CN102453066A - 一种复合分子及其制备方法和药物组合物 - Google Patents

一种复合分子及其制备方法和药物组合物 Download PDF

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Abstract

提供了一种稳定性好且血液容留时间长的复合分子及其制备方法和应用。所述复合分子含有两条至少80％互补的核酸链X1和X2，X1的5’端与X2的3’端通过连接基团L1连接和/或X2的5’端与X1的3’端通过连接基团L2连接。本发明提供的复合分子的两条核酸链X1和X2的5’端和/或3’端通过如式1所示的连接基团连接，因此核酸链不容易解旋降解，从而大大地改善了核酸的稳定性和血液容留时间。所述复合分子施用后，在细胞内，利用细胞内存在的Dicer酶释放复合分子中被锁定的核酸，从而释放的双链核酸发挥其作用，例如siRNA对靶基因的表达进行抑制。

Description

一种复合分子及其制备方法和药物组合物
技术领域
本发明涉及一种复合分子及其制备方法和药物组合物。
背景技术
干扰RNA(RNAi，或siRNA)是近年来发现的一种抑制基因表达的小RNA。siRNA的主要作用机制是通过其反义RNA与靶基因的mRNA发生同源互补而抑制靶基因的表达。由于siRNA能够特异地抑制靶基因的表达，所以它在医药领域具有广阔的应用前景。但是外源siRNA的稳定性差，血液容留时间短，细胞和组织通透性(penetration)差，这几方面严重阻碍了外源siRNA抑制靶基因表达的应用。
siRNA的稳定性差不是由于其在双链形式下被降解，而是由于在双链-单链的杂交-解旋平衡中(亦称双链核酸的“呼吸”)，其单链形式被RNase降解而导致快速失衡，造成双链siRNA快速解旋降解。根据以上原理，许多研究人员力图通过对siRNA进行修饰而使其双链不易解旋，进而改善其稳定性并提高其血液容留时间。例如WO 2004/015075公开了“An interferinghairpin RNA having the structure X.sub.1-L-X.sub.2，wherein X.sub.1 andX.sub.2 are nucleotide sequences having sufficient complementarity to oneanother to form a double-stranded stem hybrid and L is a loop region comprisinga non-nucleotide linker molecule，wherein at least a portion of one of thenucleotide sequences located within the double-stranded stem is complementaryto a sequence of said target RNA”，即两条siRNA链各自的一端用非核酸分子连接形成发卡结构的siRNA，其中所述非核酸分子选自“polyethers，polyamines，polyesters，polyphosphodiesters，alkylenes，attachments，bioconjugates，chromophores，reporter groups，dye labeled RNAs，andnon-naturally occurring nucleotide analogues or combinations thereof”。WO2009/074076公开了一种干扰靶基因表达的复合分子，该复合分子含有两条至少80％互补的siRNA链X1和X2，X1的5’端与X2的3’端通过非核酸分子L1连接，X2的5’端与X1的3’端通过非核酸分子L2连接。所述非核酸连接分子L1和非核酸连接分子L2可以为具有羧基、氨基或巯基的寡肽、聚酯、聚醚、烷烃、烯烃、炔烃和人工合成核酸类似物中的一种。
其它种类的双链核酸，如双链DNA和除siRNA之外的其它双链RNA也存在稳定性差，血液容留时间短的问题。
但是，包括WO 2004/015075和WO 2009/074076在内现有技术都没有公开通过巯基与马来酰胺酸甲酯的迈克尔加成反应来对双链核酸进行修饰。
发明内容
本发明的目的是为了提供了一种稳定性好且血液容留时间长的复合分子及其制备方法和应用。
本发明的发明人通过研究发现，通过巯基与马来酰胺酸甲酯或马来酰亚胺的迈克尔加成反应，可成功实现核酸的单双端交联，修饰交联后的核酸的稳定性得到改善，从而延长血液容留时间。
本发明提供了一种复合分子，该复合分子含有两条至少80％互补的核酸链X1和X2，X1的5’端与X2的3’端通过连接基团L1连接和/或X2的5’端与X1的3’端通过连接基团L2连接，其特征在于，所述连接基团L1和L2各自独立地如式1所示：
-R1-S-R2-S-R3-
式1
在式1中，R1和R3各自独立地表示碳原子数为1-20的任选取代的亚烷基；
R2如式2、式3或式8所示：
Figure BSA00000317713300031
式2
Figure BSA00000317713300032
式3
Figure BSA00000317713300033
式8
在式2、式3或式8中，R4表示碳原子数为1-20的任选取代的亚烷基或碳原子数为6-20的任选取代的亚芳基；
R5和R14各自独立地表示氢或碳原子数为1-20的任选取代的烷基；
R6、R7、R8和R9各自独立地表示单键、氢、卤素或碳原子数为1-20的任选取代的烷基，并且R6、R7、R8和R9中的一者表示单键，剩余的三者中的至少一者为氢，并且当剩余的三者中的一者为氢时，氢和单键不位于同一个碳原子上；
R10、R11、R12和R13各自独立地表示单键、氢、卤素或碳原子数为1-20的任选取代的烷基，并且R10、R11、R12和R13中的一者表示单键，剩余的三者中的至少一者为氢，并且当剩余的三者中的一者为氢时，氢和单键不位于同一个碳原子上。
本发明还提供了两端交联的复合分子的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)提供包括至少80％互补的第一修饰核酸链和第二修饰核酸链的双链核酸，其中第一修饰核酸链的5’端具有基团-R19-SH且第二修饰核酸链的3’端具有基团-R20-SH，并且第二修饰核酸链的5’端具有基团-R21-SH且第一修饰核酸链的3’端具有基团-R22-SH，其中，R19、R20、R21和R22各自独立地表示碳原子数为1-20的任选取代的亚烷基；
(2)提供式4、式5或式9所示的化合物；
(3)将所述双链核酸与式4、式5或式9所示的化合物进行迈克尔加成反应，
Figure BSA00000317713300041
式4
Figure BSA00000317713300042
式5
Figure BSA00000317713300051
