WO2009011413A1 - エピトープタグ化ｃ型肝炎ウイルス粒子の作製と利用 - Google Patents

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Tetsuro Suzuki
Hitoshi Takahashi
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    • C12N2770/24251—Methods of production or purification of viral material

Definitions

  • the present invention relates to epitopic tagged hepatitis C virus particles, vectors for producing the viruses, and cell lines producing the virus particles.
  • the present invention also relates to a method for purifying the virus particle, a vaccine obtained by inactivating the virus particle, and an anti-hepatitis C virus antibody against the virus particle as an antigen.
  • HCV Hepatitis C virus
  • Non-patent Document 1 Hepatitis C virus
  • hepatitis C is a serious infection with a poor prognosis, and about half of the patients with chronic hepatitis C will surely worsen the disease state to cirrhosis and liver cancer. For these reasons, it is desirable to develop antiviral drugs and vaccines aimed at preventing the occurrence of carriers and eliminating viruses.
  • a simple and highly purified method for purifying proteins obtained in a cell culture system is to express the target protein as a fusion protein with the labeling protein, and specifically bind to the antibody against the target protein and this.
  • Techniques for purifying fusion proteins with molecules that can be known are known.
  • Epitope tags include: FLAG peptide, 3XFLAG peptide, HA peptide, 3XHA peptide, fflyc peptide, 6XH is peptide, GST polypeptide, MBP polypeptide, PDZ domain polypeptide, TAP (Tandem Affinity Purification ) Peptides, alcalifosphatase, avidin, etc. are known. These peptides or polypeptides are usually fused to the N-terminus or C-terminus of the protein of interest, but in some cases can also be inserted into the protein of interest.
  • the genome of HCV is a (+) single-stranded RNA consisting of about 9600 nucleotides.
  • This genomic RNA consists of a 5 'untranslated region (also referred to as 5' NTR or 5 'UTR), a translated region composed of a structural region and a non-structural region, and a 3' untranslated region (3 'NTR or 3''(Also referred to as UTR).
  • the structural region encodes HCV structural protein
  • the nonstructural region encodes multiple nonstructural proteins.
  • HCV structural proteins Core, El, E 2 and p7
  • nonstructural proteins NS2, NS3, NS4A, NS4B , NS5A, and NS5B
  • Core is the core protein
  • E1 and E2 are envelope proteins.
  • Nonstructural proteins are responsible for the replication of the virus itself.
  • S2 has meta-protease activity
  • NS3 has serine protease activity (1/3 on the N-terminal side) and helicase activity (2/3 on the C-terminal side).
  • NS4A is a cofactor for NS3 protease activity
  • NS5B has been reported to have RNA-dependent RNA polymerase activity.
  • HCV is wrapped in a film called an envelope.
  • the envelope consists of components derived from the membrane of the host cell and proteins derived from the virus.
  • the protein constituting the envelope of HCV consists of envelope protein 1 (referred to as E1), envelope protein 2 2) and p7.
  • E1 and E2 have a transmembrane region at the C-terminus, and are anchored in the HCV membrane via this transmembrane region, and are involved in HCV particle formation and infection (Non-patent Document 4, Non-patent Document 4) Reference 5).
  • HVR1 hypervariable region 1
  • HVR2 hypervariable region 2
  • HVR1 consists of 27 amino acids in the amino terminal portion of the E2 protein, and is exposed on the surface of the E2 protein to form a B cell epitope.
  • the diversity of the amino acid sequence of HVR1 shows up to 80%, but there are several places where amino acids are conserved, so it is thought that a certain secondary structure is necessary for the survival of the virus. Yes.
  • HVR1 has almost no cysteine residue-asparagin-linked chain addition signal.
  • HRV2 consists of 7 amino acids and is located at positions 91-97 from the amino terminus of the E2 protein. HRV2 is present in the HCV lb genome, but not in other genotypes of HCV.
  • Non-Patent Document 2 As an example of an epitope tag inserted into a viral particle in HCV, the E2 protein HVR1 of the JFH-1 strain (HCV2a type) is known to be substituted with the HA peptide, which has been confirmed to be infectious. (Non-Patent Document 2). However, there is no report that this infectious epitope-tagged HCV particle could be purified with high purity.
  • Patent Document 1 W005080575A1
  • Patent Document 2 W006022422A1
  • Non-Patent Document 1 Choo, QL. Et al., Science, 244: 359-362, 1989
  • Non-Patent Document 2 Wakita, T. et al., Nat. Med., 11: 791-796, 2005 Non-Patent Document 3 Zahn, A. & Allainl, JP., J. Gen. Virol., 86: 677-685, 2005 Non-Patent Document 4 Voisset, C. & Dubuisson, Biology of the Cell, 96: 413-420,
  • Non-patent literature 5 Op De Beeck, A. et al ,, J. Gen. Virol., 82: 2589-2595, 2001
  • Non-patent literature 6 Hi jikata, M. et al., Biochem Biophys Res Comraun., 175: 220 -228, 1991 DISCLOSURE OF THE INVENTION
  • An object of the present invention is to provide an epitope-labeled HC V particle capable of easily and highly purifying HCV particles, a purification method thereof, a vaccine using the high purity HCV particles, and the like. It is in.
  • the inventors of the present invention have studied the types of epitope tags that do not affect the productivity and infectivity of HCV particles in cell culture, and combinations of HCV proteins to which the epitope tag is added and the addition position. Epitope-tagged HCV particles were successfully produced. Furthermore, a clone that produces this HCV particle at high production was prepared, and it was confirmed that the produced epitope-tagged HCV particle could be purified to high purity in one step using an anti-epitope tag antibody column, and the present invention was completed. It was.
  • the present invention relates to the following (1) to (15).
  • a nucleic acid comprising the following (a), (b) or (c), wherein the epitope tag peptide is inserted into the hypervariable region 1 (HVR1) of the E2 protein coding sequence of (a), (b) or (c).
  • HVR1 hypervariable region 1
  • HCV J6CF strain 5 untranslated region, Core protein coding sequence, E1 protein coding sequence, E2 protein coding sequence and p7 protein coding sequence, NS2 of JFH-1 strain Chimeric HCV genome comprising coding sequence, NS3 protein coding sequence, NS4 A protein coding sequence, NS4B protein coding sequence, NS5A protein coding sequence, NS5B protein coding sequence 3 'untranslated region
  • the above linker sequence is a GGG sequence, GGGGS sequence or (GGGGS) 3 sequence, or a part of the GGG sequence, GGGGS sequence or (GGGGS) 3 sequence, which lacks 1 to 10 amino acids.
  • nucleic acid according to any one of the above (1) to (4) represented by SEQ ID NO: 1, 1, 2, 30, 3 1, 4 1 or 42 (however, if the nucleic acid is RNA, The base symbol “TJ” shall be read as “UJ”.
  • nucleic acid described in (6) above which is represented by SEQ ID NO: 20 or 21 (when the nucleic acid is RNA, the base symbol “T” in the sequence listing shall be read as “U”).
  • a vector comprising the nucleic acid according to any one of (1) to (7) above.
  • the above release step consists of an epitope tag peptide-containing buffer, calcium-free buffer, pH 2.5 to pH 4.0, 0.1 M glycine buffer, pH 4.0 to pH 5.0, 1 M arginine hydrochloride.
  • Figure 1 shows the structure of HCV E2. N1 to N11 are glycosylation sites, HVR is Hyper Variable Region, and TMD is Trans Membrane Domain. A part of the amino acid of J6 / JFH-1 E2 HVR1 (underlined) was removed, and a FLAG tag sequence (underlined) was inserted there.
  • Figures 2A, 2B and 2C show the construction of PJ6 / JFH-1 (1XFLAG) and pJ6 / JFH-1 (3XFLAG) plasmids.
  • Figure 2B is a continuation of Figure 2A
  • Figure 2C is a continuation of Figure 2B.
  • Figure 3 shows the change in the amount of HCV Core protein in the culture supernatant after introducing T6 / JFH-1 RNA and J6 / JFH-1 (3XFLAG) RNA into Huh-7 cells.
  • J6 / JFH-1 produced no change, but J6 / JFH-1 (3XFLAG) decreased Core production until day 22, but then increased and increased on day 35. And almost the same production amount.
  • Figure 4 shows that after introducing J6 / JFH-1 RNA and J6 / JFH-1 (3XFLAG) RNA into Huh-7 cells,
  • Figure 5 shows the behavior of HCVE2 protein treated with endoglycosidase (PNGase F) at 4, 17, 30, and 43 days after introducing J6 / JFH-1 (3XFLAG) RNA into Huh-7 cells.
  • PNGase F endoglycosidase
  • Figure 6 shows the sequence analysis of the HCV genome on the 8th and 39th day after introduction of J6 / JFH-1 (3XFLAG) RNA.
  • wasparagine (N6) the glycosylation site in the E2 region, was replaced with lysine (K).
  • FIG. 7 shows the amount of HCV Core protein in the purified solution of J6 / JFH-1 (3XFLAG) virus.
  • HCV Core protein was detected by elution of 1XFLAG peptide or 3XFLAG peptide, confirming the purification of HCV particles.
  • Figure 8 shows the contaminating proteins contained in the purified J6 / JFH-1 (3XFLAG) virus solution.
  • the purified virus solution contained almost no contaminating protein.
  • Figure 9 shows the infectivity of purified J6 / JFH-1 (3XFLAG) virus.
  • the intracellular HCV RNA was quantified on the 4th day after infection with each virus.
  • the purified virus was confirmed to have the same infectivity as the unpurified virus.
  • FIG. 10A, FIG. 10B and FIG. 10C show the construction diagrams of PJ6 / JFH-1 (1XFLAG) N ⁇ K and pJ6 / JFH-1 (3XFLAG) N ⁇ K plasmid.
  • FIG. 10 08 is a continuation of FIG. 1 O A
  • FIG. 10 C is a continuation of FIG. 10 B.
  • FIG 11 shows the structural diagram of HCV E2.
  • N1 to N11 are glycosylation sites
  • HVR is Hyper Variable Region
  • TMD is Trans Membrane Domain.
  • a portion of the amino acid (underlined) of E2 HVRl of JFH-1 was removed, and a FLAG tag sequence (underlined) was inserted there.
  • Fig. 12 A, Fig. 12 B and Fig. 12. C show the construction of pJFH-1 (1 XFLAG) and pJFH-1 (3XFLAG) plasmids.
  • Figure 12B is a continuation of Figure 12A
  • Figure 12C is a continuation of Figure 12B.
  • Figure 13 shows the structural diagram of HCV E2.
  • N1 to N11 are glycosylation sites
  • HVR is Hyper Variable Region
  • TMD is Trans Membrane Domain.
  • pTH / JFH-1 E2 HVRl A part of the amino acid (underlined) was removed, and a FLAG tag sequence (underlined) was inserted there.
  • Fig. 14 A, Fig. 14 B and Fig. 14 C show construction diagrams of pTH / JFH-1 (1XFLAG) and pTH / JFH-1 (3XF LAG) plasmids.
  • Figure 14B is a continuation of Figure 14A
  • Figure 14C is a continuation of Figure 14B.
  • Epitope-tagged HCV particle means an HCV particle in which an epitope tag peptide is added to the structural protein of HCV.
  • the epitopylated HCV particles can be produced in a cell culture system and preferably possess infectivity.
  • one form of gene that can generate HCV particles is the viral genomic RNA of the JFH-1 strain, in order from 5 to 3 ', 5' untranslated region, Core protein coding sequence, E1 protein Coding sequence, E2 protein coding sequence, p7 protein coding sequence, NS2 protein coding sequence, NS3 protein coding sequence, NS4A protein coding sequence, NS4B protein coding sequence, NS5A protein coding sequence, NS5B protein coding sequence and 3 'untranslated It is RNA consisting of regions.
  • Another form of gene that can generate HCV particles is a chimeric gene consisting of two or more types of viral genomic RNA of HCV strains. 5 'untranslated region, Core protein coding sequence, E1 protein coding sequence, E2 protein coding sequence, p7 protein coding sequence and NS2 protein coding sequence of HCV strains other than Hl strain, and NS3 protein core of JFH-1 strain NS4A protein coding sequence IJ, NS4B protein coding sequence, NS5A protein coding sequence, NS5B protein coding sequence RNA consisting of 3 'untranslated region.
  • the genes capable of generating HCV particles include the following nucleic acids (a), (b) and (c), that is,
  • Chimeric HCV genome containing NS5A protein coding sequence, NS5B protein coding sequence and 3 'untranslated region preferably from the 5' side to the 3 'side, preferably from the JFH-1 strain
  • E2 protein coding sequence, p7 protein coding sequence, and NS2 protein coding region coding sequence up to N-terminal 33 amino acid residues, and JFH-1 strain NS2 protein coding region N-terminal 34 amino acid residues to C-terminal The sequence to encode,
  • the above HCV genome encodes EDKDDDDKGGG (SEQ ID NO: 4 9) or DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKGGG (SEQ ID NO: 50), which is an epitopic tag peptide in the hypervariable region 1 (HVR1) of the E2 protein coding sequence.
  • the nucleic acid sequence to be inserted is inserted in-frame, or a part of the region is replaced with the above-mentioned epitope tag peptide to produce the epitope-tagged HCV genomic DNA. Then, using this DNA, “epitope-tagged HCV particles” are produced in a cultured cell system to obtain high-purity purified epitope-tagged HCV particles.
  • HCV genomic DNA having an epotope tag in the HCV structural protein “Epitope tag” is particularly suitable if it can be used for HCV labeling.
  • epipe tag also called flag peptide, Flag peptide
  • 3XFLAG peptide also called 3xFLAG peptide, 3xFlag peptide, 3Xflag peptide
  • MBP polypeptide MBP polypeptide, PDZ domain polypeptide, TAP (Tandem Affinity Purificat ion) peptide, Al force phosphatase, avidin and the like.
  • a FLAG peptide amino acid sequence: DYKDDDDK (SEQ ID NO: 51)
  • 3XFLAFG peptide amino acid sequence: DYKD HDGDYKDHDIDYKDDDDK (SEQ ID NO: 52)
  • the 3XFLAG peptide is more preferred.
  • the place where the above epitope tag is added is the HVR1 region of the E2 protein of the HCV particle.
  • the epitope tag is inserted in-frame between the 8th and 19th amino acids from the N-terminus of the E2 protein with low homology between each HCV strain in the HVR1 region (so that the reading frame does not shift), or Alternatively, it is more preferable to remove the 11th to 1st amino acids at the N-terminal and insert an epitopic tag peptide here. Add an appropriate linker to the C-terminus of the above epitope tag as necessary.
  • an amino acid sequence GGG (SEQ ID NO: 53), GGGGS (SEQ ID NO: 54), or (GGGGS) X3 (also referred to as (GGGGS) 3 ), or a part of these amino acid sequences, 1 to 1 Peptides containing about 0, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 2 amino acid deletions, substitutions or additions are used, and preferred examples include GGG, GGG GS (SEQ ID NO: 5 4), (GGGGS) X 3 is mentioned, but GGG is more preferable.
  • the method of introducing a nucleic acid encoding the above-mentioned epitope tag into the HCV genome is the PCR product obtained by performing a polymerase chain reaction (PCR) using a synthetic primer containing the nucleotide sequence encoding the epitope tag with the cDNA of the HCV genome in a vertical shape.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a method of recombining to cDNA of HCV genome by enzyme treatment or ligation treatment can be mentioned. Examples of these techniques are shown in the examples below.
  • the HCV strain to be used is not limited. Genotype la (eg, H77 strain (GenBank accession number AF011751)) classified by phylogenetic analysis using the base sequence of HCV strain, genotype lb (eg J1 strain (GenBank accession number D8 9 81
  • Conl strain (GenBank accession number AJ238799, Con-1 strain, sometimes referred to as conl strain), TH strain (Wakita, T. et al., J. Biol. Chem., 269, 14205-14210) ,
  • genotype 2a eg, JFH-1 strain (GenBank accession number AB047639, sometimes referred to as Ji3 ⁇ 4l strain), J6CF strain (GenBank accession number AF177036), JCH-1 (GenBank Session number AB047640), JCH-2 (GenBank accession number AB047641), JCH-3 (GenBank accession number AB04764) 2), JCH- (GenBank accession number AB047643), JCH-5 (GenBank accession number AB047644), JCH-6 (GenBank accession number AB047645)), genotype 2b (eg HC-J8 strain (GenBank Accession number D01221)), genotype 3a (eg NZL1 strain (GenBank accession number D17763)), genotype 3b (eg Tr-Kj (GenBank accession number D49374)) Can be used.
  • JFH-1 strain GenBank accession number AB047639, sometimes referred to as Ji3 ⁇ 4l strain
  • J6CF strain
  • the nonstructural protein coding sequence and the 3 ′ untranslated region are derived from the JFH-1 strain, and the 5 ′ untranslated region and the structural protein code Nucleic acid sequences derived from TH1, JFH-1 or J6CF strains were used.
  • PCR is carried out using a vector obtained by cloning the cDNA of HCV genomic RNA as a cage and using synthetic DNA encoding the epitope tag peptide as a primer.
  • cDNA encoding an envelope protein having an epitope tag added / inserted at the target location can be obtained.
  • a cDNA fragment encoding an envelope protein with an epitope tag was isolated by digestion with an appropriate restriction enzyme, and a full-length HCV genomic RNA cDNA was cloned downstream of a promoter such as the T7 promoter.
  • a full-length HCV cDNA having an epitope tag can be obtained by inserting a cDNA fragment encoding an envelope protein having an epitope tag sequence isolated at the same position after digestion with the same restriction enzyme as described above.
  • the full-length HCV genomic RNA cDNA vector used here is capable of producing HCV particles when RNA transcribed from this vector is introduced into HCV-permissive cells such as Huh7 cells. Details of structure and fabrication are described in W004104198A1, W006 022422A1, Wakita, T. et al ,, Nat. Med. 11: 79 ⁇ 796, 2005, Lindenbach, BD. Et al., Science 309: 623-626, 2005 ing.
  • RNA from HCV cDNA By synthesizing RNA from HCV cDNA with an epitope tag coding sequence under the control of a promoter and introducing this RNA into cells, cells containing epitope-tagged HCV particles can be obtained.
  • Epitope-tagged HCV particles Can.
  • the promoter includes, but is not limited to, a force T7 promoter including T7 promoter, SP6 promoter, and T3 promoter.
  • Kits such as the MEGAscript T7 kit (Ambion) can be used to introduce HCV cDNA under the control of the T7 promoter and to prepare RNA in vitro using the cloned nucleic acid as a cage. .
  • the cells into which RNA is introduced may be cells that allow HCV particle formation, such as Huh7 cells, HepG2 cells, IMY-N9 cells, HeLa cells, 293 cells, or Huh7 cells, HepG2 cells, IMY-N9 cells, HeLa Examples thereof include cells or cells obtained by expressing CD81 gene and / or Claudinl gene in 293 cells. Of these, Huh7 cells or Huh7 cell derivatives are preferably used. Derivatives of Huh7 cells include Huh7.5 cells and Huh7.5.1 cells.
  • Examples of methods for introducing RNA into cells include calcium phosphate coprecipitation method, DEAE dextran method, ribofusion method, microinjection method, and electroporation method, but lipofection method and electroporation method are preferred. The method is more preferred.
  • cDNA may be introduced into the cell, and in this case, the HCV cDNA with the epitope tag code sequence added to the RNA polymerase I promoter and terminator vector (Neumann, G. et. al., Virology, 202: 477-479, 1994, W02 007 / 037428A1), and inserted into cells in the same manner as RNA and expressed.
  • the ability of a cell to produce virus particles can be evaluated using, for example, an antibody against Core protein, E1 protein, or E2 protein that constitutes HCV virus particles released into the culture medium. It is also possible to indirectly evaluate the ability to produce HCV viral particles by amplifying and detecting HCV genomic RNA contained in HCV viral particles in the culture medium by RT-PCR using specific primers. it can. Whether the produced virus has infectivity or not can be determined by treating HCV-permissive cells (eg Huh7) with the supernatant obtained by culturing cells into which HCV RNA has been introduced. Ability to count the number of infected cells by immunostaining the above cells with anti-core antibody ⁇ above The cell extract can be electrophoresed on SDS-polyacrylamide gel and evaluated by detecting the core protein by Western blot.
  • HCV-permissive cells eg Huh7
  • a cell line that continuously produces HCV particles can be obtained by subculturing cells into which the HCV genomic RNA prepared in (2) above has been introduced. Continuing the culture in this way may cause a compatible mutation in the HCV genome and significantly improve HCV particle production.
  • nucleic acids (a) to (c) above when the first amino acid following the last sequence of HVR1 (Puntoriero, G. et al., EMB0 J. 17: 3521-3533, 1998) 1 A mutation in which asparagine, which is the 22nd or 124th amino acid, is substituted with lysine is suitable as a mutation in producing an epitope-tagged HCV particle.
  • the nucleic acid (a) or (b) it is more preferable to mutate so that the 124th amino acid is substituted from asparagine to lysine.
  • the 122nd amino acid is changed from asparagine to lysine.
  • the adaptive mutation in the present invention can be obtained by subculture as described above, but can also be artificially introduced.
  • a mutation-introducing primer is designed and PCR is carried out to synthesize DNA with the mutation introduced.
  • mutants may be prepared using Quick Charge II XL Site-Directed Mutagenes kit (Stratagene), which is commercially available as a mutant preparation kit.
