WO2008151807A2 - Hitzestabile asparaginase zur reduktion von acrylamid in nahrungs- oder genussmitteln - Google Patents

Hitzestabile asparaginase zur reduktion von acrylamid in nahrungs- oder genussmitteln Download PDF

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    • C12N9/82—Asparaginase (3.5.1.1)
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    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
    • C12Y305/01001—Asparaginase (3.5.1.1)

Definitions

  • the invention relates to the use of an amidohydrolase for the treatment of a food or a luxury food.
  • Carbohydrate foods are consumed for millennia by people all over the world. Such foods are currently available in a variety of ways, for example in the form of crispbread, rusk, biscuits, pretzels, toasted bread, breakfast cereals, biscuits, potato chips, tortilla chips, French fries, rice cakes, etc.
  • Acrylamide is a substance that directly attacks the human genome (DNA).
  • acrylamide is converted by liver enzymes into glycidamide, which is thought to have a toxigenic effect.
  • Acrylamide as well as glycidamide form compounds with amino acids and nuclein bases and can thus change the structure and function of, for example, the DNA and hemoglobin. Overall will be Acrylamide classified by experts as carcinogenic, mutagenic, toxic, irritant, sensitizing and toxic for reproduction.
  • acrylamide The most important source of acrylamide in foods is the amino acid asparagine, which is ubiquitous in foods such as potatoes, rice and cereals, but also in coffee, dried fruits in more or less high concentrations. Contains the food / luxury addition to asparagine even sugar such. As fructose or glucose, the formation of acrylamide is still promoted at high temperatures.
  • processes for the preparation of coffee beans each comprise complex drying, steaming or moistening steps.
  • Such pretreatment steps are intended to open the pores of the coffee beans in order to be able to extract, reduce or inactivate the asparagine contained in the coffee beans as a result.
  • the coffee beans are heated at temperatures below about 50 ° C., in order subsequently to be soaked in asparagine-inactivating solutions, such as, for example, calcium lactate or calcium citrate.
  • asparagine-inactivating solutions such as, for example, calcium lactate or calcium citrate.
  • the coffee beans are sprayed with low pressure or atmospheric steam or with water, the moisture being absorbed by the beans. Subsequently, in a separate step, the beans are usually treated with asparagine-inactivating solutions. All of these previously listed, complex and sometimes very time-consuming pretreatment steps lead directly or indirectly to increased costs, as they extend the entire treatment process and subsequently more expensive.
  • the invention is therefore based on the object to improve the known from the prior art treatment methods of food or luxury foods. Such improvements should in particular simplify pre-treatment steps for reducing the content of asparagine or acrylamide in foodstuffs or semi-luxury foods, so as to make the entire treatment process shorter and less expensive.
  • foodstuffs or luxury foods can be prepared using an amidohydrolase which has a residual activity of at least 75% after incubation for 5 min at 50 ° C.
  • the invention relates to the use of an amidohydrolase, preferably asparaginase, which after a incubation period of 5 min at 50 0 C has a residual activity of at least 75%, for the preparation of a food or a luxury food, preferably for reducing the content of asparagine in the food or stimulants.
  • an amidohydrolase preferably asparaginase
  • the content of acrylamide in the food or beverage is also preferably reduced because asparagine is a precursor of acrylamide when the food or beverage is subjected to a subsequent thermal treatment.
  • FIG. 1 shows the calibration line of the ammonium ion determination by means of Nessler's reagent.
  • x-axis amount NH 4 per 40 ⁇ l
  • y-axis optical density (OD) at 436 nm.
  • the correlation coefficient R 2 is 0.9979.
  • FIG. 2 shows the enzymatic activity of asparaginase I of Pyrococcus furiosus at different incubation temperatures.
  • rA relative activity (in%)
  • T [ 0 C] temperature in degrees Celsius.
  • FIG. 3 shows the temperature stability of asparaginase I of Pyrococcus furiosus at a temperature of 95 ° C.
  • rA relative activity (in%)
  • min time in minutes. It can be seen from the graph that the asparaginase has a relative activity or residual activity of about 100% at 95 ° C. after an incubation period of 60 minutes.
  • FIG. 4 shows the temperature stability of asparaginase I of Pyrococcus furiosus at a temperature of 99.degree. rA: relative activity (in%), min: time in minutes. It can be seen from the graph that the asparaginase has a relative activity or residual activity of about 70% at 99 ° C. after an incubation period of 60 minutes.
  • Figure 5 shows the reduction of the acrylamide content after roasting of two coffees by pretreatment of green coffee beans with the inventive asparaginase according to Example 4 at 80 0 C.
  • Amidohydrolases belong to the enzyme family of hydrolases. Amidohydrolases are characterized by cleaving / hydrolyzing amide groups. They are under EC numbers EC 3.5.1 and 3.5.2. (Enzyme Commission number, as defined by the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB)).
  • residual activity in the sense of the description is understood as meaning the specific / volumetric enzymatic activity which, after a certain incubation period at a specific temperature, compared to the original specific / volumetric activity in the region of its temperature optimum, is an otherwise identical one Reaction conditions (pH, substrate, etc.).
  • the specific / volumetric activity of an enzyme in the sense of the description means a specific amount of a reacted substrate (in ⁇ mol) per time (in min) per amount of enzyme (in mg or ml).
  • the residual activity of an enzyme results from the specific / volumetric activity of the enzyme after the above-mentioned incubation period divided by the original specific / volumetric activity, expressed as a percentage (%).
  • the specific activity of an enzyme is preferably in U / mg, the volumetric activity of an enzyme, preferably in U / ml.
  • the specific / volumetric activity of an enzyme in the sense of the description can also be stated in katal / mg or katal / ml.
  • catalytic activity refers to the rate of turnover of an enzyme and is usually determined by the quotient of k k a t / K M where k ⁇ at corresponds to the catalytic constant (also called turnover number) and the K M value corresponds to the substrate concentration at which the reaction rate is half of its maximum value.
  • the enzymatic activity of an enzyme may alternatively also be determined by the specific activity ( ⁇ mol of reacted substrate x mg "1 x min " 1 , see above) or the volumetric activity ( ⁇ mol of reacted substrate x ml * 1 x min -1 , see above).
  • specific activity ⁇ mol of reacted substrate x mg "1 x min " 1 , see above
  • volumetric activity ⁇ mol of reacted substrate x ml * 1 x min -1
  • the amidohydrolase used according to the invention has a residual activity of preferably at least 75%, more preferably at least 80%, most preferably at least 90%, under the conditions given in the table below:
  • C ⁇ means that the amidohydrolase has a residual activity of at least 75%, more preferably at least 80%, most preferably at least 90%, at 70 ° C. for at least 50 minutes.
  • the amidohydrolase among the The above-mentioned conditions have a residual activity in the range of preferably 75-100%, more preferably 75-90%.
  • the amido-hydrolase used is an asparaginase.
  • an asparaginase in the sense of the description is meant an enzyme which catalyzes the hydrolysis of asparagine to aspartate and ammonium.
  • it is an asparaginase type I, in another preferred embodiment, it is an asparaginase type II.
  • the amidohydrolase preferably asparaginase, is thermoactive.
  • Thermoactive in the sense of the description are those amidohydrolases, preferably asparaginases whose optimum temperature is above 50 ° C.
  • temperature optimum is well known to those skilled in the art and refers to the temperature range at which an enzyme has its maximum enzymatic activity.
  • relevant literature such as Voet et al. "Biochemistry", 1992, VCH-Verlag, Chapter 13, page 331; I. H. Segel, Enzyme Kinetics: Behavior and Analysis of Rapid Equilibrium and Steady-State Enzyme Systems, Wiley Interscience, 1993; and A.G. Marangoni, Enzymes Kinetics: A Modern Approach, Wiley Interscience, 2002.
  • the temperature optimum is to be understood as meaning that temperature range in which the amidohydrolase used according to the invention has at least 80%, preferably at least 90%, of the maximum enzymatic activity, given otherwise constant reaction conditions.
  • the temperature optimum of the amidohydrolase is in the range of 60 to 130 ° C, more preferably in the range of 70 to 120 ° C, even more preferably in the range of 75 to 110 ° C, most preferably in the range of 80 to 100 0 C and in particular in the range of 85 to 95 ° C.
  • the amidohydrolases, preferably asparaginases, used according to the invention are therefore preferably not only thermostable (ie with regard to their enzymatic activity they stand up to thermal treatment), but are additionally thermoactive (ie their full enzymatic activity develops only at elevated temperature).
  • thermoactive asparaginase was used for the treatment of foods or stimulants for the reduction of the acrylamide content.
  • the amidohydrolase preferably asparaginase, at a temperature of preferably 60 to 120 0 C, more preferably 65 to 110 0 C, more preferably 70 to 100 0 C, most preferably 75 to 100 ° C and especially 80 to 90 ° C has a specific activity of preferably at least 100, more preferably at least 200, even more preferably at least 300, even more preferably at least 500, most preferably at least 800 and especially at least 1000 units / mg, where 1 unit is defined as the amount of amidohydrolase comprising 1, 0 .mu.mol ammonia per minute from L-asparagine at the appropriate reaction temperature and a pH of 8.6 (50 mM Tris-HCl, pH adjustment at 25 ° C) releases.
  • 1 unit is defined as the amount of amidohydrolase comprising 1, 0 .mu.mol ammonia per minute from L-asparagine at the appropriate reaction temperature and a pH of 8.6 (50 mM Tris-HCl, pH adjustment at 25
  • thermoactive asparaginases have considerable advantages over other asparaginases.
  • the cleavage of the asparagine can be carried out at comparatively high temperatures, whereby compatibility is achieved with processes in which high temperatures, in particular holding processes at high temperatures, in any case play a role.
  • performing the cleavage of the asparagine at higher temperatures allows a higher reaction rate.
  • the enzymatic treatment of coffee beans therefore requires, inter alia, the following steps: a) moistening; b) enzymatic treatment in the moistened state; c) drying; d) roasting.
  • the coffee beans For the drying step c), the coffee beans must be heated to a sufficient temperature, otherwise the water can not be efficiently removed.
  • the heating and moistening of the coffee beans is preferably carried out with hot steam (> 100 ° C).
  • the subsequent drying step c) then proceeds at 70-80 0 C.
  • amidohydrolase used a temperature optimum of, for example, only 50 0 C, it would be very inconvenient, since you initially cool to the enzyme treatment at 50 0 C and then would have to heat to dry again.
  • thermoactive asparaginases however, no cooling is required, which is a particular advantage of the invention.
  • thermoactive asparaginases Another advantage of using thermoactive asparaginases is the fact that due to the elevated temperature, the diffusion of the asparagine to be hydrolyzed is increased, which is also reflected in an improved efficiency of the method according to the invention.
  • the process according to the invention makes it possible, while maintaining the process steps of customary processes for preparing a foodstuff or a stimulant, to achieve a processing with the aid of an amidohydrolase, ie without serious changes in the processes.
  • the enzymatic treatment can be carried out during a process step in which the food or the beverage is already exposed to an elevated temperature.
  • the amidohydrolase preferably asparaginase, at a temperature of preferably 60 to 120 0 C, more preferably 65 to 110 0 C, more preferably 70 to 100 0 C, most preferably 75 to 100 0 C and in particular 80-90 0 C has a volumetric activity of preferably at least 50, more preferably at least 100, even more preferably at least 300, even more preferably at least 500, most preferably at least 800 and especially at least 1000 units / ml, where 1 unit is defined as the amount of amidohydrolase which is 1 , 0 ⁇ mol ammonia per minute of L-asparagine at the appropriate reaction temperature and a pH of 8.6 (50 mM Tris-HCl, pH adjustment at 25 0 C) releases.
  • 1 unit is defined as the amount of amidohydrolase which is 1 , 0 ⁇ mol ammonia per minute of L-asparagine at the appropriate reaction temperature and a pH of 8.6 (50 mM Tris-HCl, pH adjustment at
  • the amidohydrolase preferably asparaginase
  • pH optimum is generally known to the person skilled in the art and relates to the pH range at which an enzyme has its maximum enzymatic activity. In this context, reference may be made to the relevant literature, such as Voet et al. "Biochemistry", 1992, VCH Verlag, Chapter 13, page 331.
  • the pH optimum is to be understood as the pH range in which the amidohydrolase used according to the invention has at least 80%, preferably at least 90%, of the maximum enzymatic activity, given otherwise constant reaction conditions.
  • amidohydrolases preferably asparaginases
  • these amidohydrolases preferably asparaginases
  • these amidohydrolases preferably asparaginases
  • these amidohydrolases preferably asparaginases
  • the use of these enzymes in different processes with very different pH ranges possible. It can also be used in processes in which the pH value in the process is subject to strong fluctuations. In particular, processes are possible in which pH values of 5 to 10 occur. at For example, treatment of green coffee beans with tap water can result in very low pH values of ⁇ 5.
  • the amidohydrolase of the invention preferably asparaginase, has an activity of at least 10%, more preferably at least 15%, even more preferably at least 20%, most preferably at least 25%, and most preferably at least 30% over the entire pH range of 5-10. compared to maximum activity on, ie for maximum activity at optimal pH under otherwise identical conditions, preferably at optimal temperature and concentration.
  • the amidohydrolase used according to the invention is preferably storage-stable.
  • G 1 -G 17 to K1-K 17 has the amidohydrolase under the conditions indicated in the table below conditions a residual activity of at least 80%, more preferably at least 85%, more preferably at least 90% and especially at least 95%:
  • embodiment I 5 means that the amidohydrolase after storage for 25 days at 10 0 C, a residual activity of at least 80%, more preferably at least 85%, more preferably at least 90% and in particular especially at least 95%.
