WO2009103540A1 - Stabilisierung von dehydrogenasen mit stabilen coenzymen - Google Patents

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WO2009103540A1
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nad
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Dieter Heindl
Carina Horn
Claudia Gaessler-Dietsche
Joachim Hoenes
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F. Hoffmann - La Roche Ag
Roche Diagnostic Gmbh
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    • C12Y104/00—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12Y104/01—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.4.1)
    • C12Y104/01005—L-Amino-acid dehydrogenase (1.4.1.5)

Definitions

  • the present invention relates to a method for stabilizing an enzyme by storing the enzyme in the presence of a stable coenzyme. Furthermore, the present invention relates to a stabilized with a stable coenzyme enzyme and its use in test elements for the detection of analytes.
  • Biochemical measuring systems are important components of clinically relevant analytical methods.
  • analytes e.g. Metabolites or substrates in the foreground, which are determined directly or indirectly by means of an enzyme.
  • the analytes are hereby reacted with the aid of an enzyme-coenzyme complex and then quantified.
  • the analyte to be determined is brought into contact with a suitable enzyme and a coenzyme, the enzyme usually being used in catalytic amounts.
  • the coenzyme is altered by the enzymatic reaction, e.g. oxidized or reduced. This process can be detected electrochemically or photometrically directly or through a mediator.
  • a calibration provides a direct correlation of the measured value with the concentration of the analyte to be determined.
  • Coenzymes are organic molecules that are covalently or non-covalently bound to an enzyme and are altered by the reaction of the analyte.
  • Prominent examples of coenzymes are nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) and nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP), which form NADH and NADPH by reduction.
  • NAD nicotinamide adenine dinucleotide
  • NADP nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
  • a known measure used to increase the stability of biochemical measuring systems is the use of stable enzymes, e.g. the use of enzymes from thermophilic organisms. Furthermore, it is possible to use enzymes by chemical modification, e.g. Crosslinking, or to stabilize by mutagenesis. In addition, enzyme stabilizers, e.g. Trehalose, polyvinylpyrrolidone and serum albumin, or the enzymes e.g. be included in polymer networks by photopolymerization.
  • mediators with the lowest possible redox potential increases the specificity of tests and eliminates disturbances during the reaction.
  • a lower limit for the redox potential of mediators is the redox potentials of the enzyme / coenzyme complexes. If these are undercut, the reaction with the mediators is slowed or even stopped.
  • biochemical measuring systems without mediators, in which, for example, direct detection of coenzymes, for example of the coenzyme NADH, takes place.
  • coenzymes such as NAD and NADP
  • coenzymes are unstable.
  • NAD and NADP are base-labile molecules whose degradation pathways are described in the literature (NJ Oppenheimer in The Pyridine Nucleotide Coenzyme Academic Press New York, London 1982, ed. J. Everese, B. Anderson, K. You, Chapter 3, pages 56- 65).
  • the degradation of NAD or NADP produces ADP-ribose by cleaving the glycosyl bonds between the ribose and the pyridine moiety.
  • NADH and NADPH are acid labile: for example, epimerization is a known degradation pathway.
  • epimerization is a known degradation pathway.
  • the instability of NAD / NADP and NADH / NADPH underlies the lability of glycosyl binding between the ribose and pyridine moieties.
  • the hydrolysis of the coenzymes NAD or NADP is done solely by the ambient humidity. This instability can lead to inaccuracies in the measurement of analytes.
  • NAD / NADP derivatives are used e.g. in B.M. Anderson in the Pyridine Nucleotide Coenzyme, Academic Press New York, London 1982, ed. J. Everese, B. Anderson, K. You, Chapter 4. However, most of these derivatives are not well accepted by enzymes.
  • the only derivative heretofore used for diagnostic testing is 3-acetylpyridine-adenine dinucleotide (acetyl NAD), first described in 1956 (N.O. Kaplan, J. Biol. Chem. (1956), 221, 823). Also, this coenzyme shows a low acceptance of enzymes and a change in the redox potential.
  • WO 01/94370 describes the use of further NAD derivatives with a modified pyridine group.
  • modifications of the nicotinamide group generally have a direct influence on the catalytic reaction. In most cases this influence is negative.
  • the ribose unit was altered to influence the stability of the glycosyl bond. This procedure does not directly interfere with the catalytic reaction of - A -
  • Nicotinamide group there may be an indirect effect once the enzyme has strong and specific binding to the ribose moiety.
  • Kaufmann et al. disclose a series of thioribose NAD derivatives.
  • a connection between the modification of the nicotinamide ribose unit and the activity of the derivatives in enzymatic reactions has not yet been shown.
  • carba NAD a derivative without glycosyl linkage
  • the ribose is substituted herein by a carbacyclic sugar moiety.
  • carbaNAD has been described as a substrate for dehydrogenases, its activity has not previously been demonstrated in biochemical detection in the clinic.
  • WO 2007/012494 and US 11 / 460,366 disclose stable NAD / NADH or NADP / NADPH derivatives, enzyme complexes of these derivatives and their use in biochemical detection methods and reagent kits.
  • the object underlying the present invention was to provide processes for the stabilization of enzymes, in particular for the long-term stabilization of enzymes.
  • the enzyme stabilized by the method according to the invention is a coenzyme-dependent enzyme.
  • Suitable enzymes are e.g. Dehydrogenases selected from a glucose dehydrogenase (EC 1.1.1.47), lactate dehydrogenase (EC1.1.1.27, 1.1.1.28), malate dehydrogenase (EC1.1.1.37), glycerol dehydrogenase (EC1.1.1.6), alcohol Dehydrogenase (EC1.1.1.1), alpha-hydroxybutyrate
  • Dehydrogenase sorbitol dehydrogenase or amino acid dehydrogenase, e.g. B. L-amino acid dehydrogenase (E.C.1.4.1.5).
  • Other suitable enzymes are oxidases, such as glucose oxidase (E.C.1.1.3.4) or cholesterol oxidase (E.C.1.1.3.6) or aminotransferases, such as. Aspartate or alanine aminotransferase, 5'-nucleotidase or creatine kinase.
  • the enzyme is glucose dehydrogenase.
  • mutated glucose dehydrogenase In the context of the method according to the invention, the use of a mutated glucose dehydrogenase has proven to be particularly preferred.
  • mutant as used in the present application is used, denotes a genetically modified variant of a native enzyme which has the same number of amino acids compared to the wild-type enzyme modified amino acid sequence, that is different in at least one amino acid from the wild-type enzyme.
  • the introduction of the mutation (s) may be site-specific or non-site specific, preferably site-specific using recombinant methods known in the art, resulting in at least one amino acid substitution within the amino acid sequence of the native enzyme according to the particular requirements and conditions.
  • the mutant particularly preferably has an increased thermal or hydrolytic stability compared to the wild-type enzyme.
  • the mutated glucose dehydrogenase may in principle contain the amino acid (s) modified from the corresponding wild-type glucose dehydrogenase at any position of its amino acid sequence.
  • the mutant glucose dehydrogenase comprises a mutation at least one of positions 96, 170 and 252 of the amino acid sequence of wild-type glucose dehydrogenase, with mutants having mutations at position 96 and position 170 or mutations at position 170 and position 252 being particularly preferred , It has proved to be advantageous if the mutated glucose dehydrogenase contains no further mutations in addition to these mutations.
  • the mutation at positions 96, 170 and 252 may in principle comprise any amino acid substitution which leads to a stabilization, for example an increase in the thermal or hydrolytic stability, of the wild-type enzyme.
  • the mutation at position 96 comprises an amino acid substitution of glutamic acid for glycine, while with respect to position 170, an amino acid substitution of glutamic acid for arginine or lysine, in particular an amino acid substitution of glutamic acid for lysine, is preferred.
  • the mutation at position 252 it preferably comprises an amino acid substitution of lysine for leucine.
  • the mutant glucose dehydrogenase can be obtained by mutation of a wild-type glucose dehydrogenase derived from any biological source, the term "biological source” for the purposes of this invention including prokaryotes, such as bacteria, and eukaryotes, such as mammals and others
  • the wild-type glucose dehydrogenase is derived from a bacterium, more preferably a glucose dehydrogenase from Bacillus megaterium, Bacillus subtilis or Bacillus thuringiensis, in particular from Bacillus subtilis.
  • the mutated glucose dehydrogenase is a glucose dehydrogenase obtained by mutation of wild-type glucose dehydrogenase from Bacillus subtilis which has the sequence shown in SEQ ID NO: 1 (GlucDH_E96G_E170K) or SEQ ID NO: 1 ID NO: 2 (GlucDH_E170K_K252L) has the amino acid sequence shown.
  • the stable coenzyme is a coenzyme chemically altered from the native coenzyme, which has higher stability (e.g., hydrolytic stability) compared to the native coenzyme.
  • the stable coenzyme is stable to hydrolysis under test conditions.
  • the stable coenzyme can be a decreased
  • stable coenzymes are stable derivatives of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD / NADH) or nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP / NADPH), or truncated NAD derivatives, eg without AMP moiety or with non-nucleosidic residues, eg hydrophobic residues.
  • a stable coenzyme in the context of the present invention is the compound of the formula (I)
  • stable derivatives of NAD / NADH or NADP / NADPH are described in the aforementioned references, the disclosure of which is incorporated herein by reference.
  • Particularly preferred stabilized coenzymes are described in WO 2007/012494 and US Pat. No. 11 / 460,366, the disclosure of which is hereby expressly incorporated by reference.
  • the stable coenzyme is more preferably selected from compounds of general formula (II):
  • A adenine or an analogue thereof
  • T each independently O
  • S each independently OH
  • SH each independently OH
  • BH 3 " , BCNH 2 "
  • V each independently OH or a phosphate group, or two
  • X 1 , X 2 each independently O, CH 2 , CHCH 3 , C (CH 3 J 2 , NH, NCH 3 ,
  • Y NH 1 S 1 O 1 CH 2
  • Z a linear or cyclic organic radical, with the proviso that Z and the pyridine radical are not linked by a glycosidic compound, or
  • Z is particularly preferably a saturated or unsaturated carbocyclic or heterocyclic five-membered ring, in particular a compound of the general formula (III)
  • R 5 'and R 5 may be a single or double bond
  • the compounds of the invention contain adenine or adenine analogs such as C 8 and N 6 substituted adenine, deaza variants such as 7-deaza, azavaries such as 8-aza, or combinations such as 7-deaza or 8-aza or carbocyclic analogs, such as formycin, where the 7-deaza variants in the 7-position may be substituted by halogen, C 1 -C 6 -alkynyl, -alkenyl or -alkyl.
  • the compounds adenosine analogues which take ribose, for example, 2-methoxy-deoxyribose, 2 1 - Fluoro-deoxyribose, hexitol, altritol or polycyclic analogs containing as bicyclo-, LNA and tricyclo sugar.
  • ribose for example, 2-methoxy-deoxyribose, 2 1 - Fluoro-deoxyribose, hexitol, altritol or polycyclic analogs containing as bicyclo-, LNA and tricyclo sugar.
  • W is preferably CONH 2 or COCH 3 .