  • a carrier to which a protein capable of binding to the epitope tag is bound is used.
  • the most common protein is an antibody against an epitope tag peptide.
  • a suitable epitope tag is a FLAG peptide or 3XFLAG peptide, and an anti-FLAG antibody that can bind to these peptides, such as a carrier to which M2 antibody or M5 antibody is bound (immobilized) ( Any of them can be obtained from Sigma).
  • HCV H2.5 to pH4.0
  • 1M Argyyun HCl buffer pH4.0 to pH5.0
  • ImM ⁇ ; Lm M hydrochloric acid can be used.
  • P H6. 0 ⁇ P H8. 0 near neutral pH of buffer after elution
  • the purified HCV particles can be electrophoresed on SDS-polyacrylamide gel, and the HCV particles can be determined by detecting the HCV-derived protein by Western blot.
  • the high purity epitope-tagged HCV particles are suitable for use as a vaccine and as an antigen for the production of anti-HCV antibodies.
  • the prepared epitope-tagged HCV particles can be inactivated by methods known in the art.
  • Virus inactivation is formalin, ⁇ -op It can be achieved by adding an inactivating agent such as oral piolactone and dartardial aldehyde to the virus suspension and reacting with the virus (Appa iahgari et al., Vaccine, 22: 3669-3675). , 2004).
  • the infectivity of the virus can be lost and it can be quickly inactivated.
  • Ultraviolet irradiation has little effect on the proteins that make up the virus and can inactivate the virus.
  • the ultraviolet ray source for inactivation can be performed using a commercially available germicidal lamp, in particular, a 15 W germicidal lamp, but is not limited thereto.
  • HCV particles purified by the method described above are used, but the inactivation method is not limited by the state of purification / unpurification.
  • the epitope-tagged HCV particles can be inactivated by irradiating a solution containing the epitope-tagged HCV particles with 20 mW / cm 2 of ultraviolet light at room temperature for 5 minutes or more.
  • the actin of the present invention contains 10% to 95%, preferably 25% to 70%, of an active ingredient (virus particle or a part thereof) in the form of either a solution or a suspension, and can be administered.
  • an active ingredient virus particle or a part thereof
  • Prepared It can be prepared in the form of a solid suitable for dissolution or suspension in a liquid.
  • the preparation may be emulsified or encapsulated in ribosomes.
  • Active immunogenic ingredients such as HCV particles are pharmaceutically acceptable and are often mixed with excipients compatible with the active ingredient.
  • Suitable excipients include, for example, water, saline, dextrose, glycerol, ethanol, and the like, and mixtures thereof.
  • the vaccine may contain minor amounts of adjuvants (eg, humidifiers or emulsifiers), pH buffers, and / or adjuvants that enhance the efficacy of the vaccine.
  • adjuvants examples include, but are not limited to, for example, aluminum hydroxide, N-acetylmyl lamil L-treo-luo D—soglutamine (thr-MDP), N-acetyl-nor-muramyl L Alani Lou D—Isoglutamine (referred to as CGP 1 1 6 3 7, nor I MD P),
  • RIBI 2- (1, 1-2, dipanoremy toinole sn-glycero 3-hydroxyphosphoryloxy) ethylamine (referred to as CGP 1 98 3 5A, MTP-PE), And RIBI.
  • RIBI consists of 3 components extracted from bacteria, namely monophosphoryl lipid A, trehalose dimycolate, and cell wall skeleton (HPL + TD M + CWS) in 2% squalene / T ween® 80 in emulsion Is contained.
  • the efficacy of an adjuvant can be determined by measuring the amount of antibody produced by administering a vaccine composed of HCV particles.
  • the vaccines of the invention are usually administered parenterally, for example by injection, such as subcutaneous or intramuscular injection.
  • Other formulations suitable for other modes of administration include suppositories, and in some cases oral formulations.
  • Adjuvants are nonspecific stimulators of the immune system. They enhance the host's immune response to the HCV vaccine. Specific examples of adjuvants known in the art include Freund's complete and incomplete adjuvants, vitamin E, nonionic block polymers, muramyl dipeptides, saponins, mineral oils, vegetable oils and Carbopol. Adjuvants that are particularly suitable for mucosal applications include, for example, E. coli heat-labile toxin (LT) or cholera toxin (CT).
  • LT heat-labile toxin
  • CT cholera toxin
  • the vaccine of the present invention includes an adjuvant.
  • a pharmaceutically acceptable carrier or diluent include a stabilizer, a carbohydrate, (for example, administration with sorbitol, mannitol, starch, sucrose, glucose, dextran, proteins such as albumin or casein, protein-containing substances such as sushi serum or skim milk, and puffer (eg, phosphate buffer) can do.
  • the vaccine of the present invention is administered in a manner suitable for the dosage form and in such an amount as to have a prophylactic and / or therapeutic effect.
  • the amount to be administered is usually the antigen per dose
  • route of administration such as oral, subcutaneous, intradermal, intramuscular and intravenous routes.
  • the vaccines of the present invention may be given on a single dose schedule or preferably on a multiple dose schedule.
  • a combined dosing schedule 1 to 10 individual doses are given at the beginning of the inoculation, followed by the time interval required to maintain and / or strengthen the immune response, for example 1 to 2 as the second dose.
  • Another dose can be given after 4 months. If necessary, administration can be continued after several months.
  • the dosage regimen will also be determined, at least in part, by the individual's needs and will depend on the judgment of the physician.
  • the vaccine of the present invention may be administered together with other immunoregulatory agents (for example, immunoglobulins).
  • immunoregulatory agents for example, immunoglobulins.
  • the vaccine of the present invention may be administered to a healthy person to induce an immune response against HCV in the healthy person, and used prophylactically against a new HCV infection. Furthermore, it may be used as a therapeutic vaccine to eliminate HCV by administering it to a patient infected with HCV and inducing a strong immune response against HCV in vivo.
  • the epitope-tagged HCV particles of the present invention are useful as antigens for antibody production because they can be easily purified and have high purity.
  • the animal serum contains antibodies against impurities, if impurities exist in the HCV particle sample used for animal immunity, the serum is purified using an HCV antigen column to remove antibodies against these impurities. There is a need. However, since the epitope-tagged HCV particles of the present invention can be obtained as high-purity HCV, such a purification step is unnecessary.
  • An anti-HCV antibody can be produced by administering the epotope-tagged HCV particle of the present invention to a mammal or a bird.
  • mammals include mice, rats, rabbits, goats, hidges, horses, horses, monoremots, pigeons, Bactrian camels, and llamas. Giant camel, Bactrian camel and llama
  • an antibody consisting of only an H chain.
  • avian animals include eagle birds, geese, and ostriches. Animals administered the particles of the present invention
  • the antibody can be obtained according to a known method.
  • a hybridoma that produces monoclonal antibody-producing cells can be produced using cells of an animal immunized with the epotope-tagged HCV particles of the present invention.
  • a method for producing a hyperidoma is well known, and a method described in Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) can be used.
  • Monoclonal antibody-producing cells may be produced by cell fusion, or may be produced by other methods such as immortalization of B lymphocytes by introduction of oncogene DNA or infection with Epstein-Barr virus.
  • Monoclonal antibodies and polyclonal antibodies obtained by these methods are useful for the diagnosis, treatment and prevention of HCV.
  • the antibody produced using the epotope-tagged HCV particles of the present invention is used for the treatment and prevention of hepatitis C. It is also used to prevent HCV infection from donor organs by organ transplantation. Furthermore, the above antibody can be used in combination with existing antiviral agents such as interferon and rivapirin.
  • the effective dose of the anti-HCV antibody is selected in the range of 0.O O l mg to 100 mg per kg body weight. Alternatively, a dose of 0.01 to: 1 00 0 0 0 0 mg Z b ody per patient can be selected. However, therapeutic agents containing anti-HCV antibodies produced using the epitope-tagged HCV particles of the present invention are not limited to these doses.
  • the administration route of the therapeutic agent is not particularly limited, but is preferably subcutaneous, intradermal, or intramuscular, and more preferably intravenous.
  • the timing of administration of the therapeutic agent may be before or after the clinical symptoms of the disease occur.
  • a therapeutic agent containing an anti-HCV antibody produced using the epotope-tagged HCV particles of the present invention as an active ingredient can be formulated according to a conventional method (Remington's Pnarmaceutical Science, Latest Edition, Mark Pub ⁇ i). sning Company, Easton, USA) and may contain both pharmaceutically acceptable carriers and additives.
  • Such carriers and pharmaceutical additives include water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, carboxy vinyl polymer, sodium carboxymethyl cellulose, sodium polyacrylate Lithium, sodium alginate, water-soluble dextran, sodium carboxymethyl starch, pectin, methylcellulose, ethinolecellulose, xanthan gum, gum arabic, casein, agar, polyethylene glycol, diglycerin, glycerin, propylene glycol, petrolatum, paraffin, Examples include stearyl alcohol, stearic acid, human serum albumin (HSA), mannitol, sorbitol, lactose, and surfactants acceptable as pharmaceutical additives.
  • HSA human serum albumin
  • the actual additive is selected, for example, from the above alone or in appropriate combination depending on the dosage form of the therapeutic agent of the present invention, but is not limited thereto.
  • the anti-HCV antibody prepared using purified epotope-tagged HCV particles is dissolved in a solvent such as physiological saline, buffer solution, grape grape solution, etc.
  • Agents such as Tween 80, Tween 20, gelatin, human serum albumin and the like can be used.
  • it may be lyophilized to obtain a dosage form that is dissolved and reconstituted before use.
  • sugar alcohols or saccharides such as mannitol and glucose are used. be able to.
  • Example 1 Construction of J6 / JFH-1 plasmid with FLAG tag sequence inserted into HCV E2 HVR1 region
  • the HCV genomic RM cDNA is a J6CF strain from 5 'UTR to NS2 N-terminal 16 amino acid residues of genotype 2a (GenBank accession number AF177036, Yanagi, M. et al., Virology, 262 (1999) p250 -263) 3 from the N-terminal 17 amino acid residues of NS2.
  • Up to UTR is also the JFH-1 strain (genbank accession number AB0476) of genotype 2a
  • H-1 chimeric cMA was used.
  • a FLAG tag to be inserted a cDNA in which the FLAG sequence was repeated once or three times was inserted.
  • Each of these prepared plasmids is p
  • pJFHl (Wakita, T. et al. Nat. Med., A plasmid DNA constructed by cloning cDNA corresponding to the entire region of genomic RNA derived from JFH1 strain into pUC19 plasmid. 11 (2005) p791-796 (International Publication W02004 / 104198) was digested with EcoRI and then partially digested with Bell to remove the plasmid from the EcoRI site to the first Bell site (approximately 2840 bp). The fragment was purified.
  • a genomic cDNA derived from the J6CF strain cloned in pUC19 plasmid, pJ6CF (GenBank accession number AF177036, Yanagi, M., et al., Virology 262: 250-263, 1999) is partially composed of EcoRI and Bell. The approximately 2840 bp fragment obtained by digestion was ligated to the above fragment to obtain J6 / JFH1.
  • the J6 / JFH1 cDNA was used as a saddle, and 10 1 buffer 10 1 and 2 mM dNTP mixture 4 1 and 10 ⁇ were attached to the Phusion High-Fidelity DNA Polymerase kit (FINNZYMES).
  • Primers E2-F (SEQ ID NO: 4) and IF-R (SEQ ID NO: 5) were each added at 1 ⁇ l, and finally deionized water was added to make the total amount 49.5 ⁇ l. Thereafter, Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES) was added 0.5 ⁇ l and PCR reaction was performed.
  • the PCR reaction was performed under conditions of 30 cycles, with one cycle consisting of 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 15 seconds, and 72 ° C for 30 seconds.
  • the obtained PCR product was designated as PCR product no.
  • 10 X buffer solution (10 ⁇ 1, 2 mM dNTP mixture solution, 4 ⁇ 1, 10) attached to the Phusion High-Fidelity DNA Polymerase kit (FI ⁇ ZYMES) was used. 1 ⁇ l each of / 2-R (SEQ ID NO: 6) and IF-F (SEQ ID NO: 7) was added, and finally deionized water was added to make the total amount to 49.51. afterwards
  • PCR reaction was performed.
  • the PCR reaction was performed under conditions of 30 cycles, with one cycle consisting of 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 15 seconds, 72 ° C for 1 minute 30 seconds.
  • the obtained PCR product is designated as PCR product no. 2. It was.
  • the 10X buffer solution (10 ⁇ 1) and the 2mM dNTP mixture solution (4 ⁇ l, 10 ⁇ m) attached to the Phusion High-Fidelity DNA Polymerase kit (FINNZYMES) ⁇ 2- F (SEQ ID NO: 4) and 3F-R (SEQ ID NO: 8) were each added in ljul, and finally deionized water was added to make the total amount 49.5 ⁇ 1. Thereafter, 0.5 1 of husion DNA Polymerase (FI ⁇ ZYMES) was added and PCR was performed. The PCR reaction was performed under the conditions of 30 cycles, with one cycle consisting of 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 15 seconds, and 72 ° C for 30 seconds. The obtained PCR product was designated as PCR product no.
  • FI ⁇ ZYMES husion DNA Polymerase
  • the J6 / JFH1 cDNA was used as a cage, and the 10X buffer solution (10 ⁇ 1, 2mM dNTP mixture solution 4/1, 10M) attached to the Phusion High-Fidelity DNA Polymerase kit (FI ⁇ ZYMES) was used.
  • E2-R SEQ ID NO: 6
  • 3F-F SEQ ID NO: 9
  • deionized water was added to make the total amount 49.5 ⁇ 1.
  • Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES) 0.5 z 1 was added, and PCR was performed.
  • the PCR reaction was performed under conditions of 30 cycles, with one cycle consisting of 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 15 seconds, 72 ° C for 1 minute 30 seconds.
  • the obtained PCR product was designated as PCR product no.
  • PCR product no.1 and PCR product ⁇ ⁇ 2 DNA were mixed one by one.
  • 10X buffer solution 10 ⁇ 1, 2mM dNTP mixture 4 ⁇ 1, 10 ⁇ primer ⁇ 2-F (SEQ ID NO: 4) attached to Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Kit (F NZYMES) And ⁇ 2-R (SEQ ID NO: 6) were added respectively, and finally deionized water was added to make the total amount 49.5 / z 1.
  • F NZYMES Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Kit
  • ⁇ 2-R SEQ ID NO: 6
  • deionized water was added to make the total amount 49.5 / z 1.
  • 0.5 z 1 of Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES) was added, and PCR was performed.
  • the PCR reaction was performed under the conditions of 30 cycles, with one cycle consisting of 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 15 seconds, and 72 ° C for 2 minutes.
  • the obtained PCR product
  • J6 / JFH1 cDNA and the purified PCR product no. 5 were digested with the restriction enzyme Kpnl, and each HCV cDNA fragment was fractionated by agarose gel electrophoresis and purified. These two DNA fragments were mixed with Ligation Mix (Takara Bio Inc., Japan), and the two DNA fragments were ligated. This vector was named PJ6 / JFH-1 (1XFLAG).
  • This pJ6 / JFH-1 (1XFLAG) consists of 5 ′ untranslated region, Core protein code sequence, E1 protein coding sequence, E2 protein coding sequence, p7 Protein coding sequence, sequence encoding up to N-terminal 16 amino acid residues of NS2 protein region, and sequence encoding from N-terminal 17 amino acid residues to C-terminus of NS2 protein region of JFH-1 strain, NS3 protein code Sequence, NS4A protein coding sequence, NS4B protein coding sequence, NS5A protein coding sequence, NS5B protein region and base sequence encoding a chimeric gene consisting of 3 'untranslated region, and the FLAG peptide sequence in the HVR1 region of E2 above Contains the coding base sequence.
  • J6 / JFH1 cDNA and the purified PCR product no. 6 were digested with restriction enzyme Kpnl, and each HCV cDNA fragment was fractionated by agarose gel electrophoresis and purified.
  • FLAG in order from 5 to 3 'side, 5' untranslated region derived from J6CF strain, Core protein coding sequence, E1 protein coding sequence, E2 protein coding sequence, p7 protein coding sequence and N NS2 protein region coding sequence up to N-terminal 16 amino acid residues, JFH-1 strain NS2 protein region coding from N-terminal 17 amino acid residues to C-terminal, NS3 protein coding sequence, NS4A A base sequence encoding a chimeric gene consisting of a protein code sequence, NS4B protein coding sequence, NS5A protein coding sequence, NS5B protein region and 3 'untranslated region, and a FLAG peptide sequence in the HVR1 region of E 2 above The base sequence is repeated three times.
  • PJ6 / JFH-1 is SEQ ID NO: 10
  • pJ6 / JFH-l (1XFLAG) is SEQ ID NO: 1
  • pJ6 / JFH-l (3 XFLAG) is SEQ ID NO: 12
  • these nucleotide sequences are shown in the Sequence Listing. .
  • Example 2 In vitro RNA synthesis and introduction into cells
  • PJ6 / JFH-1, pJ6 / JFH-1 (1XFLAG) and pJ6 / JFH-1 (3XFLAG) were cleaved with Xba I, extracted with phenol / form mouth form, and ethanol precipitated.
  • each HCV RNA was synthesized using MEGAsci'ipt T7 kit (Ambion).
  • J6 / JFH-1, J6 / JFH-1 (3XFLAG) HCV Core protein contained in the culture supernatant was quantified using the HCV antigen ELI SA test kit (Ohso) at the time of passage of each cell into which RNA was introduced. Then, the production of HCV particles was confirmed. As a result, J6 / JFH-1 RNA introduction was almost constant with no change in production. However, when J6 / JFH-1 (3XFLAG) RNA was introduced, the amount of HCV Core in the culture supernatant decreased over time until the 21st day of introduction. As a result, the core production was almost the same as that of J 6 / JFH-1 after 35 days (Fig. 3).
  • J6 / JFH-1 (3XFL AG) RNA does not have high virus production ability in Huh-7 cells, but later, a compatible mutation necessary for virus production was introduced into the virus genome. It was thought to have the same ability to produce viruses as J6 / JFH-1 RNA.
  • Example 4 Expression of HCV protein by J6 / JFH-1 (3XFLAG) RNA-introduced cells
  • V protein expression was confirmed by Western blotting.
  • Cell extract samples obtained from Huh-7 cells into which RNA was not introduced were used as negative subjects.
  • Samples extracted from each cell were subjected to SDS-PAGE and blotted onto a PVDF membrane (I thigh obilon-P, Milli pore).
  • anti-core monoclonal antibody anti-FLAG monoclonal antibody (M2 antibody, Sigma) and anti-E2 monoclonal antibody, and HRP-labeled secondary antibody that recognizes these antibodies, ECL Plus (GE Healthcare) Core protein and E2 protein translated in the cell were detected.
  • Example 6 In order to evaluate the infectivity of the J6 / JFH-1 (3XFLAG) virus purified in Example 6, an infection experiment using cultured cells was performed. Huh-7 cells in one 8 wel l glass chamber
  • the cells were seeded at 1 ⁇ 10 4 cell / wel, cultured for 24 hours, and then infected with a virus solution equivalent to 1 fmol of HCV Core for 3 hours. After infection, the cells were washed twice with DMEM (Sigma) and then cultured for 4 days. After 4 days, the total RNA in the cells was extracted according to the manual attached to Trizol Reagent (Invitrogen). The amount of HCV RNA in this total RNA was measured by quantitative RT-PCR.
  • the primers and probes used are sense primer S-17 (SEQ ID NO: 1 3), antisense primer R-19 (SEQ ID NO: 14) and Taqman probe (SEQ ID NO: 1) targeting the 5'-UTR region of HCV RNA. 1 5) was used. Mix this primer and probe with the extracted total RNA, and use TaqMan EZ RT-PCR.
  • RT-PCR reaction solution was prepared according to the attached manual of CORE REAGENTS (Applied Biosystems) and detected by 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosys tems). As a result, it was shown that the purified J6 / JFH-1 (3XFLAG) virus solution was infectious to Huh-7 cells (Fig. 9). From this, it can be seen that F in the HVR1 region of HCV E2
  • Viruses containing the LAG tag sequence can be purified with high purity, and the purified virus was shown to be infectious.
  • Example 8 Construction of J6 / JFH-1 (1XFLAG) E2 N ⁇ K and J6 / JFH-1 (3XFLAG) E2 N ⁇ K mutant plasmids
  • J6 / JFH-l (1XFLAG) was used as a kit, and 10 X buffer solution 10 1 or 2 mM dNTP mixture solution attached to Phusion High-Fidelity DNA Polymerase kit (FI ⁇ ZYMES) was used. 4 ⁇ l, 10 / M primers 1141S-2a (SEQ ID NO: 16) and: [6 E2-KR (SEQ ID NO: 17) were added respectively, and deionized water was finally added to make the total amount 49.5 / z1. Thereafter, Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES) was added in an amount of 0.5 ⁇ l and PCR was performed. The PCR reaction was performed under the conditions of 30 cycles with a cycle consisting of 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 15 seconds, 72 ° C for 1 minute 30 seconds as one cycle. The obtained PCR product was designated as PCR product no.
