WO2009003625A1 - Aminophenoxazinons als antitumor- und antientzündliches mittel - Google Patents

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WO2009003625A1
WO2009003625A1 PCT/EP2008/005153 EP2008005153W WO2009003625A1 WO 2009003625 A1 WO2009003625 A1 WO 2009003625A1 EP 2008005153 W EP2008005153 W EP 2008005153W WO 2009003625 A1 WO2009003625 A1 WO 2009003625A1
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WO
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phenoxazin
group
amino
apo
acetylamino
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PCT/EP2008/005153
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English (en)
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Michael Bitzer
Ulrich Manfred Lauer
Sascha Venturelli
Sorin Armeanu
Original Assignee
Eberhard-Karls-Universitaet Tuebingen Universitaetskilinikum
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Publication date
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    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A61K31/538—1,4-Oxazines, e.g. morpholine ortho- or peri-condensed with carbocyclic ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to the use of phenoxazinone for the inhibition of enzymes with histone deacetylase activity, so-called HDAC inhibitors (HDACi), and the use of such novel HDACi for the treatment and prophylaxis of tumors and inflammations.
  • HDACi histone deacetylase activity
  • Cancer is a group of diseases characterized by the uncontrolled growth of a highly heterogeneous malignant cell population, and the estimated worldwide incidence of various types of cancer is about 10 million, about half of which is attributable to developing countries, despite a large number from currently available chemotherapeutic Guideic substances, the great success in the treatment of cancer is still pending. There is still a great medical need for targeted and side-effect-reduced substances for the treatment of cancer. Therefore, there are currently great efforts to identify new tumor-specific target structures and to develop anti-tumor substances against them.
  • Histone deacetylases have been implicated in the development of various tumors at an early stage because of increased acetylation of nucleosomal histones in various tumors.
  • HDACs histone deacetylases
  • HATs histone acetyltransferases
  • HDAC subclasses In humans one knows several HDAC subclasses.
  • the class I enzymes, HDACl, -2, -3 and -8 have a molecular weight of 42 to 45 kDa and have homologies in their catalytic portions.
  • Class II enzymes, HDAC4, -5, -6, -9 and -10 have molecular weights in the range of 120 to 130 kDa, with HDAC4, -5, -7 and -9 homologies in the C-terminal catalytic Domain and the N-terminal regulatory domain show.
  • HDACI l is another member of the HDAC enzymes. It has only low homology with the enzymes of classes I and II and is therefore grouped into a separate class.
  • the SIRC2 family of proteins forms a new class of enzymes that are considered HDACs. These enzymes are dependent on NAD + for their activity, while the class I and class II HDACs use a zinc-dependent mechanism.
  • HDAC inhibitors also known as HDACi
  • HDACi HDAC inhibitors
  • HDAC inhibitors can be classified into several groups. They include the so-called hydroxamic acids, the non-hydroxamine HDAC inhibitors, the short-chain fatty acids, the benzamides, the cychic peptides and the so-called SIR2 inhibitors.
  • hydroxamic acids the non-hydroxamine HDAC inhibitors
  • non-hydroxamine HDAC inhibitors the short-chain fatty acids
  • benzamides the cychic peptides
  • SIR2 inhibitors so-called SIR2 inhibitors.
  • An overview of these HDAC inhibitors can be found in Weinmann & Ottow histone deacetylase Inhibitors, a recent Expert Expert Opinion Ther Patents 2005, 15 1677-1690
  • HDAC inhibitors can be used in certain types of tumors comparatively. It can be assumed that HDAC inhibitors from different substance classes will also show an optimal effect-side-effect profile for different types of tumors.
  • HDAC inhibitors also have anti-inflammatory, anti-angiogenic and antiartherogenic properties.
  • the object underlying the invention to provide a new HDAC inhibitor, which can be used for the treatment and prophylaxis of tumors and / or inflammation, and is as low side effects.
  • phenoxazmon for the inhibition of histone deacetylase (HDAC) or for the treatment and / or prophylaxis of tumors and / or inflammations.
  • HDAC histone deacetylase
  • the inventors have surprisingly found that phenoxazinones are potent HDAC inhibitors which show their activity as a function of concentration. It is particularly advantageous that phenoxazinones are selectively cytotoxic to tumor cells, but leave healthy cells almost unaffected. Phenoxazinones are therefore particularly suitable for the treatment of tumors and inflammations with little side-effect. It is also advantageous that phenoxazinones are easy to prepare and are particularly stable in aqueous solution. A corresponding drug is therefore inexpensive to produce on a large scale without further ado.
  • allelopathy is the ability of plants to excrete organic compounds that inhibit or inhibit the growth or germination of other plants.
  • One of the best-studied classes of compounds in this context are the benzoxazinoids, which are present in the plants of the family Poaceae, which include wheat, maize and rye, as inactive glucoside in vacuoles. These glycosidic precursors are excreted in an injury to the plant and u.a. by means of a stored in the plastid ß-glucosidase.