式9
在式4、式5或式9中，R4表示碳原子数为1-20的任选取代的亚烷基或碳原子数为6-20的任选取代的亚芳基；
R5和R14各自独立地表示氢或碳原子数为1-20的任选取代的烷基；
R15和R16各自独立地表示氢、卤素或碳原子数为1-20的任选取代的烷基；
R17和R18各自独立地表示氢、卤素或碳原子数为1-20的任选取代的烷基。
本发明还提供了一端交联的复合分子的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)提供至少80％互补的第一修饰核酸链和第二修饰核酸链，其中第一修饰核酸链的5’端具有基团-R19-S-R21且第二修饰核酸链的3’端具有基团-R20-S-R22，其中，R19和R20各自独立地表示碳原子数为1-20的任选取代的亚烷基，R21和R22中的一者表示氢并且另一者如式6、式7、式10或式11所示；
(2)将第一修饰核酸链和第二修饰核酸链进行退火并进行迈克尔加成反应，
Figure BSA00000317713300052
式6
Figure BSA00000317713300061
式7
Figure BSA00000317713300062
式10
Figure BSA00000317713300063
式11
在式6、式7式10或式11中，R4表示碳原子数为1-20的任选取代的亚烷基或碳原子数为6-20的任选取代的亚芳基；
R5和R14各自独立地表示氢或碳原子数为1-20的任选取代的烷基；
R23和R24中的一者表示单键并且另一者表示氢、卤素或碳原子数为1-20的任选取代的烷基；
R25和R26各自独立地表示氢、卤素或碳原子数为1-20的任选取代的烷基。
本发明还提供了一种药物组合物，该药物组合物含有本发明提供的复合分子作为活性成分。
本发明提供的复合分子的两条核酸链X1和X2的5’端和/或3’端通过如式1所示的连接基团连接，因此核酸链不容易解旋降解，从而大大地改善了核酸的稳定性和血液容留时间。所述复合分子施用后，在细胞内，利用细胞内存在的Dicer酶释放复合分子中被锁定的核酸，从而释放的双链核酸发挥其作用，例如siRNA对靶基因的表达进行抑制。
附图说明
图1表示制备实施例5和6制得的产物的PAGE结果分析；
图2、3和4分别表示未经修饰的核酸、制备实施例5制得的hpRNA、制备实施例6制得的dbRNA的热稳定性；
图5表示制备实施例5和6制得的产物在血清中孵育后的PAGE检测结果；
图6表示制备实施例5和6制得的产物在Dicer切割后的PAGE检测结果；
图7表示制备实施例5和6制得的产物的RNA干扰结果；
图8表示制备实施例7制得的产物的15％变性凝胶电泳结果；
图9表示制备实施例7制得的修饰交联的核酸hpODN与dbODN的CD谱图；
图10、11和12分别表示contODN、hpODN和dbODN的热稳定性测定结果；
图13表示contODN、hpODN和dbODN的EcoRI酶切实验结果；
图14和15分别表示hpODN ben和hpODN CH2-2的热稳定性。
图16和17分别表示制备实施例7制得的修饰交联的核酸hpODN与dbODN的MALDI-TOF MS结果谱图。
具体实施方式
-R1-S-R2-S-R3-
式1
在式1中，R1和R3优选各自独立地表示碳原子数为1-10的任选取代的亚烷基，更优选各自独立地表示碳原子数为2-6的任选取代的亚烷基(例如，碳原子数为2、3、4、5或6)。R1和R3可以相同，也可以不同，优选相同。
R2优选如式3所示。按照该优选实施方式，复合分子更容易合成，并且复合分子的结构更稳定。
在式2、式3或式8中，R4优选表示碳原子数为1-20的任选取代的亚烷基，更优选表示碳原子数为1-10的任选取代的亚烷基，进一步优选表示碳原子数为2-6的任选取代的亚烷基(例如，碳原子数为2、3、4、5或6)。按照该优选实施方式，复合分子的稳定性更好、血液容留时间更长。
作为R4的任选取代的亚芳基的碳原子数优选为6-10(例如，碳原子数为6、7、8、9或10)。亚芳基的例子包括但不限于亚苯基、甲基亚苯基、乙基亚苯基。
作为R5和R14的任选取代的烷基的碳原子数优选为1-10，更优选为1-6(例如，碳原子数为1、2、3、4、5或6)。
R6、R7、R8和R9中的一者表示单键，剩余的三者中的至少一者为氢，并且当剩余的三者中的一者为氢时，氢和单键不位于同一个碳原子上。更优选地，R6、R7、R8和R9中的一者表示单键，R6、R7、R8和R9中剩余的三者均为氢。作为R6、R7、R8和R9的任选取代的烷基的碳原子数优选为1-10，更优选为1-6(例如，碳原子数为1、2、3、4、5或6)。
R10、R11、R12和R13中的一者表示单键，剩余的三者中的至少一者为氢，并且当剩余的三者中的一者为氢时，氢和单键不位于同一个碳原子上。更优选地，R10、R11、R12和R13中的一者表示单键，R10、R11、R12和R13中剩余的三者均为氢。作为R10、R11、R12和R13的任选取代的烷基的碳原子数优选为1-10，更优选为1-6(例如，碳原子数为1、2、3、4、5或6)。
在本申请中，术语“任选取代的”是指所述基团可以被取代基取代或者没有被取代基取代。所述取代基可以为常规的取代基，例如卤素。取代基的数量可以为一个或者多个。
在本申请中，术语“卤素”是指氟、氯和溴中的至少一种，优选为氯。
需要说明的是，所述5’端和3’端只是用于指代核酸链的方向，并不限定为5’位和3’位，例如3’端的连接可以通过3’位的羟基，也可以通过2’或1’位的羟基。
优选情况下，X1的5’端与X2的3’端通过连接基团L1连接，并且X2的5’端与X1的3’端通过连接基团L2连接。按照该优选实施方式，可进一步提高复合分子的化学稳定性，从而进一步延长其血液容留时间。
核酸链X1和X2可以为常规的各种核酸链，如各种DNA链或RNA链，只要核酸链X1和X2至少80％互补即可，优选核酸链X1和X2至少90％互补，更优选核酸链X1和X2100％互补。核酸链X1或X2可以具有15-50个碱基，优选19-40个碱基，更优选19-30个碱基。核酸链X1和X2优选为具有干扰靶基因表达的功能的siRNA。
下面描述本发明提供的复合分子的制备方法。
首先描述两端交联的复合分子的制备过程。
在步骤(1)，第一修饰核酸链的5’端具有基团-R19-SH且第二修饰核酸链的3’端具有基团-R20-SH，并且第二修饰核酸链的5’端具有基团-R21-SH且第一修饰核酸链的3’端具有基团-R22-SH。
其中，R19、R20、R21和R22各自独立地表示碳原子数为1-20的任选取代的亚烷基，优选各自独立地表示碳原子数为1-10的任选取代的亚烷基，更优选各自独立地表示碳原子数为2-6的任选取代的亚烷基(例如，碳原子数为2、3、4、5或6)。R19、R20、R21和R22可以相同，也可以不同，优选相同。
第一修饰核酸链和第二修饰核酸链可以通过在合成常规的核酸链的过程中在5’端和3’端引入所述基团。