  • R 5 is preferably CH 2 . Furthermore, it is preferred that R 51 is selected from CH 2 , CHOH and NH. In a particularly preferred embodiment, R 5 'and R 5 "are each CHOH. In yet another preferred embodiment, R 51 is NH and R 5 " is CH 2 . Specific examples of preferred stabilized coenzymes are shown in Figures 1A and B.
  • the stable coenzyme to carbaNAD In the most preferred embodiment, the stable coenzyme to carbaNAD.
  • the inventive method is in particular for
  • enzymes suitable Long-term stabilization of enzymes suitable. This means that the enzyme stabilized with a stable coenzyme, e.g. as a dry substance, for example over a period of at least 2 weeks, preferably of at least 4 weeks and more preferably of at least
  • the method according to the invention comprises a storage of the stabilized with a stable coenzyme enzyme at elevated temperatures, for example at a temperature of at least 20 0 C, preferably of at least 25 0 C and more preferably of at least 30 0 C.
  • the enzyme activity preferably decreases by less than 50%, more preferably less than 30%, and most preferably less than 20% of their initial value.
  • the stabilization according to the invention makes it possible to store the stabilized enzyme with a stable coenzyme without drying reagent for a long time, as indicated above, and / or at high temperatures, as indicated above. Furthermore, the stabilized enzyme may also be maintained at a high relative humidity, e.g. a relative humidity of at least 50%, wherein the enzyme activity preferably decreases by less than 50%, more preferably less than 30% and most preferably less than 20% of the initial value.
  • a high relative humidity e.g. a relative humidity of at least 50%
  • the storage of the stabilized with a stable coenzyme enzyme can be done on the one hand as dry matter and on the other hand in liquid phase.
  • the storage of the stabilized enzyme preferably takes place on or in a test element which is suitable for the determination of an analyte.
  • That with a stable coenzyme stabilized enzyme is preferably part of a detection reagent, which may optionally contain other ingredients such as salts, buffers, etc.
  • the detection reagent is free from a mediator.
  • the stabilized with a stable coenzyme enzyme can be used for the detection of analytes, such as parameters in body fluids such as blood, serum, plasma or urine or in wastewater samples or food.
  • any biological or chemical substances which can be detected by a redox reaction e.g. Substances that are substrates of a coenzyme-dependent enzyme or coenzyme-dependent enzymes themselves.
  • Preferred examples of analytes are glucose, lactic acid, malic acid, glycerol, alcohol, cholesterol, triglycerides, ascorbic acid, cysteine, glutathione, peptides, urea , Ammonium, salicylate, pyruvate, 5'-nucleotidase, creatine kinase (CK), lactate dehydrogenase (LDH), carbon dioxide, etc.
  • the analyte is glucose. 0
  • Another object of the present invention is the use of a compound of the invention or a stabilized with a stable coenzyme enzyme for the detection of an analyte in a sample by an enzymatic reaction.
  • a compound of the invention or a stabilized with a stable coenzyme enzyme for the detection of an analyte in a sample by an enzymatic reaction.
  • Particularly preferred here is the detection of glucose with the aid of glucose dehydrogenase (GlucDH).
  • the change of the stable coenzyme by reaction with the analyte can basically be detected in any way.
  • all methods known from the prior art for detecting enzymatic reactions can be used.
  • the change in the coenzyme is detected by optical methods.
  • Optical detection methods include, for example, the Measurement of absorption, fluorescence, circular dichroism (CD), optical rotation dispersion (ORD), refractometry etc.
  • An optical detection method which is preferably used in the context of the present application, is photometry.
  • photometry For the photometric measurement of a change in the coenzyme due
  • Nitrosoanilines such as [(4-nitrosophenyl) imino] dimethanol hydrochloride, quinones such as phenanthrenequinones, phenanthroline quinones or benzo [h] quinoline quinones, phenazines such as 1- (3-carboxypropoxy) -5-ethylphenazinium trifluoromethanesulfonate, or / and diaphorase (EC 1.6.99.2).
  • Preferred examples of phenanthroline quinones include 1, 10-phenanthroline-5,6-quinones, 1, 7-phenanthroline-5,6-quinones, 4,7-quinones,
  • Phenanthroline-5,6-quinones and their N-alkylated or N, N'-dialkylated salts wherein in the case of N-alkylated or N, N'-dialkylated salts halides, trifluoromethanesulfonate or other solubility enhancing anions are preferred as the counterion.
  • any substance can be used which is reducible and upon reduction undergoes a detectable change in its optical properties, such as color, fluorescence, remission, transmission, polarization and / or refractive index.
  • the determination of the presence or / and the amount of the analyte in the sample can be done with the naked eye and / or by means of a detection device using a photometric method which appears to be suitable for the person skilled in the art.
  • heteropolyacids, and especially 2,18-phosphomolybdic acid are used as optical indicators which are reduced to the corresponding heteropolyblue.
  • the change in the coenzyme is detected by measuring the fluorescence.
  • the fluorescence measurement is highly sensitive and enables the detection even of low concentrations of the analyte in miniaturized systems.
  • the change in coenzyme can also be detected electrochemically using a suitable test element, such as an electrochemical test strip.
  • a suitable test element such as an electrochemical test strip.
  • suitable mediators which can be converted by the reduced coenzyme by transferring electrons into a reduced form.
  • the analyte is determined by measuring the current required for reoxidation of the reduced mediator, which correlates with the concentration of the analyte in the sample.
  • mediators that can be used for electrochemical measurements include in particular the aforementioned mediators used for photometric measurements.
  • a liquid test may be used, the reagent being e.g. in the form of a solution or suspension in an aqueous or non-aqueous liquid or as a powder or lyophilisate.
  • a dry test may also be used wherein the reagent is applied to a carrier, a test strip.
  • the carrier may comprise a test strip comprising an absorbent and / or swellable material which is wetted by the sample liquid to be examined.
  • a particularly preferred assay format involves the use of the enzyme glucose dehydrogenase with a stable NAD derivative to detect glucose, wherein a derivative of the reduced coenzyme NADH is formed.
  • the detection of NADH is carried out by optical methods, eg by photometric or fluorometric determination after UV excitation.
  • a particularly preferred test system is described in US 2005/0214891, which is incorporated herein by reference.
  • a still further object of the present invention is a stabilized with a stable coenzyme enzyme, wherein the stabilized enzyme at a storage of preferably at least 2 weeks, more preferably at least 4 weeks and most preferably at least 8 weeks at a temperature of preferably at least 20 0 C. , more preferably at least 25 ° C., and most preferably at least 30 ° C., optionally at high humidity and without dry reagent, a decrease in enzymatic activity of less than 50%, preferably less than 30% and most preferably less than 20% from baseline having.
  • Yet another object of the invention is a detection reagent for the determination of an analyte which contains a stabilized with a stable coenzyme enzyme, as indicated above.
  • the invention relates to a test element which contains a stabilized enzyme or a detection reagent according to the invention.
  • the detection reagent or the test element may be suitable by performing dry or liquid tests.
  • the test element is a test strip for the fluorometric or photometric detection of an analyte.
  • Such a test strip contains the stable coenzyme stabilized enzyme immobilized on an absorbent or / and swellable material, such as cellulose, plastics, etc.
  • Figure 1A Representation of the stable coenzyme carba-NAD (cNAD).
  • Figure 1 B Representation of the stable coenzyme pyrrolidinyl-NAD.
  • Figure 2 Representation of the results of the enzyme kinetics of glucose dehydrogenase in the presence of NAD or of glucose dehydrogenase in the presence of cNAD before and after storage.
  • Figure 2A Kinetics of GlucDH in the presence of NAD after 1 day.
  • 2B Kinetics of GlucDH in the presence of cNAD after 1 day.
  • 2C Kinetics of GlucDH in the presence of NAD after 5 weeks of storage at 32 0 C and 85% relative humidity.
  • 2D Kinetics of GlucDH in the presence of cNAD after 5 weeks of storage at 32 0 C and 85% relative humidity.
  • Figure 3 Comparison of Blank values of glucose-dehydrogenase in the presence of NAD or of GlucDH in the presence of cNAD over a period of up to 5 weeks at 32 C C and 85% humidity.
  • Figure 4 Representation of various functional curves of glucose dehydrogenase after storage of glucose dehydrogenase in the presence of NAD at 32 0 C and 85% humidity. The storage duration varied between 1 day and 5 weeks.
  • Figure 5 Representation of various functional curves of glucose dehydrogenase after storage of glucose dehydrogenase in the presence of cNAD at 32 0 C and 85% humidity. The storage period varied between 1 day and 5 weeks (FIG. 5A) or between 1 day and 24 weeks (FIG. 5B).
  • Figure 6 Representation of the residual content of NAD or cNAD after storage of glucose dehydrogenase in the presence of NAD or cNAD for 24 weeks at 32 0 C and 85% humidity.
  • FIG. 7 Representation of GlucDH activity after storage of glucose Dehydrogenase in the presence of NAD or cNAD over 5 weeks ( Figure 7A) and 24 weeks ( Figure 7B) at 32 0 C and 85% humidity.
  • FIG. 8 Representation of GlucDH activity after storage of glucose dehydrogenase (GlucDH wt), the double mutant GlucDH_E96G_E170K (GlucDH Mut1) and the double mutant GlucDH_E170K_K252L (GlucDH Mut2) over a period of 25 weeks in the presence of NAD or cNAD at 32 0 C and 83% relative humidity.
  • GlucDH wt glucose dehydrogenase
  • GlucDH Mut1 double mutant GlucDH_E96G_E170K
  • GlucDH Mut2 double mutant GlucDH_E170K_K252L
  • FIG. 9 Gel electrophoretic analysis of glucose dehydrogenase after storage in the presence of NAD or cNAD. Test conditions: MW, 10-220 kDa markers; 1: GlucDH / NAD, 5 weeks at 6 0 C; 2: GlucDH / NAD, 5 weeks at 32 ° C / 85% relative humidity; 3: GlucDH / cNAD, 5 weeks at 6 0 C; 4: GlucDH / cNAD, 5 weeks at 32 ° C / 85% relative humidity.
  • Figure 10 Gel electrophoretic analysis of glucose dehydrogenase after storage at 50 0 C in the presence of NAD or cNAD. Test conditions: MW, 10-220 kDa markers; 1: GlucDH 8.5 mg / ml, NAD, 0 hours; 2: GlucDH 8.5 mg / ml, NAD, 22 hours; 3: GlucDH 8.5 mg / ml, NAD, 96 hours; 4: GlucDH 8.5 mg / ml, NAD, 118 hours; 5: GlucDH 8.5 mg / ml, NAD 1 140 hours; 6: GlucDH 8.5 mg / ml, NAD, 188 hours; 7: GlucDH 8.5 mg / ml, NAD, 476 hours; 8: GlucDH 8.5 mg / ml, cNAD, 0 hours; 9: GlucDH 8.5 mg / ml, cNAD, 188 hours; 10: GlucDH 8.5 mg / ml,
  • Figure 11 Representation of the stability of glucose dehydrogenase in the presence of NAD or cNAD in liquid phase at 50 0 C over a period of 4 days ( Figure 11A) and 14 days ( Figure 11B).
