WO2009091023A1 - 腎癌の診断又は検出のための組成物及び方法 - Google Patents

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Yoshinori Tanaka
Michimoto Kobayashi
Shiori Tomoda
Giman Jung
Osamu Ogawa
Eijiro Nakamura
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Toray Industries, Inc.
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Definitions

  • the present invention relates to a composition useful for diagnosis or detection of renal cancer.
  • the present invention also relates to a method for detecting renal cancer using the composition.
  • the kidney is an important urinary organ that plays a role in excreting in-vivo waste products by filtering blood to produce urine. At the same time, it is an important endocrine organ that produces hormones such as angiotensin that controls blood pressure and erythropoietin, which is an erythropoietic factor.
  • kidney cancer Tumors that occur in the kidney include renal cell carcinoma that occurs in adults and Wilms tumor that occurs in children, and sarcomas as rare tumors, but the most common malignant tumor is called renal cancer .
  • the incidence of kidney cancer is about 2.5 per 100,000 population, and the male-female ratio is 2-3: 1, which tends to be higher in males.
  • urological malignant tumors it is the second most common tumor after prostate cancer and bladder cancer.
  • Genetic factors are also known as risk factors for renal cancer, but generally include cigarettes and fat intake. It is also known that the incidence of tumors is high in patients who have undergone long-term dialysis.
  • Renal cancer rarely has some subjective symptoms when the maximum diameter of the tumor is 5 cm or less, and is often detected by CT scan at the time of screening.
  • Large tumors include hematuria, abdominal masses, and pain.
  • Systemic symptoms may include fever, weight loss, anemia, etc., and rarely endocrine factors may cause erythrocytosis, hypertension, hypercalcemia, and the like.
  • the progression of renal cancer into the inferior vena cava may cause venous anger or testicular varices in the abdominal body surface.
  • About 20% of kidney cancers are found from lung and bone metastases. In kidney cancer, the tumor tends to spread in the veins, and metastasis to other organs is likely to occur.
  • renal cancer can be further classified into several pathologically.
  • the cause of clear cell renal cancer which accounts for about 90% of them, is the cancer suppressor gene VHL (von-Hippel-Lindau). It is known that the gene is defective (Non-patent Document 1). VHL gene deficiency leads to transcriptional activation of hypoxia-inducible genes through impaired HIF- ⁇ / VHF association (Non-Patent Document 2), and it is known that expression enhancement of genes such as VEGF and TGF ⁇ occurs. Yes.
  • the main treatment for renal cancer is surgical therapy. Regardless of the stage, it is most common to remove the kidney if it can be removed, or to remove the kidney partially. Even if there is metastasis, surgical removal of the kidney may be considered.
  • As a method other than the surgical treatment there is an arterial embolization of the renal artery, and this method may be performed prior to the operation when the excision is impossible or when a large tumor is removed.
  • diagnostic imaging is a useful method for detecting early small renal cancer, it is not efficient when targeting a large number of subjects such as health examinations, and the cost required for diagnosis is also compared. High. Therefore, the discovery of blood markers that are specific and sensitive to renal cancer is strongly desired. By using a blood marker, it is considered that a relatively inexpensive and high-throughput test or diagnosis becomes possible.
  • Patent Document 1 discloses a method using a difference in gene expression.
  • Proteins known to increase in human renal cancer include MMP2 (Non-patent Document 3), which is thought to increase motility of cancer cells by degrading extracellular matrix, and increased expression in renal disorders
  • MMP2 Non-patent Document 3
  • TNFRSF7 Non-Patent Document 4
  • PDE8B Patent Document 2
  • FLOT1 Patent Document 3
  • CD5 Non-Patent Document 5
  • ECM1 Patent Document 4
  • An object of the present invention is to provide a composition useful for diagnosis of renal cancer and a method for detecting renal cancer using the composition.
  • Marker search methods include gene expression and protein expression in renal cancer cells and non-cancer cells, or comparison of the amount of cell metabolites, etc. by some means, or in body fluids of renal cancer patients and non-cancer patients.
  • the present inventors have now specifically detected the plasma of renal cancer patients and healthy individuals only in renal cancer patients, or specifically detected only in healthy individuals.
  • the present invention has the following features.
  • a method for detecting renal cancer in vitro comprising measuring any one or more of the polypeptides represented by SEQ ID NOs: 1 to 7 or fragments thereof in a biological sample derived from a subject.
  • the amount or presence of one or more of the polypeptide or fragment thereof in the sample is immunologically measured. And an indication that the amount of the polypeptide or fragment thereof is increased or decreased compared to that of a control sample, or the polypeptide or fragment thereof is present only in either the sample or the control sample.
  • a renal cancer comprising one or more of an antibody or a fragment thereof or a chemically modified derivative thereof that specifically binds to at least one of the polypeptides represented by SEQ ID NOs: 1 to 7 or a fragment thereof. Composition for diagnosis or detection.
  • the polypeptide fragment is a polypeptide fragment comprising the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 8 to 16 in the amino acid sequence of the polypeptide represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 7, respectively.
  • composition according to (13) or (14) above, wherein the polypeptide fragment contains an epitope consisting of at least 7 amino acids.
  • the “chemically modified derivative” means a labeled derivative with a label such as an enzyme, a fluorophore, or a radioisotope, or a derivative containing a chemical modification such as acetylation, glycosylation, phosphorylation, or sulfation.
  • composition for diagnosis or detection refers to the presence or absence of renal cancer, the degree of morbidity, the presence or absence of improvement, and the degree of improvement, or the prevention or improvement of renal cancer. Or what can be used directly or indirectly in order to screen the candidate substance useful for a treatment.
  • a “biological sample” to be detected or diagnosed includes a sample collected from a living body that contains or is suspected of containing a target polypeptide whose expression level increases or decreases with the occurrence of renal cancer.
  • “specifically binds” means that an antibody or a fragment thereof forms an antigen-antibody complex only with a target polypeptide that is a renal cancer marker in the present invention, a variant or a fragment thereof, and the like.
  • the peptidic or polypeptide substance means that the complex is not substantially formed.
  • substantially means that non-specific complex formation can occur to a lesser extent.
  • epitope refers to a partial amino acid region (ie, antigenic determinant) having antigenicity or immunogenicity in the target polypeptide of the present invention, a variant thereof or a fragment thereof.
  • An epitope usually consists of at least 5 amino acids, preferably at least 7 amino acids or at least 8 amino acids, more preferably at least 10 amino acids.
  • the renal cancer marker in the present invention is found in a biological sample such as blood of a renal cancer patient, but is hardly or not found in that of a healthy person, or conversely, is found only in a biological sample of a healthy person. Since it is rarely found or rarely found in patients with renal cancer, it is possible to easily detect renal cancer simply by using the presence or amount of the marker as an index, for example, using blood. Has an effect.
  • the MS peak intensity of the polypeptide represented by SEQ ID NO: 8 in the present invention is shown.
  • the MS peak intensities of the polypeptides represented by SEQ ID NOs: 9 to 12 in the present invention are shown.
  • the MS peak intensities of the polypeptides represented by SEQ ID NOs: 13 to 16 in the present invention are shown.
  • the concentration of ARHGAP25 peptide in plasma before and after excision surgery in 4 patients with renal cancer is shown.
  • a renal cancer marker for detecting renal cancer in vitro using the composition for diagnosis or detection of renal cancer of the present invention is a polypeptide represented by SEQ ID NOs: 1 to 7 or a fragment thereof.
  • polypeptides of SEQ ID NOs: 1 to 7 of the present invention are shown in the following Table 1 together with their gene names (GenBank registered names) and protein numbers (Swissprot registered numbers) and their characteristics.
  • the polypeptide represented by SEQ ID NO: 1 is specifically detected in the plasma of renal cancer patients and is not detected in the plasma of healthy subjects or detected in comparison with the plasma of renal cancer patients. The amount was significantly decreased.
  • the polypeptides represented by SEQ ID NOs: 2 to 7 are specifically detected in the plasma of healthy subjects and are not detected in the plasma of patients with renal cancer, or the amount detected is significantly higher than the plasma of healthy subjects. Had decreased.
  • the amino acid sequence or nucleotide (or base) sequence of these polypeptides and / or genes (cDNA) can be obtained by accessing a data bank such as NCBI, GenBank, Swissprot or the like.
  • the polypeptide fragment comprises at least 7, at least 8, at least 10, at least 15, preferably at least 20, at least 25, more preferably at least 30 of the amino acid sequence of the polypeptide. Consisting of at least 40, at least 50, at least 100, at least 200 consecutive amino acid residues, and retains one or more epitopes. Such a fragment is capable of immunospecifically binding to the antibody of the present invention or a fragment thereof.
  • an enzyme such as protease or peptidase.
  • the polypeptide represented by SEQ ID NO: 8 was detected at a particularly high level in a biological sample of a renal cancer patient as compared with a healthy person.
  • the polypeptides represented by SEQ ID NOs: 9 to 16 were detected at a particularly high level in the biological samples of healthy individuals as compared with renal cancer patients.
  • These polypeptides are fragments of the polypeptides represented by SEQ ID NOs: 1, 2, and 5 to 7. Therefore, the polypeptides represented by these SEQ ID NOs: 8 to 16 and the fragments having them therein are More preferably used as a renal cancer marker.
  • Table 2 the polypeptides of SEQ ID NOs: 8 to 16 are shown together with the corresponding portions of the polypeptides represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 5 to 7.
  • amino acid sequences of SEQ ID NOs: 14 and 15 appear continuously in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. Therefore, a sequence in which the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 14 and 15 are linked, that is, a polypeptide represented by a sequence from the fifth alanine to the 30th lysine of SEQ ID NO: 6, and a fragment having them therein are also kidneys. More preferably used as a cancer marker.
  • any of the above-described target polypeptides for detecting renal cancer is significantly more significant in subjects suffering from renal cancer in renal cancer patients than in healthy subjects, in which the level of the polypeptide in a biological sample such as blood is higher. Or it is characterized by being exceptionally high or low.
  • the polypeptide in the present invention can be produced by, for example, a chemical synthesis method such as solid phase synthesis, which is a technique commonly used in the art, or a DNA recombination technique.
  • a chemical synthesis method such as solid phase synthesis, which is a technique commonly used in the art, or a DNA recombination technique.
  • the use of DNA recombination technology is preferred from the viewpoint of procedure and ease of purification.
  • a polynucleotide sequence encoding a partial sequence of a polypeptide in the present invention is chemically synthesized using an automatic DNA synthesizer.
  • the phosphoramidite method is used for this synthesis, and single-stranded DNA of up to about 100 bases can be automatically synthesized by this method.
  • Automatic DNA synthesizers are commercially available from, for example, Polygen and ABI.
  • RNA extracted from living tissue such as kidney tissue in which the above gene as a target is expressed by well-known cDNA cloning
  • a cDNA library is prepared from the poly A (+) RNA obtained by the treatment by RT-PCR, and the target cDNA clone is obtained from this library by screening such as hybridization screening, expression screening, and antibody screening. If necessary, the cDNA clone can be further amplified by PCR. As a result, cDNA corresponding to the target gene can be obtained.
  • Probes or primers can be selected from contiguous sequences of 15 to 100 bases based on the polypeptide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 7 and synthesized as described above.
  • the cDNA cloning technique is described in, for example, Sambrook, J. et al. And Russel, D .; Written by Molecular Cloning, A LABORARY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, published January 15, 2001, Volumes 7.42-7.45, Volumes 8.9-8.17. .
  • the cDNA clone obtained as described above is incorporated into an expression vector, and a prokaryotic or eukaryotic host cell transformed or transfected with the vector is cultured to obtain the target poly- gen from the cell or culture supernatant. Peptides can be obtained.
  • the mature polypeptide can be secreted out of the cell by flanking the nucleotide sequence encoding the secretory signal sequence at the 5 'end of the DNA encoding the target mature polypeptide.
  • Vectors and expression systems are available from Novagen, Takara Shuzo, Daiichi Chemicals, Qiagen, Stratagene, Promega, Roche Diagnostics, Invitrogen, Genetics Institute, Amersham Bioscience, and the like.
  • host cells include prokaryotic cells such as bacteria (eg, E. coli, Bacillus subtilis), yeast (eg, Saccharomyces cerevisiae), insect cells (eg, Sf cells), mammalian cells (eg, COS, CHO, BHK, NIH3T3, etc.) Can be used.
  • Vectors in addition to the DNA encoding the polypeptide, regulatory elements such as promoters (e.g.
  • lac promoter for example, drug resistance genes such as ampicillin resistance genes and tetracycline resistance genes; auxotrophic markers such as LEU2 and URA3) Etc. can be included.
  • an expression product can be generated in the form of a fusion polypeptide in which a labeled peptide is bound to the C-terminus or N-terminus of the polypeptide.
  • Typical labeled peptides include 6-10 residue histidine repeats (His tag), FLAG, myc peptide, GST polypeptide, GFP polypeptide, etc., but the labeled peptide is not limited to these.
