WO2008132412A2 - Méthode de décontamination d'une solution des acides nucléiques indésirables - Google Patents

Méthode de décontamination d'une solution des acides nucléiques indésirables Download PDF

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WO2008132412A2
WO2008132412A2 PCT/FR2008/050540 FR2008050540W WO2008132412A2 WO 2008132412 A2 WO2008132412 A2 WO 2008132412A2 FR 2008050540 W FR2008050540 W FR 2008050540W WO 2008132412 A2 WO2008132412 A2 WO 2008132412A2
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solution
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fragmentation
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Glaucia Paranhos-Baccala
Alain Laurent
Ali Laayoun
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bioMérieux
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction

Definitions

  • the present invention relates to a method for decontaminating a solution of undesirable nucleic acids.
  • the present invention also relates to the use of such a solution thus treated.
  • This contamination can come from many sources: poorly cleaned laboratory benches, personal, environment, equipment and pipetting devices, non-sterile samples.
  • Contamination can also come from amplicons from previous amplifications or from cross-contamination between samples. Another significant source of contamination is the raw material (enzymes, reagents) used in the amplification reactions. Thus, Corless et al. expose the harm of taq polymerase contamination to the sensitivity of real-time PCR for the detection of 16S RNA (J. Clin Microbiol., 38 (5), 1747-1752 (2000)).
  • a first way of remedying the contamination of the enzymes necessary for amplification consists of enzymatic decontamination methods.
  • US Pat. No. 5,418,149 describes a method using uracil-DNA-glycosylase which makes it possible to degrade the nucleic acids originating from the cells producing the enzyme.
  • This technique implements the overexpression of a desired protein, in this case a polymerase, in E. coli cells.
  • UNG uracil-DNA glycosylase
  • dUTPase deoxyuridine triphosphatase
  • the culture medium allows the production of the desired protein (polymerase) and the incorporation of deoxyuridine into the nucleic acids.
  • the synthesized proteins are then purified by standard purification techniques and by treatment with uracil-DNA-glycosylase which fragments the uracil residue of the residual nucleic acids.
  • the glycosylase is then inactivated by heat so as to avoid destruction of the target DNA during an amplification reaction.
  • thermolabile DNAse for degrading the double-stranded nucleic acids contained in the reaction medium before contact with the target nucleic acids.
  • the enzyme is then inactivated by heat.
  • This enzyme does not allow the degradation of contaminants in the form of RNA, single-stranded DNA or RNA / DNA heteroduplexes.
  • the inactivation of this enzyme by heat in the reaction medium requires the use of thermostable polymerases.
  • Mohammadi et al. J. Clin Microbiol., 2003 Oct., 41 (10): 4796-8 discloses a technique consisting of column filtration of extraction reagents and optionally restriction enzyme digestion, Sau3AI, reagents of PCR before amplification.
  • the disadvantage of filtration techniques lies in the fact that these techniques can not be applied to complex media without changing its concentration or properties.
  • this additional filtration step can itself be a source of contamination.
  • Patent application WO-A-94/12515 describes a method for treating a photoreactive compound with a solution containing Taq polymerase and potentially contaminating nucleic acids.
  • This photoreactive compound for example a furocoumarin derivative, is activated by ultraviolet exposure.
  • a major disadvantage of this technique beyond its constraining implementation, is the harmful effect of radiation on proteins.
  • this method remains ineffective because of the random degradation of said nucleic acids and can generate fragments that can still be amplified.
  • Metal complexes have also been described in patent application WO-A-2006/034009 in order to purify biological molecules contaminated with nucleic acids.
  • a fragmentation complex consisting of two molecules of phenanthroline associated with a copper atom (bis (1,10 phenanthroline) / Cu) is used to purify a solution containing Taq polymerase. This solution is then purified by standard chromatography techniques in order to remove contaminating nucleic acids and / or fragmentation molecules.
  • EP-B-0,646,180 discloses a method for inactivating nucleotide sequences with metal chelates.
  • a fragmentation complex such as bis (1,10 phenanthroline) / Cu is used to decontaminate the solutions, after the amplification step, of all the nucleic acids present. This makes it possible to avoid the contamination of new samples by amplicons resulting from a previous amplification reaction.
  • This document also describes the use of a fragmentation molecule to decontaminate preparations of biological products.
  • a major disadvantage of this method is that it does not allow the degradation of all the contaminating nucleic acids but only the amplicons resulting from an amplification reaction. earlier.
  • the major disadvantage is the presence of a purification step (ultrafiltration, precipitation, chromatography) making it difficult to implement and increasing the risk of new contaminations.
  • the inventors propose a new simple and rapid method for decontaminating a solution of undesirable nucleic acids.
  • the present invention firstly relates to a method for decontaminating a solution of any nucleic acid present in this solution comprising the following steps: subject, for a sufficient period of time, the solution to the action of at least one type of molecule having the property of degrading the nucleic acids by fragmentation, said fragmentation molecule, and this until the total degradation of said nucleic acids, said contaminating nucleic acids, and - stop the activity of the fragmentation molecule .
  • One of the advantages of the present invention is that this method of decontamination does not require a purification step to eliminate the fragmentation molecules.
  • the treated nucleic acids are RNA or DNA, in single or double-stranded form, as well as the RNA / DNA heteroduplexes.
  • Another object of the present invention is a method for decontaminating a solution, containing contaminating nucleic acids and nucleic acids of interest, and comprising the same steps as seen above, namely: subject, for a sufficient duration, the solution to the action of at least one type of molecule having the property of degrading contaminating nucleic acids by fragmentation, the so-called fragmentation molecule, until the degradation of said contaminating nucleic acids, while retaining the nucleic acids of interest, - stop the activity of the fragmentation molecule.
  • the contaminating nucleic acids may be human genomic DNA and the nucleic acids of interest may be viral or bacterial nucleic acids present in the mixture in very small amounts. These nucleic acids of interest can be protected from the action of the fragmentation molecule. They may, for example, be naturally protected by an outer shell (capsid, bacterial wall, etc.) while the contaminating nucleic acids are not.
  • the method comprises, after stopping the activity of the fragmentation molecule, an additional step which consists of an amplification reaction.
  • the decontamination method according to the invention is characterized in that the fragmentation molecule used has the property of randomly hydrolyzing the diester phosphate bonds of the contaminating nucleic acids.
  • the fragmentation molecule is a complex consisting of two molecules of 1, 10-phenanthroline associated with a metal atom forming the complex bis (1, 10-phenanthroline) / metal.
  • the metal is a transition metal such as copper, ruthenium, nickel, iron, zinc, rhodium, cobalt, manganese.
  • the two phenanthroline nuclei of the fragmentation molecule are connected to each other by a linker to form a ClipPhen molecule.
  • ClipPhen molecules have been widely described in the literature.
  • the connecting arms connecting the two phenanthroline nuclei are varied.
  • the linker between the two phenanthroline rings is constituted by a chain of three successive carbon atoms, in which the central carbon atom is substituted and each terminal carbon atom is connected to a phenanthroline ring by an oxygen atom, such as serinol.
  • the carbon atom in the central position is substituted with NH 2 or NH-CO-CH 3 , and each terminal carbon atom is connected to a phenanthroline ring by an oxygen atom at the 2 or 3 position of said ring.
  • a ClipPhen molecule complexed with copper has the property of very efficiently and randomly hydrolysing the diester phosphate bonds of the DNA or RNA. It can complex with a copper atom to give oxidation state complexes I or II as shown in J. Chem. Soc. 1961, 2007-2019 James et al.
  • the 2-ClipPhen-Cu and 3-ClipPhen-Cu molecules are represented below:
  • the present invention also relates to a method for decontaminating a solution of any nucleic acid present in this solution consisting of subjecting, for a sufficient period of time, the solution to the action of the molecule ClipPhen / metal, and this until to the total degradation of the contaminating nucleic acids.
  • Another object of the present invention is a method for decontaminating a solution, containing contaminating nucleic acids and nucleic acids of interest consisting in subjecting, for a sufficient duration, the solution to the action of the molecule ClipPhen / metal, and this until the degradation of said contaminating nucleic acids, while maintaining the nucleic acids of interest.
  • the fragmentation activity of the fragmentation molecule is stopped by adding an excess of organic reducing agent.
  • the organic reducing agent is constituted by a thiol
  • the ratio between the fragmentation molecule and the organic reducing agent stopping the reaction is greater than 1 per 100, and preferably greater than 1 per 1000.
  • An advantage of this embodiment is that the fragmentation molecules are inactivated in situ. These molecules do not need to be removed from the solution. The latter can be used, as such, in various applications such as amplification.
  • the fragmentation molecules can be activated or deactivated.
  • the fragmentation activity of the fragmentation molecule is stopped by adding a complexing agent (AC), for example EDTA, or any other complexing agent having more affinity.
  • AC complexing agent
  • EDTA EDTA
  • any other complexing agent having more affinity for the metal that ClipPhen and allowing a shift of balance:
  • the fragmentation molecule is a type I cuprous complex associated with hydrogen peroxide H 2 O 2 and, optionally, another preferentially organic reducing agent.
  • the fragmentation molecule is a ClipPhen / Cul molecule.
  • nucleate activity proceeds in two stages: a) the positively charged cuprous complex complexes with the nucleic acid, b) the nucleic acid is oxidized by formation of an intermediate Cu-oxo or Cu-OH with H 2 O 2 which leads, after a series of reactions, to the cleavage of the nucleic acid.
  • the molecule is a type II copper complex associated with another preferentially organic reducing agent.
  • the hydrogen peroxide is generated in situ under the action of air and reducing agent.
  • the fragmentation molecule is a ClipPhen / CuII molecule.
  • the organic reducing agent is a carboxylic acid or a derivative of such an acid
  • the ratio of the fragmentation molecule to the organic reducing agent is from 1: 1 to 1: 100.
  • the organic reducing agent consists of:
  • a thiol such as di-thiothreitol (DTT), a thio-acid, such as mercaptopropionic acid or
  • a derivative of a carboxylic acid such as ascorbate or
  • a phosphine such as tri-carboxy ethyl phosphine (TCEP).
  • the fragmentation molecule and / or the reducing agent is immobilized on a solid support.
  • This solid support may be a particle of latex (possibly magnetic), glass (CPG), silica, polystyrene, agarose, sepharose, nylon, etc. It can also be a filter, a membrane or a strip or a film.
  • the fragmentation activity of the fragmentation molecule may also be stopped when the solid support to which the fragmentation molecule and / or the reducing agent is attached is removed from the solution.
  • the fragmentation molecule may be covalently bonded or adsorbed on the supports considered.
  • the duration of the treatment is between 5 and 60 minutes, preferably between 10 and 30 minutes for concentrations of ClipPhen / metal molecules between 1 nM and 100 ⁇ M.
  • the solution contains all the constituents necessary for an amplification reaction with the exception of the nucleic acids, namely the targets, the amplification primers and the detection probes.