  • Test conditions GlucDH 10 mg / ml; NAD or cNAD 12 mg / ml; Buffer: 0.1 M Tris, 1.2 M NaCl, pH 8.5; Temperature 50 ° C.
  • FIG. 12 Gel electrophoretic analysis of alcohol dehydrogenase Yeast after storage in the presence of NAD or cNAD. Test conditions: MW, 10-220 kDa markers; 1: ADH 1 65 hours at 6 0 C; 2: ADH / cNAD, 65 hours at 6 0 C; 3: ADH / NAD, 65 hours at 60 ° C; 4: ADH, 65 hours at 35 ° C .; 5: ADH / cNAD, 65 hours at 35 0 C; 6: ADH / NAD, 65 hours at 35 ° C.
  • Figure 13 Gel electrophoretic analysis of alcohol dehydrogenase from yeast after storage at 35 0 C in the presence of NAD or cNAD.
  • Test conditions MW, 10-220 kDa markers; 1: ADH / NAD, 0 days; 2: ADH / NAD, 1 day; 3: ADH / NAD, 2 days; 4: ADH / NAD, 3 days; 5: ADH / NAD, 5 days; 6: ADH / cNAD, 0 days; 7: ADH / cNAD, 1 day; 8: ADH / cNAD, 2 days; 9: ADH / cNAD, 3 days; 10: ADH / cNAD, 6 days.
  • Figure 14 Representation of the stability of alcohol dehydrogenase from yeast in the presence of NAD or cNAD in liquid phase at 35 0 C over a period of 65 hours.
  • Test conditions ADH 5 mg / ml; NAD or cNAD 50 mg / ml; Buffer: 75 mM Na 4 P 2 O 7 , glycine, pH 9.0; Temperature 35 ° C.
  • FIG. 15 Illustration of various functional curves of glucose dehydrogenase after 11 weeks of storage in the presence of NAD and different mediators at room temperature.
  • FIG. 16 Preparation of the results of the enzyme kinetics of glucose dehydrogenase in the presence of NAD and 1- (3-carboxypropoxy) -5-ethylphenazinium trifluoromethanesulfonate at various glucose concentrations.
  • FIG. 17 Schematic representation of the glucose detection with GlucDH as enzyme and diaphorase as mediator.
  • Figure 18 Representation of the functional curves of glucose-dye oxidoreductase (GlucDOR) in the presence of pyrroloquinoline quinone (PQQ) and [(4-nitrosophenyl) imino] dimethanol hydrochloride as a mediator or of Glucose dehydrogenase in the presence of NAD and diaphorase / [(4-nitrosophenyl) imino] dimethanol hydrochloride as a mediator.
  • PQQ pyrroloquinoline quinone
  • NAD and diaphorase / [(4-nitrosophenyl) imino] dimethanol hydrochloride as a mediator.
  • FIG. 19 Representation of the results of the enzyme kinetics of glucose dehydrogenase in the presence of NAD and diaphorase at various glucose concentrations.
  • FIG. 20 Representation of the current measured as a function of the glucose concentration during the electrochemical determination of glucose using glucose dehydrogenase in the presence of NAD or cNAD. Test conditions: 25 mM NAD or cNAD; 2.5 seconds delay; 5 seconds measurement time.
  • Figure 21 Representation of the amino acid sequences of the glucose dehydrogenase double mutant GlucDH_E96G_E170K and
  • Glucose-specific GlucDH was added to carba-NAD (Fig. 1A) or NAD. These formulations were each applied to Pokalon (Lonza) and stored after drying under warm and humid conditions (32 0 C, 85% relative humidity). Subsequently, the reaction kinetics and the function curve were determined at regular intervals. At the same time, a cNAD / NAD analysis and a determination of the residual activity of the enzyme was performed at the respective measurement dates.
  • the relationship between the structure of the coenzyme and its stability over a predetermined period of time is derived from Figure 6. Accordingly, the residual content of cNAD is in a glucose-detecting reagent after 24 weeks of storage (at 32 0 C and 85% relative humidity) for about 80% of the Initial level, while the content of NAD in an NAD-stabilized glucose detection reagent already after 5 weeks to about 35% of the initial value decreases and after extrapolation after about 17 weeks to zero.
  • the residual activity of GlucDH can be further increased.
  • the residual activity of a mutant GlucDH_E96G_E170K with amino acid substitutions glutamic acid is ⁇ glycine at position 96 and glutamic acid ⁇ lysine at position 170 (GlucDH Mut1) of the wild type enzyme approximately 70% while the residual activity of a mutant GlucDH_E170K_K252L with
  • Presence of cNAD stored enzyme against a band detected at the beginning of the experiment shows only a slight change.
  • glucose dehydrogenase For the determination of glucose, various test systems, each comprising glucose dehydrogenase, NAD 1 a mediator and optionally an optical indicator were measured photometrically or electrochemically.
  • FIG. 18 shows for the system glucose dehydrogenase, NAD, diaphorase, [(4-nitrosophenyl) imino] dimethanol hydrochloride and 2.18-
  • Phosphomolybdic acid (system 1) a concentration-dependent decrease in remission.
  • system glucose-dye oxidoreductase, pyrroloquinoline quinone, [(4-nitrosophenyl) imino] dimethanol hydrochloride and 2,18-phosphomolybdic acid (System 2), which likewise causes a concentration-dependent decrease in remission, due to the low specificity of glucose DYE oxidoreductase but has disadvantages.
  • the kinetics of the conversion of glucose by means of the system 1 at glucose concentrations in the range of 0 to 800 mg / dl is shown in FIG.
  • an electrochemical measurement can also be used for the purpose of determining the analyte.
  • a test element which, in addition to glucose dehydrogenase, contained NAD as coenzyme and 1- (3-carboxypropoxy) -5-ethylphenazinium trifluoromethanesulfonate as mediator, as well as for a corresponding system comprising the stabilized coenzyme cNAD instead of NAD , a linear dependence of the current required for reoxidation of the reduced mediator on the glucose concentration ( Figure 20).
  • the analyte determination using the system dehydrogenase / stable coenzyme can also be carried out by means of electrochemical detection and evaluation with a different wavelength, which is independent of the coenzyme.
  • the stable enzyme / coenzyme pair the total formulation should also be further stabilized.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Stabilisierung eines Enzyms durch Lagerung des Enzyms in Gegenwart eines stabilen Coenzyms. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein mit einem stabilen Coenzym stabilisiertes Enzyms sowie dessen Verwendung in Testelementen zum Nachweis von Analyten.

Description

Stabilisierung von Dehydrogenasen mit stabilen Coenzymen
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Stabilisierung eines Enzyms durch Lagerung des Enzyms in Gegenwart eines stabilen Coenzyms. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein mit einem stabilen Coenzym stabilisiertes Enzym sowie dessen Verwendung in Testelementen zum Nachweis von Analyten.
Biochemische Messsysteme sind wichtige Bestandteile klinisch relevanter Analyseverfahren. Hierbei steht die Messung von Analyten, z.B. Metaboliten oder Substraten, im Vordergrund, welche mit Hilfe eines Enzyms direkt oder indirekt bestimmt werden. Die Analyten werden hierbei mit Hilfe eines Enzym-Coenzym-Komplexes umgesetzt und anschließend quantifiziert. Dabei wird der zu bestimmende Analyt mit einem geeigneten Enzym und einem Coenzym in Kontakt gebracht, wobei das Enzym meist in katalytischen Mengen eingesetzt wird. Das Coenzym wird durch die enzymatische Reaktion verändert, z.B. oxidiert bzw. reduziert. Dieser Vorgang kann direkt oder durch einen Mediator elektrochemisch oder photometrisch erfasst werden. Eine Kalibrierung liefert einen direkten Zusammenhang des Messwerts mit der Konzentration des zu bestimmenden Analyten.
Coenzyme sind organische Moleküle, die kovalent oder nicht-kovalent an ein Enzym gebunden sind und durch die Umsetzung des Analyten verändert werden. Prominente Beispiele für Coenzyme sind Nicotinamid-Adenin- Dinukleotid (NAD) bzw. Nicotinamid-Adenin-Dinukleotidphosphat (NADP), aus denen durch Reduktion NADH bzw. NADPH entstehen.
Aus dem Stand der Technik bekannte Messsysteme zeichnen sich durch eine zeitlich begrenzte Haltbarkeit sowie durch spezielle Anforderungen an die Umgebung, wie Kühlung oder trockene Lagerung, zur Erzielung dieser Haltbarkeit aus. Bei bestimmten Anwendungsformen, z.B. bei Tests, die vom Endverbraucher selbst durchgeführt werden, wie etwa beim Blutglucose- Selbstmonitoring, können daher Fehlergebnisse durch falsche, unbemerkte Fehllagerung vorkommen. Besonders die Erschöpfung von Trocknungsmitteln durch zu langes öffnen der Primärverpackungen kann zu Fehlmessungen führen, die bei manchen Systemen vom Verbraucher kaum zu erkennen sind.
Eine bekannte Maßnahme, die zur Erhöhung der Stabilität von biochemischen Messsystemen eingesetzt wird, ist die Verwendung stabiler Enzyme, z.B. die Verwendung von Enzymen aus thermophilen Organismen. Weiterhin besteht die Möglichkeit, Enzyme durch chemische Modifizierung, z.B. Quervernetzung, oder durch Mutagenese zu stabilisieren. Darüber hinaus können auch Enzymstabilisatoren, wie z.B. Trehalose, Polyvinylpyrrolidon und Serumalbumin, zugesetzt werden oder die Enzyme z.B. durch Photopolymerisation in Polymernetzwerke eingeschlossen werden.
Weiterhin wird versucht, die Haltbarkeit biochemischer Messsysteme durch Verwendung stabiler Mediatoren zu verbessern. So wird durch die Verwendung von Mediatoren mit möglichst niedrigem Redoxpotential die Spezifität von Tests erhöht und Störungen während der Reaktion eliminiert. Eine untere Grenze für das Redoxpotential von Mediatoren bilden jedoch die Redoxpotentiale der Enzym/Coenzymkomplexe. Werden diese unterschritten, wird die Reaktion mit den Mediatoren verlangsamt oder gar unterbunden.
Alternativ können auch biochemische Messsysteme ohne Mediatoren verwendet werden, bei denen beispielsweise eine direkte Detektion von Coenzymen, z.B. des Coenzyms NADH, erfolgt. Ein Nachteil solcher Messsysteme besteht jedoch darin, dass Coenzyme, wie NAD und NADP, instabil sind. NAD und NADP sind basenlabile Moleküle, deren Abbauwege in der Literatur beschrieben sind (N.J. Oppenheimer in The Pyridine Nucleotide Coenzyms Academic Press New York, London 1982, Hrsg. J. Everese, B. Anderson, K. You, Kapitel 3, Seiten 56-65). Im wesentlichen entsteht beim Abbau von NAD bzw. NADP ADP-Ribose, indem die Glycosyl-Bindungen zwischen der Ribose und der Pyridineinheit gespalten wird. Die reduzierten Formen NADH und NADPH sind hingegen säurelabil: z.B. ist die Epimerisierung ein bekannter Abbauweg. In beiden Fällen liegt der Instabilität von NAD/NADP und NADH/NADPH die Labilität der Glykosyl- Bindung zwischen der Ribose- und der Pyridineinheit zugrunde. Aber auch unter nicht drastischen Bedingungen, wie z.B. in wässriger Lösung, geschieht die Hydrolyse der Coenzyme NAD bzw. NADP allein schon durch die Umgebungsfeuchte. Diese Instabilität kann zu Ungenauigkeiten bei der Messung von Analyten führen.
