ES2539817T3 - Método de descontaminación de una solución de ácidos nucleicos indeseables - Google Patents
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Abstract
Método de descontaminación de una solución de cualquier ácido nucleico presente en esta solución, que comprende las etapas siguientes: - someter, durante un tiempo suficiente, la solución a la acción de al menos una molécula de fragmentación, formada por un complejo constituido por dos moléculas de 1,10-fenantrolina asociado a un átomo metálico que forma el complejo bis(1,10-enantrolina)/metal, en presencia de reductor orgánico, hasta la degradación total de dichos ácidos nucleicos, y - detener de la actividad de la molécula de fragmentación mediante la adición: * de un exceso de reductor orgánico, o * de un agente complejante, tal como EDTA.
Description
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Curva d: Oligonucleótido fluorígeno (ADN) n° 16025 sometido a la acción de la mezcla ClipPhen-Cu/ascorbato.
Figura 7: comparación de la fragmentación de dúplex ADN o ARN o de un héterodúplex ARN/ADN por la ClipPhen-Cu (con o sin ascorbato). Curvas normalizadas a 1. Curva a: Dúplex oligonucleótido fluorígeno (ADN) n° 16025 /diana complementaria ADN (n° 16026) sometido a la
acción de la mezcla ClipPhen-Cu (control negativo).
Curva b: Dúplex oligonucleótido fluorígeno (ARN) n° 16027 /diana complementaria ARN (n° 16028) sometido a la acción de la mezcla ClipPhen-Cu (control negativo). Curva c: Dúplex oligonucleótido fluorígeno (ADN) n° 16025 /diana complementaria ADN (n° 16026) sometido a la
acción de la mezcla ClipPhen-Cu/ascorbato.
Curva d: Dúplex oligonucleótido fluorígeno (ARN) n° 16027 /diana complementaria ARN (n° 16028) sometido a la acción de la mezcla ClipPhen-Cu/ascorbato. Curva e: Heterodúplex oligonucleótido fluorígeno (ARN) n° 16027 /diana complementaria ADN (n° 16026) sometido a
la acción de la mezcla ClipPhen-Cu (control negativo).
Curva f: Heterodúplex oligonucleótido fluorígeno (ARN) n° 16027 /diana complementaria ADN (n° 16026) sometido a la acción de la mezcla ClipPhen-Cu/ascorbato. Figura 8: Observación con Bioanalizador (Agilent) de la escisión del ARN 16s (13 ng/µl) por la ClipPhen-Cu
inmovilizada sobre una bola TentaGel en presencia de 5mM de ascorbato. Electroforegrama A: Diana ARN antes de la degradación en agua; Electroforegrama B: Diana ARN antes de la degradación en presencia de ascorbato; Electroforegrama C: Diana ARN degradada en presencia de ascorbato y de la ClipPhen-Cu inmovilizada sobre
resina Tentagel (1 bola de Tentagel, 30 min.); Ejemplo 1: hidrólisis de un transcrito por la molécula ClipPhen-Cu y efecto iniciador del ascorbato Objetivo: Este ejemplo demuestra la acción de fragmentación de la mezcla ClipPhen-Cu/ascorbato sobre un ácido nucleico
modelo (Transcrito ARN salmonela: 1080 bases). Demuestra también el efecto del ascorbato sobre la iniciación de la reacción de fragmentación. El transcrito está sometido a la acción de diferentes concentraciones de la mezcla ClipPhen-Cu/ascorbato. El control está sometido también a la acción de la ClipPhen-Cu pero en ausencia de ascorbato.
Los fragmentos son después analizados con la ayuda del Bioanalizador de Agilent (figura 1). Modo de realización: Una solución de transcrito (Salmonela salvaje 1080 bases) está constituida a partir de 2 μl de transcrito en 1 μM de
agua y de 18 μl de tampón fosfato 80 mM (milimolar) pH 7,2, MgCl2 20 mM, NaCl 100 mM. Esta solución es llevada
a 70ºC durante 2 minutos y después colocada en hielo. Se extraen entonces 5 μl de esta solución a la que se añade 1 μl de ClipPhen-Cu (500, 50 y 5µ M) y 4 µl del tampón utilizado anteriormente. Se obtiene la solución 2 que se deja durante 1h a 37ºC.
