KR20150110537A - 당 사슬 수식 심방성 나트륨 이뇨 펩티드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 혈중 지속성이 연장되고, 또한, cGMP 상승 활성을 유지한, 수식 심방성 나트륨 이뇨 펩티드를 제공한다. 본 발명은 적어도 하나의 당 물질이 직접 글리코시드 결합에 의해 연결, 또는 링커 구조를 개재하여, 적어도 하나의 hANP 펩티드와 연결된 수식 펩티드, 또는 그 약학상 허용되는 염, 당해 수식 펩티드 또는 그 염을 유효 성분으로서 함유하는 의약 등을 제공한다.

Description

당 사슬 수식 심방성 나트륨 이뇨 펩티드{GLYCOSYLATION ATRIAL NATRIURETIC PEPTIDE}
본 발명은, 당 사슬이 결합하여, 혈중에서의 지속성이 개선된, 당 사슬 수식 심방성 나트륨 이뇨 펩티드, 그것을 유효 성분으로서 함유하는 의약 등에 관한 것이다.
심방성 나트륨 펩티드는 혈관 확장 작용, 이뇨 작용 세포 증식 억제 작용, 정맥 관유량의 저하 작용, 교감 신경 활성 억제 작용을 갖는 생리 활성 펩티드이다. 천연형의 hANP 는 혈중의 중성 엔도펩티다아제 (NEP) 에 의해 절단됨으로써 활성을 상실하므로, 혈중 반감기가 짧기 때문에, 현재의 임상에서는, 점적 등 에 의한 연속 투여가 필요하다.
혈중 반감기가 짧은 생리 활성 펩티드의 혈중 반감기를 연장하는 시도로서는, 서방화 제제의 적용, 아미노산의 치환이나 수식, 알부민, 면역 글로블린 Fc 부분 등을 연결시킨 융합 펩티드, PEG 등의 고분자를 부가시킨 수식 펩티드 등 여러 가지 방법을 들 수 있다. 생리 활성 펩티드의 생리 활성을 이용한 의약에 적용하려면, 당해 펩티드가 갖는 생리 활성을 약리상 필요한 레벨로 유지한 채로, 혈중 반감기를 연장할 필요가 있다. 이와 같이 혈중 반감기를 연장한 생리 활성 펩티드를 의약에 적용하려는 시도는 많은 펩티드에 대해 실시되고 있다.
비특허문헌 1 (Procc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91, 12544-12548), 비특허문헌 2 (Bioconjugate Chem. 2008, 19, 342-348) 에는, 심방성 나트륨 이뇨 펩티드 (ANP) 에 PEG 를 결합시킨 수식 펩티드가 개시되어 있다.
특허문헌 1 (WO2006/076471 A2) 에는, 뇌성 나트륨 이뇨 펩티드 (BNP) 에 PEG 를 결합시킨 수식 펩티드가 개시되어 있다.
특허문헌 2 (WO2008/154226 A1), 비특허문헌 3 (Bioconjugate Chem. 2012, 23, 518-526) 에는, ANP 에 면역 글로블린 Fc 부위를 결합시킨 융합 단백질이 기재되어 있다.
특허문헌 3 (WO2004/047871 (A2, A3), 특허문헌 4 (WO2009/142307 A1) 에는, ANP 의 아미노산 배열을 개변한 변이체가 개시되어 있다.
그러나, 반드시 성공하는 것은 아니다. 특히, 충분한 혈중 체류 시간과 약리 효과에 필요한 활성의 유지를 양립할 수 있는지의 여부는 실제로 많은 시험을 실시해 보지 않으면 예측할 수 없는 것이다.
국제 특허 공개 공보 WO2006/076471 국제 특허 공개 공보 WO2008/154226 국제 특허 공개 공보 WO2004/047871 국제 특허 공개 공보 WO2009/142307
Procc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91, 12544-12548, Bioconjugate Chem. 2008, 19, 342-348) Bioconjugate Chem. 2012, 23, 518-526
본 발명은, 천연형의 인간 심방성 나트륨 이뇨 펩티드 (hANP) 와 비교해서, 혈중 지속 시간이 연장되고, 또한, cGMP 상승 활성을 유지한 개량 펩티드를 알아내는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은 혈중 지속 시간이 연장되고, 또한, cGMP 상승 활성을 유지한 hANP 의 수식에 대해 예의 검토한 결과, hANP 에 당 사슬을 여러 가지 방법으로 결합시킨 수식 펩티드가 GC-A 수용체 발현 세포에 대해 세포 내 cGMP 농도를 상승시킨 것, 마우스에 투여했을 때의 혈중 지속 시간이 연장된 것, 이 때, 수식 펩티드의 투여 후 60 분 이후에 있어서도 지속적으로 혈중의 cGMP 농도가 상승하고 있던 것 등을 알아내어, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 이하를 제공하는 것이다.
(1) 적어도 하나의 당 물질이, 직접 글리코시드 결합에 의해 연결, 또는, 링커 구조를 개재하여, 적어도 하나의 hANP 펩티드와 연결된 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염.
(2) 당 물질이, hANP 펩티드의, N 말단, C 말단, 및, 펩티드를 구성하는 적어도 하나의 아미노산의 측사슬 중 적어도 한 지점에 있어서, 직접 글리코시드 결합에 의해 연결, 또는, 링커 구조를 개재하여 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 (1) 의 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염.
(3) hANP 펩티드가 hANP(1-28), hANP(2-28), hANP(3-28), hANP(1-27), hANP(2-27) 또는 hANP(3-27) 인 (1) 의 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염.
(4) 당 물질이 적어도 1 종류의 단당류, 이당류, 삼당류, 및, 4 개 이상의 단당류가 글리코시드 결합되어 이루어지는 당 사슬에서 선택되고, 1 분자 중에 복수의 당 물질이 함유되는 경우, 그들이 동일하거나, 서로 상이해도 되는, (1) 의 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염.
(5) 당 물질이 4 개 이상의 단당류가 글리코시드 결합한 당 사슬인 것을 특징으로 하는, (1) 의 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염.
(6) 당 물질이, 당 단백질에서 유래하는, N 결합형 당 사슬, O 결합형 당 사슬, 또는 그들의 개변 당 사슬인 것을 특징으로 하는, (5) 의 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염.
(7) 당 물질이, 이하의 식으로 나타내는 당 사슬 구조를 포함하는, N 결합형 당 사슬 또는 그 환원 말단 개변 당 사슬인 것을 특징으로 하는, (6) 의 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염.
[화학식 1]
Figure pct00001
(식 중, Gxx 는 GlcNAc, Glc 또는 Man 이며 (상기 구조로 이루어지는 당 사슬을, 이하, GXX 의 종류에 따라 각각 「AG(5)」, 「AG(5-Glc)」, 및, 「AG(5-Man)」 이라고 한다), “O/N-L” 은 O 글리코시드 결합 또는 N 글리코시드 결합에 의해 링커 구조 또는 hANP 펩티드와 결합하는 것을 나타낸다)
(8) 당 물질이 이하의 식으로 나타내는 당 사슬 구조를 포함하는 당 사슬인, (7) 의 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염,
[화학식 2]
Figure pct00002
(식 중, Gxx 는 GlcNAc, Glc 또는 Man (상기 구조로 이루어지는 당 사슬을, 이하, GXX 의 종류에 따라 각각 「AG(7)」, 「AG(7-Glc)」, 및, 「AG(7-Man)」 이라고 한다) 이며, “O/N-L” 은 O 글리코시드 결합 또는 N 글리코시드 결합에 의해 링커 구조 또는 hANP 펩티드와 결합하는 것을 나타낸다)
(9) 당 물질이 이하의 식으로 나타내는 당 사슬 구조를 포함하는 당 사슬인, (8) 의 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염,
[화학식 3]
Figure pct00003
(식 중, Gxx 는 GlcNAc, Glc 또는 Man 이며 (상기 구조로 이루어지는 당 사슬을, 이하, GXX 의 종류에 따라 각각 「AG(9)」, 「AG(9-Glc)」, 및, 「AG(9-Man)」 이라고 한다), “O/N-L” 은 O 글리코시드 결합 또는 N 글리코시드 결합에 의해 링커 구조 또는 hANP 펩티드와 결합하는 것을 나타낸다)
(10) 당 물질이 이하의 식으로 나타내는 당 사슬 구조를 포함하는 당 사슬인, (9) 의 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염,
[화학식 4]
Figure pct00004
(식 중, Gxx 는 GlcNAc, Glc 또는 Man 이며 (상기 구조로 이루어지는 당 사슬을, 이하, GXX 의 종류에 따라 각각 「SG」, 「SG(Glc)」, 및, 「SG(Man)」 이라고 한다), “O/N-L” 은 O 글리코시드 결합 또는 N 글리코시드 결합에 의해 링커 구조 또는 hANP 펩티드와 결합하는 것을 나타낸다)
(11) 당 물질에 있어서, Gxx 가 GlcNAc 인, (7) ∼ (10) 중 어느 한 항의 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염.
(12) 당 물질이 SG 인, (11) 의 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염.
(13) 1 개의 hANP 펩티드에 대해, 10 개 이하의 당 물질이 연결되어 있는 것을 특징으로 하는, (1) 의 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염.
(14) 1 개의 hANP 펩티드에 대해, 1 개, 2 개, 또는, 3 개의 당 물질이 연결되어 있는 것을 특징으로 하는, (1) 의 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염.
(15) 1 분자 중에, 2 가 이상의 hANP 펩티드를 함유하는, (1) 의 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염.
(16) hANP 펩티드와 당 물질이 링커 구조를 개재하여 연결되어 있고, 링커 구조가 3 원자 이상의 연결 사슬을 가지며, 적어도 한 지점에서 당 물질의 환원 말단과 글리코시드 결합하고, 또한, 적어도 한 지점에서 hANP 펩티드와 결합하는 화학 구조인 (3) 의 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염.
(17) 당 물질이 hANP 펩티드의 N 말단, C 말단 중 어느 일방, 또는, 그 양방에 링커 구조를 개재하여 연결되어 있는 (16) 의 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염.
(18) 링커 구조가 15 원자 이하의 연결 사슬을 갖는 구조인 (17) 의 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염.
(19) SG-hANP(1-28) (화합물 2-1), hANP(1-28)-SG (화합물 2-2), SG-hANP(1-28)-SG (화합물 2-7), AG(9)-hANP(1-28) (화합물 2-10), SG-triazole-hANP(1-28) (화합물 2-12), SG-thioacetamide-hANP(1-28) (화합물 2-25), AG(5)-hANP(1-28) (화합물 2-26), 또는, 이들의 수식 펩티드에 있어서, 당 물질이 SG, SG(Glc), SG(Man), AG(5), AG(5-Glc), AG(5-Man), AG(7), AG(7-Glc), AG(7-Man), AG(9), AG(9-Glc), AG(9-Man) 혹은 GlcNAc 로 치환되고, 및/혹은, hANP 펩티드가 hANP(1-28), hANP(2-28), hANP(3-28), hANP(1-27), hANP(2-27) 혹은 hANP(3-27) 로 치환된 것인 (18) 의 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염.
(20) 링커 구조가, 폴리옥시알킬렌 사슬, 아미노산, 및, 2 이상의 아미노산으로 이루어지는 올리고펩티드 사슬 중, 적어도 하나의 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는, (16) 의 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염.
(21) 링커 구조에 포함되는 폴리옥시알킬렌 사슬, 아미노산 및/또는 올리고펩티드 사슬이 hANP 펩티드의 N 말단 및/또는 C 말단과 아미드 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 (20) 의 수식 펩티드.
(22) 폴리옥시알킬렌 사슬이 PEG 인 (21) 의 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염.
(23) SG-PEG(3)-(SG-)Asn-hANP(1-28) (화합물 2-16), AG(9)-(AG(9)-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28) (화합물 2-21), AG(7)-(AG(7)-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28) (화합물 2-22), SG-PEG(3)-hANP(1-28)-PEG(3)-SG (화합물 2-24), SG-(SG-)Asn-PEG(11)-hANP(1-28) (화합물 2-27), SG-(SG-)Asn-PEG(11)-PEG(11)-hANP(1-28) (화합물 2-28), SG-PEG(3)-hANP(1-28) (화합물 2-29), SG-PEG(11)-hANP(1-28) (화합물 2-30), SG-*(SG-)Gln-Mal-PEG(3)-hANP(1-28) (화합물 2-31), SG-(SG-)Gln-PEG(3)-Mal-hANP(1-28) (화합물 2-32), SG-(SG-)Asn-(Ser-Gly)3-hANP(1-28) (화합물 2-36), SG-(SG-)Asn-Gly6-hANP(1-28) (화합물 2-37),
또는, 이들의 수식 펩티드에 있어서, 당 물질이 SG, SG(Glc), SG(Man), AG(5), AG(5-Glc), AG(5-Man), AG(7), AG(7-Glc), AG(7-Man), AG(9), AG(9-Glc), AG(9-Man) 혹은 GlcNAc 로 치환되고, 및/혹은, hANP 펩티드가 hANP(1-28), hANP(2-28), hANP(3-28), hANP(1-27), hANP(2-27) 혹은 hANP(3-27) 로 치환된 것인 (21) 의 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염.
(24) 링커 구조가 아미노기 측사슬 아미노산, SH 측사슬 아미노산, 카르복실기 측사슬 아미노산, 수산기 측사슬 아미노산 또는 페놀 측사슬 아미노산 중 적어도 하나의 관능기 측사슬 아미노산을 포함하고, 당해 관능기 측사슬 아미노산의 측사슬에 있어서, 당 물질 또는 hANP 펩티드와 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 (20) 의 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염.
(25) 링커 구조가 적어도 하나의 아미노기 측사슬 아미노산을 포함하고, 당 물질이 당해 아미노기 측사슬 아미노산의 측사슬에 연결되어 있고, 이하의 일반식 (C) 의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 (24) 의 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염,
[화학식 5]
Figure pct00005
(식 중, GLY 는 당 물질을 나타내고, Lg 는 링커 구조 중의 당 사슬측 구조를 나타내고, 직사슬 또는 2 이상으로 분기해도 된다. GLY 와 L 은 O- 또는 N-글리코시드 결합으로 결합되어 있고, Lg 가 분기하고 있는 경우, 분기 말단과 동수의 GLY 를 연결할 수 있다. N-(AA) 는 아미노기 측사슬 아미노산의 측사슬의 아미노기에서 유래하는 질소 원자를 나타낸다).
(26) 아미노기 측사슬 아미노산의 측사슬 아미노기 및 α 아미노기가 다른 아미노산의 α 카르복실기와 아미드 결합을 형성하고 있는 것을 특징으로 하는 (25) 의 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염.
(27) 아미노기 측사슬 아미노산이 Lys 인 (25) 또는 (26) 의 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염.
(28) SG-(SG-)Lys-Gly-hANP(1-28) (화합물 2-14), [(SG-)Cys-Gly]3-hANP(1-28) (화합물 2-15), SG-Mal-(SG-Mal-)Lys-[SG-Mal-(SG-Mal)Lys-]Lys-PEG(3)-hANP(1-28) (화합물 2-19), [SG2-Mal-(SG2-Mal-)Lys-[SG2-Mal-(SG2-Mal-)-Lys-]Lys-PEG(3)-hANP(1-28) (화합물 2-20), SG-Mal-(SG-Mal-)Lys-hANP(1-28) (화합물 2-33), SG-thioacetamide-(SG-thioacetamide-)Lys-PEG-(3)-hANP(1-28) (화합물 2-34), SG-(SG-)Lys-PEG(3)-hANP(1-28) (화합물 2-35),
또는, 이들의 수식 펩티드에 있어서, 당 물질이 SG, SG(Glc), SG(Man), AG(5), AG(5-Glc), AG(5-Man), AG(7), AG(7-Glc), AG(7-Man), AG(9), AG(9-Glc), AG(9-Man) 혹은 GlcNAc 로 치환되고, 및/혹은, hANP 펩티드가 hANP(1-28), hANP(2-28), hANP(3-28), hANP(1-27), hANP(2-27) 혹은 hANP(3-27) 로 치환된 것인 (27) 의 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염.
(29) 링커 구조가 적어도 하나의 SH 기 측사슬 아미노산을 포함하고, 당 물질이 당해 아미노기 측사슬 아미노산의 측사슬에 연결되어 있고, 이하의 일반식의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 (24) 의 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염,
[화학식 6]
Figure pct00006
(식 중, GLY 는 당 물질을 나타내고, Lg 는 링커 구조 중의 당 사슬측 구조를 나타내고, 직사슬 또는 2 이상으로 분기해도 된다. GLY 와 L 은 O- 또는 N-글리코시드 결합으로 결합되어 있고, Lg 가 분기하고 있는 경우, 분기 말단과 동수의 GLY 를 연결할 수 있다. S 는 SH 기 측사슬 아미노산의 측사슬 SH 기에서 유래하는 황 원자를 나타낸다).
(30) SH 기 측사슬 아미노산이 Cys 인 (29) 의 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염.
(31) [(SG-)Cys-Gly]5-hANP(1-28) (화합물 2-17), [(SG2-)Cys-Gly]5-hANP(1-28) (화합물 2-18),
SG-Mal-(SG-Mal-)Lys-[SG-Mal-(SG-Mal-)Lys-]Lys-PEG(11)-hANP(1-28) (화합물 2-23),
또는, 이들의 수식 펩티드에 있어서, 당 물질이 SG, SG(Glc), SG(Man), AG(5), AG(5-Glc), AG(5-Man), AG(7), AG(7-Glc), AG(7-Man), AG(9), AG(9-Glc), AG(9-Man) 혹은 GlcNAc 로 치환되고, 및/혹은, hANP 펩티드가 hANP(1-28), hANP(2-28), hANP(3-28), hANP(1-27), hANP(2-27) 혹은 hANP(3-27) 로 치환된 것인 (30) 의 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염.
(32) 링커 구조가 적어도 하나의 카르복실기 측사슬 아미노산을 포함하고, 당 물질이 당해 카르복실산 측사슬 아미노산의 측사슬에 연결되어 있고, 이하의 일반식의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 (24) 의 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염,
[화학식 7]
Figure pct00007
(식 중, GLY 는 당 물질을 나타내고, Lg 는 링커 구조 중의 당 사슬측 구조를 나타내고, 직사슬 또는 2 이상으로 분기해도 된다. GLY 와 L 은 O- 또는 N-글리코시드 결합으로 결합되어 있고, Lg 가 분기하고 있는 경우, 분기 말단과 동수의 GLY 를 연결할 수 있다. CO 는 카르복실산 측사슬 아미노산의 측사슬에서 유래하는 CO 를 나타낸다).
(33) 당 물질이, 카르복실기 측사슬 아미노산의, 측사슬 카르복실기 및 α 카르복실기의 양방에 N 글리코시드 결합되어 있고, α 아미노기를 개재하여 다른 링커 구조 또는 hANP 펩티드와 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 (32) 의 수식 펩티드.
(34) 카르복실산기 측사슬 아미노산이 Glu, Gln, ASp 또는 Asn 인 (32) 또는 (33) 의 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염.
(35) (SG-)Asn-hANP(1-28) (화합물 2-3), (SG-)Asn-hANP(2-28) (화합물 2-4), (SG-)Asn-hANP(3-28) (화합물 2-8), SG-(SG-)Asn-hANP(1-28) (화합물 2-9), SG-(SG-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28) (화합물 2-13) 또는, 이들의 수식 펩티드에 있어서, 당 물질이 SG, SG(Glc), SG(Man), AG(5), AG(5-Glc), AG(5-Man), AG(7), AG(7-Glc), AG(7-Man), AG(9), AG(9-Glc), AG(9-Man) 혹은 GlcNAc 로 치환되고, 및/혹은, hANP 펩티드가 hANP(1-28), hANP(2-28), hANP(3-28), hANP(1-27), hANP(2-27) 혹은 hANP(3-27) 로 치환된 것인 (34) 의 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염.
(36) 링커 구조가 적어도 하나의 페놀 측사슬 아미노산을 포함하고, 당 물질이 당해 페놀 측사슬 아미노산의 측사슬에 연결되어 있고, 이하의 일반식의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 (24) 의 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염,
[화학식 8]
Figure pct00008
(식 중, GLY 는 당 물질을 나타내고, Lg 는 링커 구조 중의 당 사슬측 구조를 나타내고, 직사슬 또는 2 이상으로 분기해도 된다. GLY 와 L 은 O- 또는 N-글리코시드 결합으로 결합되어 있고, Lg 가 분기하고 있는 경우, 분기 말단과 동수의 GLY 를 연결할 수 있다. 페놀기는 페놀기 측사슬 아미노산의 측사슬에서 유래하는 페놀기를 나타낸다).
(37) 페놀기 측사슬 아미노산이 Tyr 인 (36) 의 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염.
(38) hANP(1-27)-(SG-)Tyr (화합물 2-6) 또는, 이들의 수식 펩티드에 있어서, 당 물질이 SG, SG(Glc), SG(Man), AG(5), AG(5-Glc), AG(5-Man), AG(7), AG(7-Glc), AG(7-Man), AG(9), AG(9-Glc), AG(9-Man) 혹은 GlcNAc 로 치환되고, 및/혹은, hANP 펩티드가 hANP(1-28), hANP(2-28), hANP(3-28), hANP(1-27), hANP(2-27) 혹은 hANP(3-27) 로 치환된 것인 (37) 의 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염.
(39) 링커 구조가 적어도 하나의 수산기 측사슬 아미노산을 포함하고, 당 물질이 당해 수산기 측사슬 아미노산의 측사슬에 O-글리코시드 결합되어 있는, 이하의 일반식의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 (24) 의 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염,
[화학식 9]
Figure pct00009
(식 중, GLY 는 당 물질을 나타내고, O 는 수산기 측사슬 아미노산의 측사슬 수산기에서 유래하는 산소 원자를 나타낸다).
(40) 수산기 측사슬 아미노산이 Ser 인 (39) 의 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염.
(41) (SG-)Ser-hANP(2-28) (화합물 2-5)
또는, 이들의 수식 펩티드에 있어서, 당 물질이 SG, SG(Glc), SG(Man), AG(5), AG(5-Glc), AG(5-Man), AG(7), AG(7-Glc), AG(7-Man), AG(9), AG(9-Glc), AG(9-Man) 혹은 GlcNAc 로 치환되고, 및/혹은, hANP 펩티드가 hANP(1-28), hANP(2-28), hANP(3-28), hANP(1-27), hANP(2-27) 혹은 hANP(3-27) 로 치환된 것인 (40) 의 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염.
(42) 당 물질로서 1 또는 2 개의 SG, hANP 펩티드로서 1 개의 hANP(1-28) (배열 번호 1) 을 가지며, SG 가 hANP(1-28) 의 N 말단에, 10 원자 이하의 연결 사슬을 갖는 링커 구조를 개재하여 연결되어 있는, (16) ∼ (41) 중 어느 한 항의 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염. 또, 여기서, 본 발명의 수식 펩티드의 약학상 허용되는 염으로서 바람직하게는, 트리플루오로아세트산염 또는 아세트산염이다.
(43) 하기의 화합물 2-1, 2-3, 2-10, 2-11, 2-12, 2-13, 2-14, 2-15, 2-16, 2-25, 2-26, 2-27, 2-29, 또는, 2-30 의 식으로 나타내는 구조로 이루어지는 (1) 의 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염,
[화학식 10]
Figure pct00010
[화학식 11]
Figure pct00011
[화학식 12]
Figure pct00012
[화학식 13]
Figure pct00013
(화합물 2-11)
[화학식 14]
Figure pct00014
(화합물 2-12)
[화학식 15]
Figure pct00015
(화합물 2-13)
[화학식 16]
Figure pct00016
(화합물 2-14)
[화학식 17]
Figure pct00017
(화합물 2-15)
[화학식 18]
Figure pct00018
(화합물 2-16)
[화학식 19]
Figure pct00019
(화합물 2-25)
[화학식 20]
Figure pct00020
(화합물 2-26)
[화학식 21]
Figure pct00021
(화합물 2-27)
[화학식 22]
Figure pct00022
(화합물 2-29)
[화학식 23]
Figure pct00023
(화합물 2-30)
(상기 식에 있어서, hANP 는 배열 번호 1 의 아미노산 배열로 이루어지는 hANP(1-28) 이며, 당해 아미노산 배열의 N 말단에 있어서, 링커 구조와 아미드 결합되어 있다).
(44) 약학상 허용되는 염이 트리플루오로아세트산염 혹은 아세트산염인 (1) ∼ (43) 중 어느 한 항, 바람직하게는, (42) 또는 (43) 의 수식 펩티드의 염.
(45) 당 물질이 hANP 펩티드의 아미노산 측사슬에 연결되어 있고, 당해 연결된 아미노산이 hANP 펩티드에 포함되는 배열 번호 1 의 아미노산 번호 7 ∼ 23 의 아미노산 이외의 아미노산인 것을 특징으로 하는, (3) 의 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염.
(46) 수식되어 있지 않은 hANP(1-28) 과 비교해서 연장된 혈중 지속 시간을 나타내고, 또한, cGMP 상승 활성을 유지하는 것을 특징으로 하는 (1) 의 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염.
(47) 중성 엔도펩티다아제에 의한 hANP 펩티드의 분해에 대해 저항성을 갖는 것을 특징으로 하는 (1) 에 기재된 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염.
(48) 수식되어 있지 않은 hANP(1-28) 과 비교해서, 3 배 이상의 수용성을 나타내는 것을 특징으로 하는 (1) 의 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염.
(49) (1) ∼ (48) 중 어느 한 항에 기재된 수식 펩티드 또는 그 약학상 허용되는 염을 함유하는 의약.
(50) 순환기 질환의 치료제 또는 경감제인 (49) 의 의약.
(51) 유효량의 (1) ∼ (48) 중 어느 한 항의 수식 펩티드 또는 그 약학상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 순환기 질환을 치료 또는 경감시키는 방법.
(52) hANP 펩티드, 당 물질, 및 필요에 따라 링커 분자, 피전이 화합물을 연결시키는 공정을 포함하는, (1) ∼ (48) 중 어느 한 항에 기재된 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염의 제조 방법.
(53) Endo-M 또는 그 변이 효소를 사용하여, GlcNAc 화합물, Glc 화합물 또는 Man 화합물에 당 사슬을 전이시키는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 (52) 의 방법.
본 발명의 수식 펩티드는 수식되어 있지 않은 hANP(1-28) (이하, 「천연형 hANP」 라고도 한다) 보다 혈중 지속 시간이 연장되고, 또한, cGMP 상승 활성을 유지하고 있기 때문에, 임상에 있어서, 비연속 투여에 의한 약효 발현이나 천연형에서는 치료 효과를 얻을 수 없었던 질환에 대한 적용이 가능해진다. 또, 본 수식 펩티드는 천연형 hANP 와 비교해서 우수한 수용해성을 나타내기 때문에, 제제의 고용량화나 고농도화 등에 의한 다양한 투여 방법에 대한 적용이 가능해진다. 그 때문에, 본 수식 펩티드에 의해, 천연형 hANP 에서는 달성할 수 없었던, 다양한 의료 요구에 대응하는 것이 가능해진다.
도 1 은 SG-oxa/화합물 1-12A 의 NMR 차트를 나타낸다.
이하, 본 발명에 대해 상세하게 설명한다.
본 발명은, 적어도 하나의 당 물질이, 직접 글리코시드 결합에 의해, 또는, 링커 구조를 개재하여, 적어도 하나의 hANP 펩티드와 연결된 수식 펩티드를 제공한다. 본 발명의 수식 펩티드는 수식을 받지 않는 hANP(1-28) 과 비교해서 연장된 혈중 지속 시간을 나타내고, 또한, hANP(1-28) 이 갖는 cGMP 상승 활성을 유지하는 것이다. 본 발명의 수식 펩티드는 자연계로부터 분리되어, 인공적으로 제조 공정을 관리하여 제조된, 그 구조가 실질적으로 균일한 수식 펩티드이다. 본 발명의 수식 펩티드에는, 천연에 존재할 수 있는, 생체 내 또는 배양 세포 내에 있어서 생리적으로 산생된 펩티드는 포함되지 않고, 이와 같은 천연에 존재하는 물질 자체는 본 발명의 범위로부터 명확하게 배제된다.
본 발명에 있어서, 복수의 구조 단위 (예를 들어, hANP 펩티드, 당 물질, 링커 구조 등) 가 「연결되었다」 란, 각각의 구조 단위가 직접 공유 결합에 의해 결합되어 있거나, 또는, 링커 구조를 개재하여 간접적으로 결합됨으로써, 동일 분자 중에 존재하고 있는 것을 의미한다. 구조 단위간을 연결하는 화학 구조는 특별히 한정되지 않는다. 직사슬형의 구조로 연결된 경우, 각각의 구조 단위를 1 분자에 1 개 포함하게 된다. 분기한 구조에 의해 연결된 경우, 1 분자 중에 어느 일방, 또는, 양방의 구조 단위를 복수 포함하고 있어도 된다. 링커 구조와 각각의 구조 단위의 사이의 결합 양식은 특별히 한정되지 않고, 연결되는 구조 단위의 종류에 따른 결합 양식이 선택된다.
＜hANP 펩티드＞
본 발명에 있어서, 「hANP 펩티드」 란, 28 개의 아미노산으로 이루어지는 생리 활성 펩티드인 인간형 심방성 나트륨 이뇨 펩티드 (human Atrial Natriuretic Peptide：배열 번호 1, 이하 hANP, 또는, hANP(1-28) 의 아미노산 배열에 있어서, 적어도 7 위치 내지 27 위치의 아미노산을 포함하는 아미노산 배열로 이루어지는 펩티드를 의미한다. hANP 는 세포 표면에 발현하는 GC-A 수용체 (Chinkers M, et al., Nature 338 ; 78-83, 1989) 에 결합하고, 그 수용체의 세포 내 도메인에 존재하는 구아닐레이트 사이클레이스를 활성화시켜, 세포 내의 cGMP 농도를 상승시킴으로써, 그 생리 활성을 발휘한다. 천연형의 hANP 는, Biochem. Biophys. Res. Commun., 118 권, 131 페이지, 1984 년에 기재된 α-hANP 가, 일반명 카르페리티드 (carperitide) 로서, 일본에 있어서 제조 판매 승인을 취득하여, 판매 (상품명：한프, HANP) 되고 있다. α-hANP 는 일반적으로는 Human pro-ANP［99-126］으로서도 알려져 있다.
hANP 는 배열 번호 1 의 7 위치와 23 위치의 Cys 잔기끼리가 디술피드 결합하고, 분자 내 링 구조를 형성한다. hANP 에 의한 GC-A 수용체의 활성화에는, 이 링 구조와, 그 C 말단측 27 위치 Arg 잔기까지의 아미노산이 중요한 것이 알려져 있다 (Silver, MA,, Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. (2006), 15, p 14-21, A. Calderone, Minerva Endocrinol. (2004), 29, p. 113-127). 그 때문에, 이 링 구조로 이루어지는 hANP(7-27) 은 GC-A 를 활성화시키는 최소 단위라고 생각된다. 본 발명의 hANP 펩티드로서는, 배열 번호 1) 에 있어서, N 말단측으로부터 연속하는 1 내지 6 개의 아미노산, 및/또는 28 위치의 아미노산이 결실되어 있어도 되는 아미노산 배열로 이루어지는 펩티드이며, 바람직하게는, 배열 번호 1 의 1 위치, 1 위치 및 2 위치, 그리고, 28 위치의 아미노산 중 적어도 한 지점이 결실되어 있어도 되는 펩티드이며, 보다 바람직하게는 배열 번호 1 의 1 위치, 그리고, 1 위치 및 2 위치의 아미노산이 결실되어도 되는 아미노산 배열로 이루어지는 펩티드 (hANP(2-28), hANP(3-28) 등) 이며, 가장 바람직하게는, 배열 번호 1 의 아미노산 배열로 이루어지는 펩티드 (hANP(1-28)) 이다.
본 발명의 수식 펩티드에 있어서, hANP 펩티드와 당 물질이 링커 구조를 개재하지 않고, 직접 결합한 수식 펩티드의 예로서는, 예를 들어, 배열 번호 1 의 1 위치, 5 위치, 6 위치, 25 위치의 Ser 그리고, 28 위치의 Tyr 의 측사슬의 수산기 중 어느 하나 또는 복수가 당 물질과 직접 O-글리코시드 결합한 것, 배열 번호 1 의 26 위치의 Asn 의 측사슬의 아미드기와 당 물질이 직접 N-글리코시드 결합한 것 (제조에 있어서는, 당해 지점의 아미노산을 Asp 로 하고, 환원 말단을 아지드화한 당 물질과 반응시킴으로써 아미드 결합을 형성할 수도 있다) 등을 예시할 수 있다.
본 발명의 수식 펩티드에 있어서, hANP 펩티드와 당 물질이 링커 구조를 개재하여 연결되는 경우, 이하에 상세히 서술하는 바와 같이 다양한 링커 구조를 채용하여, hANP 펩티드를 구성하는 아미노산의 측사슬의 관능기, N 말단 및/또는 C 말단 연결시킬 수 있다. 당 물질을 연결시키는 hANP 펩티드 상의 지점으로서, 바람직하게는 N 말단 및/또는 C 말단이며, 보다 바람직하게는 N 말단이다.
본 발명의 수식 펩티드는 1 분자 중에, 하나의 hANP 펩티드를 포함하고 있어도 되고, 2 개 이상의 hANP 펩티드를 포함하는, 다가의 hANP 수식 펩티드여도 된다. 다가의 hANP 수식 펩티드는, 링커 구조에 대해 복수의 hANP 분자를 연결할 수 있도록, hANP 펩티드와 결합할 수 있는 관능기를 복수 갖는 링커 분자를 선택함으로써, 적절히 제조할 수 있다.
＜당 물질＞
본 발명에 있어서, 「당 물질」 이란, 하나의 단당으로 이루어지는 구조 단위, 또는, 2 개 이상의 단당이 글리코시드 결합에 의해 결합된 구조 단위를 의미한다. 본 발명에 있어서, 당 물질은 “GLY” 로 표기하는 경우도 있다. 또, 구체적인 단당이나 당 사슬을, 예를 들어, “GlcNAc-”, “SG-” 와 같이, 약호로서 표기하는 경우가 있다. 구조식 중에서 이들의 약호로 기재한 경우, 별도로 규정이 있는 경우를 제외하고, 환원 말단인 1 위치 탄소 원자에 있어서, 링커 구조 또는 hANP 펩티드와 O- 또는 N-글리코시드 결합하고 있고, 당해 글리코시드 결합에 귀속하는 산소 원자 또는 질소 원자는, 특별한 정의가 있는 경우를 제외하고, 당해 당 물질을 나타내는 약호에는 포함되지 않는 것으로서 표기된다.
본 명세서에 있어서, 당 물질의 기본 단위가 되는 단당의 기재에 있어서는, 별도로 정하는 경우를 제외하고, 편의 상, 그 고리 구조에 있어서, 고리를 구성하는 산소 원자에 결합하고, 또한, 수산기 (또는 글리코시드 결합에 귀속하는 산소 원자) 와 직접 결합한 탄소 원자를 1 위치 (시알산에 있어서만 2 위치) 로서 표기한다. 실시예 화합물의 명칭은 화학 구조 전체로서 부여된 것이며, 이 룰은 반드시 적용되는 것은 아니다.
당 물질에 포함되는 단당으로서는, 당의 기본 구조를 갖는 것이면 특별히 한정되지 않고, 6 원당, 5 원당 등 여러 가지 것을 사용할 수 있다. 또, 천연에 존재하는 당이거나, 인공적으로 합성된 당이어도 되지만, 천연에 존재하는 당이 바람직하다. 단당으로서는, 예를 들어, 글루코오스 (Glu), 프룩토오스 (Flu), 만노오스 (Man), 갈락토오스 (Gal), 글루코사민 (Glc), N 아세틸글루코사민 (GlcNAc), 글루크론산 (GlucA), 뉴라민산 (Neu), 시알산/N-아세틸뉴라민산 (NeuNAc/Neu5Ac), 갈락토사민, N 아세틸갈락토사민 (GalNAc), 자일로오스 (Xyl), 이즈론산 (IdoA), 푸코오스 (Fuc), 알도트리오스, 글리셀알데히드, 알도테트로오스, 에리트로오스, 트레오스, 알도펜토오스, 리보오스, 릭소오스, 아라비노오스, 알도헥소오스, 아로오스, 타로오스, 글로오스, 알도로오스, 이도오스, 케토트리오스, 디하이드록시아세톤, 케토테트로오스, 에리톨로오스, 케토펜토오스, 자일로오스, 리브로오스, 케토헥소오스, 푸시코오스, 소르보오스, 타가토오스 등을 들 수 있다.
본 발명의 당 물질로서는, 단당이 복수 글리코시드 결합한 올리고당이나 다당을 사용할 수도 있다. 올리고당으로서는, 원하는 수의 단당이 글리코시드 결합한 것이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 이당류로서는, 수크로오스, 말토오스, 락토오스, 트레할로오스 등, 삼당류로서는 말토트리오스, 멜레디토오스, 라피노오스 등, 사당류로서는 니스토오스, 니게로테트라오스, 스타키오스 등을 들 수 있다. 또, 다당으로서는, 예를 들어, 아밀로오스, 글리코겐, 셀룰로오스, 키틴, 키토산, 콘드로이틴, 콘드로이틴황산, 히알루론산, 덱스트란, 덱스트란황산 등을 예시할 수 있다.
본 발명의 당 물질은 당 사슬이어도 된다. 「당 사슬」 이란, 생물 내에서 산생되고, 또는, 대사에 의해 생성되는, 2 이상의 단당이 글리코시드 결합한 천연당 사슬, 또는, 천연당 사슬의 구조를 참고로 인공적인 개변을 가한 개변 당 사슬이어도 된다. 천연당 사슬은, 동물, 식물, 미생물 등에 당 사슬 (당질) 로서, 또는 당 단백질, 당 지질로서 존재하고 있고, 이들로부터 단리, 정제함으로써 취득할 수 있다. 개변 당 사슬은 천연당 사슬의 당 사슬 구조를 인공적으로 개변한 당 사슬이며, 개변의 방법으로서는, 천연 유래의 당 사슬에 있어서, 하나 이상의 단당이 합성 화학적, 또는, 효소 화학적으로, 부가, 치환, 및/또는, 결실시킬 수 있고, 바람직하게는 비환원 말단의 당에 따른 글리코시다아제를 사용하여, 비환원 말단의 당을 결실시키는 개변이다. 당 사슬에 포함되는 단당의 수는 2 개 이상이면, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 약 50 개 이하, 약 40 개 이하, 약 30 개 이하 등으로 임의의 수를 선택할 수 있지만, 바람직하게는 약 25 개 이하이며, 보다 바람직하게는 약 20 개 이하이며, 더욱 바람직하게는 약 15 개 이하이며, 한층 더 바람직하게는 11 개 이하이다.
본 발명의 당 사슬은 직사슬형이거나 분기형이어도 된다. 직사슬형 당 사슬이란, 당 사슬에 포함되는 비환원 말단 이외의 단당 모두가, 그 고리 구조에 있어서 1 위치 탄소 원자 외에 하나의 탄소 원자만으로, 직접 또는 치환기를 개재하여, 다른 단당의 1 위치 (시알산에서는 2 위치) 탄소 원자와 글리코시드 결합함으로써 직사슬형으로 연결한 당 사슬이다.
한편, 분기형 당 사슬이란, 당 사슬에 포함되는 하나 이상의 단당이, 그 고리 구조에 있어서 1 위치 탄소 원자 외에, 2 개 이상의 탄소 원자에 있어서, 직접 또는 치환기를 개재하여, 다른 단당의 1 위치 (시알산에서는 2 위치) 탄소와 글리코시드 결합함으로써 분기한 당 사슬이다. 당 사슬에 있어서, 직사슬형이거나, 분기형이어도, 고리 구조의 1 위치 탄소측의 말단 (환원 말단) 은 하나의 단당이며, 당해 환원 말단의 당의 1 위치 (시알산에서는 2 위치) 탄소는 링커 구조 또는 hANP 펩티드와 O- 또는 N- 글리코시드 결합하고 있다.
한편, 당 사슬의 비환원 말단의 단당은 1 위치 (시알산에서는 2 위치) 의 탄소 이외에서는 다른 당과 글리코시드 결합하고 있지 않다. 당 사슬에는, 분기의 수와 동수의 비환원 말단이 존재하고, 당 사슬의 개변은 주로 이 비환원 말단에서 이루어진다.
천연의 당 단백질에 포함되는 당 사슬에는, 당 단백질의 아스파라긴에 결합하고 있는 N 결합형 당 사슬과, 세린 또는 트레오닌에 결합하고 있는 O 결합형 당 사슬로 대별되고, 각각에 특징적인 기본 구조를 갖는다. 천연에 있어서는, N 결합형 당 사슬은 N 글리코시드 결합, O 결합형 당 사슬은 O 글리코시드 결합에 의해, 단백질의 아미노산 측사슬과 결합하고 있지만, 인공적으로는, 어느 글리코시드 결합에 의해서도 다른 화합물과 결합시킬 수 있다. 그 때문에, 글리코시드 결합의 양식을 한정하는 것은 아니다. 예를 들어, 당 물질의 환원 말단을 아지드화하고, 당해 아지드화된 당 물질과 카르복실기를 갖는 화합물을 트리페닐포스핀 존재하 반응시킴으로써, 당 물질에 원하는 구조를 갖는 화합물을 N-글리코시드 결합에 의해 결합시킬 수 있다. 또, 당 물질을 알코올과 같은 수산기를 갖는 화합물과 반응시킴으로써, 원하는 화합물과 당 물질을 O-글리코시드 결합으로 결합시킬 수 있다.
N 결합형 당 사슬의 기본 구조는 이하의 식 (구조식 (I), 배열식 (II) 로 나타내고, 이 당 사슬 구조로 이루어지는 당 사슬을 AG(5) 라고 부르는 것으로 한다.
[화학식 24]
Figure pct00024
[화학식 25]
Figure pct00025
(식 중, “O/N-L” 은 O 글리코시드 결합 또는 N 글리코시드 결합에 의해 링커 구조와 결합하는 것을 나타낸다. 상기 식에 있어서 환원 말단의 GlcNAc 를 Glc 또는 Man 으로 치환한 환원 말단 개변 당 사슬을 각각 AG(5-Glc), AG(5-Man) 으로 표기한다)
N 결합형 당 사슬의 대부분은 이 기본 구조를 가지고 있고, 그 비환원 말단이나 분기당에 있어서 추가로 당 사슬이 결합하고 있어도 된다.
인간형 당 사슬, 또는, 인간 적합형 당 사슬이란, 인간의 체내에서 항원성을 나타내지 않는 것이 알려져 있는 당 사슬이며, N 결합형 당 사슬에서는, 고만노오스형, 복합 (컴플렉스) 형, 혼성형 등이 알려져 있다. 고만노오스형은, N 형 기본 구조의 비환원 말단에, 복수의 만노오스가 연속한 만노오스 리치 구조를 갖는 당 사슬이다. 복합형이란, N 결합형 기본 구조의 비환원 말단에, Galβ1-4 GlcNAc 의 모티프 구조를 갖는 당 사슬이다. 혼성형 당 사슬이란, N 결합형 기본 구조의 비환원 말단에, Gal1β-4 GlcNAc 모티프 구조를 가지며, 또한, 복수의 만노오스로 이루어지는 만노오스 리치인 구조를 갖는 당 사슬이다.
＜SG, AG(n)＞
N 결합형 복합형 당 사슬의 대표적인 것으로서는, 계란의 노른자에 함유되는 시알릴글리코펩티드 (Sialyl GlycoPeptide：이하, 「SGP」라고 한다) 에 포함되는 당 사슬이며, 이하의 구조식 (III) 및 배열식 (IV) 로 나타내는 구조로 이루어지는 시알릴글리칸 (Sialyl Glycan, 이하, 「SG」 라고 한다) 을 예시할 수 있다.
[화학식 26]
Figure pct00026
[화학식 27]
Figure pct00027
(식 중, “O/N-L” 은 O 글리코시드 결합 또는 N 글리코시드 결합에 의해 링커 구조와 결합하는 것을 나타낸다. 또, 상기 식에 있어서 환원 말단의 GlcNAc 를 Glc 또는 Man 으로 치환한 환원 말단 개변 당 사슬을 각각 SG(Glc), SG(Man) 으로 표기한다)
SG 는, SGP 를, 후술하는 바와 같이, 공지된 방법으로 효소 (Endo M, 그 변이체 등) 와 반응시켜, 가수 분해에 의해 잘라내거나, 또는, 원하는 화합물로 전이시켜 꺼낼 수 있다. SGP 는 계란의 노른자로부터, 통상적인 방법, 예를 들어, WO2011/0278681 에 기재된 방법에 따라 단리, 정제할 수 있다. 또, SGP 의 정제품이 시판 (토쿄 화성 (주), (주) 후시미 제약소) 되고 있어, 구입할 수 있다.
또, SG 의 환원 말단의 GlcNAc 를 다른 당으로 치환한, 환원 말단 개변 당 사슬을 후술하는 당 전이 반응을 이용하여 제작할 수 있다. SG 의 환원 말단의 GlcNAc 를 Glc 로 치환한 환원 말단 개변 당 사슬을 SG(Glc), Man 으로 치환한 환원 말단 개변 당 사슬을 SG(Man) 으로 각각 표기하는 것으로 한다.
본 발명의 당 물질로서 사용할 수 있는 개변 당 사슬의 구체예로서, SG 를 뉴라미니다아제 처리하여, 2 개의 비환원 말단의 Neu5Ac 를 결실시킨 AG(9) (이하의 구조식 (V) 및 배열식 (VI)), AG(9) 를 갈락토시다아제 처리하여, 2 개의 비환원 말단의 Gal 을 결실시킨 AG(7) (이하 구조식 (VII) 및 배열식 (VIII)), AG(7) 을 추가로 N-아세틸글루코사미니다아제로 처리하여, 2 개의 비환원 말단의 GlcNAc 를 결실시킨 AG(5) (상기, N 결합형 기본 구조로 이루어지는 당 사슬) 등을 예시할 수 있다. 또, 상기에 있어서, SG 대신에 SG 의 환원 말단 개변 당 사슬 (예를 들어 SG(Glc), SG(Man) 등) 을 채용하여 동일하게 처리함으로써, AG(9), AG(7) 및 AG(5) 의 환원 말단 개변 당 사슬 (예를 들어 AG(9) 의 환원 말단의 GlcNAc 가 Glc 로 치환된 AG(9-Glc), AG(9) 의 환원 말단의 GlcNAc 가 Man 으로 치환된 AG(9-Man) 등) 도 본 발명의 동(棟)물질로서 채용할 수가 있다.
[화학식 28]
Figure pct00028
[화학식 29]
Figure pct00029
(식 중, “O/N-L” 은 O 글리코시드 결합 또는 N 글리코시드 결합에 의해 링커 구조와 결합하는 것을 나타낸다. 또, 상기 식에 있어서 환원 말단의 GlcNAc 를 Glc 또는 Man 으로 치환한 환원 말단 개변 당 사슬을 각각 AG(9-Glc), AG(9-Man) 으로 표기한다)
[화학식 30]
Figure pct00030
[화학식 31]
Figure pct00031
(식 중, “O/N-L” 은 O 글리코시드 결합 또는 N 글리코시드 결합에 의해 링커 구조와 결합하는 것을 나타낸다. 또, 상기 식에 있어서 환원 말단의 GlcNAc 를 Glc 또는 Man 으로 치환한 환원 말단 개변 당 사슬을 각각 AG(7-Glc), AG(7-Man) 으로 표기한다)
본 발명의 수식 펩티드에 있어서, 1 분자 중에 적어도 하나의 당 물질이 hANP 펩티드에 연결되어 있으면 되고, 당 물질의 개수의 상한은 없지만, 예를 들어 20 개 이하이며, 보다 바람직하게는 15 개 이하이며, 한층 더 바람직하게는 12 개 이하이며, 한층 더 바람직하게는 10 개 이하이며, 한층 더 바람직하게는 5 개 이하이며, 한층 더 바람직하게는 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개이며, 가장 바람직하게는, 1 개 또는 2 개이다. 1 분자 중에 포함되는 당 물질은 동일한 구조의 것이거나 상이한 구조의 당 물질이 혼재되어도 되지만, 모두 동일한 당 물질인 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 당 물질로서 천연에 존재하는 당 단백질 또는 당 지질에서 유래하는 당 사슬을 사용하는 경우, 당해 당 사슬은, 효소를 사용하여, 절단·단리되거나, 또는, 당 전이에 의해 원하는 화합물 (피전이 화합물) 로 전이시켜, 사용할 수 있다. 이와 같은 반응에 사용하는 효소로서는, 사용하는 당 사슬의 구조에 맞추어, 공지된 다양한 효소에서 선택할 수 있다 (Endo-A : Li, B., et al, J. Am. Chem. Soc. 127 (2005), pp. 9692-9693, Endo-F : Wei Huang., et al, ChemBioChem 12 (2011), pp. 932-941, Endo-D : Shu-Quan Fan, et al, J. Biol. Chem. 287 (2012), pp. 11272-11281, Endo-S : Wei Huang, et al, J. Am. Chem. Soc. 134 (2012), pp. 12308-12318). 이와 같은 효소의 예로서, 예를 들어, 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제는 키토비오스 구조의 β 글리코시드 결합을 가수 분해하는 일련의 효소 패밀리로서 알려져 있고, 그 유래에 따라, Endo-A, Endo-D, Endo-F, Endo-M, Endo-S 등이 알려져 있다.