Eine Reihe von NAD/NADP-Derivaten wird z.B. in B. M. Anderson in the Pyridine Nucleotide Coenzymes, Academic Press New York, London 1982 , Hrsg. J. Everese, B. Anderson, K. You, Kapitel 4 beschrieben. Die meisten dieser Derivate werden allerdings nicht gut von Enzymen akzeptiert. Das einzige Derivat, das daher bisher für diagnostische Tests verwendet wurde, ist 3-Acetylpyridin-Adenin-Dinukleotid (Acetyl NAD), welches erstmals 1956 beschrieben wurde (N.O. Kaplan, J. Biol. Chem. (1956), 221, 823). Auch dieses Coenzym zeigt eine geringe Akzeptanz von Enzymen und eine Änderung im Redoxpotential.
In WO 01/94370 ist die Verwendung weiterer NAD-Derivate mit einer modifizierten Pyridin-Gruppe beschrieben. Modifikationen der Nicotinamid- Gruppe haben jedoch generell direkten Einfluss auf die katalytische Reaktion. In den meisten Fällen ist dieser Einfluss negativ.
In einem weiteren Stabilisierungskonzept wurde die Ribose-Einheit verändert, um dadurch die Stabilität der Glycosyl-Bindung zu beeinflussen. Dieses Vorgehen interferiert nicht direkt mit der katalytischen Reaktion der - A -
Nicotinamid-Gruppe. Es kann jedoch ein indirekter Einfluss bestehen, sobald das Enzym eine starke und spezifische Bindung an die Ribose-Einheit aufweist. Kaufmann et al. offenbaren diesbezüglich in WO 98/33936 und US 5,801 ,006 bzw. in WO 01/49247 eine Reihe von Thioribose-NAD Derivaten. Ein Zusammenhang zwischen der Modifizierung der Nicotinamid- Riboseeinheit und der Aktivität der Derivate in enzymatischen Reaktionen wurde bisher jedoch nicht gezeigt.
carba NAD, ein Derivat ohne Glycosyl-Bindung, wurde erstmals 1988 beschrieben (JT. Slama, Biochemistry 1989, 27, 183 und Biochemistry 1989, 28, 7688). Die Ribose wird hierin durch eine carbazyklische Zucker- Einheit substituiert. carbaNAD wurde zwar als Substrat für Dehydrogenasen beschrieben, seine Aktivität wurde bisher jedoch nicht in biochemischen Nachweisverfahren in der Klinik nachgewiesen.
Ein ähnlicher Ansatz wurde später von G. M. Blackbum, Chem. Comm., 1996, 2765 beschrieben, um carbaNAD mit einer Methylenbisphosphonat- Verbindung an Stelle des natürlichen Pyrophosphats herzustellen. Das Methylenbisphosphonat zeigt erhöhte Stabilität gegen Phosphatasen und wurde als Inhibitor für ADP-Ribosylcyclase verwendet. Eine Stabilitätserhöhung gegenüber Hydrolyse war nicht das Ziel (JT. Slama, G.M. Blackburn).
WO 2007/012494 und US 11/460,366 offenbaren stabile NAD/NADH bzw. NADP/NADPH Derivate, Enzym-Komplexe dieser Derivate und ihre Verwendung in biochemischen Nachweisverfahren und Reagenzienkits.
Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe war es, Verfahren zur Stabilisierung von Enzymen, insbesondere zur Langzeitstabiliserung von Enzymen bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Stabilisierung eines Enzyms, wobei man das Enzym in Gegenwart eines stabilen Coenzyms lagert. Überraschenderweise wurde gefunden, dass mit Hilfe eines stabilen Coenzyms eine Langzeitstabiliserung von mehreren Wochen bzw. Monaten bei hoher relativer Feuchte oder sogar in flüssiger Phase und bei erhöhten Temperaturen möglich ist. Diese Erkenntnis ist überraschend, da bekannt ist, dass Enzyme in Gegenwart von nativem Coenzym zwar eine erhöhte Kurzzeitstabilität für einige Stunden besitzen (Bertoldi et al., Biochem. J. 389, (2005), 885-898; van den Heuvel et al. (J. Biol. Chem. 280 (2005), 32115-32121 ; und Pan et al. (J. Chin. Biochem. Soc. Vol. 3 (1974), pp. 1-8), aber eine geringere Haltbarkeit über einen längeren Zeitraum aufweisen (Nutrition Reviews 36 (1978), 251-254).
Gegenüber diesen Erkenntnissen gegenüber dem Stand der Technik war es überraschend, dass ein Enzym in Gegenwart eines stabilen Coenzyms eine deutlich erhöhte Langzeitstabilität als ein Enzym in Gegenwart eines nativen Coenzyms besitzt, insbesondere da die stabilen Coenzyme eine niedrigere Bindungskonstante mit dem Enzym als das native Coenzym besitzen.
Das durch das erfindungsgemäße Verfahren stabilisierte Enzym ist ein Coenyzm-abhängiges Enzym. Geeignete Enzyme sind z.B. Dehydrogenasen, ausgewählt aus einer Glucose-Dehydrogenase (E. C. 1.1.1.47), Lactat-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.27, 1.1.1.28), Malat- Dehydrogenase (E.C.1.1.1.37), Glycerin-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.6), Alkohol-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.1), alpha-Hydroxybutyrat-
Dehydrogenase, Sorbitol-Dehydrogenase oder Aminosäure-Dehydrogenase, z. B. L-Aminosäure-Dehydrogenase (E.C.1.4.1.5). Weitere geeignete Enzyme sind Oxidasen, wie etwa Glucoseoxidase (E.C.1.1.3.4) oder Cholesterinoxidase (E.C.1.1.3.6) bzw. Aminotransferasen, wie z.B. Aspartat oder Alanin Aminotransferase, 5'-Nukleotidase oder Creatin-Kinase. Vorzugsweise ist das Enzym Glucose-Dehydrogenase.
Als besonders bevorzugt hat sich im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens der Einsatz einer mutierten Glucose-Dehydrogenase erwiesen. Der Begriff „Mutante", wie er im Rahmen der vorliegenden Anmeldung verwendet wird, bezeichnet eine genetisch veränderte Variante eines nativen Enzyms, welche bei gleicher Anzahl an Aminosäuren eine gegenüber dem Wildtyp-Enzym veränderte Aminosäuresequenz besitzt, d.h. sich in mindestens einer Aminosäure vom Wildtyp-Enzym unterscheidet. Die Einführung der Mutation(en) kann ortsspezifisch oder nicht-ortsspezifisch, bevorzugt ortsspezifisch unter Verwendung von im Fachbereich bekannten rekombinanten Methoden, erfolgen, wobei entsprechend den jeweiligen Anforderungen und Bedingungen mindestens ein Aminosäureaustausch innerhalb der Aminosäuresequenz des nativen Enzyms resultiert. Besonders bevorzugt weist die Mutante eine gegenüber dem Wildtyp-Enzym erhöhte thermische oder hydrolytische Stabilität auf.
Die mutierte Glucose-Dehydrogenase kann die gegenüber der korrespondierenden Wildtyp-Glucose-Dehydrogenase veränderte(n) Aminosäure(n) grundsätzlich an einer beliebigen Position ihrer Aminosäuresequenz enthalten. Vorzugsweise umfasst die mutierte Glucose- Dehydrogenase eine Mutation an mindestens einer der Positionen 96, 170 und 252 der Aminosäuresequenz der Wildtyp-Glucose-Dehydrogenase, wobei Mutanten mit Mutationen an Position 96 und Position 170 bzw. Mutationen an Position 170 und Position 252 besonders bevorzugt sind. Als vorteilhaft hat es sich erwiesen, wenn die mutierte Glucose-Dehydrogenase neben diesen Mutationen keine weiteren Mutationen enthält.
Die Mutation an den Positionen 96, 170 und 252 kann grundsätzlich einen beliebigen Aminosäureaustausch umfassen, welcher zu einer Stabilisierung, z.B. einer Erhöhung der thermischen oder hydrolytischen Stabilität, des Wildtyp-Enzyms führt. Vorzugsweise umfasst die Mutation an Position 96 einen Aminosäureaustausch von Glutaminsäure gegen Glycin, während in Bezug auf Position 170 ein Aminosäureaustausch von Glutaminsäure gegen Arginin oder Lysin, insbesondere ein Aminosäureaustausch von Glutaminsäure gegen Lysin, bevorzugt ist. Was die Mutation an Position 252 anbetrifft, so umfasst diese bevorzugt einen Aminosäureaustausch von Lysin gegen Leucin. Die mutierte Glucose-Dehydrogenase kann durch Mutation einer aus einer beliebigen biologischen Quelle stammenden Wildtyp-Glucose- Dehydrogenase erhalten werden, wobei der Begriff „biologische Quelle" im Sinne dieser Erfindung sowohl Prokaryoten, wie beispielsweise Bakterien, als auch Eukaryoten, wie beispielsweise Säuger und andere Tiere, umfasst. Vorzugsweise entstammt die Wildtyp-Glucose-Dehydrogenase einem Bakterium, wobei es sich besonders bevorzugt um eine Glucose- Dehydrogenase aus Bacillus megaterium, Bacillus subtilis oder Bacillus thuringiensis, insbesondere aus Bacillus subtilis, handelt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der mutierten Glucose-Dehydrogenase um eine durch Mutation von Wildtyp-Glucose-Dehydrogenase aus Bacillus subtilis erhaltene Glucose-Dehydrogenase, welche die in SEQ ID NO: 1 (GlucDH_E96G_E170K) oder die in SEQ ID NO: 2 (GlucDH_E170K_K252L) dargestellte Aminosäuresequenz besitzt.
Das stabile Coenzym ist ein gegenüber dem nativen Coenzym chemisch verändertes Coenzym, welches eine im Vergleich zum nativen Coenyzm höhere Stabilität, (z.B. hydrolytische Stabilität) aufweist. Vorzugsweise ist das stabile Coenyzm unter Testbedingungen gegenüber Hydrolyse stabil. Im
Vergleich zum nativen Coenzym kann das stabile Coenzym eine verringerte
Bindungskonstante für das Enzym aufweisen, beispielsweise eine um den Faktor von 2 oder mehr verringerte Bindungskonstante.
