WO2009139413A1 - サイトカイン誘導キラー細胞含有細胞集団の製造方法 - Google Patents

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WO2009139413A1
WO2009139413A1 PCT/JP2009/058917 JP2009058917W WO2009139413A1 WO 2009139413 A1 WO2009139413 A1 WO 2009139413A1 JP 2009058917 W JP2009058917 W JP 2009058917W WO 2009139413 A1 WO2009139413 A1 WO 2009139413A1
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cells
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culture
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希山 ▲赤▼
秀宝 任
津浦 于
慧 李
水 曹
秀梅 安
郁之進 加藤
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タカラバイオ株式会社
天津医科大学附属▲中▼瘤医院
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Definitions

  • the present invention relates to a cytokine-inducing killer (CIK) cell-containing cell population having high efficacy in adoptive immunotherapy, a method for producing the cell population, and the like.
  • CIK cytokine-inducing killer
  • the proliferation of regulatory T cells is suppressed, and various cell proliferative properties including hematopoietic cells and solid tissue tumors in addition to early and late cancers. Can be used to treat disease.
  • Such therapy includes, for example, adoptive immunotherapy in which immune-related cells taken out of the body are cultured to increase the number of cells, and / or the activity related to the therapeutic effect is enhanced and transplanted to a patient.
  • lymphokine-activated killer (LAK) cells As cells used as effector cells in adoptive immunotherapy, lymphokine-activated killer (LAK) cells, tumor-infiltrating lymphocytes (TIL), and cytokine-induced killer (CIK) ) Cells are known.
  • LAK lymphokine-activated killer
  • TIL tumor-infiltrating lymphocytes
  • CIK cytokine-induced killer
  • LAK cells are a cell population that can be obtained by growing lymphocytes in the presence of interleukin (IL) -2, and have the property of lysing tumor cells but not normal cells.
  • IL interleukin
  • a method of coexisting an anti-CD3 antibody together with IL-2 during culture has been developed.
  • TIL is a T cell infiltrating a tumor tissue, and has a tumor antigen specificity remarkably higher than that of a LAK cell.
  • the cells can also be grown outside the body and used for therapy.
  • TIL needs to be obtained by extracting the tumor tissue of the patient, it has a problem that the collection operation is complicated and the number of cells obtained is small.
  • CIK cells are prepared from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by culturing in the presence of interferon (IFN) - ⁇ , anti-CD3 antibody, and IL-2.
  • CIK cells are characterized as a cell population containing CD3-positive and CD56-positive cells, a rare cell population in PBMC that can be preferentially grown in the absence of target cells .
  • CIK cells exhibit cytotoxic activity against tumor cells superior to LAK cells in vivo (for example, Non-Patent Document 1).
  • Fibronectin is a huge glycoprotein with a molecular weight of 250,000 present in animal blood, on the surface of cultured cells, and in the extracellular matrix of tissues, and is known to have a variety of functions.
  • the domain structure is divided into seven (see FIG. 1).
  • the amino acid sequence includes three types of similar sequences, and the whole is constituted by repetition of these sequences. Three similar sequences are called type I, type II and type III, respectively.
  • type III is composed of 71 to 96 amino acid residues, and the concordance rate of these amino acid residues is 17 to 40%.
  • Non-patent Document 2 Several types of fibronectin fragments have been produced by recombinant DNA technology, and some of them are expected to have cancer metastasis inhibitory activity. Furthermore, it has been reported that a fibronectin fragment having a heparin-binding domain has a function of promoting infection of retrovirus cells (Non-patent Document 3).
  • lymphokine-activated killer cells obtained by in vitro culture from cytotoxic T cells (CTL) or peripheral blood lymphocytes, etc. induced by the action of IL-2 and anti-CD3 antibodies.
  • CTL cytotoxic T cells
  • IL-2 and anti-CD3 antibodies Use fibronectin and its fragments for questions such as how to maintain cytotoxic activity when antigen-specific CTLs induced outside the body are expanded and how efficiently lymphocytes can be expanded outside the body.
  • the effects of have been studied (for example, Patent Documents 1 to 3).
  • An object of the present invention is to provide a method for expanding a cell population for cancer treatment with a low content of unnecessary cell population for the production of CIK cells, which is said to be a suitable cell population for adoptive immunotherapy. It is in.
  • the first invention of the present invention includes a step of culturing a cell population containing cells that can differentiate into cytokine-induced killer cells in the presence of a fragment of fibronectin
  • the present invention relates to a method for producing a cell population containing CIK cells.
  • a method for producing a cell population containing CIK cells that is cultured in the presence of a fragment of fibronectin containing a region selected from: A VLA-4 binding region, VLA-5 binding region and heparin binding region.
  • a preferred example of the fibronectin fragment used in the first invention is a fibronectin fragment comprising an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1, 2, and 5.
  • the first invention there is provided a method for producing a cell population containing CIK cells, wherein the culture in the presence of a fibronectin fragment is carried out in the presence of CD3 ligand, interferon- ⁇ and interleukin-2.
  • the CD3 ligand is not limited as long as it can be used in the present invention, but is preferably carried out using an anti-CD3 antibody.
  • the second invention of the present invention relates to a cell population containing CIK cells obtainable by the method of the first invention of the present invention.
  • the third invention of the present invention relates to a medicament containing the cell population of the second invention of the present invention as an active ingredient.
  • the fourth invention of the present invention relates to a method for treating or preventing a disease comprising the step of administering an effective amount of the cell population of the second invention of the present invention to a subject.
  • the disease may be any disease that is sensitive to the cell population of the second invention of the present invention.
  • the cell population of the second invention may be a cell population derived from a subject (patient) who has a disease requiring treatment or prevention, and may be a cell population derived from a donor different from the subject in some cases.
  • the fifth invention of the present invention relates to the use of the cell population of the second invention for the manufacture of a medicament.
  • the production method of the present invention provides a production method for expanding and culturing a cell population containing a high amount of CIK cells having high cytotoxic activity in large quantities.
  • a high-quality cell population obtained in a large amount by the production method exhibits a high therapeutic effect in vivo, and thus is extremely useful for treatment of diseases by cell medicine.
  • the present invention has found that by culturing PBMC in the presence of a fibronectin fragment, the cell population obtained contains cells expressing both CD3 and CD56 molecules at a high ratio on the cell surface. It has come to be completed.
  • the present invention will be specifically described below.
  • Fragment of fibronectin used in the present invention The fibronectin fragment described in the present specification is obtained from nature (such as those obtained by fragmenting natural fibronectin by enzymatic digestion), or recombinant DNA. Any of those manufactured by technology may be used. Fibronectin fragments can be obtained, for example, from Luoslati E. [J. Biol. Chem. 256, No. 14, pp. 7277-7281 (1981)], can be produced in substantially pure form from naturally occurring substances.
  • the substantially pure fibronectin fragments described herein mean that they are essentially free of other proteins that are naturally present with fibronectin.
  • a single molecular species may be used, or a plurality of molecular species may be mixed and used.
  • the useful information regarding the preparation of the fibronectin fragment that can be used in the present invention and the fragment includes corn bullet A. R. [EMBO J. et al. Vol. 4, No. 7, 1755-1759 (1985)], and Sekiguchi K .; [Biochemistry, Vol. 25, No. 17, 4936-4941 (1986)] and the like. Further, the nucleic acid sequence encoding fibronectin or the amino acid sequence of fibronectin is Genbank Accession No. NM_002026 and NP_002017.
  • a fibronectin fragment having cell adhesion activity and / or heparin binding activity can be preferably used.
  • fibronectin there is a region having an activity of binding to integrin on the cell surface. Examples of the region include a VLA (very late antigen) -4 or VLA-5 binding region.
  • a region called IIICS exists at a site near the C-terminal side of fibronectin.
  • CS-1 a region consisting of 25 amino acids
  • This region shows binding activity to VLA-4.
