WO2009074076A1

WO2009074076A1 - Molécule complexe interférant avec l'expression de gènes cibles, et ses méthodes de préparation

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Publication number: WO2009074076A1
Application number: PCT/CN2008/073241
Authority: WO
Inventors: Zhen Xi; Zicai Liang; Liqiang Cao; Junbin Zhang; Jinyu Huang
Original assignee: Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd
Priority date: 2007-11-29
Filing date: 2008-11-28
Publication date: 2009-06-18
Also published as: US20100317714A1; JP2011504730A; CN101889087B; CN101889087A; EP2233573A4; EP2233573B1; EP2233573A1

Description

一种干扰靶基因表达的复合分子及其制备方法技术领域

本发明涉及一种干扰靶基因表达的复合分子及其制备方法。背景技术

干扰 RNA (RNAi, 或 siRNA) 是近年来发现的一种抑制基因表达的小 RNA。 siRNA的主要作用机制是通过其反义 RNA与靶基因的 mRNA发生同源互补而抑制靶基因的表达。由于 siRNA能够特异地抑制靶基因的表达，所以它在医药领域具有广阔的应用前景。但是外源 siRNA的化学稳定性差，血液容留时间短，细胞和组织通透性（penetration) 差，这几方面严重阻碍了外源 siRNA抑制靶基因表达的应用。

siRNA的化学稳定性差不是由于其在双链形式下被降解，而是由于在双链一单链的杂交一解旋平衡中（亦称双链核酸的"呼吸 "），其单链形式被 RNase降解而导致快速失衡，造成双链 siRNA快速解旋降解。根据以上原理，许多研究人员力图通过对 siRNA进行修饰而使其双链不易解旋，进而改善其稳定性并提高其血液容留时间。但是，已有的修饰对 siRNA稳定性的改善还十分有限。例如 WO 2004/015075公开了 "An interfering hairpin RNA having the structure X.sub.l-L-X.sub.2, wherein X.sub. l and X.sub.2 are nucleotide sequences having sufficient complementarity to one another to form a double-stranded stem hybrid and L is a loop region comprising a non-nucleotide linker molecule, wherein at least a portion of one of the nucleotide sequences located within the double- stranded stem is complementary to a sequence of said target RNA", 即两条 siRNA链各自的一端用非核酸分子连接形成发卡结构的 siRNA , 其中所述非核酸分子选自" polyethers, polyamines, polyesters, polyphosphodiesters, alkylenes, attachments, bioconjugates, chromophores, reporter groups, dye labeled RNAs, and non-naturally occurring nucleotide analogues or combinations thereof ,但是所述发卡结构的稳定性和血液容留时间仍不理想。而且该发卡结构不易引入功能性分子（例如细胞靶向识别分子、可增强细胞通透性的脂类分子或者荧光标记分子）。发明内容本发明的目的是为了克服现有的 siRNA 的化学稳定性差，血液容留时间短的缺陷，提供了一种干扰靶基因表达的复合分子即联核酸（zipped Interfering RNA, ziRNA ) 及其制备方法。

本发明提供了一种干扰靶基因表达的复合分子，该复合分子含有两条至少 80 %互补的 siRNA链和 X₂， Xj的 5'端与 X₂的 3 '端通过非核酸分子连接， X₂的 5'端与的 3 '端通过非核酸分子 L₂连接。

本发明还提供了干扰靶基因表达的复合分子的制备方法，其中，该方法包括制备两条至少 80 %互补的修饰 siRNA链，两条修饰 siRNA链的 5'端和 3 '端均具有可连接基团；将一条修饰 siRNA链的 5'端和 3 '端的可连接基团分别与另一条修饰 siRNA链的 3 '端和 5'端可连接基团连接。

本发明提供的复合分子的两条 siRNA链和 X₂的 5 '端和 3 '端都通过非核酸分子连接，因此 siRNA链不容易解旋降解，从而大大地改善了 siRNA 的化学稳定性和血液容留时间。所述复合分子施用后，在细胞内，利用细胞内存在的 Dicer酶释放复合分子中被锁定的 siRNA,双链 siRNA解链释放出反义单链 siRNA , 从而对靶基因的表达进行抑制。附图说明

图 1为本发明提供的复合分子的示意图；

图 2为表示实施例 1制得的 ziRNA药代动力学测定结果的示意图;

图 3为表示实施例 1制得的 ziRNA的稳定性的电泳图；

图 4为表示普通的 siRNA的稳定性的电泳图。具体实施方式

本发明提供的干扰靶基因表达的复合分子含有两条至少 80 %互补的 siRNA链和 X₂， X₁的 5，端与 X₂的 3 '端通过非核酸分子连接， X₂的 5' 端与 Χ^ 3 '端通过非核酸分子 L₂连接。需要说明的是，所述 5'端和 3 '端只是用于指代核酸链的方向，并不限定为 5'位和 3 '位，例如 3 '端的连接可以通过 3 '位的羟基，也可以通过 2'或 Γ位的羟基。

siRNA 链 Xi和 X₂可以为常规的各种具有干扰靶基因表达的功能的 siRNA链，只要 siRNA链 Χ^Ρ X₂至少 80 %互补即可，优选 siRNA链或 X₂至少有 90 %的碱基与所述靶基因互补，更优选 siRNA链或 X₂的全部碱基与所述靶基因互补。 siRNA链 ₁或 ₂可以 19-50个碱基，优选 19-40 个碱基，更优选 19-30个碱基。

非核酸连接分子分别与的 5'端的磷酸基或羟基和 X₂的 3'端的磷酸基或羟基共价连接，非核酸连接分子 L₂分别与 X₂的 5'端的磷酸基或羟基和的 3'端的磷酸基或羟基共价连接。所述非核酸连接分子和非核酸连接分子 1^₂可以为各种连接基团，优选情况下，所述非核酸连接分子和非核酸连接分子 L₂各自独立地为具有羧基、氨基或巯基的寡肽、聚酯、聚醚、垸烃、烯烃、炔烃和人工合成核酸类似物中的一种。所述非核酸连接分子或非核酸连接分子 L₂的原子总数可以为 10-100个。