Bevorzugte Beispiele für stabile Coenzyme sind stabile Derivate von Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD/NADH) oder Nicotinamid-Adenin- Dinukleotidphosphat (NADP/NADPH), oder verkürzte NAD-Derivate, z.B. ohne AMP-Teil bzw. mit nicht nukleosidischen Resten, z.B. hydrophoben Resten. Ebenfalls bevorzugt ist als stabiles Coenzym im Sinne der vorliegenden Erfindung ist die Verbindung der Formel (I)
Figure imgf000009_0001
(I)-
Bevorzugte stabile Derivate von NAD/NADH bzw. NADP/NADPH sind in den zuvor genannten Referenzen beschrieben, auf deren Offenbarung hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird. Besonders bevorzugte stabilisierte Coenzyme sind in WO 2007/012494 bzw. US 11/460,366 beschrieben, auf deren Offenbarung hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird. Das stabile Coenzym wird besonders bevorzugt aus Verbindungen mit der allgemeinen Formel (II) ausgewählt:
Figure imgf000009_0002
(II)
mit A = Adenin oder ein Analog davon, T = jeweils unabhängig O, S, U = jeweils unabhängig OH, SH, BH3 ", BCNH2 ", V = jeweils unabhängig OH oder eine Phosphatgruppe, oder zwei
Gruppen, die eine cyclische Phosphatgruppe bilden; W = COOR, CON(R)2, COR, CSN(R)2 mit R = jeweils unabhängig
H oder Ci-C2-Alkyl,
X1, X2 = jeweils unabhängig O, CH2, CHCH3, C(CH3J2, NH, NCH3,
Y = NH1 S1 O1 CH2, Z = ein linearer oder cyclischer organischer Rest ist, mit der Maßgabe, dass Z und der Pyridin-Rest nicht durch eine glycosidische Verbindung verknüpft sind, oder ein
Salz oder gegebenenfalls eine reduzierte Form davon.
In den Verbindungen der Formel (II) ist Z vorzugsweise ein linearer Rest mit 4-6 C-Atomen, vorzugsweise 4 C-Atomen, worin 1 oder 2 C-Atome gegebenenfalls durch ein oder mehrere Heteroatome ausgewählt aus O, S und N ersetzt sind, oder ein Rest umfassend eine cyclische Gruppe mit 5 oder 6 C-Atomen, die gegebenenfalls ein Heteroatom ausgewählt aus O, S und N sowie gegebenenfalls einen oder mehrere Substituenten enthält, und einen Rest CR4 2, wobei CR4 2 an die cyclische Gruppe und an X2 gebunden ist, mit R4 = jeweils unabhängig H, F, Cl, CH3.
Besonders bevorzugt ist Z ein gesättiger oder ungesättigter carbocyclischer oder heterocyclischer Fünfring, insbesondere eine Verbindung der allgemeinen Formel (III)
Figure imgf000010_0001
(IM)
wobei zwischen R5' und R5" eine Einfach- oder Doppelbindung vorliegen kann, mit
R4 = jeweils unabhängig H, F, Cl1 CH3, R5 =CR4 2, wobei R51 = O, S, NH, NCi-CVAlkyl, CR4 2, CHOH, CHOCH3, und R5" = CR42, CHOH1 CHOCH3, wenn zwischen R51 und R5" eine Einfachbindung vorliegt, und wobei R5l=R5"=CR4, wenn zwischen R5' und R5" eine Doppelbindung vorliegt, und R6, R6' = jeweils unabhängig CH oder CCH3.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die erfindungsgemäßen Verbindungen Adenin oder Adenin-Analoga, wie z.B. C8- und N6- substituiertes Adenin, Deaza-Varianten wie 7-Deaza, Azavarianten wie 8- Aza oder Kombinationen wie 7-Deaza oder 8-Aza oder carbocyclische Analoga, wie Formycin, wobei die 7-Deazavarianten in der 7-Position mit Halogen, Ci-C6-Alkinyl, -Alkenyl oder -Alkyl substituiert sein können.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthalten die Verbindungen Adenosin-Analoga, welche statt Ribose z.B. 2-Methoxy-deoxyribose, 21- Fluoro-deoxyribose, Hexitol, Altritol bzw. polycyclische Analoga, wie Bicyclo-, LNA- und Tricyclo-Zucker enthalten.
Insbesondere können in den Verbindungen der Formel (II) auch (Di-)- Phosphatsauerstoffe isotronisch ersetzt sein, wie z.B. O" durch S" bzw. BH3 ", O durch NH1 NCH3 bzw. CH2 und =O durch =S.
In den erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (II) ist W vorzugsweise CONH2 oder COCH3.
In den Gruppen der Formel (IM) ist R5 vorzugsweise CH2. Weiterhin ist bevorzugt, dass R51 ausgewählt ist aus CH2, CHOH und NH. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind R5' und R5" jeweils CHOH. In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist R51 NH und R5" CH2. Spezifische Beispiele für bevorzugte stabilisierte Coenzyme sind in Figur 1A und B abgebildet.
In der am stärksten bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem stabilen Coenzym um carbaNAD.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere zur
Langzeitstabilisierung von Enzymen geeignet. Dies bedeutet, dass man das mit einem stabilen Coenzym stabilisierte Enzym, z.B. als Trockensubstanz, beispielsweise über eine Dauer von mindestens 2 Wochen, vorzugsweise von mindestens 4 Wochen und besonders bevorzugt von mindestens
8 Wochen lagert und wobei die Enzymaktivität vorzugsweise um weniger als
50 %, besonders bevorzugt weniger als 30 % und am meisten bevorzugt um weniger als 20 % bezüglich des Ausgangswerts der Enzymaktivität abnimmt.
Weiterhin umfasst das erfindungsgemäße Verfahren eine Lagerung des mit einem stabilen Coenzym stabilisierten Enzyms bei erhöhten Temperaturen, beispielsweise bei einer Temperatur von mindestens 20 0C, vorzugsweise von mindestens 25 0C und besonders bevorzugt von mindestens 30 0C. Die Enzymaktivität nimmt dabei vorzugsweise um weniger als 50 %, besonders bevorzugt weniger als 30 % und am meisten bevorzugt weniger als 20 % bezüglich ihres Ausgangswerts ab.
Durch die erfindungsgemäße Stabilisierung ist es möglich, das mit einem stabilen Coenzym stabilisierte Enzym auch ohne Trocknungsreagenz für eine lange Zeit, wie oben angegeben, und/oder bei hohen Temperaturen, wie oben angegeben, zu lagern. Weiterhin kann das stabilisierte Enzym auch bei einer hohen relativen Luftfeuchtigkeit, z.B. einer relativen Luftfeuchtigkeit von mindestens 50 % gelagert werden, wobei die Enzymaktivität vorzugsweise um weniger als 50 %, besonders bevorzugt weniger als 30 % und am meisten bevorzugt weniger als 20 % bezüglich des Ausgangswerts abnimmt.
Die Lagerung des mit einem stabilen Coenzym stabilisierten Enzyms kann einerseits als Trockensubstanz und andererseits in Flüssigphase erfolgen. Bevorzugt erfolgt die Lagerung des stabilisierten Enzyms auf oder in einem Testelement, das zur Bestimmung eines Analyten geeignet ist. Das mit einem stabilen Coenzym stabilisierte Enzym ist dabei vorzugsweise Bestandteil eines Nachweisreagenz, welches gegebenenfalls noch weitere Bestandteile wie etwa Salze, Puffer, etc. enthalten kann. Vorzugsweise ist das Nachweisreagenz dabei frei von einem Mediator.
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Das mit einem stabilen Coenzym stabilisierte Enzym kann zum Nachweis von Analyten, beispielsweise Parametern in Körperflüssigkeiten wie etwa Blut, Serum, Plasma oder Urin bzw. in Abwasserproben oder Lebensmitteln eingesetzt werden. 0
Als Analyten können beliebige biologische oder chemische Substanzen bestimmt werden, die durch eine Redoxreaktion nachgewiesen werden können, z.B. Substanzen, bei denen es sich um Substrate eines Coenzym- abhängigen Enzyms handelt oder Coenzym-abhängige Enzyme selbst.s Bevorzugte Beispiele für Analyten sind Glucose, Milchsäure, Äpfelsäure, Glycerin, Alkohol, Cholesterin, Triglyceride, Ascorbinsäure, Cystein, Glutathion, Peptide, Harnstoff, Ammonium, Salicylat, Pyruvat, 5'- Nukleotidase, Creatinkinase (CK), Lactat-Dehydrogenase (LDH), Kohlendioxid etc. Bevorzugt ist der Analyt Glucose. 0
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer erfindungsgemäßen Verbindung oder eines erfindungsgemäßen, mit einem stabilen Coenzym stabilisierten Enzyms zum Nachweis eines Analyten in einer Probe durch eine enzymatische Reaktion. Besonderss bevorzugt ist hierbei der Nachweis von Glucose mit Hilfe von Glucose- Dehydrogenase (GlucDH).
Die Veränderung des stabilen Coenzyms durch Reaktion mit dem Analyten kann grundsätzlich auf beliebige Art und Weise nachgewiesen werden. Hiero können grundsätzlich alle aus dem Stand der Technik bekannten Methoden zum Nachweis enzymatischer Reaktionen eingesetzt werden. Vorzugsweise wird jedoch die Veränderung des Coenzyms durch optische Methoden nachgewiesen. Optische Nachweismethoden umfassen beispielsweise die Messung von Absorption, Fluoreszenz, Circulardichroismus (CD), optische Rotationsdispersion (ORD), Refraktometrie etc.
Ein optisches Nachweisverfahren, welches im Rahmen der vorliegenden Anmeldung bevorzugt Anwendung findet, ist die Photometrie. Zur photometrischen Messung einer Veränderung des Coenzyms infolge
Umsetzung mit dem Analyten bedarf es indessen der zusätzlichen
Anwesenheit mindestens eines Mediators, welcher die Reaktivität des reduzierten Coenzyms erhöht und eine Übertragung von Elektronen auf einen geeigneten optischen Indikator oder ein optisches Indikatorsystem ermöglicht.
Als Mediatoren, welche für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeignet sind, kommen u.a. Nitrosoaniline, wie beispielsweise [(4- Nitrosophenyl)imino]dimethanol-Hydrochlorid, Chinone, wie beispielsweise Phenanthrenchinone, Phenanthrolinchinone oder Benzo[h]-chinolinchinone, Phenazine, wie beispielsweise 1-(3-Carboxypropoxy)-5-ethylphenazinium- trifluormethansulfonat, oder/und Diaphorase (EC 1.6.99.2) in Frage. Bevorzugte Beispiele für Phenanthrolinchinone umfassen 1 ,10- Phenanthrolin-5,6-chinone, 1 ,7-Phenanthrolin-5,6-chinone, 4,7-
Phenanthrolin-5,6-chinone sowie deren N-alkylierte oder N.N'-dialkylierte Salze, wobei im Falle N-alkylierter bzw. N.N'-dialkylierter Salze Halogenide, Trifluormethansulfonat oder andere die Löslichkeit erhöhende Anionen als Gegenion bevorzugt sind.
Als optischer Indikator oder als optisches Indikatorsystem kann eine beliebige Substanz verwendet werden, welche reduzierbar ist und bei Reduktion eine detektierbare Änderung ihrer optischen Eigenschaften, wie beispielsweise Farbe, Fluoreszenz, Remission, Transmission, Polarisation oder/und Brechungsindex, erfährt. Die Bestimmung des Vorhandenseins oder/und der Menge des Analyten in der Probe kann mit dem bloßen Auge oder/und mittels einer Detektionsvorrichtung unter Verwendung eines dem Fachmann geeignet erscheinenden photometrischen Verfahrens erfolgen. Vorzugsweise werden Heteropolysäuren, und insbesondere 2,18- Phosphormolybdänsäure, als optische Indikatoren verwendet, die zum entsprechenden Heteropolyblau reduziert werden.