  • FI ⁇ ZYMES Phusion High-Fidelity DNA Polymerase kit
  • PJ6 / JFH-1 (3XFLAG) was used as a saddle, 10X buffer solution 10 / _tl, 2mM dNTP mixture solution 4 ⁇ 1, attached to Phusion High-Fidelity DNA Polyraase kit (FINNZYMES), 10 ⁇ L of primer 1141S-2a (SEQ ID NO: 16) and J6E2-K-R (SEQ ID NO: 17) were each added to 1 1 each, and finally deionized water was added to make the total amount 49.5 ⁇ 1. Thereafter, Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES) was added at 0.5 ⁇ x / x 1 and PCR was performed. The PCR reaction was performed under the conditions of 30 cycles, with one cycle consisting of 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 15 seconds, 72 ° C for 1 minute 30 seconds. The obtained PCR product was designated as PCR product no.
  • PCR reaction was performed.
  • the PCR reaction was performed under the conditions of 30 cycles, with one cycle consisting of 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 15 seconds, and 72 ° C for 2 minutes.
  • the obtained PCR product was designated as PCR product no.
  • the PCR reaction was performed under the conditions of 30 cycles, with one cycle consisting of 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 15 seconds, and 72 ° C for 2 minutes.
  • the obtained PCR product was designated as PCR product no.
  • Each PCR product was purified and dissolved in 0 of 301.
  • the NA fragment was fractionated by agarose gel electrophoresis and purified. These two DNA fragments were mixed with Ligation Mix (Takara Bio Inc., Japan), and the two DNA fragments were ligated. This vector was named PJ6 / JFH-1 (1XFLAG) N ⁇ K. This pJ6 / JFH-1 (1XFLAG)
  • N ⁇ K in order from 5 to 3 ′, 5 ′ untranslated region from the J6CF strain, Core protein coding sequence, E1 protein coding sequence, E2 protein coding sequence, p7 protein coding sequence
  • the sequence encoding up to 16 amino acid residues at the N-terminal of the NS2 protein region, and the N-terminal 17 amino acid residue of the NS2 protein region of JFH-1 strain The base encoding the chimeric gene consisting of C-terminal coding sequence, NS3 protein coding sequence, NS4A protein coding sequence, NS4B protein coding sequence, NS5A protein coding sequence, NS5B protein region and 3 'untranslated region
  • the NS2 HVR1 region contains the nucleotide sequence encoding the FLAG peptide sequence, and the N-terminal sequence of the Core protein is counted as 1, so that the 532nd amino acid becomes lysine. Including the base sequence.
  • PJ6 / JFH1 and the purified PCR product no. 11 were digested with the restriction enzyme Kpnl, and each HCV cDNA fragment was fractionated by agarose gel electrophoresis and purified. These two DNA fragments were mixed with Ligation Mix (Takara Bio Inc., Japan), and the two DNA fragments were ligated.
  • This vector was named PJ6 / JFH-1 (3XFLAG) N ⁇ K.
  • This pJ6 / JFH-1 (3XFLAG) N ⁇ K is in order from 5 'side to 3' side, 5 'untranslated region from J6CF strain, Cole protein coding sequence, E1 protein coding sequence, E2 protein coding sequence , P7 protein coding sequence and NS2 protein region coding sequence up to N-terminal 16 amino acid residues, and JFH-1 strain NS2 protein region N-terminal 17 amino acid residue to C-terminal coding sequence, NS3 protein NS3A protein coding sequence, NS4B protein coding sequence, NS5A protein coding sequence, NS5 B protein region and 3 'non-translated region. It contains a nucleotide sequence that repeats the peptide sequence three times, and counts as 1 for methionine, the N-terminal sequence of the Core protein. Including so that base sequence.
  • PJ6 / JFH-1 (1XFLAG) N ⁇ K is SEQ ID NO: 20 and pJ6 / JFH-1 (3XFLAG) N ⁇ K is SEQ ID NO: 21. These nucleotide sequences are shown in the Sequence Listing.
  • Example 9 Preparation of J6 / JFH-1 (1XFLAG) E2 N ⁇ K and J6 / JFH-1 (3XFLAG) E2 N ⁇ K virus
  • Each of the plasmids prepared in Example 8 was cut with Xbal, extracted with phenol chloroform, and precipitated with ethanol.
  • Each of the HCV RNAs was synthesized using MEGAscript T7 kit (Ambion) using the cleaved plasmid as a cage.
  • HCV antigen ELISA test kit Ohso
  • J6 / JFH-1 (1XFLAG) E2 N ⁇ K and J6 / JFH-1 (3XFLAG) E2 N ⁇ K RNA HCV Core protein contained in the supernatant was quantified to confirm the production of HCV particles. Comparison of the amount of HCV Core contained in the culture supernatant of cells introduced with RNA without introduction of mutations and the amount of HCV Core contained in the culture supernatant of cells introduced with mutations from early to late stage of culture It was shown that the latter was higher.
  • Example 10 Construction of JFH-1 plasmid with FLAG tag sequence inserted into HCV E2 HVR1 region
  • genotype 2a strain JFH-1 strain (GenBank accession number AB047639, Kato, An epitope tag sequence was introduced into HVR1 of T. et al., Gastroenterology, 125 (2003) pl808-1817).
  • epitope tag cDNA with the FLAG sequence repeated once or three times was inserted.
  • JFH-1 (1XFLAG) and JFH-1 (3XFLAG) are called JFH-1 (1XFLAG) and JFH-1 (3XFLAG), respectively.
  • the N-terminal sequence of the E2 protein encoded by pJFH-1 (sometimes called pJFHl) is SEQ ID NO: 2 2, and the N-terminal sequence of the E2 protein encoded by pJFH-1 (1XFLAG) is SEQ ID NO: 23.
  • the N-terminal sequence of the E2 protein encoded by pJFH-1 (3XFLAG) is shown in SEQ ID NO: 24.
  • Figures 12 (A) to 12 (C) show how to make these plasmids.
  • JFH-1 c ⁇ as a kit, 10 ⁇ l of 10 ⁇ l buffer solution and 2 mM dNTP mixture supplied with Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Kit (FI ⁇ ZYMES) were used. 4 / l, 10 ⁇ primers JF-F (SEQ ID NO: 2 5) and JFH1- IF-R
  • PCR product (SEQ ID NO: 26) was added to each ⁇ , and finally deionized water was added to make the total amount 49.5 ⁇ 49. Then add Phusion DNA Polymerase (FI ⁇ ZYMES) 0 ⁇ 5 ⁇ 1 Then, a PCR reaction was performed. The PCR reaction was performed under the conditions of 30 cycles, with one cycle consisting of 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 15 seconds, and 72 ° C for 30 seconds. The obtained PCR product was designated as PCR product No. 12.
  • PCR reaction is 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 15 seconds, 72. C The process consisting of 1 minute and 30 seconds was taken as one cycle, and was performed under the conditions of 30 cycles. The obtained PCR product was designated as PCR product no.
  • PCR product was purified and dissolved in 0 of 151.
  • the PCR product no. 12 and PCR products ⁇ ⁇ 1 3 of DNA were mixed in each ⁇ ⁇ ⁇ .
  • This is a saddle type, Phusion High-Fi Delivery DNA Polymerase kit (FINNZYMES) supplied with 10 X buffer 10 1, 2 mM dNTP mixture 4 ⁇ 1, 10 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ primers JFH1- F (SEQ ID NO: 2 5) and 3189R-IH (SEQ ID NO: 19) was added in an amount of 1 ⁇ 1 each, and deionized water was finally added to make the total amount 49.5 ⁇ 1.
  • Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES) was added for 0.5 ⁇ 1 ⁇ l and PCR reaction was performed.
  • the PCR reaction was performed under the conditions of 30 cycles, with one cycle consisting of 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 15 seconds, and 72 ° C for 2 minutes.
  • the obtained PCR product was designated as PCR product ⁇ ⁇ 16.
  • the PCR reaction was performed under the conditions of 30 cycles, with one cycle consisting of 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 15 seconds, and 72 ° C for 2 minutes.
  • the obtained PCR product was designated as PCR product no.
  • Each PCR product was purified and dissolved in 0 of 301.
  • pJFH-1 cDNA and purified PCR product no. 16 were deleted with restriction enzymes EcoRI and Kpnl, and each HCV cDNA fragment was fractionated by agarose gel electrophoresis and purified. These two DNA fragments were mixed with Ligation Mix (Takara Bio Inc., Japan), and the two DNA fragments were ligated.
  • This vector was named pJFH-1 (1XFLAG).
  • This pJFH-1 (IX FLAG) is a nucleotide sequence that codes for the gene of the JFH1 strain, and includes a nucleotide sequence that encodes the FLAG peptide sequence in the HVR1 region of E2.
  • This vector was named pj FH-1 ( 3 XFLAG).
  • This pJFH-1 C3XFLAG) is a base sequence encoding the gene of JTH1, and contains a base sequence in which the FLAG peptide sequence is repeated three times in the HVR1 region of E2.
  • a TH1 strain with a genotype lb from 5 ′ UTR to the N-terminal 16 amino acid residue of NS2 ((Wakita, T. et al., J. Biol. Chem., 269, 14205-1 4210, 1994, JP-A-2004-179), NS2 N-terminal 17 amino acid residues to 3 'UTR genotype 2a strain JFH-1 (GenBank accession number AB047639, Kato, T.
  • TH / JFH-1 chimera cDNA was used to introduce an epitope tag sequence into HVR1 of TH / JFH1.
  • These plasmids were inserted pTH / JFH-1 (1XFLAG) and pTH / JFH-1 (3XFLAG), respectively, near the insertion site of the FLAG tag translated from these genes.
  • This amino acid sequence is shown in FIG. 13 as being derived from the N-terminal amino acid sequence of the E 2 protein.
  • the N-terminal sequence of the E2 protein encoded by ⁇ / JFH-l is SEQ ID NO: 3 2
  • the N-terminal sequence of the E2 protein encoded by pTH / JF H-1 (1XFLAG) is SEQ ID NO: 3 3
  • pTH / JFH- The N-terminal sequence of E2 protein encoded by 1 (3XFLAG) is shown in SEQ ID NO: 34.
  • Figure 14 shows how these plasmids are produced.
  • TH / JFH-1 was prepared. Using pJFH-1 cDNA as a saddle, add 10 ⁇ l of 10 X buffer and 4 ⁇ l, 10 ⁇ m of 2 mM dNTP mix attached to Phusion High-Fidelity DNA Polymerase kit (FINNZYMES). Primer JFm- ⁇ (SEQ ID NO: 4 3) and JFH1-B (SEQ ID NO: 4 4) were added in an amount of ⁇ ⁇ respectively, and deionized water was finally added to make the total amount 49.5 ⁇ 1.
  • PCR reaction was performed to amplify the 5 ′ untranslated region of JFH-1 and a part of the TH core contained in primer JFH1-B.
  • the PCR reaction was performed under the conditions of 30 cycles, with one cycle consisting of 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 15 seconds, and 72 ° C for 30 seconds.
  • the obtained PCR product was designated as PCR product no.
  • PCR reaction performs a part of NS2 from the TH core and part of the 5 'untranslated region of JFH-1 contained in ply TH-C.
  • a part of NS2 of JFH-1 contained in the rimer YH-D was amplified.
  • the PCR reaction was performed under the conditions of 30 cycles, with one cycle consisting of 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 15 seconds, and 72 ° C for 30 seconds.
  • the obtained PCR product was designated as PCR product no.
  • pJFH-1 was used as a saddle, and 10X buffer was added to the Phusion High-Fidelity DNA Polymerase kit (FINNZ YMES).
  • 10 1 2raM dNTP mixture was added to 10 M ply JFm-E (SEQ ID NO: 47) and JFH1-F (SEQ ID NO: 48) was added in an amount of ⁇ , and finally deionized water was added to make the total amount 49.5 ⁇ 1.
  • Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES) 0 ⁇ 5 ⁇ 1 and perform PCR reaction. Amplify part of NS2 NS3 of JFH-1 and part of NS2 of TH contained in ply JF-E. Went.
  • the PCR reaction was performed under the conditions of 30 cycles, with one cycle consisting of 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 15 seconds, and 72 ° C for 30 seconds. What is the PCR product obtained? 13 ⁇ 4 product ⁇ ). 20.
  • FIG. 14 (A) (C) A method for producing pTH / JFH-1 (1XFLAG) pTH / JFH-1 (3XFLAG) using this plasmid is shown in FIG. 14 (A) (C). Specifically, the 10X buffer solution 10 ⁇ 1 2m dNT that was attached to the Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Kit (FIYZYMES) using the pTH / JFH-1 cDNA as a saddle type was used.
  • FIYZYMES Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Kit
  • PCR product no 4 1 10 liters of ply TH-F (SEQ ID NO: 3 5) and TH-1F-R (SEQ ID NO: 36) were added in an amount of ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ respectively, and finally deionized water was added to make the total amount 49.5 ⁇ 1. Then, add 0.5 ⁇ 1 of Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES) and use PCR. Reaction was performed. The PCR reaction was performed under the conditions of 30 cycles, with one cycle consisting of 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 15 seconds, and 72 ° C for 30 seconds. The obtained PCR product was designated as PCR product no.
  • PCR reaction was carried out using Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES) for 0.5 ⁇ 5/1 force. The PCR reaction was performed under conditions of 30 cycles, with one cycle consisting of 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 15 seconds, 72 ° C for 1 minute 30 seconds. The obtained PCR product was designated as PCR product no.23.
  • PCR product was designated as PCR product no.24.
  • PCR product was designated as PCR product no.25.
  • PCR product no. 24 and PCR product no. 25 ⁇ A were mixed one by one.
  • 10X buffer solution supplied with Phusion High-Fidelity DNA Polymerase kit (FINNZYMES), lO w 1, 2mM dNTP mixture 4 1, 10 / _t M Primer TH- F (SEQ ID NO: 3 5) and 3189R-IH (SEQ ID NO: 19) were added respectively, and deionized water was finally added to make the total amount 49.5 ⁇ 1. Thereafter, 0.5 ⁇ l of Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES) was added and PCR was performed.
  • the PCR reaction was performed under the conditions of 30 cycles, with one cycle consisting of 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 15 seconds, and 72 ° C for 2 minutes.
  • the obtained PCR product was designated as PCR product no.
  • Each PCR product was purified and dissolved in 30 ⁇ 1 3 ⁇ 40.
  • pTH / JFH-1 cDNA and the purified PCR product no. 26 were digested with the restriction enzyme Kpnl, and each HCV cDNA fragment was fractionated by agarose gel electrophoresis and purified. These two DNA fragments were mixed with Ligation Mix (Takara Bio Inc., Japan), and the two DNA fragments were linked.
  • This vector was named pTH / JFH-1 (1XFLAG).
  • This pTH / JFH-1 (1XFL AG) is a base sequence encoding a gene of TH1 strain, and includes a base sequence encoding a FLAG peptide sequence in the HVR1 region of E2.
  • pTH / JFHl cDNA and the purified PCR product no. 27 were digested with the restriction enzyme Kpnl, and each HCV cDNA fragment was fractionated by fuzzy mouth gel electrophoresis and purified. These two DNA fragments were mixed with Ligation Mix (Takara Bio Inc., Japan), and the two DNA fragments were ligated.
  • This vector was named pTH / JFH-1 (3XFLAG). This pTH / JFH-1
  • (3XFLAG) is a base sequence encoding a gene of ⁇ 1 strain, and includes a base sequence obtained by repeating the FLAG peptide sequence three times in the HVR1 region of E2.
  • pTH / JFHl is SEQ ID NO: 40
  • pTH / JFH-1 (1XFLAG) is SEQ ID NO: 41
  • pTH / JFH-1 (3 XFLAG) is SEQ ID NO: 42
  • these nucleotide sequences are shown in the Sequence Listing.
  • the epitope-tagged HCV particle-containing culture supernatant is passed through a column packed with a carrier to which an anti-epitope-tagged antibody is immobilized, whereby the epitope-tagged HCV particle is specifically adsorbed, and then the HCV particle is eluted.
  • a column packed with a carrier to which an anti-epitope-tagged antibody is immobilized whereby the epitope-tagged HCV particle is specifically adsorbed, and then the HCV particle is eluted.
  • the HCV particle is eluted.
  • HCV particles in a method for producing and purifying HCV particles in a cultured cell system, HCV particles can be purified more easily and with a higher purity than conventional methods. Since the HCV particles provided by the method of the present invention have high purity, they are suitable as vaccines for preventing or treating HCV. Furthermore, the epotope-tagged HCV particles of the present invention can be used as a tool for inducing antibodies against HCV.