  • Another object of the present invention is the use of a solution treated according to the present invention, the solution being mixed with a biological sample containing target nucleic acids, which it is desired to amplify, but also the amplification primers and the detection probes specific for the target nucleic acids in the presence of the organic reducing agent, thus creating an excess of organic reducing agent which stops the action of the fragmentation molecules.
  • the organic reductant that stops the action of the fragmentation molecules may be the same as or different from the other organic reductant previously added to activate the nuclease reaction of the fragmentation molecule.
  • nucleic acid means a sequence of at least two deoxyribonucleotides or ribonucleotides.
  • the nucleic acid may be natural or synthetic, an oligonucleotide, a polynucleotide, a nucleic acid fragment, a genomic DNA, a ribosomal RNA, a messenger RNA, a transfer RNA, a nucleic acid obtained by an amplification technique enzymatic, such as: PCR (Polymerase Chain Reaction), described in US-A-4,683,195, US-A-4,683,202 and US-A-4,800,159, and its derivative RT-PCR (Reverse Transcription PCR), especially in a one-step format, as described in patent EP-BO569242,
  • any nucleic acid is meant the RNA, DNA sequences, in the form of single or double strand as well as RNA / DNA heteroduplexes.
  • stop the activity of the fragmentation molecule means that:
  • degradation means the degradation or fragmentation of at least 90% of the contaminating nucleic acids.
  • the degradation is said to be “total”, which means that the degradation of DNA or RNA, preferably by hydrolysis of the phosphate diester bonds, results in the formation of "non-amplifiable” nucleic acid sequences.
  • non-amplifiable nucleic acids is understood to mean nucleic acids which, in the presence of primers whose size is preferably at least 10 nucleotides, can not be amplified. The size of these "non-amplifiable” nucleic acids is therefore less than 20 nucleotides, preferably less than 10 nucleotides.
  • solution means a homogeneous or heterogeneous aqueous solution. It can be a complex solution containing enzymes, organic molecules (nucleoside triphosphates, sugars, saccharides, polysaccharides, small organic molecules, etc.), inorganic molecules (salts, etc.) and that in mixture or not.
  • the solution may also contain a solid support such as particles which may be optionally magnetic latex, glass (CPG), silica, polystyrene, agarose, sepharose, nylon, etc. It can also be a filter, a film, a membrane or a strip.
  • the solution may also consist of a solution in contact with a solid surface such as a plastic tube (Eppendorf type), thus allowing the decontamination of this surface.
  • a solid surface such as a plastic tube (Eppendorf type)
  • FIG. 1 Bioanalyzer study (Agilent, Kit RNA 6000 Pico, USA) of the degradation of a 1080 base transcript (wild-type Salmonella) subjected to the action of the ClipPhen-Cu / Ascorbate mixture for 1 hour at 37 ° C. The dark band at 31 seconds in columns 2, 3, 4, 6 and 7 corresponds to the 1080 base transcript.
  • Column 1 Size scale in nucleotides. Injection of an RNA range of increasing size, allowing the quantification and calculation of the size of the analyzed nucleic acids, as a function of their moment of passage in front of the bioanalyzer detector. The unit of measurement on the vertical axis is the second. The conversion between the passage time and the mass of the nucleic acids is done by the bioAnalyser software.
  • Figure 2 Inhibition of nucleic acid fragmentation by increasing the concentration of DTT (0 to 16 mM).
  • Curve A corresponds to 0 mM DTT.
  • Curve B corresponds to 1 mM of DTT.
  • Curve C corresponds to 3 mM of DTT.
  • Curve D corresponds to 5 mM of DTT.
  • the curve E corresponds to 10 mM of DTT.
  • Curve F corresponds to 16 mM of DTT.
  • Curve G corresponds to the control: OmM from DTT and 0 mM ascorbate.
  • FIG. 3 Fragmentation rate of the model fluorogenic oligonucleotide as a function of the concentration of DTT in the mixture (in relative fluorescence unit (RFU) per minute).
  • FIG. 4 Effect of the ClipPhen-Cu / ascorbate mixture on an aqueous solution containing nucleic acids (100 cell equivalent / ⁇ l of total B. cereus RNA).
  • Curve A corresponds to the amplification control that has not undergone any treatment (control +).
  • Curve B corresponds to the mixture ClipPhen-Cu 50 ⁇ M / ascorbate
  • Curve C corresponds to the ClipPhen-Cu 50 ⁇ M / ascorbate mixture
  • Figure 5 Comparison of fragmentation of DNA or single-stranded RNA by ClipPhen-Cu (with or without ascorbate).
  • Curve a Fluorogenic Oligonucleotide (DNA) No. 16025 subjected to the action of the ClipPhen-Cu / ascorbate mixture.
  • Curve b Fluorogenic Oligonucleotide (RNA) No. 16027 subjected to the action of the ClipPhen-Cu / ascorbate mixture.
  • Curve c Negative control of experiment a: Fluorogenic oligonucleotide (DNA) n ° 16025 subjected to the action of the mixture
  • Figure 6 Comparison of single or double-stranded DNA fragmentation by ClipPhen-Cu mixture (with or without ascorbate). The curves represent a speed of fragmentation corresponding to an increase in the fluorescence per minute (RFU / min).
  • Curve b Fluorogenic oligonucleotide duplex (DNA) n ° 16025
  • Curve c Fluorogenic Oligonucleotide (DNA) No. 16025 subjected to the action of the ClipPhen-Cu mixture. (negative control)
  • Curve d Fluorogenic Oligonucleotide (DNA) No. 16025 subjected to the action of the ClipPhen-Cu / ascorbate mixture.
  • RNA or an RNA / DNA heteroduplex by ClipPhen-Cu (with or without ascorbate). Normalized curves at 1.
  • Curve b Fluorogenic Oligonucleotide Duplex (RNA) # 16027
  • Curve e Hetero duplex fluorophenic oligonucleotide (RNA) no.
  • Curve f Hetero duplex fluorophenic oligonucleotide (RNA) no.
  • Electrophoregram A RNA target before degradation in water
  • Electrophoregram B RNA target before degradation in the presence of ascorbate
  • Electrophoregram C Degraded RNA target in the presence of ascorbate and resin-immobilized ClipPhen-Cu
  • Salmonella RNA 1080 bases). It also demonstrates the effect of ascorbate on the initiation of the fragmentation reaction.
  • the transcript is subjected to the action of different concentrations of the ClipPhen-Cu / ascorbate mixture.
  • the control is also subjected to the action of ClipPhen-Cu but in the absence of ascorbate.
  • a transcript solution (wild-type Salmonella 1080 base) consists of 2 ⁇ l of transcript at 1 ⁇ M in water and 18 ⁇ l of 80 mM phosphate buffer (milliMolar) pH 7.2, MgCl 2
  • ClipPhen-Cu (500, 50 and 5 ⁇ M) ascorbate or water for controls.
  • the effect of fragmentation on the column 5 to 7 transcript is observed by the appearance of bands of different sizes and smaller than 20 nucleotides (arrow on the right at the level of 20 seconds).
  • the transcript having undergone treatment with the ClipPhen-Cu / ascorbate mixture is partially degraded or totally degraded as a function of the concentration of ClipPhen-Cu. Between 5 ⁇ M and 0.5 ⁇ M, the disappearance of the initial band is shown.
  • the reaction time which makes it possible to obtain a total degradation of all the amplicons is of the order of 30-60 minutes with 5 nM of transcript, 5 ⁇ M of ClipPhen-Cu and 500 ⁇ M of ascorbate.
  • the amount of ClipPhen-Cu for the total degradation of the transcript is of the order of one micromolar (column 5).
  • the same experiment carried out without ascorbate (column 2) clearly shows an intact band.
  • This example aims to show that the degradation of nucleic acids by the ClipPhen-Cu / ascorbate mixture can be totally inhibited by the addition of an excess of reducing agent such as DTT.
  • a model fluorigenic oligonucleotide (Seq 16025 synthesized by Eurogentec (Liège, Belgium): 5 '(6-FAM) TGT AAT GATGAG GGT GTC ACT GCG GTT (TAMRA)) is subjected to the action of the ClipPhen-Cu / ascorbate mixture. By fragmenting, it shows fluorescence at 520 nm because the FAM fluorophore is physically removed from the TAMRA fluorescence extinguisher. The appearance of fluorescence is measured over time using a fluorimeter (NucliSens EasyQ Analyzer, Nasba Diagnostic, bioMérieux, Boxtel (NL)). The experiment is carried out with increasing concentrations of DTT for a fixed concentration of ClipPhen-Cu / ascorbate in order to measure the inhibition provided by the DTT by attenuation of the emitted fluorescence.
  • a ClipPhen-Cu / Ascorbate mixture prepared as follows: 200 ⁇ M ClipPhen and 200 ⁇ M CuCl 2 are then added. in DMF / 50/50 water and 20 mM ascorbate in extemporaneously prepared water (from solutions concentrated at 10 mM ClipPhen-Cu and 1 M ascorbate).
  • the 20 ⁇ l of solution contain: 10 nM fluorigenic oligonucleotide, 10 ⁇ M clip-phen + Cu 2+ , 1 mM ascorbate and 0/1/3/5/10/16 mM DTT.
  • a control is also made without ascorbate and without ClipPhen-Cu.
  • the measurement of the fluorescence emitted is then started for 60 minutes (FIG. 2).
  • the conditions are: exc / em filters (485/518 nm), time interval (1 min), integration time (100 ms).
  • Example 3 Decontaminating effect of CliPhen in an aqueous solution.
  • a control is carried out in which the activity of ClipPhen-Cu is inhibited from tO in order to measure the possible inhibitory effect of the latter.
  • DTT is added under sufficient conditions (10 mM) before adding the RNA target and an incubation of 30 minutes is maintained.
  • ClipPhen-Cu (250 ⁇ M in water / DMF 50/50) 20 ⁇ l of water and 10 ⁇ l of ascorbate at 2.5 mM in water.
  • This solution is incubated for decontamination for 30 minutes at room temperature.
  • Curve C shows that if the activity of the ClipPhen-Cu / ascorbate mixture is maintained for 30 minutes and then stopped by addition of DTT (17 mM), the fragmentation is such that no amplification curve is detected.
  • Example 4 Fragmentation by ClipPhen-Cu of nucleic acids other than RNA; application to single-stranded DNA, Double-stranded DNA to double-stranded RNA and RNA / DNA heteroduplex.
  • RNA probe 16027 UGU AAU GAU GAG GGU GUC ACU GCG GUU 6-FAM TAMRA fluorogenic
  • the mother solutions of fluorogenic oligonucleotides are at 200 nM in water which is diluted to 10 nM (1 ⁇ l) in 18 ⁇ l of 80 mM phosphate buffer pH 7.2, 20 mM MgCl 2 , 100 mM NaCl. Depending on the case, the complementary target is added at the same concentration. The solutions are then denatured and left at 37 ° C. for one hour in order to allow hybridization of the two strands.