  • the amino acid sequence of the CS-1 region is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • fibronectin has a repetitive sequence called type III, and the 10th type repetitive sequence from the N-terminal side has a cell binding region.
  • the amino acid sequence of the 10th type III repeat sequence is shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • the sequence that plays a central role in binding to VLA-5 in the above sequence is 4 amino acids of Arg-Gly-Asp-Ser (RGDS) shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.
  • C-274 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing is a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and is a recombinant fibronectin fragment having strong cell adhesion activity.
  • fibronectin has an activity of binding to heparin.
  • the heparin-binding region of fibronectin corresponds to the 12th to 14th positions from the N-terminal side of the type III repeat sequence.
  • H-271 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing is a recombinant fibronectin fragment consisting of this heparin binding region.
  • a fragment in which two or more of these regions are linked directly or via an appropriate linker can be used.
  • the regions derived from fibronectin contained in the fragment may be the same or different.
  • H-296 amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 in the sequence listing
  • VLA-4 binding region and heparin binding region VLA-5 binding region
  • CH-271 containing the heparin binding region
  • VLA-4 binding region CH-296 containing the VLA-5 binding region and heparin binding region (of the sequence listing)
  • the fragment used in the present invention is a fragment having a function equivalent to that of the fragment containing at least a part of the amino acid sequence of natural fibronectin exemplified above. It may consist of a polypeptide having an amino acid sequence having substitution, deletion, insertion or addition of one or several amino acids in the amino acid sequence of the constituent polypeptide. Further, for example, one obtained by deleting one or two type III repeat sequences from C-274 or H-271 may be used.
  • the cell adhesion activity can be examined by assaying the binding between a fragment (its cell binding domain) used in the present invention and a cell by a known method.
  • Williams D.C. A. [Nature, Vol. 352, pp. 438-441 (1991)].
  • This method is a method for measuring the binding of cells to a fragment immobilized on a culture plate.
  • the heparin binding activity can be examined by assaying the binding of the fragment (its heparin binding domain) used in the present invention to heparin using a known method.
  • the above Williams D.C. A. In these methods, by using heparin, for example, labeled heparin, instead of cells, the binding between the fragment and heparin can be evaluated in the same manner.
  • the use of the recombinant fibronectin fragment in the present invention is preferable from the standpoint of safety that it is easy to obtain and handle, the uniformity of its quality, and the low risk of contamination with viruses and the like.
  • the molecular weight of the fibronectin fragment used in the present invention is not particularly limited, but is preferably 1 to 200 kDa, more preferably 5 to 190 kDa, and further preferably 10 to 180 kDa.
  • the molecular weight can be measured, for example, by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • the present invention is a method for producing CIK cells, ie, cell populations that are highly enriched in subcell populations characterized as CD3 positive and CD56 positive.
  • the method of the present invention is characterized by comprising culturing a cell population containing cells capable of differentiating into CIK cells in the presence of the fibronectin fragment described above.
  • the cell population containing cells that can differentiate into CIK cells used in the production method of the present invention is a cell population that can be obtained from peripheral blood, bone marrow, umbilical cord blood, or the like, or separated from these materials.
  • a population of blood cells is exemplified.
  • PBMC is used in the present invention. Any of these cell populations collected directly from a living body or stored frozen can be used in the present invention.
  • the concentration of the fibronectin fragment is not particularly limited. For example, 0.001 to 500 ⁇ g / mL, particularly 0.01 to 500 ⁇ g / mL is preferable.
  • an appropriate solid phase for example, cell culture equipment such as a petri dish, flask or bag (including culture vessels; open and closed) Alternatively, it may be used by immobilizing it on a cell culture carrier such as beads, a membrane or a slide glass.
  • the material of the solid phase is not particularly limited as long as it can be used for cell culture.
  • the amount of fibronectin fragment to be immobilized is selected so that when the above equipment or carrier is subjected to culture, the ratio is the same as the desired concentration when the component is dissolved in the medium. If an effect is acquired, it will not specifically limit.
  • the method for immobilizing the fibronectin fragment on the solid phase is not particularly limited.
  • the fibronectin fragment can be immobilized by bringing a fragment dissolved in an appropriate buffer into contact with the solid phase.
  • the fibronectin fragment can also be immobilized by the methods described in WO 97/18318 pamphlet and WO 00/09168 pamphlet.
  • culturing in the presence of a fibronectin fragment is performed in the presence of a CD3 ligand.
  • the CD3 ligand is not particularly limited as long as it is a substance having a binding activity to CD3.
  • an anti-CD3 antibody is exemplified, and an anti-CD3 monoclonal antibody is particularly preferably exemplified.
  • OKT3 J. Immunol. 124, No. 6, 2708-2713 (1980)].
  • concentration of the CD3 ligand in the medium is not particularly limited.
  • CD3 ligand can also be used by immobilizing it on cell culture equipment or cell culture carrier by the same operation as fibronectin fragment. If the fibronectin fragment and the CD3 ligand are immobilized on a solid phase, the above components and the obtained cell population can be easily separated by simply separating the cell and the solid phase after the end of the culture. It is possible to prevent the components from being mixed in.
  • the medium used in the method for producing a CIK cell-containing cell population of the present invention is not particularly limited, and a known medium that can be used for expansion culture of lymphocytes can be used.
  • a commercially available medium is appropriately selected. Can be used.
  • These media may contain cytokines, appropriate proteins, or other components in addition to the original components.
  • a medium containing IFN- ⁇ and IL-2 is used in the present invention.
  • the concentration of IFN- ⁇ in the medium is not particularly limited, but is 50 to 10,000 U / mL, and more preferably 100 to 5000 U / mL.
  • the concentration of IL-2 in the medium is not limited, but is 10 to 5000 U / mL, preferably 50 to 2000 U / mL.
  • cytokines such as IL-1 ⁇ , IL-7 or IL-12 may be added to the medium.
  • the concentration of the component in the medium is not particularly limited as long as a desired effect is obtained.
  • the amount added to these media is not particularly limited, but is exemplified by more than 0% to 20% by volume, and the amount of serum or plasma used can be changed depending on the culture stage. For example, the serum or plasma concentration can be decreased in stages and used.
  • the origin of serum or plasma may be either self (meaning that the origin is the same as the cell to be cultured) or non-self (meaning that the origin is different from the cell to be cultured). From the standpoint of the above, self-derived ones are preferable.
  • An isolated serum component such as human serum albumin may also be added.
  • the production of the CIK cell-containing cell population of the present invention is carried out using the above-mentioned various components or medium in addition to the fibronectin fragment.
  • the number of cells at the start of the culture used in the present invention is not particularly limited, but is preferably 1 ⁇ 10 4 cells / mL to 1 ⁇ 10 8 cells / mL, more preferably 1 ⁇ 10 5 cells / mL. mL to 5 ⁇ 10 7 cells / mL are exemplified.
  • culture conditions The conditions used for normal cell culture can be used. For example, it is possible to 37 ° C., and cultured under conditions, such as 5% CO 2.
  • operations such as diluting a cell culture solution by adding a fresh medium at an appropriate time interval, exchanging the medium, or exchanging equipment for cell culture can be performed.
  • cell culture equipment such as a petri dish, a flask, a bag, a large culture tank, or a bioreactor can be used.
  • bag a CO 2 gas permeable bag for cell culture is suitable.
  • a large culture tank may be used.
  • the culture can be carried out in either an open system or a closed system, but the culture is preferably carried out in a closed system.
  • the culture period in the method for producing a CIK cell-containing cell population of the present invention is not particularly limited.
  • the total number of days is 4 to 30 days, preferably 6 to 25 days.
  • the culture in the presence of the fibronectin fragment may be the entire period during the culture period, or may be an arbitrary partial period. That is, any cell culture step including a culture step in the presence of a fibronectin fragment is included in the present invention. It is particularly preferable to carry out the culture in the presence of the fibronectin fragment at least at an initial stage during the entire culture period, and it is more preferable to start the culture in the presence of the fibronectin fragment.