이 중, Mucor Hiemalis 에서 유래하는 Endo-M 은, N 결합형 기본 구조를 갖는 당 사슬에 있어서, 환원 말단측의 GlcNAc-GlcNAc 사이의 글리코시드 결합을 가수 분해하는 활성을 갖는다. 또한, 당해 효소는, 이 가수 분해에 의해 잘려진, N 결합형 당 사슬 기본 구조에 있어서의 환원 말단으로부터 2 번째의 GlcNAc 를 포함하는 비환원 말단측의 당 사슬을, GlcNAc 부위를 갖는 다른 피전이 화합물의 GlcNAc 의 4 위치에 전이 결합시키는 활성도 갖는다 (Y. Tomabechi, et al, Bioorg. Med. Chem., 18 (2010), pp. 1259-1264 등 참조). 또한, EndoM 을 사용한 동일한 당 전이 반응에 있어서, 피전이 화합물로서, GlcNAc 대신에 다른 당 단위 (예를 들어, Glc, Man 등) 의 구조를 갖는 화합물을 사용한 경우에도, 당해 당 단위에 있어서, GlcNAc 의 4 위치에 대응하는 위치에 있어서, 동일한 전이 반응이 진행되는 것이 알려져 있다 (Endoglycosidases - Biochemistry, Biotechnology, Application, Masahiko Endo et al. Kodansha, Tokyo (2006)).
Endo-M 의 기질이 되는 당 사슬 구조는, N 결합형 기본 당 사슬 구조를 갖는 것이면, 고만노오스형, 복합형, 혼성형 등, 다양한 당 사슬을 기질로 할 수 있고, AG(5), AG(7), AG(9) 및 SG 도 Endo-M 의 기질이 된다. 또, Endo-M 의 변이체인 Endo-M N175Q 는, Endo-M 의 기질 특이성, 및, 당 전이 활성을 유지하면서, 가수 분해 활성을 저감시킨 변이체이며, 특히 당 사슬 전이 반응에 의해 원하는 화합물에 당 사슬을 결합시키는 경우에는, Endo-M N175Q 가 바람직하다. Endo-M N175Q 를 사용하는 경우, 당 사슬 공급원으로서는, 예를 들어, SG-Oxa 와 같은 당 사슬 부분이 잘려진 것을 사용할 수도 있고, SGP 와 같은 당 펩티드, 당 단백질을 사용해도 되는 (Midori Umekawa et al. JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 285, 2010, pp. 511-521 (다른 변이체의 보고예도 기재 있음)) Endo-M 및 그 변이 효소는 공지된 방법에 의해 유전자 공학적으로 제조할 수 있다. 또, Endo-M 및 Endo-M N175Q 는 시판되는 시약으로서 구입 (판매：토쿄 화성공업 (주)) 할 수도 있다.
가수 분해 효소에 의해 당 사슬을 잘라 사용하는 경우, 기질과 가수 분해 효소를 적절한 온도, 시간으로 반응시켜, 얻어진 반응액으로부터 당 사슬을 단리할 수 있다.
잘려진 당 사슬은 당 사슬 자체로서 사용해도 되고, 그 환원 말단을 수식하여 사용해도 된다. 예를 들어, 환원 말단에 GlcNAc 를 갖는 당 사슬의 경우, 당해 당 사슬을 DMC 로 처리함으로써 GlcNAc 의 고리 구조의 1 위치 탄소 원자에 결합한 수산기와 2 위치 탄소 원자에 결합한 N-아세틸기의 사이에서 옥사졸린 고리를 형성시킨, GLY(GlcNAc)-oxa (구체적으로는 SG-Oxa 로서 단리할 수 있다. 이와 같이 잘려진 당 사슬은, 링커 분자 (GlcNAc 화합물) 로의 전이 반응의 기질로서 사용함으로써, 원하는 화합물에 결합시킬 수 있다.
또, 당 전이 효소에 의해 당 사슬을 원하는 화합물로 전이시키는 경우, 기질 (당 사슬 공여 물질), 피전이 화합물 및 당 전이 효소를 적절한 온도, 시간으로 반응시키고, 얻어진 반응액으로부터 목적으로 하는 당 사슬이 피전이 화합물로 전이·결합한 당 사슬 결합 화합물을 단리함으로써 얻어진다. 예를 들어, 기질로서 SGP, 피전이 화합물로서 GlcNAc-화합물, 당 전이 효소로서 Endo-M N175Q 를 사용한 경우, 적당량의 GlcNAc 화합물, 당해 GlcNAc 화합물에 포함되는 GlcNAc 가수에 따른 용량의 SGP 를 Endo-M-N175Q, 원하는 바에 따라 적당량의 DMSO 존재하, 20 ∼ 40 ℃ (바람직하게는, 20 ∼ 30 ℃, 보다 바람직하게는 22 ∼ 27 ℃, 최적으로는 25 ℃), 1 ∼ 10 시간 (바람직하게는 2 ∼ 8 시간, 보다 바람직하게는 3 ∼ 6 시간) 으로 진탕하고, 역상 HPLC (ODS, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로서 사용) 를 사용하여 정제할 수 있다.
이와 같은 전이 반응을 이용하여, 후술하는 여러 가지 GlcNAc 화합물을 이용하여, 당 사슬의 환원 말단에 대해, 아미노기 (SG-NH2 등), 카르복실기 (SG-A 등) 아지드기 (SG-N3 등), 말레이미드기 (SG-M), α-요오드화아세틸아미드기 (SG-I) 등의 관능기를 결합시킬 수 있고, 이로써, 당 사슬을 원하는 링커 구조와 연결시킬 수 있다.
이와 같이 하여 얻어진 당 사슬 결합 화합물은 직접 hANP 펩티드와 결합시킬 수도 있고, 다른 링커 분자를 개재하여 hANP 펩티드와 연결시킬 수도 있다.
여기서, 「피전이 화합물」 로서는, 1 위치 탄소에 있어서의 글리코시드 결합 이외에 수식을 받지 않은 당을 포함하고, 상기 당 전이 반응의 당 수용체로서 기능하는 화합물이면 특별히 한정되지 않는다. 피전이 화합물로서 바람직하게는, 상기 당으로서 GlcNAc 를 포함하는 「GlcNAc-화합물」 (다음에 상세히 서술한다), 당으로서 Glc 를 포함하는 「Glc-화합물」, 당으로서 Man 을 포함하는 「Man-화합물」 등을 사용할 수 있고, 가장 바람직하게는 GlcNAc- 화합물이다.
＜링커 구조＞
본 발명에 있어서 링커 구조란, 본 발명의 수식 펩티드에 있어서 hANP 펩티드와 당 물질의 연결을 중개하는 화학 구조를 의미한다. 링커 구조는 적어도 한 지점에서 hANP 펩티드와 결합하고, 적어도 한 지점에서 당 물질과 글리코시드 결합하고 있다.
hANP 펩티드와 링커 구조의 결합에 있어서는, hANP 펩티드의 N 말단의 아미노기, C 말단의 카르복실기, 각각의 구성 아미노산 중 적어도 하나의 측사슬 중 어느 위치에서 결합해도 되고, 결합 지점은 한 지점이거나, 복수 지점이어도 된다. 아미노산 측사슬에 결합하는 경우, 배열 번호 1 의 1 위치, 5 위치, 6 위치, 25 위치의 Ser 그리고, 28 위치의 Tyr 의 측사슬의 수산기, 26 위치의 Asn 의 측사슬의 아미드기 등에 각각의 관능기에 따른 관능기를 갖는 원하는 화합물을 결합시킬 수 있다.
본 발명의 수식 펩티드 또는 그 부분 구조의 표기에 있어서, 아미노산 또는 펩티드는, 특별한 기재가 없는 한, 좌측에 N 말단 (아미노기), 우측에 C 말단 (카르복실기) 이 되도록 표기한다. 아미노산 또는 펩티드의 오른쪽에 “*” 를 부여하여 기재하는 경우 (예를 들어, Gln*), 상기의 룰을 역전시켜, 좌측에 C 말단, 우측에 N 말단이 되는 것을 나타내는 것으로 한다.
또, 아미노산에 대해 표기하는 경우, 중심이 되는 탄소 원자 (α 탄소) 에 직접 결합한, 아미노산으로서 필수 구조인, 아미노기 및 카르복실기를 각각 「α아미노기」 및 「α 카르복실기」 라고 표기하는 것으로 한다.
hANP 펩티드의 N 말단 (아미노기) 또는 C 말단 (카르복실기) 중 적어도 일방에서 당 물질과 연결하는 경우, hANP 펩티드와 링커 구조는 아미드 결합한다. hANP 펩티드의 N 말단에 있어서 당 물질과 링커 구조를 개재하여 연결한 수식 펩티드는 이하와 같이 표기하는 것으로 한다.
GLY-L-hANP (A)
(식 중, GLY 는 당 물질을 나타내고, L 은 직사슬 또는 2 개 이상으로 분기한 링커 구조를 나타내고, hANP 는 hANP 펩티드를 나타낸다. L 은 GLY 와 O- 또는 N- 글리코시드 결합하고 있고, L 이 분기하고 있는 경우 분기 말단과 동수의 GLY 를 연결할 수 있다. L 은 hANP 펩티드의 N 말단과 아미드 결합하고 있다)
본 명세서에 있어서, 수식 펩티드 또는 그 부분 구조의 표기에 있어서, 아미노산 또는 펩티드가 그 N 말단의 아미노기에 있어서 다른 링커와 연결하는 경우, 연결되는 구조 단위를 나타내는 기호는 당해 펩티드 또는 아미노산을 나타내는 기호의 좌측에, 하이픈을 부여하고, 괄호를 부여하지 않고 기재되고, 이 경우의 하이픈은 펩티드 또는 아미노산의 아미노기와 링커 구조가 갖는 카르복실기의 사이에 형성되는 아미드 결합을 나타내는 것으로 한다. 예를 들어, Asn 의 아미노기에 SG 가 연결된 구조는 “SG-Asn” 으로서 표기된다.
또, hANP 펩티드의 C 말단에 있어서 링커 구조를 개재하여 당 물질과 연결된 수식 펩티드는 이하와 같이 표기하는 것으로 한다.
hANP-L-GLY (B)
(식 중, GLY 는 당 물질을 나타내고, L 은 직사슬 또는 2 개 이상으로 분기한 링커 구조를 나타내고, hANP 는 hANP 펩티드를 나타낸다. L 은 GLY 와 O- 또는 N-글리코시드 결합하고 있고, L 이 분기하고 있는 경우 분기 말단과 동수의 GLY 를 연결할 수 있다. L 은 hANP 펩티드의 C 말단과 아미드 결합하고 있다)
즉, 본 명세서에 있어서의 수식 펩티드 또는 그 부분 구조의 표기에 있어서, 아미노산 또는 펩티드가 그 C 말단의 카르복실기에 있어서 다른 구조 단위와 연결되는 경우, 연결되는 구조 단위를 나타내는 기호는 당해 아미노산 또는 펩티드를 나타내는 기호의 우측에 하이픈을 부여하고, 괄호를 부여하지 않고 기재되고, 이 경우의 하이픈은 펩티드 또는 아미노산의 C 말단 카르복실기와 링커 구조가 갖는 아미노기 (또는 아지드기) 의 사이에 형성되는 아미드 결합을 나타내는 것으로 한다. 예를 들어, Tyr 의 카르복실기에 SG 가 연결된 구조는 “Tyr-SG” 로서 표기된다.
또, 본 발명에 있어서, hANP 펩티드의 N 말단 및 C 말단의 양방에 당 물질이 연결된 수식 펩티드는, 상기의 룰에 따라, 이하의 식 C 와 같이 표기된다.
GLY-L1-hANP-L2-GLY (C)
(식 중, GLY 는 당 물질을 나타내고, L1 및 L2 는 동일하거나, 상이해도 되고, 직사슬 또는 2 개 이상으로 분기한 링커 구조를 나타내고, hANP 는 hANP 펩티드를 나타낸다. L1 및 L2 는 GLY 와 O- 또는 N-글리코시드 결합하고 있고, L1 또는 L2 가 분기하고 있는 경우 분기 말단과 동수의 GLY 를 연결할 수 있다. L1 및 L2 는 hANP 펩티드의 N 말단 및 C 말단의 양방과 아미드 결합하고 있다)
또한, 본 발명의 수식 펩티드 또는 그 부분 구조에 있어서, 아미노산의 측사슬에 있어서 당 물질과 연결된 경우의 부분 구조는 이하의 식 D 와 같이 표기하는 것으로 한다.
(GLY-)AA (D)
(식 중, GLY 는 당 물질을 나타내고, A.A 는 임의의 아미노산을 나타내고, 당해 아미노산의 측사슬은, 직접 또는 링커 구조를 개재하여, GLY 와 O- 또는 N-글리코시드 결합하고 있다)
즉, 본 명세서에 있어서의 수식 펩티드 또는 그 부분 구조의 표기에 있어서, 아미노산 또는 펩티드가 측사슬의 관능기에 있어서 다른 구조 단위와 연결되는 경우, 연결되는 구조 단위를 나타내는 기호는 연결되는 아미노산을 나타내는 기호의 좌측에 하이픈 및 괄호를 부여하여 기재된다. 이 경우의 하이픈은 당 물질의 환원 말단에 있어서의 글리코시드 결합을 포함하는 화학 구조를 나타낸다. 이 경우의 연결이 링커 구조를 개재하는 경우, 당해 링커 구조에 특징적인 구조를 명기하는 경우도 있지만 (예를 들어, (SG-PEG(3)-)Asn 등), 특징적인 구조를 가지지 않는 경우 또는 링커 구조를 특정하여 기재하지 않는 경우에는 생략하여 (예를 들어, (SG-)Lys 등) 기재하는 경우도 있다. 또한, 실시예 화합물의 명칭은 병기되어 있는 구조식으로 이루어지는 구체적인 화합물을 나타내는 것이다.
이와 같은 룰에 따라, Lys 의 측사슬 아미노기와 α 아미노기의 양방에 SG 가 연결된 부분 구조는 “SG-(SG-)Lys” 와 같이 표기된다. 또, 동일하게 Glu 의 측사슬 카르복실기와 α 카르복실기의 양방에 SG 가 연결된 부분 구조는 “(SG-)Gln-SG” 또는 “SG-(SG-)Gln*” (Asp 및 Glu 는, 측사슬의 카르복실기가 아미드 결합을 형성한 경우, Asn/Gln 과 동일한 구조가 된다. Gln* 는 좌측이 카르복실기, 우측이 아미노기인 것을 나타낸다) 로서 표기된다.
또, 1 분자 중에 hANP 펩티드가 복수 포함되는 경우에는, 개별적인 표기 방법을 채용한다. 예를 들어, Lys 의 α 카르복실기에 당 물질이 연결되고, α 아미노기와 측사슬 아미노기의 양방에, 각각, PEG 링커를 개재하여 hANP 펩티드의 N 말단이 연결되어 있는 경우, “GLY-Lys*(-PEG-hANP)2” 와 같이 표기하는 것으로 한다.
당 물질과 링커 구조는, 당 물질의 환원 말단의 1 위치 탄소에 있어서, N- 또는 O-글리코시드 결합으로 결합된다. 이 때의 글리코시드 결합의 입체 배치는 α 위치 및 β 위치 중 어느 것을 선택해도 되고, 공지된 방법에 따라 (Tomoya Ogawa, et al, Agric. Biol. Chem. 47 (1983), pp. 281-285., Mamoru Mizuno, et al, 121 (1999), pp. 284-290), 어느 결합 양식을 선택적으로 합성할 수 있다. 천연의 당 단백질에서 유래하는 당 사슬을 사용하는 경우, 당해 당 사슬의 천연형에서의 결합 양식과 동일한 양식을 선택하는 것이 바람직하고, 예를 들어, 당 물질이 SG 또는 그 개변 당 사슬인 경우, 링커 구조와의 글리코시드 결합에는 β 위치를 선택하는 것이 바람직하다.
본 명세서에 있어서, 당 물질을 기호 (예를 들어, GLY, SG, GlcNAc 등) 로서 기재하는 경우, 별도로 정의되는 경우를 제외하고, 환원 말단의 탄소까지를 당해 기호에 포함하는 것으로 하고, N- 또는 O-글리코시드 결합에 귀속하는 N 또는 O 는 당해 기호에는 포함되지 않는 것으로 한다. 또, 동일하게, hANP 펩티드를 기호 (예를 들어, hANP, hANP(1-28) 등) 로서 표기하는 경우에는, 원칙으로서 N 말단의 -NH, 및, C 말단의 C=O 는 당해 기호에 포함되는 것으로서 표기된다. 또, 특별히 언급이 없는 한 좌측이 N 말단, 우측이 C 말단으로서 표기된다. 즉, 수식을 받지 않는 hANP 펩티드는 H-hANP-OH 로서 표기된다.
본 발명의 수식 펩티드에 포함되는 링커 구조의 화학 구조는 적어도 하나의 당 물질과 글리코시드 결합하는 산소 원자 또는 질소 원자, 및, 적어도 하나의 hANP 펩티드와 결합하는 부분 구조 (아미드 결합으로 결합하는 경우, NH 또는 C=O, hANP 펩티드의 측사슬에 연결되는 경우 각 측사슬의 구조에 따른 구조 (후술)) 를 갖는다. 그 이외의 구조는 한정되지 않고, 단일의 분자에서 유래하는 것이어도 되고, 복수의 분자를 결합시킨, 복수의 부분 구조로 이루어지는 것이어도 된다. 이와 같은, 링커 구조의 유래가 되는 분자를 「링커 분자」 라고 한다. 복수의 부분 구조를 포함하는 경우, 그들의 부분 구조를 당해 부분 구조에 맞추어 “Lx” 와 같이 기재하는 경우가 있다. 예를 들어, 당 물질과 직접 결합하는 부분 구조는 “Lg” 라고 표기되고, 당해 부분 구조는 hANP 펩티드와 직접 결합하는 구조를 포함하지 않지만, 그 이외의 점에 있어서는 링커 구조에 적용되는 정의를 모두 충족하는 것이다. 또, hANP 펩티드와 직접 결합하는 부분 구조는 “Lp” 로 표기되고, 당 물질과의 글리코시드 결합에 귀속하는 구조를 제외하고, 링커 구조에 적용되는 모든 정의를 충족하는 것이다.
본 발명의 링커 구조에 있어서, 글리코시드 결합에 귀속하는 N 또는 O 와 hANP 펩티드와 직접 결합하는 원자 (아미드 결합하는 경우, 당해 아미드 결합에 귀속하는 N 또는 C) 를 최단으로 연결하는 원자 사슬을 「연결 사슬」 이라고 한다. 연결 사슬에는, 상기 결합에 귀속하는 각각의 원자를 포함한다. 예를 들어, (GLY)-O-CH2-C(=O)-(N term hANP) 로 나타내는 수식 펩티드에서는, 3 원자의 연결 사슬로 이루어지는 링커 구조를 갖는다. 또, (GLY)-NH-C(=O)-CH2-CH2-NH-(C term hANP) 로 나타내는 수식 펩티드는 5 원자의 연결 사슬로 이루어지는 링커 구조를 갖는 것이 된다. 본 발명의 링커 구조는 3 원자 이상의 연결 사슬을 갖는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 200 원자 이하의 연결 사슬일 수 있고, 바람직하게는 약 150 원자 이하의 연결 사슬이며, 보다 바람직하게는 100 원자 이하의 연결 사슬이며, 한층 더 바람직하게는 70 원자 이하, 50 원자 이하 또는 30 원자 이하의 연결 사슬이며, 가장 바람직하게는 20 원자 이하, 15 원자 이하 또는 10 원자 이하의 연결 사슬이다. 이와 같은 링커 구조를 형성하려면 복수의 링커 분자를 사용함으로써 복잡한, 긴 연결 사슬의 링커 구조를 만들어 낼 수 있지만, 바람직하게는, 5 개 이하의 링커 분자를 채용한 것이며, 바람직하게는, 4, 3, 2 또는 1 개의 링커 분자를 사용한 링커 구조를 포함하는 수식 펩티드이다.
본 발명의 링커 구조가 하나의 링커 분자에서 유래하는 경우, 당해 링커 분자는, 1 분자 중에, 당 물질과 글리코시드 결합하는 관능기, 및, hANP 펩티드와 결합하는 관능기의 양방을 포함하는 화합물이며, 예를 들어 아미노산이나 펩티드 등은 아미노기와 카르복실기를 갖기 때문에 바람직하고, 또한 측사슬에 아미노기, 카르복실기, 수산기 등을 갖는 아미노산은 더욱 바람직하다. 이와 같은 링커 분자의 구체예로서는, 예를 들어, HO-CH2-COOH, HO-CH2-CH2-NH2, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 리신 등을 예시할 수 있다.
본 발명의 링커 구조가, 복수의 링커 분자에서 유래하는 경우, 당해 링커 분자로서는, 적어도, 당 물질과 글리코시드 결합할 수 있는 관능기를 포함하는 화합물, 및, hANP 펩티드와 결합할 수 있는 관능기를 갖는 화합물이 사용된다. 이 2 개의 화합물이 직접 결합할 수 있는 관능기를 추가로 가지고 있으면, 직접 결합할 수도 있고, 또한 다른 화합물을 중개하여 연결되어 있어도 된다. 이와 같은 링커 분자끼리의 결합에는, 공지된 방법을 적용할 수 있고, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 아미노기와 카르복실기에 의한 아미드 결합, SH 기와 말레이미드기의 결합, SH 기와 요오도아세틸기의 결합, 페놀기와 트리아졸디온기의 결합, (Hitoshi Ban, et al, 132 (2010), 1523-1525). 알코올과 카르복실기에 의한 에스테르 결합, 아지드기와 아세틸렌기의 Husgen 반응에 의한 결합 등을 예시할 수 있다. 본 발명에서 채용되는 링커 분자로서는 이들의 결합 양식에 합치한 관능기를 갖는 것을 적절히 선택하여, 링커 구조의 형성에 사용할 수 있다.
본 발명의 수식 펩티드는 전체로서 일정한 친수성을 나타낼 필요가 있기 때문에, 링커 구조가 일정 이상의 크기를 갖는 경우, 친수성이 높은 구조의 것을 채용하는 것이 바람직하다. 그러한 구조의 예로서 예를 들어, 폴리옥시알킬렌, 폴리아미드《다른 생물학적으로 적용되는 반복 구조》등을 들 수 있다.
폴리옥시알킬렌으로서는, 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜 (PEG), 폴리프로필렌글리콜, 폴리부틸렌글리콜, 폴리비닐알코올 (PVA) 등을 예시할 수 있지만, 바람직하게는 PEG 이다. 본 명세서에서, PEG 를 포함하는 링커 구조를 표기하는 경우, 에톡시의 반복 횟수를 PEG (3), PEG (11) 과 같이 기재한다. 이와 같은 구조를 갖는 수식 펩티드로서는, 예를 들어, 화합물 2-13, 2-27 내지 2-34 등을 예시할 수 있다.
또, 본 발명의 링커 구조에는, 아미노산, 또는, 2 이상의 아미노산이 펩티드 결합한 올리고펩티드 사슬을 포함하고 있어도 된다. 이와 같은 아미노산, 또는, 올리고펩티드 사슬은, hANP 펩티드의 N 말단 또는 C 말단과 직접 아미드 결합하여, hANP 펩티드의 펩티드 사슬이 연장된 구조를 취할 수 있다. 또, hANP 펩티드란, 펩티드 이외의 구조를 개재하여 연결되어 있어도 되고, 그들의 구조를 양방 가지고 있어도 된다.
본 발명의 링커 구조에 포함되는 아미노산으로서는, 동일한 탄소에 수소 원자, 아미노기 및 카르복실기가 결합한, 아미노산 구조를 갖는 한, 특별히 한정되지 않고, 천연형의 아미노산이어도 되고, 인공의 아미노산이어도 된다. 인공의 아미노산으로서는, D 아미노산과 같이 합성적으로 제조된 아미노산이어도 되고, 천연형 아미노산의 측사슬이 인공적으로 수식된 개변 아미노산이어도 되지만, 바람직하게는, 천연형 아미노산, 또는, 개변 아미노산이며, 보다 바람직하게는 천연형 아미노산이다. 본 발명의 수식 펩티드가 의약의 유효 성분으로서 이용되는 경우, 링커 구조에 포함되는 아미노산은 그 자체로 고유의 생물 활성을 가지지 않는 것이 바람직하고, Gly 또는 아미노산 측사슬이 다른 구조와 결합된 아미노산을 채용하는 것이 바람직하다. 이와 같은 아미노산을 포함하는 링커 구조의 예로서는, Gly 또는 2 이상의 Gly 로 이루어지는 올리고 Gly 를 포함하고, N 말단 및 C 말단에서 hANP 펩티드 및 당 물질과 연결되어 있는 것을 들 수 있다. 이와 같은 수식 펩티드의 구체예로서는, 예를 들어, 당 물질로서 SG(Glc) 를 채용하고, 링커로서 Gly 를 포함하는 화합물 2-40 등을 들 수 있다.
측사슬 구조를 갖는 아미노산으로서는, 예를 들어, Lys 와 같이 측사슬에 아미노기를 갖는 「아미노기 측사슬 아미노산」, Cys 와 같이 측사슬에 SH 기를 갖는 SH 기 측사슬 아미노산, 아스파르트산이나 글루탐산과 같은 측사슬에 카르복실기를 갖는 카르복실기 측사슬 아미노산, 세린과 같이 측사슬에 수산기를 갖는 수산기 측사슬 아미노산, 티로신과 같이 측사슬에 p-페놀기를 갖는 페놀 측사슬 아미노산 등을 채용할 수 있다. 이들의 측사슬 구조를 갖는 아미노산에 있어서는, α 탄소에 결합한 아미노기 및 카르복실기 그리고 측사슬의 관능기의 3 점으로 연결할 수 있기 때문에, 분기한 링커 구조를 형성하기 위해서는, 이들 측사슬 구조를 갖는 아미노산을 적어도 하나 포함하는 것이 바람직하다.
아미노기 측사슬 아미노산이란, 측사슬에 아미노기 (아미드기를 제외한다) 를 적어도 하나 갖는 아미노산이면 특별히 한정되지 않지만, 천연 아미노산으로서는 Lys 이다. 인공 아미노산으로서는, 예를 들어, Glu 또는 Asp 의 측사슬 카르복실기에 1,2-디아미노에탄과 같은 2 가 아민을 반응시킨 개변 아미노산 등을 예시할 수 있다.
링커 구조가 적어도 하나의 아미노기 측사슬 아미노산을 포함하고, 당 물질이 당해 아미노기 측사슬 아미노산의 측사슬에 연결되는 경우, 이하의 일반식의 부분 구조를 가질 수 있다.
[화학식 32]
Figure pct00032
(식 중, GLY 는 당 물질을 나타내고, Lg 는 링커 구조 중의 당 사슬측 구조를 나타내고, 직사슬 또는 2 이상으로 분기해도 된다. GLY 와 L 은 O- 또는 N-글리코시드 결합으로 결합되어 있고, Lg 가 분기하고 있는 경우, 분기 말단과 동수의 GLY 를 연결할 수 있다. N-(AA) 는 아미노기 측사슬 아미노산의 측사슬의 아미노기에서 유래하는 질소 원자를 나타내고, (AA) 는 아미노산 기본 구조 및 측사슬 아미노기에 연결되는 구조 부분을 포함한다)
이와 같은 부분 구조를 갖는 링커 구조는, 아미노기 측사슬 아미노산, 또는, 그것을 포함하는 링커 분자에 대해, 카르복실기에 보호기를 도입하고, 이어서 “GLY-Lg-COOH” 로 나타내는 링커 분자를 반응시키고, 카르복실기를 탈보호하여, hANP 펩티드, 또는 Lp 와 결합시킴으로써 제조할 수 있다. 이 반응에 있어서, 아미노기 측사슬 아미노산의 α-아미노기가 프리인 경우, Lg 는 측사슬의 아미노기와 α 아미노기의 양방에 아미드 결합함으로써 분기 구조를 갖는 링커 구조를 형성할 수 있다. 예를 들어, SG-(SG-)Lys 와 같은 부분 구조를 갖는 수식 펩티드이다. 이와 같은 화합물의 구체예로서는, 화합물 2-14, 2-35 등을 예시할 수 있다.
또, 동일한 제조에 있어서, Lg (-당 물질) 과 Lp (-hANP 펩티드) 를 교체함으로써, 아미노기 측사슬 아미노산의 측사슬에 hANP 펩티드가 연결된 부분 구조를 갖는 수식 펩티드를 제조할 수 있다. 이와 같은 부분 구조는, 아미노기 측사슬 아미노산, 또는, 그것을 포함하는 링커 분자에 대해, 카르복실기에 보호기를 도입하고, 이어서 “Lp-COOH” 로 나타내는 링커 분자를 반응시키고, 카르복실기를 탈보호하여, 당해 카르복실기에 Lg 또는 당 물질을 결합시킴으로써 제조할 수 있다. 이 반응에 있어서, 아미노기 측사슬 아미노산의 α-아미노기가 프리인 경우, Lp 는 측사슬의 아미노기와 α 아미노기의 양방에 아미드 결합함으로써 분기 구조를 갖는 링커 구조를 형성할 수 있다. 예를 들어, Lp-(Lp-)Lys-Lg 와 같은 부분 구조를 갖는 수식 펩티드이다. 이와 같은 화합물의 구체예로서는, 화합물 2-38, 2-39 등을 예시할 수 있다. 또한, 다른 다양한 구조를 갖는 링커 분자와 조합하여 채용함으로써, 1 분자 중에 복수의 당 물질 및/또는 복수의 hANP 펩티드를 포함하는 수식 펩티드를 적절히 제조하는 것이 가능하다.
또, 아미노기 측사슬 아미노산끼리를, 측사슬 아미노기와 α 아미노기의 각각에, 동일한 아미노기 측사슬 아미노산의 α 카르복실기와 아미드 결합을 형성시키는 것을 반복함으로써, 다수의 아미노기를 갖는 구조가 형성되고, 당해 구조와 Lg 를 결합시킴으로써, 아미노기와 동수의 당 물질을 연결시킨 링커 구조를 형성하는 것이 가능하다. 예를 들어 이와 같은 분기한 펩티드의 복수의 아미노기에, 카르복실기를 갖는 당 사슬을, 예를 들어 HATU 와 같은 축합제를 사용하여 반응시킴으로써, 복수의 당 사슬을 분기 펩티드를 개재하여 도입할 수 있다. 이와 같이 하여 제조되는 수식 펩티드로서 예를 들어, “SG-[SG-(SG-)Lys-]Lys”, “SG-(SG-)Lys-[SG-(SG-)Lys-]Lys” 와 같은 링커 구조를 들 수 있다. 이와 같은 수식 펩티드의 구체예로서는, 화합물 2-14, 2-35 를 예시할 수 있다.
SH 기 측사슬 아미노산이란, 측사슬에 SH 기를 적어도 하나 갖는 아미노산이면 특별히 한정되지 않지만, 천연 아미노산으로서는 Cys 이다. 인공 아미노산으로서는, 예를 들어, Lys 의 측사슬 아미노기에 예를 들어 HOOC-R-STr (트리틸술피드) 구조를 갖는 화합물을 반응시키거나, 또는, Glu 또는 Asp 의 측사슬 카르복실기에 예를 들어 H2N-R-STr 구조를 갖는 화합물을 반응시켜 얻어지는, SH 기를 갖는 개변 아미노산 등을 예시할 수 있다.
링커 구조가 적어도 하나의 SH 기 측사슬 아미노산을 포함하고, 당 물질이 당해 SH 기 측사슬 아미노산의 측사슬에 연결되는 경우, 이하의 일반식의 부분 구조를 가질 수 있다.
[화학식 33]
Figure pct00033
(식 중, GLY 는 당 물질을 나타내고, Lg 는 링커 구조 중의 당 사슬측 구조를 나타내고, 직사슬 또는 2 이상으로 분기해도 된다. GLY 와 L 은 O- 또는 N-글리코시드 결합으로 결합되어 있고, Lg 가 분기하고 있는 경우, 분기 말단과 동수의 GLY 를 연결할 수 있다. S 는 SH 기 측사슬 아미노산의 측사슬 SH 기에서 유래하는 황 원자를 나타내고, (AA) 는 아미노산 기본 구조 및 측사슬 아미노기에 연결되는 구조 부분을 포함한다)
이와 같은 부분 구조를 갖는 링커 구조는, SH 기 측사슬 아미노산, 또는, 그것을 포함하는 링커 분자에 대해, (GLY)-Lg-N maleimide 로 나타내는 링커 분자를 반응시킴으로써 제조할 수 있다. 이 반응에 있어서, SH 기 측사슬 아미노산의 α-아미노기 및/또는 α 카르복실기에 있어서, 다른 당 물질과 연결시킬 수 있고, 그것에 따라 분기 구조를 갖는 링커 구조를 형성할 수 있다. 예를 들어 이와 같은 분기한 펩티드의 복수의 아미노기에, SH 기가 보호된 3-메르캅토프로피온산을 반응시키고, 펩티드의 C 말단을 탈보호하여 hANP 펩티드에 결합시킨 후, SH 기를 탈보호하고, 말레이미드기를 갖는 당 사슬을 0.2 M 인산 완충액 (pH 6.75) 중에서 반응시킴으로써, 복수의 당 사슬을 분기 펩티드를 개재하여 도입할 수 있다. 이와 같은 화합물의 구체예로서는, 화합물 2-19, 2-20, 2-23 등을 들 수 있다.
또, 동일한 제조에 있어서, Lg (-당 물질) 과 Lp (-hANP 펩티드) 를 교체함으로써, SH 기 측사슬 아미노산의 측사슬에 hANP 펩티드가 연결된 부분 구조를 갖는 수식 펩티드를 제조할 수 있다. 또한, 다른 다양한 구조를 갖는 링커 분자와 조합하여 채용함으로써, 1 분자 중에 복수의 당 물질 및/또는 복수의 hANP 펩티드를 포함하는 수식 펩티드를 적절히 제조하는 것이 가능하다.
카르복실기 측사슬 아미노산이란, 측사슬에 카르복실기를 적어도 하나 갖는 아미노산이면 특별히 한정되지 않지만, 천연 아미노산으로서는 Asp 또는 Glu 이다. 인공 아미노산으로서는, 예를 들어, Lys 의 측사슬 아미노기에 말레산과 같은 2 가 카르복실산을 반응시킨 개변 아미노산 등을 예시할 수 있다.
링커 구조가 적어도 하나의 카르복실산기 측사슬 아미노산을 포함하고, 당 물질이 당해 카르복실산기 측사슬 아미노산의 측사슬에 연결되는 경우, 이하의 일반식의 부분 구조를 가질 수 있다.
[화학식 34]
Figure pct00034
(식 중, GLY 는 당 물질을 나타내고, Lg 는 링커 구조 중의 당 사슬측 구조를 나타내고, 직사슬 또는 2 이상으로 분기해도 된다. GLY 와 L 은 O- 또는 N-글리코시드 결합으로 결합되어 있고, Lg 가 분기하고 있는 경우, 분기 말단과 동수의 GLY 를 연결할 수 있다. CO 는 카르복실산 측사슬 아미노산의 측사슬에서 유래하는 CO 를 나타내고, (AA) 는 아미노산 기본 구조 및 측사슬 아미노기에 연결되는 구조 부분을 포함한다)
이와 같은 부분 구조를 갖는 링커 구조는, 카르복실기 측사슬 아미노산, 또는, 그것을 포함하는 링커 분자에 대해, 필요에 따라 아미노기에 보호기를 도입하고, 이어서 “Lg-NH2” 로 나타내는 링커 분자를 반응시킨 후, 아미노기를 탈보호하고, Lg 또는 hANP 펩티드의 C 말단과 결합시킴으로써 제조할 수 있다. 이 반응에 있어서, 카르복실기 측사슬 아미노산의 α-카르복실기가 프리인 경우, Lg 는 측사슬의 카르복실기와 α 카르복실기의 양방에 아미드 결합함으로써 분기 구조를 갖는 링커 구조를 형성할 수 있다. 예를 들어 이와 같이 분기한 복수의 카르복실기를 가지는 펩티드에 트리플루오로아세트산 무수물과 N-하이드록시숙시이미드를 사용하여 카르복실산을 활성화하고, 아미노기를 가지는 당 사슬 (SG-NH2 등) 을 반응시킴으로써 복수의 당 사슬을 분기 펩티드를 개재하여 도입할 수 있다. 이와 같은 부분 구조로서는, 예를 들어, 카르복실기 측사슬 아미노산으로서 Glu 를 사용하여 SG 와 연결시킨 경우, “-(SG(Lg)-)Gln-(Lg)SG” 로 나타낸다 (Glu 및 Asp 의 측사슬이 아미드 결합을 형성하는 점에서, 이 경우 Gln/Asn 과 동일한 구조가 되기 때문에). 이와 같은 수식 펩티드의 구체예로서는, 화합물 2-31, 2-32 등을 예시할 수 있다.
또, 동일한 제조에 있어서, Lg (당 물질) 과 Lp (hANP 펩티드) 를 교체함으로써, 카르복실기 측사슬 아미노산의 측사슬에 hANP 펩티드가 연결된 부분 구조를 갖는 수식 펩티드를 제조할 수 있다. 이와 같은 부분 구조를 갖는 링커 구조는, 카르복실기 측사슬 아미노산, 또는, 그것을 포함하는 링커 분자에 대해, 필요에 따라 아미노기에 보호기를 도입하고, 이어서 “(hANP)-Lp-NH2” 로 나타내는 링커 분자를 반응시킨 후, 아미노기를 탈보호하고, 적절한 관능기를 갖는 Lg 와 결합시킴으로써 제조할 수 있다. 이 반응에 있어서, 카르복실기 측사슬 아미노산의 α-카르복실기가 프리인 경우, Lp 는 측사슬의 카르복실기와 α 카르복실기의 양방에 아미드 결합함으로써 분기 구조를 갖는 링커 구조를 형성할 수 있다. 예를 들어 이와 같이 분기한 복수의 카르복실기를 가지는 펩티드에 트리플루오로아세트산 무수물과 N-하이드록시숙시이미드를 사용하여 카르복실산을 활성화하고, 아미노기를 가지는 Lp 또는 hANP 펩티드의 N 말단 아미노기를 반응시킴으로써 복수의 hANP 펩티드를 분기 펩티드를 개재하여 도입한, 다가 hANP 의 수식 펩티드를 제조할 수 있다. 이와 같은 부분 구조로서는, 예를 들어, 카르복실기 측사슬 아미노산으로서 Glu 를 사용하여 hANP 와 연결시킨 경우, “SG Gln-(Lp-hANP)2” 로 나타낸다 (Glu 및 Asp 의 측사슬이 아미드 결합을 형성하는 점에서, 이 경우 Gln/Asn 과 동일한 구조가 되기 때문에). 또한, 다른 다양한 구조를 갖는 링커 분자와 조합하여 채용함으로써, 1 분자 중에 복수의 당 물질 및/또는 복수의 hANP 펩티드를 포함하는 수식 펩티드를 적절히 제조하는 것이 가능하다.
또, 카르복실기 측사슬 아미노산끼리를, 측사슬 카르복실기와 α 카르복실기의 각각에, 다른 카르복실기 측사슬 아미노산 (동일한 종류이거나, 상이해도 되지만, 동종류인 것이 바람직하다) 의 α 아미노기와 아미드 결합을 형성시키는 것을 반복함으로써, 다수의 카르복실기를 갖는 구조가 형성되고, 당해 구조와 Lg 를 상기의 반응에서 결합시킴으로써, 카르복실기와 동수의 Lg 를 연결시킨 링커 구조를 형성하는 것이 가능하다. 이와 같은 링커 구조의 부분 구조로서는, 예를 들어, “H-[(SG-)Gln-SG]Gln-SG” 등이다.
또한, 카르복실기 측사슬 아미노산의 카르복실기에는, 당 물질을 N 글리코시드 결합에 의해 직접 연결시켜, 이하의 부분 구조를 형성시킬 수 있다.
[화학식 35]
Figure pct00035
(식 중, GLY 는 당 물질을 나타내고, NH-CO-(AA) 는 카르복실기 측사슬 아미노산의 측사슬에서 유래하는 아미드 구조를 나타내고, (AA) 는 아미노산 기본 구조 및 측사슬 아미노기에 연결되는 구조 부분을 포함한다)
이와 같은 부분 구조는, 카르복실산 측사슬 아미노산, 또는, 그것을 포함하는 링커 분자에 대해, 환원 말단을 아지드화한 당 물질을, 트리페닐포스핀 존재하에서 반응시키고, 당 물질의 환원 말단과 측사슬을 N-글리코시드 결합시킴으로써 제조할 수 있다. 또, 실시예에 준한 방법에 의해, 카르복실기 측사슬 아미노산의 α-카르복실기에 당 물질을 연결시킨 구조를 갖는 화합물을 합성할 수 있다. 이와 같은 수식 펩티드의 구체예로서는, 화합물 2-3, 2-4, 2-8, 2-9, 2-13, 2-21, 2-22, 2-27, 2-28, 2-38, 2-39 등을 들 수 있다.
페놀기 측사슬 아미노산이란, 측사슬에 p-페놀기를 적어도 하나 갖는 아미노산이면 특별히 한정되지 않지만, 천연 아미노산으로서는 Tyr 이다. 인공 아미노산으로서는, 예를 들어, Glu 또는 Asp 의 측사슬 카르복실기에 p-아미노페놀을 반응시킨 개변 아미노산 등을 예시할 수 있다.
링커 구조가 적어도 하나의 페놀기 측사슬 아미노산을 포함하고, 당 물질이 당해 아미노산의 측사슬에 연결되는 경우, 이하의 일반식의 부분 구조를 가질 수 있다.
[화학식 36]
Figure pct00036
(식 중, GLY 는 당 물질을 나타내고, Lg 는 링커 구조 중의 당 사슬측 구조를 나타내고, 직사슬 또는 2 이상으로 분기해도 된다. GLY 와 L 은 O- 또는 N-글리코시드 결합으로 결합되어 있고, Lg 가 분기하고 있는 경우, 분기 말단과 동수의 GLY 를 연결할 수 있다. 페놀기는 페놀 측사슬 아미노산의 측사슬에서 유래하는 페놀기를 나타내고, (AA) 는 아미노산 기본 구조 및 측사슬 아미노기에 연결되는 구조 부분을 포함한다)
이와 같은 부분 구조를 갖는 링커 구조는, 페놀기 측사슬 아미노산, 또는, 그것을 포함하는 링커 분자에 대해, (GLY)-Lg-N triazoledione(*) 로 나타내는 링커 분자를 반응시킴으로써 제조할 수 있다. 이 반응에 있어서, 페놀기 측사슬 아미노산의 α-아미노기 및/또는 α 카르복실기에 있어서, 다른 당 물질과 연결시킬 수 있고, 그것에 따라 분기 구조를 갖는 링커 구조를 형성할 수 있다. 예를 들어 트리아졸디온 구조를 가지는 GlcNAc 를 N-브로모숙시이미드로 활성화하고, hANP 와 반응시킴으로써 hANP 의 28 위치에 해당하는 Tyr 의 페놀 측사슬에 GlcNAc 구조를 선택적으로 도입할 수 있고, 이것을 발판으로 당 사슬 전위 반응을 실시할 수 있다. 이와 같은 화합물의 구체예로서는, 화합물 2-6 등을 들 수 있다.
수산기 측사슬 아미노산이란, 측사슬에 수산기를 적어도 하나 갖는 아미노산이면 특별히 한정되지 않지만, 천연 아미노산으로서는 Ser 또는 Tyr 이다. 인공 아미노산으로서는, 예를 들어, Asp 또는 Glu 의 측사슬 카르복실산에 2-아미노에탄올과 같은 아미노알콜을 반응시켜 얻어지는 개변 아미노산 등을 예시할 수 있다.
또, 동일한 제조에 있어서, Lg (당 물질) 과 Lp (hANP 펩티드) 를 교체함으로써, 페놀기 측사슬 아미노산의 측사슬에 hANP 펩티드가 연결된 부분 구조를 갖는 수식 펩티드를 제조할 수 있다. 또한, 다른 다양한 구조를 갖는 링커 분자와 조합하여 채용함으로써, 1 분자 중에 복수의 당 물질 및/또는 복수의 hANP 펩티드를 포함하는 수식 펩티드를 적절히 제조하는 것이 가능하다.
링커 구조가 적어도 하나의 수산기 측사슬 아미노산을 포함하고, 당 물질이 당해 아미노산의 측사슬에 연결되는 경우, 이하의 일반식의 부분 구조를 가질 수 있다.
[화학식 37]
Figure pct00037
(식 중, GLY 는 당 물질을 나타내고, O 는 수산기 측사슬 아미노산의 측사슬 수산기에서 유래하는 산소 원자를 나타내고, (AA) 는 아미노산 기본 구조 및 측사슬 아미노기에 연결되는 구조 부분을 포함한다)
이와 같은 부분 구조를 갖는 링커 구조는, 수산기 측사슬 아미노산, 또는, 그것을 포함하는 링커 분자에 대해, 당 물질을 O-글리코시드 결합을 형성하는 조 건하에서 반응시킴으로써 제조할 수 있다. 이 반응에 있어서, 수산기 측사슬 아미노산의 α-아미노기 및/또는 α 카르복실기에 있어서, 다른 당 물질과 연결시킬 수 있고, 그것에 따라 분기 구조를 갖는 링커 구조를 형성할 수 있다. 예를 들어 트리클로로아세트이미데이트 구조를 가지는 글루코사민 유도체에 트리플루오로메탄술폰산트리메틸실릴 존재하, 세린의 측사슬 수산기를 반응시킨 후 여러 공정 거침으로써, O-글리코시드 결합을 개재하여 세린 측사슬에 GlcNAc 를 도입할 수 있고, 이것을 발판으로 당 사슬 전위 반응을 실시할 수 있다. 이와 같은 수식 펩티드의 구체예로서는, 화합물 2-5 등을 들 수 있다.
또, 동일한 제조에 있어서, Lg (당 물질) 과 Lp (hANP 펩티드) 를 교체함으로써, 수산기 측사슬 아미노산의 측사슬에 hANP 펩티드가 연결된 부분 구조를 갖는 수식 펩티드를 제조할 수 있다. 또한, 다른 다양한 구조를 갖는 링커 분자와 조합하여 채용함으로써, 1 분자 중에 복수의 당 물질 및/또는 복수의 hANP 펩티드를 포함하는 수식 펩티드를 적절히 제조하는 것이 가능하다.
이와 같은 측사슬 구조를 갖는 아미노산을 복수 함유하는 올리고펩티드를 포함하는 링커 분자, 또는, 각각의 아미노산을 하나 이상 함유하는 복수의 링커 분자를 사용하여 상기의 여러 가지의 반응을 실시함으로써, 포함되는 관능기 측사슬과 동수 이상의 당 물질을 연결시킬 수 있다. 이와 같은 올리고펩티드로서는, 상기의 측사슬을 갖는 아미노산이 함유되는 한 특별히 한정되지 않지만, 일정수의 Gly 를 추가로 함유하고 있어도 되고, 그들이 규칙적으로 늘어선 반복 배열인 것이 바람직하다. 예를 들어, 측사슬을 갖는 아미노산을 Xaa 로 한 경우, (Xaa-Gly m)n (m, n 은, 서로 독립적으로, 1 이상의 자연수를 나타낸다) 으로 나타내는 올리고펩티드인 것이 바람직하다. n, m 은 각각 특별히 상한은 없지만, 바람직하게는 10 이하이며, 보다 바람직하게는 7 이하이며, m 에 대해서는 추가로 3 이하인 것이 바람직하다. 구체적인 올리고펩티드로서는, (Cys-Gly)3, (Cys-Gly)5, (Lys-Gly-Gly)3, (Tyr-Gly-Gly-Gly)3 등을 예시할 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 이와 같은 구조를 갖는 수식 펩티드의 구체예로서, 화합물 2-15, 2-17, 2-18 등을 예시할 수 있다.
상기한 바와 같은, 각종의 링커 분자, GlcNAc- 화합물을 적절히 조합하여 결합시킴으로써, 원하는 구조로 설계된 링커 구조를 합성할 수 있다. 이와 같은 링커 구조는 매우 다양한 구조로 설계할 수 있고, 또, 결합시키는 당 물질의 수를 제어하는 것이 가능하다. 이와 같은, 설계, 합성에 의해, 베리에이션이 풍부한 수식 펩티드를 제조할 수 있다.
＜제조 방법·GlcNAc 화합물＞
본 발명에 있어서, 당 물질과 링커 구조가 O-글리코시드 결합한 수식 펩티드는 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc) 를 옥사졸린화한 GlcNAc-oxa (혹은, 그 GlcNAc 부위에 함유되는 3 개의 수산기가 아세틸화에 의해 보호된 것과 같은 관련 물질) 에 수산기를 갖는 링커 분자 (예를 들어 글리콜산벤질, 세린, 티로신과 같은 수산기 측사슬 아미노산 등) 를 반응시킴으로써 제조할 수 있다. 또, 당 물질과 링커 구조가 N-글리코시드 결합한 수식 펩티드는 아지드기를 갖는 당 물질과 카르복실기를 갖는 링커 분자를 트리페닐포스핀 존재하 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
본 발명의 수식 펩티드에 있어서, 당 물질로서 당 사슬 구조를 갖는 당 물질을 연결시키는 경우, 당 사슬의 환원 말단을 적절히 수식하여, 링커 분자에 결합시켜도 되고, 또, 특정의 당 단위와 원하는 구조를 갖는 피전이 화합물 (예를 들어, GlcNAc 화합물) 을 합성하고, 그 당 단위 (예를 들어, GlcNAc) 에 당 사슬 전이 효소 (예를 들어, Endo-M N175Q) 를 사용하여 당 사슬을 전이시키는 것에 의해서도 제조할 수 있다.
본 발명에 있어서, 「GlcNAc-화합물」 이란, 1 위치 탄소의 글리코시드 결합 이외에 수식을 받지 않은 GlcNAc, 및, 다른 분자와 결합할 수 있는 관능기를 포함하거나, 또는, hANP 펩티드와 연결되어 있는 화합물이다. GlcNAc-화합물은, 예를 들어, 1 분자 중에 단당으로서 GlcNAc 가 원하는 화합물, 아미노산 등과 글리코시드 결합한 화합물, 예를 들어 AG(5) 와 같이 비환원 말단에 GlcNAc 를 갖는 당 사슬 또는 그것과 결합한 화합물이어도 된다. 화합물과 GlcNAc 사이의 글리코시드 결합은 α 위치이거나, β 위치여도 전이 반응은 진행되지만 (Endoglycosidases : Masahiko Endo, et al Biochemistry, Biotechnology, Application), 전이 후의 당 사슬 구조가 천연의 당 사슬을 참고로 한 것인 경우, 당해 천연형 당 사슬과 동일한 양식인 것이 바람직하다. 예를 들어, 전이 후의 당 결합 화합물이 SG 를 갖는 경우, GlcNAc 화합물에 있어서도 β 위치인 것이 바람직하다.
GlcNAc 화합물은 공지된 여러 가지 방법에 따라 제조할 수 있다. 예를 들어, 글루코사민, 4,5-디하이드로-2-메틸옥사조로[5',4':1,2]-3,4,6-트리-O-아세틸-1,2-디데옥시-α-글루코피라노오스 (하기 식, Bull. Chem. Soc. Jpn., 2003, 76, 485-500 참조))
[화학식 38]
Figure pct00038
등을 출발 물질로서, 원하는 구조, 관능기를 갖도록 적절히 합성할 수 있다. 이와 같은 GlcNAc 화합물의 구체예로서는, 카르복실기를 갖는 화합물 1-2C, 아미노기를 갖는 화합물 1-7A 등, 트리아졸디온기를 갖는 화합물 1-6D 등을 들 수 있다. 또, GlcNAc 에 아미노산을 연결시킨 GlcNAc 화합물은 아미노기와 카르복실기 중 어느 것에 대해 선택적으로 보호기를 부가시켜 합성할 수 있다. 구체예로서는, Boc-(GlcNAc-)Ser (화합물 1-1D), Boc-(GlcNAc-)Asn (J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, 284-290), (GlcNAc-)Gln 등을 예시할 수 있다.
상기와 같은 GlcNAc- 화합물과 다른 링커 분자 또는 펩티드를 결합시킴으로써, 다양한 구조, 결합 관능기를 갖는 GlcNAc 화합물을 합성할 수 있고, 이와 같은 다양한 GlcNAc 화합물은 본 발명의 수식 펩티드의 제조에 이용할 수 있다. 예를 들어, 아미노기 (카르복실기) 를 갖는 GlcNAc 화합물과 카르복실기 (아미노기) 및 원하는 구조, 관능기를 갖는 링커 분자를 결합시킴으로써, 원하는 관능기를 갖는 GlcNAc 화합물 (구체예：말레이미드기를 갖는 화합물 1-7B 등) 을 합성할 수 있다.
또, 예를 들어, 아미노기 (카르복실기) 를 갖는 GlcNAc 화합물과 카르복실기 (아미노기) 를 갖는 PEG 링커 분자를 결합시킴으로써, 원하는 길이의 PEG 를 갖는 GlcNAc 화합물 (구체예：화합물 1-3A, 1-4B, 1-5A, 1-19 등) 을 합성할 수 있다. 또, PEG 대신에, 폴리 Gly 나 폴리 (Ser-Gly) 와 같은, 폴리아미드를 사용함으로써, 원하는 길이의 폴리아미드 링커를 갖는 GlcNAc 화합물 (구체예：화합물 1-21B 등) 을 합성할 수 있다. 여기서, 폴리아미드에 함유되는 아미노산으로서, 측사슬에 관능기를 갖는 것을 채용함으로써, 당해 관능기에 추가로 GlcNAc 화합물을 결합시킬 수 있다.
또, 본 발명에 사용되는 GlcNAc-화합물은 1 분자 중에 단독의 GlucNAc 를 복수 함유하는 화합물이어도 된다. 이와 같은 다가의 GlcNAc 화합물은 전술한 아미노산에 2 개의 GlcNAc 가 N-글리코시드 결합한 것이나, 상기의 GlcNAc-화합물을 링커 분자에 복수 결합시킨 것 등을 들 수 있다. 예를 들어, Lys 와 같이 측사슬에 아미노기를 갖는 아미노산을 링커 분자로 하고, 카르복실기를 갖는 GlcNAc 화합물 2 당량과 반응시킴으로써, GlcNAc-(GlcNAc-)Lys-OH 와 같은, 2 개의 GlcNAc 및 1 개의 카르복실기를 갖는 GlcNAc 화합물을 합성할 수 있다. 또한, 이 GlcNAc-(GlcNAc-)Lys-OH 와 리신 (아미노기 측사슬 아미노산) 을 반응시킴으로써 4 가의 GlcNAc 화합물을 합성할 수 있고, 이 공정을 반복함으로써 다수의 GlcNAc 를 함유하는 GlcNAc 화합물을 합성할 수 있다. 또, GlcNAc 화합물이 복수의 관능기를 갖는 경우, 그 일부에 보호기를 도입하여 GlcNAc 를 연결시킨 후, 탈보호하여, 당해 탈보호한 관능기에 다른 GlcNAc 화합물을 결합시키는 것에 의해서도 다가의 GlcNAc 화합물을 합성할 수 있다 (구체예：화합물 1-5B). 이와 같은 수법을, 통상적인 방법에 따라, 적절히 반복하거나, 및/또는, 조합함으로써, 다양한 GlcNAc 화합물을 합성하는 것이 가능하다.
또, 상기의 GlcNAc-화합물의 정의, 형태 등에 있어서, GlcNAc 를 Glc, Man 으로 치환한 화합물을, 각각, Glc-화합물, Man-화합물이라고 정의하고, 이들도 본 발명의 수식 펩티드의 제조를 위한 피전이 화합물로서 바람직하게 채용된다.
본 발명의 수식 펩티드의 제조에 있어서는, hANP, 당 물질, 링커 분자, 피전이 화합물 등의 중간체를 적절히 결합·전이 등 시킴으로써 제조할 수 있지만, 그 제조의 순서는 특별히 한정되지 않고, 통상적인 방법에 따라, 여러 가지 방법에 의해 제조할 수 있다. 각각의 중간체가 갖는 관능기는, 당해 제조 공정에 따라, 통상적인 방법에 따라, 적절히, 활성화, 불활성화, 보호기의 부가, 탈보호 등을 실시한다.
당 물질의 연결은 여러 가지 방법을 취할 수 있다. 예를 들어, GlcNAc, Glc 등을 갖는 링커 분자에 당 사슬을 전이시켜, 당해 당 사슬 결합 링커 분자를 hANP 펩티드에 연결할 수 있다. 또, Glc 나 GlcNAc 와 hANP 펩티드를 연결시킨 중간체를 피전이 화합물로서 당 사슬을 전이시킴으로써, 수식 펩티드를 제조해도 된다. 당 물질이 갖는 수산기는, 적절히 아세틸화, 탈아세틸화 등의 공정을 거침으로써, 불필요한 부반응을 억제할 수 있다.
＜기능, 활성＞
본 발명의 수식 펩티드는, 수식되어 있지 않은 hANP(1-28) 과 비교해서, 연장된 혈중 지속 시간, 및, 우수한 수용성을 나타내고, 또한, cGMP 상승 활성을 유지하고 있다. hANP(1-28) 은, 혈중으로부터 신속하게 소실되기 때문에, 임상에서는 연속 투여할 필요가 있었지만, 본 발명의 수식 펩티드는 비연속 투여에 의해서도 약리 효과를 발휘할 수 있다. 또, 본 발명의 수식 펩티드는, 천연형 hANP 보다 우수한 수용성을 나타내기 때문에, 유효 성분을 고농도로 함유하는 제제에 적용할 수 있다. 이와 같은, 본 발명의 수식 펩티드의 특성에 의해, 종래의 천연형 hANP 에서는 달성할 수 없었던, 투여 방법, 투여 경로, 제제 기술을 채용하는 것이 가능해지고, 급성의 순환기계 질환뿐만 아니라, 만성의 순환기계 질환 (고혈압증이나 만성 심질환 등) 의 치료에 사용하는 것도 가능해진다. 또한, 본 발명의 수식 펩티드는 생물학적 연구 툴로서도 유용하다. 천연형 hANP 는 장기간 혈중에 존재한 경우의 조직 이행성 등은 불명확하지만, 본 발명의 수식 펩티드를 투여함으로써, 이와 같은 국재나 hANP 가 장기간 혈중에 존재하는 것에 의한 생체에 대한 영향을 조사하는 것이 가능해진다. 본 발명의 수식 펩티드의 혈중 지속성은, 시험예 3 의 방법에 준하여, 동물에의 투여 후의 말초혈 중의 cGMP 농도, 및/또는, 말초혈 샘플 중에 함유되는 당해 수식 펩티드를 검출함으로써 시험할 수 있다. 본 발명의 수식 펩티드는, 체내에 투여된 후, 약 15 분 후에 있어서도 말초혈 중의 cGMP 농도를 상승시키는 효과를 유지하고 있고, 보다 바람직하게는 투여 약 30 분 후에 있어서도 당해 효과를 유지하고 있고, 보다 바람직하게는 투여 약 45 분 후에 있어서도 당해 효과를 유지하고 있고, 한층 더 바람직하게는 투여 약 60 분 후에 있어서도 당해 효과를 유지하고 있다. 또, 수식 펩티드의 투여 후의 말초혈로부터의, 당해 수식 펩티드의 검출에 관해서, 약 30 분 후에 있어서도 검출되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 약 45 분 후에 있어서도 검출되는 것이며, 더욱 바람직하게는 약 60 분 후에 있어서도 검출되는 것이며, 한층 더 바람직하게는 약 90 분 후에 있어서도 검출되는 것이다.