Se coge entonces 5 µl de la solución 2 y se añaden 42,5 µl de tampón y 2,5 µl de una solución de ascorbato recien
preparada (100 eq. con respecto a la [ClipPhen-Cu]) o de agua en el caso de los controles. Así, se queda con una serie de tubos que comprenden respectivamente 5 nM de transcrito, (5 µM, 500 nM y 50 nM) de ClipPhen-Cu y (500, 50 y 5 µM) de ascorbato o de agua para los controles.
Se inyectan inmediatamente 1 µl de las 6 soluciones sobre chip de ARN 6000 Pico (Kit comercial referenciado 50671512, Agilent, USA), utilizado sobre el sistema del BioAnalizador de Agilent ,USA) para observar los productos de fragmentación.
Resultados y conclusiones:
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Descontaminación de una solución acuosa contaminada por una mezcla de ARN total de B-Cereus a una cantidad de 200 equivalentes célula/μl sometida a la acción de la mezcla ClipPhen-Cu/ascorbato (50 μM/500 μM) durante 30 minutos. La actividad de la ClipPhen-Cu es después totalmente detenida por adición de DTT en una cantidad de 10 mM. Se efectúa entonces sobre esta mezcla una reacción de amplificación NASBA (Nuclisens Basic Kit V2 de bioMérieux, referenciado 60079136, Boxtel (NL)) para evaluar la eficacia de la fragmentación y mostrar la ausencia de ácidos nucleicos amplificables. No es necesario efectuar sobre esta mezcla una purificación previa a la amplificación. Se efectúa un control en el que la actividad de la ClipPhen-Cu es inhibida a partir de t0 a fin de medir el eventual efecto inhibidor de esta última. Para ello, se añade DTT en condiciones suficientes (10 mM) antes de añadir la diana ARN y se mantiene una incubación de 30 minutos.
Modo de realización:
Descontaminación por la mezcla ClipPhen-Cu/ascorbato de una solución acuosa enriquecida en ARN totales.
A una solución de ARN totales de ARN de B. Cereus (5 μl a 2000 equivalentes célula/μl en agua) se añaden 10 μl de ClipPhen-Cu (250 μM en agua/DMF 50/50), 20 μl de agua y 10 μl de ascorbato a 2,5 mM en agua.
Se incuba esta solución a descontaminar durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Detención de la actividad de fragmentación de la mezcla ClipPhen-Cu/ascorbato
Se añaden 5 μl de DTT a 173,7 mM (concentración final DTT: 17,3 mM) a la solución anterior para detener la reacción de hidrólisis y desactivar la ClipPhen. Se obtiene la solución A.
Control para demostrar que la mezcla ClipPhen-Cu/ascorbato/DTT no tiene actividad de fragmentación y no inhibe la NASBA si la actividad de fragmentación es inmediatamente detenida por adición de DTT.
Paralelamente, se realiza un experimento control en el que una solución de ARN total de ARN de B. Cereus (5 µl a 2000 equivalentes célula/µl en agua) se incuba en presencia de 5 µl de DTT a 173,7 mM, 10 µl de ClipPhen-Cu (250 µM en agua/DMF 50/50, 20 µl de agua y 10 µl de ascorbato a 2,5 mM en agua). Se incuba esta solución en la que la mezcla ClipPhen-Cu/ascorbato está inmediatamente inactivada durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Este experimento permite medir la eventual inhibición de la reacción de amplificación por la mezcla ClipPhen-Cu/ascorbato/DTT. Se trata de la solución B.
Amplificación de los ácidos nucleicos que quedan en la solución A después de la descontaminación y aún presente en la solución B.
Se extraen entonces 5 µl de las soluciones A o B a las que se añaden 10 µl de la mezcla “Reactif Mix: REAG” (de NucliSens EasyQ Basic Kit bioMérieux (referencia comercial 285006, Boxtel (NL)). Esta mezcla contiene los reactivos necesarios para la amplificación, los dos cebadores y la sonda necesaria para la detección de la amplificación. Esta solución contiene además suficiente DTT (6 mM) para impedir una reactivación de la ClipPhen. La concentración final de la mezcla es por lo tanto de 10 mM en DTT. Las soluciones se incuban durante 2 minutos a 65ºC y después durante 2 minutos a 41ºC.