更优选的情况下，所述非核酸连接分子和非核酸连接分子 L₂各自独立地如式 I、式 II或式 III所示：

R「

式 I

式 II

式 III

所述基团 Ri、 R₂、 R₃、、 R₁₍₎和 R₁₂各自独立地为羧基、氨基或巯基;

R₇和 R₈各自独立地为一 (CH₂)_n—；

R₆、 R₉和 R_u各自独立地为以下基团中的

其中，上述各基团中的 n可以各自独立地为 0-10 的整数，优选为 1-8 的整数； m可以为 1-5的整数。

所述非核酸连接分子和 /或 L₂还可以连接有细胞靶向识别分子、可增强细胞通透性的脂类分子和荧光标记分子中的一种或几种；非核酸连接分子和非核酸连接分子 L₂中的至少一个如式 I所示，并且为

m为 2-5的整数，所述细胞靶向识别分子、可增强细胞通透性的脂分子和荧光标记分子中的一种或几种与 R₅的叠氮基 N₃-连接。

优选情况下，所述细胞靶向识别分子、可增强细胞通透性的脂类分子者荧光标记分子的化学结构式为

，其中 R为细胞靶向识别基团、可增强细胞通透性的脂类基团和荧光标记基团中的一种或几种，所述炔基与和/或1^连接。

所述炔基与和 /或 L₂的 R₅的叠氮基

所述细胞靶向识别基团、可增强细胞通透性的脂类基团和荧光标记基团可以为常规的具有相应功能的基团。

本发明提供的复合分子的实例包括但不限于如下式 (1)、式 (11)、式 (III) 和式 (IV)所示的复合分子：

式 I、式 II、式 III和式 IV中， n可以为 0-10的整数。需要说明的是，式 I、式 II、式 III和式 IV中，由 N组成的链示意性地表示根据靶基因而设定的 siRNA或者所述 siRNA的互补链，并不能认为 N的个数表示 siRNA的长度。本发明提供的干扰靶基因表达的复合分子的制备方法包括制备两条至少 80%互补的修饰 siRNA链，两条修饰 siRNA链的 5'端和 3'端均具有可连接基团；将一条修饰 siRNA链的 5'端和 3'端的可连接基团分别与另一条修饰 siRNA链的 3'端和 5'端可连接基团连接。

按照第一种优选的实施方式，所述复合分子的制备方法包括：分别固定 a3和 a3，，在 a3上从 3'向 5'合成 X 在 a3'上从 3'向 5'合成 X₂，得到 a3-Xi 和 a3'-X₂; 将 al和 al'分别引入 a3-Xi和 a3-X₂的 5'端，形成 al-X -aS和 al，-X₂-a3，; 将 a2和 a2，分别引入 al-X a3和 al，-X₂-a3，，形成 a2-al-X a3 和 a2，-ar-X₂-a3，；然后使 a2-al-X_ra3 和 a2，-ar-X₂-a3，进行退火并使 a2-al-X a3的 a2与 a2，-al，-X₂-a3，的 a3，发生链接反应以及 a2-al-X₁-a3的 a3 与 a2'-ar-X₂-a3'的 a2'发生链接反应，生成所述复合分子，其中，

al和 al'各自独立地为：

a2和 a2'各自独立地为:

a2-al和 a2，-al，各自独立地为:

a3和 a3，各自独立地为以下基团中的一种:

其中，上述各基团中的 n各自独立地为 0-10的整数， m为 1-5的整数。为了表述方便，所述 al、 al '、 a2、 a2'、 a3和 a3'没有明确地区分分子状态和基团状态，例如 a3 或 a3' 的基团状态可以为

(CH ) ―，则其对应的反应前的分子状态可以为常用的含有所述基团的反应分子，例如为所述基团上连接了卤素的分子，例如为

可以采用常规的合成核酸的方法将 a3和 a3' 固定，然后在 a3上从 3'向 5'合成在 a3'上从 3'向 5'合成 X₂，得到 a3-Xi和 a3'-X₂。例如，可以参考《生物化学》（第三版上册，王镜岩等主编，高等教育出版社）第 520-521 页介绍的固相合成法。在合成过程中，延伸至所需长度之后，可以脱去碱基等位点上的保护基团。脱除保护基团的方法可以包括：剩余氨水旋干。以及

(2) 旋干的 R A样品中加入 lml 1M TBAF (氟化四丁基胺）的四氢呋喃溶液，密封后 60°C摇床 24h。加入 lmmol的三甲基异丙氧基硅垸猝灭反应后，再向剩余液中加入等体积 DEPC (焦碳酸二乙酯）处理 ddH20，十分之一混合体积的 3MNaO Ac buffer (pH = 7.0)， 5倍体积无水乙醇沉淀。

al和 al'通过磷酯键分别引入到 a3-Xi a3-X₂的 5，端，形成 al-X a3 和 al'-X₂-a3O

可以按照如下反应式（1) 所述的方法，将 a2和 a2'分别引入 al-X_ra3 和 al，-X₂-a3，，形成 a2-al-Xi-a3禾卩 a2，-al，-X₂-a3，：

反应式（1)

可以采用常规的退火方法和条件使 a2-al-X_ra3和 a2'-al'-X₂-a3'进行退火。

所述链接反应是指叠氮基与炔基发生的聚合反应，叠氮基与炔基之间的聚合反应的实例如反应式（2 ) 所示：

反应式（2 )