  • the active benzoxazinoids 2,4-dihydroxy-l, 4-benzoxazin-3-one (DIBOA) and 2,4-dihydroxy-7-methoxy-l, 4-benzoxazin-3-one (DIMBOA).
  • the active benzoxazinoids are i.a. into the benzoxazolinones benzoxazolin-2-one (BOA) and 6-methoxy-benzoxazolin-2-one (MBOA), which are also referred to as so-called "parental" components.
  • the phenoxazinones of the invention are produced by microbial transformation via the intermediate step of the aminophenols, such as, for example, 2-aminophenol (AP), or directly via metabolization by fungi and bacteria.
  • aminophenols such as, for example, 2-aminophenol (AP)
  • AP 2-aminophenol
  • these phenoxazinones can be degraded microbially and undergo, for example, acetylation and oxidation reactions.
  • the benzoxazinoids, benzoxazolinones, aminophenols and phenoxazinones derived from the plants and their degradation products show an allelopathic Effect on various other plants, fungi, bacteria and insects.
  • allelopathic effect have so far only been elucidated.
  • the inventors have found, quite surprisingly, that the phenoxazinones act as inhibitors of cellular histone deacetylase.
  • the phenoxazinone is an aminophenoxazinone.
  • This measure has the advantage that such a Phenoxazinon is provided, which is particularly suitable according to the findings of the inventors as HDAC inhibitor and thus for the treatment and / or prophylaxis of tumors and inflammation.
  • the phenoxazinone is selected from the group consisting of: 2-amino-3H-phenoxazin-3-one (APO), 2-amino-7-methoxy-3H-phenoxazin-3-one (AMPO), 2-Acetylamino-7-hydroxy-3H-phenoxazin-3-one (AAHPO), 2-acetylamino-7-methoxy-3H-phenoxazin-3-one (AAMPO), 2-acetylamino-3H-phenoxazin-3-one ( AAPO), 2-amino-7-hydroxy-3H-phenoxazin-3-one (AHPO),, 2-amino-4,6,7-trimethoxy-3H-phenoxazin-3-one (AM 3 PO), 2- (2-hydroxyacetyl) amino-3H-phenoxazin-3-one (HAAPO), 7-hydroxy-2- (2-hydroxyacetyl) amino-3H-phenoxazin-3-one (HHAAPO), 2- (N
  • Rl is selected from the group consisting of: H, OH, OCH 3, wherein R2 is selected from the group consisting of: H, CH 2 OH, wherein R3 is selected from the group consisting of: H, CH 2 OH, wherein R4 is selected is selected from the group consisting of: O, OH, wherein R5 is selected from the group consisting of: H, COCH 3, COCH 2 OH, and wherein R6 is selected from the group consisting of: H, OH.
  • This measure has the advantage that the person skilled in the basic skeleton is provided which is common to the Aminophenoxazinonen APO and AMPO, which differ only with respect to the radical Rl from each other.
  • the radicals R 1, R 2, R 3, R 4, R 5 and R 6 the therapeutic or inhibitory properties of the compound can be optimized.
  • the radical R2 the solubility of the compound can be increased.
  • the group R2 has glucuronic acid.
  • glucuronic acid or glucuronate is a derivative of glucose, from which it differs by the oxidation state at the 6th carbon, where a carboxyl group instead of a hydroxymethyl group is present.
  • Glucuronic acid dissolves well in water and alcohol, its melting point is 165 0 C. Mutarotation is evident in the crystalline form.
  • the medicament is intended for the treatment of liver tumors.
  • phenoxazinone and in particular APO and AMPO have a particularly antiproliferative and cytotoxic effect on hepatoma cells, surprisingly not damaging primary human hepatocytes.
  • a further subject of the present invention therefore relates to a method for the treatment and / or prophylaxis of a tumor in a living being, comprising the following steps: (1) administration of a phenoxazinone into the animal, and (2) if necessary repetition of step 1.
  • FIG. 1 shows that APO and AMPO have an inhibitory activity on histone deacetylase.
  • a fluorescence-based HDAC activity / inhibition screening assay the percent inhibition of HDAC enzymes in cellular extracts from HeLa cells was measured in each case in a standardized manner. 100% inhibition is achieved if no HDAC substrate can be reacted, since all in the HeLa Nuclear extract existing enzymes are inhibited. Shown are the means of three independent experiments and the standard deviation.
  • SAHA Suberoylanilide hydroxamic acid
  • FIG. 2 shows the accumulation of acetylated histone H3 (17 kDa) in FIG.
  • Hepatoma cells after incubation with APO were treated for 24 h without HDAC inhibitor (control) or with 5 ⁇ M APO (APO) or 2 ⁇ M SAHA (SAHA).
  • APO APO
  • SAHA SAHA
  • vinculin 116 kDa was simultaneously detected in the blot.
  • Fig. 3 shows the anti-proliferative effect of APO and AMPO on tumor cell lines.
