WO2009012741A1 - Verfahren zur synthese von a-ring-aromatisierten acetyl-minocyclinen - Google Patents

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WO2009012741A1
WO2009012741A1 PCT/DE2008/001055 DE2008001055W WO2009012741A1 WO 2009012741 A1 WO2009012741 A1 WO 2009012741A1 DE 2008001055 W DE2008001055 W DE 2008001055W WO 2009012741 A1 WO2009012741 A1 WO 2009012741A1
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minocycline
acetyl
formula
ring
reaction
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PCT/DE2008/001055
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Peter Lorenz
Peter Kreutzmann
Fritz Rothe
Jens Martens-Lobenhoffer
Harry Schmidt
Gerald Wolf
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Otto-Von-Guericke Universität Magdeburg Medizinische Fakultät
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C231/00—Preparation of carboxylic acid amides
    • C07C231/02—Preparation of carboxylic acid amides from carboxylic acids or from esters, anhydrides, or halides thereof by reaction with ammonia or amines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2603/00—Systems containing at least three condensed rings
    • C07C2603/02—Ortho- or ortho- and peri-condensed systems
    • C07C2603/40—Ortho- or ortho- and peri-condensed systems containing four condensed rings
    • C07C2603/42—Ortho- or ortho- and peri-condensed systems containing four condensed rings containing only six-membered rings
    • C07C2603/44—Naphthacenes; Hydrogenated naphthacenes

Definitions

  • the invention relates to a process for the synthesis of A-ring-flavored acetyl-minocycline.
  • Minocycline is a broad-spectrum semisynthetic antibiotic from the tetracyclines group, which has been used in clinical practice for many years for the treatment of infectious diseases of the respiratory, urogenital and gastrointestinal tract in various skin diseases, such as acne vulgaris, rosacea, as well as with trachoma, clamydia-conjunctivitis, borreliosis and others is used.
  • Minocycline inhibits protein biosynthesis by binding to the 30S ribosomal subunit, thereby preventing the access of aminoacyl-t-RNA to the RNA-ribosome complex and thereby lengthening the peptide chain.
  • minocycline In addition to the already known antibiotic effect of minocycline, another biological effect of the substance has recently come into the focus of research. Initial studies indicate that minocycline appears to have a protective effect on various inflammatory processes and neurodegenerative diseases (Yong, VW, Wells, J., Giuliani, F., Casha, S., Power, C., and Metz, LM (2004) promise of minocycline in neurology, Lancet Neurol 3, 744-751).
  • minocycline is currently being proposed for the clinical treatment of progressive inflammatory processes, such as inflammatory rheumatoid arthritis (Fürst, DE (1998), Update on clinical trials in the rheumatic diseases (Curr Opin Rheumatol 10, 123-128).
  • Inflammatory processes play a major role in the pathogenesis of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, multiple sclerosis and post-traumatic brain and spinal cord injuries.
  • the document DE 38 81 024 T2 discloses a process for the preparation of tetracycline derivatives, such as.
  • Minocycline which is multi-stage, using the use of catalysts on a support using organic solvent and pressure, wherein only the dehalogenation and hydrogenation in one step be performed.
  • the document WO 2005/070878 discloses A-ring-flavored tetracycline derivatives and a process for their preparation.
  • the preparation of A-ring-flavored tetracyclines, as described in this disclosure, is possible in principle, but requires several reaction stages and a complicated purification of the reaction products by preparative HPLC, which for an industrial and thus profitable recovery of the active ingredients, e.g. in grams or kilograms, unsuitable.
  • minocycline Due to the biological and pharmacological effects found, the use of minocycline for the treatment of neurodegenerative diseases is very interesting. The study of minocycline as a lead structure represents an attractive approach in the search for neuroprotective agents.
  • the 'prodrug' concept is known to the skilled person as a method to chemically modify hydrophilic drug molecules so that on the one hand increases their lipophilicity and thus the capacity of membranes, on the other hand, the actual drug molecules only from a precursor ('prodrug') in the cells are formed.
  • the precursor ('prodrug') serves as a transporter ('carrier').
  • a 'prodrug' is by definition a substance or a drug that is not pharmacologically or metabolically active without metabolism and is converted into an active substance only through the metabolism in the body.
  • 'Prodrugs' are of strategic importance in those cases in which the actual active ingredient only slightly and less selectively reaches the site of action.
  • the 'prodrug' concept aims to improve the pharmacokinetic properties of the drug molecules, e.g. to improve their absorbability / bioavailability or to facilitate the blood-brain barrier mobility in the case of a psychotropic drug or neuroprotective agent.
  • hydrophilic active ingredient molecules such as minocycline
  • hydrophilic active ingredient molecules such as minocycline
  • OH free hydroxyl
  • NH 2 amino
  • One way of lowering their polarity is to introduce apolar protective groups.
  • the acetyl group (CH 3 CO) which after cleavage in the cells forms free acetic acid, which is a natural metabolite of the cell metabolism, has proven to be an apolar protective agent ('prodrug moiety'). Both OH and NH 2 groups can be masked by acetyl groups.
  • the polarity of the acetylated molecules is similar to that of biological membranes, whereby a stronger interaction with lipids and thus increased diffusion into the tissue is achieved. FCarrier 'effect).
  • the acetyl groups are cleaved off by non-specific esterases, whereby the actual drug molecule is released endogenously and can take action here.
  • the 'prodrug' also represents a sustained release form of the drug molecule which implies a sustained release and more favorable pharmacological behavior.
  • the object of the present invention is to obviate the drawbacks of the prior art by providing a low cost process for the preparation of A-ring aromatized acetyl-minocyclines of formula I which is also feasible on an industrial scale.
  • the invention proposes to carry out a single or multiple acetylation of the lead structure with simultaneous elimination of water and aromatization of the A-ring in one step in order to arrive at a neuroprotective agent.
  • an equimolar excess of acetic anhydride or organic proton scavenger is preferably used, these being simultaneously solvents for the minocycline hydrochloride.
  • equimolar amounts of the educts corresponding to the number of acetyl groups to be introduced, reduced amounts of acetic anhydride and proton scavengers optionally having to be replaced by an inert solvent.
  • Suitable inert solvents for the educts are, for example, chloroform, methylene chloride, nitromethane, acetonitrile, acetone, sulfolane, dimethylformamide or dimethyl sulfoxide.