  • the HCV particles provided by the method of the present invention have a high purity, they can be suitably used as a vaccine for preventing or treating HCV. Furthermore, the epitope-tagged HCV particles according to the present invention can be used as a tool for inducing antibodies against HCV. All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety. Sequence table free text
  • SEQ ID NO: 2 N-terminal sequence of E2 protein encoding pJ6 / JFH-l (lXFLAG)
  • SEQ ID NO: 3 N-terminal sequence of E2 protein encoding pJ6 / JFH-l (3XFLAG)
  • SEQ ID NO: 4 Primer-(E2-F)
  • Sequence number 8 Primer-(E2-F) Sequence number 9: Primer (3F-R)
  • SEQ ID NO: 14 Primer (R-19)
  • SEQ ID NO: 17 Primer (J6E2-K-R)
  • SEQ ID NO: 18 Primer (J6E2-K-F)
  • SEQ ID NO: 22 N-terminal sequence of E2 protein encoded by pJFH-1
  • SEQ ID NO: 2 3 N-terminal sequence of E2 protein encoded by pJFH-1 (1XFLAG)
  • SEQ ID NO: 2 4 N-terminal sequence of E2 protein encoded by pJFH-1 (3XFLAG)
  • SEQ ID NO: 2 5 Primer (JFH1 -F)
  • SEQ ID NO: 2 6 Primer (Ji3 ⁇ 4 ⁇ 1F-R)
  • SEQ ID NO: 2 7 Primer (JF1H-1F-F)
  • SEQ ID NO: 2 8 Primer (JFH1-3F-R)
  • SEQ ID NO: 29 Primer (JFH1-3F-F)
  • SEQ ID NO: 30 pJFH-1 (1XFLAG)
  • SEQ ID NO: 3 2 N-terminal sequence of E2 protein encoded by pTH / JFHl
  • SEQ ID NO: 3 3 N-terminal sequence of E 2 protein encoded by pTH / JFH-1 (1XFLAG)
  • SEQ ID NO: 3 4 pTH / JFH -1 (3XFLAG) encoded E2 protein N-terminal sequence
  • SEQ ID NO: 35 Primer (TH-F)
  • SEQ ID NO: 3 6 Primer (TH-1F-R)
  • SEQ ID NO: 3 7 Primer (TH-1F-F)
  • SEQ ID NO: 3 8 Primer (TH-3F-R)
  • SEQ ID NO: 3 9 Primer (TH-3F-F)
  • SEQ ID NO: 40 pTH / JFHl
  • SEQ ID NO: 4 3 Primer (JFH1-A)
  • SEQ ID NO: 4 4 Primer (JFH1-B)
  • SEQ ID NO: 45 Primer (TH-C)
  • SEQ ID NO: 47 Primer (JFHl-E)
  • SEQ ID NO: 48 Primer (JFHl-F)
  • SEQ ID NO: 4 9 Epitope tag peptide (1XFLAG + L inker)
  • SEQ ID NO: 50 Epitope tag peptide (3XFLAG + Linker)
  • SEQ ID NO: 5 1 Epitope tag peptide (1XFLAG)
  • SEQ ID NO: 5 2 Epitope tag peptide (3XFLAG) sequence Number 5 3: Linker

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Abstract

この発明は、天然またはキメラＣ型肝炎ウイルス（HCV）ゲノムのE2タンパク質2の超可変領域1にエピトープタグペプチドをコードする核酸配列を含む核酸、上記核酸によってコードされるエピトープタグ化HCV粒子、および抗エピトープタグ抗体固定化担体を利用した上記HCV粒子の簡便かつ高純度の精製方法に関する。

Description

明 細 書 ェピトープタグ化 C型肝炎ウィルス粒子の作製と利用 技術分野
本発明は、 ェピトープタグ化 C型肝炎ウィルス粒子、 該ウィルスを生産するた めのベクター、 該ウィルス粒子を生産する細胞株に関する。 また、 本発明は、 該 ウィルス粒子を精製する方法、 該ウィルス粒子を不活化して得られるワクチン、 抗原としての該ウィルス粒子に対する抗 C型肝炎ウィルス抗体に関する。 背景技術
C型肝炎ウィルス (HCV： Hepatitis C virus；以下、 単に 「HCV」 と称すること もある） は非 A非 B肝炎の主要な原因ウィルスとして発見同定され （非特許文献 1 ) 、 高感度な HCV の検出方法が確立されたことにより、 輸血による新たな HCV 感染患者は激減した。 しかしながら、 日本におけるウィルス保有者は肝炎の症状 を示していない、 いわゆるウィルスキャリアーを含めると 200万人以上、 世界で 1億 7000万人以上と推定されている。 それは HCV感染による肝炎の慢性化率が 70〜80%と高いことや、 現在のところィンターフヱロン以外の有効な抗ウィルス 剤がないことが大きな原因となっている。 さらに、 C型肝炎は予後の悪い深刻な 感染症であり、 C型慢性肝炎患者の半数程度は肝硬変、 肝癌へと病態が確実に悪 化していく。 こうしたことから、 キヤリァ一の発症予防やウィルスの排除を目的 とした抗ウィルス薬やワクチンの開発が望まれている。
HCVに対する治療薬を開発するためには、 感染性 HCV粒子や HCVが増殖するメ 力-ズムを研究するための細胞培養系が必要である。 これまで、 HCV を効率よく 増殖させることのできる実験系としては、 チンパンジーを用いた動物実験系のみ しか存在しなかったことが、 HCV 治療薬の開発の遅れの主たる原因であった。 し かし、 2005年に脇田らによって、 細胞培養系で感染性ウィルスを作製する技術が 開発され （特許文献 1および 2、 非特許文献 2 ) 、 感染性 HCV粒子を用いて、 HCV 治療薬を開発することが可能となった。 このような状況にあって、 細胞培養系で産生された感染性 HCV粒子を精製する ための公知の技術 （特許文献 2および非特許文献 3 ) よりも、 簡便かつ高純度に 感染性 HCV粒子を精製する新たな技術開発の必要性がある。
細胞培養系で得られたタンパク質を簡便にかつ髙純度に精製する方法としては、 目的タンパク質を標識となるタンパク質との融合タンパク質として発現させ、 標 識となるタンパク質に対する抗体やこれに特異的に結合する分子で融合タンパク 質を精製する技術が知られている。
標識となるタンパク質はェピトープタグあるいは単にタグ（Tag)と呼称される。 ェピトープタグとしては、 FLAGぺプチド、 3XFLAGぺプチド、 HAぺプチド， 3XHA ぺプチド、 fflycぺプチド、 6XH isぺプチド、 GSTポリぺプチド、 MBPポリぺプチド、 PDZ ドメインポリぺプチド、 TAP (Tandem Affinity Purification)ぺプチド、 アル カリフォスファターゼ、 アビジンなどが知られている。 これらのぺプチドまたは ポリペプチドは、 通常目的のタンパク質の N末端または C末端に融合されるが、 場合によっては目的のタンパク質内に挿入することもできる。
しかし、 タンパク質にェピトープタグを付加する際に、 タンパク質の種類、 ェ ピトープタグの種類、 タンパク質上のェピトープタグの付加位置などによって、 タンパク質本来の生物活性や立体構造が変化しないという保証はない。 そのため タンパク質毎、 ェピトープタグの種類毎、 さらにはェピトープタグの付加位置毎 にェピトープタグ化タンパク質の生物学的機能を調べる必要がある。
HCVのゲノムは、 約 9600ヌクレオチドからなる（+)鎖の一本鎖 RNAである。 こ のゲノム RNAは、 5'非翻訳領域 （5' NTRまたは 5' UTRとも表記する） 、 構造領域 と非構造領域とから構成される翻訳領域、 および 3'非翻訳領域 （3' NTR または 3' UTR とも表記する） からなる。 その構造領域には HCVの構造タンパク質がコー ドされており、 非構造領域には複数の非構造タンパク質がコードされている。 このような HCVの構造タンパク質 （Core、 El、 E2および p7) と非構造タンパク 質 （NS2、 NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A、 および NS5B) は、 翻訳領域から一続きのポリ プロテインとして翻訳された後、 プロテアーゼによる限定分解を受けて遊離、 生 成される。 構造タンパク質のうち、 Coreはコアタンパク質であり、 E1および E2 はエンベロープタンパク質である。 非構造タンパク質はウィルス自身の複製に関 与するタンパク質であり、 S2はメタ口プロテアーゼ活性、 NS3はセリンプロテア ーゼ活性 （N末端側の 3分の 1) とへリカーゼ活性 （C末端側の 3分の 2) を有す ることが知られている。 さらに、 NS4Aは NS3のプロテアーゼ活性に対するコフア クタ一であり、 NS5Bは RNA依存 RNAポリメラーゼ活性を有することも報告されて レ、る。
HCV はエンベロープと呼ばれる被膜で包まれている。 エンベロープは宿主細胞 の膜に由来する成分とウィルスに由来するタンパク質からなる。 HCV のェンベロ ープを構成するタンパク質は、 エンベロープタンパク質 1 (E1 と呼称する) 、 ェ ンべロープタンパク質 2 2と呼称する） および p7からなる。 特に E1および E2 はその C末端に膜貫通領域を持っており、 HCVの膜にこの膜貫通領域を介してァ ンカーされ、 HCV粒子形成や感染に関与している（非特許文献 4、非特許文献 5 )。
E2 タンパク質のァミノ末端側にはウィルス株間で著しく配列の異なるところ が 2力所存在し、 超可変領域 1 (HVR1 と呼称する）と超可変領域 2 (HVR2と呼称す る）と命名されている （非特許文献 6 ) 。 HVR1は E2タンパク質のァミノ末端部分 の 27アミノ酸からなり、 E2タンパク質の表面に露出して B細胞ェピトープにな つている。 HVR1のアミノ酸配列の多様性は最大 80%を示すがアミノ酸が保存され ている部分も数力所認められることから、 ウィルスの生存にはある一定の 2次構 造が必要であると考えられている。さらに HVR1にはシスティン残基ゃァスパラギ ン結合型糠鎖付加シグナルはほとんど存在しない。 一方、 HRV2は 7アミノ酸より なり、 E2タンパク質のアミノ末端より 91 - 97番目に位置している。 HRV2は HCV lb 型のゲノムに存在するが、 他の遺伝型の HCVには存在しない。
HCV においてウィルス粒子にェピトープタグが挿入された例としては、 JFH-1 株 （HCV2a型） の E2タンパク質の HVR1が HAペプチドに置換されたものが公知で あり、感染性を有することが確かめられている （非特許文献 2 )。 しかしながら、 この感染性ェピトープタグ化 HCV粒子が高純度に精製できたとの報告はない。
特許文献 1 W005080575A1
特許文献 2 W006022422A1
非特許文献 1 Choo， QL. et al.， Science, 244 : 359-362， 1989
非特許文献 2 Wakita, T. et al. , Nat. Med. , 11 : 791 - 796， 2005 非特許文献 3 Zahn, A. &Allainl， JP. , J. Gen. Virol. , 86 : 677 - 685， 2005 非特許文献 4 Voisset, C. & Dubui sson， Biology of the Cell, 96 : 413—420,
2004
非特許文献 5 Op De Beeck, A. et al,， J. Gen. Virol. , 82 : 2589-2595, 2001 非特許文献 6 Hi jikata, M. et al. , Biochem Biophys Res Comraun. , 175 : 220-228， 1991 発明の開示- 本発明の目的は、 HCV粒子を簡便かつ高純度に精製可能なェピトープタグ化 HC V粒子とその精製方法、 および高純度 HCV粒子を用いたワクチン等を提供するこ とにある。
本発明者らは、 HCV粒子の細胞培養での生産性および感染性に影響しないェピ トープタグの種類およびェピトープタグを付加する HCVタンパク質と付加位置と の組み合わせを検討し、 本発明の第一の目的であるェピトープタグ化 HCV粒子の 作製に成功した。 さらに、 この HCV粒子を高生産するクローンを作製し、 産生さ れたェピトープタグ化 HCV粒子が抗ェピトープタグ抗体カラムを用いて 1ステツ プで高純度に精製できることを確認し、 本発明を完成させるに至った。
すなわち、 本発明は以下の （1 ) 〜 （1 5 ) に関する。
( 1 ) 下記の （a ) 、 （b ) または （c ) を含む核酸であって、 （a ) 、 ( b ) または（ c ) の E2タンパク質コード配列の超可変領域 1 (HVR1)にェピトープタグ ぺプチドをコ一ドする核酸配列を含む、 核酸。
( a ) C型肝炎ゥィルス （HCV) の JFH - 1株のゲノム
( b ) HCVの J6CF株の 5， 非翻訳領域、 Coreタンパク質コード配列、 E1タンパ ク質コ一ド配列、 E2タンパク質コード配列および p7 タンパク質コード配列、 な らぴに、 JFH - 1株の NS2タンパク質コード配列、 NS3タンパク質コード配列、 NS4 Aタンパク質コ一ド配列、 NS4Bタンパク質コード配列、 NS5Aタンパク質コード配 列、 NS5Bタンパク質コード配列おょぴ 3' 非翻訳領域、 を含むキメラ HCVゲノム
( c ) HCVの JFH-1株の 5， 非翻訳領域、 TH1株の Coreタンパク質コード配列、
E1タンパク質コード配列、 E2タンパク質コード配列おょぴ p7タンパク質コード 配列、 ならびに、 JFH - 1株の NS2タンパク質コード配列、 NS3タンパク質コード配 列、 NS4Aタンパク質コード配列、 NS4Bタンパク質コード配列、 NS5Aタンパク質 コード配列、 NS5Bタンパク質コード配列おょぴ 3' 非翻訳領域、 を含むキメラ HC Vゲノム
( 2 ) 上記ェピトープタグペプチドは、 DYKDDDDKまたは DYKDHDGDYKDHDIDYKDD DDKからなるアミノ酸配列を含む、 上記 （1) に記載の核酸。
(3) 上記ェピトープタグペプチドは、 リンカ一配列をさらに含む、 上記 （1) または （2) に記載の核酸。
(4) 上記リンカ一配列は、 GGG配列、 GGGGS配列もしくは (GGGGS) 3配列、 また は、 GGG配列、 GGGGS配列もしくは（GGGGS) 3配列の一部において 1〜1 0個のアミ ノ酸の欠失、 置換または付加を含むリンカ一配列である、 上記 （3) に記載の核 酸。
(5) 配列番号 1 1、 1 2、 30、 3 1、 4 1または 42で示される、上記 （1) 〜（ 4 )のいずれかに記載の核酸（ただし核酸が RNAの場合は配列表の塩基記号「TJ は 「UJ に読み替えるものとする）。
( 6 ) 上記超可変領域 1 (HVR1) の最後の配列の次のァミノ酸を 1番としたと き、 1 22番目または 1 24番目のアミノ酸であるァスパラギンをリジンに置換 する変異を含む、 上記 （1) 〜 （5) のいずれかに記載の核酸。
(7) 配列番号 20または 2 1で示される、 上記 （6) に記載の核酸（ただし核 酸が RNAの場合は配列表の塩基記号 「T」 は 「U」 に読み替えるものとする）。
(8) 上記 （1) 〜 （7) のいずれかに記載の核酸を含有するべクタ一。
(9) 上記 （1) 〜 （7) のいずれかに記載の核酸をゲノムとして含有するェ ピトープタグ化 HCV粒子。
(1 0) 上記 （9) に記載のェピトープタグ化 HCV粒子を含有する細胞。
(1 1) Huh7またはその派生株である、 上記 （10) に記載の細胞。
(1 2) 上記 （1 0) または上記 （1 1) に記載の細胞からェピトープタグ化 HCV粒子を生成する生成ステップと、
上記ェピトープタグ化 HCV粒子を含有する液体を抗ェピトープタグ抗体固定化 担体に接触させ、 そのェピトープタグ化 HCV粒子を抗ェピトープタグ抗体固定化 担体に吸着させる吸着ステツプと、
上記ェピトープタグ化 HCV粒子を上記抗ェピトープタグ抗体固定化担体から遊 離させてェピトープタグ化 HCV粒子を得る遊離ステツプと、
を備える、 ェピトープタグ化 HCV粒子の精製方法。
( 1 3 ) 上記遊離ステップは、 ェピトープタグぺプチド含有緩衝液、 カルシゥ ム不含緩衝液、 pH2. 5〜pH4. 0の 0. 1Mグリシン緩衝液、 pH4. 0〜pH5. 0の 1Mアルギ ニン塩酸緩衝液または 0. lmM〜lmM の塩酸のいずれかを用いて、 上記抗ェピトー プタグ抗体固定化担体から上記ェピトープタグ化 HCV粒子を遊離させる、上記（ 1 2 ) に記載の精製方法。
( 1 4 ) 上記 （9 ) に記載のェピトープタグ化 HCV粒子を不活化して得られる HCVヮクチン。
( 1 5 ) 抗原としての上記 （9 ) に記載のェピトープタグ化 HCV粒子に対する 抗 HCV抗体。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2007-184587号の明細書 および Zまたは図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 HCV E2の構造図を示す。 N1〜N11は糖鎖付加部位、 HVRは Hyper Vari able Region, TMDは Trans Membrane Domainを示す。 J6/JFH - 1 の E2 HVR1のアミ ノ酸の一部 （下線） の部分を除き、 そこに FLAGタグ配列 （下線） を挿入した。 図 2 A、 図 2 Bおよび図 2 Cは、 PJ6/JFH- 1 (1XFLAG)、 pJ6/JFH- 1 (3XFLAG)プ ラスミ ドの構築図を示す。 図 2 Bは、 図 2 Aの続きであり、 図 2 Cは、 図 2 Bの 続きである。
図 3は、： T6/JFH- 1 RNAおよび J6/JFH- 1 (3XFLAG) RNAを Huh- 7細胞に導入後の 培養上清中の HCV Coreタンパク質量の変化を示す。 J6/JFH-1ではその産生量に 変化はなかったが、 J6/JFH - 1 (3XFLAG)では Core産生量が 22日目まで減少したが、 その後、 増加し 35日目で J6/JFH - 1とほぼ同じ産生量となった。
図 4は、 J6/JFH - 1 RNAおよび J6/JFH- 1 (3XFLAG) RNAを Huh- 7細胞に導入後、
4, 17, 30， 43日目の HCV Coreおよび E2タンパク質の発現を示す。 J6/JFH - 1 (3 XFLAG)において、 30, 43 日目の E2タンパク質の分子量は 4 日目よりも低くなつ ていることが示された。
図 5は、 J6/JFH-1 (3XFLAG) RNAを Huh- 7細胞に導入後、 4, 17, 30， 43日目の HCVE2 タンパク質をエンドグリコシダーゼ （PNGase F) で処理したときの挙動を 示す。 エンドグリコシダーゼ処理することにより、 図 4で見られたような分子量 の違いは見られなくなった。
図 6は、 J6/JFH- 1 (3XFLAG) RNA導入後、 8日目と 39日目の HCVゲノムの配列 解析を示す。 RNA導入後から 39 日目で E2領域の糖鎖付加部位であるァスパラギ ン（N6)がリジン（K)に置換されていた。
図 7は、 J6/JFH- 1 (3XFLAG)ウィルスの精製溶液中の HCV Coreタンパク質量を 示す。 1XFLAGぺプチドまたは 3XFLAGぺプチド溶出により HCV Coreタンパク質が 検出されたことから、 HCV粒子の精製が確認された。
図 8は、 精製した J6/JFH- 1 (3XFLAG)ウィルス溶液中に含まれる夾雑タンパク 質について示す。 精製したウィルス溶液中には夾雑タンパク質はほとんど含まれ ていなかった。
図 9は、 精製した J6/JFH- 1 (3XFLAG)ウィルスの感染性について示す。 各ウイ ルスを感染後、 4 日目の細胞内の HCV RNAを定量した。 精製したウィルスは未精 製のウィルスと同等の感染性を有することが確認された。
図 1 0 A、 図 1 0 Bおよび図 1 0 Cは、 PJ6/JFH- 1 (1XFLAG) N→K、 pJ6/JFH- 1 (3XFLAG) N→Kプラスミ ドの構築図を示す。図 1 0 8は、図1 O Aの続きであり、 図 1 0 Cは、 図 1 0 Bの続きである。
図 1 1は、 HCV E2の構造図を示す。 N1〜N11は糖鎖付加部位、 HVRは Hyper Va riable Region, TMDは Trans Membrane Domainを示す。 JFH - 1の E2 HVRlのアミ ノ酸の一部 （下線） の部分を除き、 そこに FLAGタグ配列 （下線） を挿入した。 図 1 2 A、 図 1 2 Bおよぴ図 1 2 Cは、 pJFH- 1 ( 1 XFLAG)、 pJFH- 1 (3XFLAG)プ ラスミ ドの構築図を示す。 図 1 2 Bは、 図 1 2 Aの続きであり、 図 1 2 Cは、 図 1 2 Bの続きである。
図 1 3は、 HCV E2の構造図を示す。 N1〜N11は糖鎖付加部位、 HVRは Hyper Va riable Region, TMDは Trans Membrane Domainを示す。 pTH/JFH-1の E2 HVRlの アミノ酸の一部（下線）の部分を除き、そこに FLAGタグ配列（下線）を挿入した。 図 1 4 A、 図 1 4 Bおよび図 1 4 Cは、 pTH/JFH-1 (1XFLAG) , pTH/JFH- 1 (3XF LAG)プラスミ ドの構築図を示す。 図 1 4 Bは、 図 1 4 Aの続きであり、 図 1 4 C は、 図 1 4 Bの続きである。 発明を実施するための最良の形態
本発明の実施にあたっては、 当該分野の技術の範囲内にある分子生物学および 免疫学の従来技術を利用するものとする。 このような技術は、 当業者には自明で あり、 既報において十分に説明されている （たとえば、 Sambrookら、 Molecular Cloning : A Laboratory Manual (第 3版， 2001)、 Ed Harlowり、 Antibodies： A L aboratory Manual (1988) を参照） 。
