WO2009138042A1

WO2009138042A1 - 一种糖蛋白激素组合物

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Publication number: WO2009138042A1
Application number: PCT/CN2009/071806
Authority: WO
Inventors: 季晓铭; 高霄梁; 季斌; 严惠敏; 洪云海
Original assignee: 上海天伟生物制药有限公司
Priority date: 2008-05-15
Filing date: 2009-05-15
Publication date: 2009-11-19
Also published as: CN101269215A; KR101095647B1; KR20090119741A; JP2009275045A; JP5143784B2; CN101269215B

Description

一种糖蛋白激素组合物

技术领域

本发明涉及蛋白质纯化和生物医药领域。具体而言，本发明涉及糖蛋白激素及其稳定剂的组合物，它具有良好的稳定性。背景技术

卵泡剌激素（Follicle- stimulating hormone, 简称 FSH)是由垂体产生的糖蛋白激素，它由 α链和 β链两个亚基组成。 FSH 的 a亚基与黄体生成激素 (leuteinizing hormone，简称 LH)禾口绒毛膜促性腺素 (chorionic gonadotropin, 简称 CG)的 α亚基完全相同，具有 92个氨基酸，分子量约为 14500 D，第 52和 78位置上的天冬酰胺是发生 -糖基化的氨基酸。 FSH的 β亚基由 111个氨基酸组成，分子量约为 18000 D，其中第 7和 24位置上的天冬酰胺是发生 / ^糖基化的氨基酸。而 LH的 β亚基由 121个氨基酸组成，分子量约为 14800 D; CG的 β亚基则有 145个氨基酸，分子量 22000-39000 D。

临床上 FSH主要用于治疗不育症以及体外的辅助生殖。 FSH可以从垂体或绝经期妇女的尿液中提取出来，也可通过匪重组技术而制备。

含有 FSH的第一代产品是尿促性素（HMG)，如 Serono公司的 Pergonal, 它是 FSH与 LH比例约为 1 的混合物。但是，对于体内有较多量的 LH而不需加用外源性 LH的患者， LH水平过高会影响卵泡的正常发育，不合时机的抑制减数分裂抑制因子会导致卵子的老化，从而降低受精和着床的机会。因此对这部分患者而言，更适合于使用纯 FSH制剂。另一方面，过多的 LH容易导致多囊卵巢综合症（Polycystic Ovarian Syndrome, P00S)，研究表明， LH过多对生殖功能有不利的作用，如引起月经稀发、无排卵、不孕及流产。因此对 P00S患者用纯 FSH治疗比 HMG更为安全，可减少卵巢过度剌激综合 ¾E (Ovarian Hypers timulat ion Syndrome , 0HSS)危险。

Serono公司推出的 Metrodin是一种含有极少量 LH的 FSH制剂，其后的 Metrodin-HP则是高纯度的 FSH制剂。

另外，近年来市场上也开发出一种高纯度的尿促性素（pHMG)，如 Ferring 公司的 Menopur, 它是将纯化后的高纯度 FSH 与高纯度 LH 或者是高纯度 hCG (人绒毛膜促性腺激素， human chorionic gonadotropin)按 1： 1 的比例调配而成的产品，主要用于替代普通的 HMG产品，并克服普通 HMG产品中因大量杂蛋白而造成的对人体的过敏反应。

由此可见，目前市场上都在致力于高纯度糖蛋白激素的开发和应用，但是，通过各种纯化手段获得的高纯度糖蛋白首先要做到一个原料药的形式，便于保存和检验，然后再做成制剂。这个原料药的形式很重要，一般应尽量采用固体形式而不采用液体形式，因为液体不容易保存和运输，而对于糖蛋白激素来说固体形式的获得主要是通过冷冻干燥的手段，但我们知道，高纯度的糖蛋白激素在冷冻干燥的过程中很容易发生变性失活，因此现有技术中不得不采用液体的方式来保存高纯度糖蛋白激素的原料药，但液体形式必须保存在 -20 °C以下，否则容易失活；液体形式由于会遇到冻结 -溶解过程，甚至是反复的冻结 -溶解过程，更容易导致糖蛋白失活；液体形式还会遇到包装容器在低温下接近脆性点容易破裂的危险等。

因此本领域迫切需要开发出一种具有良好稳定性的糖蛋白激素的原料药形式。发明内容

本发明旨在提供一种可作为原料药的含有高纯度的糖蛋白激素的固体组合物。在本发明的第一方面，提供了一种组合物，所述的组合物是固体组合物，其中含有二糖和糖蛋白激素或其变体。