以5’端具有基团-R19-SH且3’端具有基团-R22-SH的第一修饰核酸链为例来描述修饰核酸链的制备过程：
采用固相合成法，固定巯基修饰试剂，在巯基修饰试剂上从3’向5’合成核酸链，然后将巯基修饰试剂引入5’端，形成修饰核酸链。
可以采用常规的合成核酸的方法将巯基修饰试剂固定，然后在巯基修饰试剂上从3’向5’合成核酸链。例如，可以参考《生物化学》(第三版上册，王镜岩等主编，高等教育出版社)第520-521页介绍的固相合成法。在合成过程中，延伸至所需长度之后，可以脱去碱基等位点上的保护基团。脱除保护基团的方法可以包括：
(i)使用氨气甲醇溶液(氨水浓度4N)。55℃孵育15h。将剩余氨水旋干。以及
(ii)旋干的2’-TBDMS-RNA样品中加入200μl无水DMSO和200μlEt3N.3HF(三氢氟酸三乙胺盐)，密封后65℃孵育2h。加入600μl的异丙基三甲基硅醚猝灭反应后，再向剩余液中5倍体积无水乙醚沉淀。
所述巯基修饰试剂可以商购得到，例如Thiol-Modifier C6S-S(Glenresearch：10-1936-xx)，其结构式为
Figure BSA00000317713300101
使用该巯基修饰试剂时，5’端和3’端的修饰基团是S-S，可以通过TCEP(三[2-羧乙基]盐酸膦)还原生成活性羟基。TCEP还原反应操作可以包括：将核酸固体粉末溶解在TCEP水溶液(浓度可以为1-5％重量％)中(核酸固体粉末与TCEP的摩尔比为1∶500-2000)，在20-45℃下反应0.1-5小时；加入乙酸铵溶液(浓度可以为5-12mol/L)，混匀；加入无水乙醇，相对于每100μlTCEP水溶液，乙酸铵溶液的用量可以为20-80μl，无水乙醇的用量可以为200-800μl，混匀；-80℃下冷冻沉淀至少20分钟(优选20-100分钟)；分离出沉淀即为第一修饰核酸链。
制备第一修饰核酸链和第二修饰核酸链之后，采用常规的退火方法和条件使第一修饰核酸链和第二修饰核酸链进行退火即可得到所述双链核酸。
在步骤(2)中，式4、式5或式9所示的化合物可以通过将NH2-R4-NH2与马来酸或马来酸酐接触反应而制得。
反应的条件包括：反应介质可以为二氯甲烷、乙醚、四氢呋喃和乙酸乙酯中的至少一种；NH2-R4-NH2与马来酸或马来酸酐的物质的量比可以为1∶2-1∶10；反应温度可以为20-90℃；反应时间可以为1-10小时。
在步骤(3)中，迈克尔加成反应的条件包括：在碱性催化剂的存在下，在反应介质中进行，双链核酸与式4或式5所示的化合物的摩尔比可以为1∶500-2000，双链核酸在反应介质中的浓度可以为20-200μmol/L，反应温度为10-60℃，反应时间为1-10小时。
所述碱性催化剂可以为用于迈克尔加成反应的各种碱性催化剂，优选为有机胺，更优选为三乙胺。碱性催化剂的用量只要满足催化需要即可。
所述反应介质可以为二甲基亚砜(DMSO)或缓冲溶液，所述缓冲溶液可以为10mM Tris-HCl(pH＝8.0，20mM NaCl)、100mM MOPS-NaOH(pH8.0，200mM NaCl)或100mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)。
下面描述一端交联的复合分子的制备过程。
在步骤(1)中，对于R21或R22表示氢的修饰核酸链，可以按照在两端交联的复合分子的制备过程中描述的修饰核酸链的制备方法来制备，不同的是，核酸链只有一端引入-R19-SH或-R20-SH。
对于R21或R22如式6、式7、式10或式11所示的修饰核酸链，在制备出一端引入-R19-SH或-R20-SH的核酸链后，将该核酸链与式4、式5或式9所示的化合物进行迈克尔加成反应。迈克尔加成反应的条件与之前描述的相同。
在步骤(2)中，退火可以采用常规退火操作，迈克尔加成反应的条件与之前描述的相同。
本发明提供的该药物组合物含有所述复合分子作为活性成分。所述药物组合物可以为常规的剂型，并且根据具体的剂型含有所需的药学可接受的辅料。复合分子的用量为其发挥作用的有效剂量，例如对于siRNA而言，为可有效抑制靶基因表达的剂量。
下面通过实施例更详细地描述本发明。
制备实施例1
该实施例用于按照反应式I所示的过程制备化合物dimmer b。
Figure BSA00000317713300121
反应式I
在100ml圆底烧瓶中加入0.88g(9.0mmol)马来酸酐，40ml二氯甲烷溶解。室温搅拌下，滴加溶有0.43g(4.0mmol)对苯二胺的10ml二氯甲烷溶液，反应溶液变红，且有固体悬浊物出现。45℃加热回流反应3小时后，停止并冷却反应液至室温。抽滤并用二氯甲烷洗涤固体产物后，烘干。得橙色固体粉末a 1.19g，产率98％。将该产物粗品a(1.19g，3.9mmol)与0.10g(0.54mmol)一水合对甲苯磺酸混合加入100ml圆底烧瓶中，加入50ml甲醇，75℃加热回流反应30小时后，固体全部溶解。停止反应，甲醇重结晶，得黄绿色固体粉末0.39g，产率30％。1H NMR(400MHz，CDCl3)
Figure BSA00000317713300131
ppm 10.97(s，2H)，7.66(s，4H)，6.44(d，J＝8.5Hz，2H)，6.23(d，J＝8.5Hz，2H)，3.86(s，6H).13C NMR(100MHz，CDCl3)δ.ppm 167.31，161.28，140.44，134.38，124.89，120.66，52.83.HRMS：C16H17N2O6，[M+H]+：calc.333.1081，found.333.1076.
制备实施例2
该实施例用于按照反应式II所示的过程制备化合物dimmer ben。
Figure BSA00000317713300132
反应式II
在100ml圆底烧瓶中加入981mg(10.0mmol)马来酸酐，40ml二氯甲烷溶解。室温搅拌下，滴加溶有541mg(5.0mmol)对苯二胺的10ml二氯甲烷溶液，反应溶液变红，且有固体悬浊物出现。45℃加热回流反应3小时后，停止并冷却反应液至室温。抽滤并用二氯甲烷洗涤固体产物后，烘干。得橙色固体粉末a 1.40g，产率92％。在100ml圆底烧瓶中，将该产物粗品a(1.40g，4.6mmol)与943mg(11.5mmol)醋酸钠混合后，加入50ml醋酸酐得橙色悬浊液。90℃下搅拌反应，橙色悬浊液很快变黄、变浅。1.5小时后，悬浊固体全部溶解。冷水浴反应瓶至室温，将反应液倒入50ml冰水中。摇动片刻后，抽滤、水洗、烘干，产物为浅黄色固体粉末536mg，产率43％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.49(s，4H)，6.88(s，4H).HRMS：C14H8N2O4，[M+H]+：calc.291.0376，found.291.0372.
