた。
　なお、複合ANP(A,B及びC)の各アミノ酸配列は以下のとおりであり、いずれもヒト型グアニレートシクラーゼ受容体Ａ（GC-A受容体）アゴニスト活性を保持していた。
　複合ANP(A)：　CFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRYVQQRKESKKPPAKLQPR（下線部でS-S結合）（配列番号106）
　複合ANP(B)：　VQQRKESKKPPAKLQPRCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY（下線部でS-S結合）（配列番号107）
　複合ANP(C)：　RPQLKAPPKKSEKRQQVCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY（下線部でS-S結合）（配列番号108）
　得られた血漿中免疫活性濃度の推移から、薬物動態パラメータを算出した。その際、解析ソフトは、WinNonlin Professional Ver4.0.1（Pharsight Corporation社製、USA）を用いた。以下に各パラメータの算出方法を記載した。
　時間０における濃度（C0；外挿値、ng/mL）、血漿中濃度－時間曲線下面積（AUC；ng・min/mL）及び消失半減期（T1/2；分）を以下のとおり算出した。C0は各採血時点における血漿中免疫活性濃度の推移から時間０のときの値を外挿して算出した。AUCは、全ての測定時点（ｔ）における血漿中免疫活性濃度を用いて台形法によりを算出し、無限大時間までの外挿値を求めた。T1/2は血漿中免疫活性濃度の消失相における数点を結ぶ直線の傾きから、最小二乗法により算出した。皮下投与の際は、C0を求めずに最高血漿中濃度（Cmax；ng/mL）、最高血漿中濃度到達時間（Tmax；min）を求めた。Cmaxは各採血時点における血漿中免疫活性濃度のうち、最も高い値とし、TmaxはCmaxを示した血漿の採血時間を採用した。
　結果を、以下の表8及び表9に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　複合ANP(A,B及びC)を静脈内投与した場合、いずれの誘導体でも天然型ANPに比べて血漿中濃度が上昇して持続性を示した。
　また、複合ANP(A,B及びC)を皮下投与した場合、いずれの誘導体でも天然型ANPに比べて血漿中濃度が上昇して持続性を示した。
実施例２（天然型CNP-22、及び複合CNPの血漿中濃度推移及び生物活性）
　天然型CNP-22及びCNPに半減期延長ペプチドを付加した複合ペプチド（複合CNP）の血漿中CNP免疫活性濃度の推移を検討した。
　実験は、実施例1と同様に予め大腿動脈にポリエチレンチューブを挿入したラットを用いてネンブタール麻酔条件下で実施し、7週齢の雄性SD系ラット（日本チャールズ・リバー社製）を1群3匹として実験に供した。ラットに、天然型CNP-22（配列番号101）又は複合CNPのＡ及びＢを、それぞれ0.1mg/kgの用量で尾静脈内又は背部皮下に投与し、投与前及び投与後90分又は180分までの血液を大腿動脈に挿入したポリエチレンチューブより採取した。採取した血液には安定化剤及び抗凝固剤としてEDTA（同仁化学研究所製）及びアプロチニン（バイエル株式会社製）を加え、遠心分離により血漿を分離した。血漿中濃度を競合RIA法により測定した。その際、抗体としては天然型CNP-22のリング部分を認識するウサギポリクローナル抗体（＃2）を用い、標識化合物には１２５I-［Tyr０］CNPを用いた。薬物速度論的解析は実施例１と同様の方法で実施した。
　なお、複合CNPのＡ及びＢの各アミノ酸配列は以下のとおりであり、どちらもヒト型グアニレートシクラーゼ受容体Ｂ（GC-B受容体）アゴニスト活性を保持していた。
　複合CNP(A)：　RPQLKAPPKKSEKRQQVCFGLKLDRIGSMSGLGC（下線部でS-S結合）（配列番号109）
　複合CNP(B)：　CFGLKLDRIGSMSGLGCVQQRKESKKPPAKLQPR（下線部でS-S結合）（配列番号110）
　結果を図２、並びに以下の表10及び表11に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　静脈内投与後、天然型CNP-22は短半減期で速やかに血漿中から減少したが、複合CNPは投与後90分でも天然型CNP-22のおよそ100倍高い血漿中濃度を維持した。
　一方、天然型CNP-22及び複合CNPを皮下投与したとき、天然型CNP-22に比べて複合CNP投与時では最高血漿中濃度がおよそ1/2であり、血漿中からの消失が緩やかであった。以上のことから、複合CNPはラットにおいて、静脈内投与でも皮下投与でも天然型CNP-22に比べて長い半減期を示すことが明らかとなった。
　また、天然型CNP-22及び複合CNP(B)（構造前述）を皮下投与してCNPの生物活性を反映する血漿中cGMP濃度を競合RIA法により測定した（文献）。薬物の投与及び採血は血漿中CNP免疫活性濃度測定時と同じとした。血漿中cGMP濃度の測定には測定キットとしてYAMASA cGMP Assay Kit（ヤマサ醤油株式会社製）を使用した。結果を図3に示す。
　天然型CNP-22を皮下投与後の血漿中CNP免疫活性濃度は速やかに上昇した後、急速に減少して投与後60分でほぼ消失した。血漿中cGMP濃度は血漿中CNP免疫活性濃度よりも僅かに遅れて上昇し、投与後15～30分にピークに達した後、速やかに減少した。
　一方、複合CNPを皮下投与したとき、血漿中CNP免疫活性濃度の最高値は天然型CNP-22に比べて低く、血漿中cGMP濃度も天然型CNP-22投与時の約6割で投与後30～90分にかけて一定レベルで持続した。
実施例３（天然型CNP-22及び複合CNPのペプチド分解酵素耐性）
　天然型CNP-22及び複合CNPのペプチド分解酵素に対する耐性を検討した。
　実験は各サンプルN＝2で実施した。天然型CNP-22並びに複合CNP(A,B)（構造前述、最終濃度0.5μg/mL）ヒト型リコンビナント中性エンドペプチダーゼ（hNEP、R＆D systems Inc．製、USA）の100μL反応溶液（媒体：20mM MES pH6.5）を調整した。初期値試料は、調整後は直ちに5分間煮沸した。安定性評価試料は37℃に設定した恒温槽にて酵素反応を１時間実施した後に5分間煮沸した。煮沸後のサンプルに蒸留水を100μL添加し、よく混和したのちに50μLを高速液体クロマトグラフシステムLC-10A（株式会社島津製作所製）を用い、水・アセトニトリル系で解析した。解析データをクロマトパック（CRA-10A、株式会社島津製作所製）で解析し、未変化体のピークエリア面積を算出した。37℃で反応させたときの未変化体の平均エリア面積を煮沸サンプルの平均エリア面積で除することで１時間後の未変化体残存率を算出した。結果を以下の表12に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　天然型CNP-22溶液中にhNEPを加えて37℃に設定した恒温槽にて１時間反応させた後の試料中の天然型CNP-22未変化体の残存率は初期値の16.7％に低下したのに対し、複合CNP(A,B)の残存率はそれぞれ、84.3％及び83.8％であり、いずれもhNEPに対し、天然型CNP-22よりも代謝抵抗性を示すことが確認された。
　更に、天然型CNP-22及び複合CNP(B)のin vivoにおけるNEP抵抗性を静脈内投与後の血漿中CNP免疫活性濃度の推移に及ぼすNEP阻害剤の併用効果を指標にして評価した。