Se añaden entonces a las soluciones anteriores 5 µl de la mezcla "Enzyme Mix: ENZ” de Basic Kit NucliSens bioMérieux a fin de comenzar la amplificación. El medio de reacción se mantiene durante 1h30 a 41°C en el fluorímetro “NucliSens EasyQ” de bioMérieux (NucliSens EasyQ Analyser, Nasba Diagnostic, bioMérieux, Boxtel (NL)). Las mediciones de fluorescencia se registran y se trazan las curvas (figura 4).
Resultados y conclusiones:
Se observa un ligero desplazamiento de la curva B que corresponde al control que ha sufrido la acción de la mezcla ClipPhen-Cu/ascorbato inmediatamente inhibida por adición de la solución de DTT. Este desplazamiento de la amplificación no cambia nada la sensibilidad del ensayo, ya que las pendientes al inicio de la amplificación son de la misma amplitud. Esto se debe a un aumento de la concentración en DTT con respecto al control positivo (curva A). Se muestra en este caso que la mezcla ClipPhen-Cu/ascorbato/DTT no tiene efecto sobre la NASBA y que las enzimas de esta reacción de amplificación no están afectadas por esta mezcla de compuestos. Además, se muestra también que el DTT permite la inhibición de la actividad de fragmentación de la ClipPhen-Cu puesto que no se señala ninguna actividad cuando se añade suficiente DTT.
La curva C muestra que si la actividad de la mezcla ClipPhen-Cu/ascorbato es mantenida durante 30 minutos y después detenida por adición de DTT (17 mM), la fragmentación es tal que la curva de amplificación ya no se retrasa. Se demuestra aquí que se puede utilizar una mezcla compleja (ClipPhen-Cu/ascorbato) para degradar unos ácidos nucleicos, detener esta actividad por adición de un exceso de DTT y utilizar esta solución (sin purificación) para una amplificación enzimática ulterior. Esta técnica permite por lo tanto con una gran facilidad superar
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problemas de contaminación por unos ácidos nucleicos.
Ejemplo 4: Fragmentación por la clipPhen-Cu de ácidos nucleicos distintos del ARN; aplicación con ADN monocatenario, ADN bicatenario a ARN bicatenario y un heterodúplex ARN/ADN 5 Objetivo:
Este ejemplo demuestra que la mezcla ClipPhen-Cu/ascorbato puede también degradar tanto el ARN como el ADN monocatenario como los dúplex o heteodúplex correspondientes. 10 Modo de realización:
Se preparan las soluciones indicadas en la tabla siguiente a partir de oligonucleótidos fluorígenos (sondas) y de dianas complementarias ordenadas en Aurogentec (Tabla 1). 15 Tabla 1: Secuencias utilizadas en el ejemplo 4.
- Comentarios
- Ref. ODN Secuencia Modificación 5' Modificación 3'
- ADN sonda fluorígena
- 16025 TGT AAT GAT GAG GGT GTC ACT GCG GTT 6-FAM TAMRA
- ARN sonda fluorígena
- 16027 UGU AAU GAU GAG GGU GUC ACU GCG GUU 6-FAM TAMRA
- ADN diana complementaria
- 16026 AAC CGC AGT GAC ACC CTC ATC ATT ACA - -
- ARN diana complementaria
- 16028 AAC CGC AGU GAC ACC CUC AUC AUU ACA - -
Las soluciones madres de oligonucleótidos fluorígenos son de 200 nM en agua que se diluyen con 10 nM (1 μl) de
18 μl de tampón fosfato 80 mM, pH 7,2, MgCl2 20 mM, NaCl 100 mM. Según los casos, la diana complementaria es 20 añadida a la misma concentración. Las soluciones son entonces desnaturalizadas y dejadas a 37ºC durante una
hora a fin de permitir la hibridación de las dos hebras. Se añade entonces una solución de Cliphen-Cu (1 µl a 20 µM
en agua/DMF, [ClipPhen-Cu final] = 1 µM), después una solución de ascorbato (1 µl a 2 mM en agua, [ascorbato
final]= 100 µM), salvo en los controles, antes de empezar la medición de la fluorescencia con la ayuda del EasyQ
(bioMérieux, véase el ejemplo 1) durante 120 minutos a 37ºC. Estas mediciones se repiten cuatro veces, así como 25 los experimentos control correspondientes que no contienen ascorbato. Sólo el valor medio se representa en las
figuras 5, 6 y 7.