制备实施例3
该实施例用于按照反应式III所示的过程制备化合物dimmer CH2-2。
Figure BSA00000317713300141
反应式III
在100ml圆底烧瓶中加入981mg(10.0mmol)马来酸酐，40ml二氯甲烷溶解。室温搅拌下，滴加溶有301mg(5.0mmol)对乙二胺的10ml二氯甲烷溶液，反应液中出现白色固体悬浊物。45℃加热回流反应3小时后，停止并冷却反应液至室温。抽滤并用二氯甲烷洗涤固体产物后，烘干。得白色固体粉末b 1.173g，产率93％。在100ml圆底烧瓶中，将该产物粗品b(1.173g，4.6mmol)溶于10ml丙酮(悬浊)，再分别加入287mg(3.5mmol)醋酸钠，3.0g(29.2mmol)醋酸酐，304mg(3mmol)三乙胺。将反应液加热回流反应2.5小时，悬浊固体全部溶解后，停止反应。减压旋干反应液，少量甲苯带干醋酸酐后，柱层析纯化，石油醚/乙酸乙酯＝2/1，。产物为白色固体粉末343mg，产率34％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.26(s，4H)，3.74(s，4H).HRMS：C10H8N2O4，[M+H]+：calc.221.0557，found.221.0559.
制备实施例4
该实施例用于制备Thiol-Modifier C6 S-S修饰分子。
(1)按照反应式IV所示合成C12H26O2S2。
Figure BSA00000317713300142
反应式IV
在100ml圆底烧瓶中，将2ml(14.7mmol)6-巯基己醇的20ml二氯甲烷溶液与20ml 10％的KHCO3水溶液相混合。冰水浴搅拌下，缓慢滴加含有1ml Br2(19.5mmol)的5ml二氯甲烷。随滴加进行，反应液的红色加深，15分钟滴加完毕后，反应液为浅红色。冰水浴搅拌下反应片刻，反应液红色退去后，分液，二氯甲烷萃取有机相(20mlX3)。合并有机相，brine洗涤，干燥。柱层析纯化，石油醚/乙酸乙酯＝1/2。产物为白色蜡状固体429mg，产率22％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.65(t，J＝6.5Hz，4H)，2.69(t，J＝7.3Hz，4H)，1.72-1.53(m，8H)，1.43-1.37(m，8H)。
(2)按照反应式V所示合成C33H44O4S2。
Figure BSA00000317713300151
反应式V
氮气保护下在100ml两口瓶瓶中，将775mg(2.9mmol)S-S原料溶于20ml无水吡啶。冰盐浴搅拌下，缓慢滴加溶有985mg(2.9mmol)DMTrCl的30ml无水二氯甲烷溶液。滴加持续1小时，滴加完毕后，恢复至室温继续反应3小时。反应液由最初的浅红色变为浅黄色。结束后，加入10ml甲醇粗灭反应，减压旋干反应液。加入少量甲苯带干残留吡啶后，柱层析纯化，石油醚/乙酸乙酯＝1/1。产物为黄色油状物691mg，产率42％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.37-7.09(m，9H)，6.75(d，J＝8.4Hz，4H)，3.71(s，6H)，3.56(q，J＝6.3Hz，2H)，2.96(t，J＝6.2Hz，2H)，2.61(dd，J＝14.5，3.8Hz，4H)，1.63-1.48(m，8H)，1.33-1.30(m，8H).13C NMR(101MHz，CDCl3)δ158.18(s)，145.33(s)，136.61(s)，129.94(s)，129.07(s)，128.10(s)，127.65(s)，126.51(s)，113.07(s)，112.88(s)，85.56(s)，77.00(s)，63.21(s)，62.79(s)，55.15(s)，38.92(t)，32.52(s)，29.88(s)，29.10(s)，29.06(s)，28.36(s)，28.19(s)，25.91(s)，25.32(s).HRMS：C33H44O4S2，[M+H]+：calc.383.1941，found.383.1943.
(3)按照反应式VI所示合成C42H61N2O5PS2。
Figure BSA00000317713300161
反应式VI
氮气保护下在50ml两口瓶瓶中，将136mg(0.7mmol)Py.TFA与212mg(0.7mmol)亚磷酰胺保护基混合溶于10ml无水二氯甲烷。室温搅拌下，加入溶有267mg(0.47mmol)S-S原料的10ml无水二氯甲烷溶液。室温搅拌下反应3小时后，停止反应，减压旋干反应液。柱层析纯化，石油醚/乙酸乙酯＝2/1，。产物为无色油状物312mg，产率86％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.37-7.10(m，9H)，6.74(d，J＝8.8Hz，2H)，3.77-3.74(m，2H)，3.71(s，6H)，3.59-3.47(m，4H)，2.96(t，J＝6.5Hz，2H)，2.61-2.54(m，6H)，1.61-1.53(m，8H)，1.33-1.29(m，8H)，1.11(dd，J＝6.6，4.7Hz，12H).31P NMR(162MHz，CDCl3)δ147.27(s).