  • the inventively used amidohydrolase has a residual activity of at least 80% when stored at 4 ° C over a period of 30 days.
  • the group of amidohydrolases includes the enzyme family of asparaginases (EC 3.5.1.1), which catalyze the hydrolysis of asparagine to aspartate and ammonia.
  • the amidohydrolase used according to the invention is an asparaginase.
  • the asparaginase used according to the invention hydrolyzes L-asparagine preferably faster than L-glutamine and / or optionally faster than D-asparagine.
  • the ratio of K M values (each in mM) of L-asparagine: L-glutamine is in the range of 1:10 to 1: 400, more preferably in the range of 1:20 to 1: 200, still more preferably in the range of 1: 30 to 1: 100, most preferably in the range of 1:40 to 1:80.
  • the asparaginase L-asparagine used according to the invention prefers more than L-glutamine and / or more than D-asparagine.
  • the ratio of K M values (each in mM) of L-asparagine: L-glutamine is in the range of 1: 1 to 1: 400, more preferably in the range of 1: 5 to 1: 100, more preferably in the range of 1: 10 to 1:50.
  • Amidohydrolases or asparaginases can be thermolabile or thermostable.
  • Thermostable asparaginases are already known from the prior art (cf., for example, Li et al., Anal Chem 2002, 74, p.3336-3341, US Pat. No. 5,719,056 or Agathi et al., Mol. Cell. Biochem., 2001, 216 , p.93-101).
  • references to their use in processes for the preparation or processing of food or semi-luxury foods can not be found in these publications.
  • thermoostable amidohydrolase or “thermostable Asparagi- nose” in the sense of this description is to be understood raginase preferably an amidohydrolase or aspartic which, after an incubation period of 5 min at 50 0 C has a residual activity of at least 75%.
  • the asparaginase is an asparaginase from Archaeoglobus sp. (e.g., Archaeoglobus fulgidus), Thermus sp. (e.g., Thermus thermophilus), Pyrococcus sp. (e.g., Pyrococcus abyssi), Thermococcus sp. (e.g., Thermococcus kodakarensis), Methanothermobacter sp. (for example Methanothermobacter thermautotrophicus) or an asparaginase from further Euryarchaeota or the asparaginase I from Pyrococcus furiosus.
  • Archaeoglobus sp. e.g., Archaeoglobus fulgidus
  • Thermus sp. e.g., Thermus thermophilus
  • Pyrococcus sp. e.g., Pyrococcus aby
  • the asparaginase is encoded by a nucleotide sequence which is preferably at least 60%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, most preferably at least 99%, and most preferably at least 99.9% homologous to the nucleotide sequence ⁇ SEQ ID NO: 1>.
  • the homology is here preferably determined with the aid of the Smith & Waterman algorithm (J Mol Biol., 1981, 147 (1), 195-7), using the BLOSUM62 matrix and values of 11.0 for the opening of a gap, or 1.0 for the extension of a gap.
  • the asparaginase used according to the invention is encoded by the nucleotide sequence ⁇ SEQ ID NO: 1>.
  • the asparaginase amino acid sequence has a homology (sequence identity) of at least 50%, more preferably at least 75%, even more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, most preferably at least 99%, and most preferably at least 99.9% to the amino acid sequence ⁇ SEQ ID NO: 2> on.
  • the homology is here preferably determined with the aid of the Smith & Waterman algorithm (J Mol Biol., 1981, 147 (1), 195-7), using the BLOSUM62 matrix and values of 11.0 for the opening of a gap, or 1.0 for the extension of a gap.
  • the asparaginase used according to the invention comprises the amino acid sequence ⁇ SEQ ID NO: 2>.
  • treatment processes of preferably carbohydrate-containing foods or semi-luxury foods frequently comprise pretreatment steps for reducing the acrylamide content in these foods or luxury foods. It is therefore preferred that the use according to the invention of amidohydrolase in the treatment, in particular as part of a pretreatment, serves to hydrolyze asparagine to aspartic acid.
  • carbohydrate-containing foodstuffs is to be understood as meaning preferably foodstuffs whose content of carbohydrates is preferably at least 0.1% by weight, more preferably at least 1% by weight, more preferably at least 5% by weight, even more preferably at least 10% by weight, most preferably at least 20% by weight, and especially at least 30% by weight, based on the total weight of the foodstuff.
  • an amidohydrolase in the treatment serves to reduce the content of asparagine and / or acrylamide in the food or the beverage.
  • Such a use according to the invention of an amidohydrolase preferably results in a reduction in the content of asparagine, so that the food or the luxury product has a reduced content of acrylamide during a thermal aftertreatment.
  • thermal aftertreatment is to be understood as meaning preferably those processes which bring about a heating of the food or beverage.
  • Typical thermal aftertreatments include heating, roasting, grilling, cooking, cooking, baking, steaming, frying, and the like.
  • the amidohydrolase used according to the invention is particularly preferably suitable for the addition or preparation of carbohydrate-containing foods, such as, for example, rice, bread and baked goods, snacks, ready mixes, dried fruits, animal feed, etc. or luxury foods, such as coffee or cocoa.
  • Such food and / or stimulants are preferably selected from the group consisting of crispbread, rusk, biscuits, pretzels, toast, waffles, muffins, beagles, croissants, brownies, breakfast cereals, biscuits, potato chips, tortilla chips, corn chips, crackers, nuts, fries fries, rice waffles, polenta, couscous, pancakes, ready mixes, cake mixes, biscuit mixes, bread mixes, croutons, dog food, cat food, coffee beans, cocoa beans.
  • coffee beans Particularly preferred are coffee beans.
  • Preferred coffee bean species are Coffea arabica, Coffea canephora, Coffea liberica and Coffea robusta.
  • the treatment of a stimulant comprises a decaffeination and / or a washing of coffee beans, in which the amidohydrolase according to the invention is used.
  • the treatment of a stimulant comprises a hydrolysis of coffee beans, which is combined with the use of the amidohydrolase according to the invention, preferably asparaginase.
  • Coffee beans undergo water vapor treatment as part of the preparation for decaffeination or flavor enhancement.
  • the beans are heated strongly and associated with water.
  • thermoactive amidohydrolase to reduce the asparagine concentration in the green coffee bean proves to be particularly advantageous.
  • the use of enzymes at temperatures above 70 0 C allows complete compatibility with established methods and also very high reaction rates, which greatly reduces the process times.
  • amidohydrolase preferably asparaginase
  • asparaginase which has the properties described above, gives rise to numerous surprising advantages, which are described below with reference to FIG illustrative examples. A person skilled in the art will recognize that such examples are in no way limiting since the amidohydrolase according to the invention is suitable for use in a large number of treatment processes of foods or luxury foods.
  • the potatoes are usually pretreated with asparaginase before steaming, ie the potatoes are sliced and the asparaginase can either be sprayed on or the potato slices are dipped in an asparaginase-containing solution.
  • the duration of such a conventional asparaginase can thereby be partially considerably (up to several hours), since due to the temperature-optimum of the enzyme (usually 37 0 C, see. Eg US 7,037,540, Example 5) must not exceed the treatment temperature is a maximum of 37 0 C and the digestion of asparagine is correspondingly slow.
  • the potato slices can be subjected to asparaginase treatment at higher temperatures, i. the asparagine reduction is faster, i.a. because the solubility of asparagine increases at higher temperatures.
  • the asparaginase treatment due to the thermostable properties of the enzyme, can even be done simultaneously while the potatoes are cooking under steam.
  • the asparaginase may be previously sprayed onto the potato slices.
  • Deactivation of the amidohydrolase is conventionally accomplished by thermal post-treatment, i. by frying the potato slices. Health concerns regarding the use of these thermostable amidohydrolases therefore do not arise.
  • Another example concerns the decaffeination of coffee beans.
  • the unroasted, green coffee beans are steamed and / or soaked in some hot water to extract the caffeine from the beans.
  • amidohydrolase used according to the invention, it is possible to carry out such decaffeination steps, usually at temperatures above 37 ° C, combined with a simultaneous asparaginase treatment, ie the treatment process of decaffeinated coffee as such is less time consuming and subsequently more cost effective.
  • Conventional methods for decaffeinating coffee beans are known to the person skilled in the art and include inter alia the "Swiss Water Process", the “Direct Method”, the “Indirect Method” or the "Triglyceride Process". In this context, reference may be made in full to R. Heiss, Food Technology: Biotechnological, Chemical, Mechanical and Thermal Processes of Food Processing, Springer; 6th edition, 2003.
  • the amidohydrolase according to the invention can also be used particularly advantageously in steaming / moistening coffee beans.
  • steaming / wetting serves, as already stated above, to open the pores of the coffee beans in order subsequently to more easily deactivate / reduce the asparagine present in the beans.
  • Steaming / wetting usually takes place at elevated temperatures, ie at temperatures of preferably not more than 100 ° C., since both the solubility of asparagine in warm solvents is increased, and the pores of the coffee beans open more rapidly at warm temperatures.
  • thermostable amidohydrolase With the aid of the thermostable amidohydrolase according to the invention, on the one hand a reduction of asparagine can take place simultaneously during the steaming / humidification, on the other hand the asparagine reduction can proceed more quickly and more efficiently owing to the high temperature compatibility of the enzyme.
  • the amidohydrolase according to the invention can also be used in the production of fresh baked goods such as bread, rolls or the like. These fresh baked goods are often prepared by means of Kochextrusions process, which usually take place at temperatures between 95 and 105 0 C.
  • the enzyme can be added during the extrusion of cooking and thus bring about a reduction in the aspartate content.
  • Asparagine reduction is beneficial in the case of cooking extrusion both the kneading of the dough and the formation of gas bubbles, which are caused by the escape of carbon dioxide from the heated water.
  • the inventive amidohydrolase is inactivated or denatured.
  • the amidohydrolase according to the invention can also be used advantageously in grain-processing processes.
  • corn grits are cooked in a mixture with sugar, salt and malt and then further processed and roasted. Roasting causes the unwanted formation of the acrylamide.
  • Roasting temperatures between 70 and 100 0 C are passed, which are very well suited for use of the amidohydrolase according to the invention, so that the acrylamide formation can be suppressed.
  • extrusion processes very often play a role.
  • extrusion processes are carried out at 80 to 100 0 C final temperature.
  • holding processes at high temperatures between 70 and 100 ° C play a role.
  • thermostable amidohydrolase used in the present invention is the possibility of reuse (recycle) the enzyme.
  • the amidohydrolase which is not denatured by its thermostable properties even at elevated temperatures, ie up to preferably 100 0 C, extracted after their use or separated by other means and thus used for re-application.
  • Such a recycled amidohydrolase solution may undergo several, ie preferably at least 1, 2, 3, 4 or 5 cycles for the reduction of asparagine.
  • amidohydrolases used according to the invention is preferably harmless to health, since these amidohydrolases are natural, non-toxic substances.
  • Another aspect of the present invention relates to a process for the preparation of a foodstuff or a stimulant comprising the steps:
  • the method according to the invention for preparing a foodstuff or a stimulant comprises the steps:
  • step (iv) if necessary, reinstituting the optionally separated in step (ii) amidohydrolase in step (i).
  • Step (i) of the method according to the invention is preferably carried out under conditions (time, temperature, pH, amount of amidohydrolase, etc.) such that the amount of (free) asparagine initially contained in the food or beverage is at least 50%, more preferably at least 75%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 85%, most preferably at least 90% and especially at least 95% is reduced.
  • Suitable conditions can be found by a person skilled in the art by conventional routine experiments.
  • Step (i) of the process according to the invention is preferably carried out under conditions (time, temperature, pH, amount of amidohydrolase, etc.) that the amount of acrylamide formed in the optional subsequent thermal treatment by at least 20%, preferably 30% still more preferably at least 40%, and most preferably at least 50%.
  • step (i) of the process according to the invention is preferably carried out under conditions (time, temperature, pH, amount of amidohydrolase, etc.) that after carrying out step (iii) the amount contained in the food or beverage of acrylamide is at most 200 ppm, more preferably at most 150 ppm, even more preferably at most 135 ppm, most preferably at most 100 ppm and especially at most 50 ppm.
  • Suitable conditions can be found by a person skilled in the art by conventional routine experiments.
  • step (i) of the process according to the invention is preferably carried out under conditions (time, temperature, pH, amount of amidohydrolase, etc.) that after carrying out step (iii) those contained in the food or beverage Amount of acrylamide is at most 1,000 ⁇ g / kg, more preferably at most 500 ⁇ g / kg, even more preferably at most 300 ⁇ g / kg, most preferably at most 150 ⁇ g / kg and especially at most 50 ⁇ g / kg.
  • Suitable conditions can be found by a person skilled in the art by conventional routine experiments.
  • the performance of step (i) is for at least 240 minutes, more preferably at least 120 minutes, even more preferably at least 60 minutes, most preferably at least 20 minutes, and most preferably at least 5 minutes.
  • the weight ratio of food or beverage to amidohydrolase is in the range of 10 2 : 1 to 10 10 : 1, more preferably 10 2 : 1 to 10 8 : 1, even more preferably 10 4 : 1 to 10 8 : 1, most preferably from 10 4 : 1 to 10 7 : 1, and more preferably from 10 5 : 1 to 10 7 : 1.
  • the amidohydrolase is provided in an aqueous solution and combined with the food or beverage, for example by spraying.
  • concentration of the amidohydrolase in the aqueous solution is preferably 10 "6 to 100 g / l preferably from 10" 5 to 10 g / l, more preferably 10 "4 to 1 g / l, Elliszugtesten 10 ⁇ 3 to 10" 1 g / l and in particular 10- 2 to 5 ⁇ 10 "2 g / l.
  • the food or beverage preferably has a residual content of at most 200 ppm, more preferably at most 150 ppm, even more preferably at most 135 ppm, most preferably at most 100 ppm and especially at most 50 ppm of aspartagin and / or acrylamide.