  • organic proton scavenger is preferably used pyridine, wherein the reaction in a temperature range of 4 to 100 0 C, more preferably at 75 0 C or below the boiling temperature of
  • pyridine instead of pyridine, it is also possible to use other proton scavengers, such as, for example, primary, secondary or tertiary amines or carboxylic acid amides.
  • proton scavengers such as, for example, primary, secondary or tertiary amines or carboxylic acid amides.
  • the reaction is usually carried out at atmospheric pressure while stirring the reaction mixture. It uses a glass Reaction Appartur with reflux condenser, resulting solvent vapors are condensed and recycled continuously into the reaction mixture.
  • the erfmdungswashe method can also be carried out under reduced or elevated pressure.
  • the application of increased pressure is particularly indicated when the Reaction at a temperature Wegbuchen, in which the solvent is boiling under atmospheric pressure.
  • Pentaacetylcyclin A-ring aromatized pentaacetyl-minocycline
  • Tetraacetylcyclin (A-ring-flavored tetraacetyl-minocycline) are obtained, which are not previously published.
  • Figure 1 shows an example of the LC (HPLC) chromatogram and the corresponding mass spectra of the two main components of a
  • the selectivity for the corresponding target product can be further increased, thereby simplifying or unnecessary cleaning steps described below.
  • the VLC method can also be carried out on an industrial scale.
  • the reaction mixture is preferably added to a with petroleum benzine (boiling range: 40 - 60 0 C) or another hydrocarbon, such as n-pentane, n-hexane, cyclohexane or isobutane preconditioned carrier material which is in a Buchner funnel with frit bottom, a Chromatography column or a hanging vessel with sieve bottom is located.
  • VLC vacuum-train
  • overpressure the eluent is now passed through the support material (stationary phase).
  • the elution of the target compounds is then carried out by giving a solvent gradient mixture consisting of a hydrocarbon and a carboxylic acid ester, wherein increasing the polarity of the mixture by higher levels of the carboxylic acid ester during the elution.
  • a mixture of petroleum benzine and ethyl acetate is particularly preferably used for the elution of the target compounds.
  • eluent mixtures of hydrocarbons with other carboxylic acid esters such as methyl formate, n-butyl acetate or dimethyl carbonate can be used.
  • pentaacetylcycline (A-ring-aromatized pentaacetyl-minocycline of the formula II) and tetraacetylcyclin (A-ring-aromatised tetraacetyl-minocycline of the formula IV) which are exemplified below and prepared by the process according to the invention were prepared by mass spectroscopy (LC / MS , HR / MS), UV / VIS spectroscopy and characterized by 1 H and 13 C NMR.
  • Figure 2 shows by way of example the UV / VIS spectra of both substances mentioned above and Figure 3 the 1 H-NMR of tetraacetylcycline of formula IV.
  • the testing of the cell protecting properties of the substances represented by the method according to the invention was carried out, for example, on purely represented pentaacetylcycline of the formula II, with Help of an astrocyte damage model.
  • This model is used for the investigation of oxidative stress-mediated neurodegenerative diseases or for the testing of cell-protecting substances with which such damage can be prevented or reduced.
  • astrocytes are damaged by means of hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) and then the functionality and morphology of the cells and mitochondria are assessed microscopically.
  • H 2 O 2 reactive oxygen species
  • ROS reactive oxygen species
  • Pentaacetylcycles were carried out using an E. co / ⁇ strain (Example 4). Pentaacetylcyclin has no antibiotic effect in comparison to the minocycline hydrochloride, which surprisingly a further desired biological effect was achieved.
  • Fig. 1 Chromatogram of an LC / MS analysis of the reaction mixture according to the invention before
  • Fig. 2 UV / VIS spectra of pentaacetylcycline (A) and tetraacetylcycline (B), prepared according to the inventive method, and
  • FIG. 3 1 H-NMR spectrum of tetraacetylcycline (in DMSO-d6) prepared according to the process of the invention, wherein (A) represents an enlarged representation of the range from 2.0 to 3.6 ppm.
  • Minocycline hydrochloride (0.60 g; 1.215 mmol) was added under ice-cooling (4 0 C) in 12 ml of pyridine (11.73 g; 148.37 mmol) and then, with stirring, 12 ml of acetic anhydride added (12.98 g, 127.18 mmol). The mixture was then stirred for 30 minutes at 4 0 C, 2 hours at room temperature and for 30 minutes at 75 0 C. The purification of the reaction product was carried out by vacuum liquid chromatography (VLC). By Silica gel 60 (75 g) compressed in a sintered glass funnel under vacuum draw and with petroleum spirit (boiling range: 40 - 60 0 C) preconditioned.
  • VLC vacuum liquid chromatography
  • the reaction mixture was loaded onto the chromatographic column thus prepared and eluted with a petroleum benzine / ethyl acetate gradient (4/1, vol / vol to 100% EtOAc). Fractions containing the reaction product were pooled. After distilling off the solvent on a rotary evaporator, a residue (518.5 mg) was obtained, which was recrystallized from an ethyl acetate / petroleum benzine mixture and finally gave the almost pure pentaacetylcycline as a light yellow solid. The crude yield was 237.5 mg. For final cleaning, the product was subjected to another VLC. The pure yield was 181.9 mg (23% of theory).
  • the analytical control of the respective fractions was carried out by thin layer chromatography (TLC with fluorescence indicator, Polygram SIL G / UV 254 , Macherey & Nagel) with silica gel 60 as the stationary phase and Petroleum benzine / ethyl acetate (1/3, vol / vol) as the mobile phase.
  • TLC with fluorescence indicator Polygram SIL G / UV 254 , Macherey & Nagel
  • silica gel 60 as the stationary phase
  • Petroleum benzine / ethyl acetate (1/3, vol / vol) as the mobile phase.
  • Stock solutions of the substance in DMSO were prepared, using Nalgene nylon filters (0.22 um pore size) sterilized by filtration and stored until use at -20 0 C.
  • Tetraacetylcyclin was isolated as a by-product from the reaction mixture described in the exemplary embodiment chromatographically and then from the corresponding fraction, after distilling off the solvent and recrystallization from a petroleum benzine / ethyl acetate mixture, pure. Due to the bathochromic shift of the UV band over that of the pentaacetyl cyclic compound of the formula II, the enol form, corresponding to formula IV, is the most probable ( Figure 2). The other (non-enolic) OH or the NH 2 groups in the minocycline have a higher basicity and are therefore preferably acetylated. The 1 H NMR spectrum ( Figure 3) supports structural proof. Analytical Data Tetraacetylcyclin (A-ring flavored tetraacetyl-minocycline):
  • the culture medium used in each case was 2 ml of DMEM (PAA Laboratories GmbH Pasching, Austria) and the seed density was 0.3 ⁇ 10 6 cells / 2 ml.