制备实施例5
该实施例用于制备发卡型RNA(hpRNA)，即一端交联的siRNA复合分子。
(1)siRNA序列为HEK293细胞Firefly luciferase表达体系的siRNA。在此基础上，连接修饰基团的延伸序列参考了文献J.AM.CHEM.SOC.2007，129，15108-15109
Figure BSA00000317713300171
SEN：5’-pCC CUAUUC UCC UUC UUC GCU U-3’
ANT：5’-pGC GAA GAA GGA GAA UAG GGU U-3’
HSHPS：5’-pCC CUA UUC UCC UUC UUC GCC CUU S-3’
HSHPA：5’-SAA GGG CGA AGA AGG AGA AUA GGG UU-3’
HSDBS：5’-SAA CCC UAU UCU CCU UCU UCG CCC UUS-3’
HSDBA：5’-SAA GGG CGA AGA AGG AGA AUA GGG UUS-3’
注：p为末端磷酸酯。S为修饰基团Thiol-Modifier C6 S-S
(2)发卡型RNA(hpRNA)的合成(反应式VII)：
Figure BSA00000317713300181
反应式VII
(i)使用Expidite 8909核酸合成仪合成修饰核酸A，其3’位为含有S-S基团的修饰单元(CPG采用VitroBio生产的Universal CPG，脱除CPG及保护基的条件为55℃下，4N氨气的甲醇溶液中孵育15小时。核酸粗品纯化采用12％变性丙烯酰胺凝胶电泳)，修饰核酸A经TCEP还原生成活性巯基，得到核酸B，TCEP还原的操作为：
加入400μl 3％TCEP水溶液至核酸A固体粉末中；振荡样品管至固体全部溶解；将样品管放入摇床室温下反应1小时；加入150μl 9.5M乙酸铵溶液，混匀；加入1.5ml无水乙醇，混匀；-80℃下冷冻沉淀60分钟；样品转至4℃离心机，13,000RPM离心15分钟；移除上清液，SpeedVac将固体样品旋干。
(ii)得到核酸B后，通过迈克尔加成反应修饰上制备实施例3制得的dimmer CH2-2，得到核酸C其操作为：
将核酸B溶于5‰Et3N/DMSO溶液中，如果溶解效果不佳，可加入适量ddH2O调节至全溶。加入0.1M的修饰dimmer CH2-2(制备实施例3制得的)/DMSO溶液，使dimmer小分子为核酸分子的1000倍当量。将该反应管放入37℃摇床反应2小时后，加入4倍体积无水乙醇稀释反应液。OMEGAMICROSEP 3K(PALL)过滤稀释液，脱除剩余小分子，滤膜上的产物C用乙醇和ddH2O洗涤。加入ddH2O至完全溶解、收集产物C，260nm波长下测定样品浓度。
(ii)得到核酸C后，将其与等当量的核酸D(25nmol)混合配制成10mM Tris-HCl(pH8.0)，20mM NaC溶1缓冲液，双链核酸浓度为50μM。先将该反应液放入90℃控温槽恒温1分钟后，退火至25℃，降温速度为1℃/分钟。退火后的反应液继续37℃下孵育1小时，产物经OMEGA MICROSEP3K(PALL)脱盐后，12％变性丙烯酰胺凝胶电泳分析并纯化。
制备实施例6
该实施例用于按照反应式VIII制备哑铃型核酸(dbRNA)，即两端都交联的siRNA。
Figure BSA00000317713300201
反应式VIII
(1)制备核酸E和F：
按照与制备实施例5相同的方法制备核酸E和F，不同的是，核酸的两端均引入巯基。
(2)将等当量的核酸E、F(5nmol)混合配制成10mM Tris-HCl(pH8.0)，20mM NaCl缓冲溶液，双链核酸浓度为50μM。先将该反应液放入90℃控温槽恒温1分钟后，退火至25℃，降温速度为1℃/分钟。
(3)退火结束后，向溶液中加入10nmol(2eq)dimmer CH2-2(0.01MDMSO溶液)，37℃下摇床反应1小时。再向溶液中补加10nmol(2eq)dimmerCH2-2(0.01M DMSO溶液)，37℃下摇床反应1小时。产物经OMEGAMICROSEP 3K(PALL)脱盐后，12％变性丙烯酰胺凝胶电泳分析并纯化。
实验实施例1
该实施例用于说明制备实施例5和6制得的产物的PAGE结果分析。
按照以下过程进行PAGE分析，结果如图1和图2所示。
用变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)进行电泳分离。配制8～15％聚丙烯酰胺凝胶(7M尿素)，厚度为0.75mm，在40V/cm条件下预电泳1小时。电泳液为1×TBE。用电泳缓冲液冲洗加样孔中的尿素，将含量约为80ng的RNA样品与等体积的甲酰胺上样缓冲液混合并在90℃加热变性5min，冰中骤冷2min再快速离心后上样于加样孔，同样电压条件下继续电泳约1h。染色采用SYBR Gold染料，染色时间为40min。结束后于紫外灯下照相。
图1的(i)为hpRNA的反应结果，D、C、hpRNA对应示意图中的核酸，Marker为长度20nt～50nt的RNA。hpRNA为产物粗品，图示结果显示，单交联产率大于90％。由于反应原料C、D均为单端修饰RNA，长度约25nt，PAGE结果显示产物带在50nt左右，因此判断该新生成条带为hpRNA。熔炼温度结果同样证明该结论。
图1的(ii)为dbRNA的反应结果，E、F、dbRNA对应示意图中的核酸。下左为小板PAGE结果，产物为单一条带。下右为长板测序胶结果，该结果显示，交联结果有a，b两个条带。推测Ra和Rb应该一个是目标双交联产物，另一个是单交联产物。
实验实施例2
该实施例用于说明制备实施例5和6制得的产物的热稳定性。
热稳定性研究通过熔链温度的测定对比。测定采用CARY 100 Bio(Varian，USA)紫外仪，波长260nm。测量用核酸样品浓度为3μM，缓冲液为10mM磷酸钠(pH7.0)，10mM NaCl，1mM EDTA。测试升温速率为0.5deg/min。
图2、3和4分别表示未经修饰的siRNA、制备实施例5制得的hpRNA、制备实施例6制得的dbRNA的热稳定性，可以看出未经修饰的siRNA的熔链温度为65℃、hpRNA的熔链温度为80℃、dbRNA的熔链温度大于90℃，说明本发明提供的复合分子的热稳定性得到极大地改善。实验实施例1和实验实施例2的结果组合在一起证实了制备实施例6的产物确实为dbRNA。
实验实施例3
该实施例用于说明制备实施例5和6制得的产物在血清中的稳定性。
将未经修饰的siRNA、制备实施例5制得的hpRNA、制备实施例6制得的dbRNA各自溶于1×退火缓冲液中(100mM Tris-HCl at pH8.0，20mMNaCl)，浓度5μM。退火结束后，加入等体积的1×磷酸盐缓冲溶液(pH 7.2)。加入占总体积50％的胎牛血清混合均匀后，37℃孵育。在孵育2、4、8、16、24、48小时后，分别从反应混合液中取出6μl样品，加入2μl 0.5M EDTA(pH8.0)，-20℃保存。最终全部样品用20％变性PAGE检测(按照与实验实施例1相同的方法)。该PAGE结果经BioRad Molecular Imager FX软件处理，分析出各降解产物中原料条带的百分含量，后进行归一化。归一化采用Marquardt-Levenberg非线性最小平方递减公式y＝y0+A1e-tk1+A2e-tk2，A1、A2为参考系数，ln2/k2可计算出对应RNA在该条件下的半衰期。其半衰期的结果分别为：siRNA＝3.6小时，hpRNA＝16.8小时，dbRNA＝24.6小时。结果如图5所示。