  • FIG. 5 shows the result of the fluorescence measurement over time of a single strand fluorigenic DNA (16025, curve a) or fluorigenic RNA (16027, curve b) subjected to the action of the ClipPhen-Cu mixture. ascorbate. In both cases, a marked increase in fluorescence is observed in comparison with the controls (curves c and d). This appearance of fluorescence demonstrates that the DNA is fragmented as well as the RNA and at a comparable rate during the first instants of the reaction.
  • Figure 6 shows the fragmentation of a DNA / DNA duplex.
  • the fluorescence level is increased by a factor of 6 relative to the single-stranded control (curves c or d). This increase is not due to ClipPhen-Cu but to hybridization between the 2 strands.
  • a decrease in fluorescence of the curve b is observed, which corresponds to the fluorescence level of the curve d corresponding to the fluorescence emitted by the fully cleaved single strand.
  • the modification of the fluorescence compared to the controls demonstrates that single-stranded DNA and double-stranded DNA / DNA are cleaved in an absolutely comparable manner.
  • reaction mixture is brown in color due to 3-ClipPhen. Wash with anhydrous DMSO until the brown color of the wash solution disappears.
  • the initially yellowish marbles show a slightly darker yellow color after reaction.
  • the cleavage test is performed as follows: the desired amount of resin, between 1 mg and a single ball is a quantity of ClipPhen introduced 125nmol / 12, 5mM for TentaGel, (ie a quantity of ClipPhen introduced from 1.25 to 2 , 5nmol / 125 ⁇ M at 250 ⁇ M) is introduced into an Eppendorf tube (maximum capacity 200 ⁇ L).
  • the RNA target (16 s RNA transcripts of 1600 bases, concentration between 6 and 70 ng / ⁇ L according to the experiments) is added to the resin, as is the ascorbate at the desired concentration (5 mM).
  • a single TentaGel resin bead is sufficient to observe cleavage.
  • "Target-only" control samples (electrophoregram A FIG. 8), "target in the presence of ascorbate” (electrophoregram B), "target in the presence of resin” coupled to the ClipPhen-Cu complex are produced.
  • the "target in the presence of ascorbate” control makes it possible to control that the amount of ascorbate used has no effect on the fluorescence.
  • the samples thus prepared are stirred for 30 minutes at room temperature (1000 rpm) before being deposited on an Agilent RNA 6000 Nano chip (commercial kit referenced 5067-1512, Agilent, USA) depending on the target used. to the analysis on Bioanalyzer (Agilent, USA).
  • Example 6 Demonstration of the Decontamination of a Solution Containing Containing Nucleic Acids and Nucleic Acids of Interest
  • Aim To eliminate "genomic cell DNA” contaminants found in the supernatant of a viral culture without degrading viral nucleic acids present in smaller amounts and protected by a viral capsid. This is in order to decrease the non-specific amplifications that are made from the cellular DNA without inhibiting the specific amplification of the target of interest.
  • the concentration of 18S genomic DNA in the supernatant (commercial kit of the Search LC + genomic DNA assay, Promega, ref G3041, USA) is assayed before and after action of the ClipPhen-Cu / ascorbate mixture for the production of a range. dilution.
  • the concentration of viral RNA was measured before and after the ClipPhen-Cu / ascorbate mixture, by PCR with specific primers and a Light Cycler assay. SybrGreen (Roche, USA) Operating mode:
  • the genomic DNA concentration is 10 times lower (entry A) without the viral nucleic acid concentration being significantly affected.
  • This technique therefore makes it possible to increase the sensitivity of the viral nucleic acid assay by reducing the background noise significantly.

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Abstract

La présente invention concerne une méthode de décontamination d'une solution de tout acide nucléique présent dans cette solution comprenant les étapes suivantes : soumettre, pendant une durée suffisante, la solution à l'action d'au moins un type de molécule ayant la propriété de dégrader les acides nucléiques par fragmentation, dite molécule de fragmentation, et ce jusqu'à la dégradation totale desdits acides nucléiques, dits acides nucléiques contaminants, et arrêter l'activité de la molécule de fragmentation. L'invention concerne également l'utilisation d'une telle solution ainsi traitée. L'invention trouve une application préférentielle dans le domaine du diagnostic.

Description

« Méthode de décontamination d'une solution des acides nucléiques indésirables »
La présente invention concerne une méthode de décontamination d'une solution des acides nucléiques indésirables. La présente invention concerne également l'utilisation d'une telle solution ainsi traitée.
L'essor de la biologie moléculaire a rendu possible la manipulation des acides nucléiques. Les méthodes d'amplification sont alors devenues un outil indispensable, en permettant d'obtenir à partir d'une très faible quantité d'acides nucléiques, une plus grande quantité dans un temps relativement court. Un inconvénient majeur de ces techniques réside dans l'amplification d'acides nucléiques indésirables, entraînant des résultats erronés, voire des faux positifs dans des tests cliniques. C'est ce que l'on appelle la contamination .
Cette contamination peut provenir de nombreuses sources : paillasses de laboratoire mal nettoyées, personnels, environnement, équipements et dispositifs de pipetage, échantillons non stériles.
Un certain nombre de recommandations visant à limiter ces contaminations a été mis en place. Il s'agit de méthodes préventives concernant par exemple la manipulation des échantillons (techniques de stérilisation notamment) ou encore les équipements de laboratoire (zones de travail physiquement délimitées, utilisation de hottes d'aspiration, gradient de pression entre l'extérieur et l'intérieur, afin que le flux permette toujours l'évacuation dans la direction souhaitée, etc. ) .
La contamination peut également provenir des amplicons issus d'amplifications précédentes ou d'une contamination croisée entre échantillons. Une autre source non négligeable de contamination réside dans la matière première (enzymes, réactifs) utilisée dans les réactions d'amplification. Ainsi, Corless et al. exposent les méfaits de la contamination de la taq polymérase sur la sensibilité de la PCR en temps réel pour la détection de 1 'ARN 16S (J. Clin. Microbiol., 38(5), 1747-1752 (2000)).
Une première façon de remédier à la contamination des enzymes nécessaires à l'amplification, consiste en des méthodes de décontamination enzymatique.
Ainsi, le brevet US-A-5, 418, 149 décrit une méthode utilisant 1 ' uracile-ADN-glycosylase qui permet de dégrader les acides nucléiques provenant de la cellules productrice de l'enzyme. Cette technique met en œuvre la surexpression d'une protéine souhaitée, en l'occurrence une polymérase, dans des cellules d'E. CoIi déficiantes en uracile-DNA glycosylase (UNG) et en deoxyuridine triphosphatase (dUTPase) . Grâce à la déficience en UNG, la cellule n'élimine pas les bases deoxyuraciles incorporées. Par la déficience en dUTPase, la cellule augmente son pool de deoxyuridine. Ainsi le milieu de culture permet la production de la protéine souhaitée (polymérase) et l'incorporation de deoxyuridine dans les acides nucléiques. Les protéines synthétisées sont alors purifiées par des techniques standard de purification et par un traitement par 1 ' uracile-ADN-glycosylase qui fragmente le résidu uracile des acides nucléiques résiduels. La glycosylase est ensuite inactivée par la chaleur de façon à éviter la destruction de 1 'ADN cible au cours d'une réaction d'amplification .
Cette méthode étant spécifique de la production de protéines recombinantes, son inconvénient majeur est dû à sa mise en œuvre. De plus, la décontamination est limitée aux acides nucléiques contenant de 1 'uracile. Enfin, un autre inconvénient éventuel est que le traitement par la chaleur n'induit qu'une inactivation partielle de 1 ' uracile-ADN- glycosylase. L 'ADN cible mis en contact avec la protéine peut alors être éventuellement détruit.
Une autre méthode enzymatique décrite par Ashkenas et al. (Biotechniques; 2005 JuI.; 39 ( 1 ): 69-73 ), consiste à décontaminer une solution contenant l'ensemble des éléments nécessaires à une amplification. Il s'agit ici d'un cocktail d'enzymes de restriction utilisé dans le cadre d'une RT-PCR. Ces enzymes dégradent l'ADN double brin présent dans le milieu réactionnel d'amplification contenant l'ARN cible à amplifier. Elles sont ensuite inactivées par la chaleur lorsque la transcription inverse se produit. Une alternative à cette méthode pour une application PCR, donc en présence d'ADN cible double brin, est également décrite mais est limitée à l'utilisation d'un seul type d'enzyme de restriction (Type IIS RE). Toutefois, l'utilisation d'enzymes de restriction présente l'inconvénient de ne cliver que des acides nucléiques double brin qui en plus doivent présenter le site de reconnaissance. De ce fait, les contaminants sous forme simple brin et/ou ne présentant peu ou pas de tels sites ne sont alors pas éliminés.
D'autres méthodes enzymatiques de décontamination consistent, elles, à éliminer les acides nucléiques indésirables d'une solution avant la mise en contact avec les acides nucléiques cibles. La demande de brevet WO-A-99/07887 décrit l'utilisation d'une DNAse thermolabile permettant de dégrader les acides nucléiques double brin contenus dans le milieu réactionnel avant mise en contact avec les acides nucléiques cibles. L'enzyme est ensuite inactivée par la chaleur . L'inconvénient majeur de cette technique est que cette enzyme ne permet pas la dégradation de contaminants sous forme d'ARN, d'ADN simple brin ou d'hétéroduplexes ARN/ADN. De plus, 1 ' inactivation de cette enzyme par la chaleur dans le milieu réactionnel nécessite l'utilisation de polymérases thermostables .
L'art antérieur fait état également de méthodes non- enzymatiques .
Ainsi, Mohammadi et al. (J. Clin. Microbiol. 2003 Oct . ; 41 ( 10 ): 4796-8 ) décrit une technique consistant en la filtration sur colonnes des réactifs d'extraction et éventuellement de la digestion par une enzyme de restriction, Sau3AI, des réactifs de la PCR avant amplification. L'inconvénient des techniques de filtration réside dans le fait que ces techniques ne peuvent pas être appliquées à des milieux complexes sans en changer la concentration ni les propriétés. De plus, cette étape supplémentaire de filtration peut elle-même être source de contamination.
La demande de brevet WO-A-94/12515 décrit une méthode de traitement par un composé photoréactif d'une solution contenant la Taq polymérase et potentiellement des acides nucléiques contaminants. Ce composé photoréactif, par exemple un dérivé furocoumarine, est activé par une exposition aux ultraviolets. Un inconvénient majeur de cette technique, au- delà de sa mise en œuvre contraignante, est l'effet néfaste des radiations sur les protéines. De plus cette méthode reste peu efficace du fait de la dégradation aléatoire desdits acides nucléiques et peut générer des fragments encore amplifiables .
Une autre méthode non-enzymatique décrite par Chang et al., (RNA. 2005 May; 11(5): 831-6) met en œuvre un complexe de cobalt pour l'inhibition de la traduction. Ce complexe permet l'hydrolyse des liaisons phosphates diesters de l'ADN et de l'ARN.