  • the cell cultures were initially incubated with different concentrations (1.0, 5.0 and 25.0 ⁇ M) minocycline hydrochloride or pentaacetylcycline (formula II) for 30 minutes preincubated.
  • the untreated control used was the sole addition of the solvent DMSO (2 ⁇ l / culture dish) under identical incubation conditions. Thereafter, the addition of 1, 0 or 3.0 mM H 2 O 2 (final concentration) and a further incubation for 2 hours.
  • Untreated control cells are presented as polygonal cell bodies with 2-3 elongated processes and appear as a cellular network when the cell density is sufficient. Filiform mitochondria are distributed in the cytoplasm right down to the cell processes. After 2 hours of incubation with 1 mM H 2 O 2 (without minocycline or pentaacetylcycline), the majority of the cells are damaged and show a marked retraction of their processes. As a result, the cell bodies lose their polygonal shape and tend to round off. As a result of fission, the mitochondria are severely shortened and are deployed in the direction of the nucleus. With 3 mM H 2 O 2 , these cell-damaging processes are amplified.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von A-Ring-aromatisierten Acetyl-Minocyclinen. Die Aufgabe der Erfindung, ein aufwandgeringes Verfahren zur Herstellung von A-Ring-aromatisierten Acetyl-Minocyclinen der Formel (I), wobei R1 bis R5 = Acetyl und/oder H sind, bereitzustellen, das auch in industriellem Maßstab durchführbar ist, wird dadurch gelöst, dass Minocyclinhydrochlorid mit Acetanhydrid in Gegenwart eines Protonenfängers umgesetzt, das Reaktionsprodukt einer chromatographischen Aufreinigung unter Verwendung eines Trägermaterials und eines Eluenten unterworfen, der Eluent abdestilliert und das Produkt anschließend durch Umkristallisation gereinigt wird.

Description

Verfahren zur Synthese von A-Ring-aromatisierten Acetyl-Minocyclinen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Synthese von A-Ring- aromatisierten Acetyl-Minocyclinen.
Minocyclin (siehe Formel III) ist ein semisynthetisches Breitband- Antibiotikum aus der Gruppe der Tetracycline, welches seit vielen Jahren in der klinischen Praxis zur Behandlung von infektiösen Erkrankungen der Atemwege, des Urogenital- und Gastrointestinaltraktes, bei verschiedenen Hauterkrankungen, wie Akne vulgaris, Rosacea, sowie bei Trachom, Clamydien-Conjunctivitis, Borreliose u.a. eingesetzt wird.
Minocyclin hemmt die Proteinbiosynthese durch Bindung an die ribosomale 30S-Untereinheit, wodurch der Zugang von Aminoacyl-t- RNS zum RNS-Ribosomen-Komplex und damit die Verlängerung der Peptidkette verhindert wird.
Neben der bereits bekannten antibiotischen Wirkung von Minocyclin rückte kürzlich ein anderer biologischer Effekt der Substanz in den Blickpunkt der Forschung. Erste Untersuchungen zeigen, dass Minocyclin offenbar einen schützenden Effekt bei verschiedenen Entzündungsprozessen und neurodegenerativen Erkrankungen hat (Yong, V.W., Wells, J., Giuliani, F., Casha, S., Power, C, and Metz, L.M. (2004). The promise of minocycline in neurology. Lancet Neurol 3, 744-751).
So wird Minocyclin gegenwärtig zur klinischen Behandlung fortschreitender Entzündungsprozesse, wie z.B. inflammatorischer rheumatoider Arthritis vorgeschlagen (Fürst, D.E. (1998). Update on clinical trials in the rheumatic diseases. Curr Opin Rheumatol 10, 123- 128). Entzündungsprozesse spielen eine große Rolle in der Pathogenese von neurodegenerativen Erkrankungen, wie der Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Multipler Sklerose sowie bei posttraumatischen Hirn- und Rückenmarksverletzungen. Die Schrift DE 38 81 024 T2 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von Tetracyclinderivaten, wie bspw. Minocyclin, dass mehrstufig ist, unter dem Einsatz von Katalysatoren auf einem Träger unter Verwendung von organischem Lösungsmittel und Druck abläuft, wobei lediglich die Enthalogenierung und Hydrierung in einem Schritt durchgeführt werden.
Der Nachteil dieses Herstellungsverfahrens ist, dass es aufwendig und damit sehr kostenintensiv ist. Darüber hinaus werden bei dem Verfahren u.a. selenhaltige Legierungen als Katalysator eingesetzt.
Die Schrift WO 2005/070878 offenbart A-Ring-aromatisierte Tetracyclinderivate und ein Verfahren zu deren Herstellung. Die Herstellung von A-Ring-aromatisierten Tetracyclinen, wie sie in dieser Offenlegung beschrieben ist, gelingt prinzipiell, setzt jedoch mehrere Reaktionsstufen und eine aufwendige Reinigung der Reaktionsprodukte durch präparative HPLC voraus, welche für eine industrielle und somit rentable Gewinnung der Wirkstoffe, z.B. im Gramm- oder Kilogramm-Maßstab, ungeeignet ist.
Aufgrund der gefundenen biologischen und pharmakologischen Wirkungen ist die Verwendung von Minocyclin zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen sehr interessant. Die Untersuchung von Minocyclin als Leitstruktur stellt dabei einen attraktiven Ansatz bei der Suche nach neuroprotektiven Wirkstoffen dar.
Eine Optimierung und Verbesserung der Minocyclin-Leitstruktur ist dabei in zwei Richtungen möglich:
1. Verbesserung der Pharmakokinetik, z.B. durch Realisierung eines 'Prodrug'-Konzeptes.
2. Aufhebung der antibiotischen Aktivität, wenn diese für die Wirkung als neuroprotektive Substanz nicht relevant ist, um einen Selektionsdruck auf Mikroorganismen in Richtung einer Resistenzentwicklung auszuschließen. Das 'Prodrug' -Konzept ist dem Fachmann als Methode bekannt, um hydrophile Wirkstoffmoleküle chemisch so zu verändern, dass sich zum einen ihre Lipophilie und damit die Aufnahmefähigkeit durch Membranen erhöht, zum anderen die eigentlichen Wirkstoffmoleküle erst aus einer Vorstufe ('Prodrug') in den Zellen gebildet werden. Hierbei dient die Vorstufe ('Prodrug') u.a. als Transporter ('Carrier').