また、 本明細書中に引用されている全ての刊行物、 特許および特許出願は、 そ の全体が本明細書に参考として、 援用される。
1 . ェピトープタグ化 HCV粒子
本発明にかかる 「ェピトープタグ化 HCV粒子」 とは、 HCVの構造タンパク質内 にェピトープタグぺプチドが付加された HCV粒子を意味する。 このェピトープタ グ化 HCV粒子は、 細胞培養系で生産でき、 好ましくは感染性を保有している。 細胞培養系で HCV粒子を生産するためには、 JFH- 1株由来の全長遺伝子、 また は JFH - 1株と他の HCV株とのキメラ遺伝子を用いる必要があり、その基本技術は、 004104198Al W006022422Al,Wakita, T. et al. , Nat. Med. 11 : 79卜 796， 2005、 およぴ Undenbach, BD. et al. , Science 309 : 623 - 626, 2005に記載されてレヽる。 すなわち、 HCV粒子を生成できる遺伝子の 1つの形態は、 JFH-1株のウィルスゲ ノム RNAであって、 5， 側から 3 ' 側に順番に、 5 ' 非翻訳領域、 Coreタンパク質 コード配列、 E1タンパク質コード配列、 E2タンパク質コード配列、 p7タンパク 質コード配列、 NS2タンパク質コード配列、 NS3タンパク質コード配列、 NS4Aタ ンパク質コード配列、 NS4Bタンパク質コード配列、 NS5Aタンパク質コード配列、 NS5Bタンパク質コード配列および 3 ' 非翻訳領域からなる RNAである。
HCV粒子を生成できる遺伝子の別な形態は、 2種類以上の HCV株のウイルスゲノ ム RNAからなるキメラ遺伝子であって、 たとえば、 5， 側から 3， 側に順番に、 JF H-l株以外の HCV株の 5 ' 非翻訳領域、 Coreタンパク質コード配列、 E1タンパク 質コード配列、 E2 タンパク質コード配列、 p7 タンパク質コード配列および NS2 タンパク質コード配列、 ならびに、 JFH- 1株の NS3タンパク質コ一ド配列、 NS4A タンパク質コード配歹 IJ、NS4Bタンパク質コード配列、 NS5Aタンパク質コード配列、 NS5Bタンパク質コード配列おょぴ 3' 非翻訳領域からなる RNAである。
具体的には、 HCV 粒子を生成できる遺伝子としては、 下記の （a ) 、 ( b ) お よび （c ) の核酸、 すなわち、
( a ) 5' 側から 3' 側に順番に、 jrai株のゲノム （すなわち JFH - 1株由来の 5' 非翻訳領域、 Coreタンパク質コード配列、 E1 タンパク質コード配列、 E2 タンパ ク質コ一ド配列、 p7タンパク質コード配列、 NS2タンパク質コード配列、 NS3 タ ンパク質コード配列、 NS4Aタンパク質コード配列、 NS4Bタンパク質コード配列、 NS5Aタンパク質コード配列、 NS5Bタンパク質コード配列および 3 ' 非翻訳領域を 含む核酸： (配列番号 3 0 ： pJFH-1 (1XFLAG)、 配列番号 3 1 ： pJFH-1 (3XFLAG) # 照） ）
( b ) 5， 側から 3' 側に順番に、 J6CF株の 5' 非翻訳領域、 Coreタンパク質コー ド配列、 E1タンパク質コード配列、 E2タンパク質コード配列および p7タンパク 質コード配列、 ならびに、 JFH - 1株の NS2タンパク質コード配列、 NS3タンパク質 コード配列、 NS4Aタンパク質コード配列、 NS4Bタンパク質コード配列、 NS5Aタ ンパク質コード配列、 NS5Bタンパク質コード配列および 3 ' 非翻訳領域を含むキ メラ HCVゲノム （好ましくは、 5' 側から 3 ' 側に順番に、 J6CF株由来の 5 ' 非翻 訳領域、 Coreタンパク質コード配列、 E1 タンパク質コード配列、 E2タンパク質 コ一ド配列、 p7タンパク質コード配列、 および NS2タンパク質コ一ド領域の N末 端 16アミノ酸残基までコードする配列、 ならびに、 JFH - 1株の NS2タンパク質コ 一ド領域の N末端 17ァミノ酸残基から C末端までコ一ドする配列、 NS3タンパク 質コード配列、 NS4A タンパク質コード配列、 NS4B タンパク質コード配列、 NS5A タンパク質コード配列、 NS5Bタンパク質コード配列おょぴ 3， 非翻訳領域からな るキメラ HCVゲノム ：配列番号 1 0 ： pJ6/JFH - 1、 配列番号 1 1 ： pJ6/JFH- 1 (1XF LAG) , 配列番号 1 2 ： pJ6/JFH- 1 (3XFLAG)参照）
( c ) 5' 側から 3' 側に順番に、 JFH1株の 5' 非翻訳領域、 TH1株の Coreタンパ ク質コード配列、 El タンパク質コード配列、 E2タンパク質コード配列おょぴ p7 タンパク質コード配列、 ならびに、 JFH- 1 株の NS2 タンパク質コード配列、 NS3 タンパク質コード配列、 NS4Aタンパク質コード配列、 NS4Bタンパク質コード配列、
NS5Aタンパク質コード配列、 NS5Bタンパク質コード配列および 3' 非翻訳領域を 含むキメラ HCVゲノム （好ましくは、 5 ' 側から 3 ' 側に順番に、 JFH- 1株由来の
5， 非翻訳領域、 TH株の Coreタンパク質コード配列、 E1タンパク質コード配列、
E2タンパク質コード配列、 p7タンパク質コード配列、および NS2タンパク質コー ド領域の N末端 33アミノ酸残基までコードする配列、 ならびに、 JFH - 1株の NS2 タンパク質コード領域の N末端 34アミノ酸残基から C末端までコードする配列、
NS3タンパク質コード配列、 NS4Aタンパク質コ一ド配列、 NS4Bタンパク質コード 配列、 NS5Aタンパク質コード配列、 NS5Bタンパク質コード配列おょぴ 3 ' 非翻訳 領域からなるキメラ HCVゲノム ：配列番号 4 0 ： pTH/JFHl , 配列番号 4 1 ： pTH/
JFH1 (1XFLAG)、配列番号 4 2 ： pTH/JFHl (3XFLAG)参照） 、 を挙げることができる。 本発明では、上記 HCVゲノムに対し、 その E2タンパク質コード配列の超可変領 域 1 (HVR1)中にェピトープタグぺプチドである DYKDDDDKGGG (配列番号 4 9 ) ま たは DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKGGG (配列番号 5 0 ) をコードする核酸配列をイン フレームで揷入するか、 または当該領域の一部を上記ェピトープタグべプチドで 置換し、 ェピトープタグ化 HCVゲノム DNAを作製する。 そして、 この DNAを用い て 「ェピトープタグ化 HCV粒子」 を培養細胞系で産生させ、 高純度で精製された ェピト一プタグ化 HCV粒子を取得する。
2 . ェピトープタグ化 HCV粒子の作製
( 1 ) HCV構造タンパク質内にェピトープタグを持つ HCVゲノム DNAの作製 本明細書で用いられる「ェピトープタグ（あるいは単にタグ（Tag)と呼称する）」 は、 HCV の標識に使用可能のものであれば特に限定されるものではないが、 たと えば、 FLAGペプチド （flagペプチド、 Flagペプチドとも呼称する） 、 3XFLAGぺ プチド （3xFLAGペプチド、 3xFlagペプチド、 3Xflagペプチドとも呼称する） 、 H
Aぺプチド、 3XHAぺプチド、 mycぺプチド、 6XH i sぺプチド、 GSTポリぺプチド、
MBPポリぺプチド、 PDZ ドメィンポリぺプチド、 TAP (Tandem Affinity Purificat ion)ペプチド、 アル力リフォスファタ一ゼ、 アビジン等を挙げることができる。 本発明においては、 ェピトープタグペプチドとして FLAGペプチド （アミノ酸配 列： DYKDDDDK (配列番号 5 1 ) ) または 3XFLAFGぺプチド （ァミノ酸配列： DYKD HDGDYKDHDIDYKDDDDK (配列番号 5 2 ) ) を用いるが、 なかでも 3XFLAGペプチドが より好適である。
上記ェピトープタグを付加する場所は HCV粒子の E2タンパク質の HVR1領域で ある。 ェピトープタグは、 HVR1領域内において各 HCV株間での相同性が低い E2 タンパク質の N末端から数えて、 8 ~ 19番目アミノ酸の間にインフレームで （読 み枠がズレないように）挿入するか、あるいは上記 N末端の 11〜1ァ番目のアミノ 酸を除去して、 ここにェピトープタグぺプチドを挿入するのがより好適である。 上記ェピトープタグの C末端には、 必要に応じて適当なリンカーを付加する。 リンカーとして、 アミノ酸配列 GGG (配列番号 5 3 ) 、 GGGGS (配列番号 5 4 ) 、 または（GGGGS) X 3 ( (GGGGS) 3ともいう） 、 あるいは、 これらのアミノ酸配列の一 部に、 1 〜 1 0個程度、 好ましくは 1 〜 5個、 より好ましくは 1 〜 2個のァミノ 酸の欠失、 置換または付加を含むペプチドが使用され、 好適な例として GGG、 GGG GS (配列番号 5 4 ) 、 （GGGGS) X 3が挙げられるが、 GGGがより好適である。
上記ェピトープタグをコードする核酸を HCVゲノムに導入する方法としては、 ェピトープタグをコードする核酸配列を含む合成プライマーで HCVゲノムの cDNA を铸型にしてポリメラーゼ連鎖反応（PCR) を行い、得られた PCR産物を適宜制限 酵素処理、ライゲーション処理により HCVゲノムの cDNAに組み換える方法が挙げ られる。 これらの手法の例は、 後述の実施例に示されている。
使用する HCV株は限定されるものではなく、 HCV株の塩基配列を用いた系統解 析法によつて分類される遺伝子型 la (例えば H77株 （GenBank ァクセッション番 号 AF011751) ) 、 遺伝子型 lb (例えば J1株（GenBank ァクセッション番号 D8981
5)、 Conl株 （GenBank ァクセッション番号 AJ238799、 Con - 1株、 conl株と称する こともある） 、 TH株（Wakita, T. et al . , J. Biol . Chem. , 269， 14205-14210,
1994、 特開 2004-179) ) 、 遺伝子型 2a (例えば JFH- 1株 （GenBank ァクセッショ ン番号 AB047639、 Ji¾l株と称することもある） 、 J6CF株（GenBank ァクセッショ ン番号 AF177036)、 JCH-1 (GenBank ァクセッション番号 AB047640)、 JCH-2 (GenBa nk ァクセッション番号 AB047641)、 JCH-3 (GenBank ァクセッション番号 AB04764 2)、 JCH- (GenBank ァクセッション番号 AB047643)、 JCH-5 (GenBank ァクセッシ ヨン番号 AB047644)、 JCH-6 (GenBank ァクセッション番号 AB047645) ) 、 遺伝子型 2b (例えば HC-J8株（GenBank ァクセッション番号 D01221) ) 、 遺伝子型 3a (例え ば NZL1株（GenBank ァクセッション番号 D17763) ) 、 遺伝子型 3b (例えば Tr-Kj (GenBank ァクセッション番号 D49374) ) の 6タイプのいずれに属する株を使用 することができる。 本明細書の実施例においては、 本発明の好ましい例として、 非構造タンパク質コード配列および 3 ' 非翻訳領域は JFH- 1株由来のもので、 5 ' 非翻訳領域およぴ構造タンパク質コ一ド配列が TH1株、 JFH- 1株または J6CF株由 来の核酸配列を使用した。
HCV の HVR に所望のェピトープタグぺプチドを揷入するには、 HCV ゲノム RNA の cDNAをクローン化したベクターを鍀型にして、ェピトープタグぺプチドをコ一 ドした合成 DNAをプライマーとして、 PCRを行う。 これにより、 ェピトープタグ が目的の場所に付加/挿入されたエンベロープタンパク質をコードする cDNAを得 ることができる。
さらに、ェピトープタグを持つェンべロープタンパク質をコードする cDNA断片 を適切な制限酵素で消化して単離し、 T7プロモーターなどのプロモーターの下流 に完全長の HCVゲノム RNAの cDNAをクローン化したべクタ一を上記と同じ制限酵 素で消化し、 同じ位置に単離したェピトープタグ配列を持ったエンベロープタン パク質をコードする cDNA断片を揷入することでェピトープタグを有する完全長 H CV cDNAを得ることができる。
ここで使用する完全長の HCVゲノム RNAの cDNAをクローン化したベクターは、 このベクターから転写された RNAを Huh7細胞などの HCV許容性細胞に導入すると、 HCV粒子を産生可能なものであり、 その構造や作製の詳細は W004104198A1、 W006 022422A1、 Wakita, T. et al,， Nat. Med. 11 : 79卜 796, 2005、 Lindenbach, BD. et al. , Science 309 : 623- 626， 2005に記載されている。
( 2 ) 細胞培養系によるェピトープタグ化 HCV粒子の産生
プロモーターの制御下にェピトープタグコード配列を持つ HCV cDNA から RNA を合成し、 この RNAを細胞に導入することでェピトープタグ化 HCV粒子を含有す る細胞が得られ、 上記細胞を培養することでェピトープタグ化 HCV粒子を作製す ることができる。 プロモーターとしては、 限定するものではないが、 T7プロモー ター、 SP6プロモーター、 T3プロモーターが挙げられる力 T7プロモーターが特 に好ましい。
T7 プロモーターの制御下に HCV cDNAを導入し、 クローン化した核酸を铸型と して、 in vitroで RNAを作製するためには、 MEGAscript T7 kit (Ambion社）など のキッ トを用いることができる。
RNAを導入する細胞は、 HCV粒子形成を許容する細胞で有れば良く、 Huh7細胞、 HepG2細胞、 IMY-N9細胞、 HeLa細胞、 293細胞、 あるいは Huh7細胞、 HepG2細胞、 IMY-N9細胞、 HeLa細胞または 293細胞に CD81遺伝子および/または Claudinl遺 伝子を発現させた細胞が挙げられる。 なかでも Huh7細胞または Huh7細胞の派生 株が好適に使用される。 Huh7細胞の派生株としては、 Huh7. 5細胞、 Huh7. 5. 1細 胞を挙げることができる。
RNAを細胞に導入する方法としては、 リン酸カルシウム共沈殿法、 DEAEデキス トラン法、 リボフヱクシヨン法、 マイクロインジェクション法、 エレク トロポレ ーシヨン法が挙げられるが、 リポフエクシヨン法およびエレク トロポレーシヨン 法が好ましく、 エレク ト口ポレーション法がより好適である。
RNAの代わりに cDNAを細胞に導入してもよく、 この場合、 ェピトープタグコー ド配列を付加した HCV cDNAを RNAポリメラーゼ Iプロモーターとターミネ一ター と力、らなるベクター (Neumann, G. et al. , Virology, 202 : 477 - 479， 1994、 W02 007/037428A1) に機能しうる態様で挿入して、 RNA と同じ方法で細胞に導入し、 発現させる。
細胞のウィルス粒子産生能は、 培養液中に放出された HCVウィルス粒子を構成 する、 例えば、 Coreタンパク質、 E1タンパク質、 または E2タンパク質に対する 抗体を用いて評価することができる。 また、 培養液中の HCVウィルス粒子が含有 する HCVゲノム RNAを、特異的プライマーを用いた RT- PCR法により増幅して検出 することによって、 HCVウィルス粒子の産生能を間接的に評価することもできる。 作製されたウィルスが感染能を有しているか否かは、 HCV RNA を導入した細胞 を培養して得られた上清で HCV許容性細胞 （たとえば Huh7) を処理して、 たとえ ば 48時間後に上記細胞を抗コア抗体で免疫染色して感染細胞数を数える力 \上記 細胞の抽出物を SDS -ポリアクリルアミ ドゲルで電気泳動し、 ウェスタンブロット にて、 コアタンパク質を検出することで評価できる。
( 3 ) ェピトープタグ化 HCV粒子産生細胞株の取得
HCV ゲノムの効率的な複製には、 ゲノムの塩基配列に変異が起こることが必要 であることが示されており （Lohmann, V. et al. , J. Virol. 75 : 1437-1449, 20 01) 、 複製を向上させる変異は適合変異 （adaptive mutation) と呼ばれている。 上記 （ 2 ) により作製した HCVゲノム RNAが導入された細胞を継代培養すること で、 HCV 粒子を持続的に生産する細胞株を得ることができる。 このように培養を 続けることで、 HCVゲノムに適合変異が起こり、 HCV粒子生産が著しく向上するこ とがある。
上記 （a ) から （c ) の核酸において、 HVR1配歹 (Puntoriero, G. et al.， E MB0 J. 17 : 3521 - 3533, 1998) の最後の配列の次のアミノ酸を 1番としたとき、 1 22番目または 124番目のアミノ酸であるァスパラギンがリジンに置換するような 変異は、 ェピトープタグ化 HCV粒子の産生する際の変異として好適である。 中で も （a ) または （b ) の核酸では 124番目のアミノ酸がァスパラギンからリジン に置換するように変異することがより好適であり、 （c ) の核酸では 122番目の アミノ酸がァスパラギンからリジンに置換するように変異することがより好適で ある。 この位置のァスパラギンは糖鎖の修飾を受ける領域であると考えられ、 糖 鎖が付加されないことが、 HCV 粒子の高生産性と関係があることが示唆される。 本発明での適合変異は、 前述の通り継代培養によって得ることもできるが、 人 為的に導入することもできる。 適合変異を人為的に導入する場合、 変異導入用プ ライマーを設計し、 これを用いた PCRを行なうことにより変異が導入された DNA を合成することができる。 また、 突然変異体作製キッ トとして市販されている Qu i ck Charge II XL Site-Directed Mutagenesi s kit (Stratagene 社) 用いて変 異体を作製してもよい。
本発明での適合変異は、 ハイプリダイゼーション技術では 1アミノ酸が変異す るのに必要な核酸の変異を検出することは困難であるが、 HCV の遺伝子配列をシ ークエンスすることで確認することができる。
( 4 ) ェピトープタグ化 HCV粒子の精製 ェピトープタグ化 HCV粒子の精製には、 そのェピトープタグに結合することの 出来るタンパク質を結合させた担体が用いられる。 タンパク質としてはェピトー プタグペプチドに対する抗体がもっとも一般的である。 本発明においては、 好適 なェピトープタグが FLAGぺプチドまたは 3XFLAGぺプチドであり、 これらのぺプ チドに結合することの出来る抗 FLAG抗体である M2抗体や M5抗体を結合（固定化） させた担体 （いずれもシグマ社より入手できる） 等が使用できる。
FLAGェピトープタグ化 HCV粒子産生細胞または 3XFLAGェピトープタグ化 HCV 粒子産生細胞の培養上清、 あるいは該 HCV粒子含有液体、 を抗 FLAG抗体結合担体 カラムにかけ、 カラムをリン酸緩衝液で洗浄し、 FLAGペプチドまたは 3XFLAGぺ プチドを含む緩衝液で、抗 FLAG抗体結合担体に結合した HCV粒子を溶出すること ができる。 カルシウム依存的に FLAGぺプチドに結合する抗体である M5抗体を結 合させた担体を使用する場合は、 カルシウムを含有する緩衝液で HCV粒子を結合 させ、 カルシウム不含の緩衝液で HCV粒子を担体から溶出させることができる。 その他の溶出方法としては、 抗体結合担体からのタンパク質を溶出する一般的 な方法を使用することができる （Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spri ng Harbor Laboratory, 1988) 。 たとえば溶出溶液として、 0. 1Mグリシン緩衝液
(pH2. 5〜pH4. 0) または 1Mのアルギユン塩酸緩衝液 （pH4. 0〜pH5. 0) が使用でき る (Ejima, D. et al. , Anal. Biochem. 345 : 250-257, 2005) 。 さらに 0. ImM〜； Lm M の塩酸を使用することができる。 また、 溶出された HCV粒子が変性しないよう に、 溶出後の緩衝液の pHを中性付近 （PH6. 0〜PH8. 0) にするのが望ましい。 このようにして精製された HCV粒子を SDS-ポリアクリルアミ ドゲルにて電気泳 動し、 ウェスタンブロットにて、 HCV由来タンパク質を検出することで HCV粒子 が精製できたか否かを判断できる。
3 . ェピトープタグ化 HCV粒子の利用
( 1 ) ワクチン
純度の高いェピトープタグ化 HCV粒子はワクチンとしての用途、 抗 HCV抗体作 製のための抗原としての用途に好適である。
具体的には、 作製されたェピトープタグ化 HCV粒子を当該分野で既知の方法に より不活化して用いることができる。 ウィルスの不活化は、 ホルマリン， βープ 口ピオラク トン， ダルタルジアルデヒ ド等の不活化剤を、 例えば、 ウィルス浮遊 液に添加混合し、 ウィルスと反応させることにより達成することができる （Appa iahgari et al. , Vaccine, 22:3669-3675, 2004) 。
さらに、 紫外線で照射することによりウィルスの感染性を失わせ、 迅速に不活 化することもできる。 紫外線照射は、 ウィルスを構成するタンパク質などへの影 響が少なく、 ウィルスの不活化を行うことができる。 不活化するための紫外線の 線源としては一般に市販されている殺菌灯、 特に 15W殺菌灯を用いて行うことが できるが、 それに限るものではない。 また、 本発明においては、 HCV粒子は上記 に記載した方法により精製したものを用いているが、 不活化方法は精製 ·未精製 などの状態により限られるものではない。 好ましくはェピトープタグ化 HCV粒子 を含む溶液を 20 mW/cm2の紫外線で室温にて 5分以上照射することにより、 ェピ トープタグ化 HCV粒子を不活化することができる。
本発明のヮクチンは、溶液または懸濁液のいずれかの形態で、 1 0 %〜 9 5 %、 好ましくは 25%〜70%の活性成分 （ウィルス粒子またはその一部分） を含有 し、 投与可能に調製される。 液体中の溶解または懸濁に適した固形物の形態で調 製することができる。 調製物は乳濁され、 またはリボソームにカプセル化しても よい。
HCV粒子などの活性免疫原性成分は、 薬学的に受容可能であって、 活性成分に 適合した賦形剤がしばしば混合される。 適切な賦形剤には、 例えば、 水、 生理食 塩水、 デキストロース、 グリセロール、 エタノールなど、 およびそれらの混合物 が挙げられる。 さらに、 所望に応じて、 ワクチンは、 少量の補助剤 （例えば加湿 剤または乳化剤） 、 pH緩衝剤、 および/またはワクチンの効能を高めるアジュバ ントを含有し得る。 有効であり得るアジュバントの例は、 限定されないが、 たと えば、 水酸化アルミニウム、 N—ァセチルームラミル一 Lートレオ-ルー D—ィ ソグルタミン （ t h r—MDP) 、 N—ァセチルーノル一ムラミル一 L一ァラニ ルー D—ィソグルタミン （CGP 1 1 6 3 7、 n o r一 MD Pと称せられる） 、