  • the food agent or semi-luxury agent preferably has a residual content of at most 400 ⁇ g / kg, more preferably at most 300 ⁇ g / kg, even more preferably at most 200 ⁇ g / kg, most preferably at most 100 ⁇ g / kg and especially at most 50 ⁇ g / kg of asparagine and / or acrylamide ,
  • a further aspect of the invention relates to a vector which contains a nucleotide sequence as defined above.
  • a vector is selected from the group consisting of plasmids, cosmids, phagemids, phage vectors, bacterial artificial chromosomes and yeast artificial chromosomes.
  • a further aspect of the invention is a process for preparing an amido-hydrolase as defined above, which comprises the following steps:
  • Natural asparaginases can be localized intracellularly and extracellularly. If one wants to overexpress asparaginases intracellularly in large quantities, one encounters the problem that high asparaginase concentrations in the cell exert a toxic effect, since they hydrolyze the cell-essential amino acid asparagine.
  • the amidohydrolase according to the invention in the temperature range of 20-37 0 C, in which usually the fermentation processes of mesophilic organisms such as Escherichia coli, Pseudomonas sp., Bacillus sp., Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae or Aspergillus sp. carried out, only has a very low residual activity.
  • the enzyme has a residual activity of ⁇ 2% at 25 ° C. This allows the intracellular expression of asparaginase according to the invention in mesophilic expression hosts in large quantities.
  • Another aspect of the invention comprises a method of producing an amidohydrolase as defined above, wherein the amidohydrolase is expressed intracellularly in a microorganism, wherein the residual activity of the enzyme at the culture temperature during expression of the amidohydrolase is ⁇ 30%, preferably ⁇ 15 %, more preferably ⁇ 10%, even more preferably ⁇ 5%, most preferably ⁇ 2%.
  • Mineralogical fermentation protocols for microorganisms which are available to the person skilled in the art allow yields of organic matter of preferably> 100 g / l, more preferably> 125 g / l, more preferably> 150 g / l, even more preferably> 175 g / l and most preferably> 200 g / l.
  • the intracellular expression of amidohydrolase in a microorganism most preferably results in an activity yield of> 10 kU / g wet biomass, more preferably> 20 kU / g wet biomass, more preferably> 40 kU / g wet biomass, more preferably> 60 kU / g wet biomass > 80 kU / g organic moisture reached.
  • the expression of the intracellular according to the invention takes place in a mesophilic expression host such as Escherichia coli, Pseudomonas sp., Bacillus sp., Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae or Aspergillus sp.
  • a mesophilic expression host such as Escherichia coli, Pseudomonas sp., Bacillus sp., Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae or Aspergillus sp.
  • the resulting PCR product was purified via the QIAquick PCR purification kit (Qiagen, Hilden) according to the manufacturer's instructions.
  • the gene obtained under point 1.1 was cloned into the expression vector pRSF-1 b ⁇ SEQ ID NO: 5> (vector pRSF-1 b, Novagen-Merck-Biosciences, Bad Soden).
  • the PCR product was digested by means of the restriction endonucleases Eco31I and PstI and the vector pRSF-1 b ⁇ SEQ ID NO: 5> using the restriction endonucleases NcoI and PstI (all Fermentas, Vilnius, Lithuania) as listed below:
  • the finished plasmid was reisolated by means of the plasmid purification kit QIAprep Minipreparations Kit (Qiagen, Hilden) according to the manufacturer's instructions and the expression plasmid pRSF Pf-Asnl ⁇ SEQ ID NO: 6> obtained.
  • the expression plasmid pRSF_Pf-Asnl ⁇ SEQ ID NO: 6> was electroporated into Rosetta 2 (DE3) (Novagen-Merck-Biosciences, Bad Soden) cells and the cells were incubated on LB agar plates (10 g tryptone, 5 g yeast extract, 10 g NaCl, ad 1 l distilled water) with kanamycin (Kan) and chloramphenicol (Cam).
  • the major culture for expression consisted of 500 ml LB (Kan, Cam) medium with 1% (w / v) glucose. It was inoculated with an aliquot of preculture. The major culture was incubated at 37 ° C and 200 rpm. After reaching an OD ⁇ oo of 0.9 was induced with 1 mM IPTG (isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside) and shaken overnight at 30 0 C and 200 rpm.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • the cells were collected by centrifugation (4 0 C, 15 min, 3200 g ⁇ ) sedimented and after removal of the medium, the pellet was weighed and (with 20 ml of lysis buffer 10 mM Tris / HCl pH 8.0, 0.5 mg / ml lysozyme) and sonicated (5 ⁇ 30 s, 80% power).
  • the suspension of the disrupted cells was centrifuged (4 0 C, 30 min, 14000 ⁇ g). The supernatant was then subjected to incubation for 30 min at 80 0 C and subjected to centrifugation again (4 0 C, 30 min, 14000 ⁇ g).
  • the pellet was discarded and the crude extract so obtained was collected and stored at 4 ° C for further study. From the supernatant, the activity yield was determined to be 160 kU (see Example 2). From the weight of the cell pellet of 4 g yielded a yield of 40 kU per g of biomass.
  • Asparaginases catalyze the conversion of asparagine into aspartate with the release of ammonium ions. These can be detected via color reagents, such as the Nessler reagent. Alternatively, ammonium ions can also be detected by the Berthelot reaction (DIN 38 406 E5). The Nessler reagent assay is based on an endpoint determination. The reaction is incubated over a period of 30 min at the appropriate temperature, stopped and detected the resulting ammonium ions.
  • L-asparagine monohydrate App. A3669, MW 150.14 g / mol
  • Nessler's reagent Fluka, 72190
  • the batches were mixed and a thermocycler preheated to the desired temperature (37, 70, 80, 90 and 99 0 C).
  • the determined absorption value was converted into liberated ammonium ions on the basis of the calibration curve (see FIG. Subsequently, the definition of the unit (one unit of asparaginase releases 1 ⁇ mol of NH 4 per minute under assay conditions) was used to calculate the volumetric activity [U / ml] of the enzyme. Such calculations are well known to those skilled in the art.
  • the determination of the volumetric (enzyme) activity was always carried out at an incubation temperature of 90 ° C.
  • the asparaginase solution of Example 1 was diluted 1:10 in 50 mM Tris / HCl pH 8.6 and then diluted for different time intervals at 95 ° C (0, 1, 15, 30, 45 and 60 min) preincubated. This was followed by a further dilution of 1: 100 in 50 mM Tris / HCl pH 8.6 and the determination of the remaining residual activity.
  • the values obtained / calculated are summarized in the following table (see also FIG.
  • Blank 1 500 g green coffee beans sort Arabica mixture + 267 g 100 mM TRIS / HCl pH 8.6 (25 ° C.)
  • Blank 2 500 g raw coffee beans variety Brazil Arabica + 267 g 100 mM TRIS / HCl pH 8.6 (25 ° C.)
  • Sample 1 500 g green coffee beans sort Arabica mixture + 267 g 100 mM TRIS / HCl pH 8.6 (25 0 C) + 1400 units asparaginase from embodiment 1
  • Sample 2 500 g raw coffee beans variety Brazil Arabica + 267 g 100 mM TRIS / HCl pH 8.6 (25 ° C.) + 1400 units asparaginase from Example 1
  • the blanks and samples were incubated for 60 min at 80 ° C. with rotation.
  • the liquid was then filtered from the coffee beans, the beans dried and roasted.
  • the acrylamide content was determined by an independent accredited testing laboratory. The results of the investigations are shown in the following table (see also FIG.

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung einer Amidohydrolase zur Aufbereitung eines Nahrungsmittels oder eines Genussmittels.

Description

Amidohydrolasen zur Aufbereitung von Nahrungs- oder Genussmitteln
Die Erfindung betrifft die Verwendung einer Amidohydrolase zur Aufbereitung eines Nahrungsmittels oder eines Genussmittels.
Kohlenhydrathaltige Nahrungsmittel, werden ^eit Jahrtausenden von Menschen auf der ganzen Welt verzehrt. Derartige Nahrungsmittel sind in der heutigen Zeit in vielfältigster Weise erhältlich, beispielsweise in Form von Knäckebrot, Zwieback, Keksen, Brezeln, Toastbrot, Frühstückscerealien, Biskuites, Kartoffelchips, Tortillachips, Pommes frites, Reiswaffeln, etc.
Bei der Verarbeitung, Zubereitung oder Aufbereitung von kohlenhydrathaltigen Nahrungsmitteln, insbesondere bei Erhitzungsprozessen, wie das beispielsweise beim Backen, Braten, Rösten, Grillen oder Frittieren der Fall ist, wird häufig Acrylamid gebildet, welches sich in der Folge in diesen Nahrungsmitteln anreichert. Ein ähnliches Phänomen wird auch bei der Aufbereitung von Genussmitteln, wie beispielsweise bei der Zubereitung von Kaffee beobachtet.
Im April 2002 wurden von der schwedischen Behörde für Lebensmittelsicherheit erstmals Untersuchungsergebnisse zur Acrylamidbelastung von Nahrungsmitteln veröffentlicht. Im selben Jahr veröffentlichte die Weltgesundheitsorganisation (WHO) einen Bericht, der unter anderem gesundheitliche Risiken diskutiert, die mit einer hohen Acrylamidbelastung in Nahrungsmitteln einhergehen können (FAO/WHO: "Health Implications of Acrylamide in Food", Geneva, 2002).
Acrylamid ist eine Substanz, die direkt das menschliche Erbgut (DNA) angreift. Ferner wird Acrylamid von Leberenzymen in Glycidamid umgesetzt, welchem eine ge- notoxische Wirkung zugeschrieben wird. Acrylamid wie auch Glycidamid bilden Verbindungen mit Aminosäuren und Nukleinbasen und können so die Struktur und Funktion von beispielsweise der DNA und Hämoglobin verändern. Insgesamt wird Acrylamid von Experten als krebserzeugend, erbgutverändernd, giftig, reizend, sensibilisierend und fortpflanzungsgefährdend eingestuft.
Der wichtigste Ausgangsstoff zur Entstehung von Acrylamid in Nahrungsmitteln ist die Aminosäure Asparagin, die ubiquitär in Nahrungsmitteln wie beispielsweise Kartoffeln, Reis und Getreide, aber auch in Kaffee, Trockenfrüchten in mehr oder minder hohen Konzentrationen vorkommt. Enthält das Nahrungs-/Genussmittel neben Asparagin auch noch Zucker wie z. B. Fructose oder Glucose, so wird die Bildung von Acrylamid bei hohen Temperaturen noch zusätzlich gefördert.
Aufbereitungsverfahren für Nahrungs- oder Genussmittel, welche Vorbehandlungsschritte zur Reduktion des Acrylamidgehalts beinhalten, sind bereits aus dem Stand der Technik bekannt (vgl. z.B. US 7,037,540, US 2004/81724 oder US 2005/ 202153). Aus dem Stand der Technik sind auch Verfahren bekannt, bei denen zur Vorbehandlung Enzyme, insbesondere Asparaginasen eingesetzt werden. Diese Vorbehandlungsschritte, welche die Entfernung, Inaktivierung und/oder die Extraktion von Asparagin aus den aufzubereitenden Nahrungs- oder Genussmitteln erleichtern sollen, sind teilweise sehr kosten- und/oder zeitaufwändig.
So umfassen beispielsweise Verfahren zur Aufbereitung von Kaffeebohnen jeweils aufwändige Trocknungs-, Bedampfungs- oder Befeuchtungsschritte. Durch derartige Vorbehandlungsschritte sollen die Poren der Kaffeebohnen geöffnet werden, um in der Folge das in den Kaffeebohnen enthaltene Asparagin besser extrahieren, reduzieren oder inaktivieren zu können.
Bei einer Trocknung werden die Kaffeebohnen bei Temperaturen unter ca. 500C erwärmt, um anschließend in Asparagin-inaktivierenden Lösungen, wie beispielsweise Calciumlactat oder Calciumcitrat eingeweicht zu werden.
Bei einem Bedampfen/Befeuchten werden die Kaffeebohnen mit Niederdruck- oder atmosphärischem Dampf oder mit Wasser besprüht, wobei die Feuchtigkeit von den Bohnen aufgenommen wird. Daran anschließend werden die Bohnen - in einem separaten Schritt - üblicherweise mit Asparagin-inaktivierenden Lösungen behandelt. All diese vorstehend aufgeführten, aufwändigen und zum Teil sehr zeitintensiven Vorbehandlungsschritte führen direkt oder indirekt zu erhöhten Kosten, da sie den gesamten Aufbereitungsprozess verlängern und in der Folge auch verteuern.
Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, die aus dem Stand der Technik bekannten Aufbereitungsverfahren von Nahrungsmitteln oder Genussmitteln zu verbessern. Durch derartige Verbesserungen sollten insbesondere Vorbehandlungsschritte zur Reduktion des Gehalts an Asparagin bzw. Acrylamid in Nahrungs- oder Genussmitteln vereinfacht werden, um so das gesamte Aufbereitungsverfahren kürzer und kostengünstiger zu gestalten.
Diese Aufgabe wird durch den Gegenstand der Patentansprüche gelöst.
Es wurde überraschend gefunden, dass Nahrungs- oder Genussmittel unter Verwendung einer Amidohydrolase, welche nach einer Inkubationsdauer von 5 min bei 500C eine Restaktivität von wenigstens 75% aufweist, aufbereitet werden können.