본 발명의 수식 펩티드는, 당 물질이 연결되어 있음으로써, 우수한 수용성을 나타낸다. 이 우수한 수용성은 또한 링커 구조의 화학 구조에 의해서도 영향받는다. 물 1 ㎖ 당 용해량으로서는, 천연형 hANP 는 32 mmol 로 겔화하는데 대해, 본 발명의 수식 펩티드는 60 mmol 이상, 바람직하게는 80 mmol 이상, 더욱 바람직하게는 100 mmol (예를 들어, 구체적으로는 112 mmol) 이 용해되기 때문에, 약 2 배 이상, 바람직하게는 약 3 배 이상의 수용성을 갖는 것이다.
본 발명의 수식 펩티드의 혈중 지속 시간은 수식 펩티드를 생체에 투여하고, 일정 시간 걸러서 혈액을 채취하여, 당해 혈액 샘플 중에 함유되는 수식 펩티드를 검출함으로써 측정할 수 있다. 수식 펩티드의 검출 방법으로서는, 예를 들어, LC-MS 에 의한 검출, hANP 의 링 구조를 특이적으로 인식하는 항체를 사용한 ELISA 법 등 여러 가지 방법을 사용할 수 있다. 또, 본 발명의 수식 펩티드를 cGMP 상승 활성을 발현하는 용량으로 투여했을 경우, 당해 혈액 샘플의 cGMP 레벨을 시판되는 측정 키트를 사용하여 측정하고, 투여 개시 전의 혈중의 cGMP 레벨과 비교함으로써, 혈중의 수식 펩티드의 지속 시간을 생물 활성으로서 측정할 수 있다. 또, 수식 펩티드를 방사성 동위체로 표식하고, 혈액 샘플을 SDS-PAGE 등으로 분리하여, 방사성 시그널을 검출함으로써, 검출할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 「혈중 지속 시간이 연장되었다」 란, 천연형 hANP 와 비교해서 긴 혈중 지속 시간을 나타내는 것을 의미한다. 원숭이에 대한 피하 투여에 있어서, 천연형 hANP 는 투여 후 30 분의 시점에서 혈중으로부터 검출되지 않기 때문에, 30 분의 시점에서 검출되면 혈중 지속 시간이 연장되었다고 간주할 수 있다. 또, 동일한 원숭이에 대한 피하 투여에 있어서, 혈중 cGMP 레벨의 상승은, 천연형 hANP 에서는 투여 후 60 분에 투여 전과 동일한 레벨로 돌아오기 때문에, 투여 60 분의 시점에서 투여 전보다도 높은 cGMP 레벨을 나타낸 경우, 혈중 지속 시간이 연장되었다고 간주할 수 있다.
또, 본 발명의 수식 펩티드는 NEP 에 의한 hANP 펩티드의 분해에 대해 내성을 갖는 것이 지속 시간이 연장되는 요인의 하나로 생각된다. 이와 같은, NEP 분해 내성은 공지된 방법으로 측정할 수 있다.
본 발명의 수식 펩티드의 cGMP 상승 활성은, GC-A 수용체를 발현하는 세포를 충분량까지의 농도 구배로 조정한 피험물질로 자극한 후, 세포를 용해하여 그 세포 용해액 중의 cGMP 농도를 측정하고, 최대의 cGMP 농도 (Emax) 를 동정함으로써 측정한다. 본 발명의 수식 펩티드가 「cGMP 상승 활성을 유지한다」 란, 수식 펩티드가 나타내는 최대 cGMP 농도가, 천연형 hANP 의 최대 cGMP 농도와 비교해서, 약 30 ％ 이상인 것을 의미하고, 바람직하게는, 약 50 ％ 이상이며, 보다 바람직하게는, 약 70 ％ 이상이다. 본 발명의 수식 펩티드는, 천연형 hANP 와 비교해서, 고농도로 제제화할 수 있고, 또한, 연장된 혈중 지속 시간을 나타내기 때문에, 이른바 EC50 값과 같은 지표로 활성을 정의하는 것은 적절하지 않고, 농도를 상승시켰을 경우의 최대의 활성이 천연형의 일정 이상의 활성을 나타낼 수 있으면, 임상에 있어서, 지속적, 및 또는, 고농도로 투여되었을 경우에 충분한 약효를 얻을 수 있다.
본 발명은 본 발명의 수식 펩티드를 유효 성분으로서 함유하는 의약을 제공한다.
＜의약＞
본 발명에 관련된 의약의 유효 성분으로서 이용할 수 있는 물질은 상기 서술한 수식 펩티드의 약학적으로 허용되는 염이어도 된다. 즉, 본 발명에 있어서는, 상기 서술한 물질의, 무기산, 예를 들어 염산, 황산, 인산, 또는 유기산, 예를 들어 포름산, 아세트산, 부티르산, 트리플루오로아세트산 (TFA), 숙신산, 시트르산 등의 산 부가염을 유효 성분으로서 사용할 수도 있다. 혹은, 본 발명에 있어서는, 상기 서술한 물질의, 나트륨, 칼륨, 리튬, 칼슘 등의 금속염, 유기 염기에 의한 염의 형태를 유효 성분으로서 사용할 수도 있다. 이와 같은, 본 발명의 수식 펩티드의 염은 hANP 펩티드 부분의 염이어도 되고, 당 물질의 구조에 있어서 염을 형성하고 있어도 된다. 본 발명의 수식 펩티드의 염으로서 바람직하게는, hANP 펩티드 부분으로 약학상 허용되는 염을 형성한 것이며, 보다 바람직하게는 hANP 펩티드 부분으로 트리플루오로아세트산염 또는 아세트산염을 형성한 것이며, 또, 본 발명에 관련된 의약 조성물은 그 유효 성분에 관련된 물질의 유리형이거나, 또는 그 약학상 허용할 수 있는 염이어도 된다.
본 발명에 관련된 의약의 유효 성분으로서 이용할 수 있는 물질 또는 그 약학적으로 허용할 수 있는 염은 공지된 약학적으로 허용할 수 있는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 의약에 일반적으로 사용되고 있는 투여 방법, 즉 경구 투여 방법, 또는, 경점막 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여 혹은 피하 투여 등의 비경구 투여 방법에 의해 개체에 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명에 관련된 의약의 유효 성분으로서 이용할 수 있는 물질의 투여량은 질환의 종류, 개체 (환자) 의 연령, 체중, 증상의 정도 및 투여 경로 등에 따라서도 상이하지만, 일반적으로 1 일당 투여량의 상한으로서는, 예를 들어 약 100 mg/kg 이하이며, 바람직하게는 약 50 mg/kg 이하이며, 더욱 바람직하게는 1 mg/kg 이하이다. 또, 1 일당 투여량의 하한으로서는, 예를 들어 약 0.1 ㎍/kg 이상이며, 바람직하게는 0.5 ㎍/kg 이상이며, 보다 바람직하게는 1 ㎍/kg 이상이다.
본 발명에 관련된 의약의 투여 빈도는 사용하는 유효 성분, 투여 경로, 및 처치하는 특정의 질환에 의존해도 변동한다. 예를 들어 펩티드성의 물질을 경구 투여하는 경우, 1 일당 4 회 이하의 투여 횟수로 처방하는 것이 바람직하고, 또 비경구 투여, 예를 들어 정맥내 투여하는 경우에는, 통상적인 시린지를 사용하여 주사할 수도 있고, 인퓨전 펌프, 카테이텔 등을 이용하여 지속적으로 투여할 수도 있다. 또, 피하 주사, 근육내 주사 등의 경로로 투여하는 것도 바람직하고, 그 경우, 통상적으로 사용되는 여러 가지 투여 디바이스를 이용할 수 있다.
본 발명의 의약의 유효 성분을 액제로서 조정하는 경우, 본 발명의 수식 펩티드 또는 그 약학적으로 허용할 수 있는 염을 수성 용매에 용해하고, 필요에 따라, 안정화제, pH 조정제, 계면 활성제 등을 첨가하여 조정할 수 있다. 또, 동결 건조 제제로 하는 경우, 상기와 같이 조제한 액제를 동결 건조시키고, 사용 시에 생리 식염수, 주사 용수, 포도당액 등으로 용해하여 사용할 수 있다.
본 발명의 의약은, GC-A 에 작용하여 cGMP 레벨을 상승시킴으로써, 치료할 수 있는 질환의 환자에게 투여함으로써, 당해 질환을 치료하는 효과를 갖는다. 여기서, 질환 또는 증상의 「치료」 란 GC-A 의 활성화에 의해 정상화가 기대되는 병적 증상의 진행을 지연, 경감, 완화 및/또는 억제함으로써, 증상을 정상화에 근접시키는 것을 의미한다. 질환의 조기 또는 질환 리스크가 높은 상태에서 투여를 개시함으로써, 질환의 중증화 또는 발상을 억제하는 효과가 기대된다. 또, 과거에 당해 질환을 이환한 것은 재발, 또는, 만성화에 빠질 위험성이 있지만, 이와 같은 환자에 대해, 본 발명의 의약을 계속적으로 투여함으로써, 재발이나 만성화의 리스크를 저감시키는 것을 기대할 수 있다. 이와 같은 효과도 치료에 포함되는 것으로 한다.
이와 같은 질환으로서는, 예를 들어, 고혈압, 급성 심부전 (급성 심부전 발증 후에 있어서의 병상 관리를 포함한다), 만성 심부전, 허혈성 심질환, 급성 신염 (급성 신염 발증 후에 있어서의 병상 관리를 포함한다), 만성 신염, 급성 신부전 (급성 신부전 발증 후에 있어서의 병상 관리를 포함한다), 만성 신부전, 허혈성 심질환 (심근경색 등), 악성 종양의 전이, 간섬유화, 간경변, 투석에 있어서의 조직의 유착, 섬유화 등이다.
실시예
이하, 실시예를 사용하여, 본 발명을 구체적으로 설명한다. 실시예에 나타낸 것은 본 발명의 실시형태의 일례이며, 본 발명은 이것으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 은, 본 발명의 수식 펩티드의 제조 중간체인, 링커 분자, GlcNAc 화합물, 당 물질 또는 그 유도체의 제조예이며, 실시예 2 는 그들 중간체를 사용하여 수식 펩티드의 제조예이다. 시험예는 본 발명의 수식 펩티드의 특성이나 효과를 시험한 예이다.
［실시예 1］
＜실시예 1-1＞
(1-1A) 아세트산[(2R,3S,4R,5R,6R)-3,4-디아세톡시-6-하이드록시-5-(2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐아미노)테트라하이드로피란-2-일]메틸 (화합물 1-1A, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 39]
Figure pct00039
글루코사민염산염 (10.0 g, 46.38 mmol) 과 탄산수소나트륨 (11.7 g, 139 mmol) 을 물 (100 ㎖) 에 용해하고, 실온에서 클로로포름산2,2,2-트리클로로에틸 (7.66 ㎖, 55.7 mmol) 을 적하하여, 1 시간 교반했다. 반응 용액에 1 N 염산을 첨가하여 중화하고, 생성된 침전을 여과 채취했다. 물로 고체를 세정 후 진공 펌프로 건조시켰다. 얻어진 고체를 피리딘 (50 ㎖) 에 용해하고, 실온에서 무수 아세트산 (24.1 ㎖, 255 mmol) 을 첨가하여 철야 교반했다. 용매를 감압 증류 제거하여 미정제 생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (헥산：아세트산에틸 = 80：20 - 33：67, v/v) 로 정제하여, 중간체의 미정제 생성물을 무색 유상물 (19.4 g) 로서 얻었다.
얻어진 중간체의 미정제 생성물 (19.4 g) 을 N,N-디메틸포름아미드 (200 ㎖) 에 용해하고, 실온에서 히드라진아세트산염 (4.01 g, 44.5 mmol) 을 첨가하여 1 시간 교반했다. 반응액을 아세트산에틸로 묽게 하고, 10 ％ 식염수로 2 회, 포화 식염수로 1 회 세정했다. 무수 황산나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 증류 제거하여 미정제 생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (헥산：아세트산에틸 = 80：20 - 25：75, v/v) 로 정제하여, 목적물 1-1A 를 백색 고체 (11.6 g, 2 공정 수율 52 ％) 로서 얻었다.
Figure pct00040
(1-1B) 아세트산[(2R,3S,4R,5R,6S)-3,4-디아세톡시-6-(2,2,2-트리클로로에탄이미도일)옥시-5-(2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐아미노)테트라하이드로피란-2-일]메틸 (화합물 1-1B, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 40]
Figure pct00041
1-1A (5.00 g, 10.4 mmol) 를 디클로로메탄 (35 ㎖) 에 용해하고, 0 ℃ 에서 트리클로로아세토니트릴 (10.4 ㎖, 104 mmol) 과 디아자비시클로운데센 (0.467 ㎖, 3.12 mmol) 을 첨가했다. 반응액을 실온까지 승온하고, 40 분 교반했다. 용매를 감압 증류 제거하여 미정제 생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (헥산：아세트산에틸 = 75：25 - 50：50, v/v) 로 정제하여, 목적물 1-1B 를 무색 유상물 (3.70 g, 수율 57 ％) 로서 얻었다.
Figure pct00042
(1-1C) (2S)-3-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라하이드로피란-2-일]옥시-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)프로판산벤질 (화합물 1-1C, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 41]
Figure pct00043
1-1B (2.77 g, 4.44 mmol) 를 디클로로메탄 (50 ㎖) 에 용해하고, 실온에서 (2S)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)-3-하이드록시프로판산벤질 (1.31 g, 4.44 mmol) 과 트리플루오로메탄술폰산트리메틸실릴 (8.0 ㎕, 0.0444 mmol) 을 첨가하여 1 시간 교반했다. 트리에틸아민 (0.1 ㎖) 을 첨가하고 용매를 감압 증류 제거하여 미정제 생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (헥산：아세트산에틸 = 75：25 - 33：67, v/v) 로 정제하여, 중간체의 미정제 생성물을 백색 고체 (2.01 g) 로서 얻었다.
얻어진 중간체의 미정제 생성물 (2.01 g) 을 무수 아세트산 (50 ㎖) 에 용해하고, 0.1 N 염산, 메탄올, 디에틸에테르의 순서로 세정하여 건조시킨 아연 (1.5 g, 22.9 mmol) 을 실온에서 첨가하고, 6 시간 교반했다. 반응액을 셀라이트로 여과하고, 용매를 감압 증류 제거하여 미정제 생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (헥산：아세트산에틸 = 50：50 - 0：100, v/v) 로 2 회 정제하여, 목적물 1-1C 를 무색 고체 (0.846 g, 2 공정 수율 31 ％) 로서 얻었다.
Figure pct00044
(1-1D) (2S)-3-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라하이드로피란-2-일]옥시-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)프로판산 (화합물 1-1D, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 42]
Figure pct00045
1-1C (846 mg, 1.35 mmol) 에 10 ％ 팔라듐탄소 (약 50 ％ 수(水)습윤품) (150 mg) 와 아세트산에틸 (5 ㎖) 과 에탄올 (5 ㎖) 을 첨가하고, 수소 분위기하 실온에서 3 시간 교반했다. 반응액을 여과하여 용매를 감압 증류 제거함으로써, 중간체의 미정제 생성물을 무색 유상물 (740 mg) 로서 얻었다.
얻어진 중간체의 미정제 생성물 (740 mg) 을 메탄올 (10 ㎖) 에 용해하고, 0.5 M 나트륨메톡시드-메탄올 용액 (14 ㎖, 7.0 mmol) 을 첨가하여 실온에서 20 시간 교반했다. 반응액이 약산성이 될 때까지 Dowex-50 을 반응액에 첨가한 후, 여과하여 용매를 감압 증류 제거함으로써, 목적물 1-1D 를 담갈색 고체 (543 mg, 2 공정 수율 98 ％) 로서 얻었다.
Figure pct00046
＜실시예 1-2＞
(1-2A) 2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라하이드로피란-2-일]옥시아세트산벤질 (화합물 1-2A, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 43]
Figure pct00047
Bull. Chem. Soc. Jpn., 2003, 76, 485-500 의 기재에 준하여 제조한, 4',5'-디하이드로-2'-메틸옥사조로[5',4':1,2]-3,4,6-트리-O-아세틸-1,2-디데옥시-α-글루코피라노스 (4.30 g, 13.1 mmol) 를 디클로로에탄 (50 ㎖) 에 용해하고, 실온에서 글리콜산벤질 (5.56 ㎖, 39.1 mmol), p-톨루엔술폰산피리디늄 (1.64 g, 6.53 mmol) 을 첨가하고, 3 시간 가열 환류했다. 반응 용액을 냉각 후, 빙랭하, 포화 탄산수소나트륨 수용액에 첨가하고, 유기물을 염화메틸렌으로 추출했다. 유기층을 1 N 염산 수용액, 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수로 세정한 후, 무수 황산나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 증류 제거하여 미정제 생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (헥산：아세트산에틸 = 60：40 - 0：100, v/v) 로 정제하여, 목적물 1-2A 를 무색 고체 (3.45 g, 수율 53 ％) 로서 얻었다.
Figure pct00048
(1-2B) 2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라하이드로피란-2-일]옥시아세트산 (화합물 1-2B, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 44]
Figure pct00049
1-2A (3.45 g, 6.96 mmol) 를 메탄올 (54 ㎖) 에 용해하고, 20 ％ 수산화팔라듐-탄소 (690 mg) 를 첨가하고, 수소 분위기하 실온에서 3.0 시간 교반했다. 셀라이트로 여과하여, 용매를 감압 증류 제거했다. 디이소프로필에테르를 첨가하여 얻어진 고체를 여과 채취하고, 목적물 1-2B 를 무색 고체 (2.72 g, 수율 96 ％) 로서 얻었다.
Figure pct00050
(1-2C) 2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-아세트아미도-4,5-디하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로피란-2-일]옥시아세트산 (화합물 1-2C, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 45]
Figure pct00051
1-2B (2.72 g, 6.73 mmol) 를 메탄올 (42 ㎖) 에 용해하고, 실온에서 5 mol/ℓ 나트륨메톡시드-메탄올 용액 (2 ㎖, 10 mmol) 을 첨가한 후, 실온에서 하룻밤 동안 교반했다. 반응 종료 후, 증류수 (4 ㎖) 첨가한 후에, 이온 교환 수지 (Dawex50wx8) 를 첨가하여 pH 3 으로 하고, 반응 용액을 여과하여, 용매를 감압 증류 제거했다. 디이소프로필에테르를 첨가하여 얻어진 고체를 여과 채취하고, 목적물 1-2C 를 무색 고체 (2.72 g, 수율 96 ％) 로서 얻었다.
Figure pct00052
＜실시예 1-3＞
(1-3A) 3-[2[2[2[2[[2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-아세트아미도-4,5-디하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로피란-2-일]옥시아세틸]아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산 (화합물 1-3A, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 46]
Figure pct00053
1.20 mmol/g 의 2-클로로트리틸클로라이드레진 (694 mg, 0.833 mmol) 을 고상 합성용의 칼럼에 넣고, 디클로로메탄 (5 ㎖) 을 첨가하여 5 분 진탕했다. 여과 후, 3-[2[2[2[2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산 (488 mg, 1 mmol) 과 N,N-디이소프로필에틸아민 (730 ㎕, 4.17 mmol) 의 디클로로메탄 (5 ㎖) 용액을 첨가하고, 실온에서 2 시간 교반했다. 여과 후, 디클로로메탄 혼합 용액 (디클로로메탄：메탄올：N,N-디이소프로필에틸아민 = 85：10：5, v/v) 으로 3 회, 디클로로메탄으로 3 회, N,N-디메틸포름아미드로 3 회 세정했다. 20 ％ 피페리딘/N,N-디메틸포름아미드 용액 (5 ㎖) 을 첨가하여 5 분 진탕 후 여과하는 조작을 4 회 실시했다. N,N-디메틸포름아미드로 3 회, 디클로로메탄으로 3 회, 디에틸에테르로 3 회 세정하고, 진공 펌프로 건조시켰다. 얻어진 레진 (800 mg) 중, 일부분 (200 mg) 을 고상 합성용의 칼럼에 넣고, N,N-디메틸포름아미드 (2.5 ㎖), 트리에틸아민 (406 ㎕, 2.92 mmol), 물 (0.5 ㎖) 을 첨가했다. 여기에, 1-2C (174 mg, 0.625 mmol) 와 N,N-디메틸포름아미드 (3 ㎖) 와 트리에틸아민 (174 ㎕, 1.25 mmol) 과 디메틸티오포스포노일클로라이드 (80 mg, 0.625 mmol) 를 실온에서 1 시간 교반한 용액을 첨가했다. 실온에서 2 시간 교반한 후, 여과하여 레진을 N,N-디메틸포름아미드로 3 회, 디클로로메탄으로 3 회 세정했다. 1 ％ 트리플로아세트산/디클로로메탄 용액 (2 ㎖) 을 첨가하고, 2 분 진탕 후 여과액을 회수하는 조작을 10 회 실시했다. 회수한 용액을 감압 증류 제거하여 미정제 생성물을 얻었다. 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하고, 목적물 1-3A 를 백색 고체 (25 mg) 로서 얻었다.
ESI-LC-MS : Calcd for C21H38N2O13 : [M+H]+526, Found 526.
＜실시예 1-4＞
(1-4A) 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산 (화합물 1-4A, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 47]
Figure pct00054
3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산 (320 mg, 0.38 mmol) 을 메탄올 (2 ㎖) 과 증류수 (2 ㎖) 에 용해하고, 0 ℃ 에서 1 N 수산화나트륨 수용액 (1 ㎖) 을 첨가하고, 실온에서 1.5 시간 교반했다. 0 ℃ 에서 1 N 염산 (1 ㎖) 을 첨가하고, 감압하에서 유기 용매를 증류 제거했다. 증류수 (10 ㎖) 를 첨가하고, 디클로로메탄으로 세정한 후, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하고, 동결 건조시켜 무색 유상 물질로서 목적물 1-4A (233.5 mg, 99 ％) 를 얻었다.
Figure pct00055
(1-4B) 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-아세트아미도-4,5-디하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로피란-2-일]옥시아세틸]아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산 (화합물 1-4B, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 48]
Figure pct00056
1-2C (36.6 mg, 0.13 mmol) 를 디메틸포름아미드 (500 ㎕) 에 용해하고, 실온에서 트리에틸아민 (45.7 ㎕, 0.33 mmol) 을 첨가한 후, 0 ℃ 에서 디메틸티오포스피노일클로라이드 (16.9 mg, 0.13 mmol) 의 디메틸포름아미드 용액 (500 ㎕) 을 첨가하고, 0 ℃ 에서 0.5 시간 교반했다.
1-4A (67.5 mg, 0.11 mmol) 를 디메틸포름아미드 (500 ㎕) 에 용해하여, 0 ℃ 에서 조제한 활성 에스테르를 첨가하고, 실온에서 6 시간 교반했다. 증류수 (3 ㎖), 아세트산 (100 ㎕) 을 첨가하고, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하고, 동결 건조시켜 무색 유상 물질로서 목적물 1-4B (31.0 mg, 32 ％) 를 얻었다.
Figure pct00057
＜실시예 1-5＞
(1-5A) 3-[2-[2-[2-[2-[[(2S)-4-[[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-아세트아미도-4,5-디하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로피란-2-일]아미노-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4-옥소부타노일]아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산 (화합물 1-5A, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 49]
Figure pct00058
3-[2-[2-[2-[2-(tert-부톡시카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산 (200 mg, 0.547 mmol) 을 4 N 염산-디옥산 용액 (2 ㎖) 에 녹여, 실온에서 1 시간 교반했다. 용매를 감압 증류 제거하여 진공 펌프로 건조시킴으로써, 중간체의 미정제 생성물을 담갈색 유상물 (165 mg) 로서 얻었다.
J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, 284-290. 의 수법에 따라 제조한 (2S)-4-[[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-아세트아미도-4,5-디하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로피란-2-일]아미노]-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4-옥소부탄산 (158 mg, 0.364 mmol) 과 HATU (138 mg, 0.364 mmol) 를 N,N-디메틸포름아미드 (3 ㎖) 에 용해하고, N,N-디이소프로필에틸아민 (128 ㎕, 0.728 mmol) 을 첨가하고 실온에서 1 분 교반했다. 이 용액을, 얻어진 중간체의 미정제 생성물 (54.9 mg) 에 첨가하고, 또한 N,N-디이소프로필에틸아민 (128 ㎕, 0.728 mmol) 을 첨가하여 실온에서 0.5 시간 교반했다. 반응액을 물로 묽게 하고, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하고, 목적물 1-5A 를 백색 고체 (53 mg, 2 공정 수율 43 ％) 로서 얻었다.
ESI-LC-MS : Calcd for C28H50N4O15 : [M+H]+683, Found 683.
(1-5B) 3-[2-[2-[2-[2-[[(2S)-4-[[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-아세트아미도-4,5-디하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로피란-2-일]아미노]-2-[[2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-아세트아미도-4,5-디하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로피란-2-일]옥시아세틸]아미노]-4-옥소부타노일]아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산 (화합물 1-5B, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 50]
Figure pct00059
1-5A (53 mg, 0.0777 mmol) 에 30 ％ 트리플루오로아세트산 수용액을 첨가하여, 실온에서 7 시간 교반했다. 물로 묽게 하여 동결 건조시킴으로써, 중간체의 미정제 생성물을 담갈색 유상물 (45 mg) 로서 얻었다.
1-2C (65.1 mg, 0.233 mmol) 와 트리에틸아민 (65 ㎕, 0.466 mmol) 을 N,N-디메틸포름아미드 (0.5 ㎖) 에 용해하고, 디메틸티오포스포노일클로라이드 (30 mg, 0.233 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 (0.5 ㎖) 용액을 0 ℃ 에서 첨가했다. 실온까지 승온하고, 1 시간 교반했다. 이 용액을 0 ℃ 까지 식혀서, 얻어진 중간체의 미정제 생성물 (45 mg) 과 트리에틸아민 (152 ㎕, 1.088 mmol) 과 N,N-디메틸포름아미드 (2.5 ㎖) 와 물 (0.5 ㎖) 의 혼합 용액을 첨가했다. 실온까지 승온하여, 8 시간 교반했다. 반응액을 물로 묽게 하여, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하고, 목적물 1-5B 를 백색 고체 (9.25 mg, 2 공정 수율 14 ％) 로서 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C33H57N5O20 : [M+H]+844, Found 844.
＜실시예 1-6＞
(1-6A) 아세트산[(2R,3S,4R,5R,6R)-5-아세트아미도-3,4-디아세톡시-6-[2-(4-니트로페닐)에톡시]테트라하이드로피란-2-일]메틸 (화합물 1-6A, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 51]
Figure pct00060
Bull. Chem. Soc. Jpn., 2003, 76, 485-500 의 기재에 준하여 제조한, 4,5-디하이드로-2-메틸옥사조로[5',4':1,2]-3,4,6-트리-O-아세틸-1,2-디데옥시-α-글루코피라노오스 (1.00 g, 3.04 mmol) 를 디클로로에탄 (10 ㎖) 에 용해하고, 실온에서 몰레큘러시브 4A (312 mg), 2-(4-니트로페닐)-에탄올 (2.54 g, 15.2 mmol), (+)-캄파술폰산 (0.78 g, 3.34 mmol) 을 첨가하고, 60 ℃ 에서 3 시간 교반했다. 반응 용액을 포화 탄산수소나트륨 수용액에 첨가하여, 유기물을 아세트산에틸로 추출했다. 유기층을 포화 식염수로 세정한 후, 무수 황산나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 증류 제거하여 미정제 생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (헥산：아세트산에틸 = 67：33 - 0：100, v/v) 로 정제하여, 목적물 1-6A 를 무색 고체 (1.51 g, 수율 65 ％) 로서 얻었다.
Figure pct00061
(1-6B) 아세트산[(2R,3S,4R,5R,6R)-5-아세트아미도-3,4-디아세톡시-6-[2-(4-아미노페닐)에톡시]테트라하이드로피란-2-일]메틸 (화합물 1-6B, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 52]
Figure pct00062
1-6A (982.0 mg, 1.98 mmol) 를 아세트산에틸 (12 ㎖) 과 에탄올 (12 ㎖) 에 용해하고, 10 ％ 팔라듐-탄소 (250 mg) 를 첨가하고, 수소 분위기하 실온에서 1.5 시간 교반했다. 셀라이트로 여과하고, 용매를 감압 증류 제거하여 목적물 1-6B 를 무색 고체 (758 mg, 수율 82 ％) 로서 얻었다.
Figure pct00063
(1-6C) 아세트산[(2R,3S,4R,5R,6R)-5-아세트아미도-3,4-디아세톡시-6-[2-[4-[(에톡시카르보닐아미노)카르바모일아미노]페닐]에톡시]테트라하이드로피란-2-일]메틸 (화합물 1-6C, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 53]
Figure pct00064
1-6B (568.0 mg, 1.22 mmol) 를 테트라하이드로푸란 (22 ㎖) 에 용해하고, 실온에서 트리에틸아민 (424 ㎕, 3.04 mmol) 을 첨가한 후, -10 ℃ 에서 클로로포름산4-니트로페닐 (441.8 mg, 2.19 mmol) 을 첨가하고, 실온에서 1.5 시간 교반했다. 실온에서 트리에틸아민 (424 ㎕, 3.04 mmol) 을 첨가한 후 카르바진산에틸 (228.2 mg, 2.19 mmol) 을 첨가하고, 실온에서 30 분 교반했다. 반응 용액을 물에 첨가하고, 유기물을 아세트산에틸로 2 회 추출했다. 유기층을 포화 식염수로 세정한 후, 무수 황산나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 증류 제거하여 미정제 생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (디클로로메탄：메탄올 = 100 : 0 - 90：10, v/v) 로 정제하여, 목적물 1-6C 를 무색 포상 물질 (650.4 mg, 수율 90 ％) 로서 얻었다.
Figure pct00065
(1-6D) N-[(2R,3S,4R,5R,6R)-3-아세트아미드2-[2-[4-(3,5-디옥소-1,2,4-트리아졸리딘-4-일)페닐]에톡시]-4,5-디하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로피란-3-일]아세트아미드 (화합물 1-6D, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 54]
Figure pct00066
1-6C (650.0 mg, 1.09 mmol) 를 메탄올 (30 ㎖) 에 용해하고, 실온에서 탄산칼륨 (451.8 mg, 3.27 mmol) 을 첨가하여 60 ℃ 에서 9.5 시간 교반했다.
실온으로 식힌 후, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하고, 동결 건조시켜 목적물 1-6D 를 무색 고체 (462.4 mg, 85 ％) 로서 얻었다.
Figure pct00067
＜실시예 1-7＞
(1-7A) 2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라하이드로피란-2-일]옥시에틸아민 (화합물 1-7A, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 55]
Figure pct00068
N-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-아세트아미도-4,5-디하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로피란-2-일]옥시에틸아지드 (500 mg, 1.72 mmol) 를 에탄올 (20 ㎖) 에 용해하고, 10 ％ 팔라듐-탄소 (200 mg) 를 첨가하여, 수소 분위기하 실온에서 3 시간 교반했다. 셀라이트로 여과하고, 용매를 감압 증류 제거하여 목적물 1-7A 를 무색 고체 (460 mg, 수율 quant) 로서 얻었다.
Figure pct00069
(1-7B) N-[2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-아세트아미도-4,5-디하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로피란-2-일]옥시에틸]-3-(2,5-디옥소피롤-1-일)프로판아미드 (화합물 1-7B, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 56]
Figure pct00070
1-7A (100 mg, 0.378 mmol) 를 N,N-디메틸포름아미드에 용해하고, 3-(2,5-디옥소피롤-1-일)프로판산2,5-디옥소피롤리딘-1-일 (0.126 mg, 0.473 mmol) 을 첨가하고, 실온에서 3 시간 교반했다. 반응액을 물로 묽게 하여, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하여, 목적물 1-7B 를 백색 고체 (93 mg, 수율 59 ％) 로서 얻었다.
Figure pct00071
＜실시예 1-8＞
(1-8A) 2-[[(2R)-2-[[2-[[(2R)-2-[[2-[[(2R)-2-[[2-[[(2R)-2-[[2-[[(2R)-2-아세트아미도-3-트리틸술파닐프로파노일]아미노]아세틸]아미노]-3-트리틸술파닐프로파노일]아미노]아세틸]아미노]-3-트리틸술파닐프로파노일]아미노]아세틸]아미노]-3-트리틸술파닐프로파노일]아미노]아세틸]아미노]-3-트리틸술파닐프로파노일]아미노]아세트산 (화합물 1-8A, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 57]
Figure pct00072
1.20 mmol/g 의 2-클로로트리틸클로라이드레진 (833 mg, 1.00 mmol) 을 고상 합성용의 칼럼에 넣고, 디클로로메탄 (7.5 ㎖) 을 첨가하여 10 분 진탕했다. 여과 후, 2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)아세트산 (594 mg, 2 mmol) 과 N,N-디이소프로필에틸아민 (0.86 ㎖, 5 mmol) 의 디클로로메탄 (7.5 ㎖) 용액을 첨가하고, 실온에서 2 시간 교반했다. 여과 후, 디클로로메탄 혼합 용액 (디클로로메탄：메탄올：N,N-디이소프로필에틸아민 = 85：10：5, v/v) 으로 3 회, 디클로로메탄으로 3 회, 디에틸에테르로 3 회 세정했다. 진공 펌프로 건조시켜, 레진 (1.83 g) 을 회수했다. 회수한 레진의 일부 (1.37 g) 를 고상 합성용의 칼럼에 넣었다. 20 ％ 피페리딘/N,N-디메틸포름아미드 용액 (20 ㎖) 을 첨가하여 5 분간 진탕하고, 반응액을 여과하는 조작을 4 회 실시했다. N,N-디메틸포름아미드로 4 회 세정하고, (2R)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-3-트리틸술파닐]프로판산 (1.32 g, 2,25 mmol) 과 HATU (856 mg, 2.25 mmol) 와 N,N-디이소프로필에틸아민 (582 ㎕, 4.50 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (15 ㎖) 을 첨가하여 실온에서 30 분 진탕했다. 여과 후, N,N-디메틸포름아미드로 4 회 세정했다. 20 ％ 피페리딘/N,N-디메틸포름아미드 용액 (20 ㎖) 을 첨가하여 5 분간 진탕하고, 반응액을 여과하는 조작을 4 회 실시했다. N,N-디메틸포름아미드로 4 회 세정하고, 2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)아세트산 (669 mg, 2.25 mmol) 과 HATU (856 mg, 2.25 mmol) 와 N,N-디이소프로필에틸아민 (582 ㎕, 4.50 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (15 ㎖) 을 첨가하여 실온에서 30 분 진탕했다. 여과 후, N,N-디메틸포름아미드로 4 회 세정했다. 20 ％ 피페리딘/N,N-디메틸포름아미드 용액 (20 ㎖) 을 첨가하여 5 분간 진탕하고, 반응액을 여과하는 조작을 4 회 실시했다. N,N-디메틸포름아미드로 4 회 세정하고, (2R)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-3-트리틸술파닐]프로판산 (1.32 g, 2,25 mmol) 과 HATU (856 mg, 2.25 mmol) 와 N,N-디이소프로필에틸아민 (582 ㎕, 4.50 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (15 ㎖) 을 첨가하여 실온에서 30 분 진탕했다. 여과 후, N,N-디메틸포름아미드로 4 회 세정했다. 20 ％ 피페리딘/N,N-디메틸포름아미드 용액 (20 ㎖) 을 첨가하여 5 분간 진탕하고, 반응액을 여과하는 조작을 4 회 실시했다. N,N-디메틸포름아미드로 4 회 세정하고, 2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)아세트산 (669 mg, 2.25 mmol) 과 HATU (856 mg, 2.25 mmol) 와 N,N-디이소프로필에틸아민 (582 ㎕, 4.50 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (15 ㎖) 을 첨가하여 실온에서 30 분 진탕했다. 여과 후, N,N-디메틸포름아미드로 4 회 세정했다. 20 ％ 피페리딘/N,N-디메틸포름아미드 용액 (20 ㎖) 을 첨가하여 5 분간 진탕하고, 반응액을 여과하는 조작을 4 회 실시했다. N,N-디메틸포름아미드로 4 회 세정하고, (2R)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-3-트리틸술파닐]프로판산 (1.32 g, 2,25 mmol) 과 HATU (856 mg, 2.25 mmol) 와 N,N-디이소프로필에틸아민 (582 ㎕, 4.50 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (15 ㎖) 을 첨가하여 실온에서 30 분 진탕했다. 여과 후, N,N-디메틸포름아미드로 4 회 세정했다. 20 ％ 피페리딘/N,N-디메틸포름아미드 용액 (20 ㎖) 을 첨가하여 5 분간 진탕하고, 반응액을 여과하는 조작을 4 회 실시했다. N,N-디메틸포름아미드로 4 회 세정하고, 2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)아세트산 (669 mg, 2.25 mmol) 과 HATU (856 mg, 2.25 mmol) 와 N,N-디이소프로필에틸아민 (582 ㎕, 4.50 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (15 ㎖) 을 첨가하여 실온에서 30 분 진탕했다. 여과 후, N,N-디메틸포름아미드로 4 회 세정했다. 20 ％ 피페리딘/N,N-디메틸포름아미드 용액 (20 ㎖) 을 첨가하여 5 분간 진탕하고, 반응액을 여과하는 조작을 4 회 실시했다. N,N-디메틸포름아미드로 4 회 세정하고, (2R)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-3-트리틸술파닐]프로판산 (1.32 g, 2.25 mmol) 과 HATU (856 mg, 2.25 mmol) 와 N,N-디이소프로필에틸아민 (582 ㎕, 4.50 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (15 ㎖) 을 첨가하여 실온에서 30 분 진탕했다. 여과 후, N,N-디메틸포름아미드로 4 회 세정했다. 20 ％ 피페리딘/N,N-디메틸포름아미드 용액 (20 ㎖) 을 첨가하여 5 분간 진탕하고, 반응액을 여과하는 조작을 4 회 실시했다. N,N-디메틸포름아미드로 4 회 세정하고, 2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)아세트산 (669 mg, 2.25 mmol) 과 HATU (856 mg, 2.25 mmol) 와 N,N-디이소프로필에틸아민 (582 ㎕, 4.50 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (15 ㎖) 을 첨가하여 실온에서 30 분 진탕했다. 여과 후, N,N-디메틸포름아미드로 4 회 세정했다. 20 ％ 피페리딘/N,N-디메틸포름아미드 용액 (20 ㎖) 을 첨가하여 5 분간 진탕하고, 반응액을 여과하는 조작을 4 회 실시했다. N,N-디메틸포름아미드로 4 회 세정하고, (2R)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-3-트리틸술파닐]프로판산 (1.32 g, 2,25 mmol) 과 HATU (856 mg, 2.25 mmol) 와 N,N-디이소프로필에틸아민 (582 ㎕, 4.50 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (15 ㎖) 을 첨가하여 실온에서 30 분 진탕했다. 여과 후, N,N-디메틸포름아미드로 4 회 세정했다. 20 ％ 피페리딘/N,N-디메틸포름아미드 용액 (20 ㎖) 을 첨가하여 5 분간 진탕하고, 반응액을 여과하는 조작을 4 회 실시했다. N,N-디메틸포름아미드로 4 회 세정하고, 디클로로메탄으로 4 회, 디에틸에테르로 4 회 세정했다. 진공 펌프로 건조시켜, 레진 (1.83 g) 을 회수했다. 회수한 레진의 일부 (360 mg) 를 고상 합성용의 칼럼에 넣었다. 아세트산 (27 mg, 0.45 mmol) 과 HATU (171 mg, 0.45 mmol) 와 N,N-디이소프로필에틸아민 (154 ㎕, 0.90 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (5 ㎖) 을 첨가하여 실온에서 30 분 진탕했다. 여과 후, 레진을 N,N-디메틸포름아미드로 4 회, 디클로로메탄으로 4 회 세정했다. 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올 (1 ㎖) 과 디클로로메탄 (3 ㎖) 의 혼합 용액을 첨가하고, 실온에서 1.5 시간 진탕했다. 여과하여 레진을 제거하고, 여과액을 감압하 농축했다. 디클로로메탄으로 3 회 공비하고, 진공 펌프로 건조시킴으로써, 목적물 1-8A 를 갈색 고체 (176 mg) 로서 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C122H114N10O12S5 : [M+Na]+ 2094, Found 2094.
＜실시예 1-9＞
(1-9A) 2-[[(2S)-2,6-비스(tert-부톡시카르보닐아미노)헥사노일]아미노]아세트산벤질 (화합물 1-9A, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 58]
Figure pct00073
(2S)-2,6-비스(tert-부톡시카르보닐아미노)헥산산 (1.70 g, 5.00 mmol), 2-아미노아세트산벤질 (1.00 g, 5.00 mmol) 및 HATU (2.90 g, 7.50 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (25 ㎖) 에, N,N-디이소프로필에틸아민 (2.60 ㎖, 15.0 mmol) 을 첨가하고, 실온에서 20 시간 교반했다. 반응 용액을 물에 첨가하고, 유기물을 아세트산에틸로 추출했다. 유기층을 포화 식염수로 세정한 후, 무수 황산나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 증류 제거하여 미정제 생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (헥산：아세트산에틸 = 90：10 - 0：100, v/v) 로 정제하여, 목적물 1-9A 를 담황색 유상물 (2.30 g, 수율 93 ％) 로서 얻었다.
Figure pct00074
(1-9B) 2-[[(2S)-2,6-비스(tert-부톡시카르보닐아미노)헥사노일]아미노]아세트산벤질 (물질 1-9B, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 59]
Figure pct00075
1-9A (250 mg, 0.507 mmol) 를 디클로로메탄 (3.0 ㎖) 에 용해하고, 트리플루오로아세트산 (1.0 ㎖) 을 첨가하여, 실온에서 1 시간 교반했다. 용매를 감압 증류 제거하여 목적물 1-9B 를 담황색 유상물 (247 mg, 수율 100 ％) 로서 얻었다.
Figure pct00076
(1-9C) 2-[[(2S)-2,6-비스[[2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-아세트아미도-4,5-디하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로피란-2-일]옥시아세틸]아미노]헥사노일]아미노]아세트산벤질 (화합물 1-9C, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 60]
Figure pct00077
1-9B (93.0 mg, 0.190 mmol) 및 1-2C (160 mg, 0.573 mmol) 를 사용하여, (1-5B) 와 동일한 방법에 따라, 목적물 1-9C 를 무색 포상 물질 (180 mg, 수율 88％) 로서 얻었다.
Figure pct00078
(1-9D) 2-[[(2S)-2,6-비스[[2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-아세트아미도-4,5-디하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로피란-2-일]옥시아세틸]아미노]헥사노일]아미노]아세트산 (화합물 1-9D, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 61]
Figure pct00079
1-9C (180 mg, 0.221 mmol) 를 메탄올 (50 ㎖) 에 용해하고, 10 ％ 팔라듐-탄소 (180 mg) 를 첨가하고, 수소 분위기하 실온에서 2 시간 교반했다. 셀라이트로 여과하고, 용매를 감압 증류 제거하여 목적물 1-9D 를 담황색 포상 물질 (160 mg, 수율 100 ％) 로서 얻었다.
MS (ESI) : Calcd for C28H48N5O17 : [M+H]+726, Found 726.
＜실시예 1-10＞
(1-10A) 2-[[(2R)-2-[[2-[[(2R)-2-[[2-[[(2R)-2-아세트아미도-3-술파닐프로파노일]아미노]아세틸]아미노]-3-술파닐프로파노일]아미노]아세틸]아미노]-3-술파닐프로파노일]아미노]아세트산 (화합물 1-10A, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 62]
Figure pct00080