  • the hepatoma cell lines Hep3B, HepG2 and HuH7 were incubated for 5 days with various concentrations of APO and AMPO.
  • Cell viability was determined photometrically by SRB assay. Shown are the means of three independent experiments and the standard deviation.
  • Fig. 4 shows the cytotoxic effect of APO and AMPO on tumor cells.
  • Hepatoma cells were exemplarily treated for 48 h with various concentrations of APO and AMPO.
  • the relative LDH activity shown on the y-axis was determined spectrophotometrically from the supernatants and compared to untreated hepatoma cells. Shown are the means of three independent experiments and the standard deviation.
  • Figure 5 shows the lack of toxicity of APO and AMPO on primary human
  • Hepatocytes PHH from three different donors were treated with different concentrations of APO and AMPO for 48 h. Incubation with 40 ⁇ M TSA as positive control resulted in 100% cell death (black triangle). LDH activity was assessed supernatants are determined spectrophotometrically and set in relation to untreated hepatocytes. Shown are the means of three independent experiments and the standard deviation.
  • Example 1 Activity of APO and AMPO as histone deacetylase inhibitor CHDACO
  • a commercial test system is available, with which substances can be tested for their inhibitory activity on histone acetylases: Cayman Chemical HDAC Activity / Inhibitor Screening Assay Kit (Biozol, Eching, Germany).
  • APO and AMPO were tested with this test system.
  • HeLa cell nucleus extracts were incubated with various concentrations of APO and AMPO (1, 5, 10, 20, 50 and 100 ⁇ M) and a test-specific HDAC substrate. This fluorescence-based method allows a percentage indication of HDAC inhibition.
  • FIG. This shows a concentration-dependent HDACi activity, both for APO (- ⁇ -) and for AMPO (-A-).
  • SAHA Suberoylanilide hydroxamic acid
  • Hep3B and HepG2 hepatoma cells
  • APO or AMPO aminophenoxazinones
  • Western blotting Anti-acetyl histone H3 antibody AcH3, 1: 20,000, Biomol Hamburg, Germany, anti-vinculin antibody, 1: 5,000, Sigma-Aldrich. Accumulation of acetylated histone proteins is a surrogate parameter for the inhibition of acetyl group-releasing HDAC enzymes. The result is shown in FIG.
  • hepatoma cells were incubated with the aminophenoxazinones APO or AMPO by way of example, and a sulforhodamine B cytotoxicity assay (SRB assay) was carried out.
  • SRB assay sulforhodamine B cytotoxicity assay
  • Example 3 Selective cytotoxicity of APO and AMPO on tumor cells
  • hepatoma cell lines As a surrogate parameter for cell damage of tumor cells by the substances APO and AMPO, hepatoma cell lines (Hep3B, HuH7) were incubated for 48 h with various concentrations of APO and AMPO (5, 50 and 100 ⁇ M). Subsequently, the supernatants were measured spectrophotometrically for activity of the enzyme lactate dehydrogenase (LDH) (Sigma TOX7 In Vitro Toxicology Assay Kit, Sigma-Aldrich). An increase in LDH is considered a sure sign of serious cell damage with loss of membrane integrity. The result of this experiment is shown in FIG. Both hepatoma cell lines showed a concentration-dependent influence of APO and AMPO on the activity of LDH. That is, with increasing concentration of APO and AMPO, the tumor cells examined are increasingly killed.
  • LDH lactate dehydrogenase
  • non-malignant parenchymal cells namely primary human hepatocytes from three different donors.
  • the inventors were able to demonstrate HDACi activity for the plant products of phenoxazinones, exemplified by APO and AMPO, by experiments. Both the results of the HDAC activity / inhibitor screening assay and Western blot analyzes showed HDACi activity in the ⁇ M concentration range. In addition, a proliferation-inhibiting and cytotoxic effect on tumor cells could be demonstrated. In contrast, non-malignant primary human hepatocytes tolerate these substances even at high concentrations.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Phenoxazinon zur Inhibition von Enzymen mit Histondeacetylase-Aktivität, sogenannten HDAC-Inhibitoren (HDACi), und die Verwendung von solchen neuen HDACi zur Behandlung und Prophylaxe von Tumoren.

Description

AMINOPHENOXAZINONS ALS ANTITUMOR- UND ANTIENTZÜNDLICHES MITTEL
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Phenoxazinon zur Inhibition von Enzymen mit Histondeacetylase-Aktivität, sogenannten HDAC-Inhibitoren (HDACi), und die Verwendung von solchen neuen HDACi zur Behandlung und Prophylaxe von Tumoren und Entzündungen.