在图5中，marker为20nt～50nt的RNA，未经修饰的siRNA在孵育24小时后完全降解，hpRNA在孵育48小时后有大约50％的降解，而dbRNA降解很少。通过半衰期的计算可得出结论，hpRNA和dbRNA在血清中的稳定性远大于天然siRNA。
实验实施例4
该实施例用于说明制备实施例5和6制得的产物的Dicer切割实验。
分别将制备实施例5和6制得的退火完毕的hpRNA和dbRNA(2.5μM)与0.1units/μL BLOCK-iTTM-DICER混合，反应液为20mM Tris-HCl(pH8.5)，150mM NaCl，2.5mM MgCl2。37℃孵育下，分别在1，5，10小时后，从反应液中取出4.5μl样品，加入1.5μl 0.5M EDTA(pH8.0)粗灭反应后，-20℃冷冻保存。为避免RNA自身降解的影响，三组样品各做一份未加Dicer的平行实验。最终全部样品用20％变性PAGE检测(按照与实验实施例1相同的方法)，结果如图6所示。
在图6中，marker为20nt～50nt的RNA。在不加入Dicer的情况下，siRNA，hpRNA和dbRNA就不会有降解。hpRNA和dbRNA在Dicer中孵育10小时后，均被完全切割。说明本发明的修饰方法不会对RNA的双螺旋结构造成影响，不影响酶的识别。
实验实施例5
该实施例用于说明制备实施例5和6制得的产物的RNA干扰结果。
按照以下过程进行RNA干扰实验。
(1)复苏HEK293细胞：
于液氮罐(-196℃)中取出冻存的细胞进行复苏，于37℃水浴中快速摇动融化后，加入10ml DMEM冲洗一次，1000rpm离心5min去除培养液；再加入5ml DMEM悬浮混匀后转入含10ml培养液的培养瓶中。平放于细胞培养箱中37℃，5％CO2复苏培养。不时观察细胞生长状态。
(2)细胞传代：
观察复苏五天的细胞，贴壁良好，形态饱满。丰度达到80％～90％以上，基本符合传代条件，即可传代。
将DMEM培养液，PBS，胰酶(1.5ml分装)于37℃预热；
将已经酸化的培养液倒掉(不要沿着细胞贴壁的一侧，防止将细胞冲掉)；
加入7ml PBS缓冲液冲洗细胞层表面，洗去细胞表层粘附的杂质和死去的细胞，(轻轻震荡均匀)倾出；
加入胰酶进行消化，使贴壁细胞层脱落。肉眼可以观察到大面积的细胞剥落现象。多次震荡使细胞与胰酶充分接触，可以手掌轻拍，以使细胞充分消化。观察到胰酶溶液渐渐浑浊，有许多悬浮小颗粒，即是消化下来的细胞。消化过程时间不可过长，一般消化时间为1分钟，以防造成细胞损伤。
迅速加入10ml DMEM培养液终止消化过程。以吸管反复吹打直至细胞悬液混合分散均匀。
将上述的细胞悬液转移至15ml离心管中，1000rmp，5min离心，可观察到白色细胞体沉淀于离心管底。弃去上层培养液，以10ml DMEM培养液重新悬起细胞，作为传代的细胞液。
准备大、小培养瓶各一个，分别装入18ml与7ml DMEM培养液待用。向两瓶中分别加入细胞悬液3ml与1ml，以吸管吹打均匀并且摇匀。每次吸取细胞悬液时要吹打均匀，以防细胞沉积。
显微镜下观察细胞分散状况，(注意防止出现细胞团)培养之前再次摇匀。拧松瓶口，于37℃，5％CO2条件下培养。
24h后观察传代后细胞的生长状态。约48小时以后即可达到丰度80％～90％，满足再次传代要求。
(3)细胞铺板
将传代过程中的细胞悬液，吸取1.5ml于12ml DMEM培养液中制备铺板细胞悬液。反复吹打使细胞分散均匀，以500ul/孔的量铺入24孔板中。每次吸取细胞悬液之前都要反复吹打，以保证吸取相同的细胞数量。记录铺板时间。
显微镜下观察铺板效果，若出现细胞聚集现象应轻轻摇动细胞板使其分散开来。于37℃，5％CO2条件下培养24小时待转染使用。
(4)细胞转染
(4-1)、转染前的准备工作：
质粒的稀释：
           原浓度      实验浓度     加入量/孔    每板用量
pRL-TK     226ng/ul    100ng/ul     0.5ul        12ul
pGL3-Rosa  406.25ng/ul 200ng/ul     0.5ul        12ul
pRL-TK取53ul加入67ul ddH2O，共120ul；
pGL3-Rosa取59ul加入61ul ddH2O，共120ul。
分装每管24ul待用。
每孔：50ul Opti-MEM中溶解pRL-TK、pGL3-Rosa各0.5ul，
每板用量：1.2ml Opti-MEM中溶解pRL-TK、pGL3-Rosa各12ul。
转染试剂：lipofectamine 2000 in Opti-MEM(1∶49)
每孔：1ul lipofectamine 2000溶解于49ul Opti-MEM中，
每板用量：24ul lipofectamine 2000溶解于1176ul Opti-MEM中。
为防止加入时损耗用量不够，每次配26孔用量。
siRNA：储存浓度20uM，设置浓度梯度，加入量0.5ul/孔。
(4-2)、转染步骤：
向1.2ml Opti-MEM中加入稀释好的质粒pRL-TK、pGL3-Rosa各12ul，vortex震荡，13000rpm离心，按照200ul/管的量分为六管(A1～A6)；
以2ul ddH2O代替siRNA加入A2～A6各管；A1作为空白对照。混匀，孵育5分钟；
向每管中加入200ul lipo-opti混合液，vortex震荡，13000rpm离心，孵育15分钟；
取出24孔板，(培养24小时，细胞丰度达到50％，即可转染)用枪头沿壁的一侧轻轻吸出DMEM培养液，枪头不要碰触细胞层。同时迅速加入500ul/孔Opti-MEM；
每孔加入97ul含有质粒、siRNA的转染试剂，轻柔摇匀，于37℃，5％CO2条件下培养4小时待补液。
4小时后，补加DMEM培养液。每孔加入1ml，37℃预热的DMEM培养液。注意沿壁，缓慢加入。于37℃，5％CO2条件下培养44小时后待双荧光素酶活性检测。
(5)细胞裂解液的制备和荧光检测
准备PLB溶液(储液为5x，以去离子水稀释至1x)待用；
以微量真空泵吸净每孔中的培养液，再以PBS清洗细胞表面，500ul/孔，轻柔震荡，1min后吸出；
加入1xPLB溶液，100ul/孔，于水平摇床上200rpm，震荡20min。此时可以观察到孔内出现白色絮状沉淀；
20min后，分别吸取24孔中的溶液于对应的24个EP管中，注意管号和其中的样品名称的对应；
13000rpm离心1min，吸取上清液到新的EP管中，保存，待荧光检测。
将预先浸泡在75％酒精中的96孔板取出，用蒸馏水反复冲洗干净，控干水待用，按照细胞板对应编号将各孔中的细胞裂解液20ul分别加入96孔板的各孔内。预先避光融化两种检测液——Fassy Reagent I(含有萤火虫荧光素酶底物)和Rassy ReagentII(含有海肾荧光素酶底物)。检测时，首先迅速加入避光融化的Fassay Reagent I 100ul，检测荧光值，得到fireflyluciferase荧光数值；再迅速加入Rassay Reagent II 100ul，淬灭firefly luciferase荧光的同时得到Renilla luciferase活性数据。对所得数据进行处理，能够得到靶向萤火虫荧光素酶siRNA干扰firefly luciferase表达的情况。结果如图7所示。