Eine 'Prodrug' ist per Definition ein Stoff bzw. ein Medikament, das ohne Verstoffwechselung pharmakologisch nicht oder wenig wirksam ist und erst durch die Verstoffwechselung im Körper in einen aktiven Wirkstoff überfuhrt wird. 'Prodrugs' sind in denjenigen Fällen von strategischer Bedeutung, in denen der eigentliche Wirkstoff nur geringfügig und wenig selektiv den Wirkort erreicht. Das 'Prodrug '-Konzept zielt dabei auf eine Verbesserung der pharmakokinetischen Eigenschaften der Wirkstoffmoleküle ab, um z.B. deren Resorbierbarkeit/Bioverfügbarkeit zu verbessern oder bei einem Psychopharmakon bzw. Neuroprotektivum die Blut-Hirn-Schranken- Gängigkeit zu ermöglichen.
Hydrophile Wirkstoffmoleküle, wie Minocyclin besitzen aufgrund von freien Hydroxyl(OH)- bzw. Amino(NH2)-Gruppen oftmals zwar eine gute Wasserlöslichkeit, was ihre pharmazeutische Formulierbarkeit begünstigt, sind aber relativ schlecht membrangängig. Eine Möglichkeit der Senkung ihrer Polarität ist die Einfuhrung von apolaren Schutzgruppen. Als apolare Schutzgruppe (engl, 'prodrug moiety') hat sich die Acetyl-Gruppe (CH3CO) bewährt, die nach Abspaltung in den Zellen freie Essigsäure bildet, welche einen natürlichen Metaboliten des Zellstoffwechsels darstellt. Sowohl OH- als auch NH2-Gruppen lassen sich durch Acetyl-Gruppen maskieren. Die Polarität der acetylierten Moleküle ist ähnlich der biologischer Membranen, wobei eine stärkere Wechselwirkung mit Lipiden und somit erhöhte Diffusion in das Gewebe erreicht wird fCarrier'-Effekt). Nach Aufnahme der acetylierten 'Prodrug' in die Zellen werden die Acetyl- Gruppen durch unspezifische Esterasen abgespalten, wodurch das eigentliche Wirkstoffmolekül endogen freigesetzt wird und hier in Aktion treten kann. Die 'Prodrug' stellt außerdem eine Retardform des Wirkstofftnoleküls dar, die eine verzögerte Freisetzung und ein günstigeres pharmakologisches Verhalten impliziert.
In der Literatur sind bisher nur wenige vom Minocyclin abgeleitete neuroprotektive Wirkstoffmoleküle beschrieben, die zwar den Naturstoff zum Vorbild haben, mit denen jedoch bisher kein 'Prodrug'-Konzept verfolgt wird [Wang, R., Du, Y., and Liu, Zhou, Z., Wang, H., Wang, X., (J. (2004). Synthesis and neuroprotective activity of novel C4, C7 derivates in tetracycline series. J Chin Pharm Sei 13, 217-220].
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Nachteile des Standes der Technik zu vermeiden, in dem ein aufwandgeringes Verfahren zur Herstellung von A-Ring-aromatisierten Acetyl- Minocyclinen der Formel I bereitgestellt wird, das auch in industriellem Maßstab durchführbar ist.
Hierzu wird erfindungsgemäß vorgeschlagen, eine Ein- oder Mehrfach- Acetylierung der Leitstruktur unter gleichzeitiger Wasserabspaltung und Aromatisierung des A-Ringes in einem Schritt durchzuführen, um zu einem neuroprotektiven Wirkstoff zu gelangen.
Dabei zeigt sich überraschenderweise, dass durch eine Einstufen- Reaktion von Minocyclinhydrochlorid mit Essigsäureanhydrid (Acetanhydrid) in Gegenwart eines organischen Protonenfängers A-Ring-aromatisierte ein- oder mehrfachacetylierte Minocycline der Formel I (wobei R1 bis R5 = Acetyl und / oder H sind) durch Acetylierung von Minocyclinhydrochlorid, die präparative chromatographische Aufreinigung bzw. Trennung der Reaktionsprodukte und die anschließende weiterführende Reinigung durch Umkristallisation der entsprechenden Produkte aus einem Ethylacetat / Petroleumbenzin-Gemisch erhalten werden.
Solche A-Ring-aromatisierten Acetyl-Minocycline der Formel I (mit R1 bis R5 = Acetyl und/oder H) setzen nach Verstoffwechselung im Organismus A-Ring-aromatisiertes Minocyclin der Formel I (mit R1 bis R5 = H) frei, welches eine zell- bzw. neuroprotektive, jedoch keine antibiotische Wirkung mehr aufweist.
Die Herstellung von ein- oder mehrfachacetylierten A-Ring- aromatisierten Minocyclinen der Formel I (wobei R1 bis R5 = Acetyl und
/ oder H sind) erfolgt durch die Reaktion von Minocyclinhydrochlorid mit Acetanhydrid in Gegenwart eines organischen Protonenfängers.
Dabei wird vorzugsweise ein äquimolarer Überschuss an Acetanhydrid bzw. organischem Protonenfänger verwendet, wobei diese gleichzeitig Lösungsmittel für das Minocyclinhydrochlorid sind.
Genauso können aber auch äquimolare Mengen der Edukte, entsprechend der Anzahl einzuführender Acetyl-Gruppen eingesetzt werden, wobei verminderte Mengen an Acetanhydrid und Protonenfänger gegebenenfalls durch ein inertes Lösungsmittel zu ersetzen sind. Geeignete inerte Lösungsmittel für die Edukte sind beispielsweise Chloroform, Methylenchlorid, Nitromethan, Acetonitril, Aceton, Sulfolan, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid.
Als organischer Protonenfänger wird bevorzugt Pyridin verwendet, wobei man die Reaktion in einem Temperaturbereich von 4 bis 100 0C, besonders bevorzugt bei 75 0C bzw. unterhalb der Siedetemperatur des
Reaktionsgemisches ablaufen lässt.