Das Krankheitsbild „Krebs" umfasst eine Gruppe von verschiedenen Krankheiten, die durch unkontrolliertes Wachstum einer stark heterogenen malignen Zellpopulation charakterisiert sind. Die geschätzte weltweite Inzidenz von verschiedenen Krebstypen liegt bei ca. 10 Millionen, etwa die Hälfte hiervon ist Entwicklungsländern zuzurechnen. Trotz einer großen Zahl von gegenwärtig zur Verfügung stehenden chemothera- peutischen Substanzen, steht der große Erfolg in der Behandlung von Krebs noch aus. Es besteht nach wie vor ein großer medizinischer Bedarf an zielgerichtet wirksamen und nebenwirkungsreduzierten Substanzen zur Behandlung von Krebs. Deshalb gibt es derzeit große Bemühungen, um neue tumorspezifische Zielstrukturen zu identifizieren und hiergegen antitumorale Substanzen zu entwickeln.
Histondeacetylasen (HDACs) wurden bereits früh mit der Entstehung von verschiedenen Tumoren in Verbindung gebracht, da in verschiedenen Tumoren eine verstärkte Acetylierung von nucleosomalen Histonen beobachtet wird. So wird der Acetylierungsstatus von Lysinen von nucleosomalen Histonen, die die Chroma- tinstruktur modulieren und die Transkriptionsaktivität regulieren, durch die antagonistische Aktion von zwei Enzymfamilien kontrolliert, den Histondeacetylasen (HDACs) und den Histonacetyltransferasen (HATs).
Im Menschen kennt man mehrere HDAC-Unterklassen. Die Klasse-I-Enzyme, HDACl, -2, -3 und -8 weisen ein Molekulargewicht von 42 bis 45 kDa auf und haben Homologien in ihren katalytischen Abschnitten. Klasse-II-Enzyme, HDAC4, -5, -6, -9 und -10, weisen Molekulargewichte in einem Bereich von 120 bis 130 kDa auf, wobei HDAC4, -5,-7 und -9 Homologien in der C-terminalen katalytischen Domäne und der N-terminalen regulatorischen Domäne zeigen. HDACI l ist ein weiteres Mitglied der HDAC-Enzyme. Es weist lediglich niedrige Homologie mit den Enzymen aus den Klassen I und II auf und wird deshalb in eine eigene Klasse eingruppiert. Die SIRC2- Familie von Proteinen bildet eine neue Klasse von Enzymen, die zu den HDACs gezählt werden. Diese Enzyme sind hinsichtlich ihrer Aktivität abhängig von NAD+, während die Klasse-I- und Klasse-II-HDACs einen zinkabhängigen Mechanismus verwenden.
In der Zwischenzeit wurde eine Vielzahl von HDAC-Inhibitoren (auch HDACi genannt) entwickelt, die zum Teil bereits in Studien der klinischen Phase I und II getestet werden; vgl. Minucci & Pelicci. Histone deacetylase inhibitors and the promise of epigenetic (and more) treatments for Cancer. Nat. Rev. Cancer 2006; 6: 38-
51. HDAC-Inhibitoren lassen sich in mehrere Gruppen klassifizieren. Sie umfassen die so genannten Hydroxaminsauren, die Nicht-Hydroxamin-HDAC-Inhibitoren, die kurz- kettigen Fettsauren, die Benzamide, die cychschen Peptide und die so genannten SIR2-Inhibitoren Einen Überblick über diese HDAC-Inhibitoren findet sich in Weinmann & Ottow Histone deacetylase Inhibitors, a survey of recent patents Expert Opin Ther Patents 2005, 15 1677-1690
Inwiefern einzelne HDAC-Inmbitoren bei bestimmten Tumorarten eingesetzt werden können, ist bisher nicht vergleichend untersucht worden Es ist davon auszugehen, dass für unterschiedliche Tumorarten auch HDAC-Inhibitoren aus unterschiedlichen Substanzklassen ein optimales Wirkungs-Nebenwirkungsprofil aufweiesen werden.
Trotz der intensiven Arbeiten steht nach wie vor die Suche nach neuen nebenwirkungsarmen, therapeutisch potenten HDAC-Inhibitoren im Mittelpunkt. Es besteht deshalb nach wie vor Bedarf an der Bereitstellung neuer HDAC-Inhibitoren, die diese Eigenschaften haben, ein hohes Maß an Verträglichkeit aufweisen und vorzugsweise im Großmaßstab hergestellt werden können.
Mittlerweile weiß man, dass HDAC-Inhibitoren auch antnnflammatoπsche, antian- giogene und antiartherogene Eigenschaften aufweisen.
Vor diesem Hintergrund ist die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe, einen neuen HDAC-Inhibitor bereitzustellen, der zur Behandlung und Prophylaxe von Tumoren und/oder Entzündungen eingesetzt werden kann, und möglichst nebenwirkungsarm ist.