Besonders bevorzugt wird die Veränderung des Coenzyms durch Messung der Fluoreszenz nachgewiesen. Die Fluoreszenzmessurig ist hochsensitiv und ermöglicht den Nachweis selbst geringer Konzentrationen des Analyten in miniaturisierten Systemen.
Alternativ kann die Veränderung des Coenzyms auch elektrochemisch unter Verwendung eines geeigneten Testelements, wie beipielsweise eines elektrochemischen Teststreifens, nachgewiesen werden. Voraussetzung hierfür ist wiederum die Verwendung geeigneter Mediatoren, welche vom reduzierten Coenzym durch Übertragung von Elektronen in eine reduzierte Form überführt werden können. Die Bestimmung des Analyten erfolgt über eine Messung des zur Reoxidation des reduzierten Mediators benötigten Stromes, welcher mit der Konzentration des Analyten in der Probe korreliert. Beispiele für Mediatoren, welche für elektrochemische Messungen verwendet werden können, umfassen insbesondere die vorstehend erwähnten, für photometrische Messungen eingesetzten Mediatoren.
Zum Nachweis eines Analyten kann ein Flüssigtest verwendet werden, wobei das Reagenz z.B. in Form einer Lösung oder Suspension in einer wässrigen oder nichtwässrigen Flüssigkeit oder als Pulver oder Lyophilisat vorliegt. Es kann jedoch auch ein Trockentest verwendet werden, wobei das Reagenz auf einem Träger, einem Teststreifen, aufgebracht ist. Der Träger kann beispielsweise einen Teststreifen, umfassend ein saugfähiges oder/und quellbares Material, umfassen, das von der zu untersuchenden Probeflüssigkeit benetzt wird.
Ein besonders bevorzugtes Testformat, umfasst die Verwendung des Enzyms Glucose-Dehydrogenase mit einem stabilen NAD-Derivat zum Nachweis von Glucose, wobei ein Derivat des reduzierten Coenzyms NADH gebildet wird. Der Nachweis von NADH erfolgt durch optische Methoden, z.B. durch photometrische oder fluorometrische Bestimmung nach UV- Anregung. Ein besonders bevorzugtes Testsystem ist in US 2005/0214891 beschrieben, auf das hier ausdrücklich Bezug genommen wird.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein mit einem stabilen Coenzym stabilisiertes Enzym, wobei das stabilisierte Enzym bei einer Lagerung von vorzugsweise mindestens 2 Wochen, besonders bevorzugt mindestens 4 Wochen und am meisten bevorzugt mindestens 8 Wochen bei einer Temperatur von vorzugsweise mindestens 20 0C, besonders bevorzugt mindestens 25 0C und am meisten bevorzugt mindestens 30 0C, gegebenenfalls bei hoher Luftfeuchtigkeit und ohne Trockenreagenz eine Abnahme der enzymatischen Aktivität von weniger als 50 %, vorzugsweise weniger als 30 % und am meisten bevorzugt weniger als 20 % gegenüber dem Ausgangswert aufweist.
Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Nachweisreagenz zur Bestimmung eines Analyten, welches ein mit einem stabilen Coenzym stabilisiertes Enzym, wie zuvor angegeben, enthält. Außerdem betrifft die Erfindung ein Testelement, welches ein erfindungsgemäßes stabilisiertes Enzym bzw. ein erfindungsgemäßes Nachweisreagenz enthält. Das Nachweisreagenz bzw. das Testelement können durch Durchführung von Trocken- oder Flüssigtests geeignet sein. Bevorzugt ist das Testelement ein Teststreifen zum fluorometrischen oder photometrischen Nachweis eines Analyten. Ein solcher Teststreifen enthält das mit einem stabilen Coenzym stabilisierte Enzym immobilisiert auf einem saugfähigen oder/und quellbaren Material, wie etwa Cellulose, Kunstoffe, etc.
Die Erfindung soll durch die nachfolgenden Figuren und Beispiele näher erläutert werden:
Beschreibung der Figuren Figur 1A: Darstellung des stabilen Coenzym carba-NAD (cNAD). Figur 1 B: Darstellung des stabilen Coenzyms Pyrrolidinyl-NAD.
Figur 2: Darstellung der Ergebnisse der Enzymkinetik von Glucose- Dehydrogenase in Gegenwart von NAD bzw. von Glucose-Dehydrogenase in Gegenwart von cNAD vor und nach Lagerung. 2A: Kinetik von GlucDH in Gegenwart von NAD nach 1 Tag. 2B: Kinetik von GlucDH in Gegenwart von cNAD nach 1 Tag. 2C: Kinetik von GlucDH in Gegenwart von NAD nach 5 Wochen Lagerung bei 32 0C und 85 % relativer Luftfeuchtigkeit.
2D: Kinetik von GlucDH in Gegenwart von cNAD nach 5 Wochen Lagerung bei 32 0C und 85 % relativer Luftfeuchtigkeit.
Figur 3: Vergleich der Blankwerte von Glucose-Dehydrogenase in Gegenwart von NAD bzw. von GlucDH in Gegenwart von cNAD über einen Zeitraum von bis zu 5 Wochen bei 32 CC und 85 % Luftfeuchtigkeit.
Figur 4: Darstellung verschiedener Funktionskurven von Glucose- Dehydrogenase nach Lagerung von Glucose-Dehydrogenase in Gegenwart von NAD bei 32 0C und 85 % Luftfeuchtigkeit. Die Lagerungsdauer variierte zwischen 1 Tag und 5 Wochen.
Figur 5: Darstellung verschiedener Funktionskurven von Glucose- Dehydrogenase nach Lagerung von Glucose-Dehydrogenase in Gegenwart von cNAD bei 32 0C und 85 % Luftfeuchtigkeit. Die Lagerungsdauer variierte zwischen 1 Tag und 5 Wochen (Figur 5A) bzw. zwischen 1 Tag und 24 Wochen (Figur 5B).
Figur 6: Darstellung des Restgehaltes an NAD bzw. cNAD nach Lagerung von Glucose-Dehydrogenase in Gegenwart von NAD bzw. cNAD über 24 Wochen bei 32 0C und 85 % Luftfeuchtigkeit.
Figur 7: Darstellung der GlucDH-Aktivität nach Lagerung von Glucose- Dehydrogenase in Gegenwart von NAD bzw. cNAD über 5 Wochen (Figur 7A) bzw. 24 Wochen (Figur 7B) bei 32 0C und 85 % Luftfeuchtigkeit.
Figur 8: Darstellung der GlucDH-Aktivität nach Lagerung von Glucose- Dehydrogenase (GlucDH-wt), der Doppelmutante GlucDH_E96G_E170K (GlucDH-Mut1) und der Doppelmutante GlucDH_E170K_K252L (GlucDH- Mut2) über einen Zeitraum von 25 Wochen in Gegenwart von NAD bzw. cNAD bei 320C und 83% relativer Luftfeuchtigkeit.
Figur 9: Gelelektrophoretische Analyse von Glucose-Dehydrogenase nach Lagerung in Gegenwart von NAD bzw. cNAD. Testbedingungen: MW, 10-220 kDa-Marker; 1 : GlucDH/NAD, 5 Wochen bei 6 0C; 2: GlucDH/NAD, 5 Wochen bei 32 °C/85 % relative Luftfeuchtigkeit; 3: GlucDH/cNAD, 5 Wochen bei 6 0C; 4: GlucDH/cNAD, 5 Wochen bei 32 °C/85 % relative Luftfeuchtigkeit.
Figur 10: Gelelektrophoretische Analyse von Glucose-Dehydrogenase nach Lagerung bei 50 0C in Gegenwart von NAD bzw. cNAD. Testbedingungen: MW, 10-220 kDa-Marker; 1 : GlucDH 8,5 mg/ml, NAD, 0 Stunden; 2: GlucDH 8,5 mg/ml, NAD, 22 Stunden; 3: GlucDH 8,5 mg/ml, NAD, 96 Stunden; 4: GlucDH 8,5 mg/ml, NAD, 118 Stunden; 5: GlucDH 8,5 mg/ml, NAD1 140 Stunden; 6: GlucDH 8,5 mg/ml, NAD, 188 Stunden; 7: GlucDH 8,5 mg/ml, NAD, 476 Stunden; 8: GlucDH 8,5 mg/ml, cNAD, 0 Stunden; 9: GlucDH 8,5 mg/ml, cNAD, 188 Stunden; 10: GlucDH 8,5 mg/ml, cNAD, 476 Stunden.
Figur 11: Darstellung der Stabilität von Glucose-Dehydrogenase in Gegenwart von NAD bzw. cNAD in Flüssigphase bei 50 0C über einen Zeitraum von 4 Tagen (Figur 11A) bzw. 14 Tagen (Figur 11B). Testbedingungen: GlucDH 10 mg/ml; NAD bzw. cNAD 12 mg/ml; Puffer: 0,1 M Tris, 1,2 M NaCI, pH 8,5; Temperatur 50 0C.
Figur 12: Gelelektrophoretische Analyse von Alkohol-Dehydrogenase aus Hefe nach Lagerung in Gegenwart von NAD bzw. cNAD. Testbedingungen: MW, 10-220 kDa-Marker; 1 : ADH1 65 Stunden bei 6 0C; 2: ADH/cNAD, 65 Stunden bei 6 0C; 3: ADH/NAD, 65 Stunden bei 6 0C; 4: ADH, 65 Stunden bei 35 0C; 5: ADH/cNAD, 65 Stunden bei 35 0C; 6: ADH/NAD, 65 Stunden bei 35 0C.
Figur 13: Gelelektrophoretische Analyse von Alkohol-Dehyrogenase aus Hefe nach Lagerung bei 35 0C in Gegenwart von NAD bzw. cNAD. Testbedingungen: MW, 10-220 kDa-Marker; 1 : ADH/NAD, 0 Tage; 2: ADH/NAD, 1 Tag; 3: ADH/NAD, 2 Tage; 4: ADH/NAD, 3 Tage; 5: ADH/NAD, 5 Tage; 6: ADH/cNAD, 0 Tage; 7: ADH/cNAD, 1 Tag; 8: ADH/cNAD, 2 Tage; 9: ADH/cNAD, 3 Tage; 10: ADH/cNAD, 6 Tage.
Figur 14: Darstellung der Stabilität von Alkohol-Dehydrogenase aus Hefe in Gegenwart von NAD bzw. cNAD in Flüssigphase bei 35 0C über einen Zeitraum von 65 Stunden. Testbedingungen: ADH 5 mg/ml; NAD bzw. cNAD 50 mg/ml; Puffer: 75 mM Na4P2O7, Glycin, pH 9,0; Temperatur 35 0C.
Figur 15: Darstellung verschiedener Funktionskurven von Glucose- Dehydrogenase nach 11 Wochen Lagerung in Gegenwart von NAD und unterschiedlicher Mediatoren bei Raumtemperatur.