N—ァセチルムラミルー L一ァラ-ルー D—ィソグルタミエルー Lーァラニン一
2— （1， 一 2， ージパノレミ トイノレ一 s n—グリセロー 3—ヒ ドロキシホスホリ ルォキシ） ーェチルァミン（CGP 1 98 3 5A、 MT P— P Eと称せられる） 、 および R I B Iを包含する。 R I B Iは、 バクテリアから抽出した 3成分、 すな わちモノホスホリルリピド A、 トレハロースジミコレート、および細胞壁骨格（H P L + T D M+ CW S ) を 2 %スクアレン/ T w e e n (登録商標） 8 0ェマルジ ヨン中に含有している。 アジュバントの効能は、 HCV粒子から構成されるヮクチ ンを投与することにより生じる、 抗体の量を測定することにより決定され得る。 本発明のワクチンは、 通常非経口的に、 例えば皮下注射または筋内注射のよう な、 注射により投与される。 他の投与態様に適切な別の処方としては、 坐薬、 お よびある場合には経口処方薬が挙げられる。
所望により、 アジュバント活性を有する 1以上の化合物を HCVワクチンに加え ることができる。 アジュバントは、 該免疫系の非特異的刺激因子である。 それら は、 HCV ワクチンに対する宿主の免疫応答を増強する。 当技術分野で公知のアジ ュバントの具体例としては、 フロイン ト完全および不完全ァジュバント、 ビタミ ン E、 非イオンブロック重合体、 ムラミルジペプチド、 サポニン、 鉱油、 植物油 および Carbopolが挙げられる。粘膜適用に特に適したアジュバントとしては、例 えば、 大腸菌 （E. coli) 易熱性毒素 （LT) またはコレラ （Chol era) 毒素 （CT) が挙げられる。他の適当なアジュバントとしては、例えば、水酸化アルミニウム、 リン酸アルミユウムまたは酸化アルミニウム、 油性乳剤 （例えば、 Bayol (登録商 標） または Marcol 52 (登録商標） のもの） 、 サポニンまたはビタミン E ソリュ ビリゼートが挙げられる。 したがって、 好ましい形態においては、 本発明のワク チンはアジュバントを含む。
例えば、 皮下、 皮内、 筋肉内、 静脈内に投与する注射剤において、 本発明のヮ クチンと医薬上許容される担体または希釈剤の他の具体例には、 安定化剤、 炭水 化物 （例えば、 ソルビトール、 マンニトール、 デンプン、 ショ糖、 グルコース、 デキストラン） 、 アルブミンまたはカゼインなどのタンパク質、 ゥシ血清または 脱脂乳などのタンパク質含有物質、 およぴパッファー （例えば、 リン酸バッファ 一） などともに投与することができる。
本発明のワクチンは、投与剤形に適した方法で、そして予防および/または治療 効果があるような量で投与される。 投与されるべき量は、 通常投与当たり抗原を
O . O l gから 1 0 0 , 0 0 0 // gまでの範囲であり、これは、処置される患者、 その患者の免疫系での抗体合成能、 および所望の防御の程度に依存し、 経口、 皮 下、 皮内、 筋肉内、 静脈内投与経路などの投与経路にも依存する。
本発明のワクチンは、 単独投与スケジュールで、 または好ましくは複合投与ス ケジュールで与えられ得る。 複合投与スケジュールでは、 接種の開始時期に 1〜 1 0の個別の投与を行い、 続いて免疫応答を維持するおよびまたは強化するのに 必要とされる時間間隔で、 例えば 2回目の投与として 1〜4力月後に、 別の投与 を行い得る。 必要であれば、 数ケ月後に引続き投与を行い得る。 投与のレジメも また、 少なくとも部分的には、 個体の必要性により決定され、 医師の判断に依存 する。
また本発明のワクチンは、 他の免疫制御剤 （例えば、 免疫グロブリン） と共に 投与してもよい。
さらに本発明のワクチンは、 健常人に投与し、 健常人に HCVに対する免疫応答 を誘導し、 新たな HCV感染に対し、 予防的に使用してもよい。 さらにまた、 HCV に感染した患者に投与し、 生体内に HCVに対する強い免疫反応を誘導することに より、 HCVを排除する治療的ワクチンとして使用してもよい。
( 2 ) ェピトープタグ化 HCV粒子を抗原として誘発される抗 HCV抗体
本発明のェピト一プタグ化 HCV粒子は簡便に精製でき、 高純度であるため、 抗 体作製のための抗原として有用である。
すなわち、 動物の血清には不純物に対する抗体が含まれているため、 動物の免 疫に用いる HCV粒子サンプルに不純物が存在する場合、 この不純物に対する抗体 を除くために血清を HCV抗原カラムなどで精製する必要がある。 しかしながら、 本発明のェピトープタグ化 HCV粒子は高純度な HCVとして得られるため、 このよ うな精製工程は不要である。
抗 HCV抗体は、 本発明のェピトープタグ化 HCV粒子を哺乳類または鳥類に投与 することで作製することができる。 哺乳類動物としては、 マウス、 ラット、 ゥサ ギ、 ャギ、 ヒッジ、 ゥマ、 ゥシ、 モノレモット、 ヒ トコブラクダ、 フタコブラクダ、 ラマなどを挙げることができる。 ヒ トコブラクダ、 フタコブラクダおよびラマは
H鎖のみからなる抗体を作製するには好適である。鳥類動物としては、 -ヮトリ、 ガチョウ、 ダチョウなどを挙げることができる。 本発明の粒子を投与された動物 の血清を採取して、 既知の方法に従って抗体を取得することができる。 本発明のェピトープタグ化 HCV粒子で免疫した動物の細胞を用いてモノクロ一 ナル抗体産生細胞を産生するハイプリ ド一マを作製することができる。 ハイプリ ドーマを製造する方法は周知であり、 Antibodies : A Laboratory Manual (Col d Spring Harbor Laboratory, 1988) に記載された方法を用いることができる。 モノクローナル抗体産生細胞は、 細胞融合により作製してもよく、 また癌遺伝 子 DNAの導入や Epstein- Barrウィルスの感染により Bリンパ球を不死化させるよ うな他の方法で作製してもよい。
これらの方法によって得られたモノクロ一ナル抗体ゃポリクローナル抗体は H CVの診断や治療、 予防に有用である。
本発明のェピトープタグ化 HCV粒子を用いて作製された抗体は、 C型肝炎の治 療、 予防を目的として使用される。 さらに臓器移植によるドナー臓器からの HCV の感染予防にも使用される。 さらに上記抗体は、 既存の抗ウィルス剤たとえば、 インターフェロン、 リバピリンなどとの併用でも使用できる。
抗 HCV抗体の有効投与量は、 一回につき体重 1 k gあたり 0 . O O l m gから 1 0 0 0 m gの範囲で選ばれる。 あるいは、 患者あたり 0 . 0 1〜： 1 0 0 0 0 0 m g Z b o d yの投与量を選ぶことができる。 しかしながら、 本発明のェピトー プタグ化 HCV粒子を用いて作製された抗 HCV抗体を含有する治療剤はこれらの投 与量に制限されるものではない。
上記治療剤の投与経路は特に限定されないが、 好ましくは、 皮下、 皮内、 筋肉 内投与であり、 より好ましくは、静脈内投与である。 なお、治療剤の投与時期は、 疾患の臨床症状が生ずる前後を問わない。
本発明のェピトープタグ化 HCV粒子を用いて作製された抗 HCV抗体を有効成分 として含有する治療剤は、 常法にしたがって製剤化することができ （Remington s Pnarmaceut ical Science, Latest Edition, Mark Pub丄 i sning Company, Easto n, 米国） 、 医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。 このような担体および医薬添加物の例としては、 水、 医薬的に許容される有機 溶剤、 コラーゲン、 ポリビニルアルコール、 ポリビニルピロリ ドン、 カルボキシ ビニルポリマー、 カルボキシメチルセルロースナトリウム、 ポリアクリル酸ナト リウム、 アルギン酸ナトリウム、 水溶性デキストラン、 カルボキシメチルスター チナトリウム、 ぺクチン、 メチルセルロース、 ェチノレセルロース、 キサンタンガ ム、 アラビアゴム、 カゼイン、 寒天、 ポリエチレングリコール、 ジグリセリン、 グリセリン、 プロピレングリコール、 ワセリン、 パラフィン、 ステアリルアルコ ール、 ステアリン酸、 ヒ ト血清アルブミン (H S A) 、 マンニトール、 ソルビト ール、 ラク トース、 医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。 実際の添加物は、 本発明治療剤の剤型に応じて、 たとえば上記の中から単独で または適宜組み合わせて選ばれるが、もちろんこれらに限定されるものではない。 例えば、 注射用製剤として使用する場合、 精製されたェピトープタグ化 HCV粒子 を用いて作製された抗 HCV抗体を溶剤、 例えば生理食塩水、 緩衝液、 ブドウ糠溶 液等に溶解し、 これに吸着防止剤、 例えば Tween80、 Tween20, ゼラチン、 ヒ ト血 清アルブミン等を加えたものを使用することができる。 あるいは、 使用前に溶解 再構成する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよく、 凍結乾燥のため の賦形剤としては、 例えば、 マンニトール、 ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を 使用することができる。
以下に実施例を挙げて、 本発明をより具体的に説明する。 ただし、 これらの実 施例は説明のためのものであり、 本発明の技術的範囲を制限するものではない。 実施例
実施例 1 ： HCV E2 HVR1領域に FLAGタグ配列を挿入した J6/JFH- 1プラスミ ドの 構築
HCVゲノム RMの cDNAとして、 5 ' UTRから NS2の N末端 16アミノ酸残基まで が遺伝子型 2aの J6CF株 （GenBankァクセッション番号 AF177036、 Yanagi, M. e t al. ， Virology, 262 (1999) p250-263) 、 NS2の N末端 17アミノ酸残基から 3，
UTRまでが同じく遺伝子型 2a株の JFH- 1株（GenBankァクセッション番号 AB0476
39N Kato, T. et al. , Gastroenterology, 125 (2003) pl808- 1817) である J6/JF
H - 1キメラの cMAを使用した。揷入する FLAGタグとしては FLAG配列を 1回また は 3回繰り返した cDNAを挿入した。作製されたこれらのプラスミ ドをそれぞれ p
J6/JFH-1 (1XFLAG) , pJ6/JFH - 1 (3XFLAG)と呼ぶ。 これらの遺伝子から翻訳される FLAGタグの揷入部位近傍のアミノ酸配列を E2 タンパク質の N末端のアミノ酸から図 1に示した。 J6/JFH1のコードする E2タン パク質の N末端のアミノ酸配列を配列番号 1、pJ6/jra- 1 (1XFLAG) のコードする E2タンパク質の N末端のァミノ酸配列を配列番号 2、 pJ6/JFH-l (3XFLAG) のコ 一ドする E2タンパク質の N末端のアミノ酸配列を配列番号 3に記載した。 また、 これらのプラスミ ドの作製方法を図 2 (A) 一 (C) に示す。
具体的には、 JFH1株由来ゲノム RNA全領域に対応する cDNAを pUC19プラスミ ド中にクロー-ングすることにより構築されたプラスミド DNAである pJFHl (Wak ita, T. et al. Nat. Med. , 11 (2005) p791- 796、国際公開 W02004/104198) を E coRIで消化後、 さらに Bellで部分消化し、 EcoRI部位から最初の Bell部位まで の断片 （約 2840 bp) が除去されたプラスミ ド DNA断片を精製した。 一方、 pUC19 プラスミ ド中にクローニングされた J6CF株由来ゲノム cDNA、 pJ6CF (GenBank ァクセッション番号 AF177036、 Yanagi，M.， et al. , Virology 262： 250 - 263， 199 9) を EcoRIと Bellで部分消化して得られる約 2840 bpの断片を上記の断片に連 結し、 J6/JFH1を得た。
次に、 J6/JFH1 cDNA を鍚型として、 Phusion High- Fidel i ty DNA Polymerase キット (FINNZYMES社) に添付されていた、 10 X緩衝液を 10 1、 2mM dNTP混合 液を 4 1、 10 Μのプライマー E2 - F (配列番号 4 ) および IF- R (配列番号 5 ) をそれぞれ 1 μ 1加え、最終的に脱イオン水を加え全量を 49. 5 μ 1とした。その後 Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES社） を 0. 5 μ 1力 Pえてから、 PCR反応を行つ た。 PCR反応は、 98°C 10秒、 55°C 15秒、 72°C 30秒からなる工程を 1サイクル として 30サイクルの条件で行った。 得られた PCR産物を PCR産物 no. 1とした。 次に、 J6/JFH1 cDNA を铸型として、 Phusion High - Fidelity DNA Polymerase キット （FI丽 ZYMES社） に添付されていた、 10 X緩衝液を 10 μ 1、 2mM dNTP混合 液を 4 μ 1、 10 / Μのプライマー Ε2- R (配列番号 6 ) および IF- F (配列番号 7 ) をそれぞれ 1 μ 1加え、最終的に脱イオン水を加え全量を 49. 5 1とした。その後
Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES社） を 0. 5 1加えてから、 PCR反応を行つ た。 PCR反応は、 98°C 10秒、 55°C 15秒、 72°C 1分 30秒からなる工程を 1サイ クルとして 30サイクルの条件で行った。 得られた PCR産物を PCR産物 no. 2とし た。
次に J6/JFH1 cDNAを鎵型として、 Phusion High- Fidelity DNA Polymeraseキ ット （FINNZYMES社） に添付されていた、 10X緩衝液を 10μ1、 2mM dNTP混合液 を 4 1、 10 μΜのプライマー Ε2- F (配列番号 4) および 3F- R (配列番号 8) を それぞれ ljul加え、最終的に脱イオン水を加え全量を 49.5μ 1とした。 その後 Ρ husion DNA Polymerase (FI顺 ZYMES社）を 0.5 1加えてから、 PCR反応を行った。 PCR反応は、 98 °C 10秒、 55°C 15秒、 72°C 30秒からなる工程を 1サイクルとし て 30サイクルの条件で行った。 得られた PCR産物を PCR産物 no.3とした。
次に、 J6/JFH1 cDNA を铸型として、 Phusion High- Fidelity DNA Polymerase キット （FI丽 ZYMES社） に添付されていた、 10X緩衝液を 10μ1、 2mM dNTP混合 液を 4/ 1、 10 Mのプライマー E2- R (配列番号 6) および 3F- F (配列番号 9 ) をそれぞれ 加え、最終的に脱イオン水を加え全量を 49· 5μ 1とした。その後 Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES社） を 0.5 z 1加えてから、 PCR反応を行つ た。 PCR反応は、 98°C 10秒、 55°C 15秒、 72°C 1分 30秒からなる工程を 1サイ クルとして 30サイクルの条件で行った。 得られた PCR産物を PCR産物 no.4とし た。
それぞれの PCR産物を精製し、 15 1の H20に溶かした。 PCR産物 no.1 と PCR 産物 ηο·2の DNAを各 1 1ずつ混合した。 これを铸型として、 Phusion High - Fid elity DNA Polymeraseキット （F NZYMES社） に添付されていた、 10X緩衝液を 10μ1、 2mM dNTP混合液を 4μ 1、 10μΜのプライマー Ε2 - F (配列番号 4 ) およ び Ε2- R (配列番号 6) をそれぞれ 加え、最終的に脱イオン水を加え全量を 4 9.5/z 1 とした。 その後 Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES社） を 0.5 z 1加え てから、 PCR反応を行った。 PCR反応は、 98°C 10秒、 55°C 15秒、 72°C 2分から なる工程を 1サイクルとして 30サイクルの条件で行った。得られた PCR産物を P CR産物 no.5とした。
次に PCR産物 no.3と PCR産物 no.4の DNAを各 Ιμΐずつ混合した。これを铸型 として、 Phusion High- Fidelity DNA Polymeraseキット （FINNZYMES社） に添付 されていた、 10X緩衝液を 10//1、 2mM dNTP混合液を 4μ1、 10/ζΜのプライマー
E2-F (配列番号 4) および Ε2- R (配列番号 6) をそれぞれ 1μ 1加え、 最終的に 脱イオン水を加え全量を 49· 5 1 とした。 その後 Phusion DNA Polymerase (FINN ZYMES社） を 0. 5 / 1加えてから、 PCR反応を行った。 PCR反応は、 98°C 10秒、 5 5°C 15秒、 72°C 2分からなる工程を 1サイクルとして 30サイクルの条件で行つ た。 得られた PCR産物を PCR産物 no. 6とした。 それぞれの PCR産物を精製し、 3 0 μ 1の 0に溶かした。
J6/JFH1 cDNA および精製した PCR産物 no. 5を制限酵素 Kpnlで消化し、各 HCV cDNA断片をァガロースゲル電気泳動にて分画し、 精製した。 これら 2つの DNA 断片と Ligation Mix (タカラバイオ社、 日本） を混合し、 2つの DNA断片を連結 した。 このベクターを PJ6/JFH- 1 (1XFLAG)と名付けた。 この pJ6/JFH- 1 (1XFLAG) は、 5， 側から 3 ' 側に順番に、 J6CF株由来の 5 ' 非翻訳領域、 Coreタンパク質コ ード配列、 E1 タンパク質コード配列、 E2タンパク質コード配列、 p7タンパク質 コード配列、および NS2タンパク質領域の N末端 16ァミノ酸残基までコードする 配列、 ならびに、 JFH - 1株の NS2タンパク質領域の N末端 17アミノ酸残基から C 末端間でコードする配列、 NS3タンパク質コード配列、 NS4Aタンパク質コード配 列、 NS4Bタンパク質コード配列、 NS5Aタンパク質コード配列、 NS5Bタンパク質 領域および 3 ' 非翻訳領域からなるキメラ遺伝子をコードする塩基配列であり、 上記 E2の HVR1領域に FLAGぺプチド配列をコードする塩基配列を含む。
次いで、 J6/JFH1 cDNAおよび精製した PCR産物 no. 6を制限酵素 Kpnlで消化し、 各 HCV cDNA断片をァガロースゲル電気泳動にて分画し、精製した。 これら 2つの
DNA断片と Ligation Mix (タカラバイオ社、 日本） を混合し、 2つの DNA断片を 連結した。 このベクターを PJ6/JFH- 1 (3XFLAG)と名付けた。 この PJ6/JFH- 1 (3X
FLAG)は、 5， 側から 3 ' 側に順番に、 J6CF株由来の 5 ' 非翻訳領域、 Coreタンパ ク質コード配列、 E1 タンパク質コード配列、 E2 タンパク質コード配列、 p7 タン パク質コード配列およぴ NS2タンパク質領域の N末端 16ァミノ酸残基までコード する配列、 ならびに、 JFH - 1株の NS2タンパク質領域の N末端 17ァミノ酸残基か ら C末端までコードする配列、 NS3タンパク質コード配列、 NS4Aタンパク質コー ド配列、 NS4Bタンパク質コード配列、 NS5Aタンパク質コード配列、 NS5Bタンパ ク質領域および 3 ' 非翻訳領域からなるキメラ遺伝子をコードする塩基配列であ り、 上記 E2の HVR1領域に FLAGぺプチド配列を 3回繰り返した塩基配列を含む。 PJ6/JFH-1を配列番号 1 0、 pJ6/JFH-l (1XFLAG)を配列番号 1 1、 pJ6/JFH-l (3 XFLAG)を配列番号 1 2としてこれらの塩基配列を配列表に示した。 実施例 2： In vitro RNA合成と細胞内への導入
PJ6/JFH-1, pJ6/JFH-l (1XFLAG)、 pJ6/JFH- 1 (3XFLAG)を Xba Iで切断し、 フエ ノール/ク口口ホルム抽出、 エタノール沈殿を行った。 この切断したプラスミ ド を铸型として、 MEGAsci'ipt T7 kit (Ambion社）を用いて各 HCV RNAの合成を行つ た。
3 X 106個の Huh- 7細胞と 5 μ gの HCV RNAを Cytomix溶液（120mM KC1, 0. 15 m M CaCl2, 10 mM K2HP04/KH2P04, 25 mM Hepes, 2 mM EGTA, 5 mM MgCl2, 20 mM AT P， 50 mM Glutathione) 400 μ 1で懸濁し、 4 ramキュべットに移した後、 Gene Pu lser (BioRad社）を用いて 260 V、 950 Fでエレクトロポレーシヨンを行った。 そ の後、 HCV RNA導入細胞を 10 cm2ディッシュに播種し、 継代培養を行った。 実施例 3： J6/JFH-1 (3XFLAG) RNA導入細胞による HCV粒子の産生
J6/JFH-1, J6/JFH-1 (3XFLAG) RNAを導入した各細胞の継代時に、 HCV抗原 ELI SAテス トキット（ォーソ社）を用いて培養上清中に含まれる HCV Coreタンパク質 を定量し、 HCV粒子産生の確認を行った。 その結果、 J6/JFH- 1 RNA導入ではその 産生量に変化は見られずほぼ一定だった。 しかしながら、 J6/JFH-1 (3XFLAG) RN A導入では培養上清中の HCV Core量は導入 21 日目までは経時的に減少していつ たが、 導入から 22日を経過した時点で Core量が上昇し始め、 35日経過時点で J 6/JFH- 1と同程度の Core産生量を示した（図 3)。 このことから、 J6/JFH - 1 (3XFL AG) RNAは、 Huh- 7細胞導入当所は高いウィルス産生能を有していないが、後にゥ ィルスゲノム内にウィルス産生に必要な適合変異が導入され、 J6/JFH - 1 RNAと同 様のウィルス産生能を有するようになると考えられた。 実施例 4： J6/JFH-1 (3XFLAG) RNA導入細胞による HCVタンパク質の発現
J6/JFH-1, J6/JFH-1 (3XFLAG) RNA導入から 4， 17, 30， 43日目の細胞内の HC