　本試験もまた、予め大腿動脈に採血用にポリエチレンチューブ（PE-50、クレイ・アダムス社製、USA）、NEP阻害剤投与用に大腿静脈にポリエチレンチューブ（PE-10、クレイ・アダムス社製、USA）を挿入したラットを用いてネンブタール麻酔条件下で実施した。試験系として、７週齢の雄性SD系ラット（日本チャールズ・リバー社製、体重約250g）を１群３匹として実験に供した。大腿静脈から媒体（5％マンニトール、100μL/min/body）又はNEP阻害剤（30μg/100μL/min/body）を定速静脈内投与した。投与時間は天然型CNP-22又は複合CNP(B)の投与10分前から投与後60分の採血終了までとした。天然型CNP-22及び複合CNP(B)は20μg/kgの用量で尾静脈内投与し、NEP阻害剤投与開始前（－10分）及びCNP投与前（0分）、投与60分後までの血液を大腿動脈カニューレより採取した。採取した血液は安定化剤及び抗凝固剤を加えた後に遠心分離後に血漿とし、血漿中免疫活性濃度を前述した競合RIA法により測定した。薬物速度論的解析は実施例１と同様の方法で実施した。
　結果を図4及び以下の表13に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　天然型CNP-22を静脈内投与したときの血漿中CNP免疫活性濃度は、NEP阻害剤を併用することにより顕著に増加した。NEP阻害剤を併用したときのAUCは非併用時の約3.7倍であり、半減期は約5倍であった。
　一方、複合CNPを投与したときの血漿中CNP免疫活性濃度の推移はNEP阻害剤を併用しても変わらず、ラット体内において複合CNP(B)は天然型CNP-22よりもNEPに分解されにくいことが確認された（表13）。
実施例４（天然型CNP-22及び複合CNPの伸長促進作用）（１）
　天然型CNP-22及び複合CNPの伸長促進作用を、マウスを用いて検討した。
　実験は３週齢の雌性S/VAF　Crlj：CD1（ICR）マウス（日本チャールズ・リバー社製）を用い、１群10匹として合計30匹を実験に供した。動物は母マウス3匹と一緒に2週齢で購入し、母マウス１匹に対して子マウス10匹を付けて１週間群飼いにした後に離乳させ、投与期間中は、各群とも5匹×2ケージでシースルーケージに群飼した。水は水道水を自由に摂取させ、餌は固型飼料（CRF-1、オリエンタル酵母工業株式会社製）を自由に摂取させた。媒体、天然型CNP-22又は複合CNP(B)（構造前述）をそれぞれ10mL/kg、0.25mg/kg及び0.25mg/kgの用量で1日2回、29日間背部皮下に反復投与し、投与期間中の身長、尾長及び体重を測定した。結果を図５に示す。
　図５に示すように、CNPに半減期延長ペプチドを結合した複合CNP(B)を反復皮下投与したマウスの身長は、媒体投与群に対して有意に増加したが、天然型CNP-22投与群の身長は媒体投与群と差はなかった。
　一方、体重については全ての投与群の間に差はみられなかった。
実施例５（天然型CNP-22及び複合CNPの抗原性）
　実施例４において、4週間反復投与終了後のマウスから採取した血清を用いて、天然型CNP-22又は複合CNP(B)に対する抗体が産生したかを検討するために、indirect ELISA法によりそれぞれの抗原性を評価した。
　マキシソープ処理済96wellプレート（Nalge Nunc International社製、Denmark）に50mM 　NaHCO３、pH8.5で1.0ng/μLに調整したペプチド溶液100μLを添加し4℃で終夜コーティング操作を行なった。2.0％ブロックエース（雪印乳業株式会社製）溶液を用い、１時間室温でブロッキングを行なった。ブロッキング後、10２～10５倍まで希釈した血清サンプルを添加し、１時間室温で抗原抗体反応を実施した。ウェルを洗浄した後、Anti-mouse IgG HRP Ab（Zymed Laboratories社製、USA）を添加した。１時間の抗原抗体反応を室温で行い、ウェルを洗浄した後、基質ABTS（KPL社製、USA）を添加した。室温で１時間反応の後に、405nmの吸光度をSPECTRA MAX 190（Molecular devices社製、USA）で測定し、発色の程度を抗体価として解析した。
　その結果、天然型CNP-22又は複合CNPのＢをそれぞれ0.25mg/kgの用量で１日２回、２９日間背部皮下に反復投与しても、天然型CNP-22及び複合CNP(B)に対する抗体価の上昇は認められなかった。
実施例６（天然型モチリン及び複合モチリンの血漿中半減期）(1)
　天然型モチリン（配列番号102）及び天然型モチリンの活性中心である配列番号102のアミノ酸番号１～１２のアミノ配列に、5～22個のアミノ酸残基からなる各種長さの半減期延長ペプチドを結合した１３種の複合モチリンＡ～Ｍ（配列番号111～123）を静脈内投与したときの血漿中モチリン免疫活性濃度推移を検討した。実験は予め大腿動脈にポリエチレンチューブ（PE-50、クレイ・アダムス社製）を挿入したラットを用いてネンブタール麻酔条件下で実施した。試験系として、７週齢の雄性SD系ラット（日本チャールズ・リバー社製）を１群３匹として実験に供した。ラットに、ヒト型モチリン又は誘導体をそれぞれ10nmol/kgの用量で尾静脈内に投与し、投与前及び投与後60分までの血液を大腿動脈に挿入したポリエチレンチューブより採取した。採取した血液には安定化剤及び抗凝固剤としてEDTA（同仁化学研究所製）及びアプロチニン（バイエル株式会社製）を加え、遠心分離により血漿を分離した。血漿中モチリン免疫活性濃度を競合ラジオイムノアッセイ法（RIA法）により測定した（図６）。その際、抗体としては配列番号102に示す天然型モチリンのアミノ酸番号１～１２を特異的に認識するウサギポリクローナル抗体（＃870623）を用い、標識化合物には１２５I-［Tyr７］ヒト型モチリンを用いた。
　天然型モチリン及び複合モチリン（A～M）のアミノ酸配列、分子量及び血漿中からの消失半減期を以下の表14に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　結果を図6にも示す。
　評価した全13種の複合モチリンは、すべてヒトモチリン受容体アゴニスト活性を保持していた。複合モチリン(Ｇ、Ｌ及びＭ)については天然型モチリンよりも体内からの有意な消失半減期延長作用が確認できず、アミノ酸配列ESKKの構造を失うと、作用が消失することが確認された。そのほかのモチーフに関してはいずれも天然型モチリンよりも体内半減期を延長させる作用があったが、その中でもRKESKKの構造を保持しているかどうかが、最も半減期延長作用に及ぼす影響が大きいことが確認された。
実施例７（天然型CNP-22及び複合CNPの血漿中半減期）（１）
　配列番号101に示す天然型CNP-22及び天然型CNP-22の活性中心である配列番号101におけるＮ末端から6位～22位のアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端、Ｃ末端又は両端に17アミノ酸残基からなる半減期延長ペプチドが結合した７種の複合CNP(C～I)（配列番号124～130）を静脈内投与したときの血漿中CNP免疫活性濃度の推移を検討した。
　実験は予め大腿動脈にポリエチレンチューブ（PE-50、クレイ・アダムス社製）を挿入したラットを用いてネンブタール麻酔条件下で実施した。試験系として、７週齢の雄性SD系ラット（日本チャールズ・リバー社製）を１群３匹として実験に供した。ラットに、天然型CNP-22又は複合CNPを、それぞれ10nmol/kgの用量で尾静脈内に投与し、投与前及び投与後６０分までの血液を大腿動脈に挿入したポリエチレンチューブより採取した。採取した血液には安定化剤及び抗凝固剤としてEDTA（同仁化学研究所）及びアプロチニン（バイエル株式会社製）を加え、遠心分離により血漿を分離した。血漿中CNP免疫活性濃度を競合ラジオイムノアッセイ法（RIA法）により測定した。その際、抗体としては天然型CNP-22のリング部分構造を特異的に認識するウサギポリクローナル抗体（＃２）を用い、標識化合物には１２５I-［Tyr０］CNPを用いた。