Die Erfindung betrifft die Verwendung einer Amidohydrolase, vorzugsweise Asparaginase, welche nach einer Inkubationsdauer von 5 min bei 500C eine Restaktivität von wenigstens 75% aufweist, zur Aufbereitung eines Nahrungsmittels oder eines Genussmittels, vorzugsweise zur Verringerung des Gehalts an Asparagin in dem Nahrungs- oder Genussmittel. Durch die Verringerung des Gehalts an Asparagin wird vorzugsweise auch der Gehalt an Acrylamid in dem Nahrungs- oder Genussmittel verringert, da Asparagin ein Precursor von Acrylamid ist, wenn das Nahrungs- oder Genussmittel einer nachfolgenden thermischen Behandlung unterzogen wird.
Figur 1 zeigt die Eichgerade der Ammoniumionenbestimmung mittels Nessler- Reagens. x-Achse: Menge NH4 pro 40μl, y-Achse: Optische Dichte (OD) bei 436 nm. Der Korrelationskoeffizient R2 beträgt 0,9979.
Figur 2 zeigt die enzymatische Aktivität der Asparaginase I von Pyrococcus furiosus bei unterschiedlichen Inkubationstemperaturen. rA: relative Aktivität (in %), T [0C]: Temperatur in Grad Celsius. Figur 3 zeigt die Temperaturstabilität der Asparaginase I von Pyrococcus furiosus bei einer Temperatur von 95°C. rA: relative Aktivität (in %), min: Zeit in Minuten. Aus der Grafik ist ersichtlich, dass die Asparaginase bei 95°C nach einer Inkubationsdauer von 60 Minuten eine relative Aktivität bzw. Restaktivität von ca. 100% aufweist.
Figur 4 zeigt die Temperaturstabilität der Asparaginase I von Pyrococcus furiosus bei einer Temperatur von 99°C. rA: relative Aktivität (in %), min: Zeit in Minuten. Aus der Grafik ist ersichtlich, dass die Asparaginase bei 99°C nach einer Inkubationsdauer von 60 Minuten eine relative Aktivität bzw. Restaktivität von ca. 70% aufweist.
Figur 5 zeigt die Reduktion des Acrylamidgehaltes nach der Röstung von zwei Kaffeesorten durch Vorbehandlung der Rohkaffeebohnen mit der erfindungsgemäßen Asparaginase gemäß Beispiel 4 bei 80 0C. Blank 1 und Probe 1 - Kaffeesorte Arabica-Mischung, Blank 2 und Probe 2 - Kaffeesorte Brazil Arabica.
Amidohydrolasen gehören zur Enzymfamilie der Hydrolasen. Amidohydrolasen zeichnen sich dadurch aus, dass sie Amid-Gruppen spalten/hydrolisieren. Sie sind unter den EC-Nummern EC 3.5.1 und 3.5.2. zusammengefasst (Enzyme Commission number, nach der Definition des Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB)).
Unter dem Begriff "Restaktivität" im Sinne der Beschreibung ist jene spezifische/ volumetrische enzymatische Aktivität zu verstehen, welche ein Enzym nach einer bestimmten Inkubationsdauer bei einer bestimmten Temperatur, verglichen mit der ursprünglichen spezifischen/volumetrischen Aktivität im Bereich seines Temperatur- Optimums, unter ansonsten identischen Reaktionsbedingungen (pH, Substrat, etc.) aufweist. Dabei ist unter der spezifischen/volumetrischen Aktivität eines Enzyms im Sinne der Beschreibung eine bestimmte Menge eines umgesetzten Substrats (in μmol) pro Zeit (in min) pro Enzymmenge (in mg bzw. ml) zu verstehen. Die Restaktivität eines Enzyms ergibt sich aus der spezifischen/volumetrischen Aktivität des Enzyms nach der o.g. Inkubationsdauer dividiert durch die ursprüngliche spezifische/volumetrische Aktivität, ausgedrückt in Prozent (%). Die spezifische Aktivität eines Enzyms wird hierbei vorzugsweise in U/mg, die volumetrische Aktivität eines Enzyms vorzugsweise in U/ml angegeben. Alternativ kann die spezifische/ volumetrische Aktivität eines Enzyms im Sinne der Beschreibung auch in katal/mg bzw. katal/ml angegeben sein.
Der Begriff "enzymatische Wirksamkeit", der manchmal auch als "katalytische Wirksamkeit" oder "katalytische Effizienz" bezeichnet wird, ist dem Fachmann allgemein bekannt und bezieht sich auf die Umsatzgeschwindigkeit eines Enzyms und wird üblicherweise über den Quotienten von kkat/KM ausgedrückt werden, wobei kκat die katalytische Konstante (auch turnover number bezeichnet) und der KM-Wert jener Substratkonzentration entspricht, bei dem die Reaktionsgeschwindigkeit bei der Hälfte ihres Maximalwertes liegt. Die enzymatische Wirksamkeit eines Enzyms kann alternativ auch durch die spezifische Aktivität (μmol umgesetztes Substrat x mg"1 x min"1; vgl. oben) oder die volumetrische Aktivität (μmol umgesetztes Substrat x ml*1 x min"1; vgl. oben) angegeben werden. Im Zusammenhang mit der enzymatischen Wirksamkeit kann auf die allgemeine Literatur wie beispielsweise Voet et al. "Biochemie", 1992, VCH-Verlag, Kapitel 13, Seiten 331-332 verwiesen werden.
In bevorzugten Ausführungsformen ArA7 bis FrF7 weist die erfindungsgemäß verwendete Amidohydrolase unter den in der nachstehenden Tabelle angegebenen Bedingungen eine Restaktivität von vorzugsweise wenigstens 75%, bevorzugter wenigstens 80%, am bevorzugtesten wenigstens 90% auf:
Figure imgf000006_0001
In vorstehender Tabelle bedeutet beispielsweise Ausführungsform Cβ, dass die Amidohydrolase nach mindestens 50 Minuten bei 700C eine Restaktivität von wenigstens 75%, bevorzugter wenigstens 80%, am bevorzugtesten wenigstens 90% aufweist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist die Amidohydrolase unter den vorstehend aufgeführten Bedingungen eine Restaktivität im Bereich von vorzugsweise 75 - 100%, bevorzugter 75 - 90% auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der eingesetzten Amido- hydrolase um eine Asparaginase. Unter einer Asparaginase im Sinne der Beschreibung wird ein Enzym verstanden, welches die Hydrolyse von Asparagin zu Aspartat und Ammonium katalysiert. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um eine Asparaginase vom Typ I, in einer anderen bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um eine Asparaginase vom Typ II.
Vorzugsweise ist die Amidohydrolase, vorzugsweise die Asparaginase, thermoaktiv.
"Thermoaktiv" im Sinne der Beschreibung sind solche Amidohydrolasen, vorzugsweise Asparaginasen, deren Temperatur-Optimum oberhalb von 500C liegt.
Der Begriff "Temperatur-Optimum" ist dem Fachmann allgemein bekannt und betrifft jenen Temperaturbereich, bei dem ein Enzym seine maximale enzymatische Wirksamkeit aufweist. In diesem Zusammenhang kann auf die einschlägige Literatur, wie beispielsweise Voet et al. "Biochemie", 1992, VCH-Verlag, Kapitel 13, Seite 331 ; I. H. Segel, Enzyme Kinetics: Behavior and Analysis of Rapid Equilibrium and Steady- State Enzyme Systems, Wiley Interscience, 1993; und A.G. Marangoni, Enzyme Kinetics: A Modern Approach, Wiley Interscience, 2002.
Vorzugsweise ist im Sinne der Beschreibung unter dem Temperatur-Optimum jener Temperaturbereich zu verstehen, in dem die erfindungsgemäß verwendete Amidohydrolase wenigstens 80%, vorzugsweise wenigstens 90% der maximalen enzyma- tischen Wirksamkeit, bei ansonsten gleichbleibenden Reaktionsbedingungen, aufweist.
Vorzugsweise liegt das Temperatur-Optimum der Amidohydrolase, vorzugsweise der Asparaginase, im Bereich von 60 bis 1300C, bevorzugter im Bereich von 70 bis 1200C, noch bevorzugter im Bereich von 75 bis 1100C, am bevorzugtesten im Bereich von 80 bis 1000C und insbesondere im Bereich von 85 bis 95°C. Bevorzugt sind die erfindungsgemäß eingesetzten Amidohydrolasen, vorzugsweise Asparaginasen, daher nicht nur thermostabil (d.h. halten hinsichtlich ihrer enzymatischen Aktivität einer thermischen Behandlung stand), sondern sind zusätzlich thermoaktiv (d.h. entfalten ihre volle enzymatische Aktivität erst bei erhöhter Temperatur).
Aus dem Stand der Technik sind bisher keine Verfahren bekannt, in denen eine thermoaktive Asparaginase zur Behandlung von Nahrungs- oder Genussmitteln zur Reduktion des Acrylamid-Gehalts eingesetzt wurden.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist die Amidohydrolase, vorzugsweise Asparaginase, bei einer Temperatur von vorzugsweise 60 bis 1200C, bevorzugter 65 bis 1100C, noch bevorzugter 70 bis 1000C, am bevorzugtesten 75 bis 100°C und insbesondere 80 bis 90°C eine spezifische Aktivität von vorzugsweise wenigstens 100, bevorzugter wenigstens 200, noch bevorzugter wenigstens 300, noch bevorzugter wenigstens 500, am bevorzugtesten wenigstens 800 und insbesondere wenigstens 1000 Units/mg auf, wobei 1 Unit als diejenige Menge an Amidohydrolase definiert ist, welche 1 ,0 μmol Ammoniak pro Minute aus L-Asparagin bei der entsprechenden Reaktionstemperatur und einem pH-Wert von 8,6 (50 mM Tris-HCI, pH-Einstellung bei 25 °C) freisetzt.
Es wurde überraschend gefunden, dass thermoaktive Asparaginasen gegenüber anderen Asparaginasen erhebliche Vorteile aufweisen. So kann mit Hilfe von thermoaktiven Asparaginasen die Spaltung des Asparagins bei vergleichsweise hohen Temperaturen durchgeführt werden, wodurch eine Kompatibilität erreicht wird mit Prozessen, bei denen hohe Temperaturen, insbesondere Halteprozesse bei hohen Temperaturen, ohnehin eine Rolle spielen. Ferner erlaubt die Durchführung der Spaltung des Asparagins bei höheren Temperaturen eine höhere Reaktionsgeschwindigkeit.
Bei der enzymatischen Behandlung von Kaffeebohnen ist es beispielsweise erforderlich, die grünen Kaffeebohnen mit Wasser quellen zu lassen, ehe sie mit Enzym behandelt werden können. Um die Kaffebohnen dann im Anschluss rösten zu können, müssen sie zuvor wieder getrocknet werden. Die enzymatische Behandlung von Kaffee erfordert daher u.a. die folgenden Schritte: a) Anfeuchten; b) enzymatische Behandlung im angefeuchteten Zustand; c) Trocknen; d) Rösten.
Übliche industrielle Verfahren zur Entkoffeinierung bzw. zur Gewährleistung des „milden Aromas" umfassen bereits ohnehin die oben genannten Verfahrensschritte a), c) und d).
Für den Trocknungsschritt c) müssen die Kaffeebohnen auf eine ausreichende Temperatur erwärmt werden, da das Wasser sonst nicht effizient entfernt werden kann. Die Erwärmung und Befeuchtung der Kaffeebohnen erfolgt bevorzugt mit heißem Wasserdampf (>100°C). Der anschließende Trocknungsschritt c) läuft dann bei 70-800C ab.
Hätte die eingesetzte Amidohydrolase ein Temperatur-Optimum von z.B. lediglich 500C, so wäre dies sehr ungünstig, da man zunächst zur Enzymbehandlung auf 500C abkühlen und anschließend wieder zum Trocknen aufheizen müsste.
Mit Hilfe der erfindungsgemäß bevorzugten, thermoaktiven Asparaginasen ist hingegen kein Abkühlen erforderlich, was einen besonderen Vorteil der Erfindung darstellt.
Ein weiterer Vorteil beim Einsatz thermoaktiver Asparaginasen ist darin zu sehen, dass infolge der erhöhten Temperatur auch die Diffusion des zu hydrolysierenden Asparagins erhöht ist, was sich ebenfalls in einer verbesserten Effizienz des erfindungsgemäßen Verfahrens niederschlägt.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es, unter Beibehaltung der Prozessschritte üblicher Verfahren zur Aufbereitung eines Nahrungsmittels oder eines Genussmittels eine Aufbereitung mit Hilfe einer Amidohydrolase zu erreichen, d.h. ohne gravierende Veränderungen der Verfahrensabläufe. Bevorzugt kann die enzymatische Behandlung während eines Prozessschritts durchgeführt werden, bei dem das Nahrungsmittel bzw. das Genussmittel ohnehin einer erhöhten Temperatur ausgesetzt ist. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist die Amidohydrolase, vorzugsweise Asparaginase, bei einer Temperatur von vorzugsweise 60 bis 1200C, bevorzugter 65 bis 1100C, noch bevorzugter 70 bis 1000C, am bevorzugtesten 75 bis 1000C und insbesondere 80-900C eine volumetrische Aktivität von vorzugsweise wenigstens 50, bevorzugter wenigstens 100, noch bevorzugter wenigstens 300, noch bevorzugter wenigstens 500, am bevorzugtesten wenigstens 800 und insbesondere wenigstens 1000 Units/ml auf, wobei 1 Unit als diejenige Menge an Amidohydrolase definiert ist, welche 1 ,0 μmol Ammoniak pro Minute aus L-Asparagin bei der entsprechenden Reaktionstemperatur und einem pH-Wert von 8,6 (50 mM Tris-HCI, pH-Einstellung bei 25 0C) freisetzt.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist die Amidohydrolase, vorzugsweise Asparaginase, ein pH-Optimum im Bereich von vorzugsweise pH 1 bis pH 14, bevorzugter im Bereich von pH 3 bis pH 12, noch bevorzugter im Bereich von pH 5 bis pH 11 , am bevorzugtesten im Bereich von pH 7 bis pH 10 und insbesondere im Bereich von pH 8 bis pH 9 auf. Der Begriff "pH-Optimum" ist dem Fachmann allgemein bekannt und betrifft jenen pH-Bereich, bei dem ein Enzym seine maximale enzyma- tische Wirksamkeit aufweist. In diesem Zusammenhang kann auf die einschlägige Literatur, wie beispielsweise Voet et al. "Biochemie", 1992, VCH-Verlag, Kapitel 13, Seite 331 verwiesen werden. Vorzugsweise ist im Sinne der Beschreibung unter dem pH-Optimum jener pH-Bereich zu verstehen, in dem die erfindungsgemäß verwendete Amidohydrolase wenigstens 80%, vorzugsweise wenigstens 90% der maximalen enzymatischen Wirksamkeit, bei ansonst gleichbleibenden Reaktionsbedingungen, aufweist.