Diese Aufgabe wird durch die Verwendung von Phenoxazmon zur Inhibition der Histondeacetylase (HDAC) bzw zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Tumoren und/oder Entzündungen gelost. Die Erfinder haben überraschenderweise erkannt, dass es sich bei Phenoxazinonen um potente HDAC-Inhibitoren handelt, die konzentrationsabhängig ihre Wirkung zeigen. Besonders vorteilhaft ist, dass Phenoxazinone selektiv cytotoxisch für Tumorzellen sind, gesunde Zellen jedoch nahezu unbeeinflusst lassen. Phenoxazinone sind deshalb zur nebenwirkungsarmen Behandlung von Tumoren und Entzündungen besonders geeignet. Vorteilhaft ist ferner, dass Phenoxazinone einfach herzustellen und in wässriger Lösung besonders stabil sind. Ein entsprechendes Arzneimittel ist deshalb ohne weiteres im Großmaßstab kostengünstig herstellbar.
Diese Eignung von Phenoxazinonen war insbesondere deshalb überraschend, da diese Substanzklasse bislang in völlig anderem Zusammenhang, nämlich in Bezug auf die so genannte Allelopathie diskutiert wird. Unter Allelopathie versteht man die Eigenschaft von Pflanzen, organische Verbindungen auszuscheiden, welche das Wachstum oder das Keimen anderer Pflanzen unterbinden oder hemmen. Eine der am besten untersuchten Substanzklassen in diesem Zusammenhang sind die Benz- oxazinoide, die in den Pflanzen der Familie Poaceae, zu der Weizen, Mais und Roggen zählen, als inaktives Glucosid in Vakuolen vorkommen. Diese glycosidischen Vorstufen werden bei einer Verletzung der Pflanze ausgeschieden und mittels einer im Plastid gespeicherten ß-Glucosidase u.a. in die aktiven Benzoxazinoide 2,4- Dihydroxy-l,4-benzoxazin-3-on (DIBOA) und 2,4-Dihydroxy-7-methoxy-l,4- benzoxazin-3-on (DIMBOA) umgewandelt. Aufgrund einer spontanen und mikrobiel- len Hydrolyse werden die aktiven Benzoxazinoide u.a. in die Benzoxazolinone Benzoxazolin-2-on (BOA) und 6-Methoxy-benzoxazolin-2-on (MBOA) überführt, die auch als sog. "parentale" Komponenten bezeichnet werden. Aus diesen parentalen Komponenten gehen durch mikrobielle Transformation über den Zwischenschritt der Aminophenole, wie bspw. dem 2-Aminophenol (AP), oder direkt über Metabolisie- rung durch Pilze und Bakterien die erfindungsgemäßen Phenoxazinone hervor. Diese Phenoxazinone wiederum können mikrobiell degradiert werden und durchlaufen dabei bspw. Acetylierungs- und Oxidierungsreaktionen.
Die aus den Pflanzen stammenden Benzoxazinoide, Benzoxazolinone, Aminophenole und Phenoxazinone und deren Degradationsprodukte zeigen eine allelopathische Wirkung auf verschiedene andere Pflanzen, Pilze, Bakterien und Insekten. Die Wirkmechanismen der allelopathischen Wirkung sind bisher jedoch nur in Ansätzen aufgeklärt.
Die Erfinder haben völlig überraschend festgestellt, dass die Phenoxazinone als Inhibitoren der zellulären Histondeacetylase wirken.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird hiermit vollkommen gelöst.
Dabei ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn das Phenoxazinon ein Aminopheno- xazinon ist.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass solch ein Phenoxazinon bereitgestellt wird, das sich nach den Erkenntnissen der Erfinder als HDAC-Inhibitor und damit zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Tumoren und Entzündungen besonders eignet.
Weiter ist es bevorzugt, wenn das Phenoxazinon ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: 2-Amino-3H-phenoxazin-3-on (APO), 2-Amino-7-methoxy-3H- phenoxazin-3-on (AMPO), 2-Acetylamino-7-hydroxy-3H-phenoxazin-3-on (AAHPO), 2-Acetylamino-7-methoxy-3H-phenoxazin-3-on (AAMPO), 2-Acetylamino-3H- phenoxazin-3-on (AAPO), 2-Amino-7-hydroxy-3H-phenoxazin-3-on (AHPO), , 2- Amino-4, 6, 7-trimethoxy-3H-phenoxazin-3-on (AM3PO), 2-(2-Hydroxyacetyl)amino- 3H-phenoxazin-3-on (HAAPO), 7-Hydroxy-2-(2-hydroxyacetyl)amino-3H-phen- oxazin-3-on (HHAAPO), 2-(N-Hydroxy)acetylamino-3H-phenoxazin-3-on (NHAAPO).
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass eine Vielzahl von Phenoxazinonen bereitgestellt werden, die APO und AMPO sowie deren mikrobiellen Degradationsprodukte erfassen und allesamt als potenzielle HDAC-Inhibitoren in Frage kommen. Weiter ist es bevorzugt, wenn die erfindungsgemaße Verbindung folgende Struktur aufweist
Figure imgf000007_0001
wobei Rl ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: H, OH, OCH3, wobei R2 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: H, CH2OH, wobei R3 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: H, CH2OH, wobei R4 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: O, OH, wobei R5 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: H, COCH3, COCH2OH, und wobei R6 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: H, OH.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass dem Fachmann das Grundgerust bereitgestellt wird, das den Aminophenoxazinonen APO und AMPO gemein ist, die sich lediglich hinsichtlich des Restes Rl voneinander unterscheiden. Durch Variationen der Reste Rl, R2, R3, R4, R5 und R6 können die therapeutischen bzw. inhibitorischen Eigenschatten der Verbindung optimiert werden. Insbesondere kann durch Variation des Restes R2 die Loslichkeit der Verbindung erhöht werden.
