JP5681483B2

JP5681483B2 - 望ましくない核酸の溶液を汚染除去する方法

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Publication number: JP5681483B2
Application number: JP2010501563A
Authority: JP
Inventors: グローシアパランオス−バッカラ，; アランローラン，; アリラアユーン，
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 2007-03-30
Filing date: 2008-03-28
Publication date: 2015-03-11
Anticipated expiration: 2028-03-28
Also published as: US20100086976A1; CN101646785B; WO2008132412A3; FR2914317A1; ES2539817T3; JP2010523098A; FR2914317B1; CN101646785A; WO2008132412A2; EP2129804B1; EP2129804A2

Description

本発明は望ましくない核酸の溶液を汚染除去する方法に関する。また、本発明は、上記の処理された溶液の使用に関する。

分子生物学の進歩は、核酸を操作することを可能にした。従って、増幅方法は不可欠なツールになり、それは多数の核酸が比較的短時間に、非常に少ない量の核酸から生産できることを意味する。このような技術の主な欠点は望ましくない核酸の増幅にあり、臨床検査の間違った結果または偽陽性さえ生じる。これは混入と呼ばれる。

この混入は、実験台、スタッフ、環境、器材及びピペット装置の不十分な清掃または未滅菌サンプルという多くの原因に由来しうる。

この混入を制限することを目的とする一定数の提案が呈されてきた。それらは、例えば、サンプルの取扱い（特定の殺菌技術）または実験室装置（物理的に定義された作業面積、換気フードの使用、流れが所望の方向に常に排出されるようにするための、外部と内部との間の気圧勾配など）に関する予防的方法である。

また、混入は先行する増幅に由来するアンプリコン又はサンプル間の交差汚染によってもたらされる。

混入の他の無視できない原因は、増幅反応において使用する出発原料（酵素、試薬）にある。そのため、Corless等(J Clin Microbiol, 38(5), 1747-1752 (2000))は、１６ＳＲＮＡの検出のためのリアルタイムＰＣＲ感度における汚染されたｔａｑポリメラーゼによって生じる問題を述べている。

増幅に不可欠な酵素の混入を改善する第１の方法には、酵素による汚染除去方法にある。

そのため、米国特許US-A5-418149は、酵素を産生する細胞に由来する核酸を分解することができる、ウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼを使用する方法を記載する。その技術は、ウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼ及びデオキシウリジン・トリホスファターゼ（ｄＵＴＰａｓｅ）が不足している大腸菌細胞における所望のタンパク質（この場合ポリメラーゼ）の過剰発現を利用する。ＵＮＧ欠乏のため、細胞は、取り込まれたデオキシ・ウラシル塩基を除去しない。ｄＵＴＰａｓｅの欠乏のため、細胞でデオキシウリジンの貯留が増える。そのため、培養培地は、所望のタンパク質（ポリメラーゼ）の生産及び核酸へのデオキシウリジンの取込みを可能にする。次に、合成されたタンパク質は、標準的な精製技術を用いて、残存核酸のウラシル残基を断片化するウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼによる処理によって精製される。次に、グリコシラーゼは、増幅反応の間、標的ＤＮＡの破壊を妨げるために、熱によって不活性化される。

その方法は組換えタンパク質の生産に特異的であり、したがって、その主な欠点はその使用による。更に、汚染除去はウラシルを含む核酸に限られている。最後に、他のあり得る欠点は、熱処理がウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼの部分的な失活のみ誘発することである。タンパク質と接触させられる標的ＤＮＡは、そのためにおそらくは破壊される。
Ashkenas等(Biotechniques; Jul 2005; 39(1): 69-73)によって記載された他の酵素的方法は、増幅のために不可欠な全ての成分を含む溶液を汚染除去することから成る。この場合、制限酵素の混合がＲＴ−ＰＣＲの場面において使われる。それらの酵素は、増幅される標的ＲＮＡを含む増幅反応媒体中に存在する二本鎖ＤＮＡを分解する。次に、逆転写が起こる場合、それらは熱によって不活性化される。また、その方法のＰＣＲ適用のための変形例、すなわち二本鎖標的ＤＮＡがある場合が、記載されているが、それは単一種類の制限酵素（type IIS RE）の使用に限定される。しかしながら、制限酵素の使用は、二本鎖核酸のみを切断し、加えてそれが認識部位を有しなければならない欠点で劣っている。このために、一本鎖の形状および／または当該部位を少数しか持たないかまたは有しない汚染物は、これにより除去されない。

他の酵素による汚染除去方法は、標的核酸と接触させる前に溶液から望ましくない核酸を除去することから成る。特許出願WO-A-99/07887は、標的核酸と接触させる前に反応媒体に含まれる二本鎖核酸を分解させることができる熱不安定性のＤＮＡｓｅの使用を記載する。次に、酵素は熱によって失活される。

その技術の主な欠点は、この酵素がＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖の形の汚染物を分解することができないということである。
更に、反応媒体中の熱によるその酵素の失活は、耐熱性ポリメラーゼの使用を必要とする。
また、従来技術も非酵素的な方法で処理する。

したがって、Mohammadi等(J Clin Microbiol, Oct 2003; 41(10): 4796-8)は、抽出試薬のカラム濾過、及び任意に増幅前にＰＣＲ試薬を制限酵素、Ｓａｕ３ＡＩ、によって消化することからなる技術を記載する。濾過技術の欠点は、この技術が濃度あるいは特性を変えることなしに複合媒体に適用できないという事実にある。更に、このような補足的な濾過工程は、それ自身が混入の原因となりうる。

特許出願WO-A-94/12515は、Ｔａｑポリメラーゼ及び核酸が潜在的に混入している核酸を含む溶液の光反応性化合物による処理方法を記載する。その光反応性化合物、例えばフロクマリン誘導体は、紫外線暴露によって活性化される。その技術による主な欠点は、使用が困難であることの他に、タンパク質への放射線の悪影響である。更に、前記核酸のランダム分解のために、その方法は有効性が低いままであり、おそらくは増幅される断片をも生じる。

Chang等(RNA, May 2005; 11(5): 831-6)によって記載された他の非酵素的な方法は、翻訳を阻害するコバルト錯体を用いる。この錯体は、ＤＮＡ及びＲＮＡのリン酸ジエステル結合を加水分解する。

この技術による主な欠点は、核酸の不完全な分解及び遅い汚染除去反応（２４時間）である。

また、金属錯体は、核酸によって汚染された生体分子を精製するために、特許出願WO-A-2006/034009に記載されている。したがって、銅原子と結合した２つのフェナントロリン分子によって構成された断片化錯体（ビス（１，１０−フェナントロリン）／Ｃｕ）をｔａｑポリメラーゼを含む溶液を精製するために用いた。次に、その溶液は混入している核酸および／または断片化分子を除去するために標準クロマトグラフィー技術を使用して精製された。