Es wurde überraschend gefunden, dass Amidohydrolasen, vorzugsweise Aspara- ginasen, bereitgestellt werden können, welche über einen sehr breiten pH-Bereich aktiv sind. Im Bereich von pH 5 - pH 10 weisen diese Amidohydrolasen, vorzugsweise Asparaginasen, bevorzugt eine Aktivität von wenigstens 10% der maximalen Aktivität auf. Dadurch wird der Einsatz dieser Enzyme in verschiedenen Prozessen mit stark unterschiedlichen pH-Bereichen möglich. Auch ist ein Einsatz in Prozessen möglich, bei denen der pH-Wert im Prozess starken Schwankungen unterliegt. Auch sind insbesondere Prozesse möglich, in denen pH-Werte von 5 bis 10 auftreten. Bei der Behandlung von grünen Kaffeebohnen mit Leitungswasser beispielweise können sehr niedrige pH-Werte von ~ 5 auftreten.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist die erfindungsgemäße Amidohydrolase, vorzugsweise Asparaginase, über den gesamten pH-Bereich von 5-10 eine Aktivität von wenigstens 10%, bevorzugter wenigstens 15%, noch bevorzugter wenigstens 20%, am bevorzugtesten wenigstens 25% und insbesondere wenigstens 30% im Vergleich zu maximalen Aktivität auf, d.h. zur maximalen Aktivität bei optimalem pH- Wert unter ansonsten identischen Bedingungen, vorzugsweise bei optimaler Temperatur und Konzentration.
Die erfindungsgemäß verwendete Amidohydrolase, vorzugsweise Asparaginase, ist vorzugsweise lagerstabil. In bevorzugten Ausführungsformen G1-G17 bis K1-K17 weist die Amidohydrolase unter den in der nachstehenden Tabelle angegebenen Bedingungen eine Restaktivität von wenigstens 80%, bevorzugter wenigstens 85%, noch bevorzugter wenigstens 90% und insbesondere wenigstens 95% auf:
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In vorstehender Tabelle bedeutet beispielsweise Ausführungsform I5, dass die Amidohydrolase nach Lagerung für 25 Tage bei 100C eine Restaktivität von wenigstens 80%, bevorzugter wenigstens 85%, noch bevorzugter wenigstens 90% und insbe- sondere wenigstens 95% aufweist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der weist die erfindungsgemäß verwendete Amidohydrolase bei einer Lagerung bei 4°C über einen Zeitraum von 30 Tagen eine Restaktivität von wenigstens 80% auf.
Die Gruppe der Amidohydrolasen umfasst unter anderem die Enzymfamilie der Asparaginasen (EC 3.5.1.1 ), welche die Hydrolyse von Asparagin zu Aspartat und Ammoniak katalysieren. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der erfindungsgemäß verwendeten Amidohydrolase um eine Asparaginase.
Es ist allgemein bekannt, dass Asparaginasen sowohl Asparagin (L- und D-Form) als auch Glutamin (L- und D-Form) umsetzen können.
Angesichts dieser Substratpromiskuität von Asparaginasen hydrolysiert die erfindungsgemäß eingesetzte Asparaginase L-Asparagin vorzugsweise schneller als L- Glutamin und/oder ggf. schneller als D-Asparagin.
Vorzugsweise liegt das Verhältnis der KM-Werte (jeweils in mM) von L-Asparagin : L- Glutamin im Bereich von 1 :10 bis 1 :400, bevorzugter im Bereich von 1 :20 bis 1 :200, noch bevorzugter im Bereich von 1 :30 bis 1 :100, am bevorzugtesten im Bereich von 1 :40 bis 1 :80.
In einer bevorzugten Ausführungsform präferiert die erfindungsgemäß eingesetzte Asparaginase L-Asparagin mehr als L-Glutamin und/oder mehr als D-Asparagin. Vorzugsweise liegt das Verhältnis der KM-Werte (jeweils in mM) von L-Asparagin : L- Glutamin im Bereich von 1 :1 bis 1 :400, bevorzugter im Bereich von 1 :5 bis 1 :100, noch bevorzugter im Bereich von 1 :10 bis 1 :50.
Amidohydrolasen bzw. Asparaginasen können thermolabil oder thermostabil sein. Thermostabile Asparaginasen sind bereits aus dem Stand der Technik bekannt (vgl. z.B. Li et al., Anal. Chem. 2002, 74, p.3336-3341 , US 5,719,056 oder Agathi et al., Mol. Cell. Biochem. 2001 , 216, p.93-101 ). Hinweise auf deren Verwendung bei Prozessen der Zu- oder Aufbereitung von Nahrungsmitteln oder Genussmitteln können diesen Druckschriften jedoch nicht entnommen werden. Unter den Begriffen "thermostabile Amidohydrolase" oder "thermostabile Asparagi- nase" im Sinne der Beschreibung ist vorzugsweise eine Amidohydrolase bzw. Aspa- raginase zu verstehen, welche nach einer Inkubationsdauer von 5 min bei 500C eine Restaktivität von wenigstens 75% aufweist.
Vorzugsweise handelt es sich bei der Asparaginase um eine Asparaginase aus Archaeoglobus sp. (z.B. Archaeoglobus fulgidus), Thermus sp. (z.B. Thermus thermophilus), Pyrococcus sp. (z.B. Pyrococcus abyssi), Thermococcus sp. (z.B. Thermococcus kodakarensis), Methanothermobacter sp. (z.B. Methanothermobacter thermautotrophicus) oder um eine Asparaginase aus weiteren Euryarchaeota oder um die Asparaginase I von Pyrococcus furiosus.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Asparaginase durch eine Nukleotid- sequenz kodiert, welche vorzugsweise wenigstens 60%, bevorzugter wenigstens 80%, noch bevorzugter wenigstens 90%, noch bevorzugter wenigstens 95%, am bevorzugtesten wenigstens 99% und insbesondere wenigstens 99,9% homolog zur Nukleotidsequenz <SEQ ID NO: 1 > ist. Die Homologie wird hierbei bevorzugt mit Hilfe des Algorithmus nach Smith & Waterman (J Mol Biol., 1981 , 147(1 ), 195-7) ermittelt, unter Verwendung der BLOSUM62-Matrix und Werten von 11.0 für die Eröffnung einer Lücke, bzw. 1.0 für die Erweiterung einer Lücke.
Insbesondere ist es bevorzugt, dass die erfindungsgemäß verwendete Asparaginase durch die Nukleotidsequenz <SEQ ID NO: 1 > kodiert ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist die Aminosäuresequenz der Asparaginase eine Homologie (Sequenzidentität) von wenigstens 50%, bevorzugter wenigstens 75%, noch bevorzugter wenigstens 80%, noch bevorzugter wenigstens 90%, noch bevorzugter wenigstens 95%, am bevorzugtesten wenigstens 99% und insbesondere wenigstens 99,9% zur Aminosäuresequenz <SEQ ID NO: 2> auf. Die Homologie wird hierbei bevorzugt mit Hilfe des Algorithmus nach Smith & Waterman (J Mol Biol., 1981 , 147(1 ), 195-7) ermittelt, unter Verwendung der BLOSUM62-Matrix und Werten von 11.0 für die Eröffnung einer Lücke, bzw. 1.0 für die Erweiterung einer Lücke. In einer anderen, besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäß verwendete Asparaginase die Aminosäuresequenz <SEQ ID NO: 2>.
Zu-/Aufbereitungsverfahren von vorzugsweise kohlenhydrathaltigen Nahrungs- oder Genussmitteln weisen, wie bereits vorstehend ausgeführt wurde, häufig Vorbehandlungsschritte zur Reduktion des Acrylamidgehalts in diesen Nahrungsmitteln oder Genussmitteln auf. Es ist daher bevorzugt, dass die erfindungsgemäße Verwendung der Amidohydrolase bei der Aufbereitung, insbesondere im Rahmen einer Vorbehandlung, zur Hydrolyse von Asparagin zu Asparaginsäure dient.
Unter dem Begriff "kohlenhydrathaltige Nahrungsmittel" sind im Sinne der Beschreibung vorzugsweise Nahrungsmittel zu verstehen, deren Gehalt an Kohlenhydraten vorzugsweise wenigstens 0,1 Gew.-%, bevorzugter wenigstens 1 Gew.-%, noch bevorzugter wenigstens 5 Gew.-%, noch bevorzugter wenigstens 10 Gew.-%, am bevorzugtesten wenigstens 20 Gew.-%, und insbesondere wenigstens 30 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Nahrungsmittels beträgt.
Ferner ist es bevorzugt, dass die erfindungsgemäße Verwendung einer Amidohydrolase bei der Aufbereitung, insbesondere im Rahmen einer Vorbehandlung, der Verringerung des Gehalts an Asparagin und/oder Acrylamid in dem Nahrungsmittel oder dem Genussmittel dient.
Durch eine derartige, erfindungsgemäße Verwendung einer Amidohydrolase erfolgt vorzugsweise eine Verringerung des Gehalts an Asparagin, damit das Nahrungsmittel oder das Genussmittel bei einer thermischen Nachbehandlung einen verringerten Gehalt an Acrylamid aufweist.
Unter dem Begriff "thermische Nachbehandlung" sind im Sinne der Beschreibung bevorzugt jene Prozesse zu verstehen, die eine Erwärmung des Nahrungs- oder Genussmittels mit sich bringen. Übliche thermische Nachbehandlungen umfassen ein Erwärmen, Rösten, Grillen, Kochen, Garen, Backen, Dämpfen, Frittieren und dergleichen. Besonders bevorzugt eignet sich die erfindungsgemäß eingesetzte Amidohydrolase bei Zu- oder Aufbereitungsprozessen von kohlenhydrathaltigen Nahrungsmitteln, wie beispielsweise Reis, Brot- und Backwaren, Snacks, Fertigmischungen, Trockenfrüchten, Tierfutter, etc. oder Genussmitteln, wie Kaffee oder Kakao. Derartige Nahrungs- und/oder Genussmittel sind vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Knäckebrot, Zwieback, Keksen, Brezeln, Toastbrot, Waffeln, Muffins, Beagles, Croissants, Brownies, Frühstückscerealien, Biskuites, Kartoffelchips, Tortillachips, Maischips, Crackern, Nüssen, Pommes frites, Reiswaffeln, Polenta, Couscous, Pfannkuchen, Fertigmischungen, Kuchenmischungen, Biscuitmischungen, Brotmischungen, Croutons, Hundefutter, Katzenfutter, Kaffeebohnen, Kakaobohnen.
Besonders bevorzugt handelt es sich um Kaffebohnen. Bevorzugte Kaffeebohnenspezies sind Coffea arabica, Coffea canephora, Coffea liberica und Coffea robusta.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die Aufbereitung eines Genussmittels eine Entkoffeinierung und/oder ein Waschen von Kaffeebohnen, bei der die erfindungsgemäße Amidohydrolase eingesetzt wird.
In einer ebenfalls besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die Aufbereitung eines Genussmittels eine Hydrolyse von Kaffeebohnen, die mit dem Einsatz der erfindungsgemäßen Amidohydrolase, vorzugsweise Asparaginase, kombiniert wird. Kaffeebohnen werden im Zuge der Vorbereitung einer Entkoffeinierung oder zur Geschmacks-Veredelung einer Wasserdampf-Behandlung unterzogen. Hierbei werden die Bohnen stark erhitzt und mit Wasser in Verbindung gebracht. Hier erweist sich der Einsatz einer thermoaktiven Amidohydrolase zur Reduktion der Asparagin- Konzentration in der grünen Kaffeebohne als besonders vorteilhaft. Der Enzym- Einsatz bei Temperaturen über 700C ermöglicht eine vollständige Kompatibilität mit etablierten Verfahren und darüber hinaus sehr hohe Reaktionsgeschwindigkeiten, was die Prozesszeiten stark verkürzt.
Durch den erfindungsgemäßen Einsatz einer Amidohydrolase, vorzugsweise Asparaginase, welche die vorstehend beschriebenen Eigenschaften aufweist, ergeben sich zahlreiche, überraschende Vorteile, die nachfolgend anhand von vier illustrativen Beispielen dargelegt werden. Ein Fachmann erkennt, dass derartige Beispiele in keiner Weise limitierend aufzufassen sind, da die erfindungsgemäße Amidohydrolase für einen Einsatz in einer Vielzahl von Aufbereitungsverfahren von Nahrungsmitteln oder Genussmitteln geeignet ist.