Tabla 2: Mezclas de oligonucleótidos utilizados en el ejemplo 4.
- Mezcla ODN
- Molaridad (mM) en el tampón Cliphen.Cu (µM) Molaridad Ascorbato (mM)
- ADN sonda fluorígena
- 16025 10 1 0 100
- ARN sonda fluorígena
- 16027 10 1 0 100
- ADN/ADN
- 16025/16026 10/10 1 0 100
- ARN/ARN
- 16027/16028 10/10 1 0 100
- ARN/ADN
- 16027/16026 10/10 1 0 100
30 Resultados y conclusiones:
Se observa en la figura 5 el resultado de la medición de fluorescencia a lo largo del tiempo de un ADN fluorígeno monocatenario (16025, curva a) o ARN fluorígeno (16027, curva b) sometido a la acción de la mezcla ClipPhen
35 Cu/ascorbato. Se observa en los dos casos un aumento de la fluorescencia muy claro en comparación de los controles (curvas c y d). Esta aparición de fluorescencia demuestra que el ADN está fragmentado tanto como el ARN y a una velocidad comparable durante los primeros instantes de la reacción.
La figura 6 muestra la fragmentación de un dúplex ADN/ADN. Durante la formación del dúplex ADN/ADN (curvas a y
40 b) se observa que el nivel de fluorescencia está aumentado de un factor 6 con respecto al control monocatenario (curvas c o d). Este aumento no se debe a la Clip-Phen-Cu sino a la hibridación entre las 2 hebras. A partir del momento de la adición de ascorbato, se observa una disminución de fluorescencia de la curva b que se une al nivel de fluorescencia de la curva d correspondiente a la fluorescencia emitida por el monocatenario totalmente escindido. La modificación de la fluorescencia con respecto a los controles demuestra claramente que el ADN monocatenario y
45 el ADN/ADN bicatenario son escindidos de manera absolutamente comparable.
Finalmente, se ha evaluado la diferencia de velocidad de fragmentación según que los ácidos nucleicos a fragmentar sean ADN o ARN bicatenario o un heterodúplex ARN/ADN (figura 7). Se observa en este caso, para los 3 controles y como en la figura 6, un aumento de fluorescencia a partir de la formación de los dúplex y después, durante la
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fragmentación inducida por la adición de ascorbato, una disminución de la fluorescencia que se une al nivel de la fluorescencia de un monocatenario totalmente escindido.
En todos los casos y sea cual sea la naturaleza del híbrido, la fragmentación tiene lugar, demostrando que la mezcla ClipPhen-cu/ascorbato está perfectamente adaptada a la degradación de cualquier tipo de ácido nucleico.
Ejemplo 5: Efecto descontaminante de una molécula de fragmentación inmovilizada sobre soporte sólido
Objetivo: Inmovilizar la ClipPhen sobre un soporte sólido y demostrar el mantenimiento de su actividad después de la inmovilización sobre bolas de poliestireno Tentagel (referencia comercial MB 250 002, Rapp Polymers, Germany)
Modo de realización:
Colocar 61,5 mg de bolas Tentagel Macrobeads NH2 (referencia comercial MB 250 002 Rapp Polymers, Germany) en una columna Snap Fit (ABI, USA) o una columna Handee Centrifuge (referencia 69705 Pierce, USA) es decir n = 16,6 µmol. Lavar las bolas con dimetilsulfóxido (DMSO) anhidro a fin de eliminar cualquier traza eventual de agua. Trasegar el DMSO. Pasar bajo un flujo de argón. Filtrar 14 µL de trietilamina (6 eq, 99 µmoles, ≈150 mM) en 600 µl de DMSO anhidro (1 min). Esta etapa permite garantizar que los grupos aminas están claramente en forma NH2 y no NH3+. Trasegar la solución de trietilamina. Filtrar 36,4mg de disuccinimidilsuberato (DSS) (6 eq, 99 µmoles, ≈250 mM, Pierce) en 400 µl de DMSO anhidro (10 min). Trasegar la solución que contiene el DSS en exceso.