Figur 16: Darstellung der Ergebnisse der Enzymkinetik von Glucose- Dehydrogenase in Gegenwart von NAD und 1 -(3-Carboxypropoxy)-5- ethylphenazinium-trifluormethansulfonat bei verschiedenen Glucose- Konzentrationen.
Figur 17: Schematische Darstellung des Glucose-Nachweises mit GlucDH als Enzym und Diaphorase als Mediator.
Figur 18: Darstellung der Funktionskurven von Glucose-Dye- Oxidoreduktase (GlucDOR) in Gegenwart von Pyrrolochinolinchinon (PQQ) und [(4-Nitrosophenyl)imino]dimethanol-Hydrochlorid als Mediator bzw. von Glucose-Dehydrogenase in Gegenwart von NAD und Diaphorase/[(4- Nitrosophenyl)imino]dimethanol-Hydrochlorid als Mediator.
Figur 19: Darstellung der Ergebnisse der Enzymkinetik von Glucose- Dehydrogenase in Gegenwart von NAD und Diaphorase bei verschiedenen Glucose-Konzentrationen .
Figur 20: Darstellung des in Abhängigkeit von der Glucose-Konzentration gemessenen Stromes bei elektrochemischer Bestimmung von Glucose unter Verwendung von Glucose-Dehydrogenase in Gegenwart von NAD bzw. cNAD. Testbedingungen: 25 mM NAD bzw. cNAD; 2.5 Sekunden Verzögerung; 5 Sekunden Messzeit.
Figur 21 : Darstellung der Aminosäuresequenzen der Glucose- Dehydrogenase-Doppelmutanten GlucDH_E96G_E170K und
GlucDH_E170K_K252L.
Beispiel 1
Der Glucose-spezifischen GlucDH wurden carba-NAD (Fig. 1A) oder NAD zugesetzt. Diese Rezepturen wurden jeweils auf Pokalonfolie (Lonza) aufgetragen und nach Trocknung unter warmen und feuchten Bedingungen (32 0C, 85 % relative Luftfeuchtigkeit) eingelagert. Anschließend wurden in regelmäßigen Abständen die Reaktionskinetik sowie die Funktionskurve bestimmt. Parallel wurde zu den jeweiligen Messterminen eine cNAD/NAD- Analytik sowie eine Bestimmung der Restaktivität des Enzyms vorgenommen.
Die am ersten Tag bestimmten Kinetik-Kurven für NAD (Figur 2A) und cNAD (Figur 2B) sind vergleichbar und zeigen auch einen ähnlichen Hub in der Glucoseabhängigkeit. Nach 5 Wochen ist jedoch ein deutlicher Unterschied in den Kinetik-Kurven zu erkennen. Während die Kinetik für NAD (Figur 2C) stark in ihrer Dynamik nachlässt, bleibt die Kinetik des mit cNAD stabilisierten Enzyms praktisch unverändert (Figur 2D).
Auch in den Blankwerten (Trockenleerwert vor Auftrag einer Blutprobe) zeigt sich ein deutlicher Unterschied, wie aus Figur 3 ersichtlich ist. Der Anstieg des Trockenleerwerts bei NAD ist auf die Bildung von fluoreszierenden Teilchen zurückzuführen (Oppenheimer (1982), Supra). Überraschenderweise geschieht dies nicht bei cNAD.
Die unterschiedliche Stabilität von Glucose-Dehydrogenase in Gegenwart von NAD bzw. cNAD ist auch aus einem Vergleich der Figuren 4 und 5 ersichtlich. Nach 5 Wochen liegt die Funktionskurve bei dem mit cNAD stabilisierten Enzym noch in der Schar der voherigen Messungen (Figur 5A)1 während bei dem mit NAD versetzten Enzym (Figur 4) die Kurve bei höheren
Konzentrationen abknickt, was ein typisches Zeichen für zu geringe Mengen an Enzym/Coenzym ist. Figur 5B zeigt verschiedene Funktionskurven der mit cNAD stabilisierten Glucose-Dehydrogenase über einen Zeitraum von
24 Wochen. In diesem Zusammenhang wird deutlich, dass sich die Funktion des Enzyms bei hohen Glucose-Konzentrationen über den gesamten
Zeitraum hinweg nur geringfügig verändert und nach 24 Wochen etwa dem nach 5 Wochen erhaltenen Wert entspricht.
Die Beziehung zwischen Struktur des Coenzyms und dessen Stabilität über einen vorbestimmten Zeitraum ergibt sich aus Figur 6. Demnach beträgt der Restgehalt an cNAD in einem Glucose-Nachweisreagenz nach 24 Wochen Lagerung (bei 32 0C und 85 % relativer Luftfeuchtigkeit) noch etwa 80 % des Ausgangswertes, während sich der Gehalt an NAD in einem mit NAD stabilisierten Glucose-Nachweisreagenz bereits nach 5 Wochen auf etwa 35 % des Ausgangswertes verringert und gemäß Extrapolation nach etwa 17 Wochen auf null reduziert.
Vollkommen überraschend ist das Ergebnis der Restaktivitätsbestimmung des aktiven Enzyms GlucDH nach 5 Wochen bei 32 0C und 85 % relative Luftfeuchtigkeit (Figur 7A). Das mit NAD stabilisierte Enzym weist nur noch eine extrem geringe Enzymaktivität auf (0,5 %), während das mit cNAD stabilisierte Enzym noch eine Restaktivität von 70 % besitzt (jeweils im Vergleich zu den mit Trockenmittel (TM) im Kühlschrank (KS) eingelagerten Proben). Nach 24 Wochen bei 32 0C und 85 % relativer Luftfeuchtigkeit (Figur 7B) beträgt die Restaktivität des Enzyms bei Stabilisierung mit cNAD noch immer etwa 25 %.
Wird anstelle des Wildtyp-Enzyms (aus Bacillus subtilis) eine Mutante verwendet, so kann die Restaktivität von GlucDH noch weiter gesteigert werden. Nach 24 Wochen Lagerung bei 32 0C und 85 % relativer Luftfeuchtigkeit in Gegenwart von cNAD beträgt die Restaktivität einer Mutante GlucDH_E96G_E170K mit Aminosäuresubstitutionen Glutaminsäure → Glycin an Position 96 und Glutaminsäure → Lysin an Position 170 (GlucDH-Mut1) des Wildtyp-Enzyms etwa 70 %, während die Restaktivität einer Mutante GlucDH_E170K_K252L mit
Aminosäuresubstitutionen Glutaminsäure → Lysin an Position 170 und Lysin → Leucin an Position 252 (GlucDH-Mut2) bei etwa 50 % liegt (Figur 8).
Auch die gelelektrophoretische Analyse von Glucose-Dehydrogenase im SDS-GeI (Figuren 9 und 10) zeigt deutlich den Unterschied zwischen einer
Lagerung in Anwesenheit von NAD bzw. cNAD. Während das Enzym nach 5
Wochen Lagerung bei 32 0C und 85 % relativer Luftfeuchtigkeit in
Gegenwart von cNAD noch als Bande mit der erwarteten Mobilität zu erkennen ist, ist das in Gegenwart von NAD gelagerte Enzym vollkommen verschwunden (Figur 9). Gleichzeitig ist aus Figur 10 ersichtlich, dass die
Bande des mittels NAD stabilisierten und bei 50 0C gelagerten Enzyms mit zunehmender Lagerungsdauer schwächer wird und nach 476 Stunden nahezu verschwunden ist, während die entsprechende Bande des in
Gegenwart von cNAD gelagerten Enzyms gegenüber einer zu Beginn des Experiments detektierten Bande eine lediglich geringfügige Änderung zeigt.
Dieses Ergebnis läßt sich auch bei Lagerung in flüssiger Phase bestätigen. (Figuren 11A und 11 B). Nach 95 Stunden bei 50 0C liegt die Restaktivität von Glucose-Dehydrogenase in Gegenwart des nativen Coenzyms NAD bei ~ 5 %, während die Restaktivität der GlucDH in Gegenwart des artifiziellen Coenzyms cNAD bei 75 % liegt (Figur 11A). Nach 336 Stunden Lagerung bei 50 0C beträgt die Restaktivität des mit NAD stabilisierten Enzyms nur mehr etwa 1 %; für das in Gegenwart von cNAD gelagerte Enzym wird eine Restaktivität von immer noch etwa 70 % beobachtet Die entsprechenden SDS-GeIe zeigen ebenfalls eine Veränderung der GlucDH-Bande in Gegenwart des nativen Coenzyms NAD: es zeigen sich neue Banden bei höheren Molmassen und eine Verschiebung der 30 kDa-Bande.
Insgesamt ist es ein höchst überraschendes Ergebnis, dass die Stabilisierung des Cofaktors gleichzeitig eine Stabilisierung des Enzyms bewirkt - und dies nicht allein durch den kooperativen Effekt des besseren Zusammenhaltes des Enzyms. Der Zerfall des Cofaktors NAD hat einen negativen Effekt auf die Stabilität des Enzyms GlucDH und beschleunigt sogar dessen Inaktivierung. Der Austausch von nativem NAD durch künstliche Analoga erlaubt eine Lagerung der GlucDH unter Stressbedingungen (z.B. erhöhte Temperatur) auch in Gegenwart eines Cofaktors.
Mit einem solchen System lassen sich Blutglucose-Teststreifen mit erheblich verbesserten Stabilitätseigenschaften generieren, bei denen eine Darreichungsform ohne Trockenmittel möglich ist.
Beispiel 2
Einer Alkoholnachweislösung wurden cNAD oder NAD zugesetzt. Diese Mischungen wurden bei 35 °C eingelagert. Anschließend wurde in regelmäßigen Abständen die Stabilität des Enzyms überprüft und eine Bestimmung der Restaktivität des Enzyms vorgenommen.
Wiederum zeigt eine gelelektrophoretische Analyse im SDS-GeI (Figuren 12 und 13) den Unterschied zwischen einer Lagerung in Anwesenheit von NAD bzw. cNAD. So unterscheiden sich die Banden der mit cNAD stabilisierten Alkohol-Dehydrogenase nach Lagerung über 65 Stunden bei 6 0C bzw. 35 0C nur geringfügig, was für eine Stabilisierung des Enzyms durch das artifizielle Coenzym spricht. Demgegenüber ist die Bande des in Gegenwart von NAD bei 35 0C gelagerten Enzyms vollkommen verschwunden (Figur 12).
Ferner wird aus Figur 13 deutlich, dass die Bande des mit NAD stabilisierten und bei 35 0C gelagerten Enzyms mit zunehmender Lagerungsdauer schwächer wird und nach 5 Tagen nahezu vollständig verschwunden ist. Eine nach 6 Tagen Lagerung bei 35 "C detektierte Bande des mit cNAD stabilisierten Enzyms zeigt eine deutlich geringere Zersetzung des Enzyms und damit eine erhöhte Stabilität.