  • the culture in the presence of the active ingredient of the present invention is preferably carried out for at least 1 day, more preferably 2 days or more from the beginning of the culture.
  • CD3 ligand is used at the time of culturing, there is no particular limitation on the use period, but for example, CD3 ligand is allowed to coexist when fibronectin fragment is used.
  • the fibronectin fragment and the CD3 ligand are used only in the initial stage during the entire culture period.
  • the culture is carried out for the coexistence of the fibronectin fragment and the CD3 ligand from the start of the culture to the 7th day, preferably from the start of the culture to the 5th day.
  • CIK cell-containing cell population is produced by continuing culture in the absence of both components.
  • the production method of the present invention may further include a step of separating a CD3 positive and CD56 positive cell population from the cell population obtained by the above method. Separation can be performed by a known method using, for example, a cell sorter, a magnetic bead, or an affinity column. The cell population thus separated is enriched with cells having high cytotoxic activity, and is expected to exhibit a higher therapeutic effect.
  • the present invention provides a CIK cell-containing cell population obtainable by the above-described method for producing a CIK cell-containing cell population of the present invention. Since the CIK cell-containing cell population of the present invention contains a higher proportion of CD3-positive CD56-positive cells than the CIK cell-containing cell population produced by the conventional method, it exhibits stronger cytotoxic activity in vivo. And has a high therapeutic effect. Furthermore, the cell population has a very excellent feature in therapeutic use, such as a low content of regulatory T cells (regulatory T cells; Treg cells) having an action of suppressing cellular immunity.
  • regulatory T cells regulatory T cells
  • the present invention also provides a medicament (therapeutic agent or prophylactic agent) containing a CIK cell-containing cell population as an active ingredient.
  • the therapeutic agent containing the cell population is suitable for use in immunotherapy.
  • immunotherapy a CIK cell-containing cell population suitable for treating a patient is administered to a patient by an administration method such as intravenous, arterial, subcutaneous, or intraperitoneal injection.
  • the therapeutic agent of the present invention does not particularly limit the present invention, but for example, cancer, leukemia, malignant tumor, hepatitis, or infectious disease (for example, influenza, tuberculosis, AIDS, MRSA infection, VRE infection or deep It is very useful in the treatment of diseases sensitive to CIK cells, such as superficial mycosis.
  • the therapeutic agent can be used for bone marrow transplantation, infectious disease prevention after irradiation, or donor lymphocyte infusion for remission of relapsed leukemia.
  • the therapeutic agent and prophylactic agent of the present invention follow known methods in the pharmaceutical field, for example, using a cell population produced by the method of the present invention as an active ingredient, known organic or inorganic carriers suitable for parenteral administration, shaping It can be mixed with an agent or a stabilizer and prepared as an infusion or injection.
  • the content of the CIK cell-containing cell population of the present invention in the therapeutic agent, the dosage of the therapeutic agent, and various conditions relating to the therapeutic agent can be determined as appropriate according to known immunotherapy.
  • the content of the CIK cell-containing cell population of the present invention in medicine is not particularly limited. For example, it is preferably 1 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 11 cells / mL, more preferably 1 ⁇ 10 4.
  • the dose of the medicament of the present invention is not particularly limited. For example, it is preferably 1 ⁇ 10 6 to 1 ⁇ 10 12 cells / day, more preferably 1 ⁇ 10 7 to per adult day. Examples include 5 ⁇ 10 11 cells / day, more preferably 1 ⁇ 10 8 to 2 ⁇ 10 11 cells / day.
  • immunotherapy with the therapeutic agent may be used in combination with drug treatment by administration of a known drug, radiation therapy, or treatment by surgical operation.
  • the method for producing a CIK cell-containing cell population of the present invention can further include a step of introducing a foreign gene into the cell population.
  • foreign gene means a gene that is artificially introduced into a CIK cell to be transfected, and includes a gene derived from the same species as the cell to be transfected.
  • the means for introducing a foreign gene is not particularly limited, and an appropriate one can be selected and used by a known gene introduction method.
  • the gene transfer step can be performed at any point in the production method of the present invention. For example, it is preferable from the viewpoint of work efficiency to carry out at the same time, during or after the production of the cell population. Gene transfer can be performed with or without a viral vector. A lot of literature has already been published on details of these methods.
  • the viral vector is not particularly limited, and is usually a known viral vector used in gene transfer methods, for example, a retrovirus vector, a lentivirus vector, an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, a simian virus vector, a vaccinia virus vector. Alternatively, a Sendai virus vector or the like is used.
  • a retroviral vector or a lentiviral vector that can stably incorporate a foreign gene into the vector into the chromosomal DNA of the introduced cell is particularly preferred.
  • those lacking replication ability are preferable so that they cannot self-replicate in infected cells.
  • a substance that improves gene transfer efficiency such as RetroNectin (registered trademark, manufactured by Takara Bio Inc.), can also be used during gene transfer.
  • a method using a carrier such as liposome or ligand-polylysine, a calcium phosphate method, an electroporation method, a particle gun method, or the like can be used.
  • a foreign gene incorporated into plasmid DNA, linear DNA or RNA is introduced.
  • the foreign gene to be introduced is not particularly limited, and any gene desired to be introduced into the cell (for example, an enzyme, cytokine, or receptor-encoding protein, antisense nucleic acid or siRNA ( small interfering RNA), ribozyme-encoding genes, etc.
  • These foreign genes can be used, for example, inserted into a vector or a plasmid so as to be expressed under the control of an appropriate promoter. Control sequences such as sequences or terminator sequences may be present in the vector.
  • a gene encoding an enzyme associated with resistance to a drug used for treatment of a patient such as cancer is introduced to impart drug resistance to a CIK cell-containing cell population.
  • a gene that confers sensitivity to a specific drug for example, thymidine kinase gene
  • thymidine kinase gene can be introduced to give the CIK cell-containing cell population susceptibility to the drug. In such a case, it becomes possible to remove the cells after transplanted into the living body by administering the drug.
  • the present invention also provides a method for treating or preventing a disease comprising administering to a subject an effective amount of a CIK cell-containing cell population obtainable by the aforementioned method.
  • subject refers to, for example, a patient suffering from a disease as described above.
  • an effective amount is an amount of the cell population that can exert a therapeutic or prophylactic effect when the CIK cell-containing cell population is administered.
  • the specific effective amount is appropriately set according to the administration form, administration method, purpose of use and age, weight, symptom, etc. of the subject and is not constant.
  • the administration method There is no limitation also on the administration method, and for example, it may be administered by drip or injection or the like, similar to the above-mentioned medicine.
  • the present invention also provides the use of a CIK cell-containing cell population for the manufacture of a medicament.
  • the manufacturing method of the said pharmaceutical is performed like the above-mentioned pharmaceutical.
  • the disease to which the drug is administered is not particularly limited, but is the same as the aforementioned drug.
  • Example 1 CIK cell expansion culture using fibronectin fragment CH-296
  • Isolation of PBMC Five cancer patients with informed consent (2 renal cancer, lung cancer, liver cancer and thyroid gland) After collecting blood components from one cancer each), the cell fraction containing PBMC was layered on Ficoll and centrifuged, and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) in the intermediate layer were collected.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • (2) Immobilization of anti-human CD3 antibody and CH-296 A T225 flask was loaded with anti-human CD3 antibody having a final concentration of 5 ⁇ g / mL and CH-296 having a final concentration of 15 ⁇ g / mL (RetroNectin (registered trademark), manufactured by Takara Bio Inc.).
  • PBS phosphate buffered saline
  • CIK cells amplified by stimulation with anti-CD3 antibody and CH-296 were designated as R-CIKs, or CIK cells amplified by stimulation with anti-CD3 antibody alone were designated as C-CIKs.