　複合CNPのアミノ酸配列、分子量及び血漿中からの消失半減期を表15に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　結果を図７にも示す。
　評価した複合CNP(C～I)は、全てヒトCNP受容体アゴニスト活性を保持していた。
　今回評価した複合CNPは全て、天然型CNP-22よりも消失半減期が長かった。このことより、今回評価した半減期延長ペプチドは、目的ペプチドのＮ末側若しくはＣ末側のどちらか片方又は両方に結合しても半減期延長作用があり、また、アミノ酸配列を逆にひっくり返してもその性質は損なわれないことが分った。さらにＣ末構造アミド化しても半減期延長作用があり、目的とするペプチドの構造に合わせて結合方式を選択することができることが示された。
実施例８（天然型モチリン及び複合モチリンの血漿中半減期）(２)
　天然型モチリン（配列番号102）及び天然型モチリンの活性中心である配列番号102のアミノ酸番号1～12のアミノ配列に14～22のアミノ酸残基からなる各種長さの半減期延長ペプチドを結合した26種の複合モチリン(N～Ｚ、及びＩ～XIII)（配列番号131～156）を静脈内投与したときの血漿中モチリン免疫活性濃度推移を検討した。
　実験は予め大腿動脈にポリエチレンチューブ（PE-50、クレイ・アダムス社製）を挿入したラットを用いてネンブタール麻酔条件下で実施した。試験系として、７週齢の雄性SD系ラット（日本チャールズ・リバー社製）を１群３匹として実験に供した。ラットに、ヒト型モチリン又は誘導体をそれぞれ10nmol/kgの用量で尾静脈内に投与し、投与前及び投与後60分までの血液を大腿動脈に挿入したポリエチレンチューブより経時的に採取した。採取した血液には安定化剤及び抗凝固剤としてEDTA（同仁化学研究所製）及びアプロチニン（バイエル株式会社製）を加え、遠心分離により血漿を分離した。血漿中モチリン免疫活性濃度を競合ラジオイムノアッセイ法（RIA法）により測定した（図8）。その際、抗体としては配列番号102に示す天然型モチリンのアミノ酸番号1～12を特異的に認識するウサギポリクローナル抗体（＃870623）を用い、標識化合物には１２５I-［Tyr７］ヒト型モチリンを用いた。
　天然型モチリン及び複合モチリン(Ｎ～Ｚ、及びＩ～XIII)のアミノ酸配列、分子量及び血漿中からの消失半減期を以下の表16及び図８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
　複合モチリン(XI)(MG-d12/14)の結果から、実施例6に係る複合モチリン(A～M)の結果と共に、本願発明に係る半減期延長ペプチドの一般式のうちＡについては、存在しなくても又は任意のアミノ酸数の配列が存在してもよいことが示された。当該配列が存在する場合の長さは1～9アミノ酸程度の長さがよく、望ましくは3～9アミノ酸、より望ましくは3アミノ酸であり、最も望ましくはVal－Gln－Glnであることが示された。
　複合モチリン(T)(MG-17E/N)、(U)(MG-17E/Q）、(W)(MG-Des)の結果から、本願発明に係る半減期延長作用に必要な構造（コア配列：RKESKK配列部分）におけるRKESKK中のE(Glu)は半減期延長作用に必要なアミノ酸であり、複合モチリン(V)(MG-ES/DS)及び(X)(MG-17E/D)の結果から、当該アミノ酸はD(Asp)に置換可能であることが示された。即ち、上記E(Glu)の位置のアミノ酸は酸性アミノ酸であればよいことが示された。
　複合モチリン(O)(MG-18S/F）、(P)(MG-18S/T）、(Q)（MG-18S/P）、(R)(MG-18S/L）、及び(S)(MG-18S/A）の結果から、RKESKK中のS(Ser)については、T(Thr）、P（Pro）、L(Leu）、F(Phe）又はA(Ala）に置換可能であることが示された。即ち、上記S(Ser)の位置のアミノ酸は、芳香族アミノ酸、疎水性アミノ酸、及び極性無電荷アミノ酸等のいずれの側鎖構造をもつアミノ酸でも置換可能であることが示された。また、複合モチリン(N)(MG-dS）の結果から、上記S(Ser)の位置のアミノ酸は存在しなくてもよいことが示された。
　複合モチリン(X)(MG-17E/D)の結果から、RKESKK中のR(Arg)及びK(Lys)については、各々塩基性アミノ酸であれば置換可能であることが示された。
　RKESKK配列部分は、塩基性アミノ酸クラスター（塩基性アミノ酸２個の連続配列）と酸性アミノ酸を含むことを特徴とするが、複合モチリン(Z)(MG-i17G）、 (I)(MG-i19G）、(II)(MG-i17G2）、及び(III)(MG-i17G2-i19G)の結果から、当該クラスター間の距離は任意のアミノ酸の挿入により拡張が可能であることが示された。
　塩基性アミノ酸クラスター間の距離は、表16に記載された各複合ペプチドの結果から、1～5アミノ酸であることが示された。
　複合モチリン(Y)(MG-BR)の結果から、RKESKKの並び方については逆向き（KKSEKR）でもよいことが示された。
　また、複合モチリン(XII)(MGP1）、(XIII)(MGP2)の結果から、コア配列に相当する配列を２個タンデムに配置した場合でも半減期延長作用が増強されることが示され、分子内に複数のコア配列を有することも、より長い血中半減期延長を達成するために有効な手段であることが示された。
　複合モチリン(VI)（MG-H1）、(VII)（MG-H3）、(VIII)（MG-H4）は、本願発明に係る半減期延長ペプチドの一般式のうちＣに係る部分において、２つのPro（Pro-Pro配列）に続いて、公知の二次構造予測法（Chou-Fasman法：Biochemistry. 1974 Jan 15;13(2):222-45　Prediction of protein conformation.　Chou PY, Fasman GD、又はGarnier法： J Mol Biol. 1978 Mar 25;120(1):97-120.　Analysis of the accuracy and implications of simple methods for predicting the secondary structure of globular proteins.　Garnier J, Osguthorpe DJ, Robson B.）によりαヘリックス構造を形成すると予測されうる配列を配置したペプチドである。これらの複合ペプチドの結果から、本願発明に係る半減期延長ペプチドの一般式のうちＣについては、αヘリックス構造を形成しうる任意のアミノ酸配列を配置することが望ましいことが示された。
　更に、複合モチリン(IV)(MG-dPP)と複合モチリンＤとの比較、複合モチリン(V)(MG-dPPH1)と複合モチリン(VI)(MG-H1)との比較，複合モチリン(IX) (MG-dPPS)と複合モチリン(X)(MG-S)との比較が示すとおり、本願発明に係る半減期延長ペプチドの式Ｃに相当するアミノ酸配列のＮ末端にP(Pro)が存在しない場合は、当該部位にP(Pro)配列（Ｃのアミノ酸数が2～14となる範囲のPro数、望ましくは、Pro－Pro）を配置することが望ましいことが示された。
実施例９（天然型CNP-22及び複合CNPの血漿中半減期）（２）