需要说明的是，反应式（2 ) 中只是示意性地表示了的一端与和 X：的一端的连接情况，另一端的连接情况与此类似。

a2和 /或 a2'优选为

， m优选为 2-5的整数。

根据该优选实施方式，在 a2-al-X_ra3的 a2与 a2'-al '-X₂-a3，的 a3'发生链接反应以及 a2-al-X_ra3的 a3与 a2'-al '-X₂-a3，的 a2'发生链接反应后， a2 和 /或 a2'上还剩余有叠氮基，剩余的叠氮基可以连接上功能分子。所述功能性分子具有能与 N₃ -反应而使功能性分子与非核酸连接分子连接的基团，优选情况下，所述细胞靶向识别分子、可增强细胞通透性的脂类分子或者荧光

标记分子的化学结构式为

，其中 R为细胞靶向识别基团、可增强细胞通透性的脂类基团和荧光标记基团中的一种或几种。所述细胞靶向识别基团、可增强细胞通透性的脂类基团和荧光标记基团可以为常规的具有相应功能的基团。上述功能分子的炔基能够与 a2和 /或 a2'上的剩余叠氮基发生聚合反应，从而将细胞靶向识别基团、可增强细胞通透性的脂类基团和荧光标记基团中的一种或几种引入到复合分子中。

按照第二种优选的实施方式，所述复合分子的制备方法包括：分别固定 _a4和 _a4'，在 a4上从 3'向 5'合成 X 在 a4'上从 3'向 5'合成 X₂，得到 a4-Xi 和 a4'-X₂; 将 a5和 a5'分别引入 a4-X和 a4，-X₂的 5，端，形成 a5-X a4和 a5'-X₂-a4' _; 将 a6先与其中一条发生链接反应；两条链退火之后，再与另一条链进行链接反应，生成所述复合分子。

其中， a4、 a4，、 a5和 a5，各自独立地为以下基团中的一种：

\ 0， 0. 0 - n

O OH

/

其中，上述各基团中的 n各自独立地为 0-10的整数；

a6为：

N₃-(CH₂)_P-N₃

其中， p为 2-12的整数。

在第二种优选实施方式中，在固定 a4和 a4'，在 a4上从 3 '向 5'合成在 a4'上从 3 '向 5'合成 X₂，得到 a4-X^P a4'-X₂的过程中，可以使用与第一种优选实施方式中相同的方法。

a6的两个叠氮基可以分别与可连接基团反应（如反应式（2 )类似），该反应还称作 Click反应， Click反应的条件可以为本领域常规的 Click反应条件。

a6可以通过将二卤代烃（碳原子数为 2个或以上，且两个卤原子分别位于烃链两端的碳原子上）与叠氮化钠反应而制得。下面以 1,2-二叠氮乙垸、 1,3-二叠氮丙垸和 1,4-二叠氮丁垸的合成为例，具体说明双叠氮化合物的合成：

( 1 ) 1,2-diazidoethane的合成

在 50ml烧瓶中，加入 1.87g ( lmmol) 化合物 8，和 2.6g (4mmol) 叠氮化钠， 20mlDMF。加热至 60C°，反应 24h， TLC反应完全。停止反应后，加入 15ml水，以二氯甲垸（20mlx3 ) 萃取 3次；合并有机相，以饱和食盐水洗涤。旋除溶剂，快速柱层析得到 1.02g黄色油状物，即化合物 9。产率 92%。 NMR(400M, CDC1₃) δ ppm 3.41(4H, s, CH₂x2)。

(2) 1,3-diazidopropane的合成

DMF 在 50ml烧瓶中，加入 2.00g ( lmmol) 化合物 10，和 2.6g (4mmol) 叠氮化钠， 20mlDMF。加热至 60C°，反应 24h， TLC反应完全。停止反应后，加入 15ml水，以二氯甲垸（20mlx3 ) 萃取 3次；合并有机相，以饱和食盐水洗涤。旋除溶剂，快速柱层析得到 1.08g黄色油状物，即化合物 11。产率 86% ¾ NMR(400M, CDC1₃) δ ppm 3·44-3·40(4Η, t, CH₂-N₃x2), 1.87- 1.80(2H, quintet, CH₂).

( 3) 1,4-diazidobutane的合成

在 50ml烧瓶中，加入 2.13g ( lmmol) 化合物 12，和 2.6g (4mmol) 叠氮化钠， 20mlDMF。加热至 60C°，反应 24h， TLC反应完全。停止反应后，加入 15ml水，以二氯甲垸（20mlx3 ) 萃取 3次；合并有机相，以饱和食盐水洗涤。旋除溶剂，快速柱层析得到 1.13g黄色油状物，即化合物 13。产率 81%。 ¾ NMR(400M, CDC1₃) δ ppm 3.34(4H, s, CH₂-N₃x2), 1.69(4H, s, CH₂x2).

下面通过实施例更详细地描述本发明。

实施例中所用的部分原料的来源如下：

2-脱氧 -D-核糖由上海海曲化工有限公司购得。

丙炔醇由 Fluka公司购得。

DMTr-Cl 以及天然核苷亚磷酰胺保护单体由上海吉玛制药技术有限公司购得。

Universal CPG由北京赛百盛公司购得。

TLC为自制薄层板，硅胶为 GF254, 化学纯，青岛海洋化工厂生产。快速柱层析用硅胶， ZCX— H, 粗孔， 200— 300目，为青岛海洋化工厂生产。

合成所用溶剂如吡啶，石油醚，乙酸乙酯由天津试剂六厂购得。实施例 1

该实施例用于制备本发明的干扰靶基因表达的复合分子。

按照以下步骤制备干扰靶基因表达的复合分子：

一、选择靶基因，确定 X P X₂的序列

选择 GAPDH (Genbank登记号为 NC— 000012 )为靶基因，设计 siRNA, 其对应于 NC— 000012的位置为 2700-2718bp。