  • Example 1- (3) The C-CIKs and R-CIKs phenotypes prepared in Example 1- (3) were subjected to flow cytometry after staining the cells with fluorescently labeled antibodies.
  • CD3 positive cells, CD4 positive cells, or CD8 positive cells were stained with anti-CD3 antibody, anti-CD4 antibody, or anti-CD8 antibody, respectively.
  • CD3-positive CD56-positive cells were stained with anti-CD3 antibody and anti-CD56 antibody and evaluated as both positive cells.
  • Treg cells were stained with anti-CD4 antibody, anti-CD25 antibody and anti-CD127 antibody, and evaluated as CD4 positive CD25 positive CD127 negative cells.
  • the horizontal axis represents the detected surface antigen
  • the vertical axis represents the positive rate (%) of the surface antigen.
  • Example 2 Antitumor effect of CIK cells (1) Transfer of CIK cells to cancer patients For each cancer patient, the autologous R-CIKs prepared in Example 1 was transferred twice in 4 days. Was one cycle, and an average of 3.9 ⁇ 10 10 doses were administered. All patients received a minimum of two cycles, one of which received three cycles.
  • PBMC are differentiated into many cell populations by expansion culture, and the differentiated ones include cell populations that control or suppress immunity.
  • the present invention has made it possible to provide a large amount of high-quality cell populations with a low content of unnecessary cell populations in expanded culture to CIK cells, which is said to be a suitable cell population for adoptive immunotherapy. .
  • the cell population obtainable by the present invention is extremely useful as a cell population having remarkable efficacy in adoptive immunotherapy using the cell population.
  • SEQ ID NO: 1 Partial region of fibronectin named CS-1.
  • SEQ ID NO: 2 Partial region of fibronectin named III-10.
  • SEQ ID NO: 3 Partial region of fibronectin in III-10.
  • SEQ ID NO: 4 Fibronectin fragment named C-274.
  • SEQ ID NO: 5 Fibronectin fragment named H-271.
  • SEQ ID NO: 6 Fibronectin fragment named H-296.
  • SEQ ID NO: 7 Fibronectin fragment named CH-271.
  • SEQ ID NO: 8 Fibronectin fragment named CH-296.
  • SEQ ID NO: 9 Fibronectin fragment named C-CS1.

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Abstract

　本発明は、サイトカイン誘導キラー細胞に分化しうる細胞を含有する細胞集団をフィブロネクチンのフラグメントの存在下で培養する工程を包含することを特徴とする、ＣＩＫ細胞を含有する細胞集団の製造方法等に関する。

Description

サイトカイン誘導キラー細胞含有細胞集団の製造方法
　本発明は、養子免疫療法において効力の高いサイトカイン誘導キラー（ＣＩＫ）細胞含有細胞集団、及び当該細胞集団の製造方法等に関する。本発明のＣＩＫ細胞含有細胞集団は制御性Ｔ細胞（regulatory T cells；Ｔｒｅｇ細胞）の増殖が抑制されており、早期及び後期癌に加え、造血細胞及び固形組織腫瘍を含む、様々な細胞増殖性疾患の治療に使用することができる。
　近年、薬剤治療法や放射線療法のように患者に重い肉体的負担がある治療法が見直され、より負担の軽い免疫治療法に関心が高まっている。当該療法には、例えば体外に取り出した免疫関連細胞を培養して細胞数を増加させ、及び／又は治療効果に係る活性を強化して患者に移植する養子免疫治療法が含まれる。
　養子免疫療法においてエフェクター細胞として利用される細胞として、リンホカイン活性化キラー（lymphokine activated killer；ＬＡＫ）細胞、腫瘍内浸潤リンパ球（tumour infiltrating lymphocyte；ＴＩＬ）、及びサイトカイン誘導キラー（cytokine-induced killer；ＣＩＫ）細胞が知られている。
　ＬＡＫ細胞は、インターロイキン（ＩＬ）－２存在下にリンパ球を増殖させて得ることができる細胞集団であり、腫瘍細胞を溶解するが正常細胞を溶解しないという性質を有している。ＬＡＫ細胞の調製に関しては、培養時にＩＬ－２とともに抗ＣＤ３抗体を共存させる方法も開発されている。
　ＴＩＬは腫瘍組織に浸潤したＴ細胞であり、ＬＡＫ細胞よりも著しい腫瘍抗原特異性を有する。本細胞も体外で増殖させ、治療に使用することができる。しかしＴＩＬは患者の腫瘍組織を摘出して入手する必要があるため、採取操作が煩雑であり、得られる細胞数も少ないという問題点を有している。
　ＣＩＫ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から、インターフェロン（ＩＦＮ）－γ、抗ＣＤ３抗体、及びＩＬ－２の存在下での培養を行って調製される。ＣＩＫ細胞はＣＤ３陽性かつＣＤ５６陽性の細胞を含有する細胞集団として特徴づけられる、ＰＢＭＣ中では希有な細胞集団であるが、当該細胞集団は標的細胞の非存在下で優先的に増殖させることができる。ＣＩＫ細胞は、インビボにおいてＬＡＫ細胞に勝る腫瘍細胞に対する細胞傷害活性を発揮する(例えば、非特許文献１)。
　フィブロネクチンは動物の血液中、培養細胞表面、組織の細胞外マトリックスに存在する分子量２５万の巨大な糖タンパク質であり、多彩な機能を持つことが知られている。そのドメイン構造は７つに分けられている（図１参照）。またそのアミノ酸配列中には３種類の類似の配列が含まれており、これら各配列の繰返しで全体が構成されている。３種類の類似の配列はそれぞれＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型と呼ばれている。このうち、ＩＩＩ型は７１～９６個のアミノ酸残基で構成されており、これらのアミノ酸残基の一致率は１７～４０％である。
　組換えＤＮＡ技術により、数種のフィブロネクチンの断片が製造されており、それらのいくつかにはがん転移抑制作用が期待されている（非特許文献２）。さらに、ヘパリン結合ドメインを有するフィブロネクチンフラグメントにはレトロウイルスの細胞への感染を促進する機能のあることが報告されている（非特許文献３）。