Les inconvénients majeurs de cette technique sont la dégradation incomplète des acides nucléiques et la lenteur de la réaction de décontamination (24 heures).
Des complexes métalliques ont également été décrits dans la demande de brevet WO-A-2006/034009 afin de purifier des molécules biologiques contaminées par des acides nucléiques. Ainsi, un complexe de fragmentation constitué de deux molécules de phénanthroline associées à un atome de cuivre (bis (1,10 phénanthroline) /Cu) est utilisé pour purifier une solution contenant la taq polymérase. Cette solution est ensuite purifiée par des techniques standard de chromatographie afin d'enlever les acides nucléiques contaminants et/ou les molécules de fragmentation.
L'inconvénient majeur de cette méthode est la présence d'une étape de purification rendant difficile sa mise en œuvre et augmentant le risque de nouvelles contaminations.
Le brevet EP-B-O .646.180 décrit un procédé permettant d'inactiver des séquences de nucléotides par des chelates métalliques. Un complexe de fragmentation tel que le bis (1,10 phénanthroline) /Cu est utilisé pour décontaminer les solutions, après l'étape d'amplification, de tous les acides nucléiques présents. Ceci permet d'éviter la contamination de nouveaux échantillons par des amplicons issus d'une réaction d'amplification antérieure. Ce document décrit également l'utilisation d'une molécule de fragmentation pour décontaminer des préparations de produits biologiques.
Dans le cas de la première utilisation, un inconvénient majeur de cette méthode est qu'elle ne permet pas la dégradation de tous les acides nucléiques contaminants mais seulement des amplicons issus d'une réaction d'amplification antérieure. Dans le deuxième cas, l'inconvénient majeur est la présence d'une étape de purification (ultrafiltration, précipitation, chromatographie) rendant difficile sa mise en œuvre et augmentant le risque de nouvelles contaminations.
Compte tenu des inconvénients de l'art antérieur, les inventeurs proposent une nouvelle méthode simple et rapide de décontamination d'une solution des acides nucléiques indésirables .
Dans ce contexte, la présente invention a tout d'abord pour objet une méthode de décontamination d'une solution de tout acide nucléique présent dans cette solution comprenant les étapes suivantes : soumettre, pendant une durée suffisante, la solution à l'action d'au moins un type de molécule ayant la propriété de dégrader les acides nucléiques par fragmentation, dite molécule de fragmentation, et ce jusqu'à la dégradation totale desdits acides nucléiques, dits acides nucléiques contaminants, et - arrêter l'activité de la molécule de fragmentation.
Un des avantages de la présente invention est que cette méthode de décontamination ne nécessite pas d'étape de purification pour éliminer les molécules de fragmentation.
Les acides nucléiques traités sont de 1 'ARN ou de l'ADN, se présentant sous forme simple ou double brin, ainsi que les hétéroduplexes ARN/ADN.
Cette méthode est particulièrement utile dans la décontamination de matières premières telles que par exemple les enzymes issues de sources naturelles comme les bactéries. Ces enzymes sont alors fortement contaminées par les acides nucléiques naturels issues de ces bactéries. Un autre objet de la présente invention est une méthode de décontamination d'une solution, contenant des acides nucléiques contaminants et des acides nucléiques d'intérêt, et comprenant les mêmes étapes vues ci-dessus, à savoir : soumettre, pendant une durée suffisante, la solution à l'action d'au moins un type de molécule ayant la propriété de dégrader les acides nucléiques contaminants par fragmentation, dite molécule de fragmentation, et ce jusqu'à la dégradation desdits acides nucléiques contaminants, tout en conservant les acides nucléiques d'intérêt, - arrêter l'activité de la molécule de fragmentation.
Les acides nucléiques contaminants peuvent être de l 'ADN génomique humain et les acides nucléiques d'intérêt peuvent être des acides nucléiques viraux ou bactériens présents dans le mélange en très petite quantité. Ces acides nucléiques d'intérêt peuvent être protégés de l'action de la molécule de fragmentation. Ils peuvent, par exemple, être naturellement protégés par une enveloppe extérieure (capside, paroi bactérienne, etc.) alors que les acides nucléiques contaminants ne le sont pas.
Dans un mode avantageux de réalisation de l'invention, la méthode comprend, après l'arrêt de l'activité de la molécule de fragmentation, une étape supplémentaire qui consiste en une réaction d'amplification.
Préférentiellement , la méthode de décontamination selon l'invention est caractérisée en ce que la molécule de fragmentation utilisée a la propriété d'hydrolyser de manière aléatoire les liaisons phosphates diesters des acides nucléiques contaminants. Selon un mode de réalisation, la molécule de fragmentation est un complexe constitué de deux molécules de 1 , 10-phénanthroline associé à un atome métallique formant le complexe bis ( 1, 10-phénanthroline) /métal . Préférentiellement le métal est un métal de transition tel que le cuivre, le ruthénium, le nickel, le fer, le zinc, le rhodium, le cobalt, le manganèse.
De façon avantageuse, les deux noyaux phénanthroline de la molécule de fragmentation sont reliés l'un à l'autre par un bras de liaison pour former une molécule ClipPhen. Les molécules ClipPhen ont été largement décrites dans la littérature. Les bras de liaison reliant les deux noyaux phénanthroline sont variés. De façon avantageuse, le bras de liaison entre les deux noyaux phénanthroline est constitué par une chaîne de trois atomes de carbone successifs, dont l'atome de carbone en position centrale est substitué et dont chaque atome de carbone terminal est relié à un noyau phénanthroline par un atome d'oxygène, tel que le serinol. Préférentiellement , l'atome de carbone en position centrale est substitué par NH2 ou NH-CO-CH3, et chaque atome de carbone terminal est relié à un noyau phénanthroline par un atome d'oxygène en position 2 ou 3 dudit noyau.
De nombreux autres bras sont possibles, comme par exemple un diamino-cyclohexane (Chemistry letters, Vol 33, n°6, p 684- 985, Hayashi et al), ou encore un éthane diol, un propane diol, un pentane diol (Synlett 2001, n°10, 1629-1631, Boldron et al) .
L'activité de fragmentation de la molécule ClipPhen associée à un métal est également connue de l'homme du métier (Chemical Review, 1993, 93, 2295-2316. D. Sigman et al. ; J. Chem. Soc. 1961, 2007-2019 James et al.). Cette molécule a fait l'objet de nombreux travaux dans le but d'améliorer ses propriétés d'hydrolyse. Elle présente l'avantage de dégrader tous les acides nucléiques, c'est-à-dire 1 'ADN et 1 'ARN sous forme simple ou double brin ainsi que les hétéroduplexes ARN/ADN. Ainsi la 2-ClipPhen/métal ( 1, 3-bis ( 1, 10- phenanthrolin-2-yloxy) propan-2-amine) /métal et la 3- ClipPhen/métal ( 1, 3-bis ( 1, 10-phenanthrolin-3-yloxy) propan-2- amine) /métal ont montré une activité nucléasique largement augmentée par rapport au complexe bis (1,10- phénanthroline) /métal (Inorganic Chemistry 1998, 3486-3489, Pitié et al. ; Chem. Commun. 1998, 2597-2598, Pitié et al. ; Eur. J. Inorg. Chem. 2003, 528-540, Pitié et al. et Bioconjugate Chemistry 2000, 11, 892-900 Pitié M. et al. ). De même une molécule ClipPhen complexée au cuivre a la propriété d'hydrolyser très efficacement et de façon aléatoire les liaisons phosphates diesters de 1 'ADN ou de l'ARN. Elle peut se complexer avec un atome de cuivre pour donner des complexes d'état d'oxydation I ou II tels que montrés dans la publication J. Chem. Soc. 1961, 2007-2019 James et al. Les molécules 2-ClipPhen-Cu et 3-ClipPhen-Cu sont représentées ci- dessous :
Figure imgf000010_0001
2-ClipPhen-Cu
Figure imgf000010_0002
3-ClipPhen-Cu Ainsi, la présente invention a également pour objet une méthode de décontamination d'une solution de tout acide nucléique présent dans cette solution consistant à soumettre, pendant une durée suffisante, la solution à l'action de la molécule ClipPhen/métal, et ce jusqu'à la dégradation totale des acides nucléiques contaminants.
Un autre objet de la présente invention consiste en une méthode de décontamination d'une solution, contenant des acides nucléiques contaminants et des acides nucléiques d'intérêt consistant à soumettre, pendant une durée suffisante, la solution à l'action de la molécule ClipPhen/métal, et ce jusqu'à la dégradation desdits acides nucléiques contaminants, tout en conservant les acides nucléiques d'intérêt.
Selon un mode de réalisation de la présente invention, l'activité de fragmentation de la molécule de fragmentation est arrêtée par un ajout d'un excès de réducteur organique. Lorsque le réducteur organique est constitué par un thiol, le rapport entre la molécule de fragmentation et le réducteur organique arrêtant la réaction est supérieur à 1 pour 100, et préférentiellement supérieur à 1 pour 1000.
Un avantage de ce mode de réalisation est que les molécules de fragmentation sont inactivées in situ. Ces molécules n'ont alors pas besoin d'être retirées de la solution. Cette dernière pourra être utilisée, telle quelle, dans diverses applications comme par exemple une amplification .
Ainsi, en fonction de la concentration du réducteur organique présent, les molécules de fragmentation peuvent être activées ou désactivées. Selon un autre mode de réalisation de la présente invention, l'activité de fragmentation de la molécule de fragmentation est arrêtée par un ajout d'un agent complexant (AC) comme par exemple l'EDTA, ou tout autre complexant possédant plus d'affinité pour le métal que la ClipPhen et permettant un déplacement de l'équilibre :
ClipPhen-métal + AC ^ ClipPhen + métal-AC
Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention la molécule de fragmentation est un complexe cuivreux de type I associé à du peroxyde d'hydrogène H2O2 et, éventuellement, à un autre réducteur préférentiellement organique. De préférence, la molécule de fragmentation est une molécule ClipPhen/Cul .
Dans le cas d'un complexe cuivreux de type I, l'activité nucléasique procède en deux temps : a) le complexe cuivreux chargé positivement se complexe à l'acide nucléique, b) l'acide nucléique est oxydé par formation d'un intermédiaire Cu-oxo ou Cu-OH avec H2O2 qui conduit, après une suite de réactions, à la coupure de l'acide nucléique.
Selon un autre mode de réalisation, la molécule est un complexe cuivrique de type II associé à un autre réducteur préférentiellement organique. Dans ce cas, le peroxyde d'hydrogène est généré in-situ sous l'action de l'air et du réducteur. De préférence alors, la molécule de fragmentation est une molécule ClipPhen/CuII .