  • polypeptide according to the present invention When a polypeptide according to the present invention is produced without a labeled peptide, the polypeptide can be purified and isolated by means well known to those skilled in the art using its physical or chemical properties. . For example, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, normal phase chromatography, reverse phase chromatography, hydrophobic interaction chromatography, isoelectric point chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC), electrophoresis, ammonium sulfate. Examples thereof include a method of combining one or a plurality of methods such as fractionation, salting out, salt solution, ultrafiltration, and dialysis.
  • a labeled peptide such as histidine repeat, FLAG, myc, GST, or GFP
  • a method by affinity chromatography suitable for each generally used labeled peptide can be mentioned.
  • an expression vector that facilitates isolation and purification may be constructed.
  • an expression vector is constructed so that it is expressed in the form of a fusion polypeptide of a polypeptide and a labeled peptide, and the polypeptide is genetically engineered, isolation and purification are easy.
  • the above polypeptide in the present invention includes its variants.
  • “Mutant” means a variant comprising a deletion, substitution, addition or insertion of one or more, preferably one or several amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 7 or a partial sequence thereof, or About 80% or more, about 85% or more, preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more, about 97% or more, about 98% or more, about 99% or more of the amino acid sequence or a partial sequence thereof It means a mutant exhibiting sex.
  • Such mutants include, for example, natural mutants such as homologues of mammal species different from humans, and variants based on polymorphic mutations between the same species of mammals (eg, race).
  • “several” refers to an integer of 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 or 2.
  • % identity can be determined using a protein or nucleic acid homology search program such as BLAST or FASTA, with or without introducing a gap (Karlin, S. et al., 1993, Processedings of the National Academic Sciences, USA, Vol. 90, p. 5873-5877; Altschul, SF, et al., 1990, Journal of Molecular Biology, Vol. 215, p. 403. 410; Pearson, WR, et al., 1988, Proceedings ofationthe National Academic Sciences U.S.A., 85, pp. 2444-2448; Kanehisa Minoruhen, database usage of the genome net (second edition), 1998, Kyoritsu Shuppan Co., Ltd., Tokyo, Japan).
  • composition for diagnosis or detection of renal cancer relates to a renal cancer comprising one or more of an antibody or a fragment thereof, or a chemically modified derivative thereof, which specifically binds to the polypeptide represented by SEQ ID NOs: 1 to 7 or a fragment thereof.
  • Compositions for diagnosis or detection are provided.
  • the composition for diagnosis or detection of renal cancer in the present invention is a fragment of the polypeptide represented by SEQ ID NOs: 1 to 7, each represented by any one of SEQ ID NOs: 8 to 16.
  • a composition comprising one or more of an antibody or a fragment thereof, or a chemically modified derivative thereof capable of specifically binding to a polypeptide fragment comprising the amino acid sequence.
  • An antibody that recognizes a polypeptide that is a renal cancer marker can specifically bind to the polypeptide via an antigen-binding site of the antibody.
  • the antibody that can be used in the present invention can be produced by a conventional technique using a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1 to 7 or a fragment thereof, or a fusion polypeptide thereof as one or a plurality of immunogens. .
  • These polypeptides, fragments, variants or fusion polypeptides used as immunogens are at least 7, at least 8, at least 10, at least in the amino acid sequence of each polypeptide represented by SEQ ID NOs: 1 to 7.
  • a polypeptide fragment consisting of 15, preferably at least 20, at least 25, at least 30, at least 40, at least 50, at least 100, at least 200 consecutive amino acid residues, or SEQ ID NOs: 1-7 It consists of each polypeptide full length represented by these. More preferably, it is a polypeptide fragment comprising the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 8 to 16, respectively.
  • polypeptides, or fragments, variants or fusion polypeptides thereof contain epitopes that elicit antibody formation, but these epitopes may be linear or discontinuous epitopes (higher order structures) )
  • the epitope can be identified by any epitope analysis method known in the art, for example, phage display method, reverse immunogenetics method and the like.
  • antibodies in the present invention include, but are not limited to, antisera, polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, chimeric antibodies, single chain antibodies, human antibodies, human antibodies, and the like.
  • the antibodies that can be used in the present invention include any type, class, and subclass. Such antibodies include, for example, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, IgY, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2.
  • antibodies of all aspects are induced by the polypeptide according to the present invention. If all or part of the polypeptide or epitope is isolated, both polyclonal and monoclonal antibodies can be prepared using conventional techniques. Methods include, for example, Kennet et al. (Supervised), Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A A NewA Dimension in Biological Analyzes, Pleumnum Press, New York, 1980.
  • Polyclonal antibodies can be produced by immunizing animals such as birds (for example, chickens) and mammals (for example, rabbits, goats, horses, sheep, mice, etc.) with the polypeptide of the present invention.
  • the target antibody can be purified from the blood of an immunized animal by appropriately combining techniques such as ammonium sulfate fractionation, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like.
  • Monoclonal antibodies can be obtained by techniques including producing hybridoma cell lines that produce monoclonal antibodies specific for each polypeptide in mice by conventional techniques.
  • One method for producing such hybridoma cell lines is to immunize an animal with a polypeptide according to the invention, collect spleen cells from the immunized animal, fuse the spleen cells to a myeloma cell line, Generating hybridoma cells and identifying a hybridoma cell line that produces a monoclonal antibody that binds to the polypeptide.
  • Monoclonal antibodies can be recovered by conventional techniques.
  • A. Preparation of monoclonal antibody (1) Immunization and collection of antibody-producing cells The immunogen obtained as described above is administered to mammals such as rats, mice (for example, Balb / c of inbred mice), rabbits, and the like. . A single dose of the immunogen is appropriately determined according to the type of animal to be immunized, the route of administration, etc., and is about 50 to 200 ⁇ g per animal. Immunization is performed mainly by injecting an immunogen subcutaneously or intraperitoneally. Further, the immunization interval is not particularly limited, and after the initial immunization, booster immunization is performed 2 to 10 times, preferably 3 to 4 times at intervals of several days to several weeks, preferably at intervals of 1 to 4 weeks.
  • the antibody titer in the serum of the immunized animal is repeatedly measured by ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) method, etc.
  • ELISA Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay
  • the immunogen is intravenously or intraperitoneally Inject and give final immunization.
  • antibody-producing cells are collected 2 to 5 days, preferably 3 days after the last immunization. Examples of antibody-producing cells include spleen cells, lymph node cells, peripheral blood cells, etc., but spleen cells or local lymph node cells are preferred.
  • Hybridoma cell lines that produce monoclonal antibodies specific for each protein can be produced and identified by conventional techniques.
  • One method for producing such a hybridoma cell line is to immunize an animal with a polypeptide of the invention, collect spleen cells from the immunized animal, and fuse the spleen cells to a myeloma cell line, thereby Generating hybridoma cells and identifying a hybridoma cell line producing a monoclonal antibody that binds to the enzyme.
  • a myeloma cell line to be fused with an antibody-producing cell a generally available cell line of an animal such as a mouse can be used.
  • the cell line used has drug selectivity and cannot survive in a HAT selection medium (including hypoxanthine, aminopterin, and thymidine) in an unfused state, but can survive only in a state fused with antibody-producing cells. Those having the following are preferred.
  • the cell line is preferably derived from an animal of the same species as the immunized animal. Specific examples of myeloma cell lines include BALB / c mouse-derived hypoxanthine / guanine / phosphoribosyl transferase (HGPRT) -deficient cell line P3X63-Ag. 8 strains (ATCC TIB9).
  • cell fusion is performed between the myeloma cell line and antibody-producing cells.
  • antibody-producing cells and myeloma cell lines are mixed at a ratio of about 1: 1 to 20: 1 in animal cell culture media such as serum-free DMEM and RPMI-1640 media, and cell fusion is performed.
  • the fusion reaction is performed in the presence of an accelerator.
  • an accelerator As a cell fusion promoter, polyethylene glycol having an average molecular weight of 1500 to 4000 daltons can be used at a concentration of about 10 to 80%.
  • an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide may be used in combination in order to increase the fusion efficiency.
  • antibody-producing cells and myeloma cell lines can be fused using a commercially available cell fusion device utilizing electrical stimulation (for example, electroporation).
  • the target hybridoma is selected from the cells after cell fusion treatment.
  • the cell suspension is appropriately diluted with, for example, fetal bovine serum-containing RPMI-1640 medium, and then plated on a microtiter plate at about 2 million cells / well, and a selective medium is added to each well. Cultivate by changing the selective medium.
  • the culture temperature is 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • myeloma cells are of HGPRT-deficient strain or thymidine kinase-deficient strain
  • a selective medium HAT medium
  • hypoxanthine, aminopterin, and thymidine containing hypoxanthine, aminopterin, and thymidine. Only those hybridomas can be selectively cultured and propagated. As a result, cells that grow from about 14 days after the start of culture in the selective medium can be obtained as hybridomas.
  • Hybridoma screening is not particularly limited, and may be carried out according to ordinary methods. For example, a part of the culture supernatant contained in a well grown as a hybridoma is collected and subjected to enzyme immunoassay (EIA: Enzyme Immuno Assay and ELISA), radioimmunoassay (RIA: Radio Immuno Assay), etc. Can do. Cloning of the fused cells is performed by limiting dilution or the like, and finally a hybridoma that is a monoclonal antibody-producing cell is established. The hybridoma is stable in culture in a basic medium such as RPMI-1640 and DMEM, and produces and secretes a monoclonal antibody that specifically reacts with the polypeptide cancer marker of the present invention.
  • EIA Enzyme Immuno Assay and ELISA
  • RIA Radio Immuno Assay
  • Monoclonal antibodies can be recovered by conventional techniques. That is, as a method for collecting a monoclonal antibody from the established hybridoma, a normal cell culture method or ascites formation method can be employed. In the cell culture method, the hybridoma is cultured in an animal cell culture medium such as RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum, MEM medium, or serum-free medium under normal culture conditions (eg, 37 ° C., 5% CO 2 concentration). Cultivate for 2-10 days and obtain antibody from the culture supernatant.
  • an animal cell culture medium such as RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum, MEM medium, or serum-free medium under normal culture conditions (eg, 37 ° C., 5% CO 2 concentration).
  • hybridomas In the case of the ascites formation method, about 10 million hybridomas are administered into the abdominal cavity of a myeloma cell-derived mammal and the same type of animal, and the hybridomas are proliferated in large quantities. Ascites fluid or serum is collected after 1-2 weeks.
  • polyclonal antibody Preparation of polyclonal antibody
  • an animal is immunized in the same manner as described above, and 6 to 60 days after the last immunization, enzyme immunoassay (EIA and ELISA), radioimmunoassay (RIA), etc.
  • EIA and ELISA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • the antibody titer is measured and blood is collected on the day when the maximum antibody titer is shown to obtain antiserum. Thereafter, the reactivity of the polyclonal antibody in the antiserum is measured by an ELISA method or the like.
  • an antigen-binding fragment of the antibody can also be used.
  • antigen-binding fragments that can be produced by conventional techniques include, but are not limited to, Fab and Fab ′, F (ab ′) 2 , Fv, scFv, dsFv, and the like.
  • antibody fragments and derivatives that can be produced by genetic engineering techniques.
  • Such antibodies include, for example, synthetic antibodies, recombinant antibodies, multispecific antibodies (including bispecific antibodies), single chain antibodies, and the like.
  • the antibody of the present invention can be used in an assay for detecting the presence of a polypeptide or a (poly) peptide fragment thereof in the present invention both in vitro and in vivo.
  • the use of monoclonal antibodies is preferred to allow specific detection in the assay, but even polyclonal antibodies can be identified by the so-called absorption method, which involves binding the antibody to an affinity column to which the purified polypeptide is bound.
  • Antibodies can be obtained.
  • the composition of the present invention comprises at least one antibody or fragment thereof that can specifically bind to the polypeptide of SEQ ID NOs: 1 to 7, a variant thereof, or a fragment thereof, preferably a plurality, more preferably All types can be included. More preferably, the composition of the present invention is a fragment of the polypeptide represented by SEQ ID NOs: 1 to 7, each comprising a polypeptide fragment comprising the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 8 to 16, and It can include at least one antibody or a fragment thereof that can specifically bind, preferably multiple types, more preferably all types.
  • the antibodies or fragments thereof that can specifically bind to each of the above polypeptides are individually or appropriately mixed as a mixture and packaged in individual containers (for example, vials). can do.
  • the antibody or fragment thereof may be bound to a solid support or may be in a free form.
  • a solid support for example, polystyrene, polycarbonate, polyvinyl toluene, polypropylene, polyethylene, polyvinyl chloride, nylon , Multi-well plates made of materials such as polymethacrylate, polymethyl methacrylate, polytetrafluoroethylene, polyvinylidene fluoride, latex, agarose, cellulose, sepharose, glass, metal, ceramics, magnetic materials, beads, test tubes, sticks,
  • the antibody or fragment thereof may be attached or bound on a solid phase carrier in the form of a test piece or the like. In free form, it is a solid such as a lyophilized solid or a liquid such as a solution.
  • the antibody or fragment thereof used in the present invention may be bound with a label, for example, a fluorophore, an enzyme, a radioisotope, or the like, if necessary, or such a label may be bound to a secondary antibody. Also good.