P/N(ratio)＝[D(firefly)/D(renilla)+C(firefly)/C(renilla)]/[B(firefly)/B(renilla)+A(firefly)/A(renilla)]
firefly和renilla为双荧光检测体系的两种荧光素酶，ABCD为检测的四组不同参数。其中，A、B为两组空白试验，即两组独立的不加RNA的HEK293细胞生长结果。C、D为两组独立的加入RNA的HEK293细胞生长结果。
如图7所示，单双端交联的RNA均有较好的干扰活性。其中hpRNA的活性较天然siRNA更高，双交联dbRNA有一定程度降低。为证明修饰后的RNA在细胞内具有更长的活性时间，发明人将实验时间由48小时延长至4天，结果显示，hpRNA和dbRNA的干扰活性均比siRNA保持的时间更长，hpRNA最佳。上述结果表明，本发明对siRNA的一端或两端进行交联基本上不会影响RNA的干扰活性，并对活性起到延长作用。
制备实施例7
该制备实施例用于制备发卡型DNA(hpODN)，即一端交联的DNA复合分子、以及哑铃型DNA(dbODN)，即两端交联的DNA复合分子。
(1)交联核酸的序列设计：
如上所示为交联实验的核酸序列，其中左边的灰色部分为核因子N F-κB的结合序列，右边的灰色区域为核酸内切酶EcoRI的识别序列。
S为巯基修饰，修饰方法为购买商品化试剂Thiol-Modifier C6S-S(Glenresearch：10-1936-xx)。其结构式为
Figure BSA00000317713300281
可经固相核酸合成仪引入核酸的3’位或5’位末端。
DNA合成使用Expidite 8909核酸合成仪。CPG采用VitroBio生产的Universal CPG，脱除CPG及保护基的条件为55℃下，4N氨气的甲醇溶液中孵育15小时。核酸粗品纯化采用12％变性丙烯酰胺凝胶电泳。
(2)发卡型核酸(hpODN)的合成路线及操作(反应式IX)：
反应式IX
(2-1)经合成仪合成的修饰核酸A，其3’位为含有S-S基团的修饰单元，经TCEP还原生成活性巯基，得到核酸B。TCEP还原反应操作如下：加入400μl 3％TCEP水溶液至核酸固体粉末中；振荡样品管至固体全部溶解；将样品管放入摇床室温下反应1小时；加入150μl 9.5M乙酸铵溶液，混匀；加入1.5ml无水乙醇，混匀；-80。℃下冷冻沉淀至少20分钟；样品转至4℃离心机，13,000RPM离心15分钟；小心将上清液转移到2ml离心管中并保存；SpeedVac将固体样品旋干。
(2-2)得到核酸B后，通过迈克尔加成反应修饰上dimmer b(制备实施例1制备)，其操作为：
将dimmer b溶于5‰Et3N/CH3OH制成饱和溶液，用此溶液溶解核酸干粉固体。由于DNA在甲醇中有一定的溶解性，所以足量的溶液可将核酸固体溶解为均一反应液。将该反应管放入37℃摇床反应5小时后，OMEGAMICROSEP 3K(PALL)过滤反应液，脱除剩余小分子，滤膜上的产物C用甲醇和ddH2O洗涤。加入适量的ddH2O溶解、收集产物C，260nm波长下测定样品浓度。
(2-3)得到核酸C后，将其与等当量的核酸D(25nmol)混合配制成100mM MOPS-NaOH buffer(pH8.0)，含1M NaCl缓冲液，双链核酸浓度为10μM。先将该反应液放入烘箱90℃加热1分钟后，停止加热，退火至室温，该过程经4小时完成。退火后的反应液继续37℃下孵育10小时，孵育过程中每隔一小时取少量样品变性冷冻。产物经OMEGA MICROSEP 3K(PALL)脱盐后，15％变性丙烯酰胺凝胶电泳分析并纯化，结果如图7所示。
(3)哑铃型核酸(dbODN)的合成路线及操作(反应式X)：
反应式X
(3-1)构建dbODN过程中，TCEP的还原及dimmer b修饰的操作与hpODN中的方法一致。
(3-2)将等当量的核酸G、H(10nmol)混合配制成100mM MOPS-NaOHbuffer(pH8.0)，含1M NaCl缓冲液，双链核酸浓度为0.5μM。先将该反应液放入烘箱90℃加热1分钟后，停止加热，退火至室温，该过程经4小时完成。退火后的反应液继续37℃下孵育2小时。产物经OMEGA MICROSEP3K(PALL)脱盐后，15％变性丙烯酰胺凝胶电泳分析并纯化，结果如图8所示。
如图8所示，为15％变性凝胶电泳结果。a)为hpODN的反应结果，其中1、2为修饰核酸D、C，3-6为单交联产物，3为退火后的产物，4、5、6分别为退火后孵育1、2、10小时后的产物，7为与产物等长的标记用核酸。该结果证明，交联反应在退火后即已反应完全，说明该迈克尔加成反应体系在核酸修饰中的反应活性很高。B)为dbODN的反应结果，其中8、9为修饰核酸H、G，10为退火后的双交联产物，11为未经退火，仅将H、G等当量混合(0.5μM)，37℃下孵育5小时后的反应结果，12为与产物等长的标记用核酸。该结果证明，通过控制反应液中的核酸浓度，可有效避免多聚产物的生成，得到目的dbODN。在对hpODN和dbODN产物进行切胶纯化后，MALDI-TOF MS结果为：hpODN，[M+Na]+：calc.16926，found.16946(图16).dbODN，[M+Na]+：calc.17424，found.17442(图17).
实验实施例6
该实施例用于说明制备实施例7制得的交联产物的圆二色谱。
圆二色谱是一种特殊的吸收谱，它对手性分子的构象十分敏感，因此它是最重要的光谱实验之一。手性是物质结构中的重要特征，手性分子都具有光学活性。当单色左旋与右旋的圆偏振光通过某一种手性样品时，该样品对左、右旋圆偏振光的吸收不同，这叫做圆二色性。其差值ΔA＝ΔAL-ΔAR称为圆二色值，按波长扫描就得到了圆二色谱(CD谱)。
CD谱可用来研究DNA的B型双螺旋结构，有报道证明，26个碱基长度左右的天然双链DNA的CD谱图中，波峰出现在273nm，波谷出现在248nm，波线与横坐标的相交范围在252到258nm之间。如图9所示，制备实施例7制得的修饰交联的核酸hpODN与dbODN均满足以上特征，且谱线趋势与天然双链contODN完全一致。由此说明，本发明的修饰方法不会对DNA的B型双螺旋结构造成影响。
实验实施例7
该实施例用于说明制备实施例7制得的交联产物的交联产物的热稳定性。
热稳定性研究通过熔链温度的测定对比。测定采用CARY 100 Bio(Varian，USA)紫外仪，波长260nm。测量用核酸样品浓度为3μM，缓冲液为10mM二甲砷酸钠(pH7.0)，100mM NaCl。测试升温速率为0.5deg/min。
图10、11和12分别表示contODN、hpODN和dbODN的热稳定性测定结果，可以看出，本发明提供的修饰交联可有效的提高核酸的热稳定性，双交联dbODN的效果尤为明显。
实验实施例8
该实施例用于说明制备实施例7制得的交联产物的EcoRI酶切实验。
EcoRI酶切实验操作：
EcoRI(TaKaRa)：50units/μl.