其中为正义链，其序列为：

5， GUA UGA CAA CAG CCU CAA GTT 3，；

X₂为反义链，其序列为：

5， CUU GAG GCU GUUGUC AUA CTT 3，。

二、制备含炔链的核苷（以碱基 U为例）：

( 1 )按照如下反应式（3 )所示的方法，在 20ml微波反应瓶中加入 991mg 保护核苷 U (a, 1.5mmol)， 15ml无水四氢呋喃溶解为无色澄清溶液。再加入炔链原料 b 714mg (3mmol)， 1， 8 -二氮杂二环 (5， 4， 0) ^一烯 456mg (3mmol)。微波加热 60°C下反应 1小时。乙酸乙酯萃取，合并有机相后饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。旋干后柱层析，洗脱剂为石油醚 /乙酸乙酯 =2:1。得到产物分别为白色固体粉末 c，产率 28%, 淡黄色粘稠固体 d，产率 20%。

反应式 (3)

(2)按照如下反应式（4)所示的方法，在 25ml圆底烧瓶中加入 185mg 院基化原料 d (0.24mmol)， 10ml无水四氢呋喃溶解为无色澄清溶液。 rt.l6°C 下加入四丁基氟化铵 204ul (0.20mmol， 1M 四氢呋喃溶液）， rt.搅拌 2h后，加入 10mlH2O猝灭反应，旋蒸除去 THF, 乙酸乙酯萃取，合并有机相后饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。旋干后柱层析，洗脱剂为二氯甲院 /乙酸乙酯 /甲醇 =1:1:0.04。得到产物为淡黄色粘稠固体，产率 95%。

反应式（4)

(3 ) 按照如下反应式（5 ) 所示的方法，氮气保护下在 50ml两口瓶中加入炔链原料 f 128mg ( leq， lmmol) , 加入 5ml无水二氯甲垸溶解后， rt. (23 °C ) 搅拌下滴加溶有 lOlmg二异丙基胺（leq， lmmol) 和 70mg四唑 ( leq， lmmol) 的 5ml无水二氯甲垸溶液。搅拌片刻后滴加溶有亚磷酰胺 g 362mg ( 1.2eq， 1.2 mmol) 的 5ml无水二氯甲垸溶液。 rt.反应 2h后 TLC跟踪反应结束。加入饱和碳酸氢钠猝灭反应，分出有机相，饱和食盐水洗涤后，有机相旋干（该操作应尽快完成，且有机相保持冰浴，最后减压旋干时，先将烧瓶在空气中空旋至压力降为最低后再将瓶子放入水中）。 100-200目硅胶柱层析得黄色油状物，产率 90%。

反应式 (5 )

三、按照如下反应式（6) 进行如下反应：

(i)在 20ml二氯甲垸中加入化合物 a(0.46 g, 3.6 mmol)和 N-羟基琥珀酰亚胺 c(0.49 g, 4.3 mmol), 室温下搅拌混合均匀。再加入二环己基碳二亚胺 b(0.89 g, 4.3 mmol), 室温搅拌 4小时后， TLC检测反应充分。加入 20ml饱和食盐水猝灭反应，分离有机相，水洗，无水硫酸钠干燥后，减压旋干。经柱层析分离（99: 1，二氯甲垸:甲醇）得无色油状产物 d (0.51g， 63%)。

分析结果： IR (thin film) v: 2091, 1780, 1731 cm"¹, δΐί (300 MHz, CDC13) 3.37 (2H, t, J=6.6Hz, N3CH2), 2.77 (4H, m, COCH2CH2CO), 2.66 (2H, t, /) 7.0 Hz, COCH2-), 1.94 (2H, m, CH2); 5C (75 MHz, CDC13) 168.9 (CO), 167.9 (CO), 50.0 (N3CH2), 28.1 (COCH2-), 25.6 (COCH2CH2CO), 24.1 (CH2). mlz LRMS [ES⁺, MeCN] 249 (M + Na⁺, 100%). HRMS (M + Na⁺) (C8H10N4NaO4): calcd, 249.0594; found, 249.0590.

(ii) 反应使用的含有 5'末端氨基链修饰的 RNA e通过合成仪合成，氨基链组分化合物及天然核苷 HN亚磷酰胺保护单体均购自上海吉玛生物技术有限公司。

氨基链组分化合物结构式如下：

氨基上 TFA保护基在氨水脱碱基保护的过程中可同时脱除。

操作步骤为：将 10-50 nmol的修饰 RNA e溶于 40ul 0.5M碳酸钠 /碳酸氢钠缓冲溶液 (pH 8.75) , 再加入溶有 lOumol化合物 d的 12ul DMSO溶液，室温下孵育 4小时。将核酸产物粗品经 NAP- 10凝胶柱脱盐，再由反向 HPLC 纯化后， NAP-10凝胶柱脱盐，得到最终产物 f。

(i)

O O CH CI

C

N3 ACGUACGU

反应式（6 ) 四、按照如下反应式（7) 进行链接反应：

向 950ul 0.2M氯化钠缓冲溶液中依次加入 TBTA配体 1.38umoi>，维生素 C钠盐 P.O umol), 五水硫酸铜 (0.20 umoi:)。混合均匀后，再加入修饰单链核酸 a(2.0 nmol)，修饰单链核酸 b(2.0 nmol), 反应混合物在室温下孵育 2小时。反应结束后，先将粗产物经 NAP-10 凝胶柱脱盐后，再由阴离子交换 HPLC纯化。产物 c经 NAP-10凝胶柱脱盐后，可通过 MALDI-TOF质谱仪检测。

反应式（7)

上述步骤中制得的部分化合物的结构式及其 ¾ NMR数据如表 1所示，上述步骤中制得的部分化合物的结构式及其 ³¹PNMR数据如表 2所示。表 1

表 2

实施例 2

该实施例用于说明荧光标记分子的连接 _t 按照如下反应式（8)所示的方法连接荧光标记分子。反应式（8) 中化合物 b为荧光染料丹黄酰氯的修饰后产物，发射波长约为 530nm