  • a label for example, a fluorophore, an enzyme, a radioisotope, or the like, if necessary, or such a label may be bound to a secondary antibody. Also good.
  • Fluorophores include, for example, fluorescein and its derivatives, rhodamine and its derivatives, dansyl chloride and its derivatives, umbelliferone, and the like.
  • enzymes include horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, urease, catalase, glucose oxidase, lactate dehydrogenase, and amylase.
  • Radioisotopes include, for example, iodine ( 131 I, 125 I, 123 I, 121 I), phosphorus ( 32 P), sulfur ( 35 S), metals (eg, 68 Ga, 67 Ga, 68 Ge, 54 Mn, 99 Mo, 99 Tc, 133 Xe, etc.), tritium and the like.
  • luminescent substances such as NADH-, FMNH2-, acridinium ester, luminol, and bioluminescent substances such as luciferase and luciferin.
  • an avidin-biotin system or a streptavidin-biotin system can be used.
  • biotin can be bound to the antibody of the present invention or a fragment thereof.
  • the composition of the present invention may further take the form of a kit.
  • the above-mentioned antibodies for detecting a renal cancer marker can be individually or appropriately mixed and packaged in individual containers (for example, vials).
  • the antibodies may be bound to a solid support, as described above, or in free form.
  • the kit of the present invention can contain a labeled secondary antibody, a carrier, a washing buffer, a sample diluent, an enzyme substrate, a reaction stop solution, a marker polypeptide as a purified standard substance, instructions for use, and the like.
  • Renal cancer can be detected by a method comprising examining its amount or presence.
  • the polypeptide represented by SEQ ID NO: 1, its variant or fragment thereof is detected in the biological sample of the subject, or the polypeptide, its variant or fragment thereof compared to the control Or the polypeptide represented by SEQ ID NO: 2 to 7, its variant or fragment thereof is not detected, or the polypeptide or variant thereof compared to the control Alternatively, when it is determined that the expression level of the fragment is significantly low, the subject can be diagnosed as having kidney cancer.
  • any one or more of the polypeptide fragments represented by SEQ ID NOs: 1 to 7, each comprising the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 8 to 16, Can be detected by a method comprising examining its amount or presence.
  • a polypeptide fragment comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 is detected in a biological sample of a subject, or the expression level of the polypeptide, variant or fragment thereof compared to the control Is determined to be significantly higher, or a polypeptide fragment comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 9 to 16 is not detected, or expression of those polypeptides, variants or fragments thereof compared to the control
  • the amount is determined to be significantly low, the subject can be diagnosed or determined to have kidney cancer.
  • the detection of the renal cancer marker may be a single marker, but is preferably performed for a plurality of markers, for example, 2 or more, 3 or more, 4 or more, or 5 or more to 14, 15 or 16 or less. Is good. This is to avoid unexpected detection of non-specific complexes, in other words, misdiagnosis.
  • the renal cancer marker in the present invention may be used in combination with other cancer diagnostic markers known to those skilled in the art.
  • the composition of the present invention is useful for diagnosis, determination or detection of renal cancer, that is, diagnosis of the presence or absence of disease and the degree of disease.
  • diagnosis of renal cancer comparison with normal tissues (or cells), non-cancerous tissues (or cells), normal body fluids, and other controls is performed to detect the presence or amount of the above-mentioned renal cancer marker in a biological sample of a subject. If the difference in their presence or amount is significant, the subject is suspected of having kidney cancer.
  • Specimen samples used in the method of the present invention include, for example, kidney tissue, surrounding tissues, kidney cells, or body fluids such as blood, serum, plasma, kidney fluid, and urine.
  • the biological tissue of the subject can be collected by biopsy or obtained by surgery.
  • the subject is a mammal including a human, preferably a human.
  • Substances that can bind to the above-mentioned renal cancer marker include, for example, the above-mentioned antibodies or fragments thereof, aptamers, Affibody (trademark of Affibody), receptors for the respective renal cancer markers, specific action inhibitors for the respective renal cancer markers, It contains a substance that activates a specific action of a renal cancer marker, and is preferably an antibody or a fragment thereof, or a chemically modified derivative thereof.
  • the measurement is carried out by contacting an antibody or fragment optionally labeled with a conventional enzyme or fluorophore with a tissue section or homogenized tissue or body fluid, qualitatively or with an antigen-antibody complex.
  • a step of quantitatively measuring can be included.
  • Detection is, for example, a method for measuring the presence and level of a target polypeptide by immunoelectron microscopy, an enzyme antibody method (for example, ELISA), a fluorescent antibody method, a radioimmunoassay method, a homogeneous method, a heterogeneous method, a solid phase method, a sandwich method Or the like by a method of measuring the presence or level of the target polypeptide by a conventional method.
  • the reaction of the present invention in order to easily detect the reaction between the antibody of the present invention and the target polypeptide in the sample, the reaction of the present invention is directly detected by labeling the antibody of the present invention, or the label is labeled. Detection is indirectly by using a secondary antibody. In the detection method of the present invention, it is preferable to use the latter indirect detection in terms of sensitivity.
  • the target polypeptide is present or disappears in body fluids or renal cancer tissues or cells, preferably blood, obtained from the subject, or compared to the control, If the level of peptide is significantly increased or decreased, it is determined to be renal cancer.
  • “significantly” means that there is a statistically significant difference, and in this case, the risk factor is less than 0.05.
  • a method using mass spectrometry is included. Specifically, this method can be performed by the technique described in the examples. That is, a biological sample such as serum or plasma is filtered to remove impurities, diluted with a buffer solution (for example, pH of about 8) and adjusted to a concentration of about 10 mg / ml to about 15 mg / ml, and then a molecular weight of 5 Molecular weight fractionation is performed through a hollow fiber filter (Reference Example (1) below) or a centrifugal flat membrane filter capable of removing more than 10,000 proteins, and the fraction is treated with protease (for example, trypsin) to be peptideized, and mass spectrometry is performed.
  • a buffer solution for example, pH of about 8
  • a molecular weight fractionation is performed through a hollow fiber filter (Reference Example (1) below) or a centrifugal flat membrane filter capable of removing more than 10,000 proteins, and the fraction is treated with protease (for example, trypsin) to be peptid
  • a meter a type using matrix-assisted laser desorption / ionization or electrospray ionization
  • ⁇ Reference example> Production of hollow fiber filter 100 polysulfone hollow fibers having a pore size of about 50,000 on the membrane surface are bundled, and both ends are fixed to a glass tube with an epoxy potting agent so as not to block the hollow part of the hollow fiber. And created a mini-module.
  • the minimodule (module A) is used to remove high molecular weight proteins in serum or plasma, and has a diameter of about 7 mm and a length of about 17 cm.
  • a minimodule (module B) used for concentration of low molecular weight proteins was prepared using a membrane having a pore size of about 3,000 for the molecular weight cut off.
  • the mini module has an inlet connected to the hollow fiber lumen at one end, and an outlet at the opposite end.
  • the hollow fiber inlet and outlet are closed circulation system flow paths using silicon tubes, and the liquid is driven and circulated through the flow path by a peristaltic pump.
  • the glass tube of the hollow fiber mantle is provided with a port for discharging the liquid leaking from the hollow fiber, and one module set is configured.
  • Modules were connected by T-shaped connectors in the middle of the flow path, and three modules A and one module B were connected in tandem to form one hollow fiber filter.
  • the hollow fiber filter was washed with distilled water and filled with an aqueous solution of PBS (phosphate buffer containing 0.15 mM NaCl, pH 7.4).
  • PBS phosphate buffer containing 0.15 mM NaCl, pH 7.4
  • the fraction raw material serum or plasma is injected from the flow channel inlet of the hollow fiber filter, and is discharged from the flow channel outlet after fractionation and concentration. Serum or plasma injected into the hollow fiber filter is subjected to molecular sieving with a molecular weight of about 50,000 for each module A, and components having a molecular weight lower than 50,000 are concentrated and prepared in module B. Yes.
  • Example 1 Protein identification of healthy human and renal cancer patient plasma EDTA plasma from 7 renal cancer patients in their 50s to 70s before and 1 month after excision surgery, and EDTA plasma from 8 healthy individuals of the same age Obtained and measured for each plasma. Plasma was filtered through a filter having a pore size of 0.22 ⁇ m to remove contaminants, and the protein concentration was adjusted to 50 mg / mL. This plasma was further diluted to 12.5 mg / mL of 25 mM ammonium bicarbonate solution (pH 8.0), and fractionated by molecular weight using the hollow fiber filter shown in Reference Example (1).
  • fractionated plasma sample (total volume 1.8 mL, containing up to 250 ⁇ g protein) is separated into 7 fractions by ProteomeLab® PF2D System (Beckman Coulter) reverse phase chromatography, and each fraction is lyophilized After that, the sample was redissolved in 100 ⁇ L of 25 mM ammonium bicarbonate solution (pH 8.0). This sample was digested with trypsin in an amount of 1/50 of the total protein at 37 ° C. for 2 to 3 hours for peptideization. The peptides of each fraction were further fractionated into 4 fractions using an ion exchange column (KYA Technologies, Japan).
  • each of the fractions was further fractionated on a reverse phase column (KYA Technologies, Japan), and the eluted peptides were surveyed using a mass spectrometer Q-TOF Ultimate (Micromass) linked online. Measured in scan mode.
  • the mass / charge ratio is usually corrected by using a standard substance at the time of measurement.
  • albumin ⁇ -
  • the data was further refined by recalibrating the measurement data using some proteins such as fibrinogen as internal standards and using the theoretical mass values of those proteins. Data refined in this way was analyzed using protein analysis software MASCOT (Matrix Science, UK).
  • MS peak intensity Proteins whose MS peak intensity is increased or decreased in plasma prior to cancer removal surgery for renal cancer patients compared to that of healthy individuals
  • MS peaks at the time of detection of peptides belonging to the proteins identified in (2) above Intensity was analyzed. Although this MS peak intensity is not strictly quantitative, it is a numerical value that reflects the amount of protein present to some extent, and it is understood by those skilled in the art that quantitative comparative analysis using MS peak intensity is possible. It is well known.
  • the MS peak intensity at the time of detection of each peptide was compared between healthy persons and cancer patients, and among the detected peptides, the peak intensity in the plasma before surgery for renal cancer patients was significantly higher than that of healthy persons.
  • a peptide whose peak intensity in the plasma before surgery for renal cancer patients is larger than the peak intensity in plasma one month after the cancer removal surgery It was found as a peptide whose abundance increased significantly.
  • These peptides are the polypeptide represented by SEQ ID NO: 8, and are fragments of the polypeptide represented by SEQ ID NO: 1.
  • the peak intensity in the plasma before cancer removal surgery for renal cancer patients is significantly smaller than that in healthy individuals, and the peak intensity in the plasma before surgery for kidney cancer patients is high.
  • a peptide that is smaller than the peak intensity in plasma one month after cancer removal surgery was found as a peptide whose abundance is significantly reduced in the plasma of patients before kidney cancer removal surgery compared to healthy individuals.
  • These peptides are polypeptides represented by SEQ ID NOs: 9 to 16, and these peptides are fragments of any one of the polypeptides represented by SEQ ID NOs: 2, 5 to 7. Therefore, it was found that these polypeptides represented by SEQ ID NOs: 8 to 16 and fragments having them therein are useful in detecting renal cancer as a renal cancer marker.
  • These polypeptide fragments represented by SEQ ID NOs: 8 to 16 are gene names, fragment portions of the sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 5 to 7, peptide lengths, amino acid sequences (one letter Table 4 together with the notation.
  • 1 to 3 show the MS peak intensities of the polypeptide fragments represented by SEQ ID NOs: 8 to 16 in healthy individuals, renal cancer patients (preoperative), and renal cancer patients (postoperative).
  • the numbers on the MS peak intensity of renal cancer patients and healthy individuals in each sequence indicate the number of each individual.
  • Example 2 (1) Preparation of human ARHGAP25
  • One of the renal cancer markers in the present invention is the human ARHGAP25 polypeptide represented by SEQ ID NO: 1. Further, as shown in Example 1 (3) and FIG. 1, among the human ARHGAP25 polypeptide, the site that is more characteristically detected in renal cancer patients is the human ARHGAP25 polypeptide represented by SEQ ID NO: 8. It is the sequence from the first amino acid to the 15th amino acid (hereinafter referred to as ARHGAP25 peptide). This ARHGAP25 peptide could be chemically synthesized by contract with Takara Bio Inc. (Japan). In addition, a rabbit polyclonal antibody against this ARHGAP25 peptide was similarly commissioned and acquired.
  • ARHGAP25 (1-97) A polypeptide represented by SEQ ID NO: 17 (hereinafter referred to as ARHGAP25 (1-97)) consisting of the above region was prepared as a recombinant protein from E. coli. The preparation procedure of ARHGAP25 (1-97) is described below.
  • human ARHGAP25 mRNA was prepared from HEK293 cells.
  • Qiashredder and RNeasy mini kit manufactured by Qiagen
  • RNeasy mini kit manufactured by Qiagen
  • cDNA was synthesized using reverse transcriptase Superscript II (manufactured by Invitrogen) using the obtained total mRNA as a template to prepare a human cDNA library.