　体外で誘導した細胞傷害性Ｔ細胞（cytotoxic T cell；ＣＴＬ）や末梢血リンパ球等からＩＬ－２と抗ＣＤ３抗体の作用により拡大培養して得られるリンホカイン活性化キラー細胞を移入する免疫療法において、体外で誘導した抗原特異的ＣＴＬを拡大培養する際に細胞傷害活性をいかに維持するか、リンパ球を体外でいかに効率よく拡大培養できるか等の問題については、フィブロネクチンやそのフラグメントを使用することによる効果が検討されてきた（例えば、特許文献１～３）。
国際公開第０３／０１６５１１号パンフレット 国際公開第０３／０８０８１７号パンフレット 国際公開第２００５／０１９４５０号パンフレット
Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９４年，Ｖｏｌ.　１５３，ｐ１６８７－１６９６ Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９１年，Ｖｏｌ．１１０，Ｎｏ．２，ｐ２８４－２９１ Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９９６年，Ｖｏｌ．２，Ｎｏ．８，ｐ８７６－８８２
　ＣＩＫ細胞の拡大培養の過程では、ＰＢＭＣは多くの性質の異なる細胞集団に分化するため、拡大後の細胞集団中のＣＩＫ細胞の割合は決して高いものではない。一方で、分化した細胞集団の中には免疫を制御又は抑制する機能を有するものも含まれている。本発明の目的は、養子免疫療法に好適な細胞集団といわれているＣＩＫ細胞の製造のための、不要な細胞集団の含有率が少ない、がん治療用細胞集団の拡大培養方法を提供することにある。
　本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、サイトカイン誘導キラー細胞に分化しうる細胞を含有する細胞集団をフィブロネクチンのフラグメントの存在下で培養する工程を包含することを特徴とする、ＣＩＫ細胞を含有する細胞集団の製造方法に関する。第１の発明の態様において、下記から選択される領域を含有するフィブロネクチンのフラグメントの存在下に培養を実施するＣＩＫ細胞を含有する細胞集団の製造方法が提供される：
　ＶＬＡ－４結合領域、
　ＶＬＡ－５結合領域、及び
　ヘパリン結合領域。
　また第１の発明に使用されるフィブロネクチンのフラグメントの好適な例として、配列番号１、２及び５から選択されるアミノ酸配列を含むフィブロネクチンのフラグメントが例示される。更に、第一の発明の好適な態様として、フィブロネクチンのフラグメント存在下での培養がＣＤ３リガンド、インターフェロン－γ及びインターロイキン－２の共存下に実施されるＣＩＫ細胞を含有する細胞集団の製造方法が提供される。ＣＤ３リガンドとしては、本発明に使用できるものであれば限定はないが、好適には抗ＣＤ３抗体を使用して実施される。
　本発明の第２の発明は、本発明の第１の発明の方法により得ることができる、ＣＩＫ細胞を含有する細胞集団に関する。
　本発明の第３の発明は、本発明の第２の発明の細胞集団を有効成分として含有する医薬に関する。
　本発明の第４の発明は、対象に、有効量の本発明の第２の発明の細胞集団を投与する工程を含む疾患の治療方法又は予防方法に関する。なお当該疾患は本発明の第２の発明の細胞集団に感受性を有する疾患であればよい。また第２の発明の細胞集団は、治療又は予防を要する疾患を持ち、当該細胞集団の投与を受ける対象（患者）由来の細胞集団でも良く、場合によっては対象と異なるドナー由来の細胞集団でも良い。
　本発明の第５の発明は、医薬の製造のための、第２の発明の細胞集団の使用に関する。
　本発明の製造方法により、高い細胞傷害活性を有するＣＩＫ細胞を高含有する細胞集団を大量に拡大培養する製造方法が提供される。当該製造方法により大量に得られる高品質な細胞集団は、生体内において高い治療効果を発揮することから、細胞医療による疾患の治療に極めて有用である。
フィブロネクチンのドメイン構造を示す模式図である。 拡大培養で得られた細胞集団の表現型を示す図である。
　本発明は、フィブロネクチンのフラグメントの存在下でＰＢＭＣを培養することにより、得られた細胞集団中に、細胞表面にＣＤ３、ＣＤ５６両分子を発現する細胞が高比率に含まれていることを見出し、完成するに至ったものである。
　以下、本発明を具体的に説明する。
（１）本発明に使用されるフィブロネクチンのフラグメント
　本明細書中に記載されたフィブロネクチンのフラグメントは、天然から得られたもの（天然のフィブロネクチンを酵素消化により断片化したもの等）、又は組換えＤＮＡ技術により製造されたもののいずれでもよい。フィブロネクチンのフラグメントは、例えば、ルオスラーティ　Ｅ．ら〔Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，第２５６巻、第１４号、第７２７７～７２８１頁（１９８１）〕の開示に基づき、天然起源の物質から実質的に純粋な形態で製造することができる。ここで、本明細書に記載された実質的に純粋なフィブロネクチンフラグメントとは、これらが天然においてフィブロネクチンと一緒に存在する他のタンパク質を本質的に含有していないことを意味する。本発明において、フィブロネクチンフラグメントは、単一の分子種を使用してもよく、複数の分子種を混合して使用してもよい。
　本発明に使用できるフィブロネクチンフラグメント、ならびに該フラグメントの調製に関する有用な情報は、非特許文献２の他、コーンブリット　Ａ．Ｒ．ら〔ＥＭＢＯ　Ｊ．、第４巻、第７号、１７５５～１７５９（１９８５）〕、及びセキグチ　Ｋ．ら〔Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２５巻、第１７号、４９３６～４９４１（１９８６）〕等より得ることができる。また、フィブロネクチンをコードする核酸配列又はフィブロネクチンのアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００２０２６、ＮＰ＿００２０１７に開示されている。
　本発明には、細胞接着活性及び／又はヘパリン結合活性を有するフィブロネクチンフラグメントが好適に使用できる。
　フィブロネクチン中には、細胞表面のインテグリンと結合する活性を有する領域が存在する。前記領域として、ＶＬＡ（ｖｅｒｙ　ｌａｔｅ　ａｎｔｉｇｅｎ）－４又はＶＬＡ－５結合領域が例示される。
　フィブロネクチンのＣ末端側寄りの部位にはＩＩＩＣＳと呼ばれる領域が存在する。ここにはＣＳ－１と呼ばれる２５アミノ酸からなる領域が含まれており、当該領域はＶＬＡ－４に対して結合活性を示す。ＣＳ－１領域のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。
　また、フィブロネクチンにはＩＩＩ型と呼ばれる繰り返し配列が存在しており、Ｎ末側から１０番目のＩＩＩ型の繰り返し配列には細胞への結合領域が存在している。１０番目のＩＩＩ型の繰り返し配列のアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示す。前記配列中の、ＶＬＡ－５との結合に中心的役割を果たす配列は配列表の配列番号３に示すＡｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ（ＲＧＤＳ）の４アミノ酸である。配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列からなるＣ－２７４は配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、強い細胞接着活性を有する組換えフィブロネクチンフラグメントである。
　さらに、フィブロネクチンはヘパリンと結合する活性を有している。フィブロネクチンのヘパリン結合領域は、前記のＩＩＩ型繰り返し配列のＮ末側から１２番目～１４番目に相当する。配列表の配列番号５に示すアミノ酸配列からなるＨ－２７１はこのヘパリン結合領域からなる組換えフィブロネクチンフラグメントである。