So werden üblicherweise bei der Aufbereitung von Kartoffelchips die Kartoffeln, bevor sie unter Dampf gekocht werden, mit Asparaginase vorbehandelt, d.h. die Kartoffeln werden in Scheiben geschnitten und die Asparaginase kann entweder aufgesprüht werden oder die Kartoffelscheiben werden in eine asparaginasehaltige Lösung getaucht. Die Dauer einer derartigen, herkömmlichen Asparaginasebehandlung kann dabei teilweise beträchtlich (bis zu mehrere Stunden) sein, da aufgrund des Temperatur-Optimums des Enzyms (üblicherweise 370C, vgl. z.B. US 7,037,540, Beispiel 5) die Behandlungstemperatur maximal 370C betragen darf und der Aufschluss von Asparagin entsprechend langsam verläuft.
Durch die thermostabilen Eigenschaften der erfindungsgemäß verwendeten Amidohydrolase können die Kartoffelscheiben bei höheren Temperaturen einer Asparaginasebehandlung unterzogen werden, d.h. die Asparaginreduktion erfolgt schneller, u.a. da die Löslichkeit des Asparagins bei höheren Temperaturen zunimmt. Teilweise kann die Asparaginasebehandlung, bedingt durch die thermostabilen Eigenschaften des Enzyms sogar gleichzeitig während des Kochens der Kartoffeln unter Dampf erfolgen. Die Asparaginase kann hierbei beispielsweise zuvor auf die Kartoffelscheiben gesprüht werden.
Eine Deaktivierung der Amidohydrolase erfolgt auf herkömmliche Weise durch eine thermische Nachbehandlung, d.h. durch Frittieren der Kartoffelscheiben. Gesundheitliche Bedenken hinsichtlich der Verwendung dieser thermostabilen Amidohydrolasen ergeben sich daher nicht.
Ein weiteres Beispiel betrifft die Entkoffeinierung von Kaffeebohnen. Bei diesen Aufbereitungsverfahren werden die ungerösteten, grünen Kaffeebohnen bedampft und/oder in z.T. heißem Wasser eingeweicht, um das Koffein aus den Bohnen zu extrahieren. Mit Hilfe der erfindungsgemäß eingesetzten Amidohydrolase wird es ermöglicht, derartige Entkoffeinierungsschritte, die üblicherweise bei Temperaturen über 37°C ablaufen, mit einer gleichzeitigen Asparaginasebehandlung zu kombinieren, d.h. der Aufbereitungsprozess von entkoffeiniertem Kaffee als solcher wird weniger zeitaufwändig und in der Folge kostengünstiger. Herkömmliche Verfahren zur Entkoffeinierung von Kaffeebohnen sind dem Fachmann bekannt und umfassen unter anderem das "Schweizer Wasserverfahren", die "direkte Methode", die "indirekte Methode" oder das "Triglyceridverfahren". In diesem Zusammenhang kann beispielsweise vollumfänglich verwiesen werden auf R. Heiss, Lebensmitteltechnologie: Biotechnologische, chemische, mechanische und thermische Verfahren der Lebensmittelverarbeitung, Springer; 6. Auflage, 2003.
Überraschenderweise kann die erfindungsgemäße Amidohydrolase auch besonders vorteilhaft bei einem Bedampfen/Befeuchten von Kaffeebohnen eingesetzt werden. Ein derartiges Bedampfen/Befeuchten dient, wie bereits vorstehend ausgeführt, zum Öffnen der Poren der Kaffeebohnen, um anschließend leichter das in den Bohnen vorhandene Asparagin zu inaktivieren/reduzieren. Ein Bedampfen/Befeuchten erfolgt üblicherweise bei erhöhten Temperaturen, d.h. bei Temperaturen bis vorzugsweise höchstens 1000C, da sowohl die Löslichkeit von Asparagin in warmen Lösungsmitteln erhöht ist, als sich auch die Poren der Kaffeebohnen bei warmen Temperaturen rascher öffnen. Mit Hilfe der erfindungsgemäßen, thermostabilen Amidohydrolase kann eine Reduktion von Asparagin einerseits gleichzeitig während des Bedamp- fens/Befeuchtens erfolgen, andererseits kann die Asparaginreduktion aufgrund der hohen Temperaturverträglichkeit des Enzyms schneller und effizienter ablaufen.
Die erfindungsgemäße Amidohydrolase kann auch bei der Herstellung von Frischbackwaren wie Brot, Brötchen oder dergleichen eingesetzt werden. Diese Frischbackwaren werden häufig mit Hilfe von Kochextrusions-Verfahren hergestellt, welche üblicherweise bei Temperaturen zwischen 95 und 1050C ablaufen. Durch die thermostabilen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Amidohydrolase kann das Enzym während der Kochextrusion zugegeben werden und so eine Reduktion des Aspara- gingehalts bewirken. Für die Asparaginreduktion förderlich ist im Falle der Kochextrusion sowohl das Kneten des Teigs als auch die Entstehung von Gasblasen, welche durch das Entweichen von Kohlensäure aus dem erhitzten Wasser entstehen. Durch den anschließenden Back- bzw. Röstprozess, der üblicherweise in einem Temperaturbereich von 200 bis 6000C abläuft, wird die erfindungsgemäße Amidohydrolase inaktiviert bzw. denaturiert.
In vielen Behandlungsschritten von Nahrungs- und Genussmitteln spielen Inkubation in wässriger Umgebung bei hohen Temperaturen zwischen 70 und 1100C eine Rolle, die der thermischen Nachbehandlung, die zur Acrylamid-Bildung führt, vorgeschaltet sind. Hierzu zählen beispielweise Kochschritte. Wässrige Behandlungen in dem obigen Temperaturbereich werden zum Beispiel bei der Produktion von geformten Pommes frites oder von geformten Kartoffelchips eingesetzt. Der unerwartete Vorteil der erfindungsgemäßen Asparaginase liegt darin, dass das Enzym direkt in diesen Prozessen eingesetzt werden kann und bei den hohen Temperaturen sehr hohe Reaktionsgeschwindigkeiten erzielt, die mit sehr geringen Enzymmengen sehr hohe Wirksamkeiten ermöglichen.
Auch in Getreide-verarbeitenden Prozessen kann die erfindungsgemäße Amidohydrolase vorteilhaft eingesetzt werden. Bei der Herstellung von Com Flakes wird Maisgrits im Gemisch mit Zucker, Salz und Malz gekocht und im Anschluss weiterverarbeitet und geröstet. Das Rösten verursacht die ungewollte Bildung des Acryl- amids. Beim Kochen werden Temperaturen zwischen 70 und 1000C durchlaufen, die für einen Einsatz der erfindungsgemäßen Amidohydrolase sehr gut geeignet sind, so dass die Acrylamid-Bildung unterdrückt werden kann.
Bei Getreide-verarbeitenden Prozessen spielen Extrusions-Prozesse sehr häufig eine Rolle. Zum Beispiel werden bei der Produktion von Frühstücks-Cerealien Extrusions-Prozesse bei 80-1000C Endtemperatur durchgeführt. Auch sind Prozesse beschrieben, bei denen Halteprozesse bei hohen Temperaturen zwischen 70 und 100°C eine Rolle spielen.
Produkte, die bei hohen Temperaturen prozessiert werden und die Roggen enthalten, weisen in der Regel sehr hohe Acrylamid-Gehalte auf (zum Beispiel Knäckebrot). Bei dem Herstellen von Knäckebrot werden im Backprozess sehr schnell hohe Temperaturen erreicht. Das Knäckebrot kann vor dem Backprozess mit einer Lösung der erfindungsgemäßen Amidohydrolase behandelt werden, um die Acrylamid- Bildung beim Backprozess zu reduzieren. Ein weiterer, unerwarteter Vorteil der erfindungsgemäß eingesetzten, thermostabilen Amidohydrolase ist die Möglichkeit einer Wiederverwendung (Rezyklieren) des Enzyms. So kann die Amidohydrolase, welche durch ihre thermostabilen Eigenschaften auch bei erhöhten Temperaturen, d.h. bis zu vorzugsweise 1000C nicht denaturiert, nach deren Einsatz extrahiert oder auf anderem Wege abgetrennt und damit zur erneuten Anwendung eingesetzt werden. Eine derart rezyklisierte Amidohydrolase- lösung kann mehrere, d.h. vorzugsweise wenigstens 1 , 2, 3, 4 oder 5 Zyklen zur Reduktion von Asparagin durchlaufen.
Die Anwendung der erfindungsgemäß eingesetzten Amidohydrolasen ist vorzugsweise gesundheitlich unbedenklich, da es sich bei diesen Amidohydrolasen um natürliche, nicht-toxische Substanzen handelt.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufbereitung eines Nahrungsmittels oder eines Genussmittels umfassend die Schritte:
(i) Inkubieren des Nahrungsmittels oder des Genussmittels mit einer, wie vorstehend definierten Amidohydrolase bei einer Inkubationstemperatur von vorzugsweise wenigstens 500C, bevorzugter wenigstens 6O0C, noch bevorzugter wenigstens 7O0C, noch bevorzugter wenigstens 8O0C, am bevorzugtesten wenigstens 9O0C und insbesondere wenigstens 990C; und
(iii) ggf. Erwärmen des Nahrungsmittels oder des Genussmittels auf eine Temperatur, welche vorzugsweise wenigstens 100C, bevorzugter wenigstens 150C, noch bevorzugter wenigstens 2O0C, am bevorzugtesten wenigstens 5O0C und insbesondere wenigstens 6O0C oberhalb der Inkubationstemperatur liegt.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren zur Aufbereitung eines Nahrungsmittels oder eines Genussmittels die Schritte:
(i) Inkubieren des Nahrungsmittels oder des Genussmittels mit einer, wie vorstehend definierten Amidohydrolase bei einer Inkubationstemperatur von vorzugsweise wenigstens 50°C, bevorzugter wenigstens 6O0C, noch bevorzugter wenigstens 7O0C, noch bevorzugter wenigstens 8O0C, am bevorzugtesten wenigstens 9O0C und insbesondere wenigstens 990C; (N) Abtrennen der Amidohydrolase von dem Nahrungsmittel oder dem Genussmittel oder Inaktivieren der Amidohydrolase;
(iii) ggf. Erwärmen des Nahrungsmittels oder des Genussmittels auf eine Temperatur, welche vorzugsweise wenigstens 10°C, bevorzugter wenigstens 150C, noch bevorzugter wenigstens 2O0C1 am bevorzugtesten wenigstens 5O0C und insbesondere wenigstens 6O0C oberhalb der Inkubationstemperatur liegt; und
(iv) ggf. Wiedereinsetzen der ggf. in Schritt (ii) abgetrennten Amidohydrolase in Schritt (i).
Schritt (i) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird vorzugsweise unter Bedingungen durchgeführt (Zeit, Temperatur, pH-Wert, Menge an Amidohydrolase, etc.), dass die ursprünglich in dem Nahrungs- oder Genussmittel enthaltene Menge an (freiem) Asparagin um wenigstens 50%, bevorzugter wenigstens 75%, noch bevorzugter wenigstens 80%, noch bevorzugter wenigstens 85%, am bevorzugtesten wenigstens 90% und insbesondere wenigstens 95% vermindert wird. Geeignete Bedingungen kann ein Fachmann durch übliche Routineversuche auffinden.
Schritt (i) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird vorzugsweise unter Bedingungen durchgeführt (Zeit, Temperatur, pH-Wert, Menge an Amidohydrolase, etc.), dass die in der gegebenenfalls folgenden thermischen Nachbehandlung gebildete Acrylamid- Menge um wenigstens 20%, bevorzugt 30% noch bevorzugter um wenigstens 40% und am bevorzugtesten um wenigstens 50% reduziert wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird Schritt (i) des erfindungsgemäßen Verfahrens vorzugsweise unter Bedingungen durchgeführt (Zeit, Temperatur, pH- Wert, Menge an Amidohydrolase, etc.), dass nach Durchführung von Schritt (iii) die in dem Nahrungs- oder Genussmittel enthaltene Menge an Acrylamid höchstens 200 ppm, bevorzugter höchstens 150 ppm, noch bevorzugter höchstens 135 ppm, am bevorzugtesten höchstens 100 ppm und insbesondere höchstens 50 ppm beträgt. Geeignete Bedingungen kann ein Fachmann durch übliche Routineversuche auffinden. In einer ebenfalls bevorzugten Ausfϋhrungsform wird Schritt (i) des erfindungsgemäßen Verfahrens vorzugsweise unter Bedingungen durchgeführt (Zeit, Temperatur, pH-Wert, Menge an Amidohydrolase, etc.), dass nach Durchführung von Schritt (iii) die in dem Nahrungs- oder Genussmittel enthaltene Menge an Acrylamid höchstens 1.000 μg/kg, bevorzugter höchstens 500 μg/kg, noch bevorzugter höchstens 300 μg/kg, am bevorzugtesten höchstens 150 μg/kg und insbesondere höchstens 50 μg/kg beträgt. Geeignete Bedingungen kann ein Fachmann durch übliche Routineversuche auffinden.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Durchführung von Schritt (i) für wenigstens 240 min, bevorzugter wenigstens 120 min, noch bevorzugter wenigstens 60 min, am bevorzugtesten wenigstens 20 min und insbesondere wenigstens 5 min.