  • the reverse transcription reaction followed the protocol attached to the enzyme.
  • PCR was performed using the obtained human cDNA library as a template and a primer set consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 18 and 19.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 18 includes a part of the ARHGAP25 gene and a BamHI recognition sequence upstream thereof.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 19 includes a part of the ARHGAP25 gene and an EcoRI recognition sequence downstream thereof.
  • a DNA sequence encoding ARHGAP25 (1-97) is obtained as an amplified DNA fragment.
  • the PCR reaction was prepared using KOD (Toyobo Co., Ltd., Japan) as DNA polymerase according to the protocol attached to KOD so as to contain 10 ng of cDNA library and 10 pmol of each primer.
  • the reaction conditions are as follows: after heating at 94 ° C.
  • the amplified DNA fragment was purified using Quantum prep PCR Kleen Spin Columns (manufactured by Bio-rad). By this reaction, a PCR product having a total length of about 300 bp was obtained.
  • the obtained DNA fragment was cleaved with BamHI and EcoRI, and simultaneously dephosphorylated at the end using the BAP enzyme, and further purified by agarose gel extraction.
  • the DNA fragment was mixed with a histidine-tagged expression vector pET30b (Novagen) cut in advance with BamHI and EcoRI, and a ligation reaction was performed.
  • Ligation High Toyobo Co., Ltd., Japan
  • competent cells were transformed with the solution after the ligation reaction.
  • Escherichia coli strain DH5 ⁇ manufactured by Takara Bio Inc., Japan
  • the transformed bacteria were spread on an LB plate containing 100 ⁇ g / mL of antibiotic ampicillin and cultured at 37 ° C. overnight.
  • the obtained transformant was cultured overnight at 37 ° C. in an LB liquid medium containing 100 ⁇ g / mL ampicillin, and the desired pET30b_ARHGAP25 (1-97) was obtained by miniprep.
  • pET30b_ARHGAP25 (1-97) was used to transform E. coli strain Rosetta-GamiG2 (Novagen).
  • the obtained transformant is cultured for 3 hours at 37 ° C. using 3 L of LB medium containing ampicillin and chloramphenicol, added with IPTG having a final concentration of 1 mM, and cultured at 30 ° C. for 18 hours.
  • the cells were collected by centrifugation.
  • the obtained bacterial cells were washed with PBS, and the insoluble fraction was prepared as a precipitate using B-PER (PIERCE). The details followed the attached protocol.
  • the insoluble fraction was solubilized in PBS containing 8M Urea, and histidine tag-fused ARHGAP25 was adsorbed using Ni-NTA agarose resin (manufactured by QIAGEN). The resin adsorbed with protein was washed with PBS containing 10 mM imidazole and then eluted with 1M imidazole solution. Next, protein refolding was performed from the obtained elution fraction.
  • the ARHGAP25 (1-97) solution prepared in the same manner as described above was intraperitoneally administered 6 weeks later, and the spleen was removed 3 days later.
  • the obtained spleen cell solution was centrifuged at 1200 rpm for 7 minutes, and then the supernatant was removed and washed with RPMI1640 medium. The cells were again suspended in RPMI1640 medium, and the number of cells was counted.
  • an SP2 / 0 myeloma cell solution having 1/10 the number of spleen cells was prepared. Both cell solutions were mixed and centrifuged at 2200 rpm for 10 minutes, and the supernatant was discarded. The cells were tapped to loosen, and 1 mL of a solution prepared by mixing PEG (manufactured by ROCHE) and HBSS (manufactured by GIBCO) at a ratio of 5: 1 was added and stirred. In the following work, unless otherwise noted, all solutions and culture media were kept warm at 37 ° C.
  • RPMI1640 medium 9 mL was added over 5 minutes, mixed slowly, and then centrifuged at 2200 rpm for 10 minutes to remove the supernatant.
  • the obtained precipitated cells are suspended in RPMI1640 medium supplemented with 15% FCS and HAT (manufactured by ROCHE), poured into a 96-well cell culture plate (manufactured by Greiner) at 200 ⁇ L per well, 37 ° C., 5% CO 2. Incubated for 1 week.
  • Colonies that grew under the HAT-added condition were judged to be hybridomas in which spleen cells and myeloma cells were fused, and hybridomas producing antibodies against the ARHGAP25 peptide were further selected.
  • 50 ⁇ L of 1 ⁇ g / mL ARHGAP25 peptide was placed in a well of a 96-well peptide adsorption plate (manufactured by NUNK), and solidified overnight. After discarding the protein solution in the well, 200 ⁇ L of 4-fold diluted BlockAce solution (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd., Japan) was poured and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • the plate was washed with PBS-T to obtain an ARHGAP25 peptide-immobilized plate.
  • the supernatant of the well in which colonies were grown was diluted 5-fold, added to the well of the ARHGAP25 peptide-immobilized plate, and allowed to stand at room temperature for 1 hour. Thereafter, the solution in the wells was discarded and washed with PBS-T, and then 100 ⁇ L of an HRP-labeled anti-mouse IgG solution (manufactured by Dako) was added and allowed to stand at room temperature for 1 hour. The solution in the well was discarded, washed with PBS-T, and 100 ⁇ L of TMB solution was added and allowed to react for 15 minutes.
  • the color developed by the reaction was confirmed by the absorbance at 450 nm, and the colored well was regarded as positive.
  • the positive well colonies were suspended in RPMI medium containing 15% FCS and HT (manufactured by Invitrogen), and positive clones were cloned by the limiting dilution method.
  • the hybridoma was inoculated into 1% 10 5 cells / mL in 60 mL of 100% SFM medium and cultured for 10 days until the cells died, and then the culture was centrifuged at 3000 rpm for 15 minutes to remove the cells. .
  • the contained antibody was purified using MabTrapKit (GE Healthcare Bioscience, Japan).
  • Biotinylation of the antibodies was performed with a biotinylation reagent Sulfo-NHS-Biotin (manufactured by PIERCE). Biotinylation was performed according to the protocol attached to the reagent.
  • the capture antibody was prepared as a 2 ⁇ g / mL PBS solution, and 50 ⁇ L each was added to a well of a 96-well protein adsorption plate (Nunk Co., Ltd.), solidified overnight, and the next day PBS-containing 1% BSA and 10% sucrose. Blocking was performed with the T solution at room temperature for 2 hours.
  • Example 1 and FIG. 1 4 samples of patient plasma before surgery for removal of renal cancer in which ARHGAP25 peptide is strongly detected, and 4 samples of postoperative plasma from each patient, totaling 8 samples of plasma, 1%
  • the solution was diluted 2-fold with BSA-PBST, 100 ⁇ L of each was added to each well of the antibody-immobilized plate, and allowed to react at room temperature for 2 hours.
  • the ARHGAP25 peptide concentration in the plasma before excision surgery was higher than that after the excision surgery.
  • the ARHGAP25 peptide concentration before excision surgery was significantly higher than that after surgery. Therefore, it was found that the ARHGAP25 peptide shown in Example 1 and the ARHGAP25 protein containing the peptide are useful as markers for determining the presence or absence of renal cancer.
  • the present invention is particularly useful in the medical field because it can provide a composition for diagnosis or detection of renal cancer having excellent specificity and sensitivity.