その方法による主な欠点は、その使用を難しい状態にし、新しい混入のリスクを増す精製工程の存在である。

特許EP-B0-646180は、金属キレートを使用するヌクレオチド配列を不活性化する方法を記載する。ビス（１，１０−フェナントロリン）／Ｃｕのような断片化錯体は、増幅工程の後、核酸の全てが存在する溶液を汚染除去するために用いられた。これは、前の増幅反応に由来するアンプリコンによる新規なサンプルの混入を妨げることができる。また、上記文献は、生物学的産物調製物を汚染除去するための断片化分子の使用を記載する。

第１の使用の場合、その方法の主な欠点は、前の増幅反応に由来するアンプリコン以外の混入している核酸の全てを分解させることができるというわけでないということである。第２の場合、主な欠点は、その使用を難しい状態にし、新しい混入のリスクを増やす精製工程（限外ろ過、沈殿、クロマトグラフィー）の存在である。

従来技術の欠点を考慮して、発明者は、望ましくない核酸の溶液を汚染除去するために単純で迅速な新規方法を提案する。
これに関連して、第１の態様において、本発明は方法を溶液に存在する任意の核酸を前記溶液から汚染除去する方法であって、
・充分な時間、溶液を、断片化によって核酸を分解させる特性を有する少なくとも一種類の分子（断片化分子と呼ぶ）の作用に、前記核酸（混入している核酸と呼ぶ）が完全に分解するまで供すること；及び
・断片化分子の活性を止める工程を
含む方法を提供する。

本発明の利点の１つは、この汚染除去方法が断片化分子を除去するための精製工程を必要としないということである。

処理される核酸は、一本鎖または二本鎖形態のＲＮＡまたはＤＮＡであり、並びにＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖である。

この方法は、特に出発材料、例えばバクテリアのような天然源由来の酵素を汚染除去するために有用である。これらの酵素は、前記バクテリアに由来する天然核酸によって非常に汚染される。

別の態様においては、本発明は興味の核酸と混入している核酸とを含む溶液を汚染除去する方法であって、上記の工程、すなわち：
・充分な時間、溶液を、断片化によって核酸を分解させる特性を有する少なくとも一種類の分子（断片化分子と呼ぶ）の作用に、前記混入している核酸が分解するまで供し、一方で興味のある核酸を保護すること；
・断片化分子の活性を止める工程を
含む方法を提供する。

混入している核酸はヒトゲノムＤＮＡであってもよく、興味の核酸は非常に少ない量で混合物に存在するウイルスまたはバクテリアの核酸であってもよい。前記興味の核酸は、断片化分子の作用から保護されることができる。例えば、それらは外殻（キャプシド、細菌壁など）によって自然に保護されていてもよいが、混入している核酸はそうでない。

本発明のある有利な実施態様において、断片化分子の活性を止めた後に、方法は増幅反応を含む追加工程を含む。

好ましくは、本発明の汚染除去方法は、使用する断片化分子が、混入している核酸のリン酸ジエステル結合を無作為に加水分解する特性を有することを特徴とする。

ある実施態様によれば、断片化分子は、ビス（１，１０−フェナントロリン）／金属錯体を形成する金属原子と結合した１，１０−フェナントロリンの２分子によって構成された錯体である。好ましくは、金属は、銅、ルテニウム、ニッケル、鉄、亜鉛、ロジウム、コバルトまたはマンガンなどの遷移金属である。

有利には、断片化分子の２つのフェナントロリン核は、結合アームを介して互いに結合し、ＣｌｉｐＰｈｅｎ分子を形成する。

ＣｌｉｐＰｈｅｎ分子は、文献に広く記載されている。さまざまな結合アームは、２つのフェナントロリン核を結合する。有利には、２つのフェナントロリン核間の結合アームは、３つの連続した炭素原子の鎖によって構成され、その中心位置の炭素原子が置換され、各々の末端炭素原子が酸素原子を介してフェナントロリン核に結合している（例えば、セリノール）。好ましくは、中心位置の炭素原子は-ＮＨ_２または-ＮＨ-ＣＯ-ＣＨ_３によって置換され、各々の末端炭素原子は前記核の位置２または３において酸素原子を介してフェナントロリン核に結合している。

例えば、多くの他の結合は、ジアミノシクロヘキサン(Chemistry Letters, vol 33, no. 6, p 684-985, Hayashi等)またはエタンジオール、プロパンジオールまたはペンタンジオール(Synlett 2001, no. 10, 1629-1631, Boldron等)であってもよい。

また、金属と結合したＣｌｉｐＰｈｅｎ分子の断片化活性は、当業者に知られている(Chemical Review, 1993, 93, 2295-2316, D Sigman等; J Chem Soc 1961, 2007-2019, James等)。この分子は、その加水分解特性を改善する目的で、多くの研究で調べられている。それは、全ての核酸、すなわち一本鎖または二本鎖形態のＤＮＡ及びＲＮＡ、並びにＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖を分解させる利点がある。したがって、２−ＣｌｉｐＰｈｅｎ／金属（（１，３−ビス（１，１０−フェナントロリン−２−イルオキシ）プロパン−２−アミン）／金属）及び３−ＣｌｉｐＰｈｅｎ／金属（（１，３−ビス（１，１０−フェナントロリン−３−イルオキシ）プロパン−２−アミン）／金属）は、ビス（１，１０−フェナントロリン）／金属錯体と比較して非常に増大されたヌクレアーゼ活性を呈した(Inorganic Chemistry 1998, 3486-3489, Pitie等; Chem Commun 1998, 2597-2598, Pitie等; Eur J Inorg Chem 2003, 528-540, Pitie等及び Bioconjugate Chemistry 2000, 11, 892-900, Pitie M 等)。同様に、銅と錯体を形成したＣｌｉｐＰｈｅｎ分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡのリン酸ジエステル結合を、非常に効果的に無作為に加水分解することができる。Jame等(J Chem Soc 1961, 2007-2019)の文献に開示されているように、銅原子と錯体を形成し、酸化状態ＩまたはＩＩで錯体を形成する。分子２−ＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ及び３−ＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕを下に示す：

したがって、本発明は、また、溶液を、混入している核酸が完全に分解するまでの充分な時間、ＣｌｉｐＰｈｅｎ／金属分子の作用に供することからなる、溶液に存在する任意の核酸を前記溶液から汚染除去する方法に関する。

更なる態様において、本発明は、混入している核酸が分解するまでの充分な時間、ＣｌｉｐＰｈｅｎ／金属分子の作用に供し、一方で興味の核酸を保護することからなる、興味の核酸と混入している核酸とを含む溶液を汚染除去する方法にある。

本発明のある実施態様によれば、断片化分子の断片化活性は、過剰の有機還元剤を加えることによって止められる。有機還元剤がチオールによって構成される場合、断片化分子と反応を止める有機還元剤との間の比率は１：１００を超え、好ましくは１：１０００を超える。

この実施態様の１つ利点は、断片化分子がインサイツで不活性化させられることである。したがって、これらの分子は溶液から除去される必要はない。後者は、例えば増幅のようなさまざまな適用において使用できる。
したがって、ある有機還元剤の濃度に依存して、断片化分子は活性化または不活性化されてもよい。