1.20 mmol/g 의 2-클로로트리틸클로라이드레진 (208 mg, 0.25 mmol) 을 고상 합성용의 칼럼에 넣어, 디클로로메탄 (2.5 ㎖) 을 첨가하여 10 분 진탕했다. 여과 후, 2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)아세트산 (149 mg, 0.5 mmol) 과 N,N-디이소프로필에틸아민 (219 ㎕, 1.25 mmol) 의 디클로로메탄 (2.5 ㎖) 용액을 첨가하고, 실온에서 2 시간 교반했다. 여과 후, 디클로로메탄 혼합 용액 (디클로로메탄：메탄올：N,N-디이소프로필에틸아민 = 85：10：5, v/v) 으로 3 회, 디클로로메탄으로 3 회, N,N-디메틸포름아미드로 3 회 세정했다. 얻어진 레진을 Applied Biosystems 사 제조의 펩티드 합성기 433A Peptide Synthesizer 에 세트하고, 탈보호, 축합, 탈보호, 축합, 탈보호, 축합, 탈보호, 축합, 탈보호, 축합, 탈보호, 축합을 합성기로 실시함으로써, 펩티드 사슬을 신장했다. 탈보호에는 피페리딘과 N-methylpyrrolidone 을 사용하고, 축합 반응에는 HATU 와 N,N-디이소프로필에틸아민과 N-methylpyrrolidone 과 각종 카르복실산을 사용했다. 카르복실산은 (2R)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-3-트리틸술파닐]프로판산, 2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)아세트산, (2R)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-3-트리틸술파닐]프로판산, 2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)아세트산, (2R)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-3-트리틸술파닐]프로판산, 아세트산의 순서로 각 축합 반응에 사용했다. 얻어진 레진 (900 mg) 의 반량 (450 mg) 을 고상 합성용의 칼럼에 넣고, 트리플루오로아세트산 (2.64 ㎖) 과 물 (0.27 ㎖) 과 페놀 (0.06 g) 과 트리이소프로필실란 (0.03 ㎖) 의 혼합 용액을 첨가했다. 실온에서 2 시간 진탕하고, 트리플루오로아세트산을 증류 제거했다. 반응액을 물로 묽게 하여, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하여, 목적물 1-10A 를 백색 고체 (11 mg, 수율 16 ％) 로서 얻었다.
ESI-LC-MS : Calcd for C17H28N6O8S3 : [M+H]+ 541, Found 541.
(1-10B) 2-[[(2R)-2-[[2-[[(2R)-2-[[2-[[(2R)-2-아세트아미도-3-[1-[3-[2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-아세트아미도-4,5-디하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로피란-2-일]옥시에틸아미노]-3-옥소프로필]-2,5-디옥소피롤리딘-3-일]술파닐프로파노일]아미노]아세틸]아미노]-3-[1-[3-[2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-아세트아미도-4,5-디하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로피란-2-일]옥시에틸아미노]-3-옥소프로필]-2,5-디옥소피롤리딘-3-일]술파닐프로파노일]아미노]아세틸]아미노]-3-[1-[3-[2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-아세트아미도-4,5-디하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로피란-2-일]옥시에틸아미노]-3-옥소프로필]-2,5-디옥소피롤리딘-3-일]술파닐프로파노일]아미노]아세트산 (화합물 1-10B, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 63]
Figure pct00081
1-10B (11 mg, 0.0203 mmol) 와 1-7B (33 mg, 0.0794 mmol) 를 아세토니트릴 (1 ㎖) 과 0.2 M pH = 6.75 의 인산 버퍼 (1 ㎖) 의 혼합 용액에 녹여, 실온에서 2 시간 교반했다. 반응액을 물로 묽게 하여, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하여, 목적물 1-10B 를 백색 고체 (27 mg, 수율 74 ％) 로서 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C68H103N15O35S3 : [M-H]+ 1784, Found 1784.
＜실시예 1-11＞
(1-11A) N-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-아세트아미도-4,5-디하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로피란-2-일]옥시에틸아민 트리플루오로아세트산염 (화합물 1-11A, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 64]
Figure pct00082
1-7A (120 mg) 를 증류수 (6 ㎖) 에 용해시킨 후에, 트리플루오로아세트산 (48 ㎕) 첨가하여, 동결 건조시켰다. 얻어진 아모르퍼스상의 고체 1-11A 는 정제하지 않고 사용했다.
(1-11B) SG-NH2 (화합물 1-11B, 하기 식으로 이루어지는 화합물) 의 합성
[화학식 65]
Figure pct00083
시알릴글리코펩티드 (60 mg) 를 0.2 M 인산 완충 용액 (pH 6.25) (260 ㎕) 에 용해시킨 후에, Glycosynthase (Endo-M-N175Q, 토쿄 화성공업 (주), 1 U/㎖) 수용액 (100 ㎕) 을 첨가했다. 또한, 1-11A (28 mg) 의 0.2 M 인산 완충 용액 (pH 6.25) (160 ㎕) 을 첨가하고, 28 ℃ 에서 72 시간 반응시켰다. 반응액에, 0.2 ％ 트리플루오로아세트산 수용액 (2480 ㎕) 첨가하여 반응을 정지시키고, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하고, 동결 건조시켜 목적물 SG-NH2 (28.5 mg) 를 얻었다.
ESI-TOF-MS : Calcd for C86H143N7O62 : [M-H]- 2264.8, Found 2264.8
(1-11C) SG-I (화합물 1-11C, 하기 식으로 이루어지는 화합물) 의 합성
[화학식 66]
Figure pct00084
(1-11B) 에서 제조한 SG-NH2 (15.0 mg) 를 43 mM 탄산수소나트륨 수용액 (750 ㎕) 에, 빙랭하, 30 mM 요오도아세트산 N-하이드록시숙신이미드에스테르-아세톤 용액 (250 ㎕) 을 첨가하고, 실온에서 1 시간 교반했다. 반응액에, 아세트산 (1.8 ㎕) 을 첨가하여 반응을 정지시키고, 감압하, 유기 용매를 제거했다. 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하고, 동결 건조시켜 목적물 SG-I (13.4 mg) 를 얻었다.
ESI-TOF-MS : Calcd for C88H144IN7O63 : [M+2H]2+ 1218.5 (ave), Found 1218.3.
＜실시예 1-12＞
(1-12A) SG-Oxa (화합물 1-12A, 하기 식으로 이루어지는 화합물) 의 합성
[화학식 67]
Figure pct00085
디시알로옥타삿카리드 (토쿄 화성공업 (주), 26.0 mg, 12.8 μmol) 를 증류수 (210 ㎕) 에 용해하고, 실온에서 트리에틸아민 (80.7 ㎕, 579 μmol) 을 첨가했다. 0 ℃ 에서 2-클로로-1,3-디메틸이미다졸륨클로라이드 (32.6 mg, 192 μmol) 의 수용액 (52 ℓ) 을 첨가하고, 0 ℃ 에서 2 시간 교반했다. Sephadex G15 (0.03 ％ NH3 수용액) 로 정제하고, 0.1 N 수산화나트륨 수용액 (100 ㎕) 을 첨가하여 동결 건조시키고, 목적물 SG-Oxa 를 무색 고체 (24.6 mg, 95 ％) 로서 얻었다.
NMR (in D2O) (도 1 의 차트).
＜실시예 1-13＞
(1-13A) SG-M (화합물 1-13A, 하기 식으로 이루어지는 화합물) 의 합성
[화학식 68]
Figure pct00086
(1-11B) 에서 제조한 SG-NH2 (30.0 mg) 를 43 mM 탄산수소나트륨 수용액 (1500 ㎕) 에 용해시켜, 빙랭하, 13.9 mM 3-(2,5-디옥소피롤-1-일)부티르산N-하이드록시숙신이미드에스테르-아세톤 용액 (500 ㎕) 을 첨가하고, 실온에서 1 시간 교반했다. 반응액에, 아세트산 (3.6 ㎕) 을 첨가하여 반응을 정지시키고, 감압하, 유기 용매를 제거했다. 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하고, 동결 건조시켜 목적물 SG-M (29 mg) 을 얻었다.
ESI-TOF-MS : Calcd for C93H148N8O65 : [M+2H]2+ 1209.4, Found 1209.4.
＜실시예 1-14＞
(1-14A) 2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-아세트아미도-4,5-디하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로피란-2-일]옥시아세트산 암모늄염 (화합물 1-14A, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 69]
Figure pct00087
1-2C (200 mg) 를 증류수 (2 ㎖) 에 용해시킨 후에, 28-30 ％ 암모니아수 (100 ㎕) 첨가하여, 동결 건조시켰다. 얻어진 아모르퍼스상의 고체 1-14A 는 정제하지 않고 사용했다.
(1-14B) SG-A (화합물 1-14B, 하기 식으로 이루어지는 화합물) 의 합성
[화학식 70]
Figure pct00088
시알릴글리코펩티드 (58 mg) 를 0.2 M 인산 완충 용액 (pH 6.25) (254 ㎕) 에 용해시킨 후에, Glycosynthase (Endo-M-N175Q, 토쿄 화성공업 (주), 1 U/㎖) 수용액 (100 ㎕) 을 첨가했다. 또한, 1-14A (24 mg) 의 0.2 M 인산 완충 용액 (pH 6.25) (152 ㎕) 을 첨가하고, 28 ℃ 에서 72 시간 반응시켰다. 반응액에, 0.2 ％ 트리플루오로아세트산 수용액 (3000 ㎕) 첨가하여 반응을 정지시키고, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (시세이도, Proteonavi) 로 분리 정제를 실시하고, 동결 건조시켜 목적물 SG-A (19.5 mg) 를 얻었다.
ESI-TOF-MS : Calcd for C86H140N6O64 : [M＋2H]2+ 1142.0 (ave), Found 1141.4
＜실시예 1-15＞
(1-15A) (2S)-2-[3-(2,5-디옥소피롤-1-일)프로파노일아미노]펜탄디카르복실산디tert-부틸 (화합물 1-15A, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 71]
Figure pct00089
(2S)-2-아미노펜탄디카르복실산디tert-부틸 염산염 (295 mg, 1.00 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (5.0 ㎖) 을 0 ℃ 로 냉각시키고, N,N-디이소프로필에틸아민 (0.510 ㎖, 3.00 mmol) 및 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 3-(2,5-디옥소피롤-1-일)프로파노에이트 (293 mg, 1.10 mmol) 를 순차 첨가하여, 0 ℃ 에서 1 시간 교반하고, 다시 실온까지 승온하여, 실온에서 18 시간 교반했다. 반응 용액에 아세트산에틸을 첨가하고, 유기층을 1 M 염산 및 포화 식염수로 순차 세정한 후, 무수 황산나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 증류 제거하여 미정제 생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (헥산：아세트산에틸 = 95：5 - 0：100, v/v) 로 정제하여, 목적물 1-15A 를 담황색 유상물 (400 mg, 수율 98 ％) 로서 얻었다.
Figure pct00090
(1-15B) (2S)-2-[3-(2,5-디옥소피롤-1-일)프로파노일아미노]펜탄디카르복실산 (화합물 1-15B, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 72]
Figure pct00091
1-15A (400 mg, 0.976 mmol) 를 사용하여, (1-9B) 와 동일한 수법에 따라 목적물 1-15B (260 mg, 수율 89 ％) 를 얻었다.
MS (ESI) : Calcd for C12H15N2O7 : [M+H]+299, Found 299.
(1-15C) SG-(SG-Gln*)-Mal (화합물 1-15C, 하기 식으로 이루어지는 화합물) 의 합성
[화학식 73]
Figure pct00092
1-15B (30.0 mg, 0.101 mmol) 및 N-하이드록시숙신산이미드 (58.0 mg, 0.504 mmol) 의 디클로로메탄 용액 (0.400 ㎖) 을 0 ℃ 로 냉각시키고, 피리딘 (0.200 ㎖, 2.48 mmol) 및 트리플루오로아세트산 무수물 (70.0 ㎕, 0.500 mmol) 을 순차 첨가하고, 0 ℃ 에서 10 분간 교반했다. 실온까지 승온하고, 실온에서 다시 30 분간 교반했다. 반응 용액에 디클로로메탄을 첨가하고, 유기층을 1 M 염산으로 세정한 후, 무수 황산나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 증류 제거하여 미정제 생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (디클로로메탄：아세트산에틸 = 25：75 - 0：100, v/v) 로 정제하여, 담황색 포상 물질 (25 mg) 을 얻었다.
계속해서, 얻어진 생성물의 일부 (2.00 mg) 를 N,N-디메틸포름아미드 (200 ㎕) 에 용해하고, (1-11B) 에서 제조한 SG-NH2 (20.0 mg, 8.41 μmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (15 ㎕, 88.0 μmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (600 ㎕) 에 첨가하고, 실온에서 2 시간 교반했다. 반응 용액에 0.2 ％ 트리플루오로아세트산 수용액 (2.0 ㎖) 을 첨가하고, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하고, 동결 건조시켜 목적물 SG-(SG-Gln*)-Mal (15.0 mg, 수율 76 ％) 을 얻었다.
ESI-TOF-MS : Calcd for C184H299N16O129 : [M+3H]3+ 1599.7 (ave), Found 1599.6.
＜실시예 1-16＞
(1-16A) (2S)-2-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-디옥소피롤-1-일)프로파노일아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노일아미노]펜탄디카르복실산디tert-부틸 (화합물 1-16A, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 74]
Figure pct00093
(2S)-2-아미노펜탄디카르복실산디tert-부틸염산염 (58.0 mg, 0.196 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (1.0 ㎖) 을 0 ℃ 로 냉각시키고, N,N-디이소프로필에틸아민 (0.100 ㎖, 0.588 mmol) 및 3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-디옥소피롤-1-일)프로파노일아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산(2,5-디옥소피롤리딘-1-일) (100 mg, 0.195 mmol) 을 순차 첨가하고, 0 ℃ 에서 1 시간 교반하고, 다시 실온까지 승온하여, 실온에서 20 시간 교반했다. 반응 용액에 아세트산에틸을 첨가하고, 유기층을 1 M 염산 및 포화 식염수로 순차 세정한 후, 무수 황산나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 증류 제거하여 미정제 생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (디클로로메탄：메탄올 = 98：2 - 90：10, v/v) 로 정제하여, 목적물 1-16A 를 담황색 유상물 (100 mg, 수율 78 ％) 로서 얻었다.
Figure pct00094
(1-16B) (2S)-2-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-디옥소피롤-1-일)프로파노일아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노일아미노]펜탄디온산 (화합물 1-16B, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 75]
Figure pct00095
1-16 (100 mg, 0.152 mmol) 을 사용하여, (1-9B) 와 동일한 수법에 따라 목적물 1-16B (83 mg, 수율 100 ％) 를 얻었다.
MS (ESI) : Calcd for C23H36N3O12 : [M+H]+546, Found 546.
(1-16C) SG-(SG-Gln*)-PEG(3)-Mal (화합물 1-16C, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 76]
Figure pct00096
1-16B (32.0 mg, 58.7 μmol) 및 N-하이드록시숙신산이미드 (34.0 mg, 0.295 mmol) 의 디클로로메탄 용액 (0.400 ㎖) 을 0 ℃ 로 냉각시키고, 피리딘 (0.200 ㎖, 2.48 mmol) 및 트리플루오로아세트산 무수물 (42.0 ㎕, 0.300 mmol) 을 순차 첨가하고, 0 ℃ 에서 30 분간 교반했다. 실온까지 승온하고, 실온에서 다시 2 시간 교반했다. 반응 용액에 디클로로메탄을 첨가하고, 유기층을 1 M 염산으로 세정한 후, 무수 황산나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 증류 제거하여 미정제 생성물 (35 mg) 을 얻었다.
계속해서, 얻어진 미정제 생성물의 일부 (0.31 mg) 를 N,N-디메틸포름아미드 (20 ㎕) 에 용해하고, (1-11B) 에서 제조한 SG-NH2 (2.0 mg, 0.88 μmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (1.5 ㎕, 8.8 μmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (30 ㎕) 에 첨가하고, 실온에서 18 시간 교반했다. 반응 용액에 0.2 ％ 트리플루오로아세트산 수용액 (2.0 ㎖) 을 첨가하고, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하고, 동결 건조시켜 목적물 SG-(SG-Gln*)-PEG(3)-Mal (0.60 mg, 수율 28 ％) 을 얻었다.
ESI-TOF-MS : Calcd for C195H320N17O134 : [M+3H]3+ 1682.2 (ave), Found 1682.2.
＜실시예 1-17＞
(1-17A) AG(9)-P (화합물 1-17A, 하기 식의 화합물 1) 의 합성
[화학식 77]
Figure pct00097
시알릴글리코펩티드 (200 mg) 를 0.2 M 아세트산 완충액 (pH 5.0) (1000 ㎕) 에 용해시킨 후에, 뉴라미니다아제 ([E.C.3.2.1.18], 나카라이테스크, 1 U/㎖) 수용액 (1000 ㎕) 을 첨가하고, 37 ℃ 에서 17 시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 0.2 ％ 트리플루오로아세트산 수용액 (2000 ㎕) 을 첨가했다. 이 반응을 2 로트분 통합하여, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하고, 동결 건조시켜 목적물 AG(9)-P (307 mg) 를 얻었다.
ESI-TOF-MS : Calcd for C90H155N13O54 : [M＋2H]2+ 1142.6 (ave), Found 1142.0
(1-17B) AG(7)-P (화합물 1-17B, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 78]
Figure pct00098
(1-17A) 에서 제조한 AG(9)-P (100 mg), 황산마그네슘 (0.48 mg), β-D-갈락토시다아제 (WAKO, 600 U/mg) (2 mg) 를 0.2 M 인산 완충액 (pH 7.0) (2000 ㎕) 에 용해시키고, 37 ℃ 에서 24 시간 반응시켰다. β-D-갈락토시다아제 (WAKO, 600 U/mg) (1 mg) 를 첨가하고, 다시 24 시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 0.2 ％ 트리플루오로아세트산 수용액 (2000 ㎕) 을 첨가했다. 이 반응을 2 로트분 통합하여, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하고, 동결 건조시켜 목적물 AG(7)-P (158 mg) 를 얻었다.
ESI-TOF-MS : Calcd for [M＋H]+ C78H135N13O441959.0 (ave), Found 1958.9
(1-17C) AG(5)-P (화합물 1-17C, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 79]
Figure pct00099
(1-17B) 에서 제조한 AG(7)-P (100 mg) 를 0.2 M 인산 완충액 (pH 6.25) (3150 ㎕) 에 용해시키고, 100 × BSA (New England Bio Labs) (43 ㎕), β-N-아세틸글루코사미니다아제 (New England Bio Labs, 4000 U/㎖) (100 ㎕) 를 첨가하고, 37 ℃ 에서 20 시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 0.2 ％ 트리플루오로아세트산 수용액 (1000 ㎕) 을 첨가했다. 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하고, 동결 건조시켜 목적물 AG(5)-P (73.8 mg) 를 얻었다.
ESI-TOF-MS : Calcd for [M＋2H]2+ C62H109N11O34777.3 (ave), Found 777.3.
＜실시예 1-18＞
(1-18A) SG-N3 (화합물 1-18A, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 80]
Figure pct00100
시알릴글리코펩티드 (76 mg) 를 0.2 M 인산 완충 용액 (pH 6.25) (330 ㎕) 에 용해시킨 후에, Glycosynthase (Endo-M-N175Q, 토쿄 화성공업, 1 U/㎖) 수용액 (100 ㎕) 을 첨가했다. 또한, N-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-아세트아미도-4,5-디하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로피란-2-일]옥시에틸아지드 (23 mg) 의 0.2 M 인산 완충 용액 (pH 6.25) (230 ㎕) 을 첨가하고, 28 ℃ 에서 96 시간 반응시켰다. 반응액에, 0.2 ％ 트리플루오로아세트산 수용액 (3000 ㎕) 첨가하여 반응을 정지시키고, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (시세이도, Proteonavi) 로 분리 정제를 실시하고, 동결 건조시켜 목적물을 주성분으로서 함유하는 고체를 얻었다. 계속해서, 얻어진 고체를 증류수 (3000 ㎕) 에 용해시키고, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하고, 동결 건조시켜 목적물 SG-N3 (34.4 mg) 을 얻었다.
ESI-TOF-MS : Calcd for C86H141N9O62 : [M＋2H]2+ 1147.5, Found 1147.4.
＜실시예 1-19＞
(1-19A) tert-부틸N-[2-[2-[2-[2-[3-[2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-아세트아미도-4,5-디하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로피란-2-일]옥시에틸아미노]-3-옥소-프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에틸]카르바메이트 (화합물 1-19A, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 81]
Figure pct00101
3-[2-[2-[2-[2-(tert-부톡시카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산 (100 mg, 0.274 mmol) 및 1-7A (110 mg, 0.291 mmol) 를 사용하여, (1-9A) 와 동일한 방법에 따라, 목적물 1-19A 를 담황색 포상 물질 (150 mg, 수율 90 ％) 로서 얻었다.
MS (ESI) : Calcd for C26H49N3O13 : [M+H]+ 612, Found 612.
(1-19B) N-[2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-아세트아미도-4,5-디하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로피란-2-일]옥시에틸]-3-[2-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]프로파나미드 (화합물 1-19B, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 82]
Figure pct00102
1-19A (150 mg, 0.245 mmol) 를 디클로로메탄 (2.0 ㎖) 에 용해하고, 트리플루오로아세트산 (2.0 ㎖) 을 첨가하고, 실온에서 2 시간 교반했다. 용매를 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하고, 동결 건조시켜 목적물 1-19B (70 mg, 55 ％) 를 무색 유상 물질로서 얻었다.
MS (ESI) : Calcd for C21H41N3O11 : [M+H]+512, Found 512.
＜실시예 1-20＞
(1-20A) 3-[2-[2-[2-[2-[[(2S)-2,6-비스(tert-부톡시카르보닐아미노)헥사노일]아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산 (화합물 1-20A, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 83]
Figure pct00103
(2S)-2,6-비스(tert-부톡시카르보닐아미노)헥산산 (210 mg, 607 μmol) 및 HATU (220 mg, 579 μmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (2.0 ㎖) 에, N,N-디이소프로필에틸아민 (0.410 ㎖, 2.41 mmol) 을 첨가하고, 실온에서 2 분간 교반했다. 얻어진 반응 용액을, (1-5A) 의 수법에 따라 제조한 3-[2-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]프로판산 (150 mg, 497 μmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (0.260 ㎖, 1.53 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (0.50 ㎖) 에 첨가하고, 실온에서 2 시간 교반했다. 용매를 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하고, 동결 건조시켜 목적물 1-20A (240 mg, 80 ％) 를 담황색 유상 물질로서 얻었다.
MS (ESI) : Calcd for C27H52N3O11 : [M+H]+594, Found 594.
＜실시예 1-21＞
(1-21A) 2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-아미노-3-tert-부톡시-프로파노일]아미노]아세틸]아미노]-3-tert-부톡시-프로파노일]아미노]아세틸]아미노]-3-tert-부톡시-프로파노일]아미노]아세트산 (화합물 1-21A, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 84]
Figure pct00104
1.20 mmol/g 의 2-클로로트리틸클로라이드레진 (166 mg, 0.200 mmol) 을 고상 합성용의 칼럼에 넣고, 디클로로메탄 (3 ㎖) 을 첨가하여 10 분 진탕했다. 여과 후, 2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)아세트산 (119 mg, 0.400 mmol) 과 N,N-디이소프로필에틸아민 (171 ㎕, 1.00 mmol) 의 디클로로메탄 (3 ㎖) 용액을 첨가하고, 실온에서 2 시간 교반했다. 여과 후, 디클로로메탄 혼합 용액 (디클로로메탄：메탄올：N,N-디이소프로필에틸아민 = 85：10：5, v/v) 으로 3 회, 디클로로메탄으로 3 회, N,N-디메틸포름아미드로 3 회 세정했다. 얻어진 레진을 Applied Biosystems 사 제조의 펩티드 합성기 433A Peptide Synthesizer 에 세트하고, 탈보호, 축합, 탈보호, 축합, 탈보호, 축합, 탈보호, 축합, 탈보호, 축합, 탈보호를 합성기로 실시함으로써, 펩티드 사슬을 신장했다. 탈보호에는 피페리딘과 N-methylpyrrolidone 을 사용하고, 축합 반응에는 HATU 와 N,N-디이소프로필에틸아민과 N-methylpyrrolidone 과 각종 카르복실산을 사용했다. 카르복실산은 (2S)-3-tert-부톡시-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)프로판산, 2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)아세트산, (2S)-3-tert-부톡시-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)프로판산, 2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)아세트산, (2S)-3-tert-부톡시-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)프로판산의 순서로 각 축합 반응에 사용했다. 얻어진 레진을 고상 합성용의 칼럼에 넣고, 헥사플루오로이소프로판올 (1 ㎖) 과 디클로로메탄 (3 ㎖) 의 혼합 용액을 첨가하고, 실온에서 2 시간 진탕했다. 여과하여 레진을 제거하고, 얻어진 여과액을 감압하 농축했다. 디클로로메탄으로 6 회 공비하여 진공 펌프로 건조시킴으로써, 목적물 1-21A 를 백색 고체 (120 mg, 수율 97 ％) 로서 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C27H50N6O10 : [M+H]+619.4, Found 619.4.
(1-21B) 2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-[[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-아세트아미도-4,5-디하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로피란-2-일]아미노]-2-[[2-[[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-아세트아미도-4,5-디하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로피란-2-일]아미노]아세틸]아미노]-4-옥소부타노일]아미노]-3-tert-부톡시-프로파노일]아미노]아세틸]아미노]-3-tert-부톡시-프로파노일]아미노]아세틸]아미노]-3-tert-부톡시-프로파노일]아미노]아세트산 (화합물 1-21B, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 85]
Figure pct00105
J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, 284-290. 의 수법에 따라 제조한 (2S)-4-[[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-아세트아미도-4,5-디하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로피란-2-일]아미노]-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4-옥소부탄산 (84.5 mg, 0.194 mmol) 과 HATU (73.8 mg, 0.194 mmol) 를 N,N-디메틸포름아미드 (5 ㎖) 에 용해하고, N,N-디이소프로필에틸아민 (66 ㎕, 0.388 mmol) 을 첨가하여, 실온에서 3 분 교반했다. 이 용액을 1-21A (100 mg, 0.162 mmol) 에 첨가하여 실온에서 0.5 시간 교반했다. 반응액을 물로 묽게 하여, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시했다. 얻어진 화합물에 트리플루오로아세트산 (0.1 ㎖) 과 물 (0.9 ㎖) 의 혼합 용액을 첨가하여, 철야 교반했다. 반응액을 물로 묽게 하여, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하고, 중간체를 백색 고체 (14.7 mg, 10 ％) 로서 얻었다.
1-2C (5.91 mg, 0.0212 mmol) 와 HATU (8.04 mg, 0.0212 mmol) 를 N,N-디메틸포름아미드 (1 ㎖) 에 용해하고, N,N-디이소프로필에틸아민 (9.05 ㎕, 0.0529 mmol) 을 첨가하고, 실온에서 3 분 교반했다. 이 용액을, 얻어진 중간체 (16.5 mg, 0.0176 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 (1 ㎖) 용액에 첨가하고, 실온에서 0.5 시간 교반했다. 반응액을 물로 묽게 하여, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하고, 목적물 1-21B 를 백색 고체 (14.0 mg, 수율 66 ％) 로서 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C49H85N11O23 : [M+H]+1197.6, Found 1197.5.
＜실시예 1-22＞
(1-22A) (2S)-2,6-비스[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-디옥소피롤-1-일)프로파노일아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노일아미노]헥산산 (화합물 1-22A, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 86]
Figure pct00106
리신 (26.0 mg, 0.178 mmol) 을 0.10 M 인산 버퍼 (pH 7.0) (0.40 ㎖) 에 용해하고, 3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-디옥소피롤-1-일)프로파노일아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산(2,5-디옥소피롤리딘-1-일) (200 mg, 0.390 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (0.40 ㎖) 을 첨가하고, 실온에서 3 시간 교반했다. 반응 용액에 0.2 ％ 트리플루오로아세트산 수용액 (2.0 ㎖) 을 첨가하고, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하고, 동결 건조시켜 표기 목적 화합물 1-22A (106 mg, 수율 63 ％) 를 얻었다.
MS (ESI) : Calcd for C42H65N6O18 : [M-H]-941, Found 941.
(1-22B) SG-Lys*-[PEG(3)-Mal]2 (화합물 1-22B, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 87]
Figure pct00107
상기와 같이 제조한 화합물 1-22A (10.0 mg, 10.6 μmol), (1-11B) 에서 제조한 SG-NH2 (19.4 mg, 8.13 μmol) 및 HATU (4.00 mg, 10.6 μmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (1.0 ㎖) 에, N,N-디이소프로필에틸아민 (8.80 ㎕, 51.7 μmol) 을 첨가하고, 실온에서 1 시간 교반했다. 반응 용액을 0.5 ％ 트리플루오로아세트산 수용액 (6.0 ㎖) 에 첨가하고, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하고, 동결 건조시켜 표기 목적 화합물 SG-Lys*-[PEG(3)-Mal]2 (10.0 mg, 수율 25 ％) 를 얻었다.
ESI-TOF-MS : Calcd for C128H205N13O79 : [M-2H]2- 1595.0 (ave), Found 1595.0.
＜실시예 1-23＞
(1-23A) (2S)-2,6-비스[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-디옥소피롤-1-일)프로파노일아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노일아미노]헥산산 (화합물 1-23A, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 88]
Figure pct00108
리신 (7.70 mg, 52.7 μmol) 및 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일)3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-디옥소피롤-1-일)프로파노일아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노에이트 (100 mg, 115 μmol) 를 사용하여, (1-22A) 와 동일한 방법에 따라, 표기 목적 화합물 1-23A 를 무색 유상물 (36.0 mg, 수율 41 ％) 로서 얻었다.
MS (ESI) : Calcd for C74H129N6O34 : [M-H]-1645, Found 1645.
(1-23B) SG-Lys*-[PEG(11)-Mal]2 (화합물 1-23B, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 89]
Figure pct00109
화합물 1-23A (19.0 mg, 11.5 μmol) 및 (1-11B) 에서 제조한 SG-NH2 (25.0 mg, 10.5 μmol) 를 사용하여, (1-22B) 와 동일한 방법에 따라, 표기 목적 화합물 SG-Lys*-[PEG(11)-Mal]2 를 무색 유상물 (14.0 mg, 수율 34 ％) 로서 얻었다.
ESI-TOF-MS : Calcd for C180H269N13O95 : [M-2H]2- 1947.4 (ave), Found 1947.3.
＜실시예 1-24＞
(1-24A)
2-[[2-[(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-트리아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라하이드로피란-2-일]옥시아세트산]아미노]아세트산벤질 (화합물 1-24A, 하기 식의 반응 산물) 의 합성
[화학식 90]
Figure pct00110
이미 알려진 화합물인 2-[[2-[(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-트리아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라하이드로피란-2-일]옥시아세트산 (Tetrahedron Asymmetry, 2008, 19, 1919-1933) (670 mg) 을 DMF (6 ㎖) 에 용해시키고, HATU (630 mg) 와 DIPEA (0.57 ㎖) 를 첨가하고, 실온에서 4 분 교반 후, 글리신벤질에스테르염산염 (370 mg) 을 첨가하고, 실온에서 1 시간 교반했다. 반응액을 아세트산에틸로 묽게 하고, 10 ％ 식염수로 2 회, 1 N 염산으로 1 회 세정했다. 무수 황산나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 증류 제거하여 미정제 생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (헥산：아세트산에틸 = 60：40 - 20：80, v/v) 로 정제하여, 목적 화합물 1-24A (840 mg, 수율 62 ％) 를 아모르퍼스로서 얻었다.
Figure pct00111
(1-24B) 2-[[2-[(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-트리아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라하이드로피란-2-일]옥시아세트산]아미노]아세트산 (화합물 1-24B, 하기 식의 반응 산물) 의 합성
[화학식 91]
Figure pct00112
화합물 1-24A (840 mg) 를 사용하여, (1-2B) 와 동일한 수법의 수법에 따라, 목적 화합물 1-24B (700 mg, 수율 quant) 를 아모르퍼스로서 얻었다.
Figure pct00113
(1-24C) 2-[[2-[(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-트리하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로피란-2-일]옥시아세트산]아미노]아세트산 (화합물 1-24C, 하기 식의 반응 산물) 의 합성
[화학식 92]
Figure pct00114
화합물 1-24B (450 mg) 를 사용하여, (1-2C) 와 동일한 수법의 수법에 따라, 목적 화합물 1-24C (286 mg, 수율 quant) 를 아모르퍼스로서 얻었다.
그대로 다음의 반응에 사용했다.
Figure pct00115
(1-24D) 2-[[2-[(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-트리하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로피란-2-일]옥시아세트산]아미노]아세트산암모늄염 (화합물 1-24D, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 93]
Figure pct00116
화합물 1-24C (286 mg) 를 사용하여, (1-14A) 와 동일한 수법의 수법에 따라, 목적 화합물 1-24D (325 mg) 를 아모르퍼스로서 얻었다. 정제하지 않고 사용했다.
(1-24E) SG(Glc)-Gly-A (화합물 1-24E, 하기 식으로 이루어지는 화합물, 화합물 1-24E) 의 합성
[화학식 94]
Figure pct00117
시알릴글리코펩티드 (191 mg) 를 0.2 M 인산 완충 용액 (pH 6.25) (1000 ㎕) 에 용해시킨 후에, Glycosynthase (Endo-M-N175Q, 토쿄 화성공업 (주), 1 U/㎖) 수용액 (300 ㎕) 을 첨가했다. 또한, 1-24D (125 mg) 의 0.2 M 인산 완충 용액 (pH 6.25) (370 ㎕) 을 첨가하고, 28 ℃ 에서 72 시간 반응시켰다. 반응액에, 0.2 ％ 트리플루오로아세트산 수용액 (3000 ㎕) 첨가하여 반응을 정지시키고, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (Inertsil ODS-3, GL 사이언스) 로 분리 정제를 실시하고, 동결 건조시켜 목적물 SG(Glc)-Gly-A (88 mg) 를 얻었다.
ESI-TOF-MS : Calcd for C86H140N6O65 : [M+4H]4+ 1149.4 (ave), Found 1149.4
또, 실시예 1-24 의 반응을 참고로 하여, 화합물 1-24D 의 당 구조를, Glc 이외의 당 (예를 들어, Man, Gal 등으로 치환한 화합물을 합성할 수 있고, 이들을 피전이 화합물로서 채용하여, (1-24E) 와 동일한 당 전이 반응을 실시함으로써, SG(Man)-Gly, SG(Gal)-Gly 등의 환원 말단 개변 당 사슬을 합성할 수 있다.
또한, 실시예 1-11, 1-12, 1-13 및 1-14 의 방법에 있어서, 실시예 1-24 의 반응을 참고로 출발 물질 (피전이 화합물) 의 당 구조를 적절히, 원하는 것으로 변환하여 사용함으로써, SG-NH2, SG-I, SG-oxa, SG-A 등에 있어서의 환원 말단 개변 당 사슬을 적절히 합성할 수 있다.
［실시예 2］
이하에 있어서, 구조식 중에서, 단순히 「hANP」 라고 표기되는 경우, 수식 펩티드 중의 hANP 펩티드가 hANP(1-28) 인 것을 나타낸다.
＜실시예 2-1＞ SG-hANP(1-28) (화합물 2-1) 의 합성
(2-1A) hANP-TFA 염 (트리플루오로아세트산염) 의 조제
이하의 반응에, 사용하는 hANP-TFA 염은, 하기의 순서에 따라, 조제했다.
조제법 1
카르페리티드아세트산염 (hANP(1-28)아세트산염) (100 mg) 을 증류수 (4000 ㎕) 에 용해시키고, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하고, 동결 건조시켜 목적물 (89.6 mg) 을 얻었다.
조제법 2
카르페리티드아세트산염 (hANP(1-28)아세트산염) (250 mg) 을 증류수 (30 ㎖) 에 용해시키고, 트리플루오로아세트산 (600 ㎕) 첨가하고, 동결 건조시켜, 더 이상 정제하지 않고 그대로 사용했다.
(2-1B) SG-hANP(1-28) (하기 식의 화합물, 화합물 2-1) 의 합성
[화학식 95]
Figure pct00118
(2-1B-1 SG-hANP(1-28) (화합물 2-1) TFA 염의 합성
(1-14B) 에서 합성한 SG-A (97.7 mg) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (1000 ㎕) 에, HATU (16.3 mg) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (1000 ㎕) 을 첨가한 후에, 디이소프로필에틸아민 (30 ㎕) 을 첨가하고, 실온에서 5 분 교반하여, 신속하게 다음의 반응에 사용했다.
(2-1A) 의 순서에 따라 조제한 hANP-TFA 염 (100 mg) 을 N,N-디메틸포름아미드 (1200 ㎕), 증류수 (320 ㎕) 에 용해시켜, 디이소프로필에틸아민 (22.5 ㎕) 첨가했다. 이 용액에 대해, 사전에 조제한 활성 에스테르를 함유하는 N,N-디메틸포름아미드 용액 (2000 ㎕) 을 첨가하고, 1 시간 교반했다. 반응 종료 후, 빙랭하, 0.2 ％ 트리플루오로아세트산 수용액 (20 ㎖) 에 첨가했다. 아세트산 (2 ㎖) 을 첨가하고, 불용물을 용해시켜, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하고, 동결 건조시켜 목적물 SG-hANP(1-28) (화합물 2-1)-TFA 염 (91.0 mg) 을 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C213H341N51O102S3 : [M+H]+ 5342.2, Found 5342.2
(2-1B-2) SG-hANP(1-28) (화합물 2-1) 아세트산염의 합성
(1-14B) 에서 합성한 SG-A (790 mg) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (18 ㎖) 에, TSTU (O-(N-숙신이미딜)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄테트라플루오로보레이트) (104 mg) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (2 ㎖) 을 첨가한 후에, 디이소프로필에틸아민 (241 ㎕) 을 첨가하고, 실온에서 60 분 교반하여, 다음의 반응에 사용했다.
카르페리티드아세트산염 (hANP(1-28)아세트산염) (1000 mg) 을 N,N-디메틸포름아미드 (12 ㎖), 증류수 (3.2 ㎖) 에 용해시켜, 디이소프로필에틸아민 (241 ㎕) 첨가했다. 이 용액에 대해, 사전에 조제한 활성 에스테르를 함유하는 N,N-디메틸포름아미드 용액 (20 ㎖) 을 첨가하고, 1 시간 교반했다. 반응 종료 후, 아세토니트릴 (32 ㎖) 을 첨가하고, 침전물을 여과 채취했다. N,N-디메틸포름아미드/아세토니트릴 (1/1) (30 ㎖), 및 아세토니트릴 (100 ㎖) 로 세정 후, 얻어진 고형물을 감압 건조시켰다. 이 고형물을 증류수에 용해시켜, 0.1 ％ 아세트산 수용액과 0.1 ％ 아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하고, 동결 건조시켜 목적물 SG-hANP(1-28) (화합물 2-1)-아세트산염 (1056 mg) 을 얻었다.
ESI-TOF-MS : Calcd for C213H341N51O102S3 : [M+4H]4+ 1337.1 (ave), Found 1337.0
이와 같이, 출발 물질로서 사용하는 hANP 펩티드의 염의 종류에 따라, 목적물인 수식 펩티드도 대응하는 염으로서 합성된다. 이하의 실시예에서는, 특별히 지정이 있는 경우를 제외하고, hANP 펩티드로서는 TFA 염을 채용하여 목적물인 수식 펩티드는 TFA 염으로서 얻어지고 있고, 이 경우 염의 종류는 특별히 명시하지 않는다. 또한, (2-1B-2) 에 준하여 합성함으로써, 모든 목적물을 아세트산염으로서 합성할 수 있다.
＜실시예 2-2＞ hANP(1-28)-SG (화합물 2-2) 의 합성
