WO2008069250A1

WO2008069250A1 - 細胞物性測定装置

Info

Publication number: WO2008069250A1
Application number: PCT/JP2007/073521
Authority: WO
Inventors: Sadao Omata; Yoshinobu Murayama
Original assignee: Nihon University
Priority date: 2006-12-08
Filing date: 2007-12-05
Publication date: 2008-06-12
Also published as: JP5273660B2; JPWO2008069250A1

Abstract

　細胞物性測定装置１０は、探触子２０と、探触子２０を保持してＸＹＺの３軸方向に移動させるためのＸＹＺ移動機構３０と、さらに、探触子２０を高さ方向、すなわちＺ方向に上下に移動させるための高さ移動機構３２と、ＸＹＺ移動機構３０と、高さ移動機構３２と、探触子２０のそれぞれに信号線を介して接続される制御部６０と、制御部６０に接続される表示部８０とを含んで構成される。制御部６０の接触検出モジュール６６は、位相シフト法を用いて、探触子２０が測定対象物８に接触することを検出し、硬さ算出モジュール６８は、探触子２０を測定対象物８に接触させて位相シフト法により硬さを求める機能を有する。

Description

明細書

細胞物性測定装置

技術分野

[0001] 本発明は、細胞物性測定装置に係り、特に測定対象物である生体細胞について、その物性分布を測定する細胞物性測定装置に関する。

背景技術

[0002] 細胞の形状評価も含め物性評価には、例えば顕微鏡による形態的観察法が用いられる。また、原子間力顕微鏡 (AFM)、走査型プローブ顕微鏡（SPM)等のように、微小なカンチレバーを用いて細胞の表面の凹凸と、カンチレバーが接触したことによる凹凸の変化から細胞の応力 ·歪を測定することが行われる。また、細胞に特殊な蛍光体を配置することで細胞の輪郭等の物性を検出することが行われる。例えば、特許文献 1には、一定の温度以上で紫外線によって励起され発光する蛍光体を含む代謝プローブの中に細胞を配置し、紫外線の照射による蛍光体の発光から細胞の温度を検出することが開示されてレ、る。

[0003] なお、本願発明者は、特許文献 2において開示されているように、位相シフト法を用いて対象物の硬さを精度よく測定できる方法を開発している。この技術は、振動子から測定対象物に振動を入射し、測定対象物からの反射波を振動検出センサで検出し、入射波と反射波との間に測定対象物の硬さに応じて生じる位相差を位相シフト回路によって周波数を変化させることで位相差をゼロに補償し、その位相差をゼロに補償する周波数変化量から測定物の硬さを求めるものである。この方法によれば、測定対象物に接触して振動を入力し反射波を検出する接触式によって測定対象物の硬さを測定すること力でさる。

[0004] 特許文献 1：特開平 11 - 258159号公報

特許文献 2：特開平 9 145691号公報

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0005] 従来技術にお!/、て、 AFM、 SPM等のカンチレバー方式によれば、生体細胞の表面の凹凸と、その凹凸に基づく応力 ·歪を測定できる力その測定は細胞の表面に止まり、生体細胞内部を含めた硬さ等の物性を測定するには不十分である。また、特許文献 1に示されるようにマーカによって生体細胞の物性を測定する方法では、形状や温度等の測定が可能である力 S、例えばガン細胞の硬さ等の物性を測定することができない。また、特許文献 2の方法によれば、測定対象物の硬さを測定できるが、測定対象物の表面形状等を測定することができな!/、。

[0006] 本発明の目的は、新し!/、方法で生体細胞の表面形状を測定できる細胞物性測定装置を提供することである。また、他の目的は、生体細胞の表面形状の測定と共に細胞の硬さを測定できる細胞物性測定装置を提供することである。以下の手段は、これらの目的の少なくとも 1つに貢献する。