Anstelle von Pyridin können auch andere Protonenfänger wie beispielsweise primäre, sekundäre oder tertiäre Amine bzw. Carbonsäureamide verwendet werden.
Die Umsetzung wird üblicherweise bei Normaldruck unter Rühren der Reaktionsmischung durchgeführt. Dabei verwendet man eine Glas- Reaktionsappartur mit Rückflusskühler, wobei entstehende Lösungsmitteldämpfe kondensiert und kontinuierlich in die Reaktionsmischung zurückgeführt werden.
Das erfmdungsgemäße Verfahren kann jedoch auch unter verminderten oder erhöhten Druck durchgeführt werden. Die Anwendung von erhöhtem Druck ist insbesondere dann angezeigt, wenn man die Reaktion bei einer Temperatur durchfuhren will, bei der das Lösungsmittel unter Normaldruck siedet.
Überraschenderweise können mittels des erfmdungsgemäßen Verfahrens in einem Reaktionsschritt die beiden neuartigen Substanzen
Pentaacetylcyclin (A-Ring-aromatisiertes Pentaacetyl-Minocyclin) und
Tetraacetylcyclin (A-Ring-aromatisiertes Tetraacetyl-Minocyclin) gewonnen werden, welche bisher nicht publiziert sind.
Abbildung 1 zeigt beispielhaft das LC(HPLC)-Chromatogramm und die korrespondierenden Massenspektren der zwei Hauptkomponenten eines
Reaktionsgemisches nach Einsatz von überschüssigem Acetanhydrid. Es ist die hohe Selektivität der Reaktion für das pentaacetylierte Produkt
(Formel II und Abbildung IB) erkennbar. Durch Optimierung der
Reaktionsbedingungen kann die Selektivität für das entsprechende Zielprodukt noch weiter erhöht werden, wodurch sich nachfolgend beschriebene Reinigungsschritte vereinfachen bzw. erübrigen.
In dem hier beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren wird nach Ablauf der Reaktionszeit eine chromatographische Trennung bzw. Reinigung der Produkte mit Hilfe der VLC (Vakuum- Flüssigkeitschromatographie) durchgeführt.
Die VLC-Methode kann, je nach technischer Ausführung, auch im industriellen Maßstab durchgeführt werden. Dazu wird das Reaktionsgemisch vorzugsweise auf ein mit Petroleumbenzin (Siedebereich: 40 - 60 0C) oder einem anderen Kohlenwasserstoff, wie n-Pentan, n-Hexan, Cyclohexan oder Isobutan vorkonditioniertes Trägermaterial gegeben, welches sich in einem Büchner-Trichter mit Frittenboden, einer Chromatographie-Säule oder einem Hängegefaß mit Siebboden befindet. Durch Vakuum-Zug (VLC) oder mit Hilfe von Überdruck wird der Eluent nun durch das Trägermaterial (stationäre Phase) geleitet.
Die Elution der Zielverbindungen erfolgt anschließend durch Aufgabe eines Lösungsmittel-Gradientengemisches, bestehend aus einem Kohlenwasserstoff und einem Carbonsäureester, wobei man die Polarität des Gemisches durch höhere Anteile des Carbonsäureesters während der Elution steigert. In dem hier vorgestellten erfindungsgemäßen Verfahren wird zur Elution der Zielverbindungen besonders bevorzugt ein Gemisch aus Petroleumbenzin und Ethylacetat verwendet. Es ist jedoch auch möglich, dass anstelle dessen Eluenten-Gemische von Kohlenwasserstoffen mit anderen Carbonsäureestern, wie Methylformiat, n-Butylacetat oder Dimethylcarbonat, verwendet werden können.
Als Trägermaterial (stationäre Phase) werden Kieselgel (z.B. Kieselgel 60), Aluminiumoxid, 'reversed phase' -Kieselgel oder Sephadex verwendet. Nach Abtrennung entsprechender Fraktionen, welche die angereicherten Zielverbindungen enthalten, wird der Eluent unter vermindertem Druck durch Verwendung eines Rotationsverdampfers abdestilliert und der Rückstand aus einem der vorstehend genannten Lösungsmittel-Gemische umkristallisiert. Zur Umkristallisation wird im erfindungsgemäßen Verfahren die entsprechende Zielverbindung zunächst unter leichtem Erwärmen in Ethylacetat gelöst und dann durch Zusatz von Petroleumbenzin, somit durch Verminderung des Löslichkeitsproduktes, eine Kristallisation eingeleitet. Nach vollständiger Kristallisation, wobei man die Mischung für einige Stunden auf 4 0C kühlt, filtriert man die Zielverbindung mit Hilfe einer Filternutsche ab und entfernt Lösungsmittelreste durch Trocknung im Vakuum. Die hier im Folgenden beispielhaft aufgeführten, vermittels des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellten neuartigen Substanzen Pentaacetylcyclin (A-Ring-aromatisiertes Pentaacetyl-Minocyclin der Formel II) und Tetraacetylcyclin (A-Ring-aromatisiertes Tetraacetyl- Minocyclin der Formel IV) wurden durch Massenspektroskopie (LC/MS, HR/MS), UV/VIS-Spektroskopie sowie durch 1H- und 13C- NMR charakterisiert.
So zeigt Abbildung 2 beispielhaft die UV/VIS-Spektren beider vorstehend genannter Substanzen und Abbildung 3 das 1H-NMR von Tetraacetylcyclin der Formel IV. Die Prüfung der zellschützenden Eigenschaften der durch das erfindungsgemäße Verfahren dargestellten Substanzen erfolgte, beispielhaft an rein dargestelltem Pentaacetylcyclin der Formel II, mit Hilfe eines Astrozytenschädigungsmodells. Dieses Modell dient der Untersuchung durch oxidativen Stress vermittelter neurodegenerativer Erkrankungen bzw. zur Testung von zellschützenden Substanzen, mit denen eine solche Schädigung verhindert bzw. verringert werden kann. In dem beispielhaft verwendeten Modell werden Astrozyten mit Hilfe von Wasserstoffperoxid (H2O2) geschädigt und anschließend die Funktionalität und Morphologie der Zellen und Mitochondrien mikroskopisch beurteilt. Eine Überproduktion von H2O2, als reaktive Sauerstoffspezies (ROS), gilt im ZNS u.a. als Auslöser vieler neurodegenerativer Prozesse und Erkrankungen, wie Schlaganfall, Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, post-traumatischen Hirn- und Spinalverletzungen. Erstaunlicherweise vermochte Pentaacetylcyclin der Formel II gegenüber der Vergleichssubstanz Minocyclinhydro- chlorid bereits in viel niedrigerer Dosierung die Schädigung der Mitochondrien deutlich zu vermindern (Beispiel 3 und Abbildung 4). Dieser Befund ist überraschend und zeigt die herausragenden Wirkeigenschaften der beispielhaft getesteten Substanz.