本発明の他の実施態様によれば、断片化分子の断片化活性を、ＥＤＴＡのようなも錯化剤（ＣＡ）、またはＣｌｉｐＰｈｅｎよりも金属に親和性を有する他の任意の錯化剤であって、平衡：

を移動させることができる錯化剤を加えることによって停止させる。

本発明のある特定の実施態様において、断片化分子は、過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）、場合によっては他の還元剤（好ましくは有機）と結合した銅（Ｉ）錯体である。好ましくは、断片化分子はＣｌｉｐＰｈｅｎ／ＣｕＩ分子である。

銅（Ｉ）錯体の場合、ヌクレアーゼ活性は、２段階で進行する：
ａ）正に荷電した銅錯体が核酸と錯体を形成する；
ｂ）核酸は、Ｈ_２Ｏ_２によるＣｕ−ｏｘｏまたはＣｕ−ＯＨ中間体の形成によって酸化され、一連の反応の後、核酸の切断に結果としてなる。

他の実施態様によれば、分子は他の還元剤と結合した銅（ＩＩ）錯体であり、好ましくは有機的である。この場合、過酸化水素は、空気の作用と還元剤のもとで、インサイツに生じる。さらに好ましくは、断片化分子はＣｌｉｐＰｈｅｎ／Ｃｕ（ＩＩ）分子である。

他の有機還元剤がカルボキシル酸またはその酸の誘導体である場合、断片化分子と有機還元剤との比率は１：１と１：１００の間の範囲にある。
上記の実施態様に関して、有機還元剤は、
・ジチオスレイトール（ＤＴＴ）のようなチオール、メルカプトプロピオン酸のようなチオ酸；または
・カルボキシル酸；または
・アスコルベートのようなカルボキシル酸の誘導体；または
・トリカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）のようなホスフィン
によって構成される。

特定の実施態様において、断片化分子および／または還元剤は、固体支持体に固定される。この固体支持体は、ラテックス（場合により磁性）、ガラス（ＣＰＧ）、シリカ、ポリスチレン、アガロース、セファロース、ナイロンなどの粒子であってもよい。また、それはフィルタ、膜、ストリップまたはフィルムであってもよい。

断片化分子および／または還元剤が固定された固体支持体が溶液から取り除かれた場合も、断片化分子の断片化活性は、止められうる。

断片化分子は、検討される支持体上に、共有結合形成によって又は吸着によって、固定されてもよい。支持する試薬に関する多くの文献が存在し；特にLaurent等(Tetrahedron Letters 45, 8883-8887, 2004)を参照することができる。

本発明が従来技術に勝る他の利点は、核酸が受ける反応の速度である。処理期間は、５分から６０分の範囲の間であり、好ましくは１０分から３０分の間であり、ＣｌｉｐＰｈｅｎ／金属分子の濃度は１ｎＭから１００μＭの範囲である。

本発明の好適な態様において、溶液は、核酸を除いた増幅反応のために必要な全ての成分、すなわち標的、増幅プライマー及び検出プローブを含む。

また、本発明は、本発明に従って処理された溶液の使用であって、有機還元剤の存在下で、前記溶液を、増幅される標的核酸を含む生物試料、更に標的核酸に特異的な増幅プライマー及び検出プローブと混合し、それにより断片化分子の作用を止める有機還元剤の過剰が作成される、使用に関する。

断片化分子の作用を止める有機還元剤は、断片化分子のヌクレアーゼ反応を活性化するために加えられた他の有機還元剤と同一でも異なっていてもよい。

(定義)
「核酸」なる用語は、少なくとも２つのデオキシヌクレオチド又はリボヌクレオチドの連なりを意味する。
核酸は天然または合成、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸断片、ゲノムＤＮＡ、リボソームＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、トランスファーＲＮＡまたは以下のような酵素による増幅技術によって得られる核酸でもよい：
・特許US-A4-683195、US-A4-683202及びUS-A4-800159に記載のＰＣＲ（ポリメラーゼ鎖反応）、及びその派生的なＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）であって、特に特許EP-B0-569272に記載のワンステップ型のもの；
・例えば特許出願EP-A0-201184号に記載のＬＣＲ（ライゲーズ鎖反応）；
・例えば特許出願WO-A-90/01069に記載のＲＣＲ（修復鎖反応）；
・特許出願WO-A-90/06995の３ＳＲ（自己維持配列増幅法）；
・特許出願WO-A-91/02818のＮＡＳＢＡ（核酸ベース増幅法）；および
・特許US-A5-399491のＴＭＡ（転写仲介増幅法）。
「アンプリコン」なる用語は、酵素増幅技術によって作成される核酸を意味するために使用する。
「任意の核酸」なる用語は、一本鎖または二本鎖形態のＲＮＡまたはＤＮＡ、並びにＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖を意味する。

「断片化分子の活性を止める」なる用語は：
・過剰の有機還元剤を加えること；または
・錯化剤を加えることを意味する。
「分解」なる用語は、混入している核酸の少なくとも９０％の分解または断片化を意味する。好ましくは、分解は「完全な」と呼ばれ、それは、ＤＮＡまたはＲＮＡの分解によって、好ましくはリン酸ジエステル結合の加水分解によって、「増幅可能でない」核酸配列の形成を生じることを意味する。
「増幅可能でない」核酸なる用語は、少なくとも１０ヌクレオチドの好適なサイズを有するプライマーの存在下で増幅できない核酸を意味する。したがって、これらの「増幅可能でない」核酸のサイズは、２０ヌクレオチド未満であり、好ましくは１０ヌクレオチドより少ない。
「溶液」なる用語は、均質であるか不均一な水溶液を意味する。酵素、有機分子（３リン酸ヌクレオシド、糖類、単糖類、多糖類、有機小分子など）、無機分子（塩類など）を混合物またはその他としてを含む複合溶液（a complex solution）であってもよい。また、溶液は、ラテックス（場合により磁性）、ガラス（ＣＰＧ）、シリカ、ポリスチレン、アガロース、セファロース、ナイロンなどから形成されうる粒子のような固体支持体を含んでもよい。また、フィルター、フィルム、膜またはストリップであってもよい。
また、溶液は、プラスチックチューブ（エッペンドルフ型）のような固体表面と接触している溶液によって構成されてもよく、それにより、前記表面の汚染除去が可能となる。
添付の図と実施例は、特定の実施態様を示すものであり、本本発明の範囲を制限するために考慮されるべきでない。