課題を解決するための手段

[0007] 本発明に係る細胞物性測定装置は、測定対象物である生体細胞に超音波を入射する振動子と、測定対象物からの反射波を検出する振動検出センサとを有する探触子と、測定対象物に対し、探触子を XY平面内の任意の位置に相対的に移動させる平面内移動機構と、測定対象物に対し、探触子を XY平面に対する高さ方向に相対的に移動させる高さ移動機構と、探触子に増幅器とともに直列に接続され、振動子への入力波形と振動検出センサからの出力波形に位相差が生じるときは、周波数を変化させてその位相差をゼロに補償する位相シフト回路と、位相差をゼロに補償する周波数変化量が予め任意に設定された周波数変化閾値を超えたときに、探触子が測定対象物に接触したとして接触信号を出力する接触検出部と、接触信号が出力されたときの高さ移動機構の高さ方向の位置を、探触子が測定対象物に接触した接触高さとして出力する接触高さ出力部と、測定対象物に対する探触子の XY平面内の移動位置と、その移動位置における接触高さとに基づいて、測定対象物である生体細胞の 3次元表面形状を表示する表面形状表示手段と、を備えることを特徴とする。

[0008] また、本発明に係る細胞物性測定装置にお!/、て、位相差をゼロに補償したときの周波数変化量と硬さとの関係を予め求めておき、探触子の先端を予め任意に定めた測定高さにおいて測定対象物に接触させ、位相差をゼロに補償する周波数変化量から測定対象物の硬さを出力する硬さ出力部と、測定対象物に対する探触子の XY平面内の移動位置と、その移動位置における測定対象物の硬さとに基づいて、測定対象物である生体細胞の 2次元的硬さ分布を表示する硬さ分布表示手段と、を備えることが好ましい。

[0009] また、本発明に係る細胞物性測定装置にお!/、て、探触子は、振動子と振動検出センサとを含む本体部と、本体部に接続され細長く延び、曲率半径が 5 ^ 111以上 20 m以下の先端部を有する軸状プローブ部と、を有してレ、ることが好ましレ、。

[0010] また、本発明に係る細胞物性測定装置において、平面内移動機構は、探触子の曲率半径より短!/、距離の測定ピッチで、測定対象物に対し探触子を移動させることが好ましい。

発明の効果

[0011] 上記構成により、細胞物性測定装置は、測定対象物に対し、探触子を XY平面内の任意の位置に相対的に移動させることができ、さらに XY平面に対する高さ方向にも相対的に移動させること力 Sできる。これにより、探触子を用いて測定対象物に対し 2 次元的に走査することができる。そして、位相シフト回路を用いて、探触子の高さを移動させて、位相差をゼロに補償する周波数変化量が予め任意に設定された周波数変化閾値を超えたときに、探触子が測定対象物に接触したとする。これにより、測定対象物の接触高さの 2次元分布を得ることができる。このように、 AFM、 SPM等の従来技術とは異なる新しい方式によって、測定対象物である生体細胞の 3次元的な表面形状を測定することができる。

[0012] また、位相差をゼロに補償したときの周波数変化量と硬さとの関係を予め求めておき、探触子の先端を予め任意に定めた測定高さにおいて測定対象物に接触させ、位相差をゼロに補償する周波数変化量力測定対象物の硬さを出力する。測定高さとしては、探触子が測定対象物に接触してからの一定の深さとすることもでき、また、基準面からの一定の深さからとすることもできる。いずれにしても、測定対象物の内部を含めた硬さを測定でき、これによつて、測定対象物である生体細胞の表面形状の測定と共に細胞の硬さを測定できる。

[0013] また、探触子は、振動子と振動検出センサとを含む本体部に接続され細長く延びる軸状のプローブ部を有し、その先端部は、曲率半径が 5 m以上 20 m以下であるので、測定対象物である生体細胞の微小な部分の表面形状、硬さを測定することができる。

[0014] また、探触子の曲率半径より短!/、距離の測定ピッチで、測定対象物に対し探触子を移動させるので、探触子の先端部の大きさよりも細かい測定ピッチで、測定対象物である生体細胞の表面形状、硬さの分布を測定できる。これにより、測定対象物である生体細胞の微小な物性変化を測定できる。また、測定ピッチが細かレ、ことによる測定のばらつきが、探触子の先端部の大きさによって平均化され、測定の信頼性が向上する。

図面の簡単な説明

[0015] [図 1]本発明に係る実施の形態における細胞物性測定装置の構成を示す図である。

[図 2]本発明に係る実施の形態において、探触子と特性算出部の構成について示す図である。

[図 3]本発明に係る実施の形態において、位相シフト回路の機能を説明する図である

[図 4]本発明に係る実施の形態にお!/、て、予め求められた周波数変化量 Δ fと硬さとの対応関係の 1例を示す図である。

[図 5]本発明に係る実施の形態におレ、て、測定対象物であるガン細胞を実体顕微鏡で観察した様子を示す図である。

[図 6]本発明に係る実施の形態において、測定対象物であるガン細胞におけるァクチンの局在について免疫蛍光抗体法を用い、共焦点レーザ顕微鏡にて観察した様子を示す図である。