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Abstract

　本発明は、被験者由来の生体試料中の配列番号１～７で表されるポリペプチド、その変異体またはその断片のいずれか１つまたは複数を測定することを含む、腎癌を検出する方法、ならびに、腎癌を診断または検出するための組成物に関する。

Description

腎癌の診断又は検出のための組成物及び方法
　本発明は、腎癌の診断又は検出に有用な組成物に関する。
　本発明はまた、該組成物を使用した腎癌の検出方法に関する。
　腎臓は血液をろ過して尿を生成することにより生体内の老廃物を体外に排泄する役割を持つ、重要な泌尿器系器官である。また同時に血圧をコントロールするアンギオテンシン、赤血球造血因子であるエリスロポエチンなどのホルモンを産生する重要な内分泌器官でもある。
　腎臓に発生する腫瘍には、成人に発生する腎細胞癌と小児に発生するウィルムス腫瘍、まれな腫瘍として肉腫があるが、以後最も発生率が高い悪性腫瘍である腎細胞癌を腎癌と呼ぶ。腎癌の発生頻度は人口１０万人あたり２．５人程度であり、男女比は２～３：１で男性に多い傾向がある。泌尿器科系悪性腫瘍の中では、前立腺癌、膀胱癌に次いで多い腫瘍である。
　腎癌の危険因子としては遺伝学的要因も知られているが、一般的にはたばこ、脂肪摂取量などを挙げることができる。また長期に透析を受けている患者において腫瘍の発生率が高いことも知られている。
　腎癌では腫瘍の最大径が５ｃｍ以下の場合に何らかの自覚症状があることはまれであり、検診時のＣＴスキャンなどによって発見されることが多い。サイズの大きい腫瘍では血尿、腹部腫瘤、疼痛などがみられる。また全身的症状として発熱、体重減少、貧血などをきたすことがあり、まれに内分泌因子によって赤血球増多症や高血圧、高カルシウム血症などが引きおこされることがある。一方で腎癌の下大静脈内への進展によって腹部体表の静脈の怒張や精巣静脈瘤が起こることがある。腎癌の約２割は、肺や骨転移から発見される。腎癌では静脈の中に腫瘍が広がる傾向が強く、他の臓器への転移を生じ易い。
　腎癌の検査法としては超音波検査、ＣＴ検査、血管造影検査があるが、特異的な生化学マーカーは知られておらず、機器を利用した検診が必要となる。
　また腎癌はさらに病理学的にいくつかの分類が可能であるが、そのうちの約９０％を占める淡明細胞型腎癌の発生原因は、癌抑制遺伝子であるＶＨＬ（ｖｏｎ－Ｈｉｐｐｅｌ－Ｌｉｎｄａｕ）遺伝子の欠損であることが知られている（非特許文献１）。ＶＨＬ遺伝子の欠損はＨＩＦ－α／ＶＨＦ会合の障害を介して低酸素誘導遺伝子群の転写活性化をもたらし（非特許文献２）、ＶＥＧＦ、ＴＧＦβなどの遺伝子の発現増強が起こる事が知られている。
　腎癌の治療の主体は外科療法である。病期にかかわらず、摘出できる場合は腎臓の摘出、あるいは腎臓を部分的に摘出することが最も一般的であり、仮に転移があっても、腎臓の外科的摘出が考慮される場合がある。外科療法以外の方法としては、腎動脈の動脈塞栓術があり、この方法は摘出が不可能な場合や、大きな腫瘍を摘出する場合に手術に先立ち施行されることがある。
　腎癌は比較的早期で発見された場合は予後は比較的良く、初期癌での治療では９０％以上が治癒する。しかし、５ｃｍ以上の大きな腫瘍や転移のある腫瘍の治療成績は劣り（腎細胞癌全体の５年生存率は約５０－６０％）、早期発見の重要性が認識されている。
　画像診断は早期の小さい腎癌を発見するのに有用な方法ではあるが、例えば健康診断など大勢の被験者を対象とした場合には効率が良いとはいえず、また診断に必要な費用も比較的高い。そこで、腎癌の特異的で感受性が高い血中マーカーの発見が強く望まれている。血中マーカーを利用することにより、比較的安価でハイスループットな検査または診断が可能になると考えられる。
　ヒト腎癌の検出または診断については、遺伝子発現の差を利用する方法が特許文献１に開示されている。またヒト腎癌において増加することが知られているタンパク質としては、細胞外基質を分解することによって癌細胞の運動性を増加させると考えられるＭＭＰ２（非特許文献３）、腎障害において発現が増加することが知られているＴＮＦＲＳＦ７（非特許文献４）のほか、ＰＤＥ８Ｂ（特許文献２）、ＦＬＯＴ１（特許文献３）、ＣＤ５（非特許文献５）、ＥＣＭ１（特許文献４）なども知られているが、相対的に特異性が高いとは言えず、これらの発現量のみによる感受性が高い腎癌の検査方法の臨床的利用は行われていない。
国際公開第２００５／０２４６０３号パンフレット 国際公開第２００４／０４２０７７号パンフレット 国際公開第２００４／０４８９３３号パンフレット 米国特許第６３０３７６５号明細書 Ｌａｔｉｆ，Ｆ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９３、第２６０巻、ｐ．１３１７－１３２０ Ｍａｘｗｅｌｌ，Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９９、第３９９巻、ｐ．２７１－２７５ Ｌｅｉｎ，Ｍ．ら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ、２０００、第８５巻、ｐ．８０１－８０４ Ｎａｋａｔｓｕｊｉ，Ｔ．、Ｃｌｉｎｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００３、第２巻、ｐ．１９２－１９６ Ｎａｇａｓｅ，Ｙ．ら、日本泌尿器科学会雑誌、１９９１、第８２巻、ｐ．１７８１－１７８９
　しかしながら、上記の既存のマーカー、およびマーカー候補は特異性及び／又は感受性に乏しいことや、生体試料からのその効率的な検出方法が確立していないことから一般に臨床上の利用は行われておらず、より特異性及び感受性が高い腎癌のマーカーが切望されている。
　本発明は、腎癌の診断に有用な組成物、および該組成物を用いた腎癌の検出方法を提供することを目的とする。
　マーカー探索の方法としては、腎癌細胞と非癌細胞における遺伝子発現やタンパク質発現、又は細胞の代謝産物などの量を何らかの手段によって比較する方法や、腎癌患者と非癌患者の体液中に含まれる遺伝子、タンパク質、代謝産物などの量を測定する方法が挙げられる。
　上記の課題を解決するために、本発明者らは、今回、腎癌患者と健常人の血漿について、腎癌患者にのみ特異的に検出されるか、あるいは健常人にのみ特異的に検出されるタンパク質マーカー群を見出した。
　本発明は、以下の特徴を有する。
（１）被験者由来の生体試料中の配列番号１～７で表されるポリペプチドまたはその断片のいずれか１つまたは複数を測定することを含む、腎癌をインビトロで検出する方法。
（２）前記断片が、配列番号１～７のいずれかで表されるポリペプチドのアミノ酸配列において、それぞれ配列番号８～１６のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド断片である、上記（１）に記載の方法。
（３）前記ポリペプチドまたはその断片の量またはその存在を測定する、上記（１）または（２）に記載の方法。
（４）前記ポリペプチドまたはその断片の量が、対照試料のものと比べて有意に増大しているか、あるいは有意に減少していることを指標にする、上記（１）～（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記ポリペプチドまたはその断片の測定が免疫学的方法によるものである、上記（１）～（４）のいずれかに記載の方法。
（６）前記測定が、前記ポリペプチドまたはその断片と結合可能な物質を用いて行われる、上記（１）～（５）のいずれかに記載の方法。
（７）前記結合可能な物質が抗体またはその断片である、上記（６）に記載の方法。
（８）前記抗体が標識されている、上記（７）に記載の方法。
（９）前記ポリペプチドまたはその断片と特異的に結合する抗体またはその断片を用いて、前記試料中の該ポリペプチドまたはその断片のうちの１つまたは複数の量または存在を免疫学的に測定し、該ポリペプチドまたはその断片の量が対照試料のものと比べて増大あるいは減少していることを指標にするか、あるいは該ポリペプチドまたはその断片が前記試料または対照試料のいずれか一方にのみ存在していること、を指標にして腎癌を検出することを含む、上記（１）～（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）前記試料が血液、血漿、血清または尿である、上記（１）～（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）前記試料が腎由来の組織または細胞である、上記（１）～（９）のいずれかに記載の方法。
（１２）前記抗体が、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、上記（７）～（９）のいずれかに記載の方法。
（１３）配列番号１～７で表されるポリペプチドまたはその断片の少なくとも１つと特異的に結合する、抗体もしくはその断片またはそれらの化学修飾誘導体のうちの1つまたは複数を含む、腎癌の診断または検出のための組成物。
（１４）前記ポリペプチドの断片が、配列番号１～７のいずれかで表されるポリペプチドのアミノ酸配列において、それぞれ配列番号８～１６のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド断片である、上記（１３）記載の組成物。
（１５）前記ポリペプチドの断片が、少なくとも７個のアミノ酸からなるエピトープを含む、上記（１３）または（１４）に記載の組成物。
（１６）キットの形態である、上記（１３）～（１５）のいずれかに記載の組成物。
（１７）上記（１３）～（１６）のいずれかに記載の組成物の、被験者における腎癌のインビトロ検出のための使用。
　本明細書中で使用する用語は、以下の定義を有する。
　本明細書において「化学修飾誘導体」は、酵素、蛍光団、放射性同位元素などのラベルによるラベル化誘導体、あるいはアセチル化、グリコシル化、リン酸化、硫酸化などの化学修飾を含む誘導体を意味する。
　本明細書において「診断または検出のための組成物」とは、腎癌の罹患の有無、罹患の程度もしくは改善の有無や改善の程度を診断または検出するために、あるいは腎癌の予防、改善又は治療に有用な候補物質をスクリーニングするために、直接的又は間接的に使用しうるものをいう。
　本明細書において検出または診断対象となる「生体試料」とは、腎癌の発生にともない発現量が増加もしくは減少する標的ポリペプチドを含有する、またはその含有が疑われる、生体から採取された試料をいう。
　本明細書において「特異的に結合する」とは、抗体またはその断片が、本発明における腎癌マーカーである標的ポリペプチド、その変異体またはその断片とのみ抗原-抗体複合体を形成し、他のペプチド性またはポリペプチド性物質とは該複合体を実質的に形成しないことを意味する。ここで、「実質的」とは、程度は小さいが非特異的な複合体形成が起こり得ることを意味する。
　本明細書において「エピトープ」とは、本発明の標的ポリペプチド、その変異体またはその断片において、抗原性または免疫原性を有する部分アミノ酸領域（すなわち、抗原決定基）指す。エピトープは通常、少なくとも５アミノ酸、好ましくは少なくとも７アミノ酸または少なくとも８アミノ酸、より好ましくは少なくとも１０アミノ酸からなる。
　本発明における腎癌マーカーは、腎癌患者の血液などの生体試料中に見出されるが、健常人のそれにはほとんど、または全く見出されないか、あるいは逆に健常人の生体試料にのみ見出され、腎癌患者のそれにはほとんど、または全く見出されないため、単に該マーカーの存在または量を指標にすることによって、例えば血液を用いて、容易に腎癌を検出することができるという格別の作用効果を有する。
本発明における配列番号８で表されるポリペプチドのＭＳピーク強度を示す。 本発明における配列番号９～１２で表されるポリペプチドのＭＳピーク強度を示す。 本発明における配列番号１３～１６で表されるポリペプチドのＭＳピーク強度を示す。 腎癌患者４名における摘出手術前後での血漿中のARHGAP25ペプチドの濃度を示す。
　以下に本発明をさらに具体的に説明する。
＜腎癌マーカー＞
　本発明の腎癌の診断または検出のための組成物を使用して腎癌をインビトロで検出するための腎癌マーカーは、配列番号１～７で表されるポリペプチドまたはその断片である。
　本発明の配列番号１～７のポリペプチドを、その遺伝子名（ＧｅｎＢａｎｋ登録名）およびタンパク質番号（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ登録番号）、ならびにそれらの特性とともに下記の表１に示す。これらのポリペプチドのうち、配列番号１で表されるポリペプチドは、腎癌患者血漿中に特異的に検出され、健常者の血漿には検出されないか、または腎癌患者血漿に比べて検出される量が有意に減少していた。また、配列番号２～７で表されるポリペプチドは、健常者血漿中に特異的に検出され、腎癌患者の血漿には検出されないか、または健常人血漿に比べて検出される量が有意に減少していた。なお、これらのポリペプチドおよび／または遺伝子（ｃＤＮＡ）のアミノ酸配列またはヌクレオチド（もしくは、塩基）配列は、ＮＣＢＩ、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ等のデータバンクにアクセスすることによって入手可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　また、本発明における上記ポリペプチドの断片は、該ポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２０個、少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個の連続するアミノ酸残基からなり、１個または複数のエピトープを保持する。このような断片は、本発明に関わる抗体またはその断片と免疫特異的に結合することができるものである。上記ポリペプチドが、例えば血液中に存在する場合には、そこに存在するプロテアーゼやペプチダーゼなどの酵素によって切断され断片化されて存在することが想定される。
　また、後述の実施例１に示すように、本発明において、配列番号８で表されるポリペプチドは、健常者に比べて腎癌患者の生体試料中に特に高いレベルで検出されていた。また、配列番号９～１６で表されるポリペプチドは、逆に腎癌患者に比べて健常者の生体試料中に特に高いレベルで検出されていた。これらのポリペプチドは、配列番号１、２、５～７で表されるポリペプチドの断片であり、従って、これらの配列番号８～１６で表されるポリペプチド、およびそれらを内部に持つ断片は腎癌マーカーとしてより好ましく用いられる。下記表２に、配列番号８～１６のポリペプチドを、配列番号１、２、５～７で表されるポリペプチドのどの部分に相当するかと共に記す。
　また、配列番号１４、１５のアミノ酸配列は配列番号６のアミノ酸配列のなかで連続的に出現している。したがって、配列番号１４、１５のアミノ酸配列を連結した配列、すなわち配列番号６の第５番目のアラニンから第３０番目のリジンまでの配列で表されるポリペプチド、およびそれらを内部に持つ断片も腎癌マーカーとしてより好ましく用いられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　本発明において腎癌検出のための上記標的ポリペプチドはいずれも、腎癌患者において、血液などの生体試料中の該ポリペプチドのレベルが、健常人と比べて腎癌に罹患した被験者において有意にまたは格別に高い、あるいは低いことによって特徴付けられる。
　本発明におけるポリペプチドは、例えば当業界で慣用の技術である、固相合成等の化学合成法、またはＤＮＡ組換え技術によって作製することができる。手順や精製の簡易さの点で、ＤＮＡ組換え技術の使用が好ましい。
　はじめに本発明におけるポリペプチドの部分配列をコードするポリヌクレオチド配列を、ＤＮＡ自動合成装置を用いて化学的に合成する。この合成には一般にホスホアミダイト法が使用され、この方法によって約１００塩基までの一本鎖ＤＮＡを自動合成することができる。ＤＮＡ自動合成装置は、例えばＰｏｌｙｇｅｎ社、ＡＢＩ社などから市販されている。
　得られたポリヌクレオチドをプローブまたはプライマーとして用いて、周知のｃＤＮＡクローニングによって、具体的には、標的である上記遺伝子が発現される腎組織などの生体組織から抽出した全ＲＮＡをオリゴｄＴセルロースカラムで処理して得られるポリＡ（＋）ＲＮＡからＲＴ－ＰＣＲ法によってｃＤＮＡライブラリーを作製し、このライブラリーからハイブリダイゼーションスクリーニング、発現スクリーニング、抗体スクリーニングなどのスクリーニングによって、目的のｃＤＮＡクローンを得る。必要に応じて、ｃＤＮＡクローンをさらにＰＣＲ法によって増幅することもできる。これによって目的の遺伝子に対応するｃＤＮＡを得ることができる。
　プローブ又はプライマーは、配列番号１～７に示されるポリペプチド配列に基づいて１５～１００塩基の連続する配列の中から選択し、上記のようにして合成しうる。また、ｃＤＮＡクローニング技術は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．および Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ．著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２００１年１月１５日発行、の第１巻７．４２～７．４５、第２巻８．９～８．１７に記載されている。