Un ensayo con ninhidrina sobre algunas bolas extraídas en esta fase de la reacción permite garantizar que el conjunto de las funciones aminas ha reaccionado con el enlazador. Si este no es el caso, las bolas se tiñen de azul.
Filtrar durante 1h como mínimo (1h15-1h30) a temperatura ambiente una mezcla de reacción que contiene: la 3-ClipPhen (2,8 eq., 45 µmoles, 56 mM), 4-Dimetilaminopiridina (2,8 eq, 45 µmoles, 56 mM), 6,3 µl de trietilamina (2,8 eq, 45 µmoles, 56 mM) en 800 µl de DMSO.
Es posible extraer algunos µl de la mezcla de reacción antes y después de la reacción a fin de determinar el grado de funcionalización de las bolas por ensayo diferencial en UV a 328 nm. La mezcla de reacción tiene una coloración marrón que se debe a la 3-ClipPhen. Lavar con DMSO anhidro hasta la desaparición de esta coloración marrón de la solución de lavado.
Las bolas inicialmente amarillentas presentan un color amarillo ligeramente más oscuro después de la reacción. Añadir 5,9 µl de etanolamina (10 eq, 99 µmoles ≈ 130mM) en 800 µl de DMSO anhidro, a fin de inactivar todos los grupos NHS que no hayan reaccionado. Dejar actuar durante 10 minutos. Lavar las bolas 5 veces con 1 ml de DMSO, trasegar el DMSO. Volver a realizar la misma operación con acetonitrilo (a fin de poder secar las bolas). Pasar debajo de un flujo de argón y después evaporar con un evaporador rotativo.
Complejación con cobre
Filtrar durante 10 minutos 1 ml de solución de CuCl2 1M en DMSO/agua 50/50 (sobre 55 mg de bolas, es decir 145 equivalentes con respecto al grado de funcionalización). Lavar con DMSO y con agua hasta que la solución de lavado sea incolora (si la solución CuCl2 inicial estuviese teñida) y después con acetonitrilo. Pasar bajo un flujo de argón. Secar con un evaporador rotativo.
Ensayo de escisión
El ensayo de escisión se realiza de la siguiente manera: la cantidad deseada de resina, entre 1 mg y una sola bola, es decir una cantidad de ClipPhen introducida de 125 nmoles/12,5 mM para la TentaGel, (es decir una cantidad de ClipPhen introducida de 1,25 à 2,5 nmoles/125 µM a 250 µM) se introduce en un tubo Eppendorf (capacidad máxima de 200 µl). El ARN diana (transcritos de ARN 16s de 1600 bases, concentración entre 6 y 70 ng/µl según los experimentos) se añade a la resina, así como el ascorbato, a la concentración deseada (5mM). Las muestras tienen un volumen total de 10 µl, el tampón utilizado es un tampón tris a pH=7,4, de concentración final de 20 mM.
Una sola bola de resina TentaGel basta para la observación de la escisión. Se realizan unas muestras control de “diana sola” (electroforegrama A figura 8), “diana en presencia de ascorbato” (electroforegrama B), “diana en presencia de resina” acoplada al complejo ClipPhen-cu. El control “diana en presencia de ascorbato” permite controlar que la cantidad de ascorbato utilizada no tenga efecto sobre la fluorescencia. Las muestras así preparadas se agitan durante 30 minutos a temperatura ambiente (1000 rpm) antes de ser depositado sobre chip Agilent RNA 6000 Nano ((Kit comercial referenciado como 5067-1512, Agilent, USA) según la diana utilizada. 1 µl de sobrenadante basta para el análisis sobre un Bioanalizador (Agilent, USA).
Resultados y conclusiones:
Los resultados obtenidos y representados en la figura 8 (electroforegrama C) muestran que existe efectivamente la
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