３７℃で１時間のＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ／アスコルベート混合物の作用に供した１０８０塩基の転写産物（野生型サルモネラ）の分解のバイオアナライザー研究（Agilent, RNA 6000 Pico Kit, USA)。カラム２、３、４、６及び７の３１秒に位置する黒いバンドは、１０８０塩基の転写産物に対応する。カラム１：ヌクレオチド・サイズスケール。バイオアナライザー検出器の前を通過する時間を関数として、分析核酸のサイズの定量及び計算を可能にする、一連の増加するＲＮＡサイズの注入。縦軸上の測定単位は１秒である。通過時間と核酸の質量の間の変換は、バイオアナライザー・ソフトウェアによって行われる。カラム２：５μＭ（マイクロモル）のＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕの存在下における５ｎＭ（ナノモル）転写産物。カラム３：５００ｎＭのＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕの存在下における５ｎＭ転写産物。カラム４：５０ｎＭのＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕの存在下における５ｎＭ転写産物。カラム５：５００μＭのアスコルベートを添加した同上のカラム２。カラム６：５０μＭのアスコルベートを添加した同上のカラム３。カラム７：５μＭのアスコルベートを添加した同上のカラム４。ＤＴＴ濃度の増加（０から１６ｍＭ）よる核酸の断片化の阻害。曲線Ａは、０ｍＭのＤＴＴに対応する。曲線Ｂは、１ｍＭのＤＴＴに対応する。曲線Ｃは、３ｍＭのＤＴＴに対応する。曲線Ｄは、５ｍＭのＤＴＴに対応する。曲線Ｅは、１０ｍＭのＤＴＴに対応する。曲線Ｆは、１６ｍＭのＤＴＴに対応する。曲線Ｇは、コントロール：０ｍＭのＤＴＴと０ｍＭのアスコルベートに対応する。混合物のＤＴＴの濃度に応じたモデル蛍光性オリゴヌクレオチドの断片化の比率（分ごとの相対的蛍光単位（ＲＦＵ））核酸を含む水溶液上のＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ／アスコルベート混合物の効果（１００細胞当量／μｌのセレウス菌（B cereus）のトータルＲＮＡ）。曲線Ａは、何の処理も受けなかった増幅コントロールに対応する（＋コントロール）。曲線Ｂは、５０μＭのＣｌｉｐＰｈｅｎＣｕ／５００μＭのアスコルベート混合物であって、その活性が１７ｍＭのＤＴＴの添加によって直ちに阻害され、そして３０分間インキュベートされたものに対応する。曲線Ｃは３０分間インキュベートされ、この時間の後にＤＴＴで断片化を止めた５０μＭのＣｌｉｐＰｈｅｎＣｕ／５００μＭのアスコルベート混合物に対応する。ＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ（アスコルベートを有するものと有しないもの）によるＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡの断片化の比較。曲線は１に正規化した。曲線ａ：ＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ／アスコルベート混合物の作用に供した蛍光性オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）Ｎｏ．１６０２５。曲線ｂ：ＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ／アスコルベート混合物の作用に供した蛍光性オリゴヌクレオチド（ＲＮＡ）Ｎｏ．１６０２７。曲線ｃ：実験ａ：ＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ／アスコルベート混合物の作用に供した蛍光性オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）Ｎｏ．１６０２５のためのネガティブコントロール。曲線ｄ：実験ｂのＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ／アスコルベート混合物の作用に供した蛍光性オリゴヌクレオチド（ＲＮＡ）Ｎｏ．１６０２７のためのネガティブコントロールＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ混合物（アスコルベートを有するものと有しないもの）による一本鎖のまたは二本鎖ＤＮＡ断片化の比較。曲線は、分ごとの蛍光の増加（ＲＦＵ／分）に対応する断片化速度を表す。曲線ａ：ＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ混合物の作用に供した蛍光性オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）Ｎｏ．１６０２５／相補ＤＮＡ標的（Ｎｏ．１６０２６）二重鎖（ネガティブコントロール）。曲線ｂ：ＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ／アスコルベート混合物の作用に供した蛍光性オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）Ｎｏ．１６０２５／相補ＤＮＡ標的（Ｎｏ．１６０２６）二重鎖。曲線ｃ：ＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ混合物の作用に供した蛍光性オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）Ｎｏ．１６０２５（ネガティブコントロール）。曲線ｄ：ＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ／アスコルベート混合物の作用に供した蛍光性オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）Ｎｏ．１６０２５。ＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ（アスコルベートを有するものと有しないもの）によるＤＮＡまたはＲＮＡ二重鎖、ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖の断片化の比較。曲線は１に正規化した。曲線ａ：ＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ混合物の作用に供した蛍光性オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）Ｎｏ．１６０２５／相補ＤＮＡ標的（Ｎｏ．１６０２６）二重鎖（ネガティブコントロール）。曲線ｂ：ＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ混合物の作用に供した蛍光性オリゴヌクレオチド（ＲＮＡ）Ｎｏ．１６０２７／相補ＲＮＡ標的（Ｎｏ．１６０２８）二重鎖（ネガティブコントロール）。曲線ｃ：ＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ／アスコルベート混合物の作用に供した蛍光性オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）Ｎｏ．１６０２５／相補ＤＮＡ標的（Ｎｏ．１６０２６）二重鎖。曲線ｄ：ＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ／アスコルベート混合物の作用に供した蛍光性オリゴヌクレオチド（ＲＮＡ）Ｎｏ．１６０２７／相補ＤＮＡ標的（Ｎｏ．１６０２８）二重鎖。曲線ｅ：ＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ混合物の作用に供した蛍光性オリゴヌクレオチド（ＲＮＡ）Ｎｏ．１６０２７／相補ＤＮＡ標的（Ｎｏ．１６０２６）ヘテロ二重鎖（ネガティブコントロール）。曲線ｆ：ＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ／アスコルベート混合物の作用に供した蛍光性オリゴヌクレオチド（ＲＮＡ）Ｎｏ．１６０２７／相補ＤＮＡ標的（Ｎｏ．１６０２６）ヘテロ二重鎖。５ｍＭのアスコルベートの存在下における、Ｔｅｎｔａｇｅｌビーズに固定されたＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕによる１６ｓＲＮＡ（１３ｎｇ／μＬ）の切断のバイオアナライザー（Agilent）による計測。電気泳動図Ａ：水中の分解の前のＲＮＡ標的。電気泳動図Ｂ：アスコルベートの存在下における、分解前のＲＮＡ標的。電気泳動図Ｃ：Ｔｅｎｔａｇｅｌ樹脂に固定されたＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕおよびアスコルベートの存在下における、分解されたＲＮＡ標的（１ビーズのＴｅｎｔａｇｅｌ、３０分）。