Erfindungsgemaß ist es bevorzugt, wenn bei der vorstehenden Struktur der Rest R2 Glucuronsaure aufweist.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass die erfindungsgemaße Verbindung dadurch in ihrer Loslichkeit erhöht wird. Die Kopplung von Glucuronsaure an die Verbindung an Position Rl erfolgt durch dem Fachmann bekannte Maßnahmen, bspw. enzyma- tisch unter Verwendung der Glucoronyltransferase. Glucuronsaure bzw. Glucuronat ist ein Derivat der Glucose, von der es sich durch die Oxidationsstufe am 6. Kohlenstoff unterscheidet, wo eine Carboxylgruppe statt einer Hydroxymethylgruppe vorliegt. Glucuronsäure löst sich gut in Wasser und Alkohol, ihr Schmelzpunkt liegt bei 1650C. In der kristallinen Form zeigt sich Mutarotation.
Besonders bevorzugt ist es, wenn das Arzneimittel zur Behandlung von Lebertumoren vorgesehen ist.
So hat sich vorteilhafterweise gezeigt, dass Phenoxazinon und insbesondere APO und AMPO besonders proliferationshemmend und cytotoxisch auf Hepatomzellen wirken, wobei überraschenderweise primäre humane Hepatocyten nicht geschädigt werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft deshalb ein Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe eines Tumors bei einem Lebewesen, das folgende Schritte aufweist: (1) Verabreichung eines Phenoxazinon in das Lebewesen, und (2) ggf. Wiederholung des Schrittes 1.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Die Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen veranschaulicht, die rein exemplarisch sind und die Reichweite der Erfindung nicht einschränken. Dabei wird Bezug genommen auf die beigefügten Figuren.
Fig. 1 zeigt, dass APO und AMPO eine inhibitorische Aktivität auf die Histon- deacetylase aufweisen. Mittels eines auf Fluoreszenz basierenden HDAC-Aktivitäts-/Inhibitions-Screening-Assays wurde jeweils die prozentuale Inhibition von HDAC-Enzymen in zellulären Extrakten aus HeLa-Zellen standardisiert gemessen. 100 % Inhibition wird erreicht, wenn kein HDAC-Substrat umgesetzt werden kann, da alle im HeLa- Kernextrakt vorhandenen Enzyme inhibiert sind. Dargestellt sind die Mittelwerte von drei unabhängigen Experimenten und die Standardabweichung. Suberoylanilid-Hydroxaminsäure (SAHA) als etablierter HDAC-Inhibitor wurde als Positivkontrolle verwendet.
Fig. 2 zeigt die Akkumulierung von acetyliertem Histon H3 (17 kDa) in
Hepatomzellen nach Inkubation mit APO. Hep3B-Zellen wurden für 24 h ohne HDAC-Inhibitor (Kontrolle) oder mit 5 μM APO (APO) oder 2 μM SAHA (SAHA) behandelt. Als Nachweis für die gleiche Proteinbeladung wurde Vinculin (116 kDa) simultan im Blot nachgewiesen.
Fig. 3 zeigt den anti-proliferativen Effekt von APO und AMPO auf Tumorzelllinien. Die Hepatomzelllinien Hep3B, HepG2 und HuH7 wurden 5 Tage mit verschiedenen Konzentrationen von APO und AMPO inkubiert. Die Zellviabilität wurde photometrisch mittels SRB-Assay bestimmt. Dargestellt sind die Mittelwerte von drei unabhängigen Experimenten und die Standardabweichung.
Fig. 4 zeigt die cytotoxische Wirkung von APO und AMPO auf Tumorzellen.
Hepatomzellen wurden exemplarisch für 48 h mit verschiedenen Konzentrationen von APO und AMPO behandelt. Die auf der y-Achse dargestellte relative LDH-Aktivität wurde anhand der Überstände spektrophotometrisch bestimmt und in Bezug zu unbehandelten Hepatomzellen gesetzt. Dargestellt sind die Mittelwerte von drei unabhängigen Experimenten und die Standardabweichung.
Fig. 5 zeigt die fehlende Toxizität von APO und AMPO auf primäre humane
Hepatocyten (PHH). PHH von drei unterschiedlichen Spendern wurden für 48 h mit verschiedenen Konzentrationen von APO und AMPO behandelt. Die Inkubation mit 40 μM TSA als Positivkontrolle führte zu 100 % Zelltod (schwarzes Dreieck). Die LDH-Aktivität wurde anhand der Überstände spektrophotometrisch bestimmt und in Bezug zu unbehandelten Hepatocyten gesetzt. Dargestellt sind die Mittelwerte von drei unabhängigen Experimenten und die Standardabweichung.