　本発明には、各領域を単独で含有するフラグメントのほか、これらの領域の２以上が直接、あるいは適切なリンカーを介して結合されたフラグメントを使用することができる。前記フラグメントに含まれるフィブロネクチン由来の領域は同一のものであっても、異なるものであってもよい。複数の結合領域を分子内に有するフィブロネクチンのフラグメントとしては、ＶＬＡ－４結合領域とヘパリン結合領域を含有するＨ－２９６（配列表の配列番号６で表されるアミノ酸配列）、ＶＬＡ－５結合領域とヘパリン結合領域を含有するＣＨ－２７１（配列表の配列番号７で表されるアミノ酸配列）、ＶＬＡ－４結合領域、ＶＬＡ－５結合領域とヘパリン結合領域を含有するＣＨ－２９６（配列表の配列番号８で表されるアミノ酸配列）、又はＶＬＡ－４結合領域とＶＬＡ－５結合領域を含有するＣ－ＣＳ１（配列表の配列番号９で表されるアミノ酸配列）等のポリペプチドが例示される。これらの各種ポリペプチドは非特許文献２に記載されており、その開示に従って作製することができる。ＣＨ－２９６はレトロネクチン（Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ：登録商標）の名称でタカラバイオ社より販売されている。
　なお、本発明に使用されるフラグメントとしては、本発明の所望の効果が得られる限り、上記に例示した天然のフィブロネクチンのアミノ酸配列の少なくとも一部を含むフラグメントと同等な機能を有する、当該フラグメントを構成するポリペプチドのアミノ酸配列に１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドからなるものであってもよい。また、例えばＣ－２７４やＨ－２７１より１又は２のＩＩＩ型繰り返し配列を欠失させたものであってもよい。
　細胞接着活性は、本発明で使用されるフラグメント（その細胞結合ドメイン）と細胞との結合を公知の方法でアッセイして調べることができる。例えば、このような方法には、ウイリアムズ　Ｄ．Ａ．らの方法〔Ｎａｔｕｒｅ、第３５２巻、第４３８～４４１頁（１９９１）〕が含まれる。当該方法は、培養プレートに固定化したフラグメントに対する細胞の結合を測定する方法である。また、ヘパリン結合活性は、本発明に使用されるフラグメント（そのヘパリン結合ドメイン）とヘパリンとの結合を公知の方法を使用してアッセイすることにより調べることができる。例えば、上記のウイリアムズ　Ｄ．Ａ．らの方法において、細胞に換えてヘパリン、例えば標識ヘパリンを使用することにより、同様の方法でフラグメントとヘパリンとの結合の評価を行うことができる。
　組換えフィブロネクチンフラグメントの本発明への使用は、入手、取り扱いの容易さの他、その品質の均一性、ウイルス等の混入の危険性が低いという安全面からも好ましい。本発明に使用されるフィブロネクチンフラグメントの分子量には特に限定はないが、好適には１～２００ｋＤａ、より好適には５～１９０ｋＤａ、さらに好適には１０～１８０ｋＤａである。当該分子量は、例えば、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定することができる。
（２）ＣＩＫ細胞含有細胞集団の製造方法
　以下、本発明のＣＩＫ細胞含有細胞集団の製造方法について具体的に説明する。本発明はＣＩＫ細胞、すなわちＣＤ３陽性かつＣＤ５６陽性として特徴づけられる亜細胞集団を高含有する細胞集団を製造する方法である。本発明の方法は、前述のフィブロネクチンフラグメントの存在下で、ＣＩＫ細胞に分化しうる細胞を含有する細胞集団を培養する工程を包含することを特徴とする。
　本発明の製造方法に使用される、ＣＩＫ細胞に分化しうる細胞を含有する細胞集団としては、末梢血、骨髄、又は臍帯血等から得ることができる細胞集団、あるいはこれらの材料から分離された血球系細胞の集団が例示される。好ましくはＰＢＭＣが本発明に使用される。これらの細胞集団は生体から採取されたそのまま、もしくは凍結して保存されたもののいずれも本発明に使用することができる。
　本発明の製造方法において、フィブロネクチンのフラグメントの濃度には特に限定はないが、例えば０．００１～５００μｇ／ｍＬ、特に０．０１～５００μｇ／ｍＬが好適である。フィブロネクチンフラグメントは培地中に溶解して共存させる他、適切な固相、例えばシャーレ、フラスコ又はバッグ等の細胞培養用器材（培養用容器；開放系のもの、及び閉鎖系のもののいずれをも含む）、又はビーズ、メンブレン、スライドガラス等の細胞培養用担体に固定化して使用してもよい。それらの固相の材質は細胞培養に使用可能なものであれば特に限定されるものではない。フィブロネクチンフラグメントの固定化量は、前記の器材又は担体を培養に供した際に、該成分を培地中に溶解して用いる場合の所望の濃度と同様の割合となるよう選択されるが、所望の効果が得られれば特に限定されるものではない。
　フィブロネクチンフラグメントの固相への固定化方法としては、特に限定はないが、例えば、適当な緩衝液に溶解したフラグメントを固相と接触させることにより固定化することができる。また、国際公開第９７／１８３１８号パンフレット、ならびに国際公開第００／０９１６８号パンフレットに記載の方法によってもフィブロネクチンフラグメントの固定化を実施することができる。
　本発明の好適な態様では、フィブロネクチンのフラグメント存在下での培養はＣＤ３リガンドの存在下で行われる。ＣＤ３リガンドとしては、ＣＤ３に結合活性を有する物質であれば特に限定はないが、例えば抗ＣＤ３抗体が例示され、特に好適には抗ＣＤ３モノクローナル抗体が例示され、例えばＯＫＴ３〔Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．,第１２４巻、第６号、２７０８～２７１３（１９８０）〕が例示される。ＣＤ３リガンドの培地中の濃度としては、特に限定はなく、例えば抗ＣＤ３モノクローナル抗体を使用する場合は、例えば０．００１～５００μｇ／ｍＬ、特に０．０１～１００μｇ／ｍＬが好適である。ＣＤ３リガンドも、フィブロネクチンフラグメントと同様の操作により細胞培養用器材又は細胞培養用担体に固定化して使用することができる。
　フィブロネクチンフラグメント及びＣＤ３リガンドを固相に固定化しておけば、培養終了後、細胞と固相とを分離するのみで前記の成分と得られた細胞集団とを容易に分離することができ、細胞集団への前記成分の混入を防ぐことができる。
　本発明のＣＩＫ細胞含有細胞集団の製造方法において使用される培地は、特に限定はなく、リンパ球の拡大培養等に使用しうる公知の培地を使用することができ、たとえば市販の培地を適宜選択して使用することができる。これらの培地はその本来の構成成分以外にサイトカイン類、適当なタンパク質、又はその他の成分を含んでいてもよい。通常、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２を含有する培地が本発明に使用される。ＩＦＮ－γの培地中の濃度には特に限定はないが、５０～１００００Ｕ／ｍＬ、より好適には１００～５０００Ｕ／ｍＬである。ＩＬ－２の培地中の濃度にも限定はないが、１０～５０００Ｕ／ｍＬ、好適には５０～２０００Ｕ／ｍＬである。さらに、ＩＬ－１α、ＩＬ－７又はＩＬ－１２等のサイトカイン類を培地に添加してもよい。当該成分の培地中の濃度は、所望の効果が得られれば特に限定されるものではない。
　培地に血清又は血漿を添加して培養してもよい。これらの培地中への添加量は特に限定はないが、０容量％超～２０容量％が例示され、また培養段階に応じて使用する血清又は血漿の量を変更することができる。例えば、血清又は血漿濃度を段階的に減らして使用することもできる。なお、血清又は血漿の由来としては、自己（培養する細胞と由来が同じであることを意味する）もしくは非自己（培養する細胞と由来が異なることを意味する）のいずれでも良いが、安全性の観点から自己由来のものが好適である。また、ヒト血清アルブミンのような、単離された血清成分を添加してもよい。
　本発明のＣＩＫ細胞含有細胞集団の製造は、フィブロネクチンフラグメントの他、前記の各種成分又は培地を使用して実施される。本発明において使用される培養開始時の細胞数としては、特に限定はないが、好適には１×１０４ｃｅｌｌ／ｍＬ～１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、より好適には１×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬ～５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬが例示される。また、培養条件に特に限定はなく、通常の細胞培養に使用される条件を使用することができる。例えば、３７℃、５％ＣＯ２等の条件で培養することができる。また、適当な時間間隔で細胞培養液を新鮮な培地を加えて希釈する、培地を交換する、もしくは細胞培養用器材を交換する、等の操作を施すことができる。
　本発明の製造方法では、例えば、シャーレ、フラスコ、バッグ、大型培養槽又はバイオリアクター等の細胞培養用器材（容器）を使用することができる。なお、バッグとしては、細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグが好適である。大量の細胞を必要とする場合には大型培養槽を使用してもよい。培養は開放系、閉鎖系のどちらでも実施することができるが、好適には閉鎖系で培養が実施される。