Lorsque l'autre réducteur organique est un acide carboxylique ou un dérivé d'un tel acide, le rapport entre la molécule de fragmentation et le réducteur organique est compris entre 1 pour 1 et 1 pour 100. Selon les modes de réalisation précédents, le réducteur organique est constitué par :
• un thiol, tel que le di-thiothréitol (DTT), un thio-acide, tel que l'acide mercapto-propionique ou
• un acide carboxylique ou
• un dérivé d'un acide carboxylique tel que l'ascorbate ou
• une phosphine comme la tri carboxy ethyl phosphine (TCEP) .
Dans un mode de réalisation particulier, la molécule de fragmentation et/ou le réducteur est immobilisé sur un support solide. Ce support solide peut être une particule de latex (éventuellement magnétique) , de verre (CPG) , de silice, de polystyrène, d'agarose, de sépharose, de nylon, etc. Il peut s'agir également d'un filtre, d'une membrane ou d'une bandelette ou d'un film.
L'activité de fragmentation de la molécule de fragmentation peut également être arrêtée lorsque le support solide sur lequel est fixé la molécule de fragmentation et/ou le réducteur est retiré de la solution.
La molécule de fragmentation peut être fixée par liaison covalente ou par adsorption sur les supports considérés. De nombreuses références concernant les réactifs supportés existent, on pourra notamment se référer à Laurent et al., Tetrahedron Letters 45, 8883-8887, 2004.
Un autre avantage de la présente invention par rapport à l'art antérieur est la rapidité de la réaction subie par les acides nucléiques. La durée du traitement est comprise entre 5 et 60 minutes préférentiellement entre 10 et 30 minutes pour des concentrations en molécules ClipPhen/métal comprises entre 1 nM et 100 μM.
Dans un mode préféré de l'invention, la solution contient tous les constituants nécessaires à une réaction d'amplification à l'exception des acides nucléiques soit les cibles, les amorces d'amplification et les sondes de détection .
Un autre objet de la présente invention est l'utilisation d'une solution traitée selon la présente invention, la solution étant mélangée avec un échantillon biologique contenant des acides nucléiques cibles, que l'on souhaite amplifier, mais également les amorces d'amplification et les sondes de détection spécifiques des acides nucléiques cibles en présence du réducteur organique, créant ainsi un excès de réducteur organique ce qui arrête l'action des molécules de fragmentation .
Le réducteur organique qui arrête l'action des molécules de fragmentation peut être identique ou différent de l'autre réducteur organique ajouté préalablement pour activer la réaction nucléasique de la molécule de fragmentation.
Définitions
Le terme « acide nucléique » signifie un enchaînement d'au moins deux désoxyribonucléotides ou ribonucléotides .
L'acide nucléique peut être naturel ou synthétique, un oligonucléotide, un polynucléotide, un fragment d'acide nucléique, un ADN génomique, un ARN ribosomique, un ARN messager, un ARN de transfert, un acide nucléique obtenu par une technique d'amplification enzymatique, telle que : • PCR (Polymerase Chain Reaction) , décrite dans les brevets US- A-4,683,195, US-A-4, 683 , 202 et US-A-4, 800, 159, et sa dérivée RT-PCR (Reverse Transcription PCR) , notamment dans un format en une étape, tel que décrit dans le brevet EP-B-O .569.272,
• LCR (Ligase Chain Reaction) , exposée par exemple dans la demande de brevet EP-A-O .201.184,
• RCR (Repair Chain Reaction) , décrite dans la demande de brevet WO-A-90/01069,
• 3SR (Self Sustained Séquence Replication) avec la demande de brevet WO-A-90/06995,
• NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) avec la demande de brevet WO-A-91/02818, et
• TMA (Transcription Mediated Amplification) avec le brevet US- A-5,399, 491.
On parle alors d'amplicons pour désigner les acides nucléiques générés par une technique d'amplification enzymatique .
Par « tout acide nucléique » on entend les séquences d'ARN, d'ADN, sous la forme de simple ou double brin ainsi que les hétéroduplexes ARN/ADN.
On entend par « arrêter l'activité de la molécule de fragmentation » le fait:
- d'ajouter d'un excès de réducteur organique ou
- d'ajouter d'un agent complexant .
Le terme « dégradation » signifie la dégradation ou la fragmentation d'au moins 90% des acides nucléiques contaminants. De préférence la dégradation est dite « totale » ce qui signifie que la dégradation d'ADN ou d'ARN, préférentiellement par une hydrolyse des liaisons phosphate diesters, entraîne la formation de séquences d'acides nucléiques « non amplifiables ». On entend par des acides nucléiques « non amplifiables » des acides nucléiques qui, en présence d'amorces dont la taille est préférentiellement au moins de 10 nucléotides, ne peuvent pas être amplifiés. La taille de ces acides nucléiques « non amplifiables » est donc inférieure à 20 nucléotides, préférentiellement inférieure à 10 nucléotides.
Le terme « solution » signifie une solution aqueuse homogène ou hétérogène. Il peut s'agir d'une solution complexe contenant des enzymes, des molécules organiques (nucléosides triphosphates, sucres, saccharides, polysaccharides, petites molécules organiques, etc.), des molécules inorganiques (sels, etc) et cela en mélange ou non. La solution peut également contenir un support solide telles que des particules qui peuvent être en latex éventuellement magnétique, en verre (CPG) , en silice, en polystyrène, en agarose, en sépharose, en nylon, etc. Il peut s'agir également d'un filtre, d'un film, d'une membrane ou d'une bandelette.
La solution peut également être constituée par une solution en contact avec une surface solide tel un tube de plastique (type Eppendorf ) , permettant ainsi la décontamination de cette surface .
Les figures et exemples ci-joints représentent des modes particuliers de réalisation et ne peuvent pas être considérés comme limitant la portée de la présente invention.
Figure 1 : Etude au Bioanalyser (Agilent, Kit RNA 6000 Pico, USA) de la dégradation d'un transcrit de 1080 bases (Salmonella type sauvage) soumis à l'action du mélange ClipPhen-Cu/Ascorbate pendant 1 heure à 370C. La bande sombre située à 31 secondes dans les colonnes 2, 3, 4, 6 et 7 correspond au transcrit de 1080 bases. - Colonne 1 : Echelle de taille en nucléotides. Injection d'une gamme d'ARN de taille croissante, permettant la quantification et le calcul de la taille des acides nucléiques analysés, en fonction de leur moment de passage devant le détecteur du bioanalyser. L'unité de mesure sur l'axe vertical est la seconde. La conversion entre le temps de passage et la masse des acides nucléiques est faite par le logiciel du bioAnalyser .
- Colonne 2 : Transcrit 5 nM (nanoMolaire) en présence de 5 μM (microMolaire) ClipPhen-Cu.
- Colonne 3 : Transcrit 5 nM en présence de 500 nM ClipPhen- Cu.
- Colonne 4 : Transcrit 5 nM en présence de 50 nM ClipPhen-Cu.
- Colonne 5 : idem colonne 2 avec rajout d'ascorbate 500 μM.
- Colonne 6 : idem colonne 3 avec rajout d'ascorbate 50 μM.
- Colonne 7 : idem colonne 4 avec rajout d'ascorbate 5 μM.
Figure 2 : Inhibition de la fragmentation des acides nucléiques par augmentation de la concentration en DTT (0 à 16 mM) .
La courbe A correspond à 0 mM de DTT.
La courbe B correspond à 1 mM de DTT.
La courbe C correspond à 3 mM de DTT.
La courbe D correspond à 5 mM de DTT.
La courbe E correspond à 10 mM de DTT.
La courbe F correspond à 16 mM de DTT.
La courbe G correspond au témoin : OmM de DTT et 0 mM d'ascorbate . Figure 3 : Vitesse de fragmentation de l 'oligonucléotide fluorigène modèle en fonction de la concentration en DTT dans le mélange (en unité de fluorescence relative (RFU) par minute) .
Figure 4 : Effet du mélange ClipPhen-Cu/ascorbate sur une solution aqueuse contenant des acides nucléiques (100 équivalent cellule / μl d'ARN totaux de B. Cereus) .
La courbe A correspond au témoin d'amplification n'ayant subit aucun traitement (contrôle +) .
La courbe B correspond au mélange ClipPhen-Cu 50 μM/ascorbate
500 μM dont l'activité est immédiatement inhibée par ajout de
17 mM de DTT et qui est incubé pendant 30 minutes.
La courbe C correspond au mélange ClipPhen-Cu 50 μM/ascorbate
500 μM incubé 30 minutes avec arrêt de la fragmentation avec du DTT au bout de ce temps .
Figure 5 : Comparaison de la fragmentation de l'ADN ou de l'ARN simple brin par la ClipPhen-Cu (avec ou sans ascorbate) .
Courbes normalisées à 1.
Courbe a : Oligonucléotide fluorigène (ADN) n° 16025 soumis à l'action du mélange ClipPhen-Cu/ascorbate .
Courbe b : Oligonucléotide fluorigène (ARN) n° 16027 soumis à l'action du mélange ClipPhen-Cu/ascorbate .
Courbe c : Témoin négatif de l'expérience a : Oligonucléotide fluorigène (ADN) n° 16025 soumis à l'action du mélange
ClipPhen-Cu seulement.
Courbe d : Témoin négatif de l'expérience b : Oligonucléotide fluorigène (ARN) n° 16027 soumis à l'action du mélange
ClipPhen-Cu seulement.
Figure 6 : Comparaison de la fragmentation d'ADN simple ou double brin par le mélange ClipPhen-Cu (avec ou sans ascorbate) . Les courbes représentent une vitesse de fragmentation correspondant à une augmentation de la fluorescence par minute (RFU/min) .
Courbe a : Duplex oligonucléotide fluorigène (ADN) n° 16025
/cible complémentaire ADN (n° 16026) soumis à l'action du mélange ClipPhen-Cu (témoin négatif) .
Courbe b : Duplex oligonucléotide fluorigène (ADN) n° 16025
/cible complémentaire ADN (n° 16026) soumis à l'action du mélange ClipPhen-Cu/ascorbate .
Courbe c : Oligonucléotide fluorigène (ADN) n° 16025 soumis à l'action du mélange ClipPhen-Cu. (témoin négatif) .
Courbe d : Oligonucléotide fluorigène (ADN) n° 16025 soumis à l'action du mélange ClipPhen-Cu/ascorbate .
Figure 7 : Comparaison de la fragmentation de duplex ADN ou
ARN ou d'un héteroduplex ARN/ADN par la ClipPhen-Cu (avec ou sans ascorbate) . Courbes normalisées à 1.
Courbe a : Duplex oligonucléotide fluorigène (ADN) n° 16025
/cible complémentaire ADN (n° 16026) soumis à l'action du mélange ClipPhen-Cu (témoin négatif) .
Courbe b : Duplex oligonucléotide fluorigène (ARN) n° 16027
/cible complémentaire ARN (n° 16028) soumis à l'action du mélange ClipPhen-Cu (témoin négatif) . courbe c : Duplex oligonucléotide fluorigène (ADN) n° 16025
/cible complémentaire ADN (n° 16026) soumis à l'action du mélange ClipPhen-Cu/ascorbate . courbe d : Duplex oligonucléotide fluorigène (ARN) n° 16027
/cible complémentaire ARN (n° 16028) soumis à l'action du mélange ClipPhen-Cu/ascorbate .