(2-2A) Boc-hANP(1-28) (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 96]
Figure pct00119
hANP(1-28)-아세트산염 (62.5 mg) 을 증류수 (1.3 ㎖) 에 용해하고, 실온에서 이탄산디-t-부틸 (0.9 mg, 324.6 μmol) 의 t-부틸알코올 용액 (400 ㎕) 을 후, 트리에틸아민 (13.6 ㎕) 의 수용액 (200 ㎕) 을 첨가하고, 실온에서 3 시간 교반했다. 증류수 (6 ㎖), 아세토니트릴 (2 ㎖), 아세트산 (1 ㎖) 을 첨가하여 불용물을 용해시키고, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하고, 동결 건조시켜 목적물 Boc-hANP(1-28) (59.9 mg) 을 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C132H211N45O41S3 : [M+H]+ 3179.5, Found 3179.7
(2-2B) Boc-hANP(1-28)-GlcNAc (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 97]
Figure pct00120
(2-2A) 에서 제조한 Boc-hANP(1-28) (59.9 mg) 과 화합물 1-7A (59.7 mg) 를 증류수 (0.2 ㎖) 에 용해하고, 실온에서 HATU (35.8 mg) 의 디메틸포름아미드 용액 (2.0 ㎖) 과 트리에틸아민 (15.8 ㎕) 을 첨가하고, 실온에서 2 시간 교반했다. 빙랭한 트리플루오로아세트산 (8.7 ㎕) 의 수용액 (5 ㎖) 에 반응액을 첨가하고, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하고, 동결 건조시켜 목적물 Boc-hANP(1-28)-GlcNAc (38.7 mg) 를 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C142H229N47O46S3 : [M+H]+ 3425.6, Found 3426.0
(2-2C) hANP(1-28)-GlcNAc (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 98]
Figure pct00121
(2-2B) 에서 제조한 Boc-hANP(1-28)-GlcNAc (38.7 mg) 를 20 ％ 트리플루오로아세트산 수용액 (5 ㎖) 과 아세트산 (1 ㎖) 에 용해하고, 실온에서 7 시간 정치했다. 증류수 (10 ㎖) 를 첨가하여 동결 건조시켰다. 조정제물을 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하고, 동결 건조시켜 목적물 hANP(1-28)-GlcNAc (21.8 mg) 를 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C137H221N47O44S3 : [M+H]+ 3325.6, Found 3425.5
(2-2D) hNAP(1-28)-SG (하기 식의 화합물, 화합물 2-2) 의 합성
[화학식 99]
Figure pct00122
(1-12A) 에서 제조한 SG-Oxa 의 0.2 M 인산 완충 용액 (60 mM, 120 ㎕) 에, 실온에서 Glycosynthase (Endo-M-N175Q, 토쿄 화성공업 (주), 1 U/㎖, 48 ㎕) 를 첨가한 후, 실온에서 (2-2C) 에서 제조한 hANP(1-28)-GlcNAc (6.0 mg, 1.8 μmol) 의 디메틸술폭시드 용액 (72 ㎕) 을 2 회로 나누어 15 분 간격으로 첨가하고, 25 ℃ 에서 2 시간 진탕했다. 실온에서 0.2 ％ 트리플루오로아세트산 수용액 (1.5 ㎖) 을 첨가하여 반응을 정지시키고, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하고, 동결 건조시켜 목적물 hNAP(1-28)-SG (화합물 2-2) (6.2 mg) 를 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C213H334N52O100S3 : [M+H]+ 5327.3, Found 5326.7.
＜실시예 2-3＞ (SG-)Asn-hANP(1-28) (화합물 2-3) 의 합성
(2-3A) Boc-(GlcNAc-)Asn-hANP(1-28) (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 100]
Figure pct00123
J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, 284-290 의 기재에 준하여 합성한 (2S)-4-[[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-아세트아미드4,5-디하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로피란-2-일]아미노]-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4-옥소부탄산 (42.4 mg, 0.0976 mmol) 과 (2-1A) 의 조정법 2 의 방법으로 hANP(1-28)-아세트산염 (31.3 mg) 으로부터 조정한 hANP(1-28)-TFA 염을 사용하여, (2-1B) 와 동일한 수법에 따라 목적물 Boc-(GlcNAc-)Asn-hANP(1-28) (13.0 mg) 을 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C144H230N48O48S3 : [M+H]+ 3495.6, Found 3496.5
(2-3B) (GlcNAc-)Asn-hANP(1-28) (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 101]
Figure pct00124
(2-3A) 에서 제조한 Boc-(GlcNAc-)Asn-hANP(1-28) (13.0 mg) 로부터 (2-2C) 와 동일한 수법에 따라, 목적물 (GlcNAc-)Asn-hANP(1-28) (5.83 mg) 을 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C139H222N48O46S3 : [M+H]+ 3396.6, Found 3396.6
(2-3C) (SG-)Asn-hANP(1-28) (하기 식의 화합물, 화합물 2-3) 의 합성
[화학식 102]
Figure pct00125
(2-3B) 에서 제조한 (GlcNAc-)Asn-hANP(1-28) (4.90 mg) 로부터 (2-2D) 와 동일한 수법에 따라 목적물 (GlcNAc-)Asn-hANP(1-28) (화합물 2-3) (2.17 mg) 을 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C215H345N53O102S3 : [M+H]+ 5398.3, Found 5398.4.
＜실시예 2-4＞ (SG-)Asn-hANP(2-28) (화합물 2-4) 의 합성
(2-4A) hANP(2-28) 의 조제
hANP(1-28)-아세트산염 (100 mg) 을 1.5 ％ 디메틸알릴아민-60 ％ 피리딘-38.5 ％ 물의 혼합 용액 (10.4 ㎖) 에 녹여, 실온에서 페닐이소티오시아네이트 (1.04 ㎖) 를 첨가하고, 50 ℃ 에서 30 분 교반했다. 실온까지 냉각시켜, 물, 아세트산을 첨가했다. 벤젠으로 3 회 세정하고, 수층을 동결 건조시켰다. 트리플루오로아세트산 (2.6 ㎖) 을 첨가하고, 50 ℃ 에서 30 분 교반한 후, 트리플루오로아세트산을 증류 제거했다. 물, 아세트산을 첨가하고, 벤젠으로 3 회 세정하여, 수층을 동결 건조시켰다. 물, 아세트산에 녹여, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하고, 목적물 ANP(2-28) 을 백색 고체 (50 mg) 로서 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C124H198N44O37S3 : [M+H]+ 2992.4, Found 2992.0
(2-4B) Boc-(GlcNAc-)Asn-hANP(2-28) (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 103]
Figure pct00126
hANP(1-28) 대신에 (2-4A) 에서 제조한 hANP(2-28) (25.0 mg) 을 사용하여 (2-3A) 와 동일한 수법에 따라, 목적물 Boc-(GlcNAc-)Asn-hANP(2-28) (13.0 mg) 을 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C141H225N47O46S3 : [M+H]+ 3409.6, Found 3409.5
(2-4C) (GlcNAc-)Asn-hANP(2-28) (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 104]
Figure pct00127
(2-4B) 에서 제조한 Boc-(GlcNAc-)Asn-hANP(2-28) (13.0 mg) 로부터 (2-2C) 와 동일한 수법에 따라, 목적물 (GlcNAc-)Asn-hANP(2-28) (6.86 mg) 을 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C136H217N47O44S3 : [M+H]+ 3309.5, Found 3309.5
(2-4D) (SG-)Asn-hANP(2-28) (하기 식의 화합물, 화합물 2-4) 의 합성
[화학식 105]
Figure pct00128
(2-4C) 에서 제조한 (GlcNAc-)Asn-hANP(2-28) (5.75 mg) 로부터 (2-2D) 와 동일한 수법에 따라 목적물 (SG-)Asn-hANP(2-28) (화합물 2-4) (3.80 mg) 를 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C212H340N52O100S3 : [M+H]+ 5313.4 (ave), Found 5314.7.
＜실시예 2-5＞ (SG-)Ser-hANP(2-28) (화합물 2-5) 의 합성
(2-5A) Boc-(GlcNAc-)Ser-hANP(2-28) (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 106]
Figure pct00129
화합물 1-1D (40.8 mg) 와 (2-4A) 에서 제조한 hANP(2-28) (25.0 mg) 을 사용하여, (2-3A) 와 동일한 수법에 따라, 목적물 Boc-(GlcNAc-)Ser-hANP(2-28) (13.0 mg) 을 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C140H224N46O46S3 : [M+H]+ 3382.6, Found 3382.7
(2-5B) (GlcNAc-)Ser-hANP(2-28) (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 107]
Figure pct00130
(2-5A) 에서 제조한 Boc-(GlcNAc-)Ser-hANP(2-28) (13.0 mg) 을 사용하여 (2-2C) 와 동일한 수법에 따라 Boc 를 제거하고, 목적물 (GlcNAc-)Ser-hANP(2-28) (6.36 mg) 을 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C135H216N46O44S3 : [M+H]+ 3282.5, Found 3282.6
(2-5C) (SG-Ser)-hANP(2-28) (하기 식의 화합물, 화합물 2-5) 의 합성
[화학식 108]
Figure pct00131
(2-5B) 에서 제조한 (GlcNAc-)Ser-hANP(2-28) (5.47 mg) 을 사용하여 (2-2D) 와 동일한 수법에 따라 목적물 (SG-)Ser-hANP(2-28) (화합물 2-5) (4.40 mg) 를 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C211H339N51O100S3 : [M+H]+ 5284.2, Found 5284.4.
＜실시예 2-6＞ hANP(1-27)-(SG-)Tyr (화합물 2-6) 의 합성
(2-6A) hANP(1-27)-(GlcNAc-)Tyr (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 109]
Figure pct00132
화합물 1-6D (30.6 mg) 를 디메틸포름아미드 (200 ㎕) 에 용해하고, 0 ℃ 에서 N-브로모숙시이미드 (11.5 mg) 와 피리딘 (5.2 ㎕) 의 디메틸포름아미드 용액 (125 ㎕) 을 첨가하여 5 분 교반했다.
hANP(1-28)-아세트산염 (50.0 mg) 을 0.1 M 인산 완충액 (pH 7.0, 1 ㎖) 에 용해하고, 0 ℃ 에서 먼저 조제한 트리아졸디온 유도체의 디메틸포름아미드 용액 (325 ㎕) 을 첨가했다. 실온에서 5 시간 정치 후, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하고, 동결 건조시켜 목적물 hANP(1-27)-(GlcNAc-)Tyr (9.8 mg) 을 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C145H225N49O47S3 : [M+H]+ 3501.6, Found 3501.6
(2-6B) hANP(1-27)-(SG-)Tyr (하기 식의 화합물, 화합물 2-6) 의 합성
[화학식 110]
Figure pct00133
(2-6A) 에서 제조한 hANP(1-27)-(GlcNAc-)Tyr (8.3 mg) 을 사용하여 (2-2D) 와 동일한 수법에 따라 목적물 hANP(1-27)-(SG-)Tyr (화합물 2-6) (6.3 mg) 을 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C221H348N54O103S3 : [M+H]+ 5503.3, Found 5502.8.
＜실시예 2-7＞ SG-hANP(1-28)-SG (화합물 2-7) 의 합성
(2-7A)GlcNAc-hANP(1-28) (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 111]
Figure pct00134
화합물 1-2C (25.0 mg) 를 디메틸포름아미드 (0.5 ㎖) 에 용해하고, 실온에서 트리에틸아민 (34 ㎖) 을 첨가하고 빙랭하, 디메틸티오포스피노일클로라이드 (12.0 mg) 의 디메틸포름아미드 용액 (0.5 ㎖) 을 첨가한 후, 실온에서 1 시간 교반했다. 한편, hANP(1-28)-아세트산염 (25 mg) 을 디메틸포름아미드 (1 ㎖), 증류수 (0.32 ㎖) 에 용해하고, 실온에서 트리에틸아민 (25.3 ㎕) 을 첨가하고, 빙랭하, 먼저 조제한 활성 에스테르의 디메틸포름아미드 용액 (433 ㎕) 을 첨가하고, 실온에서 2 시간 교반했다. 빙랭한 0.5 ％ 트리플루오로아세트산 수용액 (5 ㎖) 에 반응액을 첨가하고, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하고, 동결 건조시켜 목적물 GlcNAc-hANP(1-28) (17.8 mg) 을 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C137H218N46O46S3 : [M+H]+ 3340.5, Found 3340.5
(2-7B) GlcNAc-hANP(1-28)-GlcNAc (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 112]
Figure pct00135
(2-7A) 에서 제조한 GlcNAc-hANP(1-28) (30.0 mg) 및 화합물 1-7A 를 사용하여, (2-2B) 와 동일한 수법에 따라, hANP 의 C 말단에 GlcNAc 를 연결시켜, 목적물 GlcNAc-hANP(1-28)-GlcNAc (10.0 mg) 를 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C147H236N48O51S3 : [M+H]+ 3586.7, Found 3586.7
(2-7C) SG-hANP(1-28)-SG (하기 식의 화합물, 화합물 2-7) 의 합성
[화학식 113]
Figure pct00136
(2-7B) 에서 제조한 GlcNAc-hANP(1-28)-GlcNAc (6.0 mg) 를 사용하여 (2-2D) 와 동일한 수법에 따라 목적물 SG-hANP(1-28)-SG (화합물 2-7) (13.0 mg) 을 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C299H482N58O163S3 : [M+H]+ 7590.0, Found 7589.0.
＜실시예 2-8＞ (SG-)Asn-hANP(3-28) (화합물 2-8) 의 합성
(2-8A) (GlcNAc-)Asn-hANP (3-28) (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 114]
Figure pct00137
(2-4A) 에서 제조한 hANP(2-28) (32.0 mg) 을 재차 (2-4A) 의 방법으로 N 말단의 아미노산을 제거하여 hANP(3-28) 을 얻었다. 얻어진 hANP(3-28) 을 hANP(2-28) 대신에 사용하여, 실시예 2-4 와 동일한 수법에 따라, 목적물 (GlcNAc-)Asn-hANP(3-28) (3.5 mg) 을 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C130H206N46O43S3 : [M+H]+ 3196.5, Found 3196.7
(2-8B) (SG-)Asn-hANP(3-28) (하기 식의 화합물, 화합물 2-8) 의 합성
[화학식 115]
Figure pct00138
(2-8A) 에서 제조한 GlcNAc-Asn-hANP(3-28) (3.5 mg) 을 사용하여 (2-2D) 와 동일한 수법에 따라 목적물 (SG-)Asn-hANP(3-28) (화합물 2-8) ((2.5 mg) 을 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C206H329N51O99S3 : [M+H]+ 5198.1, Found 5198.3.
＜실시예 2-9＞ SG-(SG-)Asn-hANP(1-28) (화합물 2-9) 의 합성
(2-9A) GlcNAc-(GlcNAc-)Asn-hANP(1-28) (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 116]
Figure pct00139
(2-3B) 에서 제조한 (GlcNAc-)Asn-hANP(1-28) (16.0 mg) 을 사용하여 (1-5B) 와 동일한 수법에 따라, Asp 의 아미노기에 GlcNAc 를 연결시켜, 목적물 GlcNAc-(GlcNAc-)Asn-hANP(1-28) (6.15 mg) 을 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C149H237N49O53S3 : [M+H]+ 3657.7, Found 3658.1
(2-9B) SG-(SG-)Asn-hANP(1-28) (하기 식의 화합물, 화합물 2-9) 의 합성
[화학식 117]
Figure pct00140
(1-12A) 에서 제조한 SG-Oxa 의 0.2 M 인산 완충 용액 (60 mM, 168 ㎕), Glycosynthase (Endo-M-N175Q, 토쿄 화성공업 (주), 1 U/㎖, 67 ㎕), (2-9A) 에서 제조한 GlcNAc-(GlcNAc-)Asn-hANP(1-28) (6.15 mg) 을 사용하여, 2-2D 와 동일한 수법으로 목적물 SG-(SG-)Asn-hANP(1-28) (화합물 2-9) (6.7 mg) 를 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C301H483N59O165S3 : [M+H]+ 7661.0, Found 7660.7.
＜실시예 2-10＞ AG(9)-hANP(1-28) (화합물 2-10) 의 합성
(2-10A) AG(9)-hANP(1-28) (하기 식의 화합물, 화합물 2-10) 의 합성
[화학식 118]
Figure pct00141
(2-1B) 에서 합성한 SG-hANP(1-28) (21 mg) 을 0.2 M 아세트산 완충액 (pH 5.0) (1000 ㎕) 에 용해시킨 후에, 뉴라미니다아제 ([E.C.3.2.1.18], 나카라이테스크, 1 U/㎖) 수용액 (1000 ㎕) 을 첨가하고, 37 도에서 17 시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 0.2 ％ 트리플루오로아세트산 수용액 (2000 ㎕) 을 첨가했다. 아세트산 (200 ㎕) 을 첨가하고, 불용물을 용해시켰다. 이 반응을 2 로트분 통합하여, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하고, 동결 건조시켜 목적물 AG(9)-hANP(1-28) (화합물 2-10) (33.8 mg) 을 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C191H307N49O86S3 : [M+H]+ 4760.0, Found 4760.4.
＜실시예 2-11＞ AG(7)-hANP(1-28) 의 합성
(2-11A) AG(7)-hANP(1-28) (하기 식의 화합물, 화합물 2-11) 의 합성
[화학식 119]
Figure pct00142
(2-10A) 에서 합성한 AG(9)-hANP(1-28) (16 mg) 을 증류수 (1425 ㎕) 에 용해시킨 후에, 0.2 M 인산 완충액 (pH 6.25) (1500 ㎕), β1-4 갈락토시다아제 (NEW ENGLAND BioLabs, 8000 U/㎖) 수용액 (75 ㎕) 을 첨가하고, 37 도에서 24 시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 0.2 ％ 트리플루오로아세트산 수용액 (3000 ㎕) 을 첨가했다. 아세트산 (300 ㎕) 을 첨가하고, 불용물을 용해시켜, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하고, 동결 건조시켜 목적물 AG(7)-hANP(1-28) (화합물 2-11) (11.7 mg) 을 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C179H287N49O76S3 : [M+H]+ 4435.9, Found 4435.8.
＜실시예 2-12＞ SG-triazole-hANP(1-28) (화합물 2-12) 의 합성
(2-12A) Pentynoyl-hANP(1-28) (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 120]
Figure pct00143
hANP(1-28)-아세트산염 (50.0 mg) 및 4-펜틴산 (10.0 mg, 101 μmol) 을 사용하여, (2-7A) 와 동일한 방법에 따라, 목적물 Pentynoyl-hANP(1-28) (26.0 mg) 을 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C132H207N45O40S3 : [M]+ 3158.4, Found 3158.0.
(2-12B) GlcNAC-triazole-hANP(1-28) (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 121]
Figure pct00144
(2-12A) 에서 제조한 Pentynoyl-hANP(1-28) (22.0 mg) 에, 30 mM N-[(2R,3R,4R,5S,6R)-2-(2-아지드에톡시)-4,5-디하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로피란-3-일]아세트아미드 수용액 (0.37 ㎖, 11.1 μmol), 30 mM 아스코르브산나트륨 수용액 (0.26 ㎖, 7.8 μmol), 10 mM 황산구리 수용액 (0.15 ㎖, 1.5 μmol) 및 0.1 M 인산 버퍼 (pH 7.0) 를 순차 첨가하고, 실온에서 4 시간 교반했다. 반응 용액에 0.2 ％ 트리플루오로아세트산 수용액 (12 ㎖) 을 첨가하고, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하고, 동결 건조시켜 목적물 GlcNAc-triazole-hANP(1-28) (15.0 mg) 을 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C142H225N49O46S3 : [M+H]+ 3449.6, Found 3449.6.
(2-12C) SG-triazole-hANP(1-28) (하기 식의 화합물, 화합물 2-12) 의 합성
[화학식 122]
Figure pct00145
(2-12B) 에서 제조한 GlcNAc-triazole-hANP(1-28) (8.0 mg) 을 사용하여, (2-2D) 와 동일한 수법에 따라 목적물 SG-triazole-hANP(1-28) (화합물 2-12) (9.3 mg) 를 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C218H348N54O102S3 : [M+H]+ 5451.3, Found 5451.1.
＜실시예 2-13＞ SG-(SG-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28) (화합물 2-13) 의 합성
(2-13A) GlcNAc-(GlcNAc-Asn)-PEG(3)-hANP(1-28) (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 123]
Figure pct00146
화합물 1-5B (9 mg) 와 (2-1A) 의 조정법 2 의 방법으로 조정한 hANP-TFA 염 (16.6 mg) 으로부터, (2-1B) 와 동일한 수법에 따라, 목적물 GlcNAc-(GlcNAc-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28) (12.0 mg) 을 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C160H258N50O58S3 : [M+H]+ 3904.8, Found 3904.5
(2-13B) SG-(SG-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28) (하기 식의 화합물, 화합물 2-13) 의 합성
[화학식 124]
Figure pct00147
(2-13A) 에서 제조한 GlcNAc-(GlcNAc-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28) (6.00 mg) 을 사용하여, (2-9B) 와 동일한 수법에 따라, 목적물 SG-(SG-) Asn-PEG(3)-hANP(1-28) (화합물 2-13) (6.40 mg) 을 얻었다.
ESI-TOF-MS : Calcd for C312H504N60O170S3 : [M+4H]4+ 1979.0 (ave), Found 1978.5.
＜실시예 2-14＞ SG-(SG-)Lys-Gly-hANP(1-28) (화합물 2-14) 의 합성
(2-14A) GlcNAc-(GlcNAc-) Lys-Gly-hANP(1-28) (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 125]
Figure pct00148
hANP(1-28)-아세트산염 (50.0 mg) 및 화합물 1-9D (29.0 mg, 40.0 μmol) 를 사용하여, (2-7A) 와 동일한 방법에 따라, 목적물 GlcNAc-(GlcNAc-)Lys-Gly-hANP(1-28) (14.9 mg) 을 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C155H249N50O55S3 : [M+H]+ 3786.7, Found 3786.8.
(2-14B) SG-(SG-)Lys-Gly-hANP(1-28) (하기 식의 화합물, 화합물 2-14) 의 합성
[화학식 126]
Figure pct00149
(2-14A) 에서 제조한 GlcNAc-(GlcNAc-)Lys-Gly-hANP(1-28) (6.0 mg) 을 사용하여, (2-2D) 와 동일한 수법에 따라 목적물 SG-(SG-)Lys-Gly-hANP(1-28) (화합물 2-14) (7.6 mg) 를 얻었다.
ESI-TOF-MS : Calcd for C307H498N60O167S3 : [M+4H]4+ 1949.4 (ave), Found 1949.2.
＜실시예 2-15＞ [(SG-)Cys-Gly]3-hANP(1-28) (화합물 2-15) 의 합성
(2-15A) [(GlcNAc-)Cys-Gly]3-hANP(1-28) (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 127]
Figure pct00150
화합물 1-10B (27 mg) 를 사용하여, (2-1B) 와 동일한 수법에 따라, 목적물 [(GlcNAc-)Cys-Gly]3-hANP(1-28) (18.4 mg) 을 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C195H304N60O73S6 : [M+H]+ 4847.0, Found 4847.2
(2-15B) [(SG-)Cys-Gly]3-hANP(1-28) (하기 식의 화합물, 화합물 2-15) 의 합성
[화학식 128]
Figure pct00151
(1-12A) 에서 제조한 SG-Oxa 의 0.2 M 인산 완충 용액 (60 mM, 118 ㎕) 에, Glycosynthase (Endo-M-N175Q, 토쿄 화성공업 (주), 1 U/㎖, 47 ㎕), (2-15A) 에서 제조한 [e 를 사용하여, 2-2D 와 동일한 수법으로 목적물 [(SG-)Cys-Gly3-hANP(1-28) (화합물 2-15) (5.23 mg) 를 얻었다.
ESI-TOF-MS : Calcd for C423H673N75O241S6 : [M+5H]5+ 2172.5 (ave), Found 2172.4.
＜실시예 2-16＞ SG-PEG(3)-(SG-)Asn-hANP(1-28) (화합물 2-16) 의 합성
(2-16A) GlcNAc-PEG(3)-(GlcNAc-)Asn-hANP(1-28) (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 129]
Figure pct00152
(2-3B) 에서 제조한 (GlcNAc-)Asn-hANP (19.0 mg) 와 화합물 1-3A (8.8 mg) 로부터 (2-7A) 와 동일한 수법에 따라, 목적물 GlcNAc-PEG(3)-(GlcNAc-)Asn-hANP(1-28) (9.10 mg) 을 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C160H258N50O58S3 : [M+H]+ 3904.8, Found 3904.4
(2-16B) SG-PEG(3)-(SG-)Asn-hANP(1-28) (하기 식의 화합물, 화합물 2-16) 의 합성
[화학식 130]
Figure pct00153
실온에서 (2-16A) 에서 제조한 GlcNAc-PEG(3)-(GlcNAc-)Asn-hANP(1-28) (3.50 mg) 을 사용하여, (2-9B) 와 동일한 수법에 따라, 목적물 SG-PEG(3)-(SG-)Asn-hANP(1-28) (화합물 2-16) (3.10 mg) 을 얻었다.
ESI-TOF-MS : Calcd for C312H504N60O170S3 : [M+4H]4+ 1978.1 (ave), Found 1978.8.
＜실시예 2-17＞ [(SG-)Cys-Gly]5-hANP(1-28) (화합물 2-17) 의 합성
(2-17A) [Cys-Gly]5-hANP(1-28) (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 131]
Figure pct00154
화합물 1-8A (50.6 mg) 와 (2-1A) 의 조정법 2 의 방법으로 hANP-아세트산염 (47.0 mg) 으로부터 조정한 hANP-TFA 염으로부터, (2-1B) 와 동일한 수법에 따라 중간체 (13.0 mg) 를 얻었다.
얻어진 중간체 (13.0 mg) 에, 트리플루오로아세트산 (1.9 ㎖) 과 물 (0.05 ㎖) 과 트리이소프로필실란 (0.05 ㎖) 의 혼합 용액을 첨가했다. 실온에서 1 시간 진탕했다. 반응액을 물로 묽게 하여, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하고, 목적물 [Cys-Gly]5-hANP(1-28) 을 백색 고체 (3.2 mg) 로서 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C154H245N55O50S8 : [M+H]+ 3921.6, Found 3921.9
(2-17B) (SG-)Cys-Gly))5-hANP(1-28)[(SG-)Cys-Gly]5-hANP(1-28) (하기 식의 화합물, 화합물 2-17) 의 합성
[화학식 132]
Figure pct00155
(2-17A) 에서 제조한 [Cys-Gly]5-hANP(1-28) (3.00 mg) 과 (1-13A) 에서 제조한 SG-M (9.94 mg) 을 아세토니트릴 (0.25 ㎖) 과 0.2 M pH = 6.75 의 인산 버퍼 (0.25 ㎖) 의 혼합 용액에 녹여, 실온에서 2 시간 교반했다. 반응액을 물로 묽게 하여, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하고, 목적물 [(SG-)Cys-Gly]5-hANP(1-28) (화합물 2-17) (8.19 mg) 을 얻었다.
ESI-TOF-MS : Calcd for C619H985N95O375S8 : [M+6H]6+ 2670.1 (ave), Found 2670.1.
＜실시예 2-18＞ [(SG2-)(Cys-Gly]5-hANP(1-28) (화합물 2-18) 의 합성
(2-18A) tert-부틸N-[(1R)-1-(프로프-2-이닐카르바모일)부츠-3-이닐]카르바메이트 (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 133]
Figure pct00156
(2R)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4-펜틴산 (430 mg, 2.02 mmol) 및 프로파르길아민 (140 mg, 2.54 mmol) 을 사용하여, (1-9A) 와 동일한 방법에 따라, 목적물을 담황색 고체 (480 mg, 수율 96 ％) 로서 얻었다.
MS (ESI) : Calcd for C13H19N2O3 : [M+H]+ 251, Found 251.
(2-18B) (2R)-2-아미노-N-프로피-2-닐-펜츠-4-이나미드 트리플루오로아세트산염 (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 134]
Figure pct00157
(2-18A) 에서 얻은 목적물 (250 mg, 1.00 mmol) 을 사용하여, (1-9B) 와 동일한 방법에 따라, 목적물을 담황색 유상물 (270 mg, 수율 100 ％) 로서 얻었다.
Figure pct00158
(2-18C) (2R)-2-[3-(2,5-디옥소피롤-1-일)프로파노일아미노]-N-프로프-2-이닐-펜츠-4-이나미드 (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 135]
Figure pct00159
(2-18B) 에서 얻은 목적물 (270 mg, 1.00 mmol) 을 사용하여, (1-15A) 와 동일한 방법에 따라, 목적물을 담황색 고체 (220 mg, 수율 73 ％) 로서 얻었다.
MS (ESI) : Calcd for C15H14N3O4 : [M-H]-300, Found 300.
(2-18D) [(SG2-)Cys-Gly]5-hANP(1-28) (하기 식의 화합물, 화합물 2-18) 의 합성
[화학식 136]
Figure pct00160
(1-18A) 에서 제조한 SG-N3 (20.0 mg, 8.73μmol) 을 0.10 M 인산 버퍼 (pH 8.0) (0.840 ㎖) 에 용해하고, (2-18C) 에서 얻은 목적물의 3.3 mM tert-부탄올 용액 (1.06 ㎖, 3.50 μmol), 50 mM 아스코르브산나트륨 수용액 (0.420 ㎖, 21.0 μmol), 및 10 mM 황산구리 수용액 (0.420 ㎖, 4.20 μmol) 을 순차 첨가하고, 실온에서 1 시간 30 분 교반했다. 반응 용액에 0.2 ％ 트리플루오로아세트산 수용액 (12 ㎖) 을 첨가하고, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (SHISEIDO, Proteonavi) 로 분리 정제를 실시하고, 동결 건조시켜 중간체 (6.20 mg, 36 ％) 를 얻었다.
(2-17A) 에서 제조한 (Cys-Gly)5-hANP(1-28) (1.76 mg) 과 합성한 중간체 (10.3 mg) 로부터, (2-17B) 와 동일한 수법에 따라 목적물 [(SG2-)Cys-Gly]5-hANP(1-28) (화합물 2-18) (8.42 mg) 을 얻었다.
ESI-TOF-MS : Calcd for C1089H1730N160O690S8 : [M-10H]10- 2835.1 (ave), Found 2834.9.
＜실시예 2-19＞ SG-(SG-)Lys-[SG-(SG-)Lys-]Lys-PEG(3)-hANP(1-28) (화합물 2-19)) 의 합성
(2-19A) TrS-(TrS-)Lys-[TrS-(TrS-)Lys-]Lys-PEG(3) (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 137]
Figure pct00161
1.20 mmol/g 의 2-클로로트리틸클로라이드레진 (250 mg, 0.300 mmol) 을 고상 합성용의 칼럼에 넣고, 디클로로메탄 (5 ㎖) 을 첨가하여 10 분 진탕했다. 여과 후, 3-[2[2[2[2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로피온산 (175 mg, 0.360 mmol) 과 N,N-디이소프로필에틸아민 (257 ㎕, 1.50 mmol) 의 디클로로메탄 (5 ㎖) 용액을 첨가하고, 실온에서 2 시간 교반했다. 여과 후, 디클로로메탄 혼합 용액 (디클로로메탄：메탄올：N,N-디이소프로필에틸아민 = 85：10：5, v/v) 으로 3 회, 디클로로메탄으로 3 회, N,N-디메틸포름아미드로 3 회 세정했다. 20 ％ 피페리딘/N,N-디메틸포름아미드 용액 (10 ㎖) 을 첨가하여 5 분 진탕 후 여과하는 조작을 4 회 실시했다. 레진을 N,N-디메틸포름아미드로 4 회 세정했다. 레진에 (2S)-2,6-비스(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)헥산산 (532 mg, 0.900 mmol) 과 HATU (342 mg, 0.900 mmol) 와 N,N-디이소프로필에틸아민 (308 ㎕, 1.80 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (10 ㎖) 을 첨가하여 실온에서 30 분 진탕했다. 여과 후 레진을 N,N-디메틸포름아미드로 3 회 세정했다. 20 ％ 피페리딘/N,N-디메틸포름아미드 용액 (10 ㎖) 을 첨가하여 5 분 진탕 후 여과하는 조작을 4 회 실시했다. 레진을 N,N-디메틸포름아미드로 4 회 세정했다. 레진에 (2S)-2,6-비스(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)헥산산 (1060 mg, 1.80 mmol) 과 HATU (684 mg, 1.80 mmol) 와 N,N-디이소프로필에틸아민 (616 ㎕, 3.60 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (10 ㎖) 을 첨가하여 실온에서 1 시간 진탕했다. 여과 후 레진을 N,N-디메틸포름아미드로 4 회 세정했다. 20 ％ 피페리딘/N,N-디메틸포름아미드 용액 (10 ㎖) 을 첨가하여 5 분 진탕 후 여과하는 조작을 5 회 실시했다. 레진을 N,N-디메틸포름아미드로 4 회 세정했다. 얻어진 레진의 1/3 량 (0.100 mmol 상당) 을 고상 합성용의 칼럼에 넣고, 3-트리틸술파닐프로피온산 (418 mg, 1.20 mmol) 과 HATU (456 mg, 1.20 mmol) 와 N,N-디이소프로필에틸아민 (411 ㎕, 2.40 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (10 ㎖) 을 첨가하여 실온에서 1 시간 진탕했다. 여과 후, 다시 3-트리틸술파닐프로피온산 (418 mg, 1.20 mmol) 과 HATU (456 mg, 1.20 mmol) 와 N,N-디이소프로필에틸아민 (411 ㎕, 2.40 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (10 ㎖) 을 첨가하여 실온에서 1 시간 진탕했다. 여과 후 레진을 N,N-디메틸포름아미드로 4 회, 디클로로메탄으로 3 회 세정했다. 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올 (2.5 ㎖) 과 디클로로메탄 (7.5 ㎖) 의 혼합 용액을 첨가하고, 실온에서 1.5 시간 진탕했다. 여과하여 레진을 제거하고, 여과액을 감압하 농축했다. 디클로로메탄으로 6 회 공비하고, 진공 펌프로 건조시킴으로써, 목적물 TrS-(TrS-)Lys-[TrS-(TrS-)Lys-]Lys-PEG(3) 을 갈색 고체 (170 mg) 로서 얻었다.
(2-19B) HS-(HS-)Lys[HS-(HS-)Lys-]Lys-PEG(3)-hANP(1-28) (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 138]
Figure pct00162
(2-19A) 에서 제조한 (66.1 mg) 으로부터, (2-17A) 와 동일한 수법에 따라, 중간체 (40 mg) 를 얻었다.
얻어진 중간체 (7.0 mg) 로부터, (2-17A) 와 동일한 수법에 따라, 목적물 HS-(HS-)Lys[HS-(HS-)Lys-]Lys-PEG(3)-hANP(1-28) (2.3 mg) 을 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C168H276N52O51S7 : [M+H]+ 4062.9, Found 4062.8
(2-19C) SG-(SG-)Lys-[SG-(SG-)-Lys-]Lys-PEG(3)-hANP(1-28) (하기 식의 화합물, 화합물 2-19) 의 합성
[화학식 139]
Figure pct00163
(2-19B) 의 수법으로 제조한 S4-Lys3-PEG3-hANP(1-28) (2.90 mg) 로부터, (2-17B) 와 동일한 수법에 따라, 목적물 [SG-(SG-)Lys-[SG-(SG-)-Lys-]Lys-PEG(3)-hANP(1-28) (화합물 2-19) (5.31 mg) 를 얻었다.
ESI-TOF-MS : Calcd for C540H868N84O311S7 : [M+7H]7+ 1963.4 (ave), Found 1963.4.
＜실시예 2-20＞ [SG2-(SG2-)Lys-[SG2-(SG2-)-Lys-]Lys-PEG(3)-hANP(1-28) (화합물 2-20) 의 합성
(2-20A) SG2-(SG2-)Lys-[SG2-(SG2-)-Lys-]Lys-PEG(3)-hANP(1-28) (하기 식의 화합물, 화합물 2-20) 의 합성
[화학식 140]
Figure pct00164
(2-19B) 에서 제조한 HS(HS-)-Lys-[HS-(HS-)Lys-]Lys-PEG(3)-hANP(1-28) (2.20 mg) 과 (1-15C) 에서 제조한 SG-(SG-)Gln*-Mal (12.1 mg) 로부터, (2-17B) 와 동일한 수법에 따라 목적물 SG2-(SG2-)Lys-[SG2-(SG2-)-Lys-]Lys-PEG(3)-hANP(1-28) (화합물 2-20) (4.79 mg) 을 얻었다.
ESI-TOF-MS : Calcd for C904H1460N116O567S7 : [M+8H]8+ 2907.3 (ave), Found 2907.
＜실시예 2-21＞ AG(9)-(AG(9)-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28) (화합물 2-21) 의 합성
(2-21A) AG(9)-(AG(9)-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28) (하기 식의 화합물, 화합물 2-21) 의 합성
[화학식 141]
Figure pct00165
(2-13B) 에서 합성한 SG-(SG-Asn)-PEG-hANP(1-28) (16 mg) 을 사용하여, (2-10A) 와 동일한 수법에 따라 목적물 AG(9)-(AG(9)-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28) (화합물 2-21) (8.2 mg) 을 얻었다.
ESI-TOF-MS : Calcd for C268H436N56O138S3 : [M+4H]4+ 1687.7, Found 1687.4.
＜실시예 2-22＞ AG(7)-(AG(7)-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28) (화합물 2-22) 의 합성
(2-22A) AG(7)-(AG(7)-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28) (하기 식의 화합물, 화합물 2-22) 의 합성
[화학식 142]
Figure pct00166
(2-21A) 에서 합성한 AG(9)-(AG(9)-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28) (8 mg) 을 사용하여, (2-11A) 와 동일한 수법에 따라 목적물 AG(7)-(AG(7)-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28) (화합물 2-22) (6.6 mg) 를 얻었다.
ESI-TOF-MS : Calcd for C244H396N56O118S3 : [M+4H]4+ 1525.6, Found 1525.4.
＜실시예 2-23＞ SG-Mal-(SG-Mal-)Lys-[SG-Mal-(SG-Mal-)Lys-]Lys-PEG(11)- hANP(1-28) (화합물 2-23) 의 합성
(2-23A) TrS-(TrS-)Lys-[TrS-(TrS-)Lys-]Lys-PEG(11)-CO2H (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 143]
Figure pct00167
3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로피온산 (202 mg) 으로부터, (2-19A) 와 동일한 수법에 따라, 목적물 TrS-(TrS-)Lys-[TrS-(TrS-)Lys-]Lys-PEG(11)-CO2H (135 mg) 를 얻었다.
(2-23B) HS-(HS-)Lys-[HS-(HS-)Lys-]Lys-PEG(11)-hANP(1-28) (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 144]
Figure pct00168
(2-23A) 에서 제조한 TrS-(TrS-)Lys-[TrS-(TrS-)Lys-]Lys-PEG(11)-CO2H (45.3 mg) 로부터, (2-17A) 와 동일한 수법에 따라, 목적물 HS-(HS-)Lys-[HS-(HS-)Lys-]Lys-PEG(11)-hANP(1-28) (12.0 mg) 을 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C184H308N52O59S7 : [M+H]+ 4415.1, Found 4416.1
(2-23C) SG4-Lys3-PEG11-hANP(1-28) (하기 식의 화합물, 화합물 2-23) 의 합성
[화학식 145]
Figure pct00169
(2-23B) 에서 제조한 HS-(HS-)Lys-[HS-(HS-)Lys-]Lys-PEG(11)-hANP(1-28) (3.16 mg) 로부터 (2-17B) 와 동일한 수법에 따라, 목적물 SG-Mal-(SG-Mal-)Lys-[SG-Mal-(SG-Mal-)Lys-]Lys-PEG(11)-hANP(1-28) (화합물 2-23) (4.40 mg) 을 얻었다.
ESI-TOF-MS : Calcd for C556H900N84O319S7 : [M+6H]6+ 2349.3 (ave), Found 2349.2.
＜실시예 2-24＞ SG-PEG(3)-hANP(1-28)-PEG(3)-SG (화합물 2-24) 의 합성
(2-24A) GlcNAc-PEG(3)-hANP(1-28) (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 146]
Figure pct00170
(2-1A) 에서 제조한 hANP(1-28)-TFA 염 (33.0 mg) 및 화합물 1-3A (13.0 mg, 24.7 μmol) 를 사용하여, (2-7A) 와 동일한 방법에 따라, 목적물 GlcNAc-PEG(3)-hANP(1-28) (25.0 mg) 을 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C148H240N47O51S3 : [M+H]+3587.7, Found 3587.6.
(2-24B) GlcNAc-PEG(3)-hANP(1-28)-PEG(3)-GlcNAc (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 147]
Figure pct00171
(2-24A) 에서 제조한 GlcNAc-PEG(3)-hANP(1-28) (21.0 mg) 및 화합물 1-19B (46 mg, 73.6 μmol) 를 사용하여, (2-2B) 와 동일한 방법에 따라, 목적물 GlcNAc-PEG(3)-hANP(1-28)-PEG(3)-GlcNAc (3.0 mg) 를 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C169H278N50O61S3 : [M+H]+4080.9, Found 4080.9.
(2-24C) SG-PEG(3)-hANP(1-28)-PEG(3)-SG (하기 식의 화합물, 화합물 2-24) 의 합성
[화학식 148]
Figure pct00172
(2-24B) 에서 제조한 GlcNAc-PEG(3)-hANP(1-28)-PEG(3)-GlcNAc (4.0 mg) 를 사용하여, (2-2D) 와 동일한 수법에 따라 목적물 SG-PEG(3)-hANP(1-28)-PEG(3)-SG (화합물 2-24) (5.5 mg) 를 얻었다.
ESI-TOF-MS : Calcd for C321H528N60O173S3 : [M+4H]4+ 2023.0 (ave), Found 2022.8.
＜실시예 2-25＞ SG-thioacetamide-hANP(1-28) (화합물 2-25) 의 합성
(2-25A) TrS-hANP(1-28) (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 149]