　次に、上記のようにして得られたｃＤＮＡクローンを発現ベクターに組み込み、該ベクターによって形質転換又はトランスフェクションされた原核又は真核宿主細胞を培養することによって該細胞又は培養上清から目的のポリペプチドを得ることができる。このとき、目的の成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡの５’末端に、分泌シグナル配列をコードするヌクレオチド配列をフランキングすることによって細胞外に成熟ポリペプチドを分泌させることができる。
　ベクター及び発現系はＮｏｖａｇｅｎ社、宝酒造、第一化学薬品、Ｑｉａｇｅｎ社、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｔｉｃｓ社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社などから入手可能である。宿主細胞としては、細菌などの原核細胞（例えば大腸菌、枯草菌）、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシアエ）、昆虫細胞（例えばＳｆ細胞）、哺乳動物細胞（例えばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＮＩＨ３Ｔ３など）などを用いることができる。ベクターには、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの他に、調節エレメント、例えばプロモーター（例えばｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＳＶ４０ウイルスプロモーター、３－ホスホグリセレートキナーゼプロモーター、解糖系酵素プロモーターなど）、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位、複製開始点、ターミネーター、選択マーカー（例えばアンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子；ＬＥＵ２、ＵＲＡ３などの栄養要求性マーカーなど）などを含むことができる。
　また、ポリペプチドの精製を容易にするために、標識ペプチドをポリペプチドのＣ末端またはＮ末端に結合させた融合ポリペプチドの形態で発現産物を生成させることもできる。代表的な標識ペプチドには、６～１０残基のヒスチジンリピート（Ｈｉｓタグ）、ＦＬＡＧ、ｍｙｃペプチド、ＧＳＴポリペプチド、ＧＦＰポリペプチドなどが挙げられるが、標識ペプチドはこれらに限られるものではない。
　標識ペプチドを付けずに本発明に係るポリペプチドを生産した場合には、その物理的または化学的性質を利用して、当業者に周知の手段により該ポリペプチドを精製、単離することができる。その精製法として例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、電気泳動、硫安分画、塩析、塩溶、限外ろ過、透析などの方法を１つまたは複数組み合わせる方法を挙げることができる。さらにまた、該ポリペプチドにヒスチジンリピート、ＦＬＡＧ、ｍｙｃ、ＧＳＴ、ＧＦＰ、といった標識ペプチドを付けている場合には、一般に用いられるそれぞれの標識ペプチドに適したアフィニティークロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。この場合、単離・精製が容易となるような発現ベクターを構築するとよい。特にポリペプチドと標識ペプチドとの融合ポリペプチドの形態で発現するように発現ベクターを構築し、遺伝子工学的に当該ポリペプチドを調製すれば、単離および精製も容易である。
　本発明における上記ポリペプチドには、その変異体も含まれる。「変異体」とは、配列番号１～７で表されるアミノ酸配列又はその部分配列において１以上、好ましくは１もしくは数個、のアミノ酸の欠失、置換、付加又は挿入を含む変異体、あるいは該アミノ酸配列又はその部分配列と約８０％以上、約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上の％同一性を示す変異体を意味する。このような変異体には、例えば、ヒトと異なる哺乳動物種のホモログ、同種の哺乳動物(例えば人種)間での多型性変異に基づく変異体などの天然変異体が含まれる。
　ここで、「数個」とは、１０、９、８、７、６、５、４、３又は２の整数を指す。
　また、「％同一性」は、例えばＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡなどのタンパク質または核酸のホモロジー検索プログラムを用いて、ギャップを導入してまたはギャップを導入しないで、決定することができる（Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら、１９９３年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．、第９０巻、ｐ.５８７３-５８７７；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９０年、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２１５巻、ｐ．４０３－４１０；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．ら、１９８８年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．、第８５巻、ｐ.２４４４-２４４８；高木利久・金久實編、ゲノムネットのデータベース利用法（第２版）１９９８年、共立出版社、東京、日本）。
＜腎癌の診断または検出のための組成物＞
　本発明は、配列番号１～７で表されるポリペプチドまたはその断片と特異的に結合する、抗体もしくはその断片、またはそれらの化学修飾誘導体、のうちの１つまたは複数を含む、腎癌の診断または検出のための組成物を提供する。
　さらに、より好ましくは、本発明における腎癌の診断または検出のための組成物は、配列番号１～７で表されるポリペプチドの断片であり、それぞれ配列番号８～１６のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド断片と特異的に結合可能な抗体またはその断片、またはそれらの化学修飾誘導体のうちの１つまたは複数を含む組成物である。
　腎癌マーカーであるポリペプチドを認識する抗体は、抗体の抗原結合部位を介して、該ポリペプチドに特異的に結合し得るものである。本発明で使用しうる抗体は、配列番号１～７のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその断片、あるいはその融合ポリペプチドを１または複数の免疫原として使用して慣用の技術によって作製することができる。免疫原として用いられるこれらのポリペプチド、断片、変異体または融合ポリペプチドは、配列番号１～７で表される各ポリペプチドのアミノ酸配列において、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個の連続するアミノ酸残基からなるポリペプチド断片、または配列番号１～７で表される各ポリペプチド全長からなる。また、より好ましくは、それぞれ配列番号８～１６のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド断片である。
　これらのポリペプチド、あるいは、それらの断片、変異体または融合ポリペプチドは、抗体形成を引き出すエピトープを含むが、これらエピトープは、直鎖状のエピトープでもよいし、あるいは不連続なエピトープ（高次構造）でもよい。なお、該エピトープは、当該技術分野に知られるあらゆるエピトープ解析法、例えばファージディスプレイ法、リバースイムノジェネティックス法など、によって同定できる。
　本発明における抗体としては、抗血清、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト型抗体、ヒト抗体、などがあげられるが、これらに限定されない。
　本発明で使用しうる抗体は、いずれのタイプ、クラス、サブクラスも含むものとする。そのような抗体には、例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＹ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２などが含まれる。
　さらにまた、本発明に係るポリペプチドによってあらゆる態様の抗体が誘導される。該ポリペプチドの全部もしくは一部またはエピトープが単離されていれば、慣用技術を用いてポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれも作製可能である。方法には例えば、Ｋｅｎｎｅｔら（監修），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ： 　Ａ　Ｎｅｗ 　Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅ ｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９８０に挙げられた方法がある。
　ポリクローナル抗体は、鳥類(例えば、ニワトリなど)、哺乳動物(例えば、ウサギ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ネズミなど)などの動物に本発明に係るポリペプチドを免疫することによって作製することができる。目的の抗体は、免疫された動物の血液から、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの手法を適宜組み合わせて精製することができる。
　モノクローナル抗体は、各ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を、慣用技術によってマウスにおいて産生することを含む手法によって得ることができる。こうしたハイブリドーマ細胞株を産生するための１つの方法は、動物を本発明に係るポリペプチドで免疫し、免疫された動物から脾臓細胞を採取し、該脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させ、それによりハイブリドーマ細胞を生成し、そして該ポリペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することを含む。モノクローナル抗体は、慣用技術によって回収可能である。
　モノクローナルおよびポリクローナル抗体の作製について以下に詳しく説明する。
Ａ．モノクローナル抗体の作製
（１）免疫及び抗体産生細胞の採取
　上記のようにして得られた免疫原を、哺乳動物、例えばラット、マウス（例えば近交系マウスのＢａｌｂ／ｃ）、ウサギなどに投与する。免疫原の１回の投与量は、免疫動物の種類、投与経路などにより適宜決定されるものであるが、動物１匹当たり約５０～２００μｇとされる。免疫は主として皮下、腹腔内に免疫原を注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、初回免疫後、数日から数週間間隔で、好ましくは１～４週間間隔で、２～１０回、好ましくは３～４回追加免疫を行う。初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ）法などにより繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したときは、免疫原を静脈内または腹腔内に注射し、最終免疫とする。そして、最終免疫の日から２～５日後、好ましくは３日後に、抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞または局所リンパ節細胞が好ましい。
（２）細胞融合
　各タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株は、慣用的技術によって産生し、そして同定することが可能である。こうしたハイブリドーマ細胞株を産生するための１つの方法は、動物を本発明のポリペプチドで免疫し、免疫された動物から脾臓細胞を採取し、該脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させ、それによりハイブリドーマ細胞を生成し、そして該酵素に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することを含む。抗体産生細胞と融合させる骨髄腫細胞株としては、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。また株化細胞は、免疫動物と同種系の動物に由来するものが好ましい。骨髄腫細胞株の具体例としては、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損細胞株であるＰ３Ｘ６３－Ａｇ．８株（ＡＴＣＣ　ＴＩＢ９）などが挙げられる。
　次に、上記骨髄腫細胞株と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、抗体産生細胞と骨髄腫細胞株とを約１：１～２０：１の割合で混合し、細胞融合促進剤の存在下にて融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量１５００～４０００ダルトンのポリエチレングリコール等を約１０～８０％の濃度で使用することができる。また場合によっては、融合効率を高めるために、ジメチルスルホキシドなどの補助剤を併用してもよい。さらに、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞と骨髄腫細胞株とを融合させることもできる。
（３）ハイブリドーマの選別及びクローニング
　細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を、例えばウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ－１６４０培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に２００万個/ウェル程度まき、各ウェルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。培養温度は、２０～４０℃、好ましくは約３７℃である。ミエローマ細胞がＨＧＰＲＴ欠損株またはチミジンキナーゼ欠損株のものである場合には、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む選択培地（ＨＡＴ培地）を用いることにより、抗体産生能を有する細胞と骨髄腫細胞株のハイブリドーマのみを選択的に培養し、増殖させることができる。その結果、選択培地で培養開始後、約１４日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
　次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウェルに含まれる培養上清の一部を採取し、酵素免疫測定法（ＥＩＡ：Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ａｓｓａｙ、及びＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ：Ｒａｄｉｏ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ａｓｓａｙ）等によって行うことができる。融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、最終的にモノクローナル抗体産生細胞であるハイブリドーマを樹立する。ハイブリドーマは、ＲＰＭＩ－１６４０、ＤＭＥＭ等の基本培地中での培養において安定であり、本発明のポリペプチド性癌マーカーと特異的に反応するモノクローナル抗体を産生、分泌するものである。
（４）抗体の回収
　モノクローナル抗体は、慣用的技術によって回収可能である。すなわち樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法または腹水形成法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０％ ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ－１６４０培地、ＭＥＭ培地または無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば３７℃、５％ＣＯ２濃度）で２～１０日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約１０００万個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１～２週間後に腹水または血清を採取する。