　配列番号101に示す天然型CNP-22及び天然型CNP-22の活性中心である配列番号101におけるＮ末端から6位～22位のアミノ酸配列からなるペプチドのＣ末端に17又は20アミノ酸残基からなる半減期延長ペプチドが結合した複合CNP（D、J、K）（複合CNPのＪは配列番号157、複合CNPのＫは配列番号158）を静脈内投与したときの血漿中CNP免疫活性濃度の推移を検討した。
　実験は予め大腿動脈にポリエチレンチューブ（PE-50、クレイ・アダムス社製）を挿入したラットを用いてネンブタール麻酔条件下で実施した。試験系として、7週齢の雄性SD系ラット（日本チャールズ・リバー社製）を１群3匹として実験に供した。ラットに、天然型CNP-22又は複合CNPを、それぞれ20nmol/kgの用量で尾静脈内に投与し、投与前及び投与後90分までの血液を大腿動脈に挿入したポリエチレンチューブより採取した。採取した血液には安定化剤及び抗凝固剤としてEDTA（同仁化学研究所）及びアプロチニン（バイエル株式会社製）を加え、遠心分離により血漿を分離した。血漿中濃度を競合ラジオイムノアッセイ法（RIA法）により測定した。その際、抗体としては天然型CNP-22のリング部分構造を特異的に認識するウサギポリクローナル抗体（＃2）を用い、標識化合物には１２５I-［Tyr０］CNPを用いた。
　複合CNPのアミノ酸配列、分子量及び血漿中からの消失半減期を表１７及び図9に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　今回評価した複合CNPは全て、天然型CNP-22よりも消失半減期が有意に長かった。
　複合CNP(J）の結果より、本願発明に係る半減期延長ペプチドの一般式のＢ（コア配列）に係るRKESKK中のE(Glu）については、Eの代わりにD(Asp)であってもよいことが示された。
　また、複合CNP(K)の結果より、本願発明に係る半減期延長ペプチドの一般式のＢ（コア配列）に係るRKESKK中の塩基性アミノ酸クラスター（RK、KK）とEの間には、任意のアミノ酸（例えば、Val(複数可)、H又はP）が存在していてもよいことが示された。更に、本願発明に係る半減期延長ペプチドの一般式のＡに係る部分については、特に特定のアミノ酸配列が必要なわけではなく、任意のアミノ酸でよいことが示された。例えば、Ａに係る部分のアミノ酸数は10以内であればよいことが示された。
実施例１０（複合CNPの伸長促進作用）（２）
　複合CNP(D、J)の伸長促進作用の用量依存性について、マウスを用いて検討した。
　実験は3週齢の雌性S/VAF　Crlj：CD1（ICR）マウス（日本チャールズ・リバー社製）を用い、１群10匹として合計30匹を実験に供した。動物は母マウス3匹と一緒に2週齢で購入し、母マウス１匹に対して子マウス10匹を付けて１週間群飼いにした後に離乳させ、投与期間中は、各群とも5匹×2ケージでシースルーケージに群飼した。水は水道水を自由に摂取させ、餌は固型飼料（CRF-1、オリエンタル酵母工業株式会社製）を自由に摂取させた。媒体又は複合CNP(D、J)（構造前述）をそれぞれ5mL/kg、50nmol/kg及び200nmol/kgの用量で1日1回、56日間背部皮下に反復投与し、投与期間中の身長、尾長及び体重を測定した。結果を図10に、複合CNPＪ投与終了翌日のマウスの全身写真を図11に示す。
　図10に示すように、天然型CNP-22に半減期延長ペプチドを結合した複合CNP(D、J)を反復皮下投与することにより、マウスの身長及び尾長は用量に依存して有意に増加した。
実施例１１（複合CNPの伸長促進作用）（３）
　複合CNPの伸長促進作用を、ラットを用いて検討した。
　実験は３週齢の雌性SD(IGS)系ラット（日本チャールズ・リバー社製）を用い、１群５匹として合計20匹を実験に供した。動物は17日齢で購入し、母ラット１匹に対して子ラット10匹を付けて予備飼育した後に離乳させた。投与期間中は各群ともアルミハンギングケージにて飼育した。水は水道水を自由に摂取させ、餌は固型飼料（CRF-1、オリエンタル酵母工業株式会社製）を自由に摂取させた。媒体又は複合CNP（D）（構造前述）を5mL/kg、50nmol/kg及び200nmol/kgの用量で1日１回、56日間背部皮下に反復投与し、投与期間中の身長、尾長及び体重を測定した。結果を図12に示す。
　図12に示すように、天然型CNP-22に半減期延長ペプチドを結合した複合CNP（D）を12.5、50及び200nmol/1mL/kgの用量で反復皮下投与したラットの身長は、媒体投与群に対して有意に増加した。
実施例１２（天然型CNP及びCNP-53並びに複合CNPの血漿中半減期比較）
　配列番号101に示す天然型CNP-22を単独投与又は中性エンドペプチダーゼ(NEP)阻害剤と併用投与したときの血漿中CNP免疫活性濃度の推移を測定し、天然型CNP-53(配列番号159)及び複合CNP(D)（構造前述）を静脈内投与したときの血漿中CNP免疫活性濃度の推移と比較した。
　実験は予め大腿動脈にポリエチレンチューブ（PE-50、クレイ・アダムス社製）を挿入したラットを用いてネンブタール麻酔条件下で実施した。天然型CNP-22を単独投与又はNEP阻害剤と併用投与した群では大腿静脈にもにポリエチレンチューブ（PE-10、クレイ・アダムス社製）を挿入した。試験系として、７週齢の雄性SD系ラット（日本チャールズ・リバー社製）を１群３匹として実験に供した。NEP阻害剤としてはDL-Thiorphan（Sigma社製）を用い、天然型CNP-22の投薬開始10分前から投与開始後60分の採血終了まで５％マンニトール(100μL/min/body）又はNEP阻害剤（30μg/100μL/min/body）をInfusion Pump（CFV2100、日本光電株式会社製）を用いて70分間定速静脈内投与した。ラットに、天然型CNP-22、天然型CNP-53又は複合CNP(D)を、それぞれ20nmol/kgの用量で尾静脈内に投与し、投与前及び投与後60分までの血液を大腿動脈に挿入したポリエチレンチューブより採取した。採取した血液には安定化剤及び抗凝固剤としてEDTA（同仁化学研究所）及びアプロチニン（バイエル株式会社製）を加え、遠心分離により血漿を分離した。血漿中CNP免疫活性濃度を競合ラジオイムノアッセイ法（RIA法）により測定した。その際、抗体としては天然型CNP-22及び天然型CNP-53の共通構造であるリング部分構造を特異的に認識するウサギポリクローナル抗体（＃２）を用い、標識化合物には１２５I-［Tyr０］CNP-22を用いた。
　天然型CNP-22、天然型CNP-53及び複合CNP(D)のアミノ酸配列、分子量及び血漿中からの消失半減期を表18及び図13に示す。


Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
　表18及び図13より、複合CNP(D)は天然型CNP-22、天然型CNP-22+NEP阻害剤及び天然型CNP-53のいずれに対しても半減期が長いことが示された。天然型CNP-53はNEP抵抗性があるために、天然型CNP-22に比べると半減期が長く、天然型CNP-22にNEP阻害剤を併用した場合の薬物動態パターンは両者でほぼ同等なので、天然型CNP-53の1-21位内にNEP耐性をもたらすアミノ酸配列が存在すると考えられる。また天然型CNP-53の1-21位内には本願発明に係る一般式B（コア配列相当部分）に類似した配列が存在する(RKYKGANKK)。
　複合CNP(D)は天然型CNP-53に比べ、より良好な薬物動態パターンを示したことから、一般式Bで表される塩基性アミノ酸クラスター間に酸性アミノ酸が配置されることが、より長い半減期の特性を有するには必要であることが示された。
　本発明に係る半減期延長ペプチドを短半減期である目的ペプチドに付加することにより、体内動態が改善されて医薬として実用的な半減期を有するものとなる。

Claims (14)

  1. 　以下の（Ｉ）又は（ＩＩ）のペプチド