在另一优选例中，所述的糖蛋白激素或其变体的含量为不低于 10 μ g/mg组合物、或不低于 100国际单位 /mg组合物。

在另一优选例中，所述的糖蛋白激素或其变体的含量为不低于 20 μ g/mg组合物、或不低于 200国际单位 /mg组合物。

在另一优选例中，所述的糖蛋白激素或其变体选自卵泡剌激素（FSH ) 或其变体、黄体生成素（LH ) 或其变体、或其混合。

在另一优选例中，所述的二糖选自乳糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖或其两种或两种以上的混合；更优选乳糖。

在另一优选例中，所述的卵泡剌激素或其变体是人卵泡剌激素或其变体。在另一优选例中，所述的人卵泡剌激素或其变体选自重组的人卵泡剌激素或其变体、或人尿来源的卵泡剌激素或其变体。

在另一优选例中，所述的黄体生成素或其变体是人黄体生成素或其变体。在另一优选例中，所述的人黄体生成素或其变体选自重组的人黄体生成素或其变体、或人尿来源的黄体生成素或其变体。

在另一优选例中，所述的固体组合物是冻干粉。

在另一优选例中，所述的组合物是固体，由二糖和糖蛋白激素或其变体组成，其中糖蛋白激素或其变体的含量为不低于 10 g/mg 组合物、或不低于 100国际单位 /mg组合物。在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有如上所述的固体组合物。在本发明的第三方面，提供了一种如上所述的固体组合物在制备治疗不育综合症的药物中的用途。据此，本发明提供了一种具有良好稳定性的糖蛋白激素的原料药形式。具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，惊奇地发现高纯度的糖蛋白激素与合适的稳定剂组合进行冷冻干燥后，可以得到稳定的组合物。其中的稳定剂以二糖为佳，尤其是乳糖。

发明人发现，此时二糖不仅起稀释剂和赋形剂的作用，更重要的是起保护剂的作用，它可以保护糖蛋白分子在冷冻干燥过程中可能发生的构象变化所导致的变性失活，另外一方面，它对产品的稳定性也有很大的提高。在此基础上，发明人完成了本发明。

具体而言，如背景技术部分中所述，现有技术中采用了液体形式来保存高纯度糖蛋白激素的中间品或原料药形式，不便于保存和运输，稍有不慎，便会对产品产生很大的影响。而采用固体形式又遇到冷冻干燥过程容易导致糖蛋白失活的结果。

在探索改进现有技术方法的过程中，发明人注意到将高纯度糖蛋白与乳糖进行适当的配比，特别是高纯度糖蛋白和乳糖的浓度在一个合适范围内，那么此时乳糖会起到保护剂的作用，防止糖蛋白分子在冷冻干燥过程中可能发生的构象变化所导致的变性失活。在本发明中，所述的二糖（d i sacchar i de ) 由二分子的单糖通过糖苷键形成，如麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖等；优选自下述的一种或多种，如麦芽糖、乳糖、和蔗糖；更佳地是乳糖。

在本发明中，所述的糖蛋白激素的变体是指氨基酸发生缺失或通过重组技术对其进行修饰过的糖蛋白激素，但其基本药效还是存在或是得到增强。

本发明提供的组合物中，二糖和糖蛋白激素或其变体的重量之和是组合物总重量的 60— 100 %，较佳地是 80— 99 %，更佳地是 90— 95 %。

在本发明的组合物中，所述的糖蛋白激素或其变体的生物效价为 500— 30000国际单位 /mg蛋白质，较佳地为 3500— 12000国际单位 /mg蛋白质。如果其中的糖蛋白激素仅为 FSH或其变体， FSH或其变体的生物效价为 500— 15000国际单位 /mg蛋白质，较佳地为 7000— 12000国际单位 /mg蛋白质；如果其中的糖蛋白激素仅为 LH或其变体， LH或其变体的生物效价为 500— 8000 国际单位 /mg蛋白质，较佳地为 2000— 6000国际单位 /mg蛋白质。

在本发明的组合物中，所述的糖蛋白激素或其变体的纯度为 50 %以上，较佳地为 90 %以上。

在本发明提供的每毫克组合物中，糖蛋白激素或其变体的含量不低于 100国际单位，较佳地不低于 200国际单位。

在本发明提供的每毫克组合物中，糖蛋白激素或其变体的含量不低于 10 μ g o 如果其中的糖蛋白激素仅为 FSH或其变体， FSH或其变体含量为不低于 10 g/mg组合物，较佳地不低于 20 μ g/mg组合物；如果其中的糖蛋白激素仅为 LH或其变体， LH或其变体的含量为不低于 10 μ g/mg组合物，较佳地不低于 35 μ g/mg组合物。