　本発明のＣＩＫ細胞含有細胞集団の製造方法における培養期間には特に限定はないが、例えば、総日数として４～３０日間、好適には６～２５日間の培養が実施される。本発明の製造方法において、フィブロネクチンフラグメントの存在下での培養は培養期間中の全期間であってもよく、また任意の一部の期間であってもよい。すなわち、細胞を培養する工程の一部にフィブロネクチンフラグメント存在下での培養工程を含むものであれば本発明に包含される。特に好適には全培養期間中の少なくとも初期段階においてフィブロネクチンフラグメントの存在下に培養を実施することが好適であり、より好適にはフィブロネクチンフラグメントの存在下で培養を開始することが好ましい。好適には本発明の有効成分の存在下での培養を、培養開始時から少なくとも１日以上、より好ましくは２日以上実施することが好ましい。ＣＤ３リガンドを培養時に使用する場合、その使用時期に特に限定はないが、例えばフィブロネクチンフラグメントの使用時にＣＤ３リガンドを共存させることが行われる。
　本発明の一つの好適な態様では、全培養期間中の初期段階のみにフィブロネクチンフラグメントとＣＤ３リガンドが使用される。特に本発明を限定するものではないが、例えば培養開始時より７日目まで、好適には培養開始時より５日目まで、フィブロネクチンフラグメントとＣＤ３リガンドの共存化に培養が実施され、その後にはこの両成分の非存在下に培養を継続してＣＩＫ細胞含有細胞集団が製造される。
　また、本発明の製造方法は、前記の方法得られた細胞集団より、さらに、ＣＤ３陽性、ＣＤ５６陽性の細胞集団を分離する工程を包含してもよい。分離は、例えばセルソーター、磁気ビーズ又はアフィニティーカラム等を用いる公知の手法で行うことができる。こうして分離された細胞集団は高い細胞傷害活性を有する細胞が富化されたものであり、より高い治療効果を発揮することが期待される。
（３）ＣＩＫ細胞含有細胞集団
　本発明は、上記の本発明のＣＩＫ細胞含有細胞集団の製造方法で得ることができるＣＩＫ細胞含有細胞集団を提供する。本発明のＣＩＫ細胞含有細胞集団は従来の方法で製造されたＣＩＫ細胞含有細胞集団に比べてＣＤ３陽性ＣＤ５６陽性細胞を高比率に含んでいることから、生体内でより強力な細胞傷害活性を発揮し、高い治療効果を奏する。さらに前記の細胞集団は細胞性免疫を抑制する作用を有する制御性Ｔ細胞（regulatory T cells；Ｔｒｅｇ細胞）の含有量が低いという、治療への利用においてきわめて優れた特徴を有している。
　また、本発明は、ＣＩＫ細胞含有細胞集団を有効成分として含有する医薬（治療剤又は予防剤）を提供する。当該細胞集団を含有する前記治療剤は免疫療法への使用に適している。免疫療法においては、患者の治療に適したＣＩＫ細胞含有細胞集団が、例えば注射又は点滴による静脈、動脈、皮下、又は腹腔内等の投与方法によって患者に投与される。本発明の治療剤は、本発明を特に限定するものではないが、例えば、癌、白血病、悪性腫瘍、肝炎、又は感染性疾患（例えばインフルエンザ、結核、ＡＩＤＳ、ＭＲＳＡ感染症、ＶＲＥ感染症もしくは深在性真菌症）等のＣＩＫ細胞に感受性を有する疾患の治療において非常に有用である。また、当該治療剤は骨髄移植、放射線照射後の感染症予防又は再発白血病の寛解を目的としたドナーリンパ球輸注等にも利用できる。
　本発明の治療剤及び予防剤は製薬分野で公知の方法に従い、例えば、本発明の方法により製造された細胞集団を有効成分として、公知の非経口投与に適した有機又は無機の担体、賦形剤又は安定剤等と混合し、点滴剤又は注射剤として調製できる。なお、治療剤における本発明のＣＩＫ細胞含有細胞集団の含有量、治療剤の投与量、及び当該治療剤に関する諸条件は公知の免疫療法に従って適宜決定できる。例えば、医薬における本発明のＣＩＫ細胞含有細胞集団の含有量としては、特に限定はないが、例えば、好適には１×１０３～１×１０１１ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、より好適には１×１０４～１×１０１０ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、さらに好適には１×１０５～２×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬが例示される。また、本発明の医薬の投与量としては、特に限定はないが、例えば、成人一日あたり、好適には１×１０６～１×１０１２ｃｅｌｌｓ／日、より好ましくは、１×１０７～５×１０１１ｃｅｌｌｓ／日、さらに好ましくは１×１０８～２×１０１１ｃｅｌｌｓ／日が例示される。さらに、当該治療剤による免疫療法と、公知の薬剤投与による薬剤治療、放射線治療、又は外科的手術による治療とを併用することもできる。
　本発明のＣＩＫ細胞含有細胞集団の製造方法において、当該細胞集団に外来遺伝子を導入する工程をさらに包含することができる。なお、「外来遺伝子」とは、遺伝子導入対象のＣＩＫ細胞に人為的に導入される遺伝子のことを意味し、遺伝子導入対象の細胞と同種由来のものも包含される。
　外来遺伝子の導入手段には特に限定はなく、公知の遺伝子導入方法により適切なものを選択して使用することができる。遺伝子導入の工程は、本発明の製造方法における任意の時点で実施することができる。例えば、前記細胞集団の製造と同時もしくは途中で、あるいは該工程の後に実施するのが、作業効率の観点から好適である。遺伝子導入はウイルスベクターを用いて、又はウイルスベクターを用いずに実施することができる。それらの方法の詳細についてはすでに多くの文献が公表されている。
　前記ウイルスベクターには特に限定はなく、通常、遺伝子導入方法に使用される公知のウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター又はセンダイウイルスベクター等が使用される。導入される細胞の染色体ＤＮＡ中に該ベクターに外来遺伝子を安定に組み込むことができるレトロウイルスベクター、又はレンチウイルスベクターが特に好適である。上記ウイルスベクターとしては、感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させたものが好適である。また、遺伝子導入の際にレトロネクチン（登録商標、タカラバイオ社製）などの遺伝子導入効率を向上させる物質を用いることもできる。
　ウイルスベクターを使用しない遺伝子導入方法として、リポソーム、又はリガンド－ポリリジンなどの担体を使用する方法、あるいはリン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、又はパーティクルガン法などを使用することができる。この場合にはプラスミドＤＮＡ、直鎖状ＤＮＡ又はＲＮＡに組み込まれた外来遺伝子が導入される。
　導入される外来遺伝子には特に限定はなく、前記細胞に導入することが望まれる任意の遺伝子（例えば、酵素、サイトカイン類、又はレセプター類等のタンパク質をコードするものの他、アンチセンス核酸やｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ）、リボザイムをコードするものが使用できる。これら外来遺伝子は、例えば、適当なプロモーターの制御下に発現されるようにベクター又はプラスミド等に挿入して使用することができる。また、エンハンサー配列又はターミネーター配列のような制御配列がベクター内に存在していてもよい。
　本発明の方法によれば、癌等の患者の治療に使用される薬剤に対する耐性に関連する酵素をコードする遺伝子（例えば多剤耐性遺伝子）を導入してＣＩＫ細胞含有細胞集団に薬剤耐性を付与することができる。そのような細胞集団を用いれば、免疫療法と薬剤療法とを組み合わせることができ、従って、より高い治療効果を得ることが可能となる。一方、前記の態様とは逆に、特定の薬剤に対する感受性を付与するような遺伝子（例えばチミジンキナーゼ遺伝子）を導入して、ＣＩＫ細胞含有細胞集団に該薬剤に対する感受性を付与することもできる。かかる場合、生体に移植した後の細胞を当該薬剤の投与によって除去することが可能となる。
　本発明はまた、対象に、有効量の前述の方法により得ることができるＣＩＫ細胞含有細胞集団を投与することを含む、疾患の治療方法又は予防方法を提供する。本明細書中において対象とは、例えば前述のような疾患に罹患した患者を示す。
　本明細書中において有効量とは、前記ＣＩＫ細胞含有細胞集団を投与した場合に治療もしくは予防効果を発揮しうる当該細胞集団の量である。具体的な有効量は投与形態、投与方法、使用目的及び対象の年齢、体重、症状等によって適宜設定され一定ではない。投与方法にも限定はなく、例えば、上記の医薬と同様に、点滴又は注射等により投与すればよい。