    （Ｉ）　式：Ｂ、Ａ－Ｂ、Ｂ－Ｃ、又はＡ－Ｂ－Ｃで表され、式中、Ａ、Ｂ及びＣが、それぞれ以下の（１）、（２）、及び（３）に示されるものであり、他の目的ペプチドに結合させた場合に、当該目的ペプチドの生理活性を保持しつつ、当該目的ペプチドに比べて血漿中の半減期を延長できるペプチド
    （ＩＩ）　（Ｉ）のペプチドとは逆向きの配列、（Ｉ）においてＡ－Ｂで表されＡ若しくはＢが逆向きの配列、（Ｉ）においてＢ－Ｃで表されＢ若しくはＣが逆向きの配列、又は（Ｉ）においてＡ－Ｂ－Ｃで表されＡ、Ｂ、Ｃ、Ａ及びＢ、Ｂ及びＣ、若しくはＡ及びＣが逆向きの配列からなるペプチド
    （１）Ａは、1～14の任意のアミノ酸からなるペプチド
    （２）Ｂは、式1：(Wk-Xl-Y-Zm-Wn)-(Wo-Xp-Y-Zq-Wr）sで表されるペプチド
    （式1中、Wは塩基性アミノ酸であり、X及びZは任意のアミノ酸であり、Yは酸性アミノ酸である。k=1又は2、4≧l≧0の整数、2≧m≧0の整数、4≧l+m≧０、n=1又は2である。o=1又は2、4≧p≧0の整数、2≧q≧0の整数、4≧p+q≧0、r=1又は2である。s=0又は1である。）
    （３）Ｃは、2～14の任意のアミノ酸からなるペプチド
  2. 　Ｂが式1においてs=1のペプチドである請求項１に記載のペプチド。
  3. 　上記式1において、o＝0、ｐ=0、ｑ=0、ｒ=２である請求項２に記載のペプチド。
  4. 　Ｃが、αヘリックス構造を取り得る4～9個のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のペプチド。
  5. 　Ｃが、その末端とαヘリックス構造を取り得るアミノ酸配列との間にPro配列を有する、請求項４に記載のペプチド。
  6. 　上記のＡ、Ｂ、及びＣが、以下の(1)又は(2)である請求項１に記載のペプチド。
    (1)　Aは、配列番号34においてBに連続するアミノ酸番号1～4の1以上のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列
    　Bは、配列番号34におけるアミノ酸番号5～9のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列であり、
    　Ｃは、配列番号34においてＢに連続するアミノ酸番号１０～１７の1以上のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列である。
    (2)　Ａは、配列番号67においてＢに連続するアミノ酸番号１～８の１以上のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列であり、
    　　Ｂは、配列番号67におけるアミノ酸番号９～13のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列であり、
    　　Ｃは、配列番号67においてＢに連続するアミノ酸番号14～１７の1以上のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列である。
  7. 　請求項１～６の何れかに記載のペプチドからなる群より選ばれるペプチドが、目的ペプチドのＮ末端、Ｃ末端、又は両末端に結合した複合ペプチド。
  8. 　目的ペプチドが、心房性ナトリウム利尿ペプチド、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド若しくはモチリン、又はこれらの誘導体である請求項７に記載の複合ペプチド。
  9. 　請求項７に記載の複合ペプチド又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする医薬組成物。
  10. 　請求項１～６の何れかに記載のペプチドからなる群より選ばれるペプチドを、目的ペプチドのＮ末端、Ｃ末端又は両末端に結合させることを特徴とする、目的ペプチドに比べて血漿中の半減期が延長され且つ当該目的ペプチドの生理活性を有する複合ペプチドの製造方法。
  11. 　目的ペプチドが、ナトリウム利尿ペプチド若しくはモチリン、又はこれらの誘導体である請求項１０に記載の方法。
  12. 　請求項１～６の何れかに記載のペプチドからなる群より選ばれるペプチドを、目的ペプチドのＮ末端、Ｃ末端又は両末端に結合させることを特徴とする、目的ペプチドの血漿中の半減期を延長する方法。
  13. 　目的ペプチドが、心房性ナトリウム利尿ペプチド、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド若しくはモチリン、又はこれらの誘導体である請求項１２に記載の方法。
  14. 　請求項９に記載の医薬組成物を個体に投与することを含む、当該医薬組成物に含まれる目的ペプチドによる治療が可能な疾患の治療方法。
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Cited By (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012118042A1 (ja) 2011-02-28 2012-09-07 独立行政法人国立循環器病研究センター 悪性腫瘍転移抑制用医薬
WO2013027680A1 (ja) 2011-08-19 2013-02-28 独立行政法人国立循環器病研究センター ナトリウム利尿ペプチド受容体gc-aアゴニスト及びgc-bアゴニストを組み合わせてなる悪性腫瘍の増悪防止用医薬
WO2013099376A1 (ja) * 2011-12-26 2013-07-04 国立大学法人福井大学 体外受精における成熟卵子マーカー及びその使用
WO2014115797A1 (ja) 2013-01-23 2014-07-31 第一三共株式会社 糖鎖修飾心房性ナトリウム利尿ペプチド
WO2015129812A1 (ja) * 2014-02-27 2015-09-03 第一三共株式会社 ステロイド剤投与で誘発される成長障害に対する医薬
US9266939B2 (en) 2010-12-27 2016-02-23 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising natriuretic peptides and methods of use thereof
WO2018139464A1 (ja) 2017-01-24 2018-08-02 第一三共株式会社 低身長症治療剤
US10052366B2 (en) 2012-05-21 2018-08-21 Alexion Pharmaceuticsl, Inc. Compositions comprising alkaline phosphatase and/or natriuretic peptide and methods of use thereof
US10449236B2 (en) 2014-12-05 2019-10-22 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Treating seizure with recombinant alkaline phosphatase
US10603361B2 (en) 2015-01-28 2020-03-31 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating a subject with an alkaline phosphatase deficiency