向 950ul 0.2M氯化钠缓冲溶液中依次加入 TBTA配体 1.38umoi>，维生素 C钠盐 P.O umol), 五水硫酸铜 (0.20 umoi:)。混合均匀后，再加入修饰双链核酸 a(2.0 nmol), 荧光染料分子 b(2.0 umol), 反应混合物在室温下孵育 2小时。反应结束后，先将粗产物经 NAP-10 凝胶柱脱盐后，再由阴离子交换 HPLC纯化。产物 c经 NAP-10凝胶柱脱盐后，可通过 MALDI-TOF质谱仪或荧光检测。

反应式 (8 )

反应式（8) 中 TBTA的结构式如下式所;

反应式（8 )中， N N N NN表示 siRNA双链，正义链的序列为：

5 ' GUA UGA CAA CAG CCU CAA GTT 3 '；反义链的序列为： 5 ' CUU GAG GCU GUUGUC AUA CTT 3，。实施例 3

该实施例用于测定实施例 1和实施例 2中制得的 ziRNA的抑制靶基因表达效果的测定。

( 1 ) HEK293细胞（人胚肾细胞系）的培养

用含有 10%胎牛血清、 2mM L-谷胺酰胺的 MEM完全培养基，在六孔细胞培养板上以 5xl0⁶个细胞 /孔的密度接种 HEK293细胞（源自北京大学分子医学研究所），在温度为 37°C及 C0₂含量为 5 %的培养箱中进行培养，每 48小时传代、更换新鲜培养基。

(2) ziRNA的转染

使用 Invitrogen公司的 Lipofectamine^TM2000脂质体对实施例 1中制得的 ziRNA和实施例 2制得的 ziRNA分别进行转染，以不添加 ziRNA作为阴性对照，添加 siRNA为阳性对照。具体操作步骤如下：将 ziRNA溶解于无 RNA 酶的无菌水中，配制成浓度为 20 mol/L的 ziRNA溶液。将 HEK293细胞接种至 24孔板中，用 OptiMEM I低血清培养基（Invitrogen公司， 31985-062) 稀释成浓度为 8xl0⁵个细胞 /ml , 每孔 500μ1。分别将 3μ1 ziRNA 溶液 (20μηιο1/υ 稀释于 50μ1 Opti-MEM I 低血清培养基（Invitrogen 公司， 31985-062 ) 中，将 1 μΐ Lipofectamine™ 2000脂质体稀释于 50μ1 Opti-MEM I 低血清培养基（Invitrogen公司， 31985-062 ) 中，然后将上述两种溶液在室温下孵育 5分钟后混合，混合溶液于室温静置 20分钟后，把 ΙΟΟμΙ该混合溶液加到接种有细胞的所述 24孔板中。 ziRNA的最终浓度是 100 ηΜ。细胞 37°C培养 4小时，再加入 lml含 10%胎牛血清、 2mM L-谷胺酰胺、 100U/ml 青霉素、 lOO g/ml链霉素的 MEM完全培养基，然后在 37°C下再培养 24小时。

(3 ) Realtime法测定对靶基因表达效果的抑制

通过 Realtime-PCR分别检测转染了实施例 1中制得的 ziRNA和实施例 2制得的 ziRNA的 HEK293细胞 GAPDH基因 mRNA的表达量，以未转染 ziRNA的 HEK293细胞作为阴性对照，以转染 siRNA (正义链的序歹 5' GUA UGA CAA CAG CCU CAA GTT 3'；反义链的序列为： 5' CUU GAG GCU GUUGUC AUA CTT 3 ' ) 为阳性对照。

具体步骤为：用 1ml Trizol(GIBCOL公司）裂解转染 ziRNA的 HEK293 细胞及对照样品，并提取总 RNA, 提取总 RNA的具体步骤为：将转染后的细胞在温度为 37°C及 C0₂含量为 5 %的培养箱中培养 24小时，然后离心收集细胞，并用预冷的 2ml PBS洗一遍；所述 PBS的组成为： NaCl 137mmol/L， KC1 2.7mmol/L, Na₂HP0₄ 4.3mmol/L， KH₂P0₄ 1.4mmol/L; 每孔加入 1ml Trizol, 室温放置 5分钟，细胞发生裂解；将裂解物转移到 1.5ml EP管中；加入 200μ1氯仿，用手剧烈震荡 15秒，室温放置 3分钟； 14000rpm 4°C离心 15分钟；取液相上清约 500μ1放于一新的 EP管中，加入 500μ1异丙醇，室温放置 10分钟； 12000 rpm， 4°C 离心 10分钟，除去上清，用 l ml浓度为 75%的乙醇将沉淀物洗一次； 7600 rpm， 4°C 离心 5分钟；除去上清，室温干燥 RNA沉淀 10分钟；加入 20μ1 ddH₂0溶解 RNA。

将 2单位的 DNase I (RNase-free)(TakaRa公司）加入至上述溶解有 RNA 的 DEPC水中，并在 37°C条件下静置 30分钟，以除去总 RNA中残留的 DNA。经过 DNase I处理后，采用 Invitrogen公司的 PureLink Micro-to-Midi Total RNA Purification Kit对总 RNA进行提纯，提纯的具体步骤为：在总 RNA中加入 20μ1的浓度为 70%的乙醇，振荡混合均匀，将混合物转移至纯化柱上，室温 12000rpm离心 15秒，弃去过滤液，加入 700μ1清洗缓冲液 I (TakaRa 公司），室温 12000rpm离心 15秒，弃去过滤液，加入 500μ1清洗缓冲液 II (TakaRa公司），室温 12000rpm离心 15秒，弃去过滤液，再加入 500μ1清洗缓冲液 II (TakaRa公司），室温 12000rpm离心 15秒，弃过滤液，室温 12000rpm离心 1分钟，将纯化柱转移至 RNA收集管上，加入 30μ1 DEPC水，室温放置 1分钟，室温 13000rpm离心 2分钟，将 RNA样品置于 -80°C保存。