储存缓冲液：10mM Tris-HCl
100mM KCl
0.1mM EDTA
1mM DTT
0.15％ Trton X-100
0.01％BSA
50％Glycerol(pH7.5)
反应混合比例：EcoRI                                1μl
              10×H Buffer                         2μl
              Substrate DNA                      ＜1μg
              Sterilized distilled water    up to 20μl
反应温度：37℃
反应时间：3h
EcoRI酶切实验结果如图13所示。
如图13所示，13、15、17分别代表contODN、hpODN和dbODN，14、16、18分别代表contODN、hpODN和dbODN被EcoRI的切割产物。结果证明，hpODN和dbODN均可被EcoRI有效地切割。再次说明该修饰方法不会对DNA的B型双螺旋结构造成影响，不影响酶的识别。
制备实施例8
按照与制备实施例7相同的方法制备发卡型DNA(hpODN)，即一端交联的siRNA复合分子，不同的是，用制备实施例2中制得的dimmer ben代替dimmer b，制得hpODN ben；用制备实施例3中制得的dimmer CH2-2代替dimmer b，制得hpODN CH2-2。
实验实施例9
按照与实验实施例7相同的方法测定制备实施例8制得的hpODN ben和hpODN CH2-2的热稳定性。
图14和15分别表示hpODN ben和hpODN CH2-2的热稳定性，可以看出，hpODN ben的Tm为74℃，hpODN CH2-2的Tm为76℃，与contODN相比均明显提高。

Claims (11)

1.一种复合分子，该复合分子含有两条至少80％互补的核酸链X1和X2，X1的5’端与X2的3’端通过连接基团L1连接和/或X2的5’端与X1的3’端通过连接基团L2连接，其特征在于，所述连接基团L1和L2各自独立地如式1所示：
-R1-S-R2-S-R3-
式1
在式1中，R1和R3各自独立地表示碳原子数为1-20的任选取代的亚烷基；
R2如式2、式3或式8所示：
Figure FSA00000317713200011
式2
式3
Figure FSA00000317713200013
式8
在式2、式3或式8中，R4表示碳原子数为1-20的任选取代的亚烷基或碳原子数为6-20的任选取代的亚芳基；
R5和R14各自独立地表示氢或碳原子数为1-20的任选取代的烷基；
R6、R7、R8和R9各自独立地表示单键、氢、卤素或碳原子数为1-20的任选取代的烷基，并且R6、R7、R8和R9中的一者表示单键，剩余的三者中的至少一者为氢，并且当剩余的三者中的一者为氢时，氢和单键不位于同一个碳原子上；
R10、R11、R12和R13各自独立地表示单键、氢、卤素或碳原子数为1-20的任选取代的烷基，并且R10、R11、R12和R13中的一者表示单键，剩余的三者中的至少一者为氢，并且当剩余的三者中的一者为氢时，氢和单键不位于同一个碳原子上。
2.根据权利要求1所述的复合分子，其中，R2如式3所示。
3.根据权利要求1或2所述的复合分子，其中，R4表示碳原子数为1-20的亚烷基。
4.根据权利要求3所述的复合分子，其中，R4表示碳原子数为1-6的亚烷基。
5.根据权利要求1或2所述的复合分子，其中，R1和R3各自独立地表示碳原子数为1-10的亚烷基。
6.根据权利要求1或2所述的复合分子，其中，核酸链X1和X2为DNA链或RNA链，核酸链X1或X2具有15-50个碱基。
7.复合分子的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)提供包括至少80％互补的第一修饰核酸链和第二修饰核酸链的双链核酸，其中第一修饰核酸链的5’端具有基团-R19-SH且第二修饰核酸链的3’端具有基团-R20-SH，并且第二修饰核酸链的5’端具有基团-R21-SH且第一修饰核酸链的3’端具有基团-R22-SH，其中，R19、R20、R21和R22各自独立地表示碳原子数为1-20的任选取代的亚烷基；
(2)提供式4、式5或式9所示的化合物；
(3)将所述双链核酸与式4、式5或式9所示的化合物进行迈克尔加成反应，
式4
Figure FSA00000317713200032
式5
Figure FSA00000317713200033
式9
在式4、式5或式9中，R4表示碳原子数为1-20的任选取代的亚烷基或碳原子数为6-20的任选取代的亚芳基；
R5和R14各自独立地表示氢或碳原子数为1-20的任选取代的烷基；
R15和R16各自独立地表示氢、卤素或碳原子数为1-20的任选取代的烷基；
R17和R18各自独立地表示氢、卤素或碳原子数为1-20的任选取代的烷基。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其中，在步骤(3)中，迈克尔加成反应的条件包括：在碱性催化剂的存在下，在反应介质中进行，双链核酸与式4或式5所示的化合物的摩尔比为1∶500-2000，双链核酸在反应介质中的浓度为20-200μmol/L，反应温度为10-60℃，反应时间为1-10小时。
9.复合分子的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)提供至少80％互补的第一修饰核酸链和第二修饰核酸链，其中第一修饰核酸链的5’端具有基团-R19-S-R21且第二修饰核酸链的3’端具有基团-R20-S-R22，其中，R19和R20各自独立地表示碳原子数为1-20的任选取代的亚烷基，R21和R22中的一者表示氢并且另一者如式6、式7、式10或式11所示；
(2)将第一修饰核酸链和第二修饰核酸链进行退火并进行迈克尔加成反应，
Figure FSA00000317713200051
式6
Figure FSA00000317713200052
式7
Figure FSA00000317713200053
式10
Figure FSA00000317713200054
式11
在式6、式7、式10或式11中，R4表示碳原子数为1-20的任选取代的亚烷基或碳原子数为6-20的任选取代的亚芳基；
R5和R14各自独立地表示氢或碳原子数为1-20的任选取代的烷基；
R23和R24中的一者表示单键并且另一者表示氢、卤素或碳原子数为1-20的任选取代的烷基；
R25和R26各自独立地表示氢、卤素或碳原子数为1-20的任选取代的烷基。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其中，在步骤(2)中，迈克尔加成反应的条件包括：在碱性催化剂的存在下，在反应介质中进行，第一修饰核酸链和第二修饰核酸链中的任一者在反应介质中的浓度为20-200μmol/L，反应温度为10-60℃，反应时间为1-10小时。
11.一种药物组合物，该药物组合物含有权利要求1-6中的任意一项所述的复合分子作为活性成分。
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