In einer bevorzugten Ausführungsform liegt das Gewichtsverhältnis von Nahrungsoder Genussmittel zu Amidohydrolase im Bereich von 102 : 1 bis 1010 : 1 , bevorzugter von 102 : 1 bis 108 : 1 , noch bevorzugter von 104 : 1 bis 108 : 1 , am bevorzugtesten von 104 : 1 bis 107 : 1 und insbesondere von 105 : 1 bis 107 : 1.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Amidohydrolase in einer wässrigen Lösung bereitgestellt und mit dem Nahrungs- oder Genussmittel zusammengebracht, beispielsweise durch Aufsprühen. Dabei beträgt die Konzentration der Amidohydrolase in der wässrigen Lösung bevorzugt 10"6 bis 100 g/l bevorzugter 10"5 bis 10 g/l, noch bevorzugter 10"4 bis 1 g/l, am bevorzugtesten 10~3 bis 10"1 g/l und insbesondere 10-2 bis 5 χ 10"2 g/l.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Nahrungsmittel oder Genussmittel, welches durch das vorstehend beschriebene Verfahren erhältlich ist. Das Nahrungsmittel oder Genussmittel weist vorzugsweise einen Restgehalt von höchstens 200 ppm, bevorzugter höchstens 150 ppm, noch bevorzugter höchstens 135 ppm, am bevorzugtesten höchstens 100 ppm und insbesondere höchstens 50 ppm an Aspa- ragin und/oder Acrylamid auf.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Nahrungsmittel oder Genussmittel, welches durch das vorstehend beschriebene Verfahren erhältlich ist. Das Nahrungs- mittel oder Genussmittel weist vorzugsweise einen Restgehalt von höchstens 400 μg/kg, bevorzugter höchstens 300 μg/kg, noch bevorzugter höchstens 200 μg/kg, am bevorzugtesten höchstens 100 μg/kg und insbesondere höchstens 50 μg/kg an Asparagin und/oder Acrylamid auf.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft einen Vektor, welcher eine Nukleotidse- quenz, wie vorstehend definiert, enthält. Vorzugsweise ist ein derartiger Vektor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Plasmiden, Cosmiden, Phagemiden, Pha- gen-Vektoren, Bacterial Artificial Chromosomes und Yeast Artificial Chromosomes.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer Amido- hydrolase wie vorstehend definiert, das folgende Schritte umfasst:
a) Einbringen eines Vektors, wie vorstehend definiert, in ein Expressionssystem; b) ggf. Exprimieren der Amidohydrolase in dem Expressionssystem; c) ggf. Aufschließen oder Lysieren oder Abtrennung des Expressionssystems; d) ggf. Zugeben einer geeigneten, ggf. thermostabilen Nuclease zur Hydrolyse der Nucleinsäuren des Expressionssystems; e) ggf. Denaturieren des Expressionssystems durch eine Inkubation bei vorzugsweise 6O0C, bevorzugter 7O0C, noch bevorzugter 8O0C1 am bevorzugtesten 9O0C und insbesondere 1000C für die Dauer von vorzugsweise 1 min, bevorzugter 5 min, noch bevorzugter 10 min, am bevorzugtesten 20 min und insbesondere 60 min; f) ggf. Abtrennen unerwünschter Bestandteile des Expressionssystems durch Zentrifugation, Filtration, Mikrofiltration oder Ultrafiltration; g) ggf. Binden der Amidohydrolase an einen festen Träger, wobei die Bindung über ionische, hydrophobe oder Affinitäts-Tag vermittelte Wechselwirkungen erfolgt; h) ggf. Waschen des Trägers zur Entfernung unerwünschter Bestandteile unter Bedingungen, bei denen die Amidohydrolase im wesentlichen am Träger gebunden bleibt; i) ggf. Eluieren der Amidohydrolase vom Träger durch geeignete Pufferbedingungen; k) ggf. Konzentrieren der Amidohydrolase-Lösung durch Fällung, Ultrafiltration, Gefriertrocknung oder Trocknung; und
I) ggf. Überführen der Amidohydrolase in einen geeigneten Lagerungspuffer. Natürliche Asparaginasen können intrazellulär und extrazellulär lokalisiert werden. Will man Asparaginasen intrazellulär in großen Mengen überexprimieren, so ist man mit dem Problem konfrontiert, dass hohe Asparaginase-Konzentrationen in der Zelle einen toxischen Effekt ausüben, da sie die für die Zelle essentielle Aminosäure Asparagin hydrolysieren. Es wurde überraschend gefunden, dass die erfindungsgemäße Amidohydrolase in dem Temperaturbereich von 20-370C, in dem üblicherweise die Fermentationsprozesse mesophiler Organismen wie zum Beispiel Escherichia coli, Pseudomonas sp., Bacillus sp., Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae oder Aspergillus sp. durchgeführt werden, nur noch eine sehr geringe Rest-Aktivität aufweist. So hat das Enzym bei 25°C eine Restaktivität von < 2%. Dies ermöglicht die intrazelluläre Expression des erfindungsgemäßen Asparaginase in mesophilen Expressionswirten in großen Mengen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung umfasst ein Verfahren zur Herstellung einer Amidohydrolase wie vorstehend definiert, bei dem die Amidohydrolase intrazellulär in einem Mikroorganismus exprimiert wird, wobei die Restaktivität des Enzyms bei der Kultivierungs-Temperatur während der Expression der Amidohydrolase < 30% ist, bevorzugt < 15%, noch bevorzugter < 10%, noch bevorzugter < 5%, am bevorzugtesten < 2%.
Dem Fachmann zugängliche Fermentationsprotokolle für Mikroorganismen erlauben Ausbeuten an Biofeuchtmasse von bevorzugt >100 g/l, noch bevorzugter >125 g/l, noch bevorzugter >150 g/l , noch bevorzugter >175 g/l und am bevorzugtesten >200 g/l.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird bei der intrazellulären Expression der Amidohydrolase in einem Mikroorganismus eine Aktivitätsausbeute von >10 kU / g Biofeuchtmasse, bevorzugter >20 kU / g Biofeuchtmasse, bevorzugter >40 kU / g Biofeuchtmasse, bevorzugter >60 kU / g Biofeuchtmasse, am bevorzugtesten >80 kU / g Biofeuchtmasse erreicht.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird bei der intrazellulären Expression der Amidohydrolase in einem Mikroorganismus eine Aktivitätsausbeute von > 100.000 Units pro Liter Kulturvolumen, bevorzugt > 500.000 Units pro Liter, noch bevorzugter
> 1 Mio. Units pro Liter, noch bevorzugter > 3 Mio. Units pro Liter, noch bevorzugter
> 6 Mio. Units pro Liter und am bevorzugtesten > 10 Mio. Units pro Liter erreicht.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Expression der erfindungsgemäßen intrazellulär in einem mesophilen Expressionswirt wie zum Beispiel Escherichia coli, Pseudomonas sp., Bacillus sp., Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae oder Aspergillus sp.
Die nachfolgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der Erfindung, sind jedoch nicht einschränkend auszulegen.
Beispiele
Beispiel 1 - Expression einer thermostabilen Asparaqinase
Mit den beiden Primern PF_Asnl_S (5'- ACCTGCGGTCTCGCATGAAAATTCTTC- TAATTGGGATGGG-3'; <SEQ ID NO: 3>) und PF_Asnl_A (5'- GGATCCCTGCA- GTTAATCTCTAAGCTCTCCAACTAG-3'; <SEQ ID NO: 4>) (beide Thermo Electron, Ulm) wurde das für die Asparaginase I aus Pyrococcus furiosus kodierende Gen (<SEQ ID NO: 1>) durch eine PCR aus Pyrococcus furiosus DSM 3638-DNA unter den nachfolgenden Bedingungen amplifiziert.
1.1 PCR-Bedinαunαen:
PCR-Ansatz:
Figure imgf000024_0001
Temperaturprofil der PCR:
2 min / 94 0C
1. 45 sec / 94 0C (Denaturierung) "1
2. 45 sec / 57 0C (Anlagerung) > 25 x
3. 60 sec / 72 0C (Elongation) J
2 min / 72 0C
Das resultierende PCR-Produkt wurde über das QIAquick PCR-Reinigungs-Kit (Qiagen, Hilden) nach Herstellervorschrift aufgereinigt.
1.2 Restriktionsverdau:
Das unter Punkt 1.1 erhaltene Gen wurde in den Expressionsvektor pRSF-1 b <SEQ ID NO: 5> kloniert (Vektor pRSF-1 b, Novagen-Merck-Biosciences, Bad Soden).
Dazu wurde das PCR-Produkt mittels der Restriktionsendonucleasen Eco31l und Pstl und der Vektor pRSF-1 b <SEQ ID NO: 5> mittels der Restriktionsendonucleasen Ncol und Pstl (alle Fermentas, Vilnius, Litauen) wie nachstehend aufgeführt verdaut:
1.3 Restriktionsverdau-Ansätze:
PCR-Produkt Vektor
2 μg PCR-Produkt 4 μg pRSF-1 b <SEQ ID NO: 5>
3 μl 1Ox Puffer G+ (Fermentas) 4 μl 1Ox Puffer Y+ (Fermentas) 10 U Eco31l 10 U Ncol
20 U Pstl 20 U Pstl ad 30 μl H2O dest. ad 40 μl H2O dest.
Die Restriktionsverdau-Ansätze wurden 2 Stunden bei 37 0C inkubiert. Zu dem „Vektor-Ansatz" wurde anschließend zur Dephosphorylierung 1 U SAP {Shrimp Alkaline Phosphatase, Fermentas, Vilnius, Litauen) hinzu gegeben und für weitere 30 min bei 37 0C inkubiert. Anschließend wurden die Enzyme für 20 min bei 80 0C inaktiviert. Daraufhin wurden die Produkte mittels des QIAquick PCR-Reinigungs-Kit (Qiagen, Hilden) aufgereinigt.
1.4 Liqation. Transformation in E. coli und Plasmid-Reisolation
Die Vektor-DNA und das PCR-Produkt (vgl. Punkt 1.3) wurden durch die Inkubation mit T4-DNA-Ligase wie nachstehend ausgeführt miteinander verbunden:
Ligase-Ansatz:
Figure imgf000026_0001
Die Ansätze wurden 8 h bei 16 0C inkubiert und anschließend wurde das Enzym durch 10-minütige Inkubation bei 65 0C inaktiviert. 1 μl dieses Ansatzes wurde direkt zur Transformation kommerziell erhältlicher kompetenter XUBIue-Zellen (Stratagene, La JoIIa, USA) mittels Elektroporation eingesetzt. Die elektroporierten Zellen wurden auf Festagar-Platten mit Kanamycin ausplattiert und über Nacht bei 37°C kultiviert. Ausgehend von einer resultierenden Einzelkolonie wurde das fertige Plasmid mittels des Plasmid-Reinigungskits QIAprep Minipräparations-Kit (Qiagen, Hilden) nach Herstellervorschrift reisoliert und das Expressions-Plasmid pRSF Pf- Asnl <SEQ ID NO: 6> erhalten.
Das Expressions-Plasmid pRSF_Pf-Asnl <SEQ ID NO: 6> wurde mittels Elektroporation in Rosetta 2 (DE3) (Novagen-Merck-Biosciences, Bad Soden) Zellen eingebracht und die Zellen auf LB-Agar-Platten (10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 10 g NaCI, ad 1 I Aqua dest.) mit Kanamycin (Kan) und Chloramphenicol (Cam) ausplattiert.
Von diesen Platten wurden Einzelklone gepickt und zunächst Vorkulturen für die Expression hergestellt. Dazu wurden 100 ml LB (Kan, Cam)-Medium mit 1 % (w/v) Glucose mit 1 ml einer 5 ml Vorkultur angeimpft und bis zum Erreichen einer ODβoo von 0,6 bei 37 0C und 200 Upm (Umdrehungen pro Minute) geschüttelt. Die Zellen wurden abzentrifugiert (4 0C, 15 min, 3200*g) und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde in 2 ml 10% (v/v) Glycerol resuspendiert. Die Suspension wurde zu je 200 μl aliquotiert, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 0C gelagert.
Die Hauptkultur für die Expression bestand aus 500 ml LB (Kan, Cam)-Medium mit 1% (w/v) Glucose. Sie wurde mit einem Aliquot der Vorkultur angeimpft. Die Hauptkultur wurde bei 37°C und 200 Upm inkubiert. Nach Erreichen einer ODβoo von 0,9 wurde mit 1 mM IPTG (Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid) induziert und über Nacht bei 30 0C und 200 Upm geschüttelt. Am nächsten Tag wurden die Zellen durch Zentrifugation (4 0C, 15 min, 3200χg) sedimentiert und nach Entfernung des Mediums wurde das Pellet gewogen und mit 20 ml Lysepuffer (10 mM Tris/HCI pH 8,0, 0,5 mg/ml Lysozym) resuspendiert und mit Ultraschall aufgeschlossen (5χ30 s, 80% Leistung). Die Suspension der aufgeschlossenen Zellen wurde zentrifugiert (4 0C, 30 min, 14000χg). Der Überstand wurde anschließend einer Inkubation für 30 min bei 800C unterzogen und einer erneuten Zentrifugation unterworfen (4 0C, 30 min, 14000χg). Das Pellet wurde verworfen und der so gewonnene Rohextrakt wurde abgenommen und für weitere Untersuchungen bei 4 °C gelagert. Von dem Überstand wurde die Aktivitätsausbeute mit 160 kU bestimmt (vgl. Beispiel 2). Aus dem Gewicht des Zellpellets von 4 g ergabt sich eine Ausbeute von 40 kU pro g Biofeuchtmasse.
Beispiel 2 - Bestimmung des Temperaturprofiles
Assay Prinzip
Asparaginasen katalysieren die Umwandlung von Asparagin in Aspartat unter der Freisetzung von Ammonium-Ionen. Diese können über Farbreagenzien, wie beispielsweise das Nessler-Reagens nachgewiesen. Alternativ können Ammonium- Ionen auch über die Berthelot-Reaktion (DIN 38 406 E5) nachgewiesen werden. Der Assay mit Nessler-Reagens beruht auf einer Endpunkt-Bestimmung. Die Reaktion wird dabei über einen Zeitraum von 30 min bei der entsprechenden Temperatur inkubiert, abgestoppt und die entstandenen Ammonium-Ionen detektiert.