US10822596B2 (en) 2014-07-11 2020-11-03 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating craniosynostosis
US10898549B2 (en) 2016-04-01 2021-01-26 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypophosphatasia in adolescents and adults
US10988744B2 (en) 2016-06-06 2021-04-27 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Method of producing alkaline phosphatase
US11065306B2 (en) 2016-03-08 2021-07-20 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypophosphatasia in children
US11066469B2 (en) 2019-06-12 2021-07-20 Novartis Ag Natriuretic peptide receptor 1 antibodies and methods of use
US11116821B2 (en) 2016-08-18 2021-09-14 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating tracheobronchomalacia
US11186832B2 (en) 2016-04-01 2021-11-30 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Treating muscle weakness with alkaline phosphatases
US11224637B2 (en) 2017-03-31 2022-01-18 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypophosphatasia (HPP) in adults and adolescents
US11229686B2 (en) 2015-09-28 2022-01-25 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Reduced frequency dosage regimens for tissue non-specific alkaline phosphatase (TNSALP)-enzyme replacement therapy of hypophosphatasia
JP2022025104A (ja) * 2016-01-08 2022-02-09 アセンディス ファーマ グロース ディスオーダーズ エー／エス 環部分にキャリア結合を有するｃｎｐプロドラッグ
US11248021B2 (en) 2004-04-21 2022-02-15 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Bone delivery conjugates and method of using same to target proteins to bone
US11352612B2 (en) 2015-08-17 2022-06-07 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Manufacturing of alkaline phosphatases
US11400140B2 (en) 2015-10-30 2022-08-02 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating craniosynostosis in a patient
US11913039B2 (en) 2018-03-30 2024-02-27 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Method for producing recombinant alkaline phosphatase
US12083169B2 (en) 2021-02-12 2024-09-10 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Alkaline phosphatase polypeptides and methods of use thereof

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102225470B1 (ko) * 2009-05-20 2021-03-10 바이오마린 파머수티컬 인크. 씨형 나트륨이뇨 펩티드의 변이체
EP2481751A1 (en) * 2011-01-26 2012-08-01 PharmaSurgics in Sweden AB Human lactoferrin derived peptides
JPWO2013161895A1 (ja) * 2012-04-25 2015-12-24 第一三共株式会社 骨修復促進剤
WO2013172967A1 (en) 2012-05-17 2013-11-21 Extend Biosciences, Inc Carriers for improved drug delivery
CA2964463C (en) 2014-10-22 2024-02-13 Extend Biosciences, Inc. Therapeutic vitamin d conjugates
US9616109B2 (en) 2014-10-22 2017-04-11 Extend Biosciences, Inc. Insulin vitamin D conjugates
US9789197B2 (en) 2014-10-22 2017-10-17 Extend Biosciences, Inc. RNAi vitamin D conjugates
EP3757119A1 (en) * 2015-11-16 2020-12-30 Ubiprotein, Corp. A method for extending half-life of a protein
KR102373744B1 (ko) * 2016-01-08 2022-03-15 아센디스 파마 그로우쓰 디스오더스 에이/에스 낮은 npr-c 결합을 갖는 제어 방출성 cnp 작용제
EP4043010A1 (en) * 2016-05-06 2022-08-17 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Elp fusion proteins for controlled and sustained release
CA3056433A1 (en) * 2017-03-22 2018-09-27 Pharmain Corporation Npra agonists, compositions, and uses thereof
JP7378839B2 (ja) * 2018-12-26 2023-11-14 スキンメドカンパニーリミテッド アセチルコリン受容体阻害ペプチド及びその用途
WO2024162772A1 (ko) * 2023-02-01 2024-08-08 주식회사 에이티지씨 생체 내 지속성이 증가된 생리활성물질의 결합체