Vタンパク質発現をウェスタンブロッティングにより確認した。解析にあたって、 RNAを導入していない Huh - 7細胞から得られた細胞抽出試料を陰性対象とした。 それぞれの細胞からの抽出試料の SDS- PAGEを行い、 PVDF膜（I腿 obilon-P， Milli pore社）にブロッテイングした。 その後、 抗 Coreモノクローナル抗体、 抗 FLAG モノクローナル抗体（M2抗体、 シグマ社）および抗 E2モノクローナル抗体と、 こ れらの抗体を認識する HRP標識 2次抗体を用いて、 ECL Plus (GE Healthcare社） にて細胞内で翻訳された Coreタンパク質および E2タンパク質を検出した。
その結果、 J6/JFH- 1 (3XFLAG)導入において、 30, 43 日目での E2タンパク質は RNA導入時の E2タンパク質より分子量が軽くなっていることが示された（図 4)。C oreタンパク質においてはそのような変化は見られなかった。そこで、 これらの E 2タンパク質を脱糖鎖酵素である PNGase Fで処理したところ、そのような分子量 の違いはみられなくなつていた（図 5)。 このことから、 J6/JFH - 1 (3XFLAG) RNA ゲノムの E2領域は細胞の継代を重ねることによって、そのゲノム内に変異を生じ、 その部位は糖鎖結合部位である可能性が示唆された。 実施例 5：継代を重ねた J6/JFH-1 (3XFLAG) ウィルス感染細胞内の HCVゲノム配 列解析
J6/JFH-1 (3XFLAG) ウィルスが高い感染性を有するために必要な適合変異を調 ベるために、 RNA導入から 8日目と 39日目の感染細胞内の total RNAを抽出し、 この中に含まれる HCVゲノムの配列解析を行った。
その結果、 E2領域の糖鎖付加部位の一つであるァスパラギン AAU (N) がリジン AAA (K) に置換されており、 この部位の糖鎖修飾が無くなることにより、 RNA導 入時の E2タンパク質よりも分子量が軽くなることが示された（図 6)。 なお、 本ァ スパラギンは J6CF株 （GenBankァクセッション番号 AF177036、 Yanagi, M. et a 1. , Virology, 262 (1999) p250- 263)の Coreタンパク質の N末端配列であるメチ ォニンを 1 として数えて 534番目のアミノ酸に対応する。 実施例 6： J6/JFH- 1 (3XFLAG) ウィルス粒子の精製
J6/JFH-1 (3XFLAG) ウィルス粒子を精製するために、 J6/JFH- 1 (3XFLAG) RNA 導入から 56日目の培養上清を用いた。 この培養上清 600 μ ΐに、 0. 1 M glycine - HC1 (pH3. 5)で前処理した M2 抗体 agarose (シグマ社) 500 μ 1 を加え、 4°Cで 2 時間転倒混和を行った。 フロースルーを回収し、 M2 抗体 agaroseを TBS buffer で 3回洗浄後、 200 1 の 1XFLAGぺプチド（シダマ社）溶液または 3XFLAGぺプチ ド（シグマ社） 溶液を用いて 3回溶出操作を行った。 これらの溶出サンプルの HCV Coreタンパク質量を HCV抗原 ELISAテストキット（ォーソ社）により定量したと ころ、どちらの FLAGぺプチドでも溶出でき、その精製効率は約 5%であった（図 7)。 これらの溶出サンプルの純度を調べるために、 HCV Core 0. 1 fmo l 相当の溶出 サンプルおよび未精製の培養上清の SDS- PAGEを行った。その後、銀染色を行い各 溶液中に含まれる夾雑タンパク質を確認したところ、 溶出サンプルではほとんど 夾雑タンパク質は確認されなかった（図 8)。 以上から、 溶出サンプルは HCV粒子 が高純度に精製されていることが確かめられた。 実施例 7：精製した J6/JFH- 1 (3XFLAG) ウィルスの感染性の評価
実施例 6で精製した J6/JFH- 1 (3XFLAG) ウィルスの感染性を評価するために、 培養細胞を用いての感染実験を行った。 Huh- 7細胞を 8 wel lガラスチャンバ一に
1 X 104 ce l l/wel lで播種し、 24時間培養後、 HCV Core 1 fmol相当のウィルス液 を 3時間感染させた。 感染後、 DMEM (シグマ社）で 2回洗浄し、 そこから 4日間培 養を行った。 4曰後の細胞内の total RNAを Tr i zol Reagent ( i nv i trogen社）の添 付マニュアルに従って抽出した。 この total RNA中の HCV RNA量を定量的 RT- PCR 法により測定した。 使用するプライマーおよびプローブは HCV RNAの 5 ' - UTR領 域を標的としたセンスプライマー S-17 (配列番号 1 3 )、 アンチセンスプライマ 一 R-19 (配列番号 1 4 )およびタックマンプローブ （配列番号 1 5 )を用いた。こ のプライマーおよびプローブと抽出した total RNAを混合し、 TaqMan EZ RT- PCR
CORE REAGENTS (Appl i ed Biosystems)の添付マニュアルに従い RT- PCR反応溶液を 調製し、 7500 Fast Real -Time PCR Sys tem (Appl i e d Bi osys tems)による検出を行 つた。 その結果、 精製した J6/JFH- 1 (3XFLAG) ウィルス溶液は Huh- 7細胞に対し て感染性を有することが示された（図 9)。 このことから、 HCV E2の HVR1領域に F
LAG タグ配列を揷入したウィルスは高純度に精製することが可能であり、 その精 製ウィルスは感染性を有することが示された。 実施例 8:J6/JFH - 1 (1XFLAG) E2 N→Kおよび J6/JFH- 1 (3XFLAG) E2 N→K変異プ ラスミ ドの構築
実施例 5で示した、 J6/JFH - 1 (3XFLAG) ウィルスが高い感染性を有するために 必要な適合変異 （E2領域の糖鎖付加部位のァスパラギン AAI (N6) からリジン AA A (K) への置換） を持つプラスミ ド PJ6/JFH - 1 (1XFLAG) N→Kおよび pJ6/JFH- 1 (3XFLAG) N→Kの構築を行った。 プラスミ ドの作製方法を図 10 (A) — (C) に示 す。
具体的には、 J6/JFH-l (1XFLAG)を铸型として、 Phusion High - Fidelity DNA Polymeraseキット （FI爾 ZYMES社） に添付されていた、 10 X緩衝液を 10 1、 2mM dNTP混合液を 4μ1、 10 /Mのプライマー 1141S- 2a (配列番号 1 6 ) および： [6 E2-K-R (配列番号 1 7) をそれぞれ 加え、 最終的に脱イオン水を加え全量を 49.5/z 1とした。 その後 Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES社） を 0·5μ1加え てから、 PCR反応を行った。 PCR反応は、 98°C 10秒、 55°C 15秒、 72°C 1分 30 秒からなる工程を 1 サイクノレとして 30サイクルの条件で行った。 得られた PCR 産物を PCR産物 no.7とした。
次に、 PJ6/JFH - 1 (3XFLAG)を铸型として、 Phusion High- Fidelity DNA Polyrae raseキット （FINNZYMES社） に添付されていた、 10 X緩衝液を 10/_tl、 2mM dNTP 混合液を 4μ1、 10μΜのプライマー 1141S- 2a (配列番号 1 6 ) および J6E2 - K - R (配列番号 1 7) をそれぞれ 1 1加え、 最終的に脱イオン水を加え全量を 49.5 μ 1とした。 その後 Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES社） を 0· 5/x 1加えてか ら、 PCR反応を行った。 PCR反応は、 98°C 10秒、 55°C 15秒、 72°C 1分 30秒か らなる工程を 1サイクルとして 30サイクルの条件で行つた。得られた PCR産物を PCR産物 no.8とした。
次に、 pJ6/JFH - 1を铸型として、 Phusion High- Fidelity DNA Polymeraseキッ ト （FINNZYMES社） に添付されていた、 10 X緩衝液を 10 μ 1、 2mM dNTP混合液を 4 μ 1, 10 μΜのプライマー J6E2-K- F (配列番号 1 8) および 3189R- ΙΗ (配列番号
1 9) をそれぞれ Ιμΐ加え、 最終的に脱イオン水を加え全量を 49.5 1 とした。 その後 Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES社） を 0.5 U加えてから、 PCR反応 を行った。 PCR反応は、 98°C 10秒、 55°C 15秒、 72°C 1分 30秒からなる工程を 1サイクルとして 30サイクルの条件で行った。 得られた PCR産物を PCR産物 no. 9とした。
それぞれの PCR産物を精製し、 50 μ 1の ¾0に溶かした。 PCR産物 no. 7 と PCR 産物 no9の DNAを各 1 μ 1ずつ混合した。 これを铸型として、 Phusion High-Fide lity DNA Polymeraseキット （FINNZYMES社） に添付されていた、 10 X緩衝液を 1 0〃 1、 2mM dNTP混合液を 4 1、 10 /i Mのプライマー 1141S - 2a (配列番号 1 6 ) お よび 3189R- IH (配列番号 1 9 ) をそれぞれ 1 1加え、 最終的に脱イオン水を加 え全量を 49. とした。 その後 Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES社） を 0·
5 μ 1加えてから、 PCR反応を行った。 PCR反応は、 98°C 10秒、 55°C 15秒、 72°C 2分からなる工程を 1サイクルとして 30サイクルの条件で行った。 得られた PC R産物を PCR産物 no. 10とした。
次に、 PCR産物 no. 8と PCR産物 no. 9の DNAを各 1 μ 1ずつ混合した。 これを铸 型として、 Phusion High - Fidelity DNA Polymeraseキット （FINNZYMES社） に添 付されていた、 10 X緩衝液を 10 μ 1、 2mM dNTP混合液を 4 μ 1、 10 μ Μのプライマ 一 1141S- 2a (配列番号 1 6 ) および 3189R- IH (配列番号 1 9 ) をそれぞれ Ι μ ΐ 加え、 最終的に脱イオン水を加え全量を 49. 5 ^ 1とした。 その後 Phusion DNA Po lymerase (FINNZYMES社） を 0. 5 μ 1加えてから、 PCR反応を行った。 PCR反応は、 98°C 10秒、 55°C 15秒、 72°C 2分からなる工程を 1サイクルとして 30サイクル の条件で行った。 得られた PCR産物を PCR産物 no. 11 とした。 それぞれの PCR産 物を精製し、 30 1の 0に溶かした。
PJ6/JFH1および精製した PCR産物 no. 10を制限酵素 Kpnlで消化し、 各 HCV cD
NA断片をァガロースゲル電気泳動にて分画し、 精製した。 これら 2つの DNA断片 と Ligation Mix (タカラバイオ社、 日本） を混合し、 2つの DNA断片を連結した。 このベクターを PJ6/JFH- 1 (1XFLAG) N→Kと名付けた。 この pJ6/JFH - 1 (1XFLAG)
N→Kは、 5， 側から 3 ' 側に順番に、 J6CF株由来の 5 ' 非翻訳領域、 Coreタンパ ク質コード配列、 E1タンパク質コード配列、 E2タンパク質コード配列、 p7タン パク質コード配列おょぴ NS2タンパク質領域の N末端 16アミノ酸残基までコード する配列、 ならびに、 JFH - 1株の NS2タンパク質領域の N末端 17アミノ酸残基か ら C末端間でコードする配列、 NS3タンパク質コード配列、 NS4Aタンパク質コ一 ド配列、 NS4Bタンパク質コード配列、 NS5Aタンパク質コード配列、 NS5Bタンパ ク質領域および 3' 非翻訳領域からなるキメラ遺伝子をコードする塩基配列であ り、 上記 NS2の HVR1領域に FLAGぺプチド配列をコードする塩基配列を含み、 か つ Coreタンパク質の N末端配列であるメチォユンを 1として数えて 532番目のァ ミノ酸がリジンとなるような塩基配列を含む。
次いで、 PJ6/JFH1および精製した PCR産物 no. 11を制限酵素 Kpnlで消化し、 各 HCV cDNA断片をァガ口一スゲル電気泳動にて分画し、精製した。 これら 2つの DNA断片と Ligation Mix (タカラバイオ社、 日本） を混合し、 2つの DNA断片を 連結した。 このベクターを PJ6/JFH- 1 (3XFLAG) N→Kと名付けた。 この pJ6/JFH - 1 (3XFLAG) N→Kは、 5 ' 側から 3 ' 側に順番に、 J6CF株由来の 5 ' 非翻訳領域、 C oreタンパク質コード配列、 E1タンパク質コード配列、 E2タンパク質コード配列、 p7タンパク質コード配列および NS2タンパク質領域の N末端 16アミノ酸残基ま でコードする配列、 ならびに、 JFH- 1株の NS2タンパク質領域の N末端 17ァミノ 酸残基から C末端までコードする配列、 NS3タンパク質コード配列、 NS4Aタンパ ク質コード配列、 NS4Bタンパク質コード配列、 NS5Aタンパク質コード配列、 NS5 Bタンパク質領域および 3 '非翻訳領域からなるキメラ遺伝子をコードする塩基配 列であり、 上記 NS2の HVR1領域に FLAGぺプチド配列を 3回繰り返した塩基配列 を含み、かつ Coreタンパク質の N末端配列であるメチォニンを 1として数えて 5 32番目のアミノ酸がリジンとなるような塩基配列を含む。
PJ6/JFH-1 (1XFLAG) N→Kを配列番号 2 0、pJ6/JFH- 1 (3XFLAG) N→Kを配列番 号 2 1 としてこれらの塩基配列を配列表に示した。 実施例 9 : J6/JFH- 1 (1XFLAG) E2 N→Kおよび J6/JFH - 1 (3XFLAG) E2 N→Kウィル スの作製
実施例 8で作製したプラスミ ドをそれぞれ Xbalで切断し、フエノールクロロホ ルム抽出、 エタノール沈殿を行った。 この切断したプラスミ ドを錶型に MEGAscri pt T7 kit (Ambion社）を用いて各 HCV RNAの合成を行った。
3 X 106個の Huh- 7細胞と 5 μ gの HCV RNAを Cytomix溶液（120mM KC1, 0. 15 m M CaCl2， 10 mM K2HP04/KH2P04, 25 mM Hepes, 2 mM EGTA, 5 mM MgCl2， 20 mM AT P， 50 mM Glutathione) 400 ^ 1で懸濁し、 4 mmキュべットに移した後、 Gene Pu lser (BioRad社）を用いて 260 V、 950 Ai Fでエレク トロポレーシヨンを行った。 そ の後、 HCV RNA導入細胞を 10 cm2ディッシュに播種し、 継代培養を行った。
J6/JFH-1 (1XFLAG) E2 N→Kおよび J6/JFH - 1 (3XFLAG) E2 N→K RNAを導入し た各細胞の継代時に、 HCV抗原 ELISAテス トキット（ォーソ社）を用いて培養上清 中に含まれる HCV Coreタンパク質を定量し、 HCV粒子産生の確認を行った。 培養 初期から後期にわたって、 変異を導入しない RNAを導入した細胞の培養上清中に 含まれる HCV Cor e量と変異を導入した RNAを導入した細胞の培養上清に含まれる HCV Core量とを比較すると後者の方が高いことが示された。 実施例 10 : HCV E2 HVR1領域に FLAGタグ配列を挿入した JFH - 1プラスミ ドの構築 実施例 1 と同様な方法で、遺伝子型 2a株の JFH - 1株 （GenBankァクセッション 番号 AB047639、 Kato, T. et al. , Gastroenterology, 125 (2003) pl808 - 1817) の HVR1内にェピトープタグ配列を導入した。 ェピトープタグとしては FLAG配列 を 1回または 3回繰り返した cDNAを挿入した。 これらのプラスミ ドをそれぞれ J FH-1 (1XFLAG)、 JFH- 1 (3XFLAG)と呼ぶ。
これらの遺伝子から翻訳される FLAGタグの挿入部位近傍のアミノ酸配列を E2 タンパク質の N末端のァミノ酸から図 11に示した。
pJFH-1 (pJFHl と呼称されることもある) のコードする E2タンパク質の N末端 の配列を配列番号 2 2、pJFH- 1 (1XFLAG) のコードする E2タンパク質の N末端の 配列を配列番号 2 3、pJFH - 1 (3XFLAG) のコードする E2タンパク質の N末端の配 列を配列番号 2 4に記載した。 また、 これらのプラスミ ドの作製方法を図 12 (A) 〜 （C) に示す。
具体的には、 JFH-1 c賺を鏺型として、 Phusion High - Fidel ity DNA Polymer ase キット （FI丽 ZYMES 社） に添付されていた、 10 X緩衝液を 10 μ 1、 2mM dNTP 混合液を 4 / l、 10 μ Μのプライマー JF -F (配列番号 2 5 ) および JFH1- IF - R
(配列番号 2 6 ) をそれぞれ Ι μ ΐ加え、 最終的に脱イオン水を加え全量を 49. 5 μ 1とした。 その後 Phusion DNA Polymerase (FI丽 ZYMES社） を 0· 5 μ 1加えてか ら、 PCR反応を行った。 PCR反応は、 98°C 10秒、 55°C 15秒、 72°C 30秒からな る工程を 1サイクルとして 30サイクルの条件で行った。得られた PCR産物を PCR 産物 no. 12とした。
次に、 pJFH-1 cDNAを錶型として、 Phusion High- Fidelity DNA Polymeraseキ ット （FI丽 ZYMES社） に添付されていた、 10X緩衝液を 10μ 1、 2mM dNTP混合液 を 4 l、 ΙΟμ Μのプライマー 3189R - ΙΗ (配列番号 1 9 ) および JFH1- 1F - F (配 列番号 2 7 ) をそれぞれ Ιμ ΐ 加え、 最終的に脱イオン水を加え全量を 49.5μ 1 とした。.その後 Phusion DNA Polymerase (FI丽 ZYMES社） を 0. 5μ 1加えてから、 PCR反応を行った。 PCR反応は、 98°C 10秒、 55°C 15秒、 72°C 1分 30秒からな る工程を 1サイクルとして 30サイクルの条件で行った。得られた PCR産物を PCR 産物 no. 13とした。
次に JFH1 cDNAを録型として、 Phusion High— Fidelity DNA Polymeraseキット (FINNZYMES社） に添付されていた、 10 X緩衝液を 10μ 1、 2mM dNTP混合液を 4 μ 1、 10/χ Μのプライマー JFH1- F (配列番号 2 5 ) および JFH1 - 3F - R (配列番号 2 8 ) をそれぞれ 1 μ 1加え、最終的に脱イオン水を加え全量を 49· 5μ 1とした。 そ の後 Phusion DNA Polymerase (FI顺 ZYMES社） を 0.5 μ 1力 []えて力 ら、 PCR反応を 行った。 PCR反応は、 98°C 10秒、 55°C 15秒、 72°C 30秒からなる工程を 1サイ クルとして 30サイクルの条件で行つた。得られた PCR産物を PCR産物 no. 14とし た。
次に、 pJFH— 1 cDNAを鍚型として、 Phusion High— Fidelity DNA Polymeraseキ ット （FI顺 ZYMES社） に添付されていた、 10X緩衝液を 10 1、 2mM dNTP混合液 を 4μ 1、 10μΜのプライマー 3189R- ΙΗ (配列番号 1 9 ) および JFH1 - 3F-F (配列 番号 2 9 ) をそれぞれ Ι μ ΐ加え、最終的に脱イオン水を加え全量を 49· 5μ 1 とし た。 その後 Phusion DNA Polymerase (FI画 ZYMES社） を 0.5μ 1加えてから、 PCR 反応を行った。 PCR反応は、 98°C 10秒、 55°C 15秒、 72。C 1分 30秒からなるェ 程を 1サイクルとして 30サイクルの条件で行った。得られた PCR産物を PCR産物 no. 15とした。
それぞれの PCR産物を精製し、 15 1の 0に溶かした。 PCR産物 no. 12と PCR 産物 ηο· 13の DNAを各 Ι μ ΐずつ混合した。 これを鍀型として、 Phusion High - Fi del ity DNA Polymeraseキット （FINNZYMES社） に添付されていた、 10 X緩衝液を 10 1、 2mM dNTP混合液を 4 μ 1、 10 Μのプライマー JFH1- F (配列番号 2 5 ) お よび 3189R-IH (配列番号 1 9 ) をそれぞれ 1 μ 1加え、 最終的に脱イオン水を加 え全量を 49. 5 μ 1とした。 その後 Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES社） を 0· 5 μ 1力 Βえて力ゝら、 PCR反応を行った。 PCR反応は、 98°C 10秒、 55°C 15秒、 72°C 2分からなる工程を 1サイクルとして 30サイクルの条件で行った。 得られた PC R産物を PCR産物 ηο· 16とした。
次に PCR産物 ηο· 1 と PCR産物 no. 15の DNAを各 1 μ 1ずつ混合した。これを铸 型として、 Phusion High - Fidelity DNA Polymeraseキット （FINNZYMES社） に添 付されていた、 10 X緩衝液を 10 / 1、 2mM dNTP混合液を 4 / 1、 10 / Mのプライマ 一 JFH1- F (配列番号 2 5 ) および 3189R- IH (配列番号 1 9 ) をそれぞれ 1 1 加え、最終的に脱イオン水を加え全量を 49. 5 / 1 とした。 その後 Phusion DNA Po lymerase (FINNZYMES社） を 0· 5 μ 1加えてから、 PCR反応を行った。 PCR反応は、 98°C 10秒、 55°C 15秒、 72°C 2分からなる工程を 1サイクルとして 30サイクル の条件で行った。 得られた PCR産物を PCR産物 no. 17とした。 それぞれの PCR産 物を精製し、 30 1の 0に溶かした。
pJFH-1 cDNA および精製した PCR産物 no. 16を制限酵素 EcoRIおよび Kpnlで消 化し、各 HCV cDNA断片をァガロースゲル電気泳動にて分画し、精製した。 これら 2つの DNA断片と Ligation Mix (タカラバイオ社、 日本） を混合し、 2つの DNA 断片を連結した。 このベクターを pJFH - 1 (1XFLAG)と名付けた。 この pJFH - 1 (IX FLAG)は、 JFH1株の遺伝子をコ一ドする塩基配列で、 E2の HVR1領域に FLAGぺプ チド配列をコードする塩基配列を含む。 次いで、 pJFHl cDNA および精製した PCR 産物 no. 17を制限酵素 EcoRIおよび ΚρηΙで消化し、 各 HCV cDNA断片をァガロー スゲル電気泳動にて分画し、精製した。これら 2つの DNA断片と Ligation Mix (タ カラバイオ社、 日本） を混合し、 2つの DNA断片を連結した。 このベクターを pj FH-1 (3XFLAG)と名付けた。 この pJFH- 1 C3XFLAG)は、 JTH1株の遺伝子をコードす る塩基配列で、 E2の HVR1領域に FLAGぺプチド配列を 3回繰り返した塩基配列を 含む。