Figure pct00173
3-트리틸술파닐프로피온산 (2.24 mg, 6.43 μmol) 을 디메틸포름아미드 (100㎕) 에 용해하고, 실온에서 트리에틸아민 (1.79 ㎕, 12.8 μmol) 을 첨가하고, 빙랭하, 디메틸티오포스피노일클로라이드 (0.83 mg, 6.46 μmol) 의 디메틸포름아미드 용액 (60㎕) 을 첨가한 후, 실온에서 1 시간 교반했다. 한편, hANP-트리플루오로아세트산염 (10 mg) 을 디메틸포름아미드 (200 ㎕), 증류수 (60 ㎕) 에 용해하고, 실온에서 트리에틸아민 (4.2 ㎕) 을 첨가하고, 빙랭하, 먼저 조제한 활성 에스테르의 디메틸포름아미드 용액 (160 ㎕) 을 첨가하여, 실온에서 5 시간 교반했다. 빙랭한 0.5 ％ 트리플루오로아세트산 수용액 (2 ㎖) 에 반응액을 첨가하고, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하고, 동결 건조시켜 목적물 TrS-hANP(1-28) (5.77 mg) 을 얻었다.
ESI-TOF-MS : Calcd for C149H221N45O40S4 : [M＋3H]3+ 1138.0 (ave), Found 1137.8
(2-25B) HS-hANP(1-28) (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 150]
Figure pct00174
(2-25A) 에서 합성한 TrS-hANP(1-28) (5.77 mg) 을 트리플루오로아세트산/증류수/트리이소프로필실란 (90/5/5) 용액에 용해시켜, 실온에서 1 시간 교반했다. 반응 종료 후, 증류수/아세트산 (10/1) 용액 (3 ㎖) 을 첨가하고, 불용물을 용해시켜, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하고, 동결 건조시켜 목적물 HS-hANP(1-28) (2.88 mg) 을 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C130H207N45O40S4 : [M＋H]+ 3167.4, Found 3167.7
(2-25C) SG-thioacetamide-hANP(1-28) (하기 식의 화합물, 화합물 2-25) 의 합성
[화학식 151]
Figure pct00175
(2-25B) 에서 합성한 HS-hANP(1-28) (2.88 mg), (1-11C) 에서 합성한 SG-I (2.66 mg) 를 디메틸포름아미드 (300 ㎕) 에 용해시켜, 디이소프로필에틸아민 (0.77 ㎕) 첨가하고, 실온에서 1 시간 교반했다. 반응 종료 후, 증류수/아세트산 (10/1) 용액 (3 ㎖) 을 첨가하고, 불용물을 용해시켜, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하고, 동결 건조시켜 목적물 SG-thioacetamide-hANP(1-28) (화합물 2-25) (2.90 mg) 를 얻었다.
ESI-TOF-MS : Calcd for C218H350N52O103S4 : [M＋4H]4+ 1369.9 (ave), Found 1369.6.
＜실시예 2-26＞ AG(5)-hANP(1-28) (화합물 2-26) 의 합성
(2-26A) AG(5)-hANP(1-28) (하기 식의 화합물, 화합물 2-26) 의 합성
[화학식 152]
Figure pct00176
(2-7A) 에서 합성한 GlcNAc-hANP 의 트리플루오로아세트산염을, 이온 교환 수지 (Dowex 1x8) 사용하여 염 교환을 실시하고, GlcNAc-hANP 아세트산염으로서 다음의 반응에 사용했다.
(1-17C) 에서 합성한 AG(5)-P (18 mg) 를 0.2 M 인산 완충 용액 (pH 6.75, 160 ㎕) 에 용해시킨 후에, Glycosynthase (Endo-M-N175Q, 토쿄 화성공업, 1 U/㎖, 64 ㎕), (2-7A) 에서 합성한 hANP-GlcNAc 의 아세트산염 (8.0 mg) 의 디메틸술폭시드 용액 (96 ㎕) 을 첨가하고, 25 ℃ 에서 3 시간 반응시켰다. 실온에서 0.2 ％ 트리플루오로아세트산 수용액 (1.5 ㎖) 을 첨가하여 반응을 정지시키고, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하고, 동결 건조시켜 목적물 AG(5)-hANP(1-28) (화합물 2-26) (5.6 mg) 을 얻었다.
ESI-TOF-MS : Calcd for C163H261N47O66S3 : [M＋3H]3+ 1345.1 (ave), Found 1344.6.
＜실시예 2-27＞ SG-(SG-)Asn-PEG(11)-hANP(1-28) (화합물 2-27) 의 합성
(2-27A) Boc-(GlcNAc-)Asn-PEG(11)-CO2H (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 153]
Figure pct00177
J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, 284-290 의 기재에 준하여 제조한 (2S)-4-[[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-아세트아미도-4,5-디하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로피란-2-일]아미노]-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4-옥소부탄산 (187 mg, 0.43 mmol) 및 HATU (163 mg, 0.43 mmol) 를 N,N-디메틸포름아미드 (3.0 ㎖) 에 용해하고, 실온에서 디이소프로필에틸아민 (150 ㎕, 0.86 mmol) 을 첨가하여 3 분간 교반했다. 이 반응액을 (1-4A) 에서 제조한 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산 (0.22 g, 0.36 mmol) 에 첨가하여 실온에서 3 시간 교반했다. 이 반응 혼합물을 빙랭한 증류수 (3 ㎖) 및 아세트산 (100 ㎕) 의 혼합 용매에 적하하여 용해하고, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 에 의해 분리 정제를 실시하고, 동결 건조시켜 목적물 Boc-(GlcNAc-Asn)-PEG(11)-CO2H (210 mg) 를 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C44H82N4O23 : [M+K]+ 1073.6, Found 1073.5
(2-27B) Boc-(GlcNAc-)Asn-PEG(11)-hANP(1-28) (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 154]
Figure pct00178
(2-27A) 에서 제조한 Boc-(GlcNAc-)Asn-PEG(11)-CO2H (7.3 mg, 7.1 μmol) 를 N,N-디메틸포름아미드 (150 ㎕) 에 용해하고, 빙랭하, 트리에틸아민 (5.9 ㎕, 43 μmol) 및, 디메틸티오포스피노일클로라이드 (1.7 mg, 21 μmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (50 ㎕) 을 첨가했다. 이 반응액을 실온까지 승온하면서 1.5 시간 교반했다. 이 반응액을 빙랭하, (2-1A) 의 순서에 따라 조제한 hANP-TFA 염 (36 mg, 60 w/w％, 7.1 μmol) 및 트리에틸아민 (14 ㎕, 99 μmol) 을 N,N-디메틸포름아미드 (1500 ㎕) 및 증류수 (300 ㎕) 의 혼합 용매에 용해한 용액에 첨가하고, 실온까지 승온하면서 1 일간 교반했다. 이 반응액을 빙랭한 0.2 v/v％ 트리플루오로아세트산 수용액 (8.3 ㎖) 에 첨가하고, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하고, 동결 건조시켜 목적물 GlcNAc-(GlcNAc-)Asn-PEG(11)-OH (14.8 mg) 를 얻었다.
ESI-TOF-MS : Calcd for C171H283N49O61S3 : [M+2H]2+ 2049.8 (ave), Found 2049.5
(2-27C) GlcNAc-(GlcNAc-)Asn-PEG(11)-hANP(1-28) (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 155]
Figure pct00179
(2-27B) 에서 제조한 Boc-(GlcNAc-)Asn-PEG(11)-hANP(1-28) (14.8 mg) 을 33 v/v％ 트리플루오로아세트산 수용액 (1.0 ㎖) 에 용해하고, 실온에서 3 시간 정치했다. 이 반응액을 빙랭한 증류수 (9.5 ㎖) 및 아세트산 (0.5 ㎖) 의 혼합 용매에 첨가하고, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하고, 동결 건조시켜 중간체 (10.2 mg) 를 얻었다.
(1-2C) 에서 제조한 2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-아세트아미도-4,5-디하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로피란-2-일]옥시아세트산 (1.4 mg, 5.1 μmol) 을 N,N-디메틸포름아미드 (150 ㎕) 에 용해하고, 빙랭하, 트리에틸아민 (2.1 ㎕, 15 μmol) 및, 디메틸티오포스피노일클로라이드 (0.98 mg, 7.7 μmol) 를 첨가했다. 이 반응액을 실온까지 승온하면서 1.5 시간 교반했다. 이 반응액을 빙랭하, 얻어진 중간체 (10 mg, 2.6 μmol) 및 트리에틸아민 (5.0 ㎕, 36 μmol) 을 N,N-디메틸포름아미드 (1500 ㎕) 및 증류수 (300 ㎕) 의 혼합 용매에 용해한 용액에 첨가하고, 실온까지 승온하면서 3 일간 교반했다. 이 반응액을 빙랭한 0.2 v/v％ 트리플루오로아세트산 수용액 (8.5 ㎖) 에 첨가하고, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하고, 동결 건조시켜 목적물 GlcNAc-(GlcNAc-)Asn-PEG(11)-hANP(1-28) (9.0 mg) 을 얻었다.
ESI-TOF-MS : Calcd for C176H290N50O66S3 : [M-2H]2- 2128.3 (ave), Found 2128.0
(2-27D) SG-(SG-Asn)-PEG(11)-hANP(1-28) (하기 식의 화합물, 화합물 2-27) 의 합성
[화학식 156]
Figure pct00180
(1-12A) 에서 제조한 SG-Oxa 의 0.2 M 인산 완충 용액 (60 mM, 188 ㎕) 에, 실온에서 Endo-M-N175Q (1 U/㎖, 100 ㎕) 를 첨가한 후, 실온에서 (2-27D) 에서 제조한 hANP-GlcNAc (8.0 mg, 1.9 μmol) 의 디메틸술폭시드 용액 (120 ㎕) 을 2 회로 나누어 15 분 간격으로 첨가하고, 25 ℃ 에서 1 일간 진탕했다. 실온에서 0.2 ％ 트리플루오로아세트산 수용액 (4.5 ㎖) 및 아세트산 (0.5 ㎖) 의 혼합 용매를 첨가하여 반응을 정지시키고, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하고, 동결 건조시켜 목적물 SG-(SG-)Asn-PEG(11)-hANP(1-28) (화합물 2-27) (3.4 mg) 을 얻었다.
ESI-TOF-MS : Calcd for C328H536N60O178S3 : [M+5H]5+ 1653.8 (ave), Found 1653.7.
＜실시예 2-28＞ SG-(SG-)Asn-PEG(11)-PEG(11)-hANP(1-28) (화합물 2-28) 의 합성
(2-28A) Fmoc-PEG(11)-PEG(11)-CO2H (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 157]
Figure pct00181
3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산 (350 mg, 0.42 mmol) 및 HATU (192 mg, 0.50 mmol) 를 N,N-디메틸포름아미드 (3.0 ㎖) 에 용해하고, 실온에서 디이소프로필에틸아민 (176 ㎕, 1.01 mmol) 을 첨가하여 3 분간 교반했다. 이 반응액을 (1-4A) 에서 제조한 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산 (259 mg, 0.42 mmol) 에 첨가하여 실온에서 3 시간 교반했다. 이 반응 혼합물을 빙랭한 증류수 (3 ㎖) 및 아세트산 (117 ㎕) 의 혼합 용매에 적하하여 용해하고, 또한 N,N-디메틸포름아미드 (3.0 ㎖) 및 증류수 (15 ㎖) 의 혼합 용매로 희석했다. 이 용액을 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 에 의해 분리 정제하고, 동결 건조시켜 목적물 Fmoc-PEG(11)-PEG(11)-CO2H (399 mg) 를 얻었다.
ESI-TOF-MS : Calcd for C69H118N2O29 : [M-H]- 1437.8, Found 1437.8
(2-28B) H2N-PEG(11)-PEG(11)-CO2H (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 158]
Figure pct00182
(2-28A) 에서 제조한 Fmoc-PEG(11)-PEG(11)-CO2H (250 mg) 로부터 (1-4A) 와 동일한 수법에 따라 목적물 H2N-PEG(11)-PEG(11)-CO2H (77 mg) 를 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C54H108N2O27 : [M+H]+ 1217.7, Found 1217.9
(2-28C) Boc-(GlcNAc-)Asn-PEG(11)-PEG(11)-CO2H (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 159]
Figure pct00183
J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, 284-290 의 기재에 준하여 제조한 (2S)-4-[[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-아세트아미도-4,5-디하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로피란-2-일]아미노]-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4-옥소부탄산 (32 mg, 74 μmol) 및 (2-28B) 에서 제조한 H2N-PEG(11)-PEG(11)-CO2H (76 mg) 로부터 (2-27A) 와 동일한 수법에 따라 목적물 Boc-(GlcNAc-)Asn-PEG(11)-PEG(11)-CO2H (58 mg) 를 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C71H135N5O36 : [M+K]+ 1673.0, Found 1672.9
(2-28D) Boc-(GlcNAc)-Asn-PEG(11)-PEG(11)-hANP(1-28) (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 160]
Figure pct00184
(2-28C) 에서 제조한 Boc-(GlcNAc-Asn)-PEG(11)-PEG(11)-COOH (29 mg, 18 μmol) 및 (2-1A) 에서 제조한 hANP(1-28)-TFA 염 (50 mg, 60 w/w％, 9.7 μmol) 을 사용하여 (2-27B) 와 동일한 수법에 따라 목적물 Boc-(GlcNAc-)Asn-PEG(11)-PEG(11)-hANP(1-28) (35 mg) 을 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C198H336N50O74S3 : [M+H]+ 4695.3, Found 4697.5
(2-28E) GlcNAc-(GlcNAc-Asn)-PEG(11)-PEG(11)-hANP(1-28) (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 161]
Figure pct00185
(2-28D) 에서 제조한 Boc-(GlcNAc-Asn)-PEG(11)-PEG(11)-hANP(1-28) (35 mg, 7.4 μmol) 로부터 (2-27C) 와 동일한 수법에 따라 목적물 GlcNAc-(GlcNAc-)Asn-PEG(11)-PEG(11)-hANP(1-28) (16 mg) 을 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C203H343N51O79S3 : [M+H]+ 4859.4 (ave), Found 4858.4
(2-28F) SG-(SG-Asn)-PEG(11)-PEG(11)-hANP(1-28) (하기 식의 화합물, 화합물 2-28) 의 합성
[화학식 162]
Figure pct00186
(1-12A) 에서 제조한 SG-Oxa 의 0.2 M 인산 완충 용액 (60 mM, 190 ㎕) 및, (2-28F) 에서 제조한 GlcNAc-(GlcNAc)-Asn-PEG(11)-PEG(11)-hANP(1-28) (16 mg, 3.2 μmol) 로부터 (2-27D) 와 동일한 수법에 따라 목적물 SG-(SG-Asn)-PEG(11)-PEG(11)-hANP(1-28) (화합물 2-28) (13 mg) 을 얻었다.
ESI-TOF-MS : Calcd for C355H589N61O191S3 : [M+4H]4+ 2217.0 (ave), Found 2216.9.
＜실시예 2-29＞ SG-PEG(3)-hANP(1-28) (화합물 2-29) 의 합성
(2-29A) SG-PEG(3)-hANP(1-28) (하기 식의 화합물, 화합물 2-29) 의 합성
[화학식 163]
Figure pct00187
(2-24A) 에서 제조한 GlcNAc-PEG(3)-hANP(1-28) (15.0 mg) 로부터 (1-14B) 와 동일한 수법에 따라 목적물 SG-PEG(3)-hANP(1-28) (화합물 2-29) (12.32 mg) 를 얻었다.
ESI-TOF-MS : Calcd for C224H362N52O107S3 : [M+4H]4+ 1399.0 (ave), Found 1398.3.
＜실시예 2-30＞ SG-PEG(11)-hANP(1-28) (화합물 2-30) 의 합성
(2-30A) GlcNAc-PEG(11)-hANP(1-28) (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 164]
Figure pct00188
hANP(1-28)-TFA 염 (43.9 mg) 과 화합물 1-4B (15.0 mg) 를 사용하여 (2-7A) 와 동일한 수법에 따라, 목적물 GlcNAc-PEG(11)-hANP(1-28) (33.7 mg) 을 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C164H271N47O59S3 : [M+H]+ 3939.9, Found 3939.8
(2-30B) SG-PEG(11)-hANP(1-28) (하기 식의 화합물, 화합물 2-30) 의 합성
[화학식 165]
Figure pct00189
(2-30A) 에서 제조한 GlcNAc-PEG(11)-hANP(1-28) (15.0 mg) 을 사용하여, (1-14B) 와 동일한 수법에 따라 목적물 SG-PEG(11)-hANP(1-28) (화합물 2-30) (11.52 mg) 을 얻었다.
ESI-TOF-MS : Calcd for C240H394N52O115S3 : [M+5H]5+ 1189.8 (ave), Found 1189.3.
＜실시예 2-31＞ SG-(SG-) Gln*-Mal-PEG(3)-hANP(1-28) (화합물 2-31) 의 합성
(2-31A) H2N-PEG(3)-hANP(1-28) (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 166]
Figure pct00190
3-[2-[2-[2-[2-(tert-부톡시카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로피온산 (11.7 mg) 과 (2-1A) 의 조정법 2 의 방법으로 hANP(1-28)-아세트산염 (41.0 mg) 으로부터 조정한 hANP(1-28)-TFA 염을 사용하여, (2-1B) 와 동일한 수법에 따라 Boc-PEG(3)-hANP(1-28) (12.7 mg) 을 얻었다. 얻어진 Boc-PEG(3)-hANP(1-28) (12.7 mg) 을 사용하여 (2-2C) 와 동일한 수법에 따라, 목적물 H2N-PEG(3)-hANP(1-28) (12.0 mg) 을 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C138H224N46O44S3 : [M+H]+ 3326.6, Found 3326.6
(2-31B) HS-PEG(3)-hANP(1-28) (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 167]
Figure pct00191
(2-31A) 에서 제조한 H2N-PEG(3)-hANP(1-28) (12.0 mg) 을 사용하여 (2-25A), (2-25B) 와 동일한 수법에 따라, 목적물 HS-PEG(3)-hANP(1-28) (5.00 mg) 을 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C141H228N46O45S4 : [M+H]+ 3414.6, Found 3414.7
(2-31C) SG-(SG-)Gln*-Mal-PEG(3)-hANP(1-28) (하기 식의 화합물, 화합물 3-31) 의 합성
[화학식 168]
Figure pct00192
(2-31C) 에서 제조한 HS-PEG(3)-hANP(1-28) (4.00 mg) 과 (1-15C) 에서 제조한 SG-(SG-)Gln*-Mal (7.43 mg) 을 사용하여, (2-17B) 와 동일한 수법에 따라, 목적물 SG-(SG-)Gln*-Mal-PEG(3)-hANP(1-28) (화합물 2-31) (2.09 mg) 을 얻었다.
ESI-TOF-MS : Calcd for C325H524N62O174S4 : [M+5H]5+ 1643.4 (ave), Found 1643.2.
＜실시예 2-32＞ SG-(SG-)Gln*-PEG(3)-Mal-hANP(1-28) (하기 식의 화합물, 화합물 2-32) 의 합성
[화학식 169]
Figure pct00193
(2-25B) 에서 제조한 HS-hANP(1-28) (2.3 mg) 및 (1-16C) 에서 제조한 SG-(SG-)Gln*-PEG(3)-Mal (4.0 mg) 을 0.2 M 아세트산 버퍼 (pH 5.0) (0.10 ㎖) 와 디메틸술폭시드 (0.10 ㎖) 의 혼합 용매에 용해하고, 실온에서 5 시간 교반했다. 반응 용액에 0.2 ％ 트리플루오로아세트산 수용액 (2.0 ㎖) 을 첨가하고, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하고, 동결 건조시켜 목적물 SG-(SG-)Gln*-PEG(3)-Mal-hANP(1-28) (화합물 2-32) (3.5 mg) 를 얻었다.
ESI-TOF-MS : Calcd for C325H528N62O174S4 : [M+4H]4+ 2054.0 (ave), Found 2053.8.
＜실시예 2-33＞ SG-Mal-(SG-Mal-)Lys-hANP(1-28) (화합물 2-33) 의 합성
(2-33A) TrS-(TrS-)Lys-PEG(3)-CO2H (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 170]
Figure pct00194
1.20 mmol/g 의 2-클로로트리틸클로라이드레진 (83 mg, 0.100 mmol) 을 고상 합성용의 칼럼에 넣고, 디클로로메탄 (2 ㎖) 을 첨가하여 10 분 진탕했다. 여과 후, 3-[2[2[2[2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로피온산 (97.5 mg, 0.200 mmol) 과 N,N-디이소프로필에틸아민 (85.6 ㎕, 0.500 mmol) 의 디클로로메탄 (2 ㎖) 용액을 첨가하고, 실온에서 2 시간 진탕했다. 여과 후, 디클로로메탄 혼합 용액 (디클로로메탄：메탄올：N,N-디이소프로필에틸아민 = 85：10：5, v/v) 으로 3 회, 디클로로메탄으로 3 회, N,N-디메틸포름아미드로 3 회 세정했다. 20 ％ 피페리딘/N,N-디메틸포름아미드 용액 (2 ㎖) 을 첨가하여 5 분 진탕 후 여과하는 조작을 4 회 실시했다. 레진을 N,N-디메틸포름아미드로 4 회 세정했다. 레진에 (2S)-2,6-비스(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)헥산산 (177 mg, 0.300 mmol) 과 HATU (114 mg, 0.300 mmol) 와 N,N-디이소프로필에틸아민 (103 ㎕, 0.600 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (2 ㎖) 을 첨가하여 실온에서 30 분 진탕했다. 여과 후 레진을 N,N-디메틸포름아미드로 4 회 세정했다. 20 ％ 피페리딘/N,N-디메틸포름아미드 용액 (2 ㎖) 을 첨가하여 5 분 진탕 후 여과하는 조작을 4 회 실시했다. 레진을 N,N-디메틸포름아미드로 4 회 세정했다. 3-트리틸술파닐프로피온산 (209 mg, 0.600 mmol) 과 HATU (228 mg, 0.600 mmol) 와 N,N-디이소프로필에틸아민 (205 ㎕, 1.20 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (2 ㎖) 을 첨가하여 실온에서 1 시간 진탕했다. 여과 후 레진을 N,N-디메틸포름아미드로 4 회, 디클로로메탄으로 4 회 세정했다. 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올 (0.5 ㎖) 과 디클로로메탄 (1.5 ㎖) 의 혼합 용액을 첨가하고, 실온에서 2 시간 진탕했다. 여과하여 레진을 제거하고, 여과액을 감압하 농축했다. 디클로로메탄으로 6 회 공비하고, 진공 펌프로 건조시킴으로써, 목적물 TrS-(TrS-)Lys-PEG(3)-CO2H 를 갈색 고체 (105 mg) 로서 얻었다.
(2-33B) TrS-(TrS-)Lys-PEG-(3)-hANP(1-28) (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 171]
Figure pct00195
(2-33A) 에서 제조한 TrS-(TrS-)Lys-PEG(3)-CO2H (27.4 mg) 로부터, (2-17A) 와 동일한 수법에 따라, 목적물 TrS-(TrS-)Lys-PEG-(3)-hANP(1-28) (30 mg) 을 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C188H272N48O47S5 : [M+H]+ 4114.9, Found 4115.1
(2-33C) HS-(HS-)Lys-PEG-(3)-hANP(1-28) (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 172]
Figure pct00196
(2-33B) 에서 제조한 TrS-(TrS-)Lys-PEG-(3)-hANP(1-28) (30.0 mg) 로부터, (2-17B) 와 동일한 수법에 따라, 목적물 HS-(HS-)Lys-PEG-(3)-hANP(1-28) (15.3 mg) 을 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C150H244N48O47S5 : [M+H]+ 3630.7, Found 3631.0
(2-33D) SG-Mal-(SG-Mal-)Lys-PEG-(3)-hANP(1-28) (하기 식의 화합물, 화합물 2-33) 의 합성
[화학식 173]
Figure pct00197
(2-33C) 의 수법으로 제조한 HS-(HS-)Lys-PEG-(3)-hANP(1-28) (5.00 mg) 로부터, (2-17C) 와 동일한 수법에 따라, 목적물 SG-Mal-(SG-Mal-)Lys-PEG-(3)-hANP(1-28) (화합물 2-33) (8.55 mg) 을 얻었다.
ESI-TOF-MS : Calcd for C336H540N64O177S5 : [M+5H]5+ 1694.7 (ave), Found 1694.5.
＜실시예 2-34＞ SG-thioacetamide-(SG-thioacetamide-)Lys-PEG-(3)-hANP(1-28) (화합물 2-34) 의 합성
(2-34A) SG-thioacetamide-(SG-thioacetamide-)Lys-PEG-(3)-hANP(1-28) (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 174]
Figure pct00198
(2-33C) 에서 제조한 HS-(HS-)Lys-PEG-(3)-hANP(1-28) (4.14 mg) 과 (1-19D) 에서 제조한 SG-I (7.40 mg) 를 사용하여, (2-25C) 와 동일한 수법에 따라, 목적물 SG-thioacetamide-(SG-thioacetamide-)Lys-PEG-(3)-hANP(1-28) (화합물 2-34) (4.74 mg) 를 얻었다.
ESI-TOF-MS : Calcd for C326H530N62O173S5 : [M+5H]5+ 1650.3 (ave), Found 1650.2.
＜실시예 2-35＞ SG-(SG-)Lys-PEG(3)-hANP(1-28) (화합물 2-35) 의 합성
(2-35A) Lys-PEG(3)-hANP(1-28) (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 175]
Figure pct00199
화합물 1-20A (4.40 mg, 7.42 μmol) 및 HATU (2.6 mg, 6.84 μmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (94 ㎕) 에, N,N-디이소프로필에틸아민 (5.0 ㎕, 29.4 μmol) 을 첨가하고, 실온에서 3 분간 교반했다. 얻어진 반응 용액을, hANP 트리플루오로아세트산염 (25 mg) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (13 ㎕, 76.4 μmol) 의 N,N-디메틸포름아미드/물 (5 : 1, v/v) 혼합 용액 (0.60 ㎖) 에 첨가하고, 실온에서 2 시간 교반했다. 반응 용액에 0.2 ％ 트리플루오로아세트산 수용액 (3 ㎖) 을 첨가하고, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하고, 동결 건조시켜 Boc-(Boc-)Lys-PEG(3)-hANP(1-28) (18.0 mg) 을 얻었다.
얻어진 Boc-(Boc-)Lys-PEG(3)-hANP(1-28) (18.0 mg) 을 사용하여, (2-2C) 와 동일한 수법에 따라 목적물 Lys-PEG(3)-hANP(1-28) (12.0 mg) 을 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C144H237N48O45S3 : [M+H]+ 3454.7, Found 3454.7.
(2-35C) SG-(SG-)Lys-PEG(3)-hANP(1-28) (하기 식의 화합물, 화합물 2-35) 의 합성
[화학식 176]
Figure pct00200
(2-35B) 에서 제조한 Lys-PEG(3)-hANP(1-28) (6.0 mg) 을 사용하여, (2-1B) 와 동일한 수법에 따라 목적물 SG-(SG-)Lys-PEG(3)-hANP(1-28) (화합물 2-35) (6.4 mg) 를 얻었다.
ESI-TOF-MS : Calcd for C316H507N60O171S3 : [M-5H]5-1595.7 (ave), Found 1595.6.
＜실시예 2-36＞ SG-(SG-)Asn-(Ser-Gly)3-hANP(1-28) (화합물 2-36) 의 합성
(2-36A) GlcNAc-(GlcNAc-)Asn-(tBuSer-Gly)3-hANP(1-28) (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 177]
Figure pct00201
화합물 1-21B (13.8 mg) 와 (2-1A) 의 조정법 2 의 방법으로 hANP-아세트산염 (37.1 mg) 으로부터 조정한 hANP(1-28)-TFA 염을 사용하여, (2-1B) 와 동일한 수법에 따라 목적물 GlcNAc-(GlcNAc-)Asn-(tBuSer-Gly)3-hANP(1-28) (27.0 mg) 을 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C176H286N56O61S3 : [M+H]+ 4258.0, Found 4257.8
(2-36B) GlcNAc-(GlcNAc-Asn)-(Ser-Gly)3-hANP(1-28) (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 178]
Figure pct00202
(2-36A) 에서 제조한 GlcNAc-(GlcNAc-Asn)-(tBuSer-Gly)3-hANP(1-28) (27.0 mg) 로부터, (2-17A) 와 동일한 수법에 따라, 목적물 GlcNAc-(GlcNAc-Asn)-(Ser-Gly)3-hANP(1-28) (4.66 mg) 을 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C164H262N56O61S3 : [M+H]+ 4089.8, Found 4090.1
(2-36C) SG-(SG-Asn)-(Ser-Gly)3-hANP(1-28) (하기 식의 화합물, 화합물 2-36) 의 합성
[화학식 179]
Figure pct00203
(2-36B) 에서 제조한 GlcNAc-(GlcNAc-)Asn-(Ser-Gly)3-hANP(1-28) (3.50 mg) 로부터 (2-2D) 와 동일한 수법에 따라 목적물 SGc-(SG-)Asn-(Ser-Gly)3-hANP(1-28) (화합물 2-36) (3.24 mg) 을 얻었다.
ESI-TOF-MS : Calcd for C316H508N66O173S3 : [M+4H]4+ 2025.0 (ave), Found 2025.0.
＜실시예 2-37＞ SG-(SG-)Asn-Gly6-hANP(1-28) (화합물 2-37) 의 합성
(2-37A) Gly3-hANP(1-28) (하기 식의 화합물의 합성)
[화학식 180]
Figure pct00204
2-[[2-[[2-(tert-부톡시카르보닐아미노)아세틸]아미노]아세틸]아미노]아세트산 (27.7 mg) 과 (2-1A) 의 조정법 2 의 방법으로 hANP-아세트산염 (246 mg) 으로부터 조정한 hANP-TFA 염을 사용하여, (2-1B) 와 동일한 수법에 따라 Boc-Gly3-hANP(1-28) (196 mg) 을 얻었다. 얻어진 Boc-Gly3-hANP(1-28) (196 mg) 로부터, (2-2C) 와 동일한 수법에 따라, 목적물 Gly3-hANP(1-28) (190 mg) 을 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C133H212N48O42S3 : [M+H]+ 3250.5, Found 3250.6
(2-37B) Gly6-hANP(1-28) (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 181]
Figure pct00205
(2-37A) 에서 제조한 Gly3-hANP(1-28) (190 mg) 과 2-[[2-[[2-(tert-부톡시카르보닐아미노)아세틸]아미노]아세틸]아미노]아세트산 (13.4 mg) 으로부터, (2-1B) 와 동일한 수법에 따라, Boc-Gly6-hANP(1-28) (115 mg) 을 얻었다.
얻어진 Boc-Gly6-hANP(1-28) (115 mg) 로부터, (2-2C) 와 동일한 수법에 따라, 목적물 Gly6-hANP(1-28) (115 mg) 을 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C139H221N51O45S3 : [M+H]+ 3421.6, Found 3421.5
(2-37C) Boc-(GlcNAc-)Asn-Gly6-hANP(1-28) (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 182]
Figure pct00206
(2-37B) 에서 제조한 Gly6-hANP(1-28) (60.0 mg) 로부터, (1-5A) 와 동일한 수법에 따라, 목적물 Boc-(GlcNAc-)Asn-Gly6-hANP(1-28) (23.0 mg) 을 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C156H248N54O54S3 : [M+H]+ 3838.7, Found 3839.0
(2-37D) GlcNAc-(GlcNAc-)Asn-Gly6-hANP(1-28) (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 183]
Figure pct00207
(2-37C) 에서 제조한 Boc-(GlcNAc-Asn)-Gly6-hANP (1-28) (23.0 mg) 로부터, (1-5B) 와 동일한 수법에 따라, 목적물 GlcNAc-(GlcNAc-)Asn-Gly6-hANP(1-28) 을 백색 고체 (6.77 mg) 로서 얻었다.
MALDI-TOF-MS : Calcd for C161H255N55O59S3 : [M+H]+ 3999.8, Found 4000.1
(2-37E) SG-(SG-)Asn-Gly6-hANP(1-28) (하기 식의 화합물, 화합물 2-37) 의 합성
[화학식 184]
Figure pct00208
(2-37D) 에서 제조한 GlcNAc-(GlcNAc-)Asn-Gly6-hANP(1-28) (3.40 mg) 로부터 (2-2D) 와 동일한 수법에 따라 목적물 SG-(SG-)Asn-Gly6-hANP(1-28) (화합물 2-37) (4.32 mg) 을 얻었다.
ESI-TOF-MS : Calcd for C313H501N65O171S3 : [M+4H]4+ 2002.7 (ave), Found 2002.5.
＜실시예 2-38＞ SG-Lys*-[PEG(3)-Mal-hANP(1-28)]2 (화합물 2-38, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 185]
Figure pct00209
(1-22B) 에서 제조한 SG-Lys-[PEG(3)-Mal]2 (3.0 mg, 0.94 μmol) 를 사용하여, (2-32A) 와 동일한 방법에 따라, 표기 목적 화합물 SG-Lys*-[PEG(3)-Mal-hANP(1-28)]2 (화합물 2-38) (7.0 mg) 을 얻었다.
ESI-TOF-MS : Calcd for C388H616N103O159S8 : [M-5H]5- 1904.8 (ave), Found 1904.8.
＜실시예 2-39＞ SG-Lys*-[PEG(11)-Mal-hANP(1-28)]2 (화합물 2-39, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 186]
Figure pct00210
(1-23B) 에서 제조한 SG-Lys*-[PEG(11)-Mal]2 (3.7 mg, 0.95 μmol) 를 사용하여, (2-32A) 와 동일한 방법에 따라, 표기 목적 화합물 SG-Lys*-[PEG(11)-Mal-hANP(1-28)]2 (화합물 2-39) (7.0 mg) 를 얻었다.
ESI-TOF-MS : Calcd for C420H680N103O175S8 : [M-5H]5- 2045.8 (ave), Found 2045.8.
＜실시예 2-40＞ SG(Glc)-Gly-A-hANP(1-28) (화합물 2-40, 하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 187]
Figure pct00211
(1-24E) 에서 합성한 SG(Glc)-Gly-A (30 mg) 를 사용하여, (2-1B) 와 동일한 수법에 따라, 목적 화합물 SG(Glc)-Gly-A-hANP(1-28) (화합물 2-40) (34.2 mg) 을 얻었다.
ESI-TOF-MS : Calcd for C213H341N51O103S3 : [M+4H]4+1341.1 (ave), Found 1341.0
또, 실시예 2 의 각종 수식 hANP 의 제조에 있어서, 실시예 1-11, 1-12, 1-13 또는 1-14, 및, 실시예 1-24 에 준한 방법으로 합성한, 각종의 환원 말단 개변 당 사슬을 사용함으로써, 당 사슬로서 환원 말단 개변 당 사슬을 채용한 수식 hANP 를 적절히 제조할 수 있다.
［시험예］
＜시험예 1＞ 당 사슬 수식 펩티드의 cGMP 상승 활성 시험
이하의 방법에 의해, 실시예 2 에서 제작한 각 수식 펩티드의 cGMP 상승 활성을 측정했다.
CHO 세포에 human GC-A 를 항상적으로 발현시킨 CHO/human GC-A 세포를 α-MEM, 10 ％ FBS, 1 ％ Penicillin-streptomycin 으로 2 × 105 cells/㎖ 로 현탁하고, 384 well plate (Corning, 3826) 에 20 ㎕/well 로 파종하여 (4 × 103 cells/well), CO2 인큐베이터 내에서 하룻밤 배양했다. 다음날, 이 플레이트로부터 배지를 제거한 후, 1.6 mM IBMX/KRB buffer 를 10 ㎕/well 첨가하고, 플레이트 셰이커로 교반 후, 실온에서 10 분간 인큐베이션을 했다. 다음으로, 물에 용해시켜, 최종 농도의 3 배 농도로 조제한 피험물질 (각 수식 펩티드 및 천연형 hANP(1-28) (펩티드 연구소), 최종 농도 농도 범위 0.01, 0.1, 1, 10, 100 nM 이 되도록 희석 계열을 조제) 을 5 ㎕/well 씩 첨가하고, 플레이트 셰이커로 교반 후, CO2 인큐베이터 내에서 15 분간 인큐베이션을 했다. 그 후, Lysis buffer (50 mM phosphate buffer, pH 7.0, 1 ％ Triton X-100) 를 5 ㎕ 첨가하고, 플레이트 셰이커로 10 분간 교반하여, 세포를 용해시켰다. 계속해서, 그 세포 용해액 중의 cGMP 량을 cGMP kit (CISBIO 제조) 를 사용하여 측정했다. 즉, 384 well plate (Greiner, 784076) 에 키트에 첨부된 diluent 를 5 ㎕/well, 세포 용해액을 5 ㎕/well, cGMP-d2 를 5 ㎕/well, anti cGMP-Cryptate 를 5 ㎕/well 첨가하고, 플레이트 셰이커로 교반 후, 차광하 4 ℃ 에서 하룻밤 인큐베이션을 한 후, RubyStar (BMG LABTECH 제조) 로 균일 시간 분해 형광을 측정했다. 각 농도에 있어서의 피험물질의 활성치 (T/C) 는 용매만을 첨가한 웰의 활성치를 0, 1 nM ANP 를 첨가한 웰의 활성치를 1 로 하여 산출했다. 각 농도에 있어서의 T/C 를 플롯하고, 얻어진 시그모이드 곡선으로부터 T/C = 0.5 의 값을 EC50 으로 하고, 측정 농도 범위에 있어서의 최대 T/C 값을 Emax 로 했다 (표 1).
표 1 의 결과로부터, 모든 수식 펩티드가, hANP 의 50 ％ 이상의 cGMP 상승 활성을 나타내고 (Emax > 0.5), cGMP 상승 활성을 유지하고 있는 것이 나타났다. 화합물 2-17, 2-18, 2-20 은, Emax 가 0.6 ∼ 0.7 정도로 약간 낮은 경향이었지만, 그 이외의 수식 펩티드는 Emax 가 0.95 이상이며, 천연형 hANP 와 동등의 cGMP 상승 작용을 유지하고 있었다.
피험물질의 cGMP 상승 활성
Figure pct00212
＜시험예 2＞ 수식 펩티드의 NEP 분해 시험
이하의 방법에 의해, 실시예 2 에서 제작한 각 수식 펩티드의 중성 엔도펩티다아제 (일반명：Neprilysin) 에 의한 분해에 대한 내성을 조사했다.
피험물질 (각종 당 사슬 수식 ANP 및 천연형 hANP(1-28)) 의 용액 중에 Neprilysin (R&D systems) 을 1 ug/㎖ 가 되도록 첨가하고, 37 ℃, 30 분간 전처리했다. 당해 Neprilysin 처리액을 사용하여 피험물질의 cGMP 상승 활성을 시험예 1 의 방법으로 조사했다.
그 결과, 천연형 hANP 는 NEP 처리에 의해 활성이 소실되었지만, 본 발명의 수식 펩티드는 NEP 처리 후여도 시험예 1 과 동일한 정도로 cGMP 상승 활성을 유지하고 있고, NEP 에 의한 분해를 받기 어려운 것이 나타났다.
동물의 혈중에 있어서의 천연형 ANP 의 조속한 소실의 주된 메커니즘은 NEP 에 의한 분해라고 생각되고 있다. 본 발명의 수식 펩티드는, NEP 처리 후도 cGMP 상승 활성을 유지하는 점에서, 동물체 내에 있어서도 NEP 에 의한 분해를 받기 어렵고, 유효량이 투여되면 투여 후 장시간에 걸쳐서 cGMP 상승 활성을 발휘할 수 있는 것이 나타났다.
＜시험예 3＞ 수식 펩티드의 래트의 혈중 지속성 시험
이하의 방법에 의해, 실시예 2 에서 제작한 각 수식 펩티드의 래트의 혈중에 있어서의 지속성 (혈중 cGMP 의 지속적 상승 작용 및 피험물질의 혈중으로부터의 검출 시간) 을 조사했다.
(1) 혈장 샘플의 조제
이소풀루란：일본 약국방 이소풀루란
채혈용 침 및 시린지：테르모시린지 25G x 1 SR 투베르쿨린용
채혈용 튜브：캐피젝트 미량 채혈관 EDTA-2Na 500 ㎕
샘플 보관용 튜브：MTARIX4170 샘플 트랙 튜브 0.75 ㎖
8 주령의 웅성 Slc : SD 래트에 대해 이소풀루란 흡입 마취 ((에스카인 흡입 마취액을 1-2 ％ 의 농도로 유지하여 흡입) 를 실시했다. 물에 용해시켜, 100 uM 의 농도로 조제한 피험물질 (각 수식 펩티드 및 천연형 hANP(1-28) (펩티드 연구소)) 의 용액을, 경정맥으로부터, 100 nmol/kg 의 용량 (1 ㎖/kg) 으로 급속 정맥 주사했다. 투여 전, 투여 후 15, 30, 60, 90, 120, 180 및 240 분의 시점에서, 경정맥으로부터 시간 경과적 채혈 (200 ㎕/회) 을 실시하고, 혈액 샘플은 신속하게 빙상(氷上)에 두었다.
채취한 혈액 샘플은 원심기 (Sigma 4K15, 로터 : Nr12130-H) 를 사용하여 5000 rpm, 5 min, 4 ℃ 에서 원심 분리하고, 분리한 혈장 샘플을 PK 측정용과 cGMP 측정용의 2 개로 나누어 측정까지 -80 ℃ 에 보존했다.
(2) 혈장 중 cGMP 농도의 측정
혈장 중의 cGMP 농도는, Amersham cGMP Enzymeimmunoassay BiotrakTM (EIA) System (dual range) 을 사용하여, 첨부된 프로토콜에 따라 측정했다. 그 결과를, 세로축에 cGMP 농도, 가로축에 투여 후의 경과 시간 (분) 으로서 플롯하고, 0 분 ∼ 240 분까지의 AUC (AUC0-240) 와 투여 후 60 - 240 분의 AUC (AUC60-240) 를 산출했다(표 2).
(3) 혈장 샘플 중의 피험물질의 검출
(1) 에서 조정한 래트 혈장 샘플 50 ㎕ 에 내부 표준 물질 (hANP 의 안정 동위체 500 nM, 20 ㎕) 과 아세트산 혼합 용매 (AcOH/증류수./DMSO = 5/3/2, v/v/v) 를 첨가 후 혼합하고, Amicon Ultra-0.5 50K (Millipore Corp., MA) 로 옮겨 15 ℃, 14000 rpm 으로 30 분 원심 분리했다. 얻어진 여과액을 Amicon Ultra-0.5 3K (Millipore Corp., MA) 로 옮겨, 상기 조건에서 재차 원심 분리했다. 필터 상에 남은 액을 꺼내어, 96 구멍 딥 웰 플레이트로 옮기고, LC-MS/MS (LC：Shimadzu LC-10ADVP (시마즈 제작소)., MS/MS：API4000QTrap (AB SCIEX)) 로, 피험물질의 함유량을 측정하여, 혈장 중의 농도를 산출했다. 피험물질이 최후에 검출된 시간을 표 2 의 가장 오른쪽의 칼럼에 나타냈다.
래트에 있어서의 혈중 지속 시간의 평가
Figure pct00213
*) Pre 값 (0 분의 값) 을 베이스 라인으로서, 곡선의 모든 점에 대해 베이스 라인과의 차분을 적산한 AUC 값. 곡선이 베이스 라인보다 아래가 되는 점은 부(負)의 값으로서 계산했다.
**) Pre 값 (0 분의 값) 을 베이스 라인으로서, 곡선이 베이스 라인보다 위에 있는 점에 대해서만 베이스 라인과의 차분을 적산한 AUC 값. 곡선이 베이스 라인보다 아래가 되는 점은 무시하고 계산했다.
천연형 hANP 에서는, 투여에 의해 일과성에 cGMP 가 급상승하지만, 투여 30 분 후에는, 투여 개시 전에 가까운 레벨까지 저하되고, 60 분 이후는 완전하게 cGMP 의 상승은 소실되었기 때문에, AUC60-240 은 0 이하이며, 혈중에서의 지속성이 없는 것이 확인되었다. 또, 혈장 중의 피험물질의 검출에 있어서는, 투여 15 분 후의 혈장 샘플에 있어서도 천연형 hANP 는 검출되지 않았다.
이것에 대해, 실시예 2 의 수식 펩티드에서는, AUC60-240 에 있어서도 높은 값을 나타내고 있고, 피험물질의 투여에 의해 상승한 혈장 중 cGMP 농도가 투여 후 60 분 이후 (화합물 2-1, 2-10 에서는 180 분 후, 화합물 2-12, 2-13, 2-14, 2-16 에 대해서는 120 분 후, 화합물 2-11, 2-15, 2-19 에 대해서는 60 분 후) 에 있어서도 투여 전보다도 높은 값을 유지하고 있었다. 또, 피험물질 자체가, 투여 1.5 시간 후 이후의 혈장 샘플에서도 검출되고 있고, 체내에서 장시간에 걸쳐서 대사되지 않고, 혈중에 머물러 있는 것이 나타났다. 이 결과로부터, 본 발명의 수식 펩티드는 혈중의 지속 시간이 연장되고 있고, 당해 지속 시간 중 cGMP 상승 활성을 유지하고 있는 것이 나타났다.
SEQUENCE LISTING <110> Daiichi Sankyo Company, Limited <120> A Glycosilated Atrial Natriuretic Peptide comprising agonistic agents for natriuretic peptide <130> FP1401 <150> JP2013-010612 <151> 2013-01-23 <160> 1 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Inventor:Iwamoto, Mitsuhiro;Yamaguchi, Takahiro;Mori, Yutaka;Saito, Keiji;Honda, Takeshi; Nagayama, Takahiro <400> 1 Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly 1 5 10 15 Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr 20 25