[図 7]本発明に係る実施の形態において、測定対象物であるガン細胞について 2次元凹凸分布を測定して表示した例を示す図である。

[図 8]本発明に係る実施の形態において、測定対象物であるガン細胞について 2次元硬さ分布を測定して表示した例を示す図である。

符号の説明

[0016] 6 透明シリコンシート、 8 測定対象物、 10 細胞物性測定装置、 20 探触子、 22 軸状プローブ部、 24 探触子本体部、 26 振動子、 28 振動検出センサ、 30 XY Z移動機構、 32 高さ移動機構、 34 測定軌跡、 40 特性算出部、 42, 44, 46, 48 端子、 50 増幅器、 52 位相シフト回路、 54 周波数変化量算出部、 56 接触検出部、 58 硬さ算出部、 60 制御部、 62 平面内移動モジュール、 64 高さ方向移動モジュール、 66 接触検出モジュール、 68 硬さ算出モジュール、 70 分布表示モジュール、 80 表示部。

発明を実施するための最良の形態

[0017] 以下に図面を用いて本発明に係る実施の形態につき詳細に説明する。以下では、探触子を生体細胞に対し移動させて、 XYZ方向に走査するものとして説明するが、走査は相対的なものであればよぐ例えば、測定対象物である生体細胞を試料台に固定し、試料台を XYZ方向に移動するものとしてもよい。また、試料台を XY方向に走査するものとし、探触子を Z方向に移動させるものとしてもよい。また、以下において探触子は、振動子と振動検出センサとを積層したものとして説明するが、それ以外の配置方法であってもよい。例えば振動子と振動検出センサとを同心状に配置してもよぐ、また、振動子と振動検出センサとを並列に別個に配置するものとしてもよい。

[0018] 図 1は、細胞物性測定装置 10の構成を示す図である。図 1には、細胞物性測定装置 10の構成要素ではないが、測定対象物 8の生体細胞として、コラーゲンシートを貼り付けた透明シリコンシート 6の上に培養して付着させたガン細胞が示されて!/、る。測定対象物 8であるガン細胞の詳細については後述する。細胞物性測定装置 10は、探触子 20と、探触子 20を保持して XYZの 3軸方向に移動させるための XYZ移動機構 30と、さらに、探触子 20を高さ方向、すなわち Z方向に上下に移動させるための高さ移動機構 32と、 XYZ移動機構 30と、高さ移動機構 32と、探触子 20のそれぞれに信号線を介して接続される制御部 60と、制御部 60に接続される表示部 80とを含んで構成される。

[0019] XYZ移動機構 30は、測定対象物 8である生体細胞に対し、探触子 20を図 1に示した XYZの 3軸方向に任意に移動させる機能を有する。ここで、 XY平面は、測定対象物 8である生体細胞が固定される試料台の表面に平行な平面である。 XYZ移動機構 30のうち、 Z方向の移動機能は、測定対象物 8である生体細胞が試料台の上に固定される高さがばらつく際に、その中心的な高さに探触子 20を移動するためのもので、一旦測定対象物 8である生体細胞に対して中心的位置の位置決めがなされると、そこで XYZ移動機構 30の Z移動機能は完了する。したがって、その後は、 XYZ移動機構 30は、実質的に、測定対象物 8である生体細胞に対し、探触子 20を XY平面内の任意の位置に移動させる機能を有することになる。

[0020] 力、かる XYZ移動機構 30は、いわゆる XYZテーブルと、精密なステッピングモータを X軸、 Y軸、 z軸駆動用としてそれぞれ備えるものとして構成することができる。例えば、 X軸ステッピングモータは、固定台に対し X軸方向に移動可能な Xテーブルを駆動し、 Y軸ステッピングモータは Xテーブルの上に搭載され Y軸方向に移動可能な Y軸テーブルを駆動し、 Z軸ステッピングモータは Yテーブルの上に搭載され Z軸方向に移動可能な Z軸テーブルを駆動するものとして構成することができる。この例では、 Z 軸テーブル上に探触子 20が取り付けられる。固定台は、測定対象物 8である生体細胞が固定される試料台と一定の位置関係で相互に固定されている。なお、 XYZ移動機構 30の制御信号線は、制御部 60と接続される。