本发明提供的组合物中，二糖和糖蛋白激素或其变体的重量比为 8— 99: 1，较佳地为 12— 60: 1。

本发明提供的组合物中，乳糖和糖蛋白激素或其变体的重量比为 8— 99: 1，较佳地为 12— 60: 1。如果其中的糖蛋白激素仅为 FSH或其变体，乳糖和 FSH或其变体的重量比为 20— 99: 1，较佳地为 30— 50: 1 ; 如果其中的糖蛋白激素仅为 LH或其变体，乳糖和 LH或其变体的重量比为 8— 99 : 1，较佳地为 12— 20: 1。

本发明提供的组合物在冷冻干燥过程中糖蛋白激素不会发生变性失活，并且此组合物具有良好的稳定性。本发明提供一种药物组合物，它包括：（a )糖蛋白激素或其变体；（b ) 二糖；和（c ) 药学上可接受的载体。

如本文所用，术语 "药学上可接受的载体" 指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在 Remington' s Pharmaceut i cal Sc i ences (Mack Pub. Co.， N. J. 1991 )中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。在组合物中药学上可接受的载体可包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如崩解剂、润湿剂、乳化剂、 pH缓冲物质等。

所述药物组合物可以根据不同给药途径而制备成各种剂型。这些剂型以下面方式之一施用：口服、喷雾吸入、直肠用药、鼻腔用药、颊部用药、局部用药、非肠道用药，如皮下、静脉、肌肉、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内和颅内注射或输入，或借助一种外植储器用药。其中治疗时优选皮下给药方式。

另外需要指出，本发明药物组合物中有效成分的使用剂量和使用方法取决于诸多因素，包括患者的年龄、体重、性别、自然健康状况、营养状况、有效成分活性强度、服用、代谢速率、病症的严重程度以及诊治医师的主观判断。建议安全有效量通常至少约 10微克 /千克体重，而且在大多数情况下不超过约 10毫克 /千克体重，较佳地该剂量是约 10微克 /千克体重-约 1 毫克 /千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。本发明的主要优点在于：

1、提供了一种固体形式的糖蛋白激素的组合物，便于保存和运输；

2、本发明方法获得的糖蛋白激素的组合物，具有良好的稳定性，作为原料药适用于制备相应的制剂。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件、或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例 1

含 FSH的组合物

在本实施例中，将高纯度 FSH (购自上海天伟生物制药有限公司）用作 FSH 药物组合物的原料，其中 FSH的生物效价为 9521 国际单位 /mg。

配制 50mL 0. 01M磷酸二氢钠溶液（用 NaOH调 pH约 6. 5)，加入 2 g乳糖，搅拌溶解后，用 0. 22 μ m过滤器过滤。取 10mL滤过液，加入 10. 0 mg上述高纯度 FSH (购自上海天伟生物制药有限公司），完全溶解后，装盘放入冻干机中，按如下程序进行冷冻干燥：

1 . 层板至 -40 °C预冻 3小时；

2 . 冷阱至 -45 °C ;

3 . 启动真空泵；

4. 层板至 - 10 °C维持 15小时；

5 . 层板至 +2 CTC维持 5小时；

6. 出箱，得 392mg冻干粉末。此产品测定 FSH的生物效价结果如下：

单位效价

总效价（万 IU) 冻干得率（％)

(IU/mg) 冻干前 9. 52 冻干后 236 9. 25 97%

对照例

在本对照例中，将高纯度 FSH与乳糖配制成含 FSH低于 50国际单位 /mg 组合物总量的配比，再对其冷冻干燥过程及稳定性进行考察。

在本对照例中，将高纯度 FSH (购自上海天伟生物制药有限公司）用作 FSH 药物组合物的原料，其中 FSH的生物效价为 9521 国际单位 /mg。

配制 500mL 0. 01M磷酸二氢钠溶液（用 NaOH调 pH约 6. 5)，加入 20 g乳糖，搅拌溶解后，用 0. 22 μ ηι过滤器过滤。取 l OOmL 滤过液，加入 5. 0 mg 上述高纯度 FSH (购自上海天伟生物制药有限公司），完全溶解后，装盘放入冻干机中，按实施例 1 的程序进行冷冻干燥，得 3. 89 g冻干粉末。