Die Überprüfung der antibiotischen Aktivität des durch das erfindungsgemäße Verfahren gewonnenen Pentaacetylcyclins erfolgte unter Verwendung eines E. co/ϊ-Stammes (Beispiel 4). Pentaacetylcyclin weist im Vergleich zum Minocyclinhydrochlorid keine antibiotische Wirkung mehr auf, womit überraschenderweise ein weiterer angestrebter biologischer Effekt erreicht wurde.
Die Erfindung wird nachstehend an Hand der folgenden Ausführungsbeispiele und Abbildungen näher erläutert.
Abb. 1 : Chromatogramm einer LC/MS-Analyse des erfindungsgemäßen Reaktionsgemisches vor der
Aufreinigung, wobei
(A) -Analytisches LC-Chromatogramm des Reaktionsgemisches,
(B) - Massenspektrum des Pentaacetylcyclins (Analyse des Peak bei 11 ,69 min) und (C) - Massenspektrum des Tetraacetylcyclins (Analyse des Peak bei 12,37 min) bedeuten,
Abb. 2: UV/VIS-Spektren von Pentaacetylcyclin (A) und Tetraacetylcyclin (B), hergestellt gemäß dem erfmdungsgemäßen Verfahren, sowie
Abb.3: 1H-NMR- Spektrum von Tetraacetylcyclin (in DMSO-d6) hergestellt gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren, wobei (A) eine vergrößerte Darstellung des Bereich von 2.0 - 3.6 ppm darstellt.
Ausfuhrungsbeispiel 1
Synthese von Pentaacetylcyclin der Formel II
Minocyclinhydrochlorid (0,60 g; 1,215 mmol) wurde unter Eiskühlung (4 0C) in 12 ml Pyridin (11,73 g; 148,37 mmol) gelöst und anschließend unter Rühren 12 ml Acetanhydrid (12.98 g, 127.18 mmol) hinzugefügt. Dann wurde die Mischung 30 Minuten bei 4 0C, 2 Stunden bei Raumtemperatur und 30 Minuten bei 75 0C nachgerührt. Die Reinigung des Reaktionsproduktes erfolgte durch Vakuumflüssigkeits- Chromatographie (VLC). Dazu wurde Kieselgel 60 (75 g) in einer Glasfilternutsche unter Vakuumzug verdichtet und mit Petroleumbenzin (Siedebereich: 40 - 60 0C) vorkonditioniert. Das Reaktionsgemisch wurde auf die so vorbereitete Chromatographiesäule geladen und mit einem Petroleumbenzin / Ethylacetat-Gradienten (4/1, vol/vol bis 100 % EtOAc) eluiert. Fraktionen, die das Reaktionsprodukt enthielten, wurden vereinigt. Nach Abdestillieren des Lösungsmittels am Rotationsverdampfer wurde ein Rückstand (518,5 mg) erhalten, der aus einem Ethylacetat / Petroleumbenzin-Gemisch umkristallisiert wurde und schließlich das fast reine Pentaacetylcyclin als hellgelben Feststoff lieferte. Die Roh-Ausbeute betrug 237,5 mg. Zur Endreinigung wurde das Produkt einer weiteren VLC unterworfen. Die Reinausbeute betrug 181,9 mg (23 % d. Theorie). Die analytische Kontrolle der jeweiligen Fraktionen erfolgte über Dünnschichtchromatographie (DC mit Fluoreszenzindikator, Polygram SIL G/UV254, Firma Macherey & Nagel) mit Kieselgel 60 als stationäre Phase und Petroleumbenzin/Ethylacetat (1/3, vol/vol) als mobile Phase. Für Zellkulturexperimente bzw. zur Testung der antibiotischen Wirkung wurden Stammlösungen der Substanz in DMSO hergestellt, mit Hilfe von Nalgene-Nylonfiltern (0,22 μm Porengröße) steril filtriert und bis zur Verwendung bei -20 0C gelagert.
Analytische Daten Pentaacetylcyclin (A-Ring aromatisiertes Pentaacetyl- Minocyclin):
- Rf (DC) = 0,50 - UV-VlS (λmax in MeOH): 330 nm (log ε 4,27)
- LC/MS (positive ion mode): 723 [M + C3H6O2]+, 688 [M + K]+, 672 [M + Na]+, 650 [M + H]+, 608 [650 - Acetyl + H]+, 590 [608 - H2O], 565 [608 - Acetyl]+, 548 [590 - Acetyl + H]+, 506 [548 - Acetyl + H]+
- HR-ESI-MS (negative ion mode): (M - H") gef. 648,2198825, C33H34O11N3, dev. 2,5 ppm - HR-ESI-MS: (M - Acetyl) gef. 606,2093178 (M - Acetyl), C31H32O10N3, dev. 1 ,2 ppm
- HR-ESI-MS (positive ion mode): (M+Na+) gef. 672,21638, C33H35O11N3Na, dev. 2,4 ppm
- 1H-NMR (DMSO-d6): δ (ppm) 2,16 (s, CH3); 2,23 (s, CH3); 2,27 (s, CH3); 2,28 (s, 2 CH3); 2,56 (m, CH); 2,66 (s, N(CH3J2); 2,73 (s, N(CH3)2); 2,76 (m, CH2, überlagert von N(CH3)2- Signal); 3,48 (m, CH2); 7,00 (d, J = 8,6 Hz, aromat. CH); 7,29 (d, J = 8,2 Hz, aromat. CH); 11 ,08 (br s, NH)