对提纯后得到的总 RNA进行逆转录反应，在逆转录反应中，所用的逆转录酶为 Promega公司的 M-MLV逆转录酶，逆转录反应的具体步骤为：将 lug提纯后的总 RNA与 0.5ug的 Oligo dT在试管中进行混合，用 DEPC水将总体积补足至 16.25μ1，将试管进行加热，加热的条件包括加热温度为 70 °C，加热时间为 5分钟；然后将试管迅速冷却至 0°C，并加入缓冲液（5xMLV buffer 5 ΐ, lOmM Dntp 1.25 1, RNasin 0.5 l， M-MLV 1μ1)，在 42 °C条件下孵育 1小时，得到 cDNA。

将得到的 cDNA作为 PCR反应的模板，进行 Real-time PCR反应。

Real-time PCR反应体系为： ddH₂0 17.5μ1, 10mM Dntp 0.5μ1， lO Taq buffer 2·5μ1， Taq 0.5 1, F primer 0.5 ΐ, R primer 0.5 1, Syber Green I 1μ1， οϋΝΑ 2 1; PCR反应的条件为： 94°C2分钟， 94°C 15秒， 60°C30秒，共 40个循环。同时设立 β-actin作为内参，根据下式计算 ziRNA的抑制率。

ziRNA的抑制率 = [1- (ziRNA转染后 GAPDH基因的拷贝数 /ziRNA转染后的 β-actin拷贝数）/ (对照孔 GAPDH基因的拷贝数 /对照孔 β-actin拷贝数)] xl00%。

据上式计算得结果： siRNA对 GAPDH的抑制率为 91%; 转染实施例 1 中制得的 ziRNA和实施例 2制得的 ziRNA后对 GAPDH的抑制效率分别达到 92%和 89%。

从以上结果可以看出，本发明提供的 ziRNA 能够高效的抑制 GAPDH 基因的表达。实施例 4

该实施例用于测定实施例 1制得的 ziRNA药代动力学。

实施例 1制得的 ziRNA和普通 siRNA (正义链的序歹 U: 5' GUAUGA CAA CAG CCU CAA GTT 3'；反义链的序列为： 5' CUU GAG GCU GUUGUC AUA CTT 3， )分别通过 ³²P末端标记方法进行标记，标记比活性 2uCi/ug, 实验所用动物为 60只昆明鼠,体重 20-25mg，雌雄不限，动物按 10mg/kg体重的剂量给与上述放射性标记的 ziRNA或普通 siRNA,在给药前、给药后 lmin、 10min、 30 min、 60min、 3h、 6h、 12 h、 24 h、 48h各取 3只动物，眶静脉取血，分离血桨，测定血桨中的放射性比活。结果如图 2所示。从图 2所示的结果可以看出， ziRNA比普通 siRNA在血清中的容留时间长。实施例 5

该实施例用于测定实施例 1制得的 ziRNA的稳定性。

将实施例 1制得的 ziRNA和 10%血清分别孵育 lmin、 30min、 1.5h、 3h、 6h、 12h、 24h后进行 20% PAGE电泳，以观察 ziRNA在血清中的稳定性，结果如图 3所示。图 3中数字所代表的含义是， 1 : ziRNA; 2：单链 RNA; 3： lmin; 4； 30min_; 5： 1.5h; 6： 3h; 7： 6h; 8： 12h; 9： 24h; 10： RNA。

将普通 siRNA (正义链的序列： 5 ' GUA UGA CAA CAG CCU CAA GTT 3，；反义链的序列为： 5， CUU GAG GCU GUUGUC AUA CTT 3' )和 10%血清分别孵育 lmin、 30min、 1.5h、 3h、 6h、 12h、 24h后进行 20% PAGE电泳，以观察普通 siRNA在血清中的稳定性，结果如图 4所示。图 4中数字所代表的含义是， 1 : 普通 siRNA; 2：单链 RNA; 3： lmin; 4; 30min; 5： 1.5h; 6： 3h_; 7： 6h_; 8： 12h; 9： 24h; 10： RNA。

将图 3和图 4进行比较，可以观察到双链 ziRNA在血清中比普通 siRNA 稳定。 ziRNA在血清中稳定存在超过 24小时，而普通 siRNA在血清中孵育 30分钟就明显降解，在 6小时基本观察不到双链 RNA的存在。实施例 6

该实施例用于制备本发明的干扰靶基因表达的复合分子。

按照与实施例 1相同的方法制备复合分子，不同的是，步骤二中制备含炔链的核苷的过程如下：

( 1 ) 2，-Deoxy-l， a //?-propynyloxy-D-ribofurano se的合成

1 2

5.2g (4mmol) 的化合物 1置于 250ml烧瓶中，加入 3.9g (7.3mmol)丙炔醇，冰浴，搅拌下滴入 1.27g浓盐酸，室温（20C° )搅拌 3h。 TLC检测反应完全，加入重蒸干燥吡啶 20ml，旋蒸除去溶剂，柱层析（石油醚：乙酸乙酯：甲醇 =1 : 1： 0.25 ) 得到白色固体 6.6g，即化合物 2。产率 75%。 ¾ NMR(400M, CDC1₃) δ ppm 5.22(1H, m, HI'), 4.22-4.07(2H, m, OCH₂), 3.91-3.86(2H, m, H4'， H5'a), 3.65-3.43 (2H, m, H5'b, H3')， 2.45(1H, t, CH), 1.96-1.98(2H, m, H2') .ESI-MS[M+ Na]⁺, 195.0628.