[0021] XYZ移動機構 30は、その Z軸方向の移動は、測定対象物 8である生体細胞の厚み程度の移動を精密に行う必要があり、その X軸方向及び Y軸方向の移動は、測定対象物 8である生体細胞の大きさに対し、十分多数の測定位置を設定できる程度の移動を精密に行う必要がある。これらの精密な移動の必要性から、 XYZ移動機構 30 は、移動分解能として、 X軸方向で 10nm、 Y軸方向で 20nm、 Z軸方向で 10nm程度を確保できる仕様のものが用いられる。

[0022] 高さ移動機構 32は、 XYZ移動機構 32に取り付けられ、探触子 20を XY平面に対し高さ方向、すなわち Z方向に上下移動させる機能を有する。上記の XYZテーブル方式の XYZ移動機構 30の場合では、 Zテーブルに高さ移動機構 32が取り付けられ、 Z テーブルに対して、探触子 20を Z方向に上下移動させる機能を有する。上記のように、 XYZ移動機構 30は、初期に Z方向の高さ設定を行った後は、実質上 XY移動機構、すなわち XY平面内の走査機構として働くが、高さ移動機構 32は、この XY走査の間に、各測定点において、高さ方向に探触子 20を移動させる。高さ移動機構 32 の制御信号線は制御部 60に接続される。

[0023] 力、かる高さ移動機構 32は、 XYZ移動機構 30とは独立の Z軸ステッピングモータで構成することができる。 Z軸方向の上下移動は、測定対象物 8である生体細胞の厚み方向に対して、十分な分解能の精度で行う必要があることから、 lOnm程度の移動分解能を有するものが用いられる。

[0024] 探触子 20は、振動子 26と振動検出センサ 28が積層された探触子本体部 24と、探触子本体部 24から先端に向けて細くなつて延びる軸状プローブ部 22を含んで構成される。振動子 26と振動検出センサ 28にそれぞれ一端側が接続される各信号線は、他端側で制御部 60に接続される。

[0025] 探触子 20は、その根元の部分で高さ移動機構 32に接続される。そして、高さ移動機構 32は、 XYZ移動機構 30の Zテーブルに取り付けられ、 XYZ移動機構 30は固定台に対し XYZ方向に移動可能であり、固定台は、測定対象物 8である生体細胞が固定される試料台と一定の位置関係にある。したがって、 XYZ移動機構 30を XY方向に移動させ、適当な測定位置で高さ移動機構 32によって探触子 20を上下させることで、測定対象物 8である生体細胞に対し、 2次元的に走査しながら、適当な測定位置で探触子 20を生体細胞に接触させることができる。このように、 XYZ移動機構 3 0と高さ移動機構 32とは、測定対象物 8である生体細胞に対し、 2次元的に走査しながら、各測定位置で探触子 20の先端を生体細胞に接触させる機能を有する測定走查機構である。図 1には、測定対象物 8である生体細胞に対し、探触子 20の先端が 2 次元的に走査する測定軌跡 34が示されている。

[0026] 制御部 60は、 XYZ移動機構 30を制御して、 Z方向の初期位置を設定し、 XY平面内で探触子 20を任意の位置に移動させる平面内移動モジュール 62と、高さ移動機構 32を制御して、探触子 20を XY平面に対する高さ方向に移動させる高さ方向移動モジュール 64と、探触子 20が測定対象物 8に接触することを検出する接触検出モジユール 66と、探触子 20を測定対象物 8に接触させてその硬さを求める硬さ算出モジユール 68と、接触検出モジュール 66の接触高さ検出機能と、硬さ算出モジュール 68 の硬さ検出機能とを用いて、測定対象物 8の表面形状と硬さ分布とを表示部 80に表示する分布表示モジュール 70とを含んで構成される。

[0027] かかる制御部 60は、信号処理を行う電子回路と、データ処理等を実行するコンビュ一タとを組み合わせて構成できる。データ処理等の機能は、ソフトウェアを用いて実行でき、具体的には、例えば細胞物性表示プログラムを実行することで実現できる。

[0028] 図 2は、探触子 20と、制御部 60の接触検出モジュール 66、高さ算出モジュール 68 の機能を実現する電子回路である特性算出部 40の構成について抜き出して示す図である。