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007058359A1 (ja) * 2005-11-21 2007-05-24 University Of Miyazaki グレリン及びその誘導体又はＧＨＳ－Ｒ１ａに作用する物質を有効成分とする皮膚修復促進治療剤
WO2007058360A1 (ja) * 2005-11-21 2007-05-24 University Of Miyazaki デスアシルグレリン及びその誘導体を有効成分とする皮膚修復促進治療剤
WO2008018597A1 (fr) * 2006-08-11 2008-02-14 University Of Miyazaki Agent thérapeutique permettant d'accélérer la réparation des nerfs rachidiens comprenant en tant que matière active de la désacyl ghréline ou un dérivé de celle-ci
WO2008018600A1 (fr) * 2006-08-11 2008-02-14 University Of Miyazaki AGENT THÉRAPEUTIQUE PERMETTANT D'ACCÉLÉRER LA RÉPARATION DES NERFS RACHIDIENS COMPRENANT EN TANT QUE MATIÈRE ACTIVE DE LA GHRÉLINE, UN DÉRIVÉ DE CELLE-CI OU UNE SUBSTANCE CAPABLE D'AGIR SUR LE GHS-R1a

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3026354B2 (ja) * 1990-09-27 2000-03-27 壽之 松尾 ヒトｃｎｐ遺伝子及び前駆体蛋白
US20060263382A1 (en) * 1998-06-20 2006-11-23 Richard Hotchkiss Membrane-permeant peptide complexes for treatment of sepsis
PT1197496E (pt) 1999-07-23 2007-08-29 Kenji Kangawa Novos péptidos
CN101519449A (zh) * 2001-08-30 2009-09-02 比奥雷克西斯药物公司 经修饰的运铁蛋白融合蛋白
EP1427750B1 (en) * 2001-08-30 2010-12-08 Biorexis Pharmaceutical Corporation Modified transferrin fusion proteins
US20100034194A1 (en) * 2006-10-11 2010-02-11 Siemens Communications Inc. Eliminating unreachable subscribers in voice-over-ip networks

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007058359A1 (ja) * 2005-11-21 2007-05-24 University Of Miyazaki グレリン及びその誘導体又はＧＨＳ－Ｒ１ａに作用する物質を有効成分とする皮膚修復促進治療剤
WO2007058360A1 (ja) * 2005-11-21 2007-05-24 University Of Miyazaki デスアシルグレリン及びその誘導体を有効成分とする皮膚修復促進治療剤
WO2008018597A1 (fr) * 2006-08-11 2008-02-14 University Of Miyazaki Agent thérapeutique permettant d'accélérer la réparation des nerfs rachidiens comprenant en tant que matière active de la désacyl ghréline ou un dérivé de celle-ci
WO2008018600A1 (fr) * 2006-08-11 2008-02-14 University Of Miyazaki AGENT THÉRAPEUTIQUE PERMETTANT D'ACCÉLÉRER LA RÉPARATION DES NERFS RACHIDIENS COMPRENANT EN TANT QUE MATIÈRE ACTIVE DE LA GHRÉLINE, UN DÉRIVÉ DE CELLE-CI OU UNE SUBSTANCE CAPABLE D'AGIR SUR LE GHS-R1a

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DONG, J. Z. ET AL.: "GHS-la receptor agonists that are highly effective in stimulating body weight gain and food intake.", BIOPOLYMERS, vol. 80, no. 4, 2005, pages 578 - 579, XP008131378 *
KOJI MAGOTA: "Idenshi Kumikae ni yoru Peptide Iyakuhin no Chosei", GENE & MEDICINE MOOK, no. 8, July 2007 (2007-07-01), pages 232 - 238 *
PEMBERTON, C. J. ET AL.: "Biochemistry of Ghrelin Precursor Peptides", VITAMINS AND HORMONES, vol. 77, December 2007 (2007-12-01), pages 13 - 30, XP008131376 *
See also references of EP2277890A4 *

Cited By (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11248021B2 (en) 2004-04-21 2022-02-15 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Bone delivery conjugates and method of using same to target proteins to bone
US9266939B2 (en) 2010-12-27 2016-02-23 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising natriuretic peptides and methods of use thereof
EP3189835A1 (en) 2011-02-28 2017-07-12 National Cerebral and Cardiovascular Center Medical agent for suppressing malignant tumor metastasis
WO2012118042A1 (ja) 2011-02-28 2012-09-07 独立行政法人国立循環器病研究センター 悪性腫瘍転移抑制用医薬
WO2013027680A1 (ja) 2011-08-19 2013-02-28 独立行政法人国立循環器病研究センター ナトリウム利尿ペプチド受容体gc-aアゴニスト及びgc-bアゴニストを組み合わせてなる悪性腫瘍の増悪防止用医薬