　また、本発明により、医薬の製造のためのＣＩＫ細胞含有細胞集団の使用も提供される。当該医薬の製造方法は前述の医薬と同様に行われる。また、当該医薬の投与される疾患についても、特に限定はないが、前述の医薬と同様である。
　以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの記載に何ら限定されるものではない。
実施例１　フィブロネクチンフラグメントＣＨ－２９６を用いたＣＩＫ細胞の拡大培養
（１）ＰＢＭＣの分離
　インフォームド・コンセントの得られたがん患者５名（腎がん２名、肺がん、肝臓がん及び甲状腺がん各１名）より成分採血を実施後、ＰＢＭＣを含む細胞画分をＦｉｃｏｌｌ上に重層して遠心し、中間層の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を回収した。
（２）抗ヒトＣＤ３抗体及びＣＨ－２９６の固定化
　Ｔ２２５フラスコに終濃度５μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３抗体及び終濃度１５μｇ／ｍＬのＣＨ－２９６（レトロネクチン（登録商標）、タカラバイオ社製）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）４０ｍＬあるいは終濃度５μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３抗体のみを含むＰＢＳ４０ｍＬを添加した後、４℃で終夜インキュベートした。使用直前にこの培養器材から抗体、ＣＨ－２９６を含むＰＢＳを吸引除去後、ＰＢＳで２回洗浄して各試験に供した。
（３）ＣＩＫ細胞の拡大培養
　実施例１－（２）で分離したＰＢＭＣ ９×１０８ｃｅｌｌｓを０．２％ ヒト血清アルブミン、１０００Ｕ／ｍＬ　ＩＦＮ－γ、及び３００Ｕ／ｍＬ　ＩＬ－２を含む６０ｍＬのＧＴ－Ｔ５０３培地（タカラバイオ社製、以下“完全ＧＴ－Ｔ５０３培地”と記載）に懸濁し、実施例１－（２）で作製した抗ＣＤ３抗体及びＣＨ－２９６固定化Ｔ２２５フラスコ４個あるいは抗ＣＤ３抗体固定化Ｔ２２５フラスコ４個に添加し、５％ＣＯ２中３７℃で培養を開始した（培養０日目）。
　１日目（培養開始翌日）に、各フラスコに１５０ｍＬの完全ＧＴ－Ｔ５０３培地を添加し、培養を継続した。
　４日目に、各フラスコ内の細胞を培地に懸濁して全量を採取し、何も固定化していないガス透過性培養バッグＣｕｌｔｉＬｉｆｅＥｖａ（タカラバイオ社製）に移した。この際、完全ＧＴ－Ｔ５０３培地をバッグ１枚あたり７００ｍＬとなるように添加し、５％ＣＯ２中３７℃で培養した。
　７日目及び９日目に完全ＧＴ－Ｔ５０３培地４００ｍＬを各バッグに添加して継代を行い、１４日目まで培養を継続した。最終的にバッグ１枚あたり１，５００ｍＬの培養液となった。
　培養最終日の生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表１に示す。なお、抗ＣＤ３抗体とＣＨ－２９６で刺激して増幅したＣＩＫ細胞をＲ－ＣＩＫｓ、又は抗ＣＤ３抗体のみで刺激して増幅したＣＩＫ細胞をＣ－ＣＩＫｓとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　表１に示すように、培養初期にフィブロネクチンフラグメントを共存させることで、顕著なＣＩＫ細胞拡大培養率の向上が認められた。
（４）ＣＩＫ細胞の表現型の解析
　実施例１－（３）で調製したＣ－ＣＩＫｓ及びＲ－ＣＩＫｓの表現型を、蛍光標識された抗体を用いて細胞を染色後、フローサイトメトリーに供することにより解析した。ＣＤ３陽性細胞、ＣＤ４陽性細胞、又はＣＤ８陽性細胞はそれぞれ抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、又は抗ＣＤ８抗体で染色した。ＣＤ３陽性ＣＤ５６陽性細胞は抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ５６抗体で染色し、両陽性の細胞として評価した。Ｔｒｅｇ細胞は抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ２５抗体及び抗ＣＤ１２７抗体で染色し、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性ＣＤ１２７陰性細胞として評価した。
　その結果を図１に示す。図中、横軸は検出した表面抗原、縦軸は表面抗原の陽性率（％）を示す。
　図１に示すように刺激時にフィブロネクチンフラグメントを使用して調製した細胞集団では、顕著なＴｒｅｇ細胞の比率の低下が認められた。Ｔｒｅｇ細胞は抗腫瘍免疫活性を低下させる働きが知られており、移入するＣＩＫ細胞中のＴｒｅｇ細胞比率が低いということは、高い抗腫瘍効果が得られる。
実施例２　ＣＩＫ細胞の抗腫瘍効果
（１）ＣＩＫ細胞のがん患者への移入
各がん患者に対して、実施例１で調製された自己由来のＲ－ＣＩＫｓを４日間で２回の移入を１サイクルとし、平均３．９×１０１０個投与した。すべての患者に対して最低２サイクルの投与を行い、うち１名に対しては３サイクルの投与を行った。
（２）抗腫瘍効果
　Ｒ－ＣＩＫｓを投与した全てのがん患者において、細胞投与に伴う重篤な有害事象は認められなかった。
　Ｒ－ＣＩＫｓの投与により全てのがん患者において臨床症状の改善、生理機能の回復が認められた。また、甲状腺がんの患者において腫瘍マーカーであるカルシトニンの有意な減少が確認された。さらに、肺がんの患者においてＰＥＴ－ＣＴにより腫瘍の大きさを測定したところ、約５０％の腫瘍の退縮が認められた。
　以上より、Ｒ－ＣＩＫｓは、きわめて安全で抗腫瘍効果の高い細胞製剤であることが判明した。
　ＰＢＭＣは拡大培養により多くの細胞集団に分化し、分化したものの中には免疫を制御又は抑制する細胞集団が含まれてくる。本発明により、現在養子免疫療法に好適な細胞集団といわれているＣＩＫ細胞への拡大培養において、不要な細胞集団の含有率が少ない高品質な細胞集団を大量に提供することが可能になった。本発明により得ることができる細胞集団は、当該細胞集団を用いる養子免疫療法において、著効性を有する細胞集団として極めて有用である。
SEQ ID NO:1 ; Partial region of fibronectin named CS-1.
SEQ ID NO:2 ; Partial region of fibronectin named III-10.
SEQ ID NO:3 ; Partial region of fibronectin in III-10.
SEQ ID NO:4 ; Fibronectin fragment named C-274.
SEQ ID NO:5 ; Fibronectin fragment named H-271.
SEQ ID NO:6 ; Fibronectin fragment named H-296.
SEQ ID NO:7 ; Fibronectin fragment named CH-271.
SEQ ID NO:8 ; Fibronectin fragment named CH-296.
SEQ ID NO:9 ; Fibronectin fragment named C-CS1.

Claims (8)

  1. 　サイトカイン誘導キラー細胞に分化しうる細胞を含有する細胞集団をフィブロネクチンのフラグメントの存在下で培養する工程を包含することを特徴とする、サイトカイン誘導キラー細胞を含有する細胞集団の製造方法。
  2. 　下記から選択される領域を含有するフィブロネクチンのフラグメントの存在下に培養を実施する請求項１記載の製造方法：
    　ＶＬＡ－４結合領域、
    　ＶＬＡ－５結合領域、及び
    　ヘパリン結合領域。
  3. 　配列番号１、２及び５から選択されるアミノ酸配列を含むフィブロネクチンのフラグメントの存在下に培養を実施する請求項２記載の製造方法。
  4. 　フィブロネクチンのフラグメント存在下での培養がＣＤ３リガンド、インターフェロン－γ及びインターロイキン－２の共存下に実施される請求項１記載の製造方法。
  5. 　請求項１～４いずれか１項に記載の方法により得ることができる、サイトカイン誘導キラー細胞を含有する細胞集団。
  6. 　請求項５記載の細胞集団を有効成分として含有する医薬。
  7. 　対象に、有効量の請求項５記載の細胞集団を投与する工程を含む疾患の治療方法又は予防方法。
  8. 　医薬の製造のための、請求項５記載の細胞集団の使用。
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