Courbe e : Hétéro duplex oligonucléotide fluorigène (ARN) n°
16027 /cible complémentaire ADN (n° 16026) soumis à l'action du mélange ClipPhen-Cu (témoin négatif) .
Courbe f : Hétéro duplex oligonucléotide fluorigène (ARN) n°
16027 /cible complémentaire ADN (n° 16026) soumis à l'action du mélange ClipPhen-Cu/ascorbate . Figure 8: Observation au Bioanalyseur (Agilent) du clivage de
1 'ARN 16s (13ng/μL) par la ClipPhen-Cu immobilisée sur une bille TentaGel en présence d'ascorbate 5mM.
Electrophoregramme A : Cible ARN avant dégradation dans l'eau ;
Electrophoregramme B : Cible ARN avant dégradation en présence d'ascorbate ;
Electrophoregramme C : Cible ARN dégradée en présence d'ascorbate et de la ClipPhen-Cu immobilisée sur résine
Tentagel (1 bille de Tentagel, 30 min) ;
Exemple 1 : Hydrolyse d'un transcrit par la molécule ClipPhen- Cu et effet initiateur de l'ascorbate.
But :
Cet exemple démontre l'action de fragmentation du mélange
ClipPhen-Cu/ascorbate sur un acide nucléique modèle (Transcrit
ARN Salmonelle : 1080 bases). Il démontre également l'effet de l'ascorbate sur l'initiation de la réaction de fragmentation.
Le transcrit est soumis à l'action de différentes concentrations du mélange ClipPhen-Cu/ascorbate . Le témoin est soumis également à l'action de la ClipPhen-Cu mais en absence d'ascorbate .
Les fragments sont ensuite analysés à l'aide du Bionalyser d'Agilent (figure 1).
Mode opératoire :
Une solution de transcrit (Salmonella sauvage 1080 base) est constituée à partir de 2 μl de transcrit à 1 μM dans l'eau et de 18 μl de tampon phosphate 80 mM (milliMolaire) pH 7,2, MgCl2
20 mM, NaCl 100 mM. Cette solution est portée à 7O0C pendant 2 minutes puis mise dans la glace.
On prélève alors 5μl de cette solution à laquelle on rajoute 1 μl de ClipPhen-Cu (500, 50 et 5μM) et 4 μl du tampon utilisé précédement . On obtient la solution 2 que l'on laisse Ih à
370C.
On prend alors 5 μl de la solution 2 et on y ajoute 42,5 μl de tampon et 2,5 μl d'une solution d'ascorbate fraîchement préparée (100 eq par rapport à la [ClipPhen-Cu] ) ou d'eau dans le cas des témoins.
Ainsi on se retrouve avec un série de tubes comportant respectivement 5 nM de transcrit, (5 μM, 500 nM et 50 nM) de
ClipPhen-Cu et (500, 50 et 5 μM) d'ascorbate ou d'eau pour les témoins .
On injecte immédiatement 1 μl des 6 solutions sur la puce RNA
6000 Pico (Kit commercial référencé 5067-1512, Agilent, USA), utilisé sur le système BioAnalyzer d'Agilent ,USA) pour observer les produits de fragmentation.
Résultats et conclusions :
On observe l'effet de la fragmentation sur le transcrit colonnes 5 à 7 par l'apparition de bandes de différentes tailles et inférieures à 20 nucléotides (flèche sur la droite au niveau de 20 secondes). Ainsi le transcrit ayant subit le traitement par le mélange ClipPhen-Cu/ascorbate est partiellement dégradé ou totalement dégradé en fonction de la concentration en ClipPhen-Cu. Entre 5 μM et 0,5 μM, on montre la disparition de la bande initiale. Le temps de réaction permettant d'obtenir une dégradation totale de tous les amplicons est de l'ordre de 30-60 minutes avec 5 nM de transcrit, 5 μM de ClipPhen-Cu et 500 μM d'ascorbate. La quantité de ClipPhen-Cu pour la dégradation totale du transcrit est de l'ordre du micromolaire (colonne 5). Par contre la même expérience effectuée sans ascorbate (colonne 2) montre bien une bande intacte.
On démontre ainsi que le mélange ClipPhen-Cu n'a aucune activité tant que 1 'ascorbate n'a pas été ajouté (excès de l'ordre de 1-100 équivalents). Exemple 2 : Inhibition de la molécule ClipPhen-Cu par un réducteur .
But :
Cet exemple vise à montrer que la dégradation des acides nucléiques par le mélange ClipPhen-Cu/ascorbate peut être totalement inhibée par l'ajout d'un excès de réducteur comme le DTT.
Un oligonucléotide fluorigène modèle (Seq 16025 synthétisée par Eurogentec (Liège, Belgique) : 5' (6-FAM) TGT AAT GAT GAG GGT GTC ACT GCG GTT (TAMRA)) est soumis à l'action du mélange ClipPhen-Cu /ascorbate. En se fragmentant, il laisse apparaître de la fluorescence à 520 nm car le fluorophore FAM se retrouve éloigné physiquement de l'extincteur de fluorescence TAMRA. L'apparition de fluorescence est mesurée au cours du temps à l'aide d'un fluorimètre (NucliSens EasyQ Analyser, Nasba Diagnostic, bioMérieux, Boxtel (NL)). L'expérience est effectuée avec des concentrations croissantes de DTT pour une concentration fixe de ClipPhen-Cu/ascorbate afin de mesurer l'inhibition apportée par le DTT par atténuation de la fluorescence émise.
Mode opératoire :
Une série de tubes contenant les éléments ci-dessous est mise à incuber à 370C pendant 5 minutes :
- 1 'oligonucléotide fluorigène 16025 à 10 nM (1 μl à 200 nM) ,
- le DTT (1 μl à une concentration telle pour être en suite de 1 à 16 mM dans le volume final), et
- 17 μl de tampon phosphate 80 mM pH 7,2, MgCl2 20 mM, NaCl 100 mM.
On rajoute alors 1 μl d'un mélange ClipPhen-Cu/Ascorbate préparé de la façon suivante : 200 μM ClipPhen et 200 μM CuCl2 dans DMF/eau 50/50 et ascorbate 20 mM dans l'eau préparé extemporanément (à partir de solutions concentrées à 10 mM de ClipPhen-Cu et à 1 M d'ascorbate) .
Au final, les 20 μl de solution contiennent : 10 nM d 'oligonucléotide fluorigène, 10 μM clip-phen + Cu2+, 1 mM ascorbate et 0/1/3/5/10/16 mM de DTT.
Un témoin est également réalisé sans ascorbate et sans ClipPhen-Cu. On commence alors la mesure de la fluorescence émise pendant 60 minutes (Figure 2). Les conditions sont les suivantes : filtres exc/em (485/518 nm) , intervalle de temps (1 min), temps d'intégration (100 ms).
A partir des courbes obtenues, on mesure la vitesse de la réaction de fragmentation sur les 2 premières minutes de la réaction et on trace le graphe, Figure 3, représentant la vitesse de fragmentation en fonction de la concentration en DTT.
Résultats et conclusions :
On constate que pour des concentrations croissantes en DTT, la fluorescence n'apparaît plus, et cela à partir de 10 mM (Figures 2 et 3). Ce qui signifie que l'activité du mélange ClipPhen-Cu/Ascorbate est totalement arrêtée par excès de réducteur. Cette expérience démontre que l'ajout de 10-16 mM de DTT au mélange acides nucléiques/CliPhen-Cu/Ascorbate permet d'arrêter la réaction et de rendre ce mélange compatible avec une future utilisation dans une réaction d ' amplification .
Exemple 3 : Effet décontaminant de la CliPhen dans une solution aqueuse.
But :
Décontamination d'une solution aqueuse contaminée par un mélange d'ARN totaux de B. Cereus à hauteur de 200 équivalent cellule/μl soumise à l'action du mélange ClipPhen-Cu/ascorbate (50 μM / 500 μM) pendant 30 minutes. L'activité de la ClipPhen-Cu est ensuite totalement arrêtée par ajout de DTT à hauteur de 10 mM. On effectue alors sur ce mélange une réaction d'amplification NASBA (Nuclisens Basic Kit V2 de bioMérieux, référencé 60079136, Boxtel (NL)) pour évaluer l'efficacité de la fragmentation et montrer l'absence d'acides nucléiques amplifiables . Il n'est pas nécessaire d'effectuer sur ce mélange une purification préalablement à l'amplification. Un témoin est effectué dans lequel l'activité de la ClipPhen-Cu est inhibée dès tO afin de mesurer l'éventuel effet inhibiteur de cette dernière. Pour cela on ajoute le DTT en conditions suffisantes (10 mM) avant d'ajouter la cible ARN et on maintient une incubation de 30 minutes .
Mode opératoire :
Décontamination par le mélange ClipPhen-Cu/ascorbate d'une solution aqueuse enrichie en ARN totaux.
A une solution d'ARN totaux d'ARN de B. Cereus (5 μl à 2000 équivalent Cellule/μl dans l'eau) sont ajoutés 10 μl de
ClipPhen-Cu (250 μM dans eau/DMF 50/50) 20 μl d'eau et 10 μl d'ascorbate à 2,5 mM dans l'eau.
On incube cette solution à décontaminer pendant 30 minutes à température ambiante.
Arrêt de l'activité de fragmentation du mélange ClipPhen-
Cu/ascorbate .
On rajoute 5 μl de DTT à 173,7 mM (concentration finale DTT :
17,3 mM) à la solution précédente pour arrêter la réaction d'hydrolyse et désactiver la ClipPhen. On obtient la solution
A. Témoin pour montrer que le mélange ClipPhen-Cu/Ascorbate/DTT n'a pas d'activité de fragmentation et n'inhibe pas la NASBA si l'activité de fragmentation est immédiatement arrêtée par l'ajout de DTT.
Parallèlement est réalisée une expérience témoin dans laquelle une solution d'ARN totaux d'ARN de B. Cereus (5 μl à 2000 équivalent Cellule/μl dans l'eau) est incubée en présence de 5 μl de DTT à 173,7 mM, 10 μl de ClipPhen-Cu (250 μM dans eau/DMF 50/50, 20 μl d'eau et 10 μl d'ascorbate à 2,5 mM dans l'eau). On incube cette solution dans laquelle le mélange ClipPhen-Cu/ascorbate est immédiatement inactivé pendant 30 minutes à température ambiante.
Cette expérience permet de mesurer l'éventuelle inhibition de la réaction d'amplification par le mélange ClipPhen- Cu/ascorbate/DTT. Il s'agit de la solution B.