Dieses Ergebnis läßt sich auch bei Lagerung in flüssiger Phase bestätigen. (Figur 14). Nach 65 Stunden bei 35 0C liegt die Restaktivität von Alkohol- Dehydrogenase in Gegenwart des nativen Coenzyms NAD bei etwa 6 %, während die Restaktivität des Enzyms in Gegenwart des artifiziellen Coenzyms cNAD noch bei etwa 60 % liegt.
Beispiel 3
Zur Bestimmung von Glucose wurden verschiedene Testsysteme, welche jeweils Glucose-Dehydrogenase, NAD1 einen Mediator und ggf. einen optischen Indikator umfassten, photometetrisch bzw. elektrochemisch vermessen.
Für photometetrische Messungen wurden zunächst vier Testelemente, welche jeweils 11 Wochen bei Raumtemperatur gelagert worden waren und neben Glucose-Dehydrogenase, NAD und einem Mediator 2,18- Phosphormolybdänsäure enthielten, bei verschiedenen Glucose- Konzentrationen untersucht. Wie aus Figur 15 ersichtlich ist, wurde bei allen vier eingesetzten Mediatoren, d.h. [(4-Nitrosophenyl)imino]dimethanol-Hydrochlorid (Med A), 1-Methyl-5,6-dioxo-5,6-dihydro-1 ,10-phenanthrolinium-trifluormethansulfonat (Med B), 7-Methyl-5,6-dioxo-5,6-dihydro-1 ,7-phenanthrolinium- trifluomnethansulfonat (Med F) und 1 -(3-Carboxypropoxy)-5- ethylphenazinium-trifluormethansulfonat (Med G)1 mit steigender Glucose- Konzentration ein Abfall der Remission beobachtet, womit oben genannte Mediatoren grundsätzlich für eine Bestimmung von Glucose mittels Photometrie geeignet sind.
Bei hohen Glucose-Konzentrationen im Bereich von 800 mg/dl beträgt die Remission der vermessenen Probe bei Verwendung von [(4- Nitrosophenyl)imino]dimethanol-Hydrochlorid bzw. 1 -(3-Carboxypropoxy)-5- ethylphenazinium-trifluormethansulfonat noch etwa 20%, was auf die besondere Eignung dieser beiden Mediatoren für photometrische Messungen unter Verwendung des Systems Glucose-Dehydrogenase/NAD, und damit auch des Systems Glucose-Dehydrogenase/cNAD, schließen lässt. Die Kinetik der Umsetzung von Glucose mittels des Systems Glucose- Dehydrogenase, NAD, 1-(3-Carboxypropoxy)-5-ethylphenazinium- trifluormethansulfonat und 2,18-Phosphormolybdänsäure bei Glucose- Konzentrationen im Bereich von 0 bis 800 mg/dl ist in Figur 16 dargestellt.
Wie der schematischen Darstellung in Figur 17 zu entnehmen ist, kann die photometrische Bestimmung von Glucose auch unter (zusätzlicher) Verwendung von Diaphorase als Zwischenmediator erfolgen. Figur 18 zeigt für das System Glucose-Dehydrogenase, NAD, Diaphorase, [(4- Nitrosophenyl)imino]dimethanol-Hydrochlorid und 2,18-
Phosphormolybdänsäure (System 1) einen konzentrationsabhängigen Abfall der Remission. Als Vergleich diente das System Glucose-Dye- Oxidoreduktase, Pyrrolochinolinchinon, [(4-Nitrosophenyl)imino]dimethanol- Hydrochlorid und 2,18-Phosphormolybdänsäure (System 2), welches gleichermaßen einen konzentrationsabhängigen Abfall der Remission bedingt, aufgrund der geringen Spezifität von Glucose-Dye-Oxidoreduktase jedoch Nachteile besitzt. Die Kinetik der Umsetzung von Glucose mittels des Systems 1 bei Glucose-Konzentrationen im Bereich von 0 bis 800 mg/dl ist in Figur 19 abgebildet.
Alternativ zur Photometrie kann zum Zwecke der Analytbestimmung auch eine elektrochemische Messung eingesetzt werden. So zeigte sich sowohl für ein Testelement, welches neben Glucose-Dehydrogenase NAD als Coenzym und 1-(3-Carboxypropoxy)-5-ethylphenazinium- trifluormethansulfonat als Mediator enthielt, als auch für ein korrespondierendes System, welches anstelle von NAD das stabilisierte Coenzym cNAD umfasste, eine lineare Abhängigkeit des zur Reoxidation des reduzierten Mediators benötigten Stromes von der Glucose- Konzentration (Figur 20).
Damit ist gezeigt, dass die Analytbestimmung unter Verwendung des Systems Dehydrogenase/stabiles Coenzym auch mittels elektrochemischer Detektion und Auswertung mit einer anderen Wellenlänge, welche unabhäbgig vom Coenzym ist, erfolgen kann. Durch den Einsatz des stabilen Enzym/Coenzym-Paares sollte die Gesamtrezeptur auch weitergehend stabilisiert werden.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Stabilisierung eines Enzyms, dadurch gekennzeichnet, dass man das Enzym in Gegenwart eines stabilen Coenzyms lagert.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym aus Dehydrogenasen ausgewählt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass dass das Enzym eine Dehydrogenase ist, ausgewählt aus einer Glucose-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.47), Lactat-Dehydrogenase (E.C.
1.1.1.27, 1.1.1.28), Malat-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.37), Glycerin-
Dehydrogenase (E.C.1.1.1.6), Alkohol-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.1), alpha-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase, Sorbitol-Dehydrogenase oder einer Aminosäure-Dehydrogenase, wie etwa L-Aminosäure- Dehydrogenase (E.C.1.4.1.5).
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass als Enzym eine Glucose-Dehydrogenase verwendet wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass das stabile Coenzym aus stabilen Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid- (NAD/NADH)- und Nicotinamid-Adenin-Dinudeotidphosphat- (NADP/NADPH)-Verbindungen und der Verbindung der Formel (I)
Figure imgf000028_0001
(I)
ausgewählt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das stabile Coenzym aus Verbindungen mit der allgemeinen Formel (II) ausgewählt wird:
Figure imgf000028_0002
(II)
mit A = Adenin oder ein Analog davon,
T = jeweils unabhängig O, S, U = jeweils unabhängig OH, SH, BH3-, BCNH2-, V = jeweils unabhängig OH oder eine Phosphatgruppe, oder zwei
Gruppen, die eine cyclische Phosphatgruppe bilden;
W = COOR1 CON(R)2, COR, CSN(R)2 mit R = jeweils unabhängig H oder d-C2-Alkyl.
X1, X2 = jeweils unabhängig O, CH2, CHCH3, C(CH3)2, NH1 NCH3,
Y = NH, S, O, CH2,
Z = ein linearer oder cyclischer organischer Rest ist, mit der Maßgabe, dass Z und der Pyridin-Rest nicht durch eine glycosidische Verbindung verknüpft sind, oder ein Salz oder gegebenenfalls eine reduzierte Form davon.
7. Verfahren nach Anspruch 6, worin Z ausgewählt wird aus (i) einem linearen Rest mit 4-6 C-Atomen, vorzugsweise 4 C-Atomen, worin 1 oder 2 Atome gegebenenfalls durch ein oder mehrere
Heteroatome ausgewählt aus O, S und N ersetzt sind, und
(ii) einem Rest umfassend eine cyclische Gruppe mit 5 oder 6 C-
Atomen, die gegebenenfalls ein Heteroatom ausgewählt aus O, S und N sowie gegebenenfalls einen oder mehrere Substituenten enthält, und einen Rest CR4 2, wobei CR4 2 an die cyclische Gruppe und an X2 gebunden ist, mit R4 = jeweils unabhängig H, F, Cl, CH3.
8. Verfahren nach Anspruch 7, worin Z ein gesättiger oder ungesättigter carbocyclischer oder heterocyclischer Fünfring ist, insbesondere eine
Verbindung der allgemeinen Formel (IM)
Figure imgf000029_0001
(III)
wobei zwischen R5' und R5" eine Einfach- oder Doppelbindung vorliegen kann, mit R4 = jeweils unabhängig H, F, Cl, CH3,
Figure imgf000029_0002
wobei R51 = O, S, NH, NCi-C2-Alkyl, CR4 2, CHOH, CHOCH3, und R5" = CR4Z, CHOH, CHOCH3, wenn zwischen R5' und Rs" eine Einfachbindung vorliegt, wobei R5I=R5"=CR4, wenn zwischen R5' und R5" eine Doppelbindung vorliegt, und R6, R6' = jeweils unabhängig CH oder CCH3.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6-8, worin W = CONH2 oder COCH3.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, worin R5 CH2 ist.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8-10, worin R51 ausgewählt ist aus CH2, CHOH und NH.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8-11, worin R51 und R5" jeweils CHOH sind.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 8-11 , worin R51 NH und R5" CH2 ist.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-13, dadurch gekennzeichnet, dass das stabile Coenzym carbaNAD ist.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-14, dadurch gekennzeichnet, dass man das mit einem stabilen Coenzym stabilisierte Enzym für eine Dauer von mindestens 2 Wochen, vorzugsweise von mindestens 4 Wochen, und besonders bevorzugt von mindestens 8 Wochen lagert.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-15, dadurch gekennzeichnet, dass man das mit einem stabilen Coenzym stabilisierte Enzym bei einer Temperatur von mindestens 20 0C, vorzugsweise von mindestens 25 0C und besonders bevorzugt von mindestens 30 0C lagert.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-16, dadurch gekennzeichnet, dass man das mit einem stabilen Coenzym stabilisierte Enzym ohne
Trocknungsreagenz lagert.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-17, dadurch gekennzeichnet, dass man das mit einem stabilen Coenzym stabilisierte Enzym bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von mindestens 50 % lagert.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-18, dadurch gekennzeichnet, dass die Lagerung des mit einem stabilen Coenzym stabilisierten
Enzyms als Trockensubstanz erfolgt.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-18, dadurch gekennzeichnet, dass die Lagerung des mit einem stabilen Coenzym stabilisierten
Enzyms in flüssiger Phase erfolgt.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-20, dadurch gekennzeichnet, dass die Lagerung des mit einem stabilen Coenzym stabilisierten
Enzyms auf einem Testelement erfolgt.
22. Enzym, welches mit einem stabilen Coenzym stabilisiert ist, dadurch gekennzeichnet, dass bei einer Lagerung von vorzugsweise mindestens 2 Wochen, besonders bevorzugt mindestens 4 Wochen, und am meisten bevorzugt mindestens 8 Wochen bei einer Temperatur von vorzugsweise mindestens 20 0C, besonders bevorzugt mindestens 25 0C und am meisten bevorzugt mindestens 30 0C1 gegebenenfalls bei hoher Luftfeuchtigkeit und ohne Trockenreagenz eine Abnahme der enzymatischen Aktivität von weniger als 50 %, vorzugsweise weniger als 30 % und am meisten bevorzugt weniger als 20 % gegenüber dem Ausgangswert aufweist.
23. Nachweisreagenz zur Bestimmung eines Analyten, welches ein stabilisiertes Enzym nach Anspruch 22 enthält.
24. Testelement, dadurch gekennzeichnet, dass es ein stabilisiertes Enzym nach Anspruch 22 oder ein Nachweisreagenz nach Anspruch 23 enthält.
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