　上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜に選択して、またはこれらを組み合わせることにより、精製された本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。
Ｂ．ポリクローナル抗体の作製
　ポリクローナル抗体を作製する場合は、前記と同様に動物を免疫し、最終の免疫日から６～６０日後に、酵素免疫測定法（ＥＩＡ及びＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）等で抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。その後は、抗血清中のポリクローナル抗体の反応性をＥＬＩＳＡ法などで測定する。
　また本発明においては、上記抗体の抗原結合断片も使用しうる。慣用的技術によって産生可能な抗原結合断片の例には、ＦａｂおよびＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖなどの断片が含まれるが、これらに限定されない。遺伝子工学技術によって産生可能な抗体断片および誘導体もまた含まれる。そのような抗体には、例えば合成抗体、組換え抗体、多重特異性抗体（二重特異性抗体を含む）、単鎖抗体などが含まれる。
　本発明の抗体は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ及びｉｎ　ｖｉｖｏのいずれにおいても、本発明において、ポリペプチドまたはその（ポリ）ペプチド断片の存在を検出するためのアッセイに使用可能である。アッセイにおける特異的検出を可能にするために、モノクローナル抗体の使用が好ましいが、ポリクローナル抗体であっても、精製ポリペプチドを結合したアフィニティーカラムに抗体を結合させることを含む、いわゆる吸収法によって、特異抗体を得ることができる。
　したがって、本発明の組成物は、配列番号１～７のポリペプチド、その変異体、またはその断片と特異的に結合可能な抗体またはその断片を少なくとも１つ含む、好ましくは複数種、より好ましくは全ての種類を含むことができる。さらに、より好ましくは、本発明の組成物は、配列番号１～７で表されるポリペプチドの断片であり、それぞれ配列番号８～１６のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド断片と特異的に結合可能な抗体またはその断片を少なくとも１つ含む、好ましくは複数種、より好ましくは全ての種類を含むことができる。
　本発明の組成物においては、上記の各ポリペプチドに特異的に結合可能な抗体またはその断片を、それぞれ個別に、あるいは適宜混合して混合物として、個別の容器（例えばバイアルなど）に入れて包装することができる。抗体またはその断片は、固相担体に結合されていてもよいしまたは遊離の形態でもよく、固相担体に結合される場合、例えばポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ポリメタクリル酸メチル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデン、ラテックス、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス、磁性体等の材質からなるマルチウエルプレート、ビーズ、試験管、スティック、試験片などの形状の固相担体上に抗体またはその断片を付着または結合させてもよい。遊離の形態の場合、凍結乾燥固体などの固体または溶液などの液体である。
　本発明で使用される抗体またはその断片には、必要に応じてラベル、例えば蛍光団、酵素、放射性同位元素などを結合させてもよいし、あるいは二次抗体にこのようなラベルを結合してもよい。
　蛍光団には、例えばフレオロレセインとその誘導体、ローダミンとその誘導体、ダンシルクロリドとその誘導体、ウンベリフェロンなどが含まれる。
　酵素には、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素、アミラーゼなどが含まれる。
　放射性同位元素には、例えばヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、リン（３２Ｐ）、イオウ（３５Ｓ）、金属類（例えば６８Ｇａ、６７Ｇａ、６８Ｇｅ、５４Ｍｎ、９９Ｍｏ、９９Ｔｃ、１３３Ｘｅなど）、トリチウムなどが含まれる。
　その他のラベルには、例えばＮＡＤＨ－、ＦＭＮＨ２－、アクリジニウムエステル、ルミノールなどの発光物質、ルシフェラーゼ、ルシフェリンなどの生物発光物質などが含まれる。
　また、必要に応じて、アビジン－ビオチン系またはストレプトアビジン－ビオチン系を利用することも可能であり、この場合、本発明の抗体またはその断片に例えばビオチンを結合することもできる。
　本発明の組成物はさらに、キットの形態をとってもよい。腎癌マーカーを検出するための上記の抗体類を個別に、または適宜混合して、個別の容器（例えばバイアルなど）に入れて包装することができる。さらに、それらの抗体は、上記のように、固相担体に結合されていてもよいしまたは遊離の形態でもよい。本発明のキットは、標識二次抗体、担体、洗浄バッファー、試料希釈液、酵素基質、反応停止液、精製された標準物質としてのマーカーポリペプチド、使用説明書、等を含むことができる。
＜腎癌の検出＞
　本発明によれば、上記腎癌マーカーと結合可能な物質を用いて、被験者由来の生体試料中の配列番号１～７で表されるポリペプチドまたはその断片、好ましくはそのうちの１つまたは複数について、その量または存在を調べることを含む方法によって、腎癌を検出することができる。本発明の方法によって、被験者の生体試料中に配列番号１で表されるポリペプチド、その変異体またはその断片が検出されるか、又は対照と比べてそれらのポリペプチド、その変異体またはその断片の発現量が有意に高いと判定されるとき、あるいは配列番号２～７で表されるポリペプチド、その変異体またはその断片が検出されないか、又は対照と比べてそれらのポリペプチド、その変異体またはその断片の発現量が有意に低いと判定されるときには、被験者は腎癌に罹患していると診断しうる。
　また、より好ましくは、配列番号１～７で表されるポリペプチドの断片であり、それぞれ配列番号８～１６のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド断片、のいずれか１つまたは複数について、その量または存在を調べることを含む方法によって、腎癌を検出することができる。本発明の方法によって、被験者の生体試料中に配列番号８で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド断片が検出されるか、又は対照と比べてそのポリペプチド、その変異体またはその断片の発現量が有意に高いと判定されるとき、あるいは配列番号９～１６で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド断片が検出されないか、又は対照と比べてそれらのポリペプチド、その変異体またはその断片の発現量が有意に低いと判定されるときには、被験者は腎癌に罹患していると診断または決定しうる。
　本発明の方法では、上記腎癌マーカーの検出は、単一のマーカーでもよいが、好ましくは複数、例えば２以上、３以上、４以上または５以上から１４、１５または１６以下のマーカーについて行うのがよい。これは、予期せぬ非特異的複合体の検出、言い換えれば誤診、を回避するためである。また、本発明における腎癌マーカーを、当業者に知られている他の癌の診断マーカーと組合せて利用してもよい。
　本発明の組成物は、腎癌の診断、判定又は検出、すなわち罹患の有無や罹患の程度の診断、のために有用である。腎癌の診断においては、正常組織（または細胞）、非癌組織（または細胞）、正常体液などの対照との比較を行い、被験者の生体試料中の上記腎癌マーカーの存在または量を検出し、その存在または量の差が有意であれば、被験者について腎癌の罹患が疑われる。
　本発明方法で用いられる検体試料としては、例えば腎組織、その周辺組織、腎細胞、あるいは体液、例えば血液、血清、血漿、腎液、尿などである。被験者の生体組織は、バイオプシーなどで採取するか、もしくは手術によって得ることができる。
　本発明において、被験者とは、ヒトを含む哺乳動物、好ましくはヒトである。
　上記腎癌マーカーと結合可能な物質は、例えば上記抗体またはその断片、アプタマー、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ社商標）、それぞれの腎癌マーカーの受容体、それぞれの腎癌マーカーの特異的作用阻害物質、それぞれの腎癌マーカーの特的作用活性化物質などを含み、好ましくは抗体もしくはその断片、またはそれらの化学修飾誘導体である。
　本発明の実施形態において、測定は、慣用の酵素又は蛍光団で必要により標識した抗体又は断片と、組織切片又はホモゲナイズした組織または体液とを接触させる工程、抗原－抗体複合体を定性的に又は定量的に測定する工程を含むことができる。検出は、例えば免疫電顕により標的ポリペプチドの存在とレベルを測定する方法、酵素抗体法(例えばＥＬＩＳＡ)、蛍光抗体法、放射性免疫測定法、均一法、不均一法、固相法、サンドイッチ法などの慣用法によって標的ポリペプチドの存在またはレベルを測定する方法などによって行うことができる。さらにまた、本発明においては、本発明の抗体と、試料中の標的ポリペプチドとの反応を容易に検出するために、本発明の抗体を標識することにより該反応を直接検出するか、または標識二次抗体を用いることにより間接的に検出する。本発明の検出方法については、感度の点で、後者の間接的検出を利用することが好ましい。
　上記の腎癌マーカーの種類に応じて、被験者から得られた体液または腎癌組織もしくは細胞、好ましくは血液、において、標的ポリペプチドが存在あるいは消失している場合、あるいは対照と比較して標的ポリペプチドのレベルが有意に増大または減少している場合、腎癌であると決定する。ここで、「有意に」とは、統計学的に有意差があることを意味し、この場合、危険率は０．０５未満である。
　免疫学的方法に代わる測定方法として、質量分析法を用いる方法が含まれる。この方法は、具体的には実施例に記載される手法で行うことができる。すなわち、生物試料、例えば血清または血漿をフィルターでろ過して夾雑物を除き、緩衝液（例えばｐＨ約８）で希釈して約１０ｍｇ／ｍｌ～約１５ｍｇ／ｍｌの濃度に調整したのち、分子量５万以上のタンパク質を除去可能な中空糸フィルター（下記参考例（１））または遠心型平膜フィルターを通して分子量分画し、画分をプロテアーゼ（例えばトリプシン）で処理してペプチド化し、これを質量分析計（マトリックス支援レーザー脱離イオン化法、またはエレクトロスプレーイオン化法を利用したタイプ）に掛けて、目的のポリペプチド由来の特定ピークの質量／荷電数と強度に基づいて、腎癌摘出手術前の患者と健常人の間における試料中のポリペプチドの存在量の差異を測定することができる。
　本発明を以下の実施例によってさらに具体的に説明する。しかし、本発明の範囲は、これらの実施例によって制限されないものとする。
＜参考例＞
（１）中空糸フィルターの作製
　分画分子量約５万の孔径を膜表面に有するポリスルホン中空糸を１００本束ね、中空糸中空部を閉塞しないようにエポキシ系ポッティング剤で両末端をガラス管に固定し、ミニモジュールを作成した。該ミニモジュール（モジュールＡ）は血清または血漿中の高分子量タンパク質の除去に用いられ、その直径は約７ｍｍ、長さは約１７ｃｍである。同様に低分子量タンパク質の濃縮に用いられるミニモジュール（モジュールＢ）を分画分子量約３千の孔径の膜を用いて作成した。ミニモジュールは片端に中空糸内腔に連結する入口があり、反対側の端は出口となる。中空糸入口と出口はシリコンチューブによる閉鎖循環系流路であり、この流路内を液体がペリスタポンプに駆動されて循環する。また、中空糸外套のガラス管には、中空糸から漏出してきた液体を排出するポートを備え、１つモジュールセットが構成される。流路途中にＴ字のコネクターによって、モジュールを連結し、モジュールＡ３本と、モジュールＢ１本をタンデムに連結してひとつの中空糸フィルターとした。この中空糸フィルターを蒸留水にて洗浄し、ＰＢＳ（０．１５ｍＭ ＮａＣｌを含むリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）水溶液を充填した。分画原料の血清または血漿は該中空糸フィルターの流路入口から注入され、分画および濃縮後に流路出口から排出される。該中空糸フィルターに注入された血清または血漿は、モジュールＡ毎に分子量約5万で分子篩いがかかり、分子量５万よりも低分子の成分はモジュールＢで濃縮され、調製されるようになっている。
＜実施例１＞
（１）健常人および腎癌患者血漿のタンパク質同定
　５０～７０歳代の腎癌患者７名から、摘出手術前および摘出手術一ヶ月後のＥＤＴＡ血漿、および同年代の健常人８名からＥＤＴＡ血漿を得て、それぞれの血漿について測定を行った。血漿をポアサイズ０．２２μｍのフィルターでろ過して夾雑物質を取り除き、タンパク質濃度５０ｍｇ／ｍＬとなるように調整した。この血漿をさらに２５ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液（ｐＨ８．０）１２．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、参考例（１）に示した中空糸フィルターによって分子量による分画を行った。分画後の血漿サンプル（全量１．８ｍＬ、最大２５０μｇのタンパク質を含む）をＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ(登録商標)ＰＦ２Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ社）逆相クロマトグラフィーで７分画に分離し、それぞれのフラクションを凍結乾燥した後、１００μＬの２５ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液（ｐＨ８．０）に再溶解した。このサンプルについて、総タンパク質の５０分の１量のトリプシンで３７℃、２～３時間の条件で消化し、ペプチド化を行った。各分画のペプチドをさらにイオン交換カラム（ＫＹＡテクノロジーズ、日本）によって４分画化した。その各々の分画を、逆相カラム（ＫＹＡテクノロジーズ、日本）でさらに分画し、溶出されてきたペプチドについて、オンラインで連結された質量分析計Ｑ－ＴＯＦ　Ｕｌｔｉｍａ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ社）を用いて、サーベイスキャンモードで測定した。
　当該分野においては通常、測定を行う際に標準物質を用いることによって質量／電荷比の補正を行うが、さらに本発明における解析では、さらにそれに加えて、通常血液タンパク質として必ず検出されるアルブミン、α－フィブリノーゲンなどのいくつかのタンパク質を内部標準とし、それらのタンパク質の理論質量の値を用いて、測定データの再補正を行うことで、データのさらなる精密化を図った。そのようにして精密化を行ったデータについて、タンパク質解析ソフトＭＡＳＣＯＴ（Matrix Science社、英国）を用いて、データの解析を行った。血液タンパク質を同定する基準として、(i)そのタンパク質に属するペプチドのうち、少なくとも一本以上がＭｏｗｓｅスコア３４以上の高い信頼性をもって検出されていること、(ii)ペプチドのＭＳデータの測定値およびＭＳ／ＭＳデータの測定値と、ペプチドの理論値との誤差が０．０３ダルトン以下であること、という二つの基準を用い、誤ったタンパク質同定を極力排除できる条件での解析を行った。
（２）腎癌患者の癌摘出手術前血漿において健常人の血漿と比べ検出人数が増加または減少したタンパク質
　このデータを健常人と癌患者間で比較し、同定されたタンパク質のうち、３人以上の腎癌患者の癌摘出手術前血漿で検出され、健常人血漿では全く検出されていないタンパク質を健常人と比べ腎癌摘出手術前の患者の血漿中でその発現が有意に増強するタンパク質として見いだした。これらのタンパク質は、下記表３に示した配列番号１で表されるポリペプチドである。また、同定されたタンパク質のうち、健常人血漿における検出人数が、手術前の腎癌患者血漿における検出人数よりも３人以上多いタンパク質を健常人と比べ腎癌摘出手術前の患者の血漿中でその発現が有意に減少するタンパク質として見いだした。これらのタンパク質は、下記表３に示した配列番号２～７で表されるポリペプチドである。従って、これらの配列番号１～７で表されるポリペプチドは腎癌マーカーとして腎癌の検出において有用であることが判明した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（３）腎癌患者の癌摘出手術前血漿において健常人の血漿と比べＭＳピーク強度が増加または減少したタンパク質