実施例１：ＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ分子による転写産物の加水分解とアスコルベートの開始剤効果
（目的）
この実施例は、モデル核酸（サルモネラＲＮＡ転写産物：１０８０塩基）上のＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ／アスコルベート混合物の断片化作用を示す。また、断片化反応の開始におけるアスコルベートの効果を示す。転写産物は、さまざまな濃度のＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ／アスコルベート混合物の作用に供された。また、コントロールは、アスコルベートの非存在下でＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕの作用を受けた。
次に、断片は、Agilent社のバイオアナライザーを使用して分析された（図１）。
（操作の手順）
転写産物の溶液（サルモネラ野生型、１０８０塩基）は、２μｌの１μＭ濃度の転写産物水溶液と１８μｌの８０ｍＭ（ミリモル）のリン酸バッファー（１００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＭｇＣｌ_２、ｐＨ７．２）から構成された。７０℃で２分間加熱し、次に氷に入れた。
次に、この溶液の５μｌに、１μｌのＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ（５００、５０及び５μＭ）と上で使用したバッファーを４μｌ加えた。得られた溶液２は３７℃に１時間置いた。
次に、５μｌの溶液２を取り、４２．５μｌのバッファー及び２．５μｌの新しく調製したアスコルベート溶液（［ＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ］につき１００ｅｑ）を加え、コントロールの場合は水を加えた。
したがって、一連のチューブは、それぞれ５ｎＭの転写産物、（５μＭ、５００ｎＭ及び５０ｎＭ）のＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ、（５００、５０及び５μＭ）のアスコルベート、または対照ための水を含んで成るように、調製された。
直ちに、１μｌの６つの溶液は、断片化産物を測定するために、RNA6000 Pico chip（参照番号5067-1512にて市販されるキット、Agilent社、米国、バイオアナライザーシステムで使用される）に注入された。
（結果と結論）
転写産物、カラム５から７、における断片化の効果は、２０ヌクレオチド（右側２０秒上の矢）より下の、さまざまなサイズを有するバンドの出現により観察された。したがって、ＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ／アスコルベート混合物による処理を受けた転写産物は、ＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕの濃度に応じて、部分的にまたは完全に分解した。５μＭと０．５μＭとの間の当初バンドの消失が観察された。全てのアンプリコンの完全な分解を得るための反応時間は、５ｎＭの転写産物、５μＭのＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ及び５００μＭのアスコルベートについて、３０−６０分のオーダーであった。転写産物の完全分解のためのＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕの量は、マイクロモル濃度のオーダーであった（カラム５）。
対照的に、アスコルベートなしで行われた同じ実験（カラム２）は、完全なバンドをはっきりと示した。
したがって、これは、アスコルベートが添加されなかった場合、ＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ混合物が活性を有しないことを証明する（１−１００等価量のオーダーの過剰）。

実施例２：還元剤によるＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ分子の阻害
（目的）
この実施例は、ＤＴＴのような還元剤の過剰量を添加することによって、ＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ／アスコルベート混合物による核酸の分解が完全に阻害できることを示すことを目的とする。
モデルの蛍光性オリゴヌクレオチド（Eurogentec（リェージェ、ベルギー）によって合成された配列１６０２５：５’（６−ＦＡＭ）ＴＧＴＡＡＴＧＡＴＧＡＧＧＧＴＧＴＣＡＣＴＧＣＧＧＴＴ（ＴＡＭＲＡ））はＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ／アスコルベート混合物の作用に供した。断片化によって、ＦＡＭフルオロフォアがＴＡＭＲＡ蛍光エクスティングウィッシャーから物理的に離れていたので、蛍光が５２０ｎＭに出現した。蛍光の出現は、蛍光光度計（NucliSens EasyQアナライザー、Nasba Diagnostic、ビオベリュー、Boxtel(NL))を使用して、時間で測定された。
実験は、放出された蛍光の弱化によって、ＤＴＴにより与えられた阻害を測定するために、ＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ／アスコルベートの固定濃度に対しＤＴＴの濃度を増加させて実施した。
（操作の手順）
下記の成分を含む一連のチューブは、３７℃で５分間インキュベートした：
・蛍光性オリゴヌクレオチド１６０２５、１０ｎＭ（１μｌから２００ｎＭ）；
・ＤＴＴ（最終濃度の１から１６ｍＭのシリーズを作成するため濃度を１μｌ）；及び
・１７μｌの８０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．２、２０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１００ｍＭのＮａＣｌ）。
次に、以下の通りに調製された１μｌのＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ／アスコルベート混合物を添加した：２００μＭのＣｌｉｐＰｈｅｎ及び２００μＭのＣｕＣｌ２１ＭのＤＭＦ／水（５０／５０）溶液、及び２０ｍＭのアスコルベート水溶液を、（１０ｍＭのＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ及び１Ｍのアスコルベート濃縮液から）即座に調製した。
最終的に、２０μｌの溶液は：１０ｎＭの蛍光性オリゴヌクレオチド、１０μＭのＣｌｉｐＰｈｅｎ＋Ｃｕ２^＋、１ｍＭのアスコルベートと０／１／３／５／１０／１６ｍＭのＤＴＴを含む。
また、コントロールは、アスコルベート無し及びＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ無しで作成した。次に、放出された蛍光は、６０分以上測定された（図２）。条件は、以下の通りだった：ｅｘｃ／ｅｍフィルター（４８５／５１８ｎＭ）、時間間隔（１分）、積分時間（１００ミリ秒）。
得られた曲線を使用して、反応の最初の２分にわたる断片化反応速度を測定し、ＤＴＴ濃度に応じた断片化速度を表すグラフ（図３）をトレースした。
（結果と結論）
ＤＴＴの濃度が増大した場合の、蛍光が１０ｍＭからもはや出現しなかったことが分かる（図２及び３）。これは、ＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ／アスコルベート混合物の活性が過剰な還元剤によって完全に止められることを意味する。この実験は、核酸／ＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ／アスコルベート混合物への１０−１６ｍＭのＤＴＴの添加が反応を止め、この混合物が増幅反応における将来的な使用に適合する状態になることを証明する。

実施例３：水溶液中のＣｌｉｐＰｈｅｎの除去効果：
(目的)
３０分間のＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ／アスコルベート混合物（５０μＭ／５００μＭ）の作用に供した、２００細胞当量／μｌの量のセレウス菌（B cereus）のトータルＲＮＡが混入した水溶液の汚染除去。次に、ＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕの活性は、１０ｍＭ量のＤＴＴの添加によって、完全に止められた。次に、ＮＡＳＢＡ増幅反応（Nuclisens Basic Kit V2、ビオメリュー、参照60079136、Boxtel(NL)）を、断片化効率を評価し、増幅可能な核酸の欠如を示すために実行された。この混合物の増幅の前に精製を実行する必要はなかった。後者の任意の阻害効果を測定するために、ＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕの活性がｔ０から阻害されたコントロールを作成した。この目的において、ＤＴＴは、標的ＲＮＡを加える前に、十分条件（１０ｍＭ）で添加され、３０分間インキュベートされた。
(操作の手順)
[トータルＲＮＡについて濃縮された水溶液のＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ／アスコルベート混合物による汚染除去]
１０μｌのＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ（２５０μＭの水／ＤＭＦ（５０／５０）溶液）、２０μｌの水及び１０μｌの２．５ｍＭ濃度アスコルベート水溶液をセレウス菌由来のＲＮＡのトータルＲＮＡ溶液に加えた（５μｌの２０００細胞当量／μｌの水溶液）。
汚染除去されるこの溶液は、周囲温度で３０分間インキュベートされた。

[ＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ／アスコルベート混合物の断片化活性の停止]
５μｌの１７３．７ｍｍのＤＴＴ（最終ＤＴＴ濃度：１７．３ｍｍ）を加水分解反応を止めて、ＣｌｉｐＰｈｅｎを失活させるために、前記溶液に加えた。溶液Ａを得た。

[ＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ／アスコルベート／ＤＴＴ混合物が断片化活性を有しないこと及びＤＴＴの添加によって断片化活性が直ちに停止されるならばＮＡＳＢＡを阻害しないことを示すコントロール]
同時に、５μｌのＤＴＴ（１７３．７ｍＭ）、１０μｌのＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ（２５０μＭの水／ＤＭＦ（５０／５０）溶液）、２０μｌの水及び１０μｌのアスコルベート（２．５ｍＭ）水溶液の存在下でインキュベートされたセレウス菌由来のＲＮＡのトータルＲＮＡ溶液（５μｌの２０００細胞当量／μｌ水溶液）において、コントロール実験を実施した。ＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ／アスコルベート混合物が直ちに不活性化されたこの溶液は、周囲温度で３０分間インキュベートされた。
この実験は、ＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ／アスコルベート／ＤＴＴ混合物による増幅反応の何らかの阻害を測定するかもしれない。これは溶液Ｂである。

[汚染除去後に溶液Ａに残存する核酸及び溶液Ｂに依然として存在する核酸の増幅]
次に、５μｌの溶液Ａ又はＢを、１０μｌの「反応ミックス：ＲＥＡＧ」（NucliSens EasyQ Basic Kit、ビオメリュー、取引参照番号２８５００６、Boxtel(NL)）に取った。この混合物は、増幅のために必要な試薬、２つのプライマー、増幅の検出のために必要なプローブを含んでいた。また、この溶液も、ＣｌｉｐＰｈｅｎの再活性化を妨げるために、充分なＤＴＴ（６ｍＭ）を含んでいた。したがって、混合物の最終濃度は、１０ｍＭのＤＴＴであった。溶液は、６５℃で２分間、それから４１℃で２分間、インキュベートされた。
次に、NucliSens EasyQ Basic Kit（ビオメリュー）の５μｌの「酵素ミックス：ＥＮＺ」混合物を、増幅を開始するために、前記溶液に加えた。反応媒体は、ビオメリューの「Nuclisens EasyQ」蛍光計に、４１℃で１時間３０分間、保持した。蛍光測定は記録され、曲線がトレースされた（図４）。
(結果と結論)
ＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ／アスコルベート混合物の作用に供されて、ＤＴＴ溶液の添加によって直ちに阻害されたコントロールに対応する曲線Ｂで、わずかな遅延が観察された。増幅開始の傾斜が同じ振幅の中にあるので、増幅におけるこの遅延は全くテストの感受性を変えない。それは、ポジティブコントロール（曲線Ａ）に対するＤＴＴの濃度の増加による。この場合、ＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ／アスコルベート／ＤＴＴ混合物がＮＡＳＢＡに影響を及ぼさないこと、及びこの増幅反応のための酵素がこの化合物の混合物に影響されないことが示された。更に、また、充分なＤＴＴが添加された場合は、少しの分解活性も記録されなかったので、ＤＴＴがＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕの断片化活性の阻害を可能にすることが示された。
曲線Ｃは、ＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ／アスコルベート混合物の活性が３０分間維持されて、次にＤＴＴ（１７ｍＭ）の添加により停止されるが、断片化は増幅曲線がもはや遅延しないということを示す。
錯体混合物（ＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ／アスコルベート）が核酸を分解するために使用できること、この活性が過剰量のＤＴＴの添加によって停止できること、及びこの溶液（精製なし）は続く酵素による増幅に使用できることが証明された。したがって、この技術は、核酸による混入に関する問題を容易に解決することができる。

実施例４：ＲＮＡ以外の核酸のＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕによる断片化；一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡと二本鎖ＲＮＡに対するとＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖に対する適用：
(目的)
この実施例は、ＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ／アスコルベート混合物が一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ、並びに対応する二重鎖またはヘテロ二重鎖を分解できることを証明する。
(操作の手順)
下の表に示す溶液は、Eurogentec社から注文した蛍光性オリゴヌクレオチド（プローブ）と相補標的から調製された（表１）。
表１

蛍光性オリゴヌクレオチドの原液は、２００ｎＭ濃度の水溶液であり、それは、１８μｌの８０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．２、２０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１００ｍＭのＮａＣｌ）に、１０ｎＭ（１μｌ）で希釈された。相補標的は、このケースに応じて、同じ濃度で加えられた。それから、溶液は変性され、２つの鎖がハイブリザイズすることを可能にするために、３７℃で１時間に置いた。次に、ＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕの溶液（１μｌの２０μＭの水／ＤＭＦ溶液、［最終ＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ］＝１μＭ）、次にアスコルベートの溶液（１μｌの２μＭ水溶液［最終アスコルベート］＝１００μＭ）を、コントロールを除いて、ＥａｓｙＱ（ビオメリュー、実施例１を参照）を使用して、蛍光測定を開始する前に、３７℃で１２０分間、加えられた。これらの測定は、アスコルベートを含んでいない対応するコントロール実験とともに、４回実行した。平均値のみを、図５、６及び７に示す。
表２

(結果と結論)
図５は、ＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ／アスコルベート混合物の作用に供した一本鎖蛍光性ＤＮＡ（１６０２５、曲線ａ）又は蛍光性ＲＮＡ（１６０２７、曲線ｂ）の、時間にわたる蛍光測定の結果を示す。いずれの場合においても、蛍光の非常に明確な増加が、コントロール（曲線ｃとｄ）と比較して観察された。この蛍光の出現は、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方が断片化され、反応の初めの瞬間の間は同程度の速度であったことを証明する。
図６は、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖の断片化を示す。ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖（曲線ａとｂ）の形成の間、蛍光のレベルが一本鎖コントロール（曲線ｃまたはｄ）と比較して６倍に増加することが観察される。この増加は、ＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕによるものではなく、２つの鎖の間のハイブリダイゼーションによる。アスコルベートが添加される瞬間から、曲線ｂの蛍光の減少が観察され、それは完全に切断された一本鎖によって放出される蛍光に対応する曲線ｄの蛍光のレベルに合う。コントロールと比較した蛍光の変化は、一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡ／ＤＮＡが完全に同程度の様式で切断されることを明確に示す。
最後に、我々は、断片化される核酸が二本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖であるかどうかに関する、断片化速度の違いを評価した（図７）。この場合では、３つのコントロールに対し、図６に示すように、アスコルベートの添加によって誘導された断片化の間、二重鎖の形成に由来する蛍光の増加、次に完全に切断された一本鎖の蛍光のレベルに合う蛍光の減少が観察される。
全ての場合において、ハイブリッドの性質に関係なく、断片化が起こり、ＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ／アスコルベート混合物が任意の種類の核酸の分解に完全に適していることを示す。