Claims (53)

  1. 적어도 하나의 당 물질이, 직접 글리코시드 결합에 의해 연결, 또는, 링커 구조를 개재하여, 적어도 하나의 hANP 펩티드와 연결된 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염.
  2. 제 1 항에 있어서,
    당 물질이, hANP 펩티드의, N 말단, C 말단, 및, 펩티드를 구성하는 적어도 하나의 아미노산의 측사슬 중 적어도 한 지점에 있어서, 직접 글리코시드 결합에 의해 연결, 또는, 링커 구조를 개재하여 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염.
  3. 제 1 항에 있어서,
    hANP 펩티드가 hANP(1-28), hANP(2-28), hANP(3-28), hANP(1-27), hANP(2-27) 또는 hANP(3-27) 인 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염.
  4. 제 1 항에 있어서,
    당 물질이 적어도 1 종류의 단당류, 이당류, 삼당류, 및, 4 개 이상의 단당류가 글리코시드 결합되어 이루어지는 당 사슬에서 선택되고, 1 분자 중에 복수의 당 물질이 함유되는 경우, 그들이 동일하거나, 서로 상이해도 되는 수식 펩티드, 또는, 그 약학상 허용되는 염.
  5. 제 1 항에 있어서,
    당 물질이 4 개 이상의 단당류가 글리코시드 결합한 당 사슬인 것을 특징으로 하는 수식 펩티드, 또는, 그 약리학상 허용되는 염.
  6. 제 5 항에 있어서,
    당 물질이, 당 단백질에서 유래하는, N 결합형 당 사슬, O 결합형 당 사슬, 또는 그들의 개변 당 사슬인 것을 특징으로 하는 수식 펩티드, 또는, 그 약리학상 허용되는 염.
  7. 제 6 항에 있어서,
    당 물질이, 이하의 식으로 나타내는 당 사슬 구조를 포함하는, N 결합형 당 사슬 또는 그 환원 말단 개변 당 사슬인 것을 특징으로 하는 수식 펩티드, 또는, 그 약리학상 허용되는 염.
    [화학식 1]
    Figure pct00214