　さらに、上記（２）において同定されたタンパク質に属するペプチドについて、その検出時におけるＭＳピーク強度を解析した。このＭＳピーク強度は、厳密には定量的なものではないが、タンパク質の存在量をある程度反映した数値であり、ＭＳピーク強度を用いた定量的な比較解析が可能であることは、当業者において周知である。それぞれのペプチドの検出時におけるＭＳピーク強度を健常人と癌患者間で比較し、検出されたペプチドのうち、腎癌患者の癌摘出手術前血漿におけるピーク強度が、健常人のそれと比較して有意に大きく、かつ、腎癌患者の癌摘出手術前血漿におけるピーク強度が、癌摘出手術後一ヵ月後の血漿におけるピーク強度と比較して大きいペプチドを、腎癌摘出手術前の患者の血漿中でその存在量が有意に増加するペプチドとして見いだした。これらのペプチドは配列番号８で表されるポリペプチドであり、配列番号１で表されるポリペプチドの断片である。また同様に、検出されたペプチドのうち、腎癌患者の癌摘出手術前血漿におけるピーク強度が、健常人のそれと比較して有意に小さく、かつ、腎癌患者の癌摘出手術前血漿におけるピーク強度が、癌摘出手術後一ヵ月後の血漿におけるピーク強度と比較して小さいペプチドを、健常人と比べ腎癌摘出手術前の患者の血漿中でその存在量が有意に減少するペプチドとして見いだした。これらのペプチドは配列番号９～１６で表されるポリペプチドであり、これらのペプチドは配列番号２、５～７で表されるポリペプチドのうちの、いずれか一つの断片である。従って、これらの配列番号８～１６で表されるポリペプチド、およびそれらを内部に持つ断片は腎癌マーカーとして腎癌の検出において有用であることが判明した。これらの配列番号８～１６で表されるポリペプチド断片を、それぞれ遺伝子名、配列番号１、２、５～７で表される配列のどの部位の断片であるか、ペプチド長、アミノ酸配列（一文字表記）と共に表４に示す。また、配列番号８～１６で表されるポリペプチド断片の健常人、腎癌患者（術前）、腎癌患者（術後）におけるＭＳピーク強度を図１～３に示す。各配列の腎癌患者および健常人のＭＳピーク強度上の数字は各個人の番号を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
＜実施例２＞
（１）ヒトARHGAP25の調製
　本発明における腎癌マーカーの一つは、配列番号１で表されるヒトARHGAP25ポリペプチドである。また、実施例１（３）および図１に示すとおり、そのヒトARHGAP25ポリペプチドのなかでも、腎癌患者においてさらに特徴的に検出される部位は、配列番号８で表されるヒトARHGAP25ポリペプチドの第１アミノ酸から第１５アミノ酸までの配列（以下、ARHGAP25ペプチド）である。このARHGAP25ペプチドを、タカラバイオ社(日本)への受託により化学合成し得た。また、このARHGAP25ペプチドに対するウサギポリクローナル抗体の作製を同社に同様に受託依頼し取得した。さらに、ARHGAP25ペプチドの検出用マウスモノクローナル抗体を取得するための免疫原として、配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む第１アミノ酸から第９７アミノ酸までの領域からなる、配列番号１７で表されるポリペプチド（以下、ARHGAP25（1-97））を、大腸菌から組換え型タンパク質として調製した。以下にARHGAP25（1-97）の調製手順を記載する。
　まず、HEK293細胞より、ヒトARHGAP25 mRNAの調製を行った。mRNAの調製は、Qiashredder及びRNeasy mini kit（Qiagen社製）を使用し、詳細は付属のプロトコールに従った。次に、逆転写酵素SuperscriptII（invitrogen社製）を用いて、得られたトータルmRNAを鋳型にcDNAを合成し、ヒトcDNAライブラリーを作製した。逆転写反応は、前記酵素に付属のプロトコールに従った。続いて、得られたヒトcDNAライブラリーを鋳型に、配列番号１８及び１９に示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてPCRを行った。配列番号１８で示した塩基配列は、ARHGAP25遺伝子の一部とその上流側にBamHI認識配列を含む。配列番号１９で示した塩基配列は、ARHGAP25遺伝子の一部とその下流側にEcoRI認識配列を含む。これらのプライマーを利用してPCR法による遺伝子増幅をおこなった場合、ARHGAP25（1-97）をコードするDNA配列が増幅DNA断片として得られる。PCR反応は、DNAポリメラーゼにKOD（東洋紡社製、日本）を用いて、cDNAライブラリー10ngと各プライマー10pmolを含むようにKODに添付のプロトコールに従い調製した。反応条件は、94℃の温度で１分間加熱した後、94℃で３０秒間、55℃で３０秒間、72℃で１分間保つサイクルを３０回繰り返した後、最後に72℃で４分間保温する条件で行った。増幅したDNA断片は、Quantum　prep　PCR　Kleen　Spin　Columns（Bio-rad社製）を用いて精製した。この反応により全長約300bpのPCR産物を得た。
　得られたDNA断片をBamHIおよびEcoRIにより切断し、同時にBAP酵素を用いて末端部の脱リン酸化処理をおこない、さらにアガロースゲル抽出法により精製した。そのDNA断片を、あらかじめBamHIおよびEcoRIにより切断処理したヒスチジンタグ融合型発現ベクターpET30b（Novagen社製）と混合し、ライゲーション反応を行った。DNAリガーゼにはLigation　High（東洋紡社製、日本）を使用し、反応は付属のプロトコールに従った。続いて、ライゲーション反応後の溶液を用いて、コンピテント細胞の形質転換を行った。コンピテント細胞は、大腸菌株DH5α（タカラバイオ社製、日本）を用い、詳細は付属のプロトコールに従って行った。形質転換処理後の菌は、抗生物質アンピシリンを100μg／mLを含有するLBプレート上に塗布し、37℃で一晩培養した。得られた形質転換体を100μg／mLアンピシリンを含有するLB液体培地で37℃にて一晩培養し、ミニプレップによって目的とするpET30b_ARHGAP25（1-97）を得た。
　組換え型ARHGAP25（1-97）を調製するために、pET30b_ARHGAP25（1-97）を用いて、大腸菌株Rosetta-Gami 2（Novagen社製）への形質転換を行った。得られた形質転換体を、アンピシリン及びクロラムフェニコールを含むLB培地3Lを用いて、37℃にて３時間培養し、終濃度１mMのIPTGを添加して30℃にて18時間培養を行い、目的のヒスチジンタグ融合型組換えARHGAP25（1-97）の発現を誘導させた後、遠心分離により菌体を回収した。
　得られた菌体をPBSにて洗浄した後、B-PER（PIERCE社製）を用いて不溶性画分を沈殿として調製した。詳細は付属のプロトコールに従った。次に不溶性画分を8M Ureaを含むPBSにて可溶化した後、Ni-NTA agarose resin（QIAGEN社製）を用いてヒスチジンタグ融合型ARHGAP25を吸着させた。タンパク質の吸着したレジンを、10mMイミダゾールを含むPBSにて洗浄した後、１Mイミダゾール溶液を用いて溶出した。次に得られた溶出画分から、タンパク質のリフォールディングを行った。まず、6M塩酸グアニジンを含むPBS-T溶液に一晩透析した後、0.4Mのアルギニン、1mMのDTTを含むPBS-T溶液に一晩透析し、得られたリフォールディング溶液についてアクリルアミドゲル電気泳動を行い、クマシーブリリアントブルー染色によりARHGAP25（1-97）の精製を確認した。
（２）ヒトARHGAP25ペプチドに対するマウスモノクローナル抗体の作製
　上記（１）で得られた100μLの2mg／mLヒトARHGAP25（1-97）溶液を100μLのMPL＋TDM Emulsion（Corixa社製）と混合し、全量を７週齢のBALB/cマウスに腹腔投与した。２週間後、及び４週間後に同様に調製したARHGAP25（1-97）溶液を同量投与した。5週間後にマウス尾部静脈より血液を100μL採取し、一晩清置した後、5000×gで５分遠心して上清を部分血清として回収した。その血清を用いて、ARHGAP25ペプチドに対する抗体価を評価した。
　ARHGAP25ペプチドに対する抗体の産生が確認されたマウスについて、6週間後に上記と同様に調製したARHGAP25（1-97）溶液を腹腔投与し、３日後に脾臓の摘出を行った。摘出した脾臓にシリンジで穴を開け、RPMI1640培地（GIBCO社製）を注入して脾臓細胞を押し出し、脾臓細胞液を得た。得られた脾臓細胞液を1200rpmで７分間遠心した後に上清を除去し、RPMI1640培地にて洗浄した。再びRPMI1640培地に懸濁して細胞数をカウントし、脾臓細胞数の1/10量のSP2/0ミエローマ細胞液を調製した。両細胞液を混合し、2200rpmで１０分遠心し、上清を廃棄した。細胞をタッピングしてほぐし、PEG（ROCHE社製）とHBSS（GIBCO社製）を５：１で混合した溶液を1mL添加して攪拌した。以降の作業では、特に断りがない限り、溶液や培地は全て37℃で保温したものを用いた。
　PEGとHBSSを加えた細胞溶液に、RPMI1640培地9mLを５分かけて添加し、ゆっくり混合した後、2200rpmで１０分遠心し、上清を除去した。得られた沈殿細胞を、15％FCSとHAT（ROCHE社製）を添加したRPMI1640培地に懸濁し、９６ウェル細胞培養プレート（グライナー社製）に１ウェルあたり200μL注ぎ、37℃、5％CO2下で１週間培養した。
　HAT添加条件下で生育したコロニーを脾臓細胞とミエローマ細胞が融合したハイブリドーマと判断し、さらにその中からARHGAP25ペプチドに対する抗体を産生しているハイブリドーマの選別を行った。まず、９６ウェルペプチド吸着プレート（ヌンク社製）のウェルに1μg/mLのARHGAP25ペプチドを50μL入れ、一晩固相化した。ウェル中のタンパク溶液を廃棄後、４倍に希釈したBlockAce溶液（大日本住友製薬社製、日本）を200μL注ぎ、１時間室温で静置した。その後、PBS－Tで洗浄し、ARHGAP25ペプチド固相化プレートとした。、コロニーの生育しているウェルの上清を５倍希釈して、前記ARHGAP25ペプチド固相化プレートのウェルに100μL添加し、室温で１時間静置した。その後、ウェル中の溶液を廃棄し、PBS-Tで洗浄した後、HRP標識抗マウスIgG溶液（Dako社製）を100μL入れ、さらに室温で１時間静置した。ウェル中の溶液を廃棄し、PBS‐Tにて洗浄後、TMB溶液100μLを入れて１５分反応させた。反応によって生じる発色を450nmの吸光度で確認し、発色したウェルを陽性とした。陽性ウェルのコロニーを15％FCSとHT（invitrogen社製）を含むRPMI培地に懸濁し、限界希釈法によって陽性クローンのクローニングを行った。クローニングの結果得られたハイブリドーマ２０種類について、SFM培地に馴化し、抗体の産生を行った。100％SFM培地60mLにハイブリドーマを１×105細胞／mLになるように接種し、細胞が死滅するまで１０日間培養を行った後、培養液を3000rpm、１５分間遠心分離し、細胞を除去した。得られた培養上清について、MabTrapKit（GEヘルスケアバイオサイエンス社製、日本）を用いて含まれている抗体を精製した。また、20種の各抗体について、ビオチン化試薬Sulfo-NHS-Biotin（PIERCE社製）による抗体のビオチン化を行った。ビオチン化は試薬に付属のプロトコールに従って行った。
（3）取得した抗体を用いたサンドイッチELISA法による腎癌患者血漿中ヒトARHGAP25ペプチドの検出
　上記（2）にて取得した、精製抗体およびビオチン標識した精製抗体を用いてサンドイッチELISA法による検出系構築に向けた検討を行った。ビオチン化をしていない精製抗体を捕捉用抗体、ビオチン標識した精製抗体を検出用抗体として用い、最も高感度にヒトARHGAP25ペプチドを検出可能な捕捉用抗体、検出用抗体それぞれ一種ずつの組み合わせを選定した。その捕捉用抗体を２μg/mLのPBS溶液として調製した後、９６ウェルタンパク質吸着プレート（ヌンク社製）のウェルに50μLずつ入れ、一晩固相化し、翌日1％BSA, 10%スクロース含有PBS-T溶液により室温で２時間ブロッキングを行った。次に実施例１および図１で示される、ARHGAP25ペプチドが強く検出される腎癌摘出手術前の患者血漿４検体と、それぞれの患者の術後血漿４検体、計８検体の血漿を、１％BSA-PBSTを用いて２倍希釈し、それぞれを100μLずつ抗体固相化プレートの各ウェルに添加し、2時間室温で反応させた。反応後、ウェル内のサンプル溶液を廃棄してPBS‐Tにて洗浄し、1％BSA‐PBSTを用いて希釈した200ng/mLの検出用抗体50μLに１時間室温で反応させた。反応後のウェルを洗浄し、avidin‐HRP溶液（R＆D社製）100μLを３０分間室温で反応させた。avidin‐HRPの希釈はPBSを用いて行った。PBS‐Tにて洗浄後、TMB溶液（PIERCE社製）100μLを入れて１５分反応させた後、1N硫酸溶液100μLを添加して反応を停止させ、450nmの吸光度を測定した。その結果、図４に示すとおり、全ての腎癌患者において、摘出手術前血漿中のARHGAP25ペプチド濃度が摘出手術後のそれと比べて高い値を示した。また、腎癌患者４名中２名の血漿においては、摘出手術前のARHGAP25ペプチド濃度が手術後の濃度に比べて有意に高値であった。従って、実施例１で示されるARHGAP25ペプチドおよびそれを含むARHGAP25タンパク質は、腎癌の罹患の有無を判定するマーカーとして有用であることが判明した。
　本発明は、特異性および感受性に優れた、腎癌の診断または検出のための組成物を提供することができるため、特に医療分野において有用である。
　本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願2008-008411号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。また、本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (16)

  1. 　被験者由来の生体試料中の配列番号１～７で表されるポリペプチドまたはその断片のいずれか１つまたは複数を測定することを含む、腎癌をインビトロで検出する方法。
  2. 　前記断片が、配列番号１～７のいずれかで表されるポリペプチドのアミノ酸配列において、それぞれ配列番号８～１６のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド断片である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記ポリペプチドまたはその断片の量またはその存在を測定する、請求項１に記載の方法。
  4. 　前記ポリペプチドまたはその断片の量が、対照試料のものと比べて有意に増大しているか、あるいは有意に減少していることを指標にする、請求項３に記載の方法。
  5. 　前記ポリペプチドまたはその断片の測定が免疫学的方法によるものである、請求項１に記載の方法。
  6. 　前記測定が、前記ポリペプチドまたはその断片と結合可能な物質を用いて行われる、請求項１に記載の方法。
  7. 　前記結合可能な物質が抗体またはその断片である、請求項６に記載の方法。
  8. 　前記抗体が標識されている、請求項７に記載の方法。
  9. 　前記ポリペプチドまたはその断片と特異的に結合する抗体またはその断片を用いて、前記試料中の該ポリペプチドまたはその断片のうちの１つまたは複数の量または存在を免疫学的に測定し、該ポリペプチドまたはその断片の量が対照試料のものと比べて増大あるいは減少していることを指標にするか、あるいは該ポリペプチドまたはその断片が前記試料または対照試料のいずれか一方にのみ存在していることを指標にして腎癌を検出することを含む、請求項１に記載の方法。
  10. 　前記試料が血液、血漿、血清または尿、あるいは腎由来の組織または細胞である、請求項１に記載の方法。
  11. 　前記抗体が、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、請求項７に記載の方法。
  12. 　配列番号１～７で表されるポリペプチドまたはその断片の少なくとも１つと特異的に結合する、抗体もしくはその断片またはそれらの化学修飾誘導体のうちの１つまたは複数を含む、腎癌の診断または検出のための組成物。
  13. 　前記ポリペプチドの断片が、配列番号１～７のいずれかで表されるポリペプチドのアミノ酸配列において、それぞれ配列番号８～１６のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド断片である、請求項１２に記載の組成物。
  14. 　前記ポリペプチドの断片が、少なくとも７個のアミノ酸からなるエピトープを含む、請求項１２に記載の組成物。
  15. 　キットの形態である、請求項１２に記載の組成物。
  16. 　請求項１２に記載の組成物の、被験者における腎癌のインビトロ検出のための使用。
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