- 13C-NMR (DMSO-d6): Signale, Auswahl δ (ppm) 13,9; 20,2; 20,6; 24,6; 31 ,7; 42,4; 43,9; 59,5; 122,0; 124,5; 139,9; 148,5; 161 ,7; 167,2; 167,8; 168,1 ; 168,9; 169,8
Ausfuhrungsbeispiel 2
Synthese von A-Ring-aromatisiertem Tetraacetyl-Minocyclin der Formel IV
Tetraacetylcyclin wurde als Nebenprodukt aus dem, im Ausfuhrungsbeispiel beschriebenen Reaktionsgemisch chromato- graphisch isoliert und anschließend aus der entsprechenden Fraktion, nach Abdestillieren des Lösungsmittels und Umkristallisation aus einem Petroleumbenzin/Ethylacetat-Gemisch, rein gewonnen. Aufgrund des bathochromen Shifts der UV-Bande gegenüber der des Pentaacetylcyclins der Formel II ist die Enol-Form, entsprechend Formel IV, am wahrscheinlichsten (Abbildung 2). Die anderen (nicht enolischen) OH- bzw. die NH2-Gruppen im Minocyclin weisen eine höhere Basizität auf und werden deshalb bevorzugt acetyliert. Das 1H- NMR-Spektrum (Abbildung 3) unterstützt den Strukturbeweis. Analytische Daten Tetraacetylcyclin (A-Ring aromatisiertes Tetraacetyl- Minocyclin):
- Rf (DC) = 0,57
- UV-VlS (λmax): 252,381 (log ε 4,27) - LC/MS (positive ion mode): 681 [M + C3H6O2J+, 646 [M + K]+, 630 [M + Na]+, 608 [M + H]+, 566 [608 - Acetyl + H]+, 548 [566 - H2O]+, 524 [566 - Acetyl + H]+, 506 [524 - H2O]+
- 1H-NMR (DMSO-d6): δ (ppm) 2,16 (s, CH3); 2,22 (s, CH3); 2,27 (s, CH3); 2,29 (s, CH3); 2,49 (dt, J = 13,7 Hz, CH2); 2,63 (m, J = 4,5; 13,6 Hz; CH); 2,66 (s, N(CH3)2); 2,72 (s, N(CH3J2); 3,50 (dt, J = 4,5; 14,9 Hz; CH); 7,04 (d, J = 8,6 Hz; aromat. CH); 7,37 (d, J = 8,6 Hz; aromat. CH); 11 ,10 (s, NH)
Ausführungsbeispiel 3
Prüfung der zell- bzw. neuroprotektiven Wirkeigenschaften am Astrozyten-Mitochondrien-Modell Astrogliazellen, d.h. nicht-neoplastische embryonale Astrozyten- Zelllinie der Ratte [Chamaon, K., Kirches, E., Kanakis, D., Braeuninger, S., Dietzmann, K., and Mawrin, C. (2005). Regulation of the pituitary tumor transforming gene by insulin-like-growth factor-I and insulin differs between malignant and non-neoplastic astrocytes. Biochem Biophys Res Commun 331, 86-92] wurden auf mit Poly-D-Lysin beschichteten Deckgläschen am Boden von Kulturschalen für 18 Stunden bei 37 0C (5 % CO2) kultiviert. Als Kulturmedium diente jeweils 2 ml DMEM (PAA Laboratories GmbH Pasching, Österreich) und die Einsaatdichte betrug 0,3 x 106 Zellen/2 ml. Die Zellkulturen wurden zunächst mit unterschiedlichen Konzentrationen (1,0; 5,0 bzw. 25,0 μM) Minocyclinhydrochlorid bzw. Pentaacetylcyclin (Formel II) für 30 Minuten vorinkubiert. Als unbehandelte Kontrolle diente die alleinige Zugabe des Lösungsmittels DMSO (2 μl/Kulturschale) unter identischen Inkubationsbedingungen. Danach erfolgt die Zugabe von 1 ,0 bzw. 3,0 mM H2O2 (Endkonzentration) und eine weitere Inkubation für 2 Stunden. Als Vergleich dienten die entsprechend behandelten Zellen, welche nur mit 1,0 bzw. 3,O mM H2O2 oder nur mit Minocyclinhydrochlorid bzw. Pentaacetylcyclin, in den angegebenen Konzentrationen kultiviert wurden. Nach Austausch des Kulturmediums gegen 2 ml auf 37 0C temperierten HEPES-Puffer (1O mM HEPES, 14O mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1O mM D-Glukose, pH 7,4) fand eine weitere Inkubation der Zellen für 30 Minuten statt. Darauf folgte die Zugabe von 40 nM MitoTracker® Orange CMTMRos (1 μl einer 80 μM Stammlösung der oxidierten Form, Bestell-Nr. M7510; ^Anregung = 554 m, λEmission = 576 nm; Molecular Probes Inc., Eugene, USA). Nach 30-minütiger Inkubation bei 37 0C wurden die Zellkulturen in 4% Paraformaldehyd (m/vol in HEPES-Puffer) für 30 Minuten fixiert, zur Entfernung des Fixationsmittels dreimal für 10 Minuten mit 0,1 M PBS gespült und anschließend die Deckgläschen mit den fixierten Zellen auf Objektträger in ImmuMount® befestigt. Zur visuellen Untersuchung und Dokumentation kam ein Zeiss-Axiophot-Fluoreszensmikroskop mit CCD-Kamera (AxioCam MRc) zum Einsatz.