    (식 중, Gxx 는 GlcNAc, Glc 또는 Man 이며 (상기 구조로 이루어지는 당 사슬을, 이하, GXX 의 종류에 따라 각각 「AG(5)」, 「AG(5-Glc)」, 및, 「AG(5-Man)」 이라고 한다), “O/N-L” 은 O 글리코시드 결합 또는 N 글리코시드 결합에 의해 링커 구조 또는 hANP 펩티드와 결합하는 것을 나타낸다)
  8. 제 7 항에 있어서,
    당 물질이 이하의 식으로 나타내는 당 사슬 구조를 포함하는 당 사슬인 수식 펩티드, 또는, 그 약리학상 허용되는 염,
    [화학식 2]
    Figure pct00215

    (식 중, Gxx 는 GlcNAc, Glc 또는 Man (상기 구조로 이루어지는 당 사슬을, 이하, GXX 의 종류에 따라 각각 「AG(7)」, 「AG(7-Glc)」, 및, 「AG(7-Man)」 이라고 한다) 이며, “O/N-L” 은 O 글리코시드 결합 또는 N 글리코시드 결합에 의해 링커 구조 또는 hANP 펩티드와 결합하는 것을 나타낸다)
  9. 제 8 항에 있어서,
    당 물질이 이하의 식으로 나타내는 당 사슬 구조를 포함하는 당 사슬인 수식 펩티드, 또는, 그 약리학상 허용되는 염,
    [화학식 3]
    Figure pct00216

    (식 중, Gxx 는 GlcNAc, Glc 또는 Man 이며 (상기 구조로 이루어지는 당 사슬을, 이하, GXX 의 종류에 따라 각각 「AG(9)」, 「AG(9-Glc)」, 및, 「AG(9-Man)」 이라고 한다), “O/N-L” 은 O 글리코시드 결합 또는 N 글리코시드 결합에 의해 링커 구조 또는 hANP 펩티드와 결합하는 것을 나타낸다)
  10. 제 9 항에 있어서,
    당 물질이 이하의 식으로 나타내는 당 사슬 구조를 포함하는 당 사슬인 수식 펩티드, 또는, 그 약리학상 허용되는 염,
    [화학식 4]
    Figure pct00217

    (식 중, Gxx 는 GlcNAc, Glc 또는 Man 이며 (상기 구조로 이루어지는 당 사슬을, 이하, GXX 의 종류에 따라 각각 「SG」, 「SG(Glc)」, 및, 「SG(Man)」 이라고 한다), “O/N-L” 은 O 글리코시드 결합 또는 N 글리코시드 결합에 의해 링커 구조 또는 hANP 펩티드와 결합하는 것을 나타낸다)
  11. 제 7 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    당 물질에 있어서, Gxx 가 GlcNAc 인 수식 펩티드, 또는, 그 약리학상 허용되는 염.
  12. 제 11 항에 있어서,
    당 물질이 SG 인 수식 펩티드, 또는, 그 약리학상 허용되는 염.
  13. 제 1 항에 있어서,
    1 개의 hANP 펩티드에 대해, 10 개 이하의 당 물질이 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 수식 펩티드, 또는, 그 약리학상 허용되는 염.
  14. 제 1 항에 있어서,
    1 개의 hANP 펩티드에 대해, 1 개, 2 개, 또는, 3 개의 당 물질이 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 수식 펩티드, 또는, 그 약리학상 허용되는 염.
  15. 제 1 항에 있어서,
    1 분자 중에, 2 가 이상의 hANP 펩티드를 함유하는 수식 펩티드, 또는, 그 약리학상 허용되는 염.
  16. 제 3 항에 있어서,
    hANP 펩티드와 당 물질이 링커 구조를 개재하여 연결되어 있고, 링커 구조가 3 원자 이상의 연결 사슬을 가지며, 적어도 한 지점에서 당 물질의 환원 말단과 글리코시드 결합하고, 또한, 적어도 한 지점에서 hANP 펩티드와 결합하는 화학 구조인 수식 펩티드, 또는, 그 약리학상 허용되는 염.
  17. 제 16 항에 있어서,
    당 물질이 hANP 펩티드의 N 말단, C 말단 중 어느 일방, 또는, 그 양방에 링커 구조를 개재하여 연결되어 있는 수식 펩티드, 또는, 그 약리학상 허용되는 염.
  18. 제 17 항에 있어서,
    링커 구조가 15 원자 이하의 연결 사슬을 갖는 구조인 수식 펩티드, 또는, 그 약리학상 허용되는 염.
  19. 제 18 항에 있어서,
    SG-hANP(1-28) (화합물 2-1), hANP(1-28)-SG (화합물 2-2), SG-hANP(1-28)-SG (화합물 2-7), AG(9)-hANP(1-28) (화합물 2-10), SG-triazole-hANP(1-28) (화합물 2-12), SG-thioacetamide-hANP(1-28) (화합물 2-25), AG(5)-hANP(1-28) (화합물 2-26),
    또는, 이들의 수식 펩티드에 있어서, 당 물질이 SG, SG(Glc), SG(Man), AG(5), AG(5-Glc), AG(5-Man), AG(7), AG(7-Glc), AG(7-Man), AG(9), AG(9-Glc), AG(9-Man) 혹은 GlcNAc 로 치환되고, 및/혹은, hANP 펩티드가 hANP(1-28), hANP(2-28), hANP(3-28), hANP(1-27), hANP(2-27) 혹은 hANP(3-27) 로 치환된 것인 수식 펩티드, 또는, 그 약리학상 허용되는 염.
  20. 제 16 항에 있어서,
    링커 구조가 폴리옥시알킬렌 사슬, 아미노산, 및, 2 이상의 아미노산으로 이루어지는 올리고펩티드 사슬 중 적어도 하나의 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 수식 펩티드, 또는, 그 약리학상 허용되는 염.
  21. 제 20 항에 있어서,
    링커 구조에 포함되는 폴리옥시알킬렌 사슬, 아미노산 및/또는 올리고펩티드 사슬이 hANP 펩티드의 N 말단 및/또는 C 말단과 아미드 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 수식 펩티드.
  22. 제 21 항에 있어서,
    폴리옥시알킬렌 사슬이 PEG 인 수식 펩티드, 또는, 그 약리학상 허용되는 염.
  23. 제 21 항에 있어서,
    SG-PEG(3)-(SG-)Asn-hANP(1-28) (화합물 2-16), AG(9)-(AG(9)-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28) (화합물 2-21), AG(7)-(AG(7)-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28) (화합물 2-22), SG-PEG(3)-hANP(1-28)-PEG(3)-SG (화합물 2-24), SG-(SG-)Asn-PEG(11)-hANP(1-28) (화합물 2-27), SG-(SG-)Asn-PEG(11)-PEG(11)-hANP(1-28) (화합물 2-28), SG-PEG(3)-hANP(1-28) (화합물 2-29), SG-PEG(11)-hANP(1-28) (화합물 2-30), SG-*(SG-)Gln-Mal-PEG(3)-hANP(1-28) (화합물 2-31) SG-(SG-)Gln-PEG(3)-Mal-hANP(1-28) (화합물 2-32), SG-(SG-)Asn-(Ser-Gly)3-hANP(1-28) (화합물 2-36) SG-(SG-)Asn-Gly6-hANP(1-28) (화합물 2-37),
    또는, 이들의 수식 펩티드에 있어서, 당 물질이 SG, SG(Glc), SG(Man), AG(5), AG(5-Glc), AG(5-Man), AG(7), AG(7-Glc), AG(7-Man), AG(9), AG(9-Glc), AG(9-Man) 혹은 GlcNAc 로 치환되고, 및/혹은, hANP 펩티드가 hANP(1-28), hANP(2-28), hANP(3-28), hANP(1-27), hANP(2-27) 혹은 hANP(3-27) 로 치환된 것인 수식 펩티드, 또는, 그 약리학상 허용되는 염.
  24. 제 20 항에 있어서,
    링커 구조가 아미노기 측사슬 아미노산, SH 측사슬 아미노산, 카르복실기 측사슬 아미노산, 수산기 측사슬 아미노산 또는 페놀 측사슬 아미노산 중 적어도 하나의 관능기 측사슬 아미노산을 포함하고, 당해 관능기 측사슬 아미노산의 측사슬에 있어서, 당 물질 또는 hANP 펩티드와 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 수식 펩티드, 또는, 그 약리학상 허용되는 염.
  25. 제 24 항에 있어서,
    링커 구조가 적어도 하나의 아미노기 측사슬 아미노산을 포함하고, 당 물질이 당해 아미노기 측사슬 아미노산의 측사슬에 연결되어 있고, 이하의 일반식 (C) 의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 수식 펩티드, 또는, 그 약리학상 허용되는 염,
    [화학식 5]
    Figure pct00218

    (식 중, GLY 는 당 물질을 나타내고, Lg 는 링커 구조 중의 당 사슬측 구조를 나타내고, 직사슬 또는 2 이상으로 분기해도 된다. GLY 와 L 은 O- 또는 N-글리코시드 결합으로 결합되어 있고, Lg 가 분기하고 있는 경우, 분기 말단과 동수의 GLY 를 연결할 수 있다. N-(AA) 는 아미노기 측사슬 아미노산의 측사슬의 아미노기에서 유래하는 질소 원자를 나타낸다).
  26. 제 25 항에 있어서,
    아미노기 측사슬 아미노산의 측사슬 아미노기 및 α 아미노기가 다른 아미노산의 α 카르복실기와 아미드 결합을 형성하고 있는 것을 특징으로 하는 수식 펩티드, 또는, 그 약리학상 허용되는 염.
  27. 제 25 항 또는 제 26 항에 있어서,
    아미노기 측사슬 아미노산이 Lys 인 수식 펩티드, 또는, 그 약리학상 허용되는 염.
  28. 제 27 항에 있어서,
    SG-(SG-)Lys-Gly-hANP(1-28) (화합물 2-14), [(SG-)Cys-Gly]3-hANP(1-28) (화합물 2-15), SG-Mal-(SG-Mal-)Lys-[SG-Mal-(SG-Mal)Lys-]Lys-PEG(3)-hANP(1-28) (화합물 2-19), [SG2-Mal-(SG2-Mal-)Lys-[SG2-Mal-(SG2-Mal-)-Lys-]Lys-PEG(3)-hANP(1-28) (화합물 2-20), SG-Mal-(SG-Mal-)Lys-hANP(1-28) (화합물 2-33), SG-thioacetamide-(SG-thioacetamide-)Lys-PEG-(3)-hANP(1-28) (화합물 2-34), SG-(SG-)Lys-PEG(3)-hANP(1-28) (화합물 2-35),
    또는, 이들의 수식 펩티드에 있어서, 당 물질이 SG, SG(Glc), SG(Man), AG(5), AG(5-Glc), AG(5-Man), AG(7), AG(7-Glc), AG(7-Man), AG(9), AG(9-Glc), AG(9-Man) 혹은 GlcNAc 로 치환되고, 및/혹은, hANP 펩티드가 hANP(1-28), hANP(2-28), hANP(3-28), hANP(1-27), hANP(2-27) 혹은 hANP(3-27) 로 치환된 것인 수식 펩티드, 또는, 그 약리학상 허용되는 염.
  29. 제 24 항에 있어서,
    링커 구조가 적어도 하나의 SH 기 측사슬 아미노산을 포함하고, 당 물질이 당해 아미노기 측사슬 아미노산의 측사슬에 연결되어 있고, 이하의 일반식의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 수식 펩티드, 또는, 그 약리학상 허용되는 염,
    [화학식 6]
    Figure pct00219

    (식 중, GLY 는 당 물질을 나타내고, Lg 는 링커 구조 중의 당 사슬측 구조를 나타내고, 직사슬 또는 2 이상으로 분기해도 된다. GLY 와 L 은 O- 또는 N-글리코시드 결합으로 결합되어 있고, Lg 가 분기하고 있는 경우, 분기 말단과 동수의 GLY 를 연결할 수 있다. S 는 SH 기 측사슬 아미노산의 측사슬 SH 기에서 유래하는 황 원자를 나타낸다).
  30. 제 29 항에 있어서,
    SH 기 측사슬 아미노산이 Cys 인 수식 펩티드, 또는, 그 약리학상 허용되는 염.
  31. 제 30 항에 있어서,
    [(SG-)Cys-Gly]5-hANP(1-28) (화합물 2-17), [(SG2-)Cys-Gly]5-hANP(1-28) (화합물 2-18),
    SG-Mal-(SG-Mal-)Lys-[SG-Mal-(SG-Mal-)Lys-]Lys-PEG(11)-hANP(1-28) (화합물 2-23),
    또는, 이들의 수식 펩티드에 있어서, 당 물질이 SG, SG(Glc), SG(Man), AG(5), AG(5-Glc), AG(5-Man), AG(7), AG(7-Glc), AG(7-Man), AG(9), AG(9-Glc), AG(9-Man) 혹은 GlcNAc 로 치환되고, 및/혹은, hANP 펩티드가 hANP(1-28), hANP(2-28), hANP(3-28), hANP(1-27), hANP(2-27) 혹은 hANP(3-27) 로 치환된 것인 수식 펩티드, 또는, 그 약리학상 허용되는 염.
  32. 제 24 항에 있어서,
    링커 구조가 적어도 하나의 카르복실기 측사슬 아미노산을 포함하고, 당 물질이 당해 카르복실산 측사슬 아미노산의 측사슬에 연결되어 있고, 이하의 일반식의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 수식 펩티드, 또는, 그 약리학상 허용되는 염,
    [화학식 7]
    Figure pct00220

    (식 중, GLY 는 당 물질을 나타내고, Lg 는 링커 구조 중의 당 사슬측 구조를 나타내고, 직사슬 또는 2 이상으로 분기해도 된다. GLY 와 L 은 O- 또는 N-글리코시드 결합으로 결합되어 있고, Lg 가 분기하고 있는 경우, 분기 말단과 동수의 GLY 를 연결할 수 있다. CO 는 카르복실산 측사슬 아미노산의 측사슬에서 유래하는 CO 를 나타낸다).
  33. 제 32 항에 있어서,
    당 물질이, 카르복실기 측사슬 아미노산의, 측사슬 카르복실기 및 α 카르복실기의 양방에, N 글리코시드 결합되어 있고, α 아미노기를 개재하여 다른 링커 구조 또는 hANP 펩티드와 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 수식 펩티드.
  34. 제 32 항 또는 제 33 항에 있어서,
    카르복실산기 측사슬 아미노산이 Glu, Gln, ASp 또는 Asn 인 수식 펩티드, 또는, 그 약리학상 허용되는 염.
  35. 제 34 항에 있어서,
    (SG-)Asn-hANP(1-28) (화합물 2-3), (SG-)Asn-hANP(2-28) (화합물 2-4), (SG-)Asn-hANP(3-28) (화합물 2-8), SG-(SG-)Asn-hANP(1-28) (화합물 2-9), SG-(SG-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28) (화합물 2-13) 또는, 이들의 수식 펩티드에 있어서, 당 물질이 SG, SG(Glc), SG(Man), AG(5), AG(5-Glc), AG(5-Man), AG(7), AG(7-Glc), AG(7-Man), AG(9), AG(9-Glc), AG(9-Man) 혹은 GlcNAc 로 치환되고, 및/혹은, hANP 펩티드가 hANP(1-28), hANP(2-28), hANP(3-28), hANP(1-27), hANP(2-27) 혹은 hANP(3-27) 로 치환된 것인 수식 펩티드, 또는, 그 약리학상 허용되는 염.
  36. 제 24 항에 있어서,
    링커 구조가 적어도 하나의 페놀 측사슬 아미노산을 포함하고, 당 물질이 당해 페놀 측사슬 아미노산의 측사슬에 연결되어 있고, 이하의 일반식의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 수식 펩티드, 또는, 그 약리학상 허용되는 염,
    [화학식 8]
    Figure pct00221

    (식 중, GLY 는 당 물질을 나타내고, Lg 는 링커 구조 중의 당 사슬측 구조를 나타내고, 직사슬 또는 2 이상으로 분기해도 된다. GLY 와 L 은 O- 또는 N-글리코시드 결합으로 결합되어 있고, Lg 가 분기하고 있는 경우, 분기 말단과 동수의 GLY 를 연결할 수 있다. 페놀기는 페놀기 측사슬 아미노산의 측사슬에서 유래하는 페놀기를 나타낸다).
  37. 제 36 항에 있어서,
    페놀기 측사슬 아미노산이 Tyr 인 수식 펩티드, 또는, 그 약리학상 허용되는 염.
  38. 제 37 항에 있어서,
    hANP(1-27)-(SG-)Tyr (화합물 2-6) 또는, 이들의 수식 펩티드에 있어서, 당 물질이 SG, SG(Glc), SG(Man), AG(5), AG(5-Glc), AG(5-Man), AG(7), AG(7-Glc), AG(7-Man), AG(9), AG(9-Glc), AG(9-Man) 혹은 GlcNAc 로 치환되고, 및/혹은, hANP 펩티드가 hANP(1-28), hANP(2-28), hANP(3-28), hANP(1-27), hANP(2-27) 혹은 hANP(3-27) 로 치환된 것인 수식 펩티드, 또는, 그 약리학상 허용되는 염.
  39. 제 24 항에 있어서,
    링커 구조가 적어도 하나의 수산기 측사슬 아미노산을 포함하고, 당 물질이 당해 수산기 측사슬 아미노산의 측사슬에 O-글리코시드 결합되어 있는, 이하의 일반식의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 수식 펩티드, 또는, 그 약리학상 허용되는 염,
    [화학식 9]
    Figure pct00222

    (식 중, GLY 는 당 물질을 나타내고, O 는 수산기 측사슬 아미노산의 측사슬 수산기에서 유래하는 산소 원자를 나타낸다).
  40. 제 39 항에 있어서,
    수산기 측사슬 아미노산이 Ser 인 수식 펩티드, 또는, 그 약리학상 허용되는 염.
  41. 제 40 항에 있어서,
    (SG-)Ser-hANP(2-28) (화합물 2-5)
    또는, 이들의 수식 펩티드에 있어서, 당 물질이 SG, SG(Glc), SG(Man), AG(5), AG(5-Glc), AG(5-Man), AG(7), AG(7-Glc), AG(7-Man), AG(9), AG(9-Glc), AG(9-Man) 혹은 GlcNAc 로 치환되고, 및/혹은, hANP 펩티드가 hANP(1-28), hANP(2-28), hANP(3-28), hANP(1-27), hANP(2-27) 혹은 hANP(3-27) 로 치환된 것인 수식 펩티드, 또는, 그 약리학상 허용되는 염.
  42. 제 16 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서,
    당 물질로서 1 또는 2 개의 SG, hANP 펩티드로서 1 개의 hANP(1-28) (배열 번호 1) 을 가지며, SG 가 hANP(1-28) 의 N 말단에, 10 원자 이하의 연결 사슬을 갖는 링커 구조를 개재하여 연결되어 있는 수식 펩티드, 또는, 그 약리학상 허용되는 염.
  43. 제 1 항에 있어서,
    하기의 화합물 2-1, 2-3, 2-10, 2-11, 2-12, 2-13, 2-14, 2-15, 2-16, 2-25, 2-26, 2-27, 2-29, 또는, 2-30 의 식으로 나타내는 구조로 이루어지는 수식 펩티드, 또는, 그 약리학상 허용되는 염,
    [화학식 10]
    Figure pct00223

    [화학식 11]

    [화학식 12]
    Figure pct00225

    [화학식 13]
    Figure pct00226

    [화학식 14]
    Figure pct00227

    [화학식 15]
    Figure pct00228

    (화합물 2-13)
    [화학식 16]
    Figure pct00229

    (화합물 2-14)
    [화학식 17]
    Figure pct00230

    (화합물 2-15)
    [화학식 18]
    Figure pct00231

    (화합물 2-16)
    [화학식 19]
    Figure pct00232

    (화합물 2-25)
    [화학식 20]
    Figure pct00233

    (화합물 2-26)
    [화학식 21]
    Figure pct00234

    (화합물 2-27)
    [화학식 22]
    Figure pct00235

    (화합물 2-29)
    [화학식 23]
    Figure pct00236

    (화합물 2-30)
    (상기 식에 있어서, hANP 는 배열 번호 1 의 아미노산 배열로 이루어지는 hANP(1-28) 이며, 당해 아미노산 배열의 N 말단에 있어서, 링커 구조와 아미드 결합되어 있다).
  44. 제 42 항 또는 제 43 항에 있어서,
    약학상 허용되는 염이 트리플루오로아세트산염 혹은 아세트산염인 수식 펩티드의 염.
  45. 제 3 항에 있어서,
    당 물질이 hANP 펩티드의 아미노산 측사슬에 연결되어 있고, 당해 연결된 아미노산이 hANP 펩티드에 포함되는 배열 번호 1 의 아미노산 번호 7 ∼ 23 의 아미노산 이외의 아미노산인 것을 특징으로 하는 수식 펩티드, 또는, 그 약리학상 허용되는 염.
  46. 제 1 항에 있어서,
    수식되어 있지 않은 hANP(1-28) 과 비교해서 연장된 혈중 지속 시간을 나타내고, 또한, cGMP 상승 활성을 유지하는 것을 특징으로 하는 수식 펩티드, 또는, 그 약리학상 허용되는 염.
  47. 제 1 항에 있어서,
    중성 엔도펩티다아제에 의한 hANP 펩티드의 분해에 대해 저항성을 갖는 것을 특징으로 하는 수식 펩티드, 또는, 그 약리학상 허용되는 염.
  48. 제 1 항에 있어서,
    수식되어 있지 않은 hANP(1-28) 과 비교해서, 3 배 이상의 수용성을 나타내는 것을 특징으로 하는 수식 펩티드, 또는, 그 약리학상 허용되는 염.
  49. 제 1 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 기재된 수식 펩티드 또는 그 약학상 허용되는 염을 함유하는 의약.
  50. 제 48 항에 있어서,
    순환기 질환의 치료제 또는 경감제인 의약.
  51. 유효량의 제 1 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항의 수식 펩티드 또는 그 약학상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는 순환기 질환을 치료 또는 경감시키는 방법.
  52. hANP 펩티드, 당 물질, 및 필요에 따라 링커 분자, 피전이 화합물을 연결시키는 공정을 포함하는, 제 1 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 기재된 수식 펩티드의 제조 방법.
  53. 제 52 항에 있어서,
    Endo-M 또는 그 변이 효소를 사용하여, GlcNAc 화합물, Glc 화합물 또는 Man 화합물에 당 사슬을 전이시키는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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