(2 ) 2，-Deoxy-l， a //?-propynyloxy-3'-di-0-acetyl-D-ribofuranose的合成

1.72g ( lmmol) 化合物 2溶解于 10ml干燥吡啶，和 3.06g (3mmol) 乙酸酐置于 100ml烧瓶中，迅速升温至 150C。加热回流 5minTLC监测，反应完全。将反应液倒入 10ml水中，以二氯甲垸（15mlx3 ) 萃取，干燥。旋蒸除去溶剂后，多次柱层析（石油醚：乙酸乙酯 =5 : 1 ) 分离得到微黄色油状物 0.86g，即化合物 3，和白色晶体 1.60g，即化合物 4。总产率 91%。 ¾ NMR,a-anomer: ¾ NMR(400M, CDC1₃) δ ppm 5.09(1Η, t, HI'), 4.24-4.21(2H, m, H4'， H3')， 3.88-3.76(4H, m, H5'， OCH₂), 2.45(1H, s, CH), 1.97-1.91(8H, m, COCH3x2, H2'a, b); -anomer: ¾ NMR(400M, CDC1₃) δ ppm 5.23(1H, m, HI'), 4.32-4.16(3H, m, H4'， H3'， H5'a), 3.76-3.62(3H, m, H5'b, OCH₂), 2.46(1H, m, CH), 2.23- 1.95(8H, m, COCH3 x2, H2'a, H2'b). ESI-MS[M+ Na]⁺, 279.0839.

( 3 ) 2'-Deoxy- 1 '/?-propynyloxy-D-ribofuranose的合成

500mg ( 1.95mmol ) 1置于 50ml烧瓶中，加入 5ml甲醇搅拌溶解，加入 NaOH ( 10% )甲醇溶液 4ml，室温搅拌 5min， TLC监测反应完全。加入 10ml 水，旋蒸除去部分甲醇，以乙酸乙酯（15mlx3 )萃取 3次，干燥，旋除溶剂，以甲醇重结晶，得到 320mg白色固体 5。产率 92%。 NMR(400M, CDC1₃) δ ppm 5.23(1H, m, HI'), 4.30-4.23(2H, m, OCH₂), 4.19(1H, m, H4')， 3.86(1H, m, H5'a), 3.65-3.61 (2H, m, H5'b, H3')， 2.47(1H, dt, CH), 2.17- 1.95(2H, m, H2'). ESI-MS[M+ Na]⁺, 195.0628.

(4 ) 2 ' -Deoxy- 1 ' 5-propynyloxy-5 '-O-dimethoxytrityl-D-ribofuranose的合成

320mg ( 1.9mmol ) 化合物 5置于 50ml烧瓶中，反复与 5ml干燥吡啶旋蒸 3 次除去水分。加入 5ml 干燥吡啶使其溶解，加入 1.352g DMTr-CI (4mmol)，室温搅拌 0.5h， TLC监测反应完全。加入 3ml无水甲醇继续搅拌 5min。将反应液倒入 30ml， 5%碳酸氢钠水溶液。以二氯甲垸（15mlx3 ) 萃取，干燥。旋蒸除去溶剂后，柱层析（石油醚：乙酸乙酯 =3 : 1 )。得到 600mg白色絮状固体，即化合物 6。产率 71%。 ^ NMR^OOM, CDC1₃) δ ppm 7.56-7.21(9H, m, Ar-H), 6.84(4H, m ,Ar-H), 5.23(1H, m, HI'), 4.34-4.11(3H_: OCH₂ ,H4')， 3.81(6H, s, OCH₃x2), 3.63-3.51(3H, m, Η3Ή5'), 2.45(1H, m, CH)_: 2.36-2.06(2H, m, H2'). ESI-MS[M+ Na]⁺, 497.1935.

(5 ) 2'-Deoxy- 1 '/?-propynyloxy-3，-0- (2-Cyanoethyl N,N- Diisopropylphosphoramidite)-5'-0-dimethoxytrityl-D-ribofuranose的合成

6 7 在 50ml两口瓶中，氮气保护下， 160mg (2.28mmol) 1-氢四唑和 760mg (5.56mmol) 亚磷酰胺试剂溶于 5ml重蒸二氯甲垸。搅拌 5min后，滴入溶于 4ml重蒸二氯甲垸的 600mg ( 1.27mmol)化合物 6溶液，氮气保护下室温搅拌 10h， TCL 监测反应完全，旋蒸除去溶剂后 (石油醚：乙酸乙酯 =5 : 1) 快速柱层析，得到白色絮状固体 620mg，即化合物 7，产率 82%。 NMR(400M_: CDC1₃) δ ppm 7.56-7.21(9H, m, Ar-H), 6.84(4H, m, Ar-H), 5.36(1H, m, HI'), 4.37-4.23(4H, m, OCH₂C, H4'， POCH₂a), 3.80(6H, s, OCH₃x2), 3.63-3.51(3H, m_: H3'， H5'), 3.36-3.07(2H, m, CHx2), 2.65(1H, m, POCH₂b), 2.56(1H, m, CCH), 2.37-2.06(2H, m, H2')， 1.23(12H, m, 4xCH₃); ³¹P-NMR(162M, CDC1₃): δ ppm 148.3,147.4; ¹³C NMR(CDC1₃, 100MHz) δ ppm 158.52, 145.89, 136.92, 130.52, 128.56, 127.65, 126.73, 117.72, 112.99, 96.752, 86.37, 79.69, 77.41, 77.10, 76.78_: 73.90, 71.16, 66.73, 63.89, 57.20, 55.22, 53.90, 43.35, 32.09, 24.74, 20.38. ESI-MS[M+ Na]⁺, 697.3013.