実施例５：固体支持体に固定された断片化分子の汚染除去効果
(目的）
ＣｌｉｐＰｈｅｎを固体支持体上に固定すること、及びその活性がＴｅｎｔａｇｅｌポリスチレンビーズ（取引参照番号MB 250 002、Rapp Polymers、ドイツ）上に固定化の後に維持されることを証明すること。
（操作の手順）
６１．５ｍｇのＴｅｎｔａｇｅｌＮＨ_２マクロビーズ（取引参照番号MB250 002、Rapp Polymers、ドイツ）をスナップフィットカラム（ＡＢＩ、米国）またはＨａｎｄｅｅ遠心カラム（参照番号69705、Pierce、米国）中に置いた。すなわちｎ＝１６．６μｍｏｌ。ビーズは、水の考えられる何らかのトレースを取り除くために、無水のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）によって洗われた。ＤＭＳＯは抽出された。それは、アルゴン流れ中に置かれた。６００μｌの無水ＤＭＳＯ（１分）中の１４μｌのトリエチルアミン（６ｅｑ、９９μｍｏｌ、約１５０ｍＭ）は、浸透された。この工程は、アミン基が適切にＮＨ_２形態であって、ＮＨ_３ ^＋形態でないことを確かにする。溶液はトリエチルアミンによって抽出された。３６．４ｍｇのスベリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＳ）（６等価物、９９μｌ、約２５０ｍＭ、Pierce）は４００μｌの無水ＤＭＳＯ（１０分）に、浸透された。過剰量のＤＳＳを含む溶液は、抽出された。
ニンヒドリン試験は、全てのアミン基がリンカーと反応したことを確かめるために、反応のこの段階で、取り出した数個のビーズについて実行された。上記と異なる場合、ビーズは青色に変わる。
以下を含む反応混合物は、周囲温度で最低１時間（１時間１５分−１時間３０分）、浸透された：３−ＣｌｉｐＰｈｅｎ（２．８ｅｑ、４５μｍｏｌ、５６ｍＭ）、４−ジメチルアミノピリジン（２．８ｅｑ、４５μｍｏｌ、５６ｍＭ）、８００μｌのＤＭＳＯ中の６．３μｌのトリエチルアミン（２．８ｅｑ、４５μｍｏｌ、５６ｍＭ）。
３２８ｎｍのＵＶ下で差異アッセイによって、ビーズの機能付与の程度を決定するために、反応の前後で数μｌの反応混合物を除去することは可能である。反応混合物は、３−ＣｌｉｐＰｈｅｎによる茶色の呈色を有した。洗浄溶液の茶色の呈色が消えるまで、無水ＤＭＳＯによる洗浄が実施された。
最初に黄色がかったビーズは、反応の後、わずかにより暗い黄色を有した。８００μｌの無水ＤＭＳＯ中の５．９μｌのエタノールアミン（１０ｅｑ、９９μｍｏｌ、１３０ｍＭ）は、反応しなかった全てのＮＨＳ基を失活させるために加えられた。それは、１０分間、作用させた。ビーズは、１ｍｌのＤＭＳＯにより５回洗浄され、ＤＭＳＯにより抽出された。同じ操作は、（ビーズを乾燥させることを可能にするために）アセトニトリルで繰り返された。アルゴンによって洗い流され、それから回転乾燥機によって蒸発させた。
［銅による錯体生成］
１ＭのＣｕＣｌ２のＤＭＳＯ／水（５０／５０）溶液の１ｍｌを、（５５ｍｇのビーズ、すなわち機能付与の程度に関して１４５等価量に）１０分間浸透させた。（最初のＣｕＣｌ２溶液が有色だった場合）洗浄溶液が無色になるまで、ＤＭＳＯと水によって洗われ、次にそれからアセトニトリルで洗浄された。それは、アルゴンによって洗い流された。それは、回転乾燥機によって乾燥された。
［切断テスト］
切断テストは、以下の通りに実施された：樹脂の所望量、１ｍｇと単一のビードの間、すなわちＴｅｎｔａｇｅｌに対し１２５ｎｍｏｌ／１２．５ｍＭの導入されるＣｌｉｐＰｈｅｎ量（すなわち導入されるＣｌｉｐＰｈｅｎ量は１．２５ｎｍｏｌから２．５ｎｍｏｌ／１２５μＭから２５０μＭ）を、エッペンドルフチューブ（最大容量２００μＬ）に入れた。標的ＲＮＡ（１６００塩基の１６ｓＲＮＡ転写産物、実験に応じて６と７０ｎｇ／μｌとの間の濃度）を樹脂に加え、同様に所望の濃度（５ｍＭ）のアスコルベート（５ｍＭ）を加えた。サンプルは、総体積１０μｌを有した；使用するバッファーは、ｐＨ７．４のトリスバッファー（最終濃度２０ｍＭ）であった。
単一のビーズのＴｅｎｔａｇｅｌ樹脂は、切断を観察するために充分だった。ＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ錯体コントロール試料と結合した「標的単独」（図８の電気泳動図Ａ）、「アスコルベート存在下の標的」（電気泳動図Ｂ）、「樹脂存在下の標的」を作成した。「アスコルベート存在下の標的」コントロールは、使用するアスコルベートの量が蛍光に影響を及ぼさないという事実が確認できることを意味した。調製されたサンプルは、使用する標的により、Agilent RNA 6000 Nano chip（取引参照番号５０６７−１５１２の市販キット、Agilent）に置く前に、周囲温度（１０００ｒｐｍ）で３０分間攪拌した。１μｌの上清は、バイオアナライザー（Agilent、米国）上の解析に充分だった。
（結果と結論）
図８（電気泳動図Ｃ）に示される、得られた結果は、標的の切断が、最小量の樹脂（Ｔｅｎｔａｇｅｌのちょうど１ビーズ、すなわち、１ｍｇの樹脂が５０から１００ビーズを含むと仮定すると、１．２５から２．５ｎｍｏｌの範囲の担持されたＣｌｉｐＰｈｅｎの量、すなわち１２５から２５０μＭの範囲の濃度）に対し、アスコルベートの存在下においてのみ、３０分以内に実際に起こったことをしめす。
生じた断片が電気泳動図上に見えるので、この切断はＲＮＡモデルでは非常に容易に観察可能だった（電気泳動図Ｃ）。
したがって、固定されたＣｌｉｐＰｈｅｎが依然として機能的であって、核酸分解の特性を保持することが証明された。

実施例６：興味の核酸と混入している核酸とを含む溶液の汚染除去の例証
（目的）
興味の標的の特異的な増幅を阻害することなしに、細胞ＤＮＡから生じる非特異的増幅を減じる目的で、より少ない量で存在し、ウイルス・カプシドによって保護されているウイルス核酸を分解させることなしに、ウイルス培養株の上清にある「ゲノム細胞ＤＮＡ」混入物を除去すること。
このために、ＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ／アスコルベート混合物の作用の前後で、上清中のゲノム１８ＳＤＮＡの濃度は、希釈の範囲を作成するために、分析された（サーチＬＣ＋ゲノムＤＮＡ、市販のアッセイキット、プロメガ、参照番号Ｇ３０４１、米国）。同時に、ＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ／アスコルベート混合物の作用の前後のウイルスＲＮＡの濃度は、特異的プライマーを用いたＰＣＲによって分析され、ライトサイクラー、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ（ロシュ、米国）によって分析された。
（操作の手順）
ウイルスに感染している細胞は培養された。コントロール実験において、上清に残存するゲノムＤＮＡ（１８Ｓ）は、キット・サーチＬＣを用いて分析された（下記の表のエントリーＢ）。また、ウイルスに対応する核酸の量は、ライトサイクラー（ロシュ）を使用して測定された（特異的プライマーを使用する増幅技術）（下記の表のエントリーＢ）。
別の実験（下記の表のエントリーＡ）において、上清は３０分間、ＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ／アスコルベート混合物（１００μＭのＣｌｉｐＰｈｅｎ−Ｃｕ、５０ｍＭのアスコルベート、３０分、最終２．５ＭによるＤＴＴ失活）の作用に供され、次に残存するゲノムＤＮＡ（１８Ｓ）の量とウイルスに対応する核酸の量は測定された。