Unbehandelte Kontrollzellen stellen sich als polygonale Zellkörper mit 2-3 langgestreckten Fortsätzen dar und erscheinen bei ausreichender Zelldichte als ein zelluläres Netz. Fadenförmige Mitochondrien sind im Zytoplasma bis in die Zellfortsätze hinein verteilt. Nach 2-stündiger Inkubation mit 1 mM H2O2 (ohne Minocyclin bzw. Pentaacetylcyclin) sind die Mehrzahl der Zellen geschädigt und zeigen einen deutlichen Rückzug ihrer Fortsätze. Dadurch verlieren die Zellkörper ihre polygonale Form und tendieren zur Abrundung. Infolge von Fission sind die Mitochondrien stark verkürzt und werden in Richtung des Zellkerns disloziert. Mit 3 mM H2O2 sind diese zellschädigenden Prozesse verstärkt. Die Dichte der haftenden Zellen ist verringert, die Zellkörper sind weit mehr abgerundet und die noch stärker verkürzten Mitochondrien sind nahe dem Zellkern akkumuliert. Die Zugabe von 25 μM Minocyclinhydrochlorid zu den zuvor mit H2O2 geschädigten Zellen hat einen schützenden Effekt. Die Zellen erhalten weitgehend ihre polygonale Gestalt und die Mitochondrien sind weniger verkürzt. Überraschenderweise zeigte sich, dass bei Verwendung von Pentaacetylcyclin schon bei der viel niedrigeren Konzentration von 1,0 μM die H2O2-induzierte Schädigung der Mitochondrien deutlich verringert wird. Dieser Schutzeffekt des A-Ring-aromatisierten Pentaacetyl-Minocyclins ist eine Verbesserung gegenüber Minocyclinhydrochlorid, mit welchem erst ab 25 μM eine ähnliche Schutzwirkung beobachtet werden kann. In dem genutzten Testsystem und den hier verwendeten Konzentrationen schädigen Minocyclinhydrochlorid und Pentaacetylcyclin die Zellen nicht. Ausführungsbeispiel 4
Prüfung der antibiotischen Wirkung von Pentaacetylcyclin und Minocyclinhydrochlorid im Plattendiffusionstest Die Flüssigkultur (24 Stunden in LB-Lennox-L-Broth-Base kultiviert) einer E. co/i-Suspension (150 μl) des Stammes C 600 hfc wurde auf LB- Agar (Lennox-L-Agar, Gibco) mit Hilfe eines sterilen Drigalski-Spatels gleichmäßig verteilt. Anschließend wurden sterile Filterpapierblättchen (Durchmesser 5,3 mm), die zuvor mit sterilen DMSO-Lösungen sowie unterschiedlichen Konzentrationen (100 μM bis 2,5 mM) von Minocyclinhydrochlorid bzw. Pentaacetylcyclin (Formel II) getränkt wurden, auf den Nährboden aufgelegt. Nach Inkubation der Platten bei 37 0C für 24 Stunden erfolgte die Beurteilung der antibiotischen Aktivität der Substanzen anhand der Durchmesser der Hemmhöfe, welche durch die fehlende Eintrübung durch Bakterien sichtbar werden. An Hand der unterschiedlichen Größe der Hemmhöfe ist erkennbar, dass Minocyclinhydrochlorid konzentrationsabhängig das Wachstum von E. coli inhibiert. Hingegen zeigt Pentaacetylcyclin selbst in der höchsten getesteten Konzentration von 2,5 mM keine Wachstumshemmung und ist demzufolge gegen den verwendeten E. coli Stamm nicht antibiotisch wirksam.
Alle in der Beschreibung und den nachfolgenden Ansprüchen dargestellten Merkmale können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination miteinander erfindungswesentlich sein.
Figure imgf000016_0001
Figure imgf000016_0002
Figure imgf000016_0003
Formel III

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von A-Ring-aromatisierten Acetyl- Minocyclinen
Figure imgf000017_0001
wobei R1 bis R5 = Acetyl und/oder H sind, dadurch gekennzeichnet, dass Minocyclinhydrochlorid mit Acetanhydrid in Gegenwart eines Protonenfangers umgesetzt, das Reaktionsprodukt einer chromatographischen Aufreinigung unter Verwendung eines
Trägermaterials und eines Eluenten unterworfen, der Eluent abdestilliert und das Produkt anschließend durch Umkristallisation gereinigt wird.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Protonenfänger eine organische Base verwendet wird.
3. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Base ein primäres, sekundäres oder tertiäres Amin ist.
4. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Protonenfänger bevorzugt Pyridin ist.
5. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Acetanhydrid und der Protonenfänger im Überschuss oder äquimolar, entsprechend der Anzahl der einzuführenden Acetylgruppen, eingesetzt werden.
6. Verfahren nach einem oder mehrerer der voran stehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung der Edukte in einem inerten Lösungsmittel erfolgt.
7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittel Chloroform, Methylenchlorid, Nitromethan, Acetonitril, Aceton, Sulfolan, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid ist.
8. Verfahren nach einem oder mehrerer der voran stehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung bei einer Temperatur von 4 bis 100 0C, bei Normal- oder Überdruck durchgeführt wird.
9. Verfahren nach einem oder mehrerer der voran stehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Pentaacetylcyclin (A-Ring- aromatisiertes Pentaacetyl-Minocyclin) der Formel II
Figure imgf000018_0001
Formel Il als Hauptprodukt synthetisiert wird.
1 O.Verfahren nach einem oder mehrerer der voran stehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass je nach Reaktionsführung andere A-
Ring-aromatisierte, ein- oder mehrfachacetylierte Minocycline der Formel I (mit R1 bis R5 = Acetyl und/oder H) synthetisiert werden, wobei die Anzahl der Acetylgruppen im Molekül kleiner oder gleich 5 ist.
11. Verfahren nach einem oder mehrerer der voran stehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Nebenprodukt besonders bevorzugt das Tetraacetylcyclin (A-Ring-aromatisiertes Tetraacetyl-Minocyclin) der Formel IV
Figure imgf000019_0001
Formel IV synthetisiert wird.
12. Verfahren nach einem oder mehrerer der voran stehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die chromatographische Reinigung der
Reaktionsprodukte an Kieselgel 60 (Silicagel) oder einem anderen
Trägermaterial wie Aluminiumoxid, 'reversed-phase'-Silicagel oder
Sephadex durchgeführt wird.
13. Verfahren nach einem oder mehrerer der voran stehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die chromatögraphische Aufreinigung im Festbett, in einer Chromatographiesäule, in einem Büchner- Trichter mit Glasfritten-Einsatz oder einem Hängegefäß mit Siebboden-Einlage erfolgt.
H.Verfahren nach einem oder mehrerer der voran stehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Elution über das Trägermaterial und zur Umkristallisation der Reaktionsprodukte besonders bevorzugt ein Gemisch aus Ethylacetat und Petroleumbenzin verwendet wird.
15. Verfahren nach einem oder mehrerer der voran stehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass an Stelle von Ethylacetat und
Petroleumbenzin auch Methylformiat, w-Butylacetat,
Dimethylcarbonat bzw. andere Kohlenwasserstoffe wie n-Pentan, n-
Hexan, Cyclohexan oder Isobutan eingesetzt werden.
16. Wirkstoff oder Wirkstoffgemisch hergestellt nach einem oder mehrerer der voran stehenden Ansprüche.
17. Verwendung des Wirkstoffes oder Wirkstoffgemisches gemäß
Anspruch 16 zur Herstellung eines Medikamentes, welches zur Behandlung von durch oxidativen Stress und/oder mitochondriale
Schädigungen vermittelter neurodegenerativer Erkrankungen eingesetzt werden kann.
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