Ausführungsbeispiele
Beispiel 1: Aktivität von APO und AMPO als Histondeacetylase-Inhibitor CHDACO
Ein kommerzielles Testsystem steht zur Verfügung, mit dem Substanzen daraufhin untersucht werden können, ob sie eine inhibitorische Aktivität gegenüber Histonde- acetylasen aufweisen: Cayman Chemical HDAC Activity/Inhibitor Screening Assay Kit (Biozol, Eching, Deutschland). In einem ersten Schritt wurden mit diesem Testsystem APO und AMPO untersucht. Hierbei wurden HeLa-Zellkernextrakte mit verschiedenen Konzentrationen von APO und AMPO (1, 5, 10, 20, 50 und 100 μM) und einem testspezifischen HDAC-Substrat inkubiert. Diese auf Fluoreszenz basierende Methode erlaubt eine prozentuale Angabe der HDAC-Inhibition.
Das Ergebnis dieses Experimentes ist in Fig. 1 dargestellt. Dabei zeigt sich eine konzentrationsabhängige HDACi-Aktivität, sowohl für APO (-■-) als auch für AMPO (-A-). Als Positivkontrolle wurde Suberoylanilid-Hydroxaminsäure (SAHA) verwendet, ein bekannter HDACi, der bereits in der klinischen Onkologie eingesetzt wird (-
Als zusätzlicher und unabhängiger Nachweis für eine inhibitorische Wirkung von Aminophenoxazinonen auf HDAC-Enzyme wurden Hepatomzellen (Hep3B und HepG2) mit 5 oder 10 μM APO bzw. AMPO für 24 h inkubiert und mittels Western- Blotting der Acetylierungsstatus von Histon-H3-Proteinen untersucht (Anti-Acetyl- Histon-H3-Antikörper AcH3, 1:20.000, Biomol Hamburg, Deutschland; Anti- Vinculin-Antikörper, 1:5.000, Sigma-Aldrich). Eine Akkumulierung acetylierter Histonproteine ist ein Surrogatparameter für die Hemmung der Acetylgruppen- abspaltenden HDAC-Enzyme. Das Ergebnis ist in Fig. 2 dargestellt. Dabei zeigt sich eine Akkumulierung von acety- liertem Histon H3 im Vergleich zur Kontrolle sowohl bei APO als auch bei AMPO in beiden Hepatomzelllinien (her exemplarisch die Behandlung mit APO und SAHA bei Hep3B dargestellt. Als Positivkontrolle fungierte die Behandlung mit 2 μM SAHA.
Beispiel 2: Proliferationshemmende Wirkung von APO und AMPO auf Tumorzellen
Für die Bestimmung eines inhibitorischen Effektes auf das Proliferationsverhalten von Tumorzellen wurden exemplarisch Hepatomzellen mit den Aminophenoxazino- nen APO bzw. AMPO inkubiert und ein Sulforhodamin-B-Cytotoxizitätsassay (SRB- Assay) durchgeführt. Hierfür wurden Hepatomzellen (Hep3B, HepG2 und HuH7) mit verschiedenen Konzentrationen von APO und AMPO (5, 10, 20 und 50 μM) für fünf Tage behandelt. Es erfolgte nach Fixierung eine Färbung der Zellen mit SRB (Sulfo- rhodamin-B-Natriumsalz, Sigma-Aldrich). Photometrisch wurde die Färbeintensität gemessen und die Viabilität (anhand unbehandelter Zellen) berechnet.
Das Ergebnis dieses Experimentes ist in Fig. 3 dargestellt. Dabei zeigte sich für alle drei Zelllinien, dass sowohl APO als auch AMPO das Wachstum signifikant und konzentrationsabhängig hemmen konnten.
Beispiel 3: Selektive Cytotoxizität von APO und AMPO auf Tumorzellen
Als Surrogatparameter für eine Zellschädigung von Tumorzellen durch die Substanzen APO und AMPO wurden Hepatomzelllinien (Hep3B, HuH7) für 48 h mit verschiedenen Konzentrationen von APO und AMPO (5, 50 und 100 μM) inkubiert. Nachfolgend wurden die Überstände spektrophotometrisch auf Aktivität des Enzyms Laktatdehydrogenase (LDH) gemessen (Sigma TOX7 In Vitro Toxicology Assay Kit, Sigma-Aldrich). Ein Anstieg der LDH gilt als sicheres Zeichen für eine schwerwiegende Zellschädigung mit Verlust der Membranintegrität. Das Ergebnis dieses Experimentes ist in Fig. 4 dargestellt. Dabei zeigte sich bei beiden Hepatomzelllinien ein konzentrationsabhängiger Einfluss von APO und AMPO auf die Aktivität der LDH. Das heißt, mit zunehmender Konzentration von APO und AMPO werden die untersuchten Tumorzellen vermehrt abgetötet.