Claims

权利要求书

1、一种干扰靶基因表达的复合分子，其特征在于，该复合分子含有两条至少 80 %互补的 siRNA链和 X₂， Xj的 5'端与 X₂的 3'端通过非核酸分子连接， X₂的 5，端与的 3'端通过非核酸分子 L₂连接。

2、根据权利要求 1所述的复合分子，其中，非核酸连接分子分别与 Xi的 5'端的磷酸基或羟基和 X₂的 3'端的磷酸基或羟基共价连接，非核酸连接分子 L₂分别与 X₂的 5'端的磷酸基或羟基和 Xi的 3'端的磷酸基或羟基共价连接。

3、根据权利要求 1所述的复合分子，其中，所述非核酸连接分子和非核酸连接分子 L₂各自独立地为具有羧基、氨基或巯基的寡肽、聚酯、聚醚、垸烃、烯烃、炔烃、人工合成核酸类似物中的一种。

4、根据权利要求 1-3 中任意一项所述的复合分子，其中，所述非核酸

R「R:

— R2

式 I

式 II

式 III

R₇和 R₈各自独立地为一 (CH₂)_n—；

R₆、 R₉和 R_u各自独立地为以下基团中的

其中，上述各基团中的 n各自独立地为 0-10的整数， m为 1-5的整数。

5、根据权利要求 1所述的复合分子，其中，所述非核酸连接分子和 /或 L₂连接有细胞靶向识别分子、可增强细胞通透性的脂类分子和荧光标记分子中的一种或几种。

6、根据权利要求 5所述的复合分子，其中，所述非核酸连接分子和非核酸连接分子 L₂各自独立地各自独立地如式 I、式 II或式 III所示，并且所述非核酸连接分子和非核酸连接分子 L₂中的至少一个如式 I所示：

R

式 I

式 II

式 III

所述基团 Ri、 R₂、 R₃、、 R_1Q和 R₁₂各自独立地为羧基、氨基或巯基;

R₇和 R₈各自独地为一 (CH₂)_n—；

R₆、 R₉和 R„为以下基团中的一禾中:

其中，上述各基团中的 n各自独立地为 0-10的整数， m为 2-5的整数，所述细胞靶向识别分子、可增强细胞通透性的脂类分子和荧光标记分子中的一种或几种与 R₅的叠氮基 N₃-连接。

7、根据权利要求 5或 6所述的复合分子，其中，所述细胞靶向识别分子、可增强细胞通透性的脂类分子或者荧光标记分子的化学结构式为

，其中 R为细胞靶向识别基团、可增强细胞通透 f生的脂类基团和荧光标记基团中的一种或几种，所述炔基与和/或1^₂连接。

8、根据权利要求 7所述的复合分子，其中，所述炔基与和/或 L₂的

R₅的叠氮基

9、一种制备权利要求 1 所述的干扰靶基因表达的复合分子的方法，其特征在于，该方法包括制备两条至少 80%互补的修饰 siRNA链，两条修饰 siRNA链的 5'端和 3'端均具有可连接基团；将一条修饰 siRNA链的 5'端和 3'端的可连接基团分别与另一条修饰 siRNA链的 3'端和 5'端可连接基团连接。

10、根据权利要求 9所述的方法，其中，该方法包括：分别固定 a3和 a3'，在 a3上从 3'向 5'合成 X，在 a3'上从 3'向 5'合成 X₂，得到 a3-X^P a3'-X₂; 将 al和 al，分别引入 a3-Xi和 a3'-X₂的 5，端，形成 al-X a3和 al，-X₂-a3，; 将 a2 和 a2，分别引入 al-X a3 和 al，-X₂-a3，，形成 a2-al-X a3 和 a2，-al，-X₂-a3，；然后使 a2-al-X₁-a3和 a2，-al，-X₂-a3，进行退火并使 a2-al-X₁-a3 的 a2 与 a2，-al，-X₂-a3，的 a3，发生链接反应以及 a2-al-X₁-a3 的 a3 与 a2'-_ar-X₂-a3'的 a2'发生链接反应，生成所述复合分子，其中，

al和 al '各自独立地为：

o

0- -0-

Η,Ν

〇θ

a2和 a2'各自独立地为

a2-al和 a2，-al，各自独立地为

a3和 a3，各自独立地为以下基团中的一种:

11、根据权利要求 10所述的方法，其中， a2和 /或 a2'为

， m为 2-5的整数， n为 0-10的整数，该方法还包括在 a2-al-Xl-a3的 a2与 a2'-al '-X2-a3，的 a3'发生链接反应以及 a2-al-Xl-a3的 a3与 a2'-al '-X2-a3，的 a2'发生链接反应后，在 a2和 /或 a2'上连接上细胞靶向识别分子、可增强细胞通透性的脂类分子和荧光标记分子中的一种或几种，细胞靶向识别分子、可增强细胞通透性的脂类分子或荧光标记分子与 a2和 /或 a2'的叠氮基 N₃-连接。

12、根据权利要求 11所述的方法，其中，所述细胞靶向识别分子、可增强细胞通透性的脂类分子或者荧光标记分子的化学结构式为

，其中 R为细胞靶向识别基团、可增强细胞通透的脂类基团和荧光标记基团中的一种或几种，所述炔基与 a2和 /或 a2，的 Ϊ

13、根据权利要求 9所述的方法，其中，该方法包括：分别固定 a4和 a4，，在 a4上从 3，向 5，合成，在 a4，上从 3，向 5，合成 X₂，得到 a4-X^P a4 -X₂; 将 a5和 a5，分别引入 a4-Xj和 a4'-X₂的 5，端，形成 a5-X a4和 a5'-X₂-a4' _; 将 a6先与其中一条发生链接反应；两条链退火之后，再与另一条链进行链接反应，生成所述复合分子，

其中， a4 a4 a5和 a5，各自独立地为以下基团中的一种：

其中，上述各基团中的 n各自独立地为 0-10的整数;

a6为： N₃-(CH₂)_P-N₃

其中， p为 2-12的整数。