Reagenzien und Lösungen Reagenzien:
L-Asparagin Monohydrat: Applichem A3669, MW 150,14 g/mol
Ammoniumsulfat: Merck, 1.101211 , MW 132,14 g/mol
Nessler-Reagens: Fluka, 72190
Tris, TCA
Stammlösungen und Puffer: 50 mM Tris/HCI pH 8,6 172 mM L-Asparagin-Lösung 1 ,5 M TCA (Trichloressigsäure)
Eichlösungen:
5 mM (NH4)2SO4-Lösung
2.1 Erstellung einer Eichkurve
Hierzu wurden folgende Ansätze gemacht:
Figure imgf000028_0001
Die Ansätze wurden gemischt und jeweils 5 μl 1 ,5 M TCA zugegeben und erneut gemischt.
Es wurde für jeden Wert 860 μl dest. H2O in einem 1 ,5 ml Reaktionsgefäß vorgelegt und 40 μl des jeweiligen Ansatzes zugegeben und gemischt. Zu jedem Ansatz wurden zügig 100 μl Nessler-Reagens gegeben und die Proben kurz gemischt. Nach 5 min wurde das Photometer bei 436 nm gegen Wasser abgeglichen und die Proben zügig vermessen. Die Werte wurden in eine Eichgerade eingetragen (vgl. Figur 1 ).
2.2 Probenmessunα Mittels eines kommerziellen Protein-Bestimmungstest (Bradfort, Bio-Rad Laboratories GmbH, München) wurde die Protein-Konzentration des Rohextraktes aus Ausführungsbeispiel 1 mit ca. 4 mg/ml bestimmt. Die Asparaginase-Lösung wurde 1 :2000 in 50 mM Tris/HCI pH 8,6 verdünnt. Für jede zu messende Probe wurde folgender Ansatz vorgelegt:
Figure imgf000029_0001
Die Ansätze wurden gemischt und ein Thermocycler auf die gewünschte Temperatur (37, 70, 80, 90 und 99 0C) vorgeheizt.
Zu den Ansätzen wurden 5 μl der verdünnten Enzymprobe und zum Leerwert 5 μl Puffer gegeben, die Ansätze kurz gemischt und dann für 30 min bei der jeweiligen Reaktionstemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Reaktionen auf Eis abgekühlt und durch Zugabe von 5 μl 1,5 M TCA-Lösung gestoppt.
Die Bestimmung der freigesetzten Ammonium-Ionen erfolgte sofort im Anschluss. Es wurde für jeden Wert 860 μl dest. H2O in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß vorgelegt und 40 μl des jeweiligen Ansatzes zugegeben und gemischt. Zu jedem Ansatz wurden zügig 100 μl Nessler-Reagens gegeben und die Proben kurz gemischt. Nach 5 min wurde das Photometer bei 436 nm gegen Wasser abgeglichen und die Proben zügig vermessen.
Zuerst wurde der ermittelte Absorptionswert in freigesetzte Ammonium-Ionen anhand der Eichkurve (vgl. Figur 1 ) umgerechnet. Anschließend wurde über die Definition der Unit (eine Unit Asparaginase setzt 1 μmol NH4 pro min unter Assay-Bedingungen frei) die volumetrische Aktivität [U/ml] des Enzyms berechnet. Derartige Berechnungen sind dem Fachmann allgemein bekannt.
2.3 Bestimmung des Temperatur-Optimums
Für die verschiedenen Temperaturen wurde der Gehalt an NH4 bei einer Wellenlänge von 436 nm gemessen und die daraus resultierenden volumetrischen (Enzym-) Aktivitäten ermittelt. Die volumetrische Aktivität bei 90 0C wurde 100% gesetzt (=Referenzwert) und die jeweiligen volumetrischen Aktivitäten bei den anderen Temperaturen entsprechend auf diesen Referenzwert bezogen (= relative Aktivität). Die entsprechenden Werte sind in der nachfolgenden Tabelle, sowie grafisch in Figur 2 zusammengefasst:
Messwert Units pro Relative P' 436 nm ml Aktivität
37°C 0,018 320 9%
700C 0,126 2140 58%
800C 0,205 3460 94%
90°C 0,218 3670 100%
99°C 0,2 3370 92%
Beispiel 3 - Bestimmung des Temperaturstabilität
Reagenzien und Lösungen, die Bestimmung der Eichkurve sowie die Durchführung der Aktivitätstests erfolgten wie vorstehend in Ausführungsbeispiel 2 beschrieben.
3.1 Temperaturstabilität bei 95°C
Die Bestimmung der volumetrischen (Enzym-)Aktivität erfolgte hierbei immer bei einer Inkubationstemperatur von 900C. Für die Bestimmung der Temperaturstabilität wurde die Asparaginase-Lösung aus Ausführungsbeispiel 1 1 :10 in 50 mM Tris/HCI pH 8,6 verdünnt und anschließend für verschiedene Zeitintervalle bei 95°C (0, 1 , 15, 30, 45 und 60 min) vorinkubiert. Anschließend erfolgte eine weitere Verdünnung von 1 :100 in 50 mM Tris/HCI pH 8,6 und die Bestimmung der verbliebenen Restaktivität. Die volumetrische enzymatische Aktivität ohne Vorinkubation bei 95°C wurde 100% gesetzt (=Referenzwert) und alle anderen Werte auf diesen Referenzwert bezogen (=relative Aktivität). Die dabei erhaltenen/errechneten Werte sind in der nachfolgenden Tabelle (vgl. auch Figur 3) zusammengefasst:
Zeit in Messwert bei Units pro Relative min 436 nm mj Aktivität
0 0,398 3340 100% 1 0,466 3900 117%'
15 0,403 3380 101 %*
30 0,464 3890 116%'
45 0,464 3890 116%*
60 0,418 3500 105%* relative Aktivität = Restaktivität
3.2 Temperaturstabilität bei 99°C
Der Versuch zur Bestimmung der Temperaturstabilität bei 99°C wurde analog zu dem vorstehend in Punkt 3.1 beschriebenen Versuch durchgeführt. Die hierbei erhaltenen/errechneten Werte sind in der nachstehenden Tabelle (vgl. auch Figur 4) zusammengefasst:
Zeit in Messwert bei Units pro Relative min 436 nm ml Aktivität
0 0,411 3440 100%
1 0,416 3490 101 %*
15 0,396 3320 97%*
30 0,276 2320 67%*
45 0,329 2790 81%*
60 0,294 2470 72%* relative Aktivität = Restaktivität
Beispiel 4 - Reduktion des Acrylamidqehaltes in Kaffeebohnen
Zum Nachweis der Wirksamkeit der Behandlung von Lebensmitteln mit der erfindungsgemäßen Asparaginase wurden Rohkaffeebohnen vor der Röstung einem Behandlungsschritt mit dem Enzym bei 80 0C unterzogen und die Reduktion des Acrylamidgehaltes nach der Röstung bestimmt.
Hierzu wurden folgende Versuchsansätze erstellt:
Blank 1 : 500 g Rohkaffeebohnen Sorte Arabica-Mischung + 267 g 100 mM TRIS/HCI pH 8,6 (25 0C) Blank 2: 500 g Rohkaffeebohnen Sorte Brazil Arabica + 267 g 100 mM TRIS/HCI pH 8,6 (25 0C)
Probe 1 : 500 g Rohkaffeebohnen Sorte Arabica-Mischung + 267 g 100 mM TRIS/HCI pH 8,6 (25 0C) + 1400 Units Asparaginase aus Ausführungsbeispiel 1
Probe 2: 500 g Rohkaffeebohnen Sorte Brazil Arabica + 267 g 100 mM TRIS/HCI pH 8,6 (25 0C) + 1400 Units Asparaginase aus Ausführungsbeispiel 1
Die Blanks und Proben wurden 60 min bei 80 0C unter Rotation inkubiert. Anschließend wurde die Flüssigkeit von den Kaffeebohnen abfiltriert, die Bohnen getrocknet und geröstet.
Die Ermittlung des Acrylamidgehaltes erfolgte durch ein unabhängiges akkreditiertes Prüflabor. Die Ergebnisse der Untersuchungen zeigt nachfolgende Tabelle (vgl. auch Figur 4):
Acrylamidgehalt Mittelabweichung Rest- in μg/kg in μg/kg gehalt
Blank 1 480 20 100% Probe 1 222 19 46%
Blank 2 585 35 100% Probe 2 273 18 47%

Claims

Patentansprüche:
1. Verwendung einer Amidohydrolase, welche nach einer Inkubationsdauer von 5 min bei 500C eine Restaktivität von wenigstens 75% aufweist, zur Aufbereitung eines Nahrungsmittels oder eines Genussmittels.
2. Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Amidohydrolase ein Temperatur-Optimum im Bereich von 70 bis 1200C aufweist.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Amidohydrolase bei einer Temperatur im Bereich von 60 bis 1200C eine spezifische Aktivität von wenigstens 200 Units/mg aufweist.
4. Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Amidohydrolase ein pH-Optimum im Bereich von pH 1 bis pH 14 aufweist.
5. Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Amidohydrolase nach Lagerung bei 4°C über einen Zeitraum von 1 Monat eine Restaktivität von wenigstens 80% aufweist.
6. Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Amidohydrolase über den pH-Bereich von pH 5 - pH 10 eine Aktivität von mindestens 10% im Vergleich zu maximalen Aktivität aufweist.
7. Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Amidohydrolase eine Asparaginase ist.
8. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Asparaginase "Asparaginase I" aus Pyrococcus furiosus ist.
9. Verwendung nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Aspa- raginase durch eine Nukleotidsequenz kodiert ist, welche wenigstens 60% homolog zur Nukleotidsequenz <SEQ ID NO: 1> ist.
10. Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Asparaginase durch die Nukleotidsequenz <SEQ ID NO: 1 > kodiert ist.
11. Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz der Asparaginase eine Homologie von wenigstens 50% zur Aminosäuresequenz <SEQ ID NO: 2> aufweist.
12. Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass die Asparaginase die Aminosäuresequenz <SEQ ID NO: 2> umfasst.
13. Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Aufbereitung des Nahrungsmittels oder des Genussmittels zur Hydrolyse von Asparagin zu Asparaginsäure dient.
14. Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Aufbereitung des Nahrungsmittels oder des Genussmittels der Verringerung des Gehalts an Asparagin und/oder Acrylamid in dem Nahrungsmittel oder dem Genussmittel dient.
15. Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Verringerung des Gehalts an Asparagin erfolgt, damit das Nahrungsmittel oder das Genussmittel bei einer thermischen Nachbehandlung einen verringerten Gehalt an Acrylamid aufweist.
16. Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Nahrungsmittel und/oder Genussmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Knäckebrot, Zwieback, Keksen, Brezeln, Toastbrot, Waffeln, Muffins, Beagles, Croissants, Brownies, Frühstückscerealien, Biskuites, Kartoffelchips, Tortillachips, Maischips, Crackern, Pommes frites, Reiswaffeln, Polenta, Couscous, Pfannkuchen, Nüssen, Fertigmischungen Kuchenmischungen, Biscuitmischungen, Brotmischungen, Croutons, Hundefutter, Katzenfutter, Kaffeebohnen und Kakaobohnen.
17. Verwendung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Aufbereitung eine Entkoffeinierung und/oder ein Waschen von Kaffeebohnen umfasst.
18. Verfahren zur Aufbereitung eines Nahrungsmittels oder eines Genussmittels umfassend die Schritte:
(i) Inkubieren des Nahrungsmittels oder des Genussmittels mit einer Amido- hydrolase definiert wie in einem der Ansprüche 1 bis 10 bei einer Inkubationstemperatur von wenigstens 500C; und
(iii) ggf. Erwärmen des Nahrungsmittels oder des Genussmittels auf eine
Temperatur, welche wenigstens 1O0C oberhalb der Inkubationstemperatur liegt.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass es die Schritte umfasst:
(ii) Abtrennen der Amidohydrolase von dem Nahrungsmittel oder dem Genussmittel oder Inaktivieren der Amidohydrolase; und
(iv) ggf. Wiedereinsetzen der in Schritt (ii) abgetrennten Amidohydrolase in Schritt (i).
20. Nahrungsmittel oder Genussmittel erhältlich durch das Verfahren nach Anspruch 18.
21. Nahrungsmittel oder Genussmittel nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Restgehalt von höchstens 200 ppm an Asparagin und/oder Ac- rylamid aufweist.
22. Nahrungsmittel oder Genussmittel nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Restgehalt von höchstens 400 μg/kg an Acrylamid aufweist.
23. Vektor enthaltend eine Nukleotidsequenz definiert wie in Anspruch 9 oder 10.
24. Vektor nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass er ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Plasmiden, Cosmiden, Phagemiden, Phagen-Vekto- ren, Bacterial Artificial Chromosomes und Yeast Artificial Chromosomes.
25. Verfahren zur Herstellung einer Amidohydrolase definiert wie in einem der Ansprüche 1 bis 12, umfassend die Schritte
a) Einbringen eines Vektors, definiert wie in Anspruch 23 oder 24, in ein Expressionssystem; b) ggf. Exprimieren der Amidohydrolase in dem Expressionssystem; und c) ggf. Aufschließen oder Lysieren oder Abtrennung des Expressionssystems.
26. Verfahren zur Herstellung einer Amidohydrolase definiert wie in einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Amidohydrolase in einem Mikroorganismus intrazellulär exprimiert wird und die Restaktivität der Amidohydrolase bei der Kultivierungs-Temperatur während der Expression der Amidohydrolase <30% ist.
27. Verfahren zur Herstellung einer Amidohydrolase definiert wie in einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Amidohydrolase in einem Mikroorganismus intrazellulär exprimiert wird und eine Aktivitätsausbeute von > 100.000 Units pro Liter Kulturvolumen erreicht wird.
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