Im Vergleich zu Hepatomzellen wurde nachfolgend eine Charakterisierung von nicht-malignen Parenchymzellen, nämlich primären humanen Hepatozyten von drei unterschiedlichen Spendern durchgeführt.
Das Ergebnis ist in Fig. 5 dargestellt. Dabei zeigte sich überraschend, dass weder die Behandlung mit APO noch mit AMPO, selbst bei hohen Konzentrationen von bis zu 100 μM, zu einer relevanten Zellschädigung führt. Als Positivkontrolle fungierten 40 μM TSA (bekannter "toxischer" HDACi, der in hohen Konzentrationen Zelltod auslösen kann).
Beispiel 4: Schlussfolgerung
Die Erfinder konnten durch Experimente erstmals für die pflanzlichen Produkte der Phenoxazinone, exemplarisch vertreten durch APO und AMPO, eine HDACi-Aktivität zeigen. Sowohl die Ergebnisse des HDAC-Aktivitäts/Inhibitor-Screening-Assays als auch die der Western-Blot-Analysen zeigten eine HDACi-Aktivität im μM- Konzentrationsbereich. Zusätzlich konnte eine proliferationsinhibierende und cytotoxische Wirkung auf Tumorzellen gezeigt werden. Im Gegensatz hierzu tolerieren nicht-maligne primäre humane Hepatozyten diese Substanzen selbst in hohen Konzentrationen.

Claims

Patentansprüche
Verwendung eines Phenoxazinons zur Inhibition der Histondeacetylase (HDAC).
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Phenoxazi- non ein Aminophenoxazinon ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dass das Phenoxazinon ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: 2-Amino-3H-phenoxazin-3-on (APO), 2-Ami- no-7-methoxy-3H-phenoxazin-3-on (AMPO), 2-Acetylamino-7-hydroxy-3H- phenoxazin-3-on (AAHPO), 2-Acetylamino-7-methoxy-3H-phenoxazin-3-on (AAMPO), 2-Acetylamino-3H-phenoxazin-3-on (AAPO), 2-Amino-7-hydroxy- 3H-phenoxazin-3-on (AHPO), , 2-Amino-4,6,7-trimethoxy-3H-phenoxazin-3- on (AM3PO), , 2-(2-Hydroxyacetyl)amino-3H-phenoxazin-3-on (HAAPO), 7- Hydroxy-2-(2-hydroxyacetyl)amino-3H-phenoxazin-3-on (HHAAPO), 2-(N- hydroxy)acetylamino-3H-phenoxazin-3-on (NHAAPO).
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass diese folgende Struktur aufweist:
Figure imgf000013_0001
wobei Rl ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: H, OH, OCH3, wobei R2 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: H, CH2OH, wobei R3 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: H, CH2OH, wobei R4 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: O, OH, wobei R5 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: H, COCH3, COCH2OH, und wobei R6 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: H, OH.
Verwendung nach Anspruch 4 dadurch gekennzeichnet, dass R4 Glucuronsäu- re aufweist.
Verwendung von Phenoxazinon zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Tumoren und/oder Entzündungen.
Verwendung nach Anspruch 6 dadurch gekennzeichnet, dass das Phenoxazinon ein Aminophenoxazinon ist.
Verwendung nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Phenoxazinon ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: 2-Amino-3H- phenoxazin-3-on (APO), 2-Amino-7-methoxy-3H-phenoxazin-3-on (AMPO), 2-Acetylamino-7-hydroxy-3H-phenoxazin-3-on (AAHPO), 2-Acetylamino-7- methoxy-3H-phenoxazin-3-on (AAMPO), 2-Acetylamino-3H-phenoxazin-3-on (AAPO), 2-Amino-7-hydroxy-3H-phenoxazin-3-on (AHPO), 2-Amino-4,6,7- trimethoxy-3H-phenoxazin-3-on (AM3PO), , 2-(2-Hydroxyacetyl)amino-3H- phenoxazin-3-on (HAAPO), 7-Hydroxy-2-(2-hydroxyacetyl)amino-3H-phen- oxazin-3-on (HHAAPO), 2-(N-Hydroxy)acetylamino-3H-phenoxazin-3-on (NHAAPO).
Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung folgende Struktur aufweist:
Figure imgf000014_0001
wobei Rl ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: H, OH, OCH3/ wobei R2 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: H, CH2OH, wobei R3 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: H, CH2OH, wobei R4 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: O, OH, wobei R5 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: H, COCH3, COCH2OH, und wobei R6 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: H, OH.
10. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass R4 Glucuron- säure aufweist.
11. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Tumor ein Lebertumor ist.
12. Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe eines Tumors bei einem Lebewesen, das folgende Schritte aufweist:
(1) Verabreichung eines Phenoxazinon in das Lebewesen, und
(2) ggf. Wiederholung des Schrittes 1.
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