（結果と結論）
上清が切断剤で処理された場合において、ウイルス核酸の濃度が実質的に影響を受けずに、ゲノムＤＮＡの濃度が１０倍低いことが観察された（エントリーＡ）。
したがって、バックグラウンドノイズを実質的に減らすことによって、この技術は、ウイルス核酸を分析する感受性を増大することができる。

Claims

溶液に存在する任意の核酸を前記溶液から汚染除去する方法であって、該方法は
充分な時間、溶液を、ビス（１，１０−フェナントロリン）／金属錯体を形成する、金属原子と結合した１，１０−フェナントロリンの２分子によって構成された錯体によって形成された少なくとも一つの断片化分子の作用に、前記核酸が完全に分解するまで供する工程であって、前記金属原子が銅、ルテニウム、ニッケル、鉄、亜鉛、ロジウム、コバルトまたはマンガンから選択される工程；及び
過剰量の有機還元剤を加えることによって、断片化分子の分解作用を停止する工程を含んでなり、
該方法は断片化分子の分解作用を停止した後に、増幅反応からなる追加の工程を含み、該方法は断片化分子を除去するために精製の工程を必要としない、方法。
興味の核酸と混入している核酸とを含む溶液を汚染除去する方法であって、該方法は
充分な時間、溶液を、ビス（１，１０−フェナントロリン）／金属錯体を形成する金属原子と結合した１，１０−フェナントロリンの２分子によって構成された錯体によって形成された少なくとも一つの断片化分子の作用に、前記混入している核酸が分解するまで供する一方で、興味の核酸をウイルスのキャプシド又は細菌壁により保護し、該興味の核酸を断片化分子の分解作用から守る工程であって、前記金属原子が銅、ルテニウム、ニッケル、鉄、亜鉛、ロジウム、コバルトまたはマンガンから選択される工程；及び
過剰量の有機還元剤を加えることによって、断片化分子の分解作用を停止する工程を含んでなり、
該方法は断片化分子の分解作用を停止した後に、増幅反応からなる追加の工程を含み、該方法は断片化分子を除去するために精製の工程を必要としない、方法。
有機還元剤が、
・ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはメルカプトプロピオン酸；または
・カルボキシル酸；または
・カルボキシル酸の誘導体；または
・ホスフィン；または
・前記有機還元剤の少なくとも２つの組合せ
によって構成されることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
カルボキシル酸の誘導体がジチオスレイトール（ＤＴＴ）である、請求項３に記載の方法。
断片化分子の２つのフェナントロリン核が、ＣｌｉｐＰｈｅｎ分子を形成するために結合アームを介して互いに結合することを特徴とする、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
２つのフェナントロリン核間の結合アームは、３つの連続した炭素原子の鎖によって構成され、その中心位置の炭素原子が置換され、各々の末端炭素原子が酸素原子を介してフェナントロリン核に結合することを特徴とする、請求項５に記載の方法。
中心位置の炭素原子は-ＮＨ_２または-ＮＨ-ＣＯ-ＣＨ_３によって置換され、各々の末端炭素原子はフェナントロリン核の位置２または３において酸素原子を介して前記核に結合することを特徴とする、請求項６に記載の方法。
ＣｌｉｐＰｈｅｎ分子が３−ＣｌｉｐＰｈｅｎ（１，３−ビス（１，１０−フェナントロリン−３−イルオキシ）プロパン−２−アミン）であることを特徴とする、請求項５から７の何れか一項に記載の方法。
断片化分子は、過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）と結合した銅（Ｉ）錯体であることを特徴とする、請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
断片化分子は銅（ＩＩ）錯体であることを特徴とする、請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
銅（Ｉ）錯体又は銅（ＩＩ）錯体は他の有機還元剤と結合していることを特徴とする、請求項９又は１０に記載の方法。
前記他の有機還元剤が、
・チオール、チオ酸；または
・カルボキシル酸；または
・カルボキシル酸の誘導体；または
・ホスフィン；または
・前記有機還元剤の少なくとも２つの組合せ
によって構成される有機還元剤であることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
前記他の還元剤がカルボキシル酸またはカルボキシル酸の誘導体である、請求項１２に記載の方法。
カルボキシル酸の誘導体がアスコルベートであり、前記アスコルベートが断片化分子の分解作用の開始剤である、請求項１２又は１３に記載の方法。
断片化分子がＣｌｉｐＰｈｅｎ／銅錯体であり、還元剤がジチオスレイトール（ＤＴＴ）である、請求項１４に記載の方法。
断片化分子が固体支持体に固定されることを特徴とする、請求項１から１５の何れか一項に記載の方法。
請求項１から１０の何れか一項に記載の有機還元剤または請求項１１から１４の何れか一項に記載の他の有機還元剤が固体支持体に固定されることを特徴とする、請求項１から１６の何れか一項に記載の方法。
固体支持体が粒子、膜、ストリップ、フィルムまたはフィルターであることを特徴とする、請求項１６又は１７に記載の方法。
他の有機還元剤がカルボキシル酸または当該酸の誘導体である場合、断片化分子と前記他の有機還元剤との比率は１：１と１：１００との間の範囲にあることを特徴とする請求項１１から１４の何れか一項に記載の方法。
前記断片化分子と請求項１から１０の何れか一項に記載の有機還元剤の間の比率は１：１００を超えており、有機還元剤がチオールによって構成される、請求項１から１９の何れか一項に記載の方法。
溶液は、核酸を除いた増幅反応のために必要な全ての成分、すなわち：
・標的；
・増幅プライマー；および
・検出プローブ
を含むことを特徴とする、請求項１から２０の何れか一項に記載の方法。
処理される核酸が一本鎖または二本鎖形態のＲＮＡまたはＤＮＡ、並びにＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖であることを特徴とする、請求項１から２１の何れか一項に記載の方法。
核酸が少なくとも一の断片化分子の作用に供される期間は、５分から６０分の範囲の間であり、断片化分子の濃度は１μＭから１００μＭの範囲であることを特徴とする、請求項１から２２の何れか一項に記載の方法。
核酸が少なくとも一の断片化分子の作用に供される期間は、１０分から３０分の範囲の間であることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
前記他の有機還元剤が、請求項１から１０の何れか一項に記載の有機還元剤と同一であることを特徴とする、請求項１１から２４の何れか一項に記載の方法。
前記他の有機還元剤が、請求項１から１０の何れか一項に記載の有機還元剤と異なることを特徴とする、請求項１１から２４の何れか一項に記載の方法。