Amplification des acides nucléiques restant dans la solution A après décontamination et toujours présent dans la solution B. On prélève alors 5 μl des solutions A ou B auxquelles on rajoute, 10 μl du mélange « Reactif Mix : REAG » (du NucliSens EasyQ Basic Kit bioMérieux (référence commerciale 285006, Boxtel (NL) ) . Ce mélange contient les réactifs nécessaires à l'amplification , les deux amorces et la sonde nécessaire à la détection de l'amplification. Cette solution contient en outre suffisamment de DTT (6 mM) pour empêcher une réactivation de la ClipPhen. La concentration finale du mélange est donc de 10 mM en DTT. Les solutions sont mises à incuber 2 minutes à 650C puis 2 minutes à 410C.
On rajoute alors aux solutions précédentes 5 μl du mélange « Enzyme Mix : ENZ» du Basic Kit NucliSens bioMérieux afin de commencer l'amplification. Le milieu réactionnel est maintenu lh30 à 410C dans le fluorimètre « NucliSens EasyQ » de bioMérieux (NucliSens EasyQ Analyser, Nasba Diagnostic, bioMérieux, Boxtel (NL)) . Les mesures de fluorescence sont enregistrées et les courbes tracées (Figure 4).
Résultats et conclusions :
On observe un léger décalage de la courbe B qui correspond au témoin ayant subit l'action du mélange ClipPhen-Cu/ascorbate immédiatement inhibée par ajout de la solution de DTT. Ce décalage de l'amplification ne change en rien la sensibilité du test puisque les pentes au démarrage de l'amplification sont de même amplitude. Il est dû à une augmentation de la concentration en DTT par rapport au témoin positif (Courbe A) . On montre dans ce cas que le mélange ClipPhen-Cu/ascorbate/DTT n'a pas d'effet sur la NASBA et que les enzymes de cette réaction d'amplification ne sont pas affectées par ce mélange de composés. De plus, on montre également que le DTT permet l'inhibition de l'activité de fragmentation de la ClipPhen-Cu puisqu 'aucune activité de dégradation n'est notée quand on rajoute suffisamment de DTT.
La courbe C montre que si l'activité du mélange ClipPhen- Cu/ascorbate est maintenue pendant 30 minutes puis stoppée par ajout de DTT (17 mM) , la fragmentation est telle que l'on ne décèle plus de courbe d'amplification.
On démontre ici que l'on peut utiliser un mélange complexe (ClipPhen-Cu/ascorbate) pour dégrader des acides nucléiques, arrêter cette activité par ajout d'un excès de DTT et utiliser cette solution (sans purification) pour une amplification enzymatique ultérieure. Cette technique permet donc avec une grande facilité de s'affranchir de problèmes de contamination par des acides nucléiques.
Exemple 4 : Fragmentation par la ClipPhen-Cu d'acides nucléiques autres que l'ARN ; application à l'ADN simple brin, 1 'ADN double brin à 1 'ARN double brin et un hétéroduplex ARN/ADN.
But :
Cet exemple démontre que le mélange ClipPhen-Cu/ascorbate peut aussi bien dégrader de l'ARN ou de l'ADN simple brin que les duplex ou hétéroduplex correspondants.
Mode opératoire :
On prépare les solutions indiquées dans le tableau ci dessous à partir d'oligonucléotides fluorigènes (les sondes) et de cibles complémentaires commandés chez Eurogentec (Tableau 1) .
Coππnentaires Ref ODN Séquence Modification 5' Modification 3'
ADN sonde 16025 TGT AAT GAT GAG GGT GTC ACT GCG GTT 6-FAM TAMRA fluorigène
ARN sonde 16027 UGU AAU GAU GAG GGU GUC ACU GCG GUU 6-FAM TAMRA fluorigène
ADN cible 16026 AAC CGC AGT GAC ACC CTC ATC ATT ACA complémentaire
ARN cible 16028 AAC CGC AGU GAC ACC CUC AUC AUU ACA complémentaire
Tableau 1 : Séquences utilisées dans l'exemple 4.
Les solutions mères d'oligonucléotides fluorigènes sont à 200 nM dans l'eau que l'on dilue à 10 nM (1 μl) dans 18 μl de tampon phosphate 80 mM pH 7,2, MgCl2 20 mM, NaCl 100 mM. Selon les cas, la cible complémentaire est ajoutée à la même concentration. Les solutions sont alors dénaturées et laissées à 370C pendant une heure afin de permettre l'hybridation des deux brins. On rajoute alors une solution de Cliphen-Cu (1 μl à 20 μM dans eau/DMF, [ClipPhen-Cu finale] = 1 μM) puis une solution d'ascorbate (1 μl à 2 mM dans l'eau, [ascorbate finale] = 100 μM) , sauf dans les témoins, avant de commencer la mesure de la fluorescence à l'aide de l'EasyQ (bioMérieux Cf exemple 1) pendant 120 minutes à 370C. Ces mesures sont répétées quatre fois ainsi que les expériences témoin correspondantes ne contenant pas d'ascorbate. Seule la valeur moyenne est représentée sur les figures 5, 6 et 7.
Figure imgf000028_0001
Tableau Mélanges d'oligonucléotides utilisés dans
1 'exemple 4.
Résultats et conclusions :
On observe sur la figure 5 le résultat de la mesure de fluorescence au cours du temps d'un simple brin ADN fluorigène (16025, courbe a) ou ARN fluorigène (16027, courbe b) soumis à l'action du mélange ClipPhen-Cu/ascorbate . On observe dans les deux cas une augmentation de fluorescence très nette en comparaison aux témoins (courbes c et d) . Cette apparition de fluorescence démontre que l'ADN est fragmenté aussi bien que l'ARN et à une vitesse comparable pendant les premiers instants de la réaction.
La figure 6 montre la fragmentation d'un duplex ADN/ADN. Lors de la formation du duplex ADN/ADN (courbes a et b) nous observons que le niveau de fluorescence est augmenté d'un facteur 6 par rapport au témoin simple brin (courbes c ou d) . Cette augmentation n'est pas due à la ClipPhen-Cu mais à l'hybridation entre les 2 brins. Dès l'ajout d'ascorbate, on observe une diminution de fluorescence de la courbe b qui rejoint le niveau de fluorescence de la courbe d correspondant à la fluorescence émise par le simple brin totalement clivé. La modification de la fluorescence par rapport aux témoins démontre bien que le simple brin ADN et le double brin ADN/ADN sont clivés de façon absolument comparable.
Nous avons enfin évalué la différence de vitesse de fragmentation selon que les acides nucléiques à fragmenter sont de l 'ADN ou de 1 'ARN double brin ou un hétéroduplex ARN/ADN (Figure 7) . On observe dans ce cas, pour les 3 témoins et comme dans la Figure 6, une augmentation de fluorescence dès la formation des duplex puis, lors de la fragmentation induite par l'ajout d'ascorbate, une diminution de fluorescence rejoignant le niveau de fluorescence d'un simple brin totalement clivé.
Dans tous les cas et quelle que soit la nature de l'hybride, la fragmentation a lieu, montrant que le mélange ClipPhen-Cu /Ascorbate est parfaitement adapté à la dégradation de n'importe quel type d'acides nucléiques.
Exemple 5 : Effet décontaminant d'une molécule de fragmentation immobilisée sur un support solide
But : Immobiliser la ClipPhen sur un support solide et démontrer le maintien de son activité après l'immobilisation sur billes de polystyrène Tentagel (référence commerciale MB 250 002, Rapp Polymers, Germany)
Mode opératoire :
Placer 61,5mg de billes TentaGel Macrobeads NH2 (référence commerciale MB 250 002 Rapp Polymers, Germany) dans une colonne Snap Fit (ABI, USA) ou une colonne Handee Centrifuge (référence 69705 Pierce, USA) soit n=16,6μmol. Laver les billes avec du diméthyl sulfoxyde (DMSO) anhydre afin d'enlever toute trace éventuelle d'eau. Soutirer le DMSO. Passer sous un flux d'argon. Percoler 14μL de triéthylamine (6eq, 99 μmol, ≈150mM) dans 600μL de DMSO anhydre (1min) . Cette étape permet de s'assurer que les groupements aminés sont bien sous la forme NH2 et non NH3 +. Soutirer la solution de triéthylamine . Percoler 36,4mg de disuccinimidyl suberate (DSS) (6eq, 99 μmol, «250mM, Pierce) dans 400μL de DMSO anhydre (10 min). Soutirer la solution contenant le DSS en excès. Un test à la ninhydrine sur quelques billes prélevées à ce stade de la réaction permet de s'assurer que l'ensemble des fonctions aminés ont réagi avec le linker. Si ce n'est pas le cas, les billes se colorent en bleu.
Percoler pendant Ih minimum (Ihl5-lh3θ) à température ambiante un mélange réactionnel contenant : la 3-ClipPhen (2,8eq, 45μmol, 56 mM) , 4-Dimethylaminopyridine (2,8eq, 45μmol, 56mM) , 6,3μL de triéthylamine (2,8eq, 45μmol, 56mM) dans 800μL de DMSO.
Il est possible de prélever quelques μL de mélange réactionnel avant et après réaction afin de déterminer le taux de fonctionnalisation des billes par dosage différentiel en UV à 328nm. Le mélange réactionnel a une coloration brune due à la 3-ClipPhen. Laver au DMSO anhydre jusqu'à disparition de cette coloration brune de la solution de lavage.
Les billes initialement jaunâtres présentent une couleur jaune légèrement plus foncée après réaction. Ajouter 5,9 μL d'éthanolamine (10 eq, 99 μmol « 13OmM) dans 800μL de DMSO anhydre, afin d'inactiver tous les groupements NHS n'ayant pas réagi. Laisser agir 10 minutes. Laver les billes 5 fois avec ImL de DMSO, soutirer le DMSO. Refaire la même opération avec de 1 'acétonitrile (afin de pouvoir sécher les billes). Passer sous un flux d'argon puis évaporer avec un évaporateur rotatif .
Complexation au cuiyre.
Percoler pendant 10 minutes ImL d'une solution de CuCl2 IM dans DMSO/eau 50/50 (Sur 55mg de billes, soit 145 équivalents par rapport au taux de fonctionnalisation) . Laver au DMSO et à l'eau jusqu'à ce que la solution de lavage soit incolore (si la solution CuCl2 initiale était colorée) puis à 1 ' acétonitrile . Passer sous un flux d'Argon. Sécher avec un évaporateur rotatif.
Test de clivage.