从上述两例的结果可见，采用本发明所获得的 FSH组合物，在冷冻干燥过程中几乎没有变性失活，而对照例有较明显的失活现象。稳定性对比

将实施例 1和对照例的样品在 30 °C下考察其稳定性，结果如下

可见，采用本发明所获得的 FSH组合物与对照例相比具有良好的稳定性。实施例 2

含 LH的组合物

在本实施例中，将高纯度 LH (购自上海天伟生物制药有限公司）用作 LH 药物组合物的原料，其中 LH的生物效价为 4307国际单位 /mg

配制 50mL 0. 01M磷酸二氢钠溶液（用 NaOH调 pH约 6. 5)，加入 2 g乳糖，搅拌溶解后，用 0. 22 μ m过滤器过滤。取 10mL滤过液，加入 25 mg上述高纯度 LH (购自上海天伟生物制药有限公司），完全溶解后，装盘放入冻干机中，按实施例 1 的程序进行冷冻干燥，获得 402mg冻干粉末。此产品测定 LH的生物效价以及在 30 °C下考察其稳定性，结果如下

可见，采用本发明所获得的 LH 组合物，几乎没有变性失活，且具有良好的稳定性。实施例 3

含 FSH LH混合物的组合物

配制 l OOmL 0. 9%的氯化钠溶液（用 NaOH或 HC1调 pH约 7. 0)，加入 4 g 麦芽糖，搅拌溶解后，用 0. 22 μ ηι过滤器过滤。取 10mL滤过液，加入 10. 0 mg 高纯度 FSH (购自上海天伟生物制药有限公司，生物效价为 9521 国际单位 /mg ) ，再加入 25. 0 mg高纯度 LH (购自上海天伟生物制药有限公司，生物效价为 4307 国际单位 /mg ) ，完全溶解后，装盘放入冻干机中，按实施例 1 的程序进行冷冻干燥，获得 405mg冻干粉末。测得 FSH生物效价为 223 IU/mg， LH生物效价为 242 IU/mg。此产品在 30 °C下的稳定性结果如下:

实施例 4

FSH冻干针剂的制备

用于制造 100瓶 FSH冻干针剂，且每瓶含 75 IU FSH的例子如下：将实施例 1所制备的 FSH冻干组合物 35mg，溶解于 10mL注射用无热原水中，用 0. 22 μ ηι过滤器进行无菌过滤，并用注射用无热原水洗涤过滤器。

将 l g乳糖溶解于 30mL注射用无热原水中，如果需要的话，用 HC1或 NaOH 调节 pH6. 5 ± 0. 2，用 0. 22 μ ηι过滤器进行无菌过滤。然后加入到上述 FSH溶液中，用注射用无热原水定容至 75mL，混匀。

将上述溶液分装入安瓿瓶中，每瓶 0. 75mL，进行冷冻干燥。

所得到的安瓿瓶中，每瓶含约 75 IU FSH和 10mg乳糖。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

Claims

权利要求

1.一种组合物，其特征在于，它是含有二糖和糖蛋白激素或其变体的固体组合物。

2.如权利要求 1 所述的组合物，其特征在于，其中糖蛋白激素或其变体的含量为不低于 10 g/mg组合物、或不低于 100国际单位 /mg组合物。

3.如权利要求 1 所述的组合物，其特征在于，其中糖蛋白激素或其变体的含量为不低于 20 g/mg组合物、或不低于 200国际单位 /mg组合物。

4.如权利要求 1 所述的组合物，其特征在于，所述的糖蛋白激素或其变体选自卵泡剌激素或其变体、黄体生成素或其变体、或其混合。

5.如权利要求 1所述的组合物，其特征在于，所述的二糖选自乳糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖或其两种或两种以上的混合；优选乳糖。

6.如权利要求 4 所述的组合物，其特征在于，所述的卵泡剌激素或其变体是人卵泡剌激素或其变体。

7. 如权利要求 6所述的组合物，其特征在于，所述的人卵泡剌激素或其变体选自重组的人卵泡剌激素或其变体、或人尿来源的卵泡剌激素或其变体。

8.如权利要求 4 所述的组合物，其特征在于，所述的黄体生成素或其变体是人黄体生成素或其变体。

9. 如权利要求 8所述的组合物，其特征在于，所述的人黄体生成素或其变体选自重组的人黄体生成素或其变体、或人尿来源的黄体生成素或其变体。

10. 如权利要求 1 所述的组合物，其特征在于，所述的固体组合物是冻干粉。

1 1 . 一种药物组合物，其特征在于，它含有如权利要求 1 一 10 中任一权利要求所述的组合物。

12 . 一种如权利要求 1 一 10中任一权利要求所述的组合物在用于制备治疗不育综合症的药物中的用途。