WO2013099376A1 (ja) * 2011-12-26 2013-07-04 国立大学法人福井大学 体外受精における成熟卵子マーカー及びその使用
US10052366B2 (en) 2012-05-21 2018-08-21 Alexion Pharmaceuticsl, Inc. Compositions comprising alkaline phosphatase and/or natriuretic peptide and methods of use thereof
WO2014115797A1 (ja) 2013-01-23 2014-07-31 第一三共株式会社 糖鎖修飾心房性ナトリウム利尿ペプチド
KR20150110537A (ko) 2013-01-23 2015-10-02 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 당 사슬 수식 심방성 나트륨 이뇨 펩티드
JPWO2014115797A1 (ja) * 2013-01-23 2017-01-26 第一三共株式会社 糖鎖修飾心房性ナトリウム利尿ペプチド
US10947289B2 (en) 2013-01-23 2021-03-16 Daiichi Sankyo Company, Limited Glyco-modified atrial natriuretic peptide
WO2015129812A1 (ja) * 2014-02-27 2015-09-03 第一三共株式会社 ステロイド剤投与で誘発される成長障害に対する医薬
US10822596B2 (en) 2014-07-11 2020-11-03 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating craniosynostosis
US11224638B2 (en) 2014-12-05 2022-01-18 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Treating seizure with recombinant alkaline phosphatase
US10449236B2 (en) 2014-12-05 2019-10-22 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Treating seizure with recombinant alkaline phosphatase
US10603361B2 (en) 2015-01-28 2020-03-31 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating a subject with an alkaline phosphatase deficiency
US11564978B2 (en) 2015-01-28 2023-01-31 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating a subject with an alkaline phosphatase deficiency
US11352612B2 (en) 2015-08-17 2022-06-07 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Manufacturing of alkaline phosphatases
US11229686B2 (en) 2015-09-28 2022-01-25 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Reduced frequency dosage regimens for tissue non-specific alkaline phosphatase (TNSALP)-enzyme replacement therapy of hypophosphatasia
US11400140B2 (en) 2015-10-30 2022-08-02 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating craniosynostosis in a patient
JP2022025104A (ja) * 2016-01-08 2022-02-09 アセンディス ファーマ グロース ディスオーダーズ エー／エス 環部分にキャリア結合を有するｃｎｐプロドラッグ
US11065306B2 (en) 2016-03-08 2021-07-20 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypophosphatasia in children
US10898549B2 (en) 2016-04-01 2021-01-26 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypophosphatasia in adolescents and adults
US11186832B2 (en) 2016-04-01 2021-11-30 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Treating muscle weakness with alkaline phosphatases
US10988744B2 (en) 2016-06-06 2021-04-27 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Method of producing alkaline phosphatase
US11116821B2 (en) 2016-08-18 2021-09-14 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating tracheobronchomalacia
WO2018139464A1 (ja) 2017-01-24 2018-08-02 第一三共株式会社 低身長症治療剤
US11224637B2 (en) 2017-03-31 2022-01-18 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypophosphatasia (HPP) in adults and adolescents
US11913039B2 (en) 2018-03-30 2024-02-27 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Method for producing recombinant alkaline phosphatase
US11066469B2 (en) 2019-06-12 2021-07-20 Novartis Ag Natriuretic peptide receptor 1 antibodies and methods of use
US12083169B2 (en) 2021-02-12 2024-09-10 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Alkaline phosphatase polypeptides and methods of use thereof

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EP2277890A1 (en) 2011-01-26
KR101350251B1 (ko) 2014-01-14

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