Le test de clivage est réalisé comme suit : la quantité souhaitée de résine, entre lmg et une seule bille soit une quantité de ClipPhen introduite de 125nmol/12, 5mM pour la TentaGel, (soit une quantité de ClipPhen introduite de 1,25 à 2, 5nmol/125μM à 250μM) est introduite dans un tube Eppendorf (contenance maximale 200μL) . La cible ARN (transcrits ARN 16s de 1600 bases, concentration entre 6 et 70ng/μL selon les expériences) est ajoutée sur la résine, de même que l'ascorbate à la concentration souhaitée (5mM). Les échantillons ont un volume total de lOμL, le tampon utilisé est un tampon tris à pH=7,4, de concentration finale 2OmM. Une seule bille de résine TentaGel suffit à l'observation du clivage. Des échantillons témoins « cible seule » (electrophoregramme A figure 8), « cible en présence d'ascorbate » (electrophoregramme B), « cible en présence de résine » couplée au complexe ClipPhen-Cu sont réalisés. Le témoin « cible en présence d'ascorbate » permet de contrôler que la quantité d'ascorbate utilisée n'a pas d'effet sur la fluorescence. Les échantillons ainsi préparés sont mis à agiter 30 minutes à température ambiante (1000 rpm) avant d'être déposé sur puce Agilent RNA 6000 Nano ((Kit commercial référencé 5067-1512, Agilent, USA) selon la cible utilisée. lμL de surnageant suffit à l'analyse sur Bioanalyseur (Agilent, USA) .
Résultats et conclusions : Les résultats obtenus et représentés sur la figure 8 (Electrophoregramme C) montrent qu'il y a bien clivage de la cible considérée en une demi heure, uniquement en présence d'ascorbate, pour une quantité de résines minimales (1 seule bille pour la TentaGel, soit en considérant qu'lmg de résine contient entre 50 et 100 billes, une quantité de ClipPhen supportée comprise entre 1,25 et 2,5 nmol, soit une concentration comprise entre 125 et 250μM) . Ce clivage est très facilement observable sur le modèle ARN, puisque les fragments générés sont visibles sur 1 'electrophoregramme (Electrophoregramme C) .
On démontre ainsi que la ClipPhen immobilisée est encore active et a conservée ses propriétés de dégradation des acides nucléiques .
Exemple 6 : Démonstration de la décontamination d'une solution contenant des acides nucléiques contaminants et des acides nucléiques d'intérêt
But : Eliminer les contaminants « ADN cellulaire génomique » se trouvant dans le surnageant d'une culture virale sans dégrader des acides nucléiques viraux présents en plus petite quantité et protégés par une capside virale. Ceci dans le but de diminuer les amplifications non spécifiques qui se font à partir de l'ADN cellulaire sans inhiber l'amplification spécifique de la cible d'intérêt.
Pour cela on dose avant et après action du mélange ClipPhen- Cu/ascorbate la concentration d'ADN 18S génomique dans le surnageant (kit commercial de dosage Search LC + ADN génomique, Promega, réf G3041, USA) pour la réalisation d'une gamme de dilution. On dose en parallèle la concentration en ARN viral avant et après action du mélange ClipPhen-Cu/ascorbate, par PCR avec des primers spécifiques et un dosage au Light Cycler . SybrGreen (Roche, USA) Mode opératoire :
Des cellules infectées par un virus sont mises en culture. Dans une expérience témoin on dose dans le surnageant l 'ADN génomique résiduel (18S) avec le Kit Search LC (Entrée B du tableau ci-dessous). On mesure également au Light Cycler (Roche) la quantité d'acides nucléiques correspondant au virus (technique d'amplification avec des primers spécifiques) (Entrée B du tableau ci-dessous).
Dans une autre expérience (Entrée A du tableau ci-dessous) on soumet le surnageant à l'action du mélange ClipPhen- Cu/ascorbate (ClipPhen-Cu lOOμM, Ascorbate 50 mM, 30 min, inactivation au DTT avec 2,5M final) pendant 30 minutes, puis on mesure la quantité d'ADN génomique résiduel (18S) et la quantité d'acides nucléiques correspondant au virus.
Entrée
Figure imgf000033_0001
Résultats et conclusions :
On constate que dans le cas où le surnageant a été traité avec l'agent de clivage la concentration en ADN génomique est 10 fois plus faible (Entrée A) sans que la concentration en acide nucléique viral ne soit affectée de façon conséquente.
Cette technique permet donc d'augmenter la sensibilité du dosage des acides nucléiques viraux en réduisant le bruit de fond de façon notable.

Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode de décontamination d'une solution de tout acide nucléique présent dans cette solution comprenant les étapes suivantes :
- soumettre, pendant une durée suffisante, la solution à l'action d'au moins une molécule de fragmentation, formée par un complexe constitué de deux molécules de 1,10- phénanthroline associé à un atome métallique formant le complexe bis ( 1, 10-phénanthroline) /métal, jusqu'à la dégradation totale desdits acides nucléiques, et
- arrêter l'activité de la molécule de fragmentation par un ajout :
• d'un excès de réducteur organique, ou
• d'un agent complexant, tel que l'EDTA.
2. Méthode de décontamination d'une solution, contenant des acides nucléiques contaminants et des acides nucléiques d'intérêt, comprenant les étapes suivantes :
- soumettre, pendant une durée suffisante, la solution à l'action d'au moins une molécule de fragmentation formée par un complexe constitué de deux molécules de 1,10- phénanthroline associé à un atome métallique formant le complexe bis ( 1, 10-phénanthroline) /métal, et ce jusqu'à la dégradation desdits acides nucléiques contaminants tout en conservant les acides nucléiques d'intérêt, et
- arrêter l'activité de la molécule de fragmentation par un ajout :
• d'un excès de réducteur organique, ou
• d'un agent complexant, tel que l'EDTA.
3. Méthode, selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que la méthode comprend, après l'arrêt de l'activité de la molécule de fragmentation, une étape supplémentaire qui consiste en une réaction d'amplification .
4. Méthode, selon l'une quelconque des revendications 1 à
3, caractérisée en ce que le métal est un métal de transition tel que le cuivre, le ruthénium, le nickel, le fer, le zinc, le rhodium, le cobalt, le manganèse.
5. Méthode, selon l'une quelconque des revendications 1 à
4, caractérisée en ce que les deux noyaux phénanthroline de la molécule de fragmentation sont reliés l'un à l'autre par un bras de liaison pour former une molécule ClipPhen.
6. Méthode, selon la revendication 5, caractérisée en ce que le bras de liaison entre les deux noyaux phénanthroline est constitué par une chaîne de trois atomes de carbone successifs, dont l'atome de carbone en position centrale est substitué et dont chaque atome de carbone terminal est relié à un noyau phénanthroline par un atome d'oxygène.
7. Méthode, selon la revendication 6, caractérisée en ce que l'atome de carbone en position centrale est substitué par -NH2 ou -NH-CO-CH3, et que chaque atome de carbone terminal est relié à un noyau phénanthroline par un atome d'oxygène en position 2 ou 3 dudit noyau.
8. Méthode, selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisée en ce que la molécule ClipPhen est une 3-ClipPhen ( ( 1, 3-bis ( 1, 10-phenanthrolin-3-yloxy) propan- 2-amine) .
9. Méthode de décontamination d'une solution de tout acide nucléique présent dans cette solution consistant à soumettre, pendant une durée suffisante, la solution à l'action de la molécule ClipPhen/métal, et ce jusqu'à la dégradation totale desdits acides nucléiques, dits acides nucléiques contaminants.
10. Méthode de décontamination d'une solution, contenant des acides nucléiques contaminants et des acides nucléiques d'intérêt consistant à soumettre, pendant une durée suffisante, la solution à l'action de la molécule ClipPhen/métal et ce jusqu'à la dégradation desdits acides nucléiques contaminants tout en conservant les acides nucléiques d'intérêt.
11. Méthode, selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que la molécule de fragmentation est un complexe cuivreux de type I associé à du peroxyde d'hydrogène H2O2 et, éventuellement, à un autre réducteur, préférentiellement organique.
12. Méthode, selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que la molécule est un complexe cuivrique de type II associé, préférentiellement , à un autre réducteur organique.
13. Méthode, selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que le réducteur, selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, ou l'autre réducteur, selon l'une quelconque des revendications 11 ou 12, est un réducteur organique constitué par :
• un thiol, tel que le di-thiothréitol (DTT), un thio-acide, tel que l'acide mercapto-propionique ou • un acide carboxylique ou
• un dérivé d'un acide carboxylique tel que l'ascorbate ou
• une phosphine comme la tri carboxy ethyl phosphine (TCEP), ou
• une combinaison d'au moins deux de ces réducteurs organiques.
14. Méthode, selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que la molécule de fragmentation est immobilisée sur un support solide.
15. Méthode, selon l'une quelconque des revendications 1 à
14, caractérisée en ce que le réducteur, selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, ou l'autre réducteur, selon l'une quelconque des revendications 11 ou 12, est immobilisé sur un support solide.
16. Méthode, selon l'une quelconque des revendications 14 ou
15, caractérisée en ce que le support solide est une particule, une membrane, une bandelette, un film ou un filtre.
17. Méthode, selon l'une quelconque des revendications 11 ou 12, caractérisée en ce que le rapport entre la molécule de fragmentation et l'autre réducteur organique, constitué par un acide carboxylique ou un dérivé d'un tel acide, est compris entre 1 pour 1 et 1 pour 100.
18. Méthode, selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, dans laquelle le rapport entre ladite molécule de fragmentation et le réducteur, selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, constitué par un thiol, est supérieur à 1 pour 100, et préférentiellement supérieur à 1 pour 1000.
19. Méthode, selon l'une quelconque des revendications 1 à
18, caractérisée en ce que la solution contient tous les constituants nécessaires à une réaction d'amplification à l'exception des acides nucléiques, soit :
• des cibles,
• des amorces d'amplification, et
• des sondes de détection.
20. Méthode, selon l'une quelconque des revendications 1 à
19, caractérisée en ce que les acides nucléiques traités sont de 1 'ARN ou de l'ADN, se présentant sous forme simple ou double brin, ainsi que les hétéroduplexes ARN/ADN.
21. Méthode, selon l'une quelconque des revendications 1 à 19, caractérisée en ce que la durée du traitement subie par les acides nucléiques traités est comprise entre 5 et 60 minutes préférentiellement entre 10 et 30 minutes pour des concentrations en ClipPhen/métal comprises entre 1 μM et 100 μM.
22. Utilisation d'une solution traitée, par une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 21, caractérisée en ce que la solution est mélangée avec un échantillon biologique contenant des acides nucléiques cibles, que l'on souhaite amplifier, mais également les amorces d'amplification et les sondes de détection spécifiques des acides nucléiques cibles en présence du réducteur organique, selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, créant ainsi un excès de réducteur organique, ce qui arrête l'action des molécules de fragmentation .
23. Utilisation, selon la revendication 22, caractérisée en ce que le réducteur organique, selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, est identique à l'autre réducteur organique, selon l'une quelconque des revendications 11 ou 12.
24. Utilisation, selon la revendication 22, caractérisée en ce que le réducteur organique, selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, est différent de l'autre réducteur organique, selon l'une quelconque des revendications 11 ou 12.
PCT/FR2008/050540 2007-03-30 2008-03-28 Méthode de décontamination d'une solution des acides nucléiques indésirables WO2008132412A2 (fr)

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