pJFH-1 (1XFLAG)を配列番号 3 0、 pJFH-1 (3XFLAG)を配列番号 3 1としてこれ らの塩基配列を配列表に示した。 実施例 11 : HCV E2 HVR1領域に FLAGタグ配列を挿入した TH/JFH1プラスミ ドの構 築
HCVゲノム RNAの cDNAとして、 5 ' UTRから NS2の N末端 16ァミノ酸残基まで が遺伝子型 l bの TH1株 （（Wakita, T. et al.， J. Biol. Chem. , 269， 14205-1 4210, 1994、 特開 2004- 179)、 NS2の N末端 17アミノ酸残基から 3 ' UTRまでが同 じく遺伝子型 2a株の JFH- 1株 (GenBankァクセッション番号 AB047639、 Kato, T. et al . , Gastroenterology, 125 (2003) pl808- 1817) である TH/ JFH- 1キメラの cDNAを使用し、 TH/JFH1の HVR1内にェピトープタグ配列を導入した。挿入するェ ピトープタグとしては FLAG配列を 1回または 3回繰り返した cDNAを挿入した。 これらのプラスミ ドをそれぞれ pTH/JFH - 1 (1XFLAG)、 pTH/JFH- 1 (3XFLAG)と呼ぶ。 これらの遺伝子から翻訳される FLAGタグの挿入部位近傍のアミノ酸配列を、 E 2タンパク質の N末端のアミノ酸配列由来ものとして図 13に示した。
ρΤΗ/JFH-lのコードする E2タンパク質の N末端の配列を配列番号 3 2、 pTH/JF H - 1 (1XFLAG) のコー する E2タンパク質の N末端の配列を配列番号 3 3、 pTH/ JFH-1 (3XFLAG) のコードする E2タンパク質の N末端の配列を配列番号 3 4に記 載した。 また、 これらのプラスミ ドの作製方法を図 14に示す。
まず、 TH/JFH-1を作製した。 pJFH-1 cDNAを铸型として、 Phusion High-Fidel ity DNA Polymeraseキッ ト （FINNZYMES社） に添付されていた、 10 X緩衝液を 10 μ 1、 2mM dNTP混合液を 4 μ 1、 10 μ Μのプライマー JFm- Α (配列番号 4 3 ) お ょぴ JFH1- B (配列番号 4 4 ) をそれぞれ Ι μ ΐ加え、 最終的に脱イオン水を加え 全量を 49· 5 μ 1 とした。 その後 Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES社） を 0· 5 加えてから、 PCR反応を行い、 JFH - 1の 5 ' 非翻訳領域とプライマー JFH1 - Bに 含まれる THの Coreの一部の増幅を行った。 PCR反応は、 98°C 10秒、 55°C 15秒、 72°C 30秒からなる工程を 1サイクルとして 30サイクルの条件で行った。得られ た PCR産物を PCR産物 no. 18とした。
次に、 pTH (Wakita et al.， J. Biol. Chem. , 269 ： 14205 - 14210, 199 および
Moradpour et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun.， 246： 920-924, 1998) を 铸型として、 Phusion High- Fidelity DNA Polymeraseキット （FINNZYMES社） に 添付されていた、 10X緩衝液を 10μ1 2mM dNTP混合液を 4 1 lO^uMのプライ TH- C (配列番号 45) および TH- D (配列番号 46) をそれぞれ 1 1加え、 最終的に脱イオン水を加え全量を 49.5μ1とした。その後 Phusion DNA Polymera se (FINNZYMES社) を 0.5 1力卩えてから、 PCR反応を行い、 THの Coreから NS2 の一部分とプライ TH-Cに含まれる JFH - 1の 5' 非翻訳領域の一部分およびプ ライマー YH- Dに含まれる JFH-1の NS2の一部分の増幅を行った。 PCR反応は、 98°C 10秒、 55°C 15秒、 72°C 30秒からなる工程を 1サイクルとして 30サイクルの 条件で行った。 得られた PCR産物を PCR産物 no.19とした。
pJFH-1を鎵型として、 Phusion High - Fidelity DNA Polymeraseキット （FINNZ YMES社） に添付されていた、 10X緩衝液を 10 1 2raM dNTP混合液を 10 Mのプライ JFm- E (配列番号 47) および JFH1- F (配列番号 48) をそ れぞれ Ιμΐ加え、最終的に脱イオン水を加え全量を 49.5μ 1とした。 その後 Phu sion DNA Polymerase (FINNZYMES社） を 0· 5 μ 1加えてから、 PCR反応を行い、 J FH-1の NS2 NS3の一部とプライ JF - Eに含まれる THの NS2の一部の増幅を 行った。 PCR反応は、 98°C 10秒、 55°C 15秒、 72°C 30秒からなる工程を 1サイ クルとして 30サイクルの条件で行った。得られた PCR産物を？じ1¾産物^).20とし た。
上記 PCR産物 no.18, no.19 no.20とプライ JFH- Aおよび JFH- Eを用いて P CRを行い、 JFH - 1の 5'翻訳領域から TH株の Coreから NS2の一部、 JFH- 1の NS2 から NS3の一部のフラグメントを得た （PCR産物no·21)
次に、 pJFH- 1および PCR産物 no.21をそれぞれ EcoR I Spelで制限酵素処理 を行い、 ライゲーションし、 pTH/JFI-1-lを得た。 このプラスミ ドを用いて、 pTH/J FH-1 (1XFLAG) pTH/JFH - 1 (3XFLAG)を作製する方法を図 14(A)一 (C)に示す。 具体的には、 pTH/JFH- 1 cDNAを鎵型として、 Phusion High- Fidelity DNA Poly meraseキット （FI丽 ZYMES社） に添付されていた、 10X緩衝液を 10μ1 2m dNT
P混合液を 4 1 10 Μのプライ TH- F (配列番号 3 5) および TH-1F - R (配列 番号 36)をそれぞれ Ιμΐ加え、最終的に脱イオン水を加え全量を 49.5μ1とし た。 その後 Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES社） を 0.5 μ 1カ卩えて力 ら、 PCR 反応を行った。 PCR反応は、 98°C 10秒、 55°C 15秒、 72°C 30秒からなる工程を 1サイクルとして 30サイクルの条件で行った。 得られた PCR産物を PCR産物 no. 22とした。
次に、 pTH/JFH - 1 cDNAを铸型として、 Phusion High - Fidelity DNA Polymerase キット （FINNZYMES社） に添付されていた、 10X緩衝液を 10μ1、 2mM dNTP混合 液を 4μ1、 ΙΟμΜのプライマー 3189R - ΙΗ (配列番号 1 9 ) および TH-1F- F (配 列番号 3 7) をそれぞれ Ιμΐ 加え、 最終的に脱イオン水を加え全量を 49.5^1 とした。 その後 Phusion DNA Polymerase (FINNZYMES社） を 0· 5/ 1力 Pえて力 ら、 PCR反応を行った。 PCR反応は、 98°C 10秒、 55°C 15秒、 72°C 1分 30秒からな る工程を 1サイクルとして 30サイクルの条件で行った。得られた PCR産物を PCR 産物 no.23とした。
次に pTH/JFHl cDNAを錄型として、 Phusion High— Fidelity DNA Polymeraseキ ット （FINNZYMES社） に添付されていた、 10X緩衝液を 10/ 1、 2mM dNTP混合液 を 4μ1、 10μΜのプライマー TH- F (配列番号 35) および TH- 3F- R (配列番号 3 8) をそれぞれ 1 1加え、最終的に脱イオン水を加え全量を 49.5 1とした。 そ の後 Phusion DNA Polymerase (FI應 ZYMES社） を 0· 5 /i 1カ卩えてから、 PCR反応を 行った。 PCR反応は、 98°C 10秒、 55°C 15秒、 72°C 30秒からなる工程を 1サイ クルとして 30サイクルの条件で行った。得られた PCR産物を PCR産物 no.24とし た。
次に、 pTH/JFH - 1 cDNAを鏡型として、 Phusion High - Fidelity DNA Polymerase キット （FINNZYMES社） に添付されていた、 10X緩衝液を 10μ 1、 2mM dNTP混合 液を 4/ 1、 10//Mのプライマー 3189R - IH (配列番号 1 9) および TH- 3F- F (配列 '番号 3 9) をそれぞれ 1 1加え、最終的に脱イオン水を加え全量を 49.5 1とし た。 その後 Phusion DNA Polymerase (FI删 ZYMES社） を 0.5 ^ 1加えてから、 PCR 反応を行った。 PCR反応は、 98°C 10秒、 55°C 15秒、 72°C 1分 30秒からなるェ 程を 1サイクルとして 30サイクルの条件で行った。得られた PCR産物を PCR産物 no.25とした。
それぞれの PCR産物を精製し、 15 1の 0に溶かした。 PCR産物 no.22と PCR 産物 no.23の DNAを各 1μ 1ずつ混合した。 これを铸型として、 Phusion High- Fi del ity DNA Polymeraseキット （FINNZYMES社） に添付されていた、 10 X緩衝液を 10 // 1、 2mM dNTP混合液を 4 // 1、 10 μ Mのプライマー TH- F (配列番号 3 5 ) およ ぴ 3189R- ΙΗ (配列番号 1 9 ) をそれぞれ Ι μ ΐ加え、 最終的に脱イオン水を加え 全量を 49. 5 μ 1 とした。 その後 Phusion DNA Polymerase (FI丽 ZYMES社） を 0. 5 μ ΐ加えてから、 PCR反応を行った。 PCR反応は、 98°C 10秒、 55°C 15秒、 72°C 2分からなる工程を 1サイクルとして 30サイクルの条件で行った。 得られた PCR 産物を PCR産物 no. 26とした。
次に PCR産物 no. 24と PCR産物 no. 25の丽 Aを各 1 1ずつ混合した。これを铸 型として、 Phusion High - Fidelity DNA Polymeraseキット （FINNZYMES社） に添 付されていた、 10 X緩衝液を lO w 1、 2mM dNTP混合液を 4 1、 10 /_t Mのプライマ 一 TH- F (配列番号 3 5 )および 3189R- IH (配列番号 1 9 )をそれぞれ 加え、 最終的に脱イオン水を加え全量を 49. 5 μ 1 とした。その後 Phusion DNA Polymera se (FINNZYMES社） を 0. 5 μ 1加えてから、 PCR反応を行った。 PCR反応は、 98°C 10秒、 55°C 15秒、 72°C 2分からなる工程を 1サイクルとして 30サイクルの条 件で行った。 得られた PCR産物を PCR産物 no. 27とした。 それぞれの PCR産物を 精製し、 30 μ 1の ¾0に溶かした。
pTH/JFH-1 cDNA および精製した PCR産物 no. 26を制限酵素 Kpnlで消化し、 各 HCV cDNA断片をァガロースゲル電気泳動にて分画し、 精製した。 これら 2つの D NA断片と Ligation Mix (タカラバイオ社、 日本） を混合し、 2つの DNA断片を連 結した。 このベクターを pTH/JFH - 1 (1XFLAG)と名付けた。 この pTH/JFH - 1 (1XFL AG)は、 TH1株の遺伝子をコードする塩基配列で、 E2の HVR1領域に FLAGぺプチド 配列をコードする塩基配列を含む。
次いで、 pTH/JFHl cDNA および精製した PCR産物 no. 27を制限酵素 Kpnlで消化 し、 各 HCV cDNA断片をァガ口一スゲル電気泳動にて分画し、 精製した。 これら 2 つの DNA断片と Ligation Mix (タカラバイオ社、 日本） を混合し、 2つの DNA断 片を連結した。 このベクターを pTH/JFH- 1 (3XFLAG)と名付けた。 この pTH/JFH - 1
(3XFLAG)は、 ΊΉ 1株の遺伝子をコードする塩基配列で、 E2の HVR1領域に FLAGぺ プチド配列を 3回繰り返した塩基配列を含む。
pTH/JFHlを配列番号 4 0、 pTH/JFH-1 (1XFLAG)を配列番号 4 1、 pTH/JFH-1 (3 XFLAG)を配列番号 4 2としてこれらの塩基配列を配列表に示した。 上記実施例で作製されたベクター類から合成された RNAはいずれも、 培養 HCV 許容性細胞（Huh7等）に導入すると、 ェピトープタグ化 HCV粒子を生成した。 そし て、 ェピトープタグ化 HCV粒子含有培養上清を、 抗ェピトープタグ抗体を固定し た担体を充填したカラムに通すことによって、 ェピトープタグ化 HCV粒子を特異 的に吸着し、 その後の溶離処理により、 該 HCV粒子を精製することができた。 産業上の利用可能性
本発明によれば、 HCV 粒子を培養細胞系で生産し、 精製するための方法におい て、 従来の方法よりも、 簡便かつ高純度に HCV粒子を精製できる。 本発明の方法 によって提供される HCV粒子は高純度であるため、 HCVの予防または治療用ワク チンとして好適である。 さらに、 本発明のェピトープタグ化 HCV粒子は HCVに対 する抗体を誘導するツールとしても利用できる。
本発明の方法によって提供される HCV粒子は高純度であるため、 HCVの予防ま たは治療用ワクチンとして好適に利用できる。 さらに、 本発明にかかるェピトー プタグ化 HCV粒子は HCVに対する抗体を誘導するツールとしても利用できる。 本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。 配列表フリ一テキスト
配列番号 1 ： J6/JFH1のコードする E2タンパク質の N末端の配列
配列番号 2 ： pJ6/JFH- l (lXFLAG)のコ -ドする E2タンパク質の N末端の配列 配列番号 3 ： pJ6/JFH-l (3XFLAG)のコ -ドする E2タンパク質の N末端の配列 配列番号 4 ：プライマー - (E2-F)
配列番号 5 ：プライマー - (1F-R)
配列番号 6 ：プライマー - (E2-R)
配列番号 7 ：プライマー - (1F-F)
配列番号 8 ：プライマー - (E2-F) 配列番号 9 ：プライマー （3F-R)
配列番号 1 0 ： PJ6/JFH-1
配列番号 1 1 ： PJ6/JFH- 1 (1XFLAG)
配列番号 1 2 ： pJ6/JFH-l (3XFLAG)
配列番号 1 3 ： プライマー （S - 17)
配列番号 1 4 ： プライマー （R - 19)
配列番号 1 5 ： プローブ
配列番号 1 6 ： プライマー （1141S - 2a)
配列番号 1 7 ： プライマー （J6E2- K - R)
配列番号 1 8 ： プライマー （J6E2- K - F)
配列番号 1 9 ： プライマ一 （3189R- 1H)
配列番号 2 0 ： PJ6/JFH- 1 (1 X FLAG) N→K
配列番号 2 1 ： pJ6/JFH-l (3 X FLAG) N→K
配列番号 2 2 ： pJFH-1のコ一ドする E2タンパク質の N末端の配列
配列番号 2 3 ： pJFH-1 (1XFLAG)のコードする E2タンパク質の N末端の配列 配列番号 2 4 ： pJFH-1 (3XFLAG)のコードする E2タンパク質の N末端の配列 配列番号 2 5 ： プライマー （JFH1- F)
配列番号 2 6 ： プライマ一 （Ji¾卜 1F - R)
配列番号 2 7 ： プライマー （JF1H-1F - F)
配列番号 2 8 ： プライマー （JFH1 - 3F - R)
配列番号 2 9 ： プライマー （JFH1- 3F- F)
配列番号 3 0 ： pJFH-1 (1XFLAG)
配列番号 3 1 ： pJFH-1 (3XFLAG)
配列番号 3 2 ： pTH/JFHlのコードする E2タンパク質の N末端の配列 配列番号 3 3 ： pTH/JFH-1 (1XFLAG)のコードする E2タンパク質の N末端の配列 配列番号 3 4 ： pTH/JFH-1 (3XFLAG)のコードする E2タンパク質の N末端の配列 配列番号 3 5 ： プライマー （TH- F)
配列番号 3 6 ： プライマー （TH-1F-R)
配列番号 3 7 ： プライマー （TH- 1F - F) 配列番号 3 8 ： プライマー （TH- 3F- R)
配列番号 3 9 ： プライマー （TH- 3F - F)
配列番号 4 0 ： pTH/JFHl
配列番号 4 1 ： pTH/JFHl (1XFLAG)
配列番号 4 2 ： TH/JFHl (3XFLAG)
配列番号 4 3 ： プライマー （JFH1 - A)
配列番号 4 4 ： プライマー （JFH1 - B)
配列番号 4 5 ： プライマー （TH-C)
配列番号 4 6 ： プライマー （TH-D)
配列番号 4 7 ： プライマー （JFHl- E)
配列番号 4 8 ： プライマー （JFHl- F)
配列番号 4 9 ：ェピトープタグぺプチド (1XFLAG+L inker) 配列番号 5 0 ：ェピトープタグぺプチド (3XFLAG+Linker) 配列番号 5 1 ：ェピトープタグぺプチド (1XFLAG) 配列番号 5 2 ：ェピトープタグぺプチド (3XFLAG) 配列番号 5 3 ： リンカー
配列番号 5 4 ： リンカー

Claims

請求の範囲
1 . 下記の （a ) 、 ( b ) または （c ) を含む核酸であって、 前記 （a ) 、 前記 （b ) または前記 （c ) の E2 タンパク質コード配列の超可変領域 1 (HVR1) にェピトープタグぺプチドをコ一ドする核酸配列を含む、 核酸。
( a ) C型肝炎ウィルス (HCV) の JFH-1株のゲノム
( b ) C型肝炎ウィルス （HCV) の J6CF株の 5， 非翻訳領域、 Coreタンパク質 コ一ド配列、 E1タンパク質コ一ド配列、 E2タンパク質コ一ド配列および p7タン パク質コード配列、 ならびに、 JFH-1株の NS2タンパク質コード配列、 NS3タンパ ク質コ一ド配列、 NS4Aタンパク質コ一ド配列、 NS4Bタンパク質コ一ド配列、 NS5 Aタンパク質コード配列、 NS5Bタンパク質コード配列および 3' 非翻訳領域、 を 含むキメラ C型肝炎ウィルス （HCV) ゲノム
( c ) C型肝炎ウィルス （HCV) の JFH- 1株の 5， 非翻訳領域、 TH1株の Core タンパク質コード配列、 E1タンパク質コード配列、 E2タンパク質コード配列およ び p7タンパク質コード配列、 ならびに、 JFH- 1株の NS2タンパク質コード配列、 NS3タンパク質コ一ド配列、 NS4Aタンパク質コ一ド配列、 NS4Bタンパク質コード 配列、 NS5Aタンパク質コード配列、 NS5Bタンパク質コード配列および 3， 非翻訳 領域、 を含むキメラ C型肝炎ウィルス （HCV) ゲノム
2 . 前記ェピト一プタグべプチドは、 DYKDDDDKまたは DYKDHDGDYKDHDIDYKDD DDKからなるァミノ酸配列を含む、 請求項 1に記載の核酸。
3 . 前記ェピトープタグペプチドは、 リンカ一配列をさらに含む、 請求項 1 または 2に記載の核酸。
4 . 前記リンカ一配列は、 GGG配列、 GGGGS配列もしくは（GGGGS) 3配列、 また は、 前記 GGG配列、 前記 GGGGS配列もしくは前記 (GGGGS) 3配列の一部において 1 〜 1 0個のアミノ酸の欠失、 置換または付加を含むリンカ一配列である、 請求項 3に記載の核酸。
5 . 配列番号 1 1、 1 2、 3 0、 3 1、 4 1または 4 2で示される、 請求項
1〜4のいずれか一項に記載の核酸（ただし核酸が RNA の場合は配列表の塩基記 号 「T」 は 「U」 に読み替えるものとする）。
6 . 前記超可変領域 1 (HVR1) の最後の配列の次のアミノ酸を 1番としたと き、 1 2 2番目または 1 2 4番目のアミノ酸であるァスパラギンをリジンに置換 する変異を含む、 請求項 1〜 5のいずれか一項に記載の核酸。
7 . 配列番号 2 0または 2 1で示される、請求項 6に記載の核酸（ただし核酸 が RNAの場合は配列表の塩基記号 「T」 は 「U」 に読み替えるものとする）。
8 . 請求項 1〜 7のいずれか一項に記載の核酸を含有するベクター。
9 . 請求項 1〜 7のいずれか一項に記載の核酸をゲノムとして含有するェピ トープタグ化 C型肝炎ウィルス (HCV) 粒子。
1 0 . 請求項 9に記載のェピトープタグ化 C型肝炎ウィルス （HCV)粒子を含 有する細胞。
1 1 . Huh7またはその派生株である、 請求項 1 0に記載の細胞。
1 2 . 請求項 1 0または 1 1に記載の細胞からェピトープタグ化 C型肝炎ゥ ィルス (HCV) 粒子を生成する生成ステップと、
前記ェピトープタグ化 C型肝炎ウィルス （HCV)粒子を含有する液体を抗ェピト ープタグ抗体固定化担体に接触させ、前記ェピトープタグ化 C型肝炎ウィルス （H CV) 粒子を前記抗ェピトープタグ抗体固定化担体に吸着させる吸着ステップと、 前記ェピトープタグ化 C型肝炎ウィルス （HCV)粒子を前記抗ェピトープタグ抗 体固定化担体から遊離させて前記ェピトープタグ化 C型肝炎ウィルス （HCV)粒子 を得る遊離ステップと、
を備える、 ェピトープタグ化 C型肝炎ウィルス （HCV) 粒子の精製方法。
1 3 . 前記遊離ステップは、 ェピトープタグぺプチド含有緩衝液、 カルシゥ ム不含緩衝液、 ρΗ2. 5〜ρΗ4. 0の 0. 1Μグリシン緩衝液、 pH4. 0〜pH5. 0の 1Mアルギ ニン塩酸緩衝液または 0. 1mM〜lmM の塩酸のいずれかを用いて、 前記抗ェピトー プタグ抗体固定化担体から前記ェピトープタグ化 C型肝炎ウィルス （HCV)粒子を 遊離させる、 請求項 1 2に記載の精製方法。
1 4 . 請求項 9に記載のェピトープタグ化 C型肝炎ウィルス （HCV)粒子を不 活化して得られる C型肝炎ウィルス （HCV) ワクチン。
1 5 . 抗原としての請求項 9に記載のェピトープタグ化 C型肝炎ウィルス （H
CV) 粒子に対する抗 C型肝炎ウィルス (HCV) 抗体。
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