[0029] 探触子 20は、上記のように、先端に向けて細くなつて延びる軸状プローブ部 22の根元に、振動子 26と振動検出センサ 28が積層された探触子本体部 24を備える。振動子 26は、軸状プローブ部 22を介してその先端に接触する測定対象物 8である生体細胞に超音波を入射する機能を有し、振動検出センサ 28は、測定対象物 8である生体細胞からの反射波を軸状プローブ部 22を介して受け取り検出する機能を有する。図 2の例では、振動子 26と振動検出センサ 28とが直列に積層されて接続され、接続点を接地して用いられている。具体的には、円板状の圧電素子の両面にそれぞれ電極を設けたものを 2つ用いて積み重ね、中間の電極 2つを一体化して接地電極とし、積み重ねた上面側電極と下面側電極の一方側を振動子 26の入力電極とし、他方側を振動検出センサ 28の出力電極とする。そして、図 2の例では、振動子 26の入力電極側の面を軸状プローブ部 22の平坦な裏面に接着して固定される。圧電素子としては、市販の PZT素子を用いることができる。

[0030] 軸状プローブ部 22は、探触子本体部 24から放射される超音波について、小さな測定対象物 8である生体細胞上に位置決めして接触できるように、また、小さな生体細胞上のその接触したところからの反射波を探触子本体部 24に伝える機能を有する素子である。例えば、探触子 20に用いられる振動子 26と振動検出センサ 28が円板状として、その直径を数 mmとすれば、その大きさのままでは、例えば、 1mm以下あるいは 0. 1mm程度の小さな測定対象物 8である生体細胞に位置決めして接触することが困難である。そこで、探触子本体部 24の外径をできるだけ小さくすると共に、軸状プローブ部 22の形状として、探触子本体部 24から先端に向けて細くなつて延びるものを用いる。

[0031] 具体的な寸法の例を挙げると、探触子本体部 24は、軸方向の長さが約 15mmで、外径が約 2mmから約 5mmの円筒部分と、円筒部分に取り付けられ、あるいは一体となって、先端に向けて次第に細くなるテーパ部分とを有する。テーパ部分の先端部の直径は、約 0. 2mm力、ら約 0. 5mmである。軸状プローブ部 22は、長さが約 30m mで、直径が約 50 μ mから約 30 μ mで、先端は、直径 dが約 1 μ mから約 20 μ mの半球状に仕上げられる。かかる軸状プローブ部 22は、例えば、ガラス棒を加熱溶融し、細長く延ばし、先端を半球状にして成形したものを用いることができる。軸状プローブ部 22は、適当な接合材を用いて、探触子本体部 24のテーパ部分の先端に取り付けられる。

[0032] 図 2には、特性算出部 40の構成が示されている。特性算出部 40は、振動検出センサ 28からの反射波に相当する出力信号を受け取る端子 42と、振動子 26への入射波に相当する入力信号を出す端子 44と、図 1に示す制御部 60に接続される端子 46, 48とを有する。特性算出部 40の内部は、次のように構成される。

[0033] 振動検出センサ 28に接続される端子 42は、適当な DCカットコンデンサを介して増幅器 50に接続される。増幅器 50は、振動検出センサ 28によって検出された反射波信号を適当に増幅する電子回路で、周知の増幅回路を用いることができる。

[0034] 増幅器 50の出力は、位相シフト回路 52に入力され、位相シフト回路 52の出力は、端子 44を介して振動子 26に接続される。したがって、振動子 26—軸状プローブ部 2 2—測定対象物 8である生体細胞-軸状プローブ部 22—振動検出センサ 28—増幅器 50—位相シフト回路 52—振動子 26の閉ループが構成される。したがって、位相シフト回路 52の内容を適当に設定することで、この閉ループにおいて自励発振を生じさせること力 Sでさる。

[0035] 位相シフト回路 52の機能は、この閉ループにおいて、位相シフト回路 52に入力される入力信号の位相 Θ と、位相シフト回路 52から出力される出力信号の位相 Θ と

1 2 の間に位相差が生じるときは、閉ループの発振周波数を変更して、位相差をゼロに補償する機能を有する。そして、位相差をゼロに補償したときの周波数を周波数変化量算出部 54に出力する。

[0036] 図 3は、位相シフト回路 52の機能を説明する図である。図 3の横軸は周波数で、縦軸は位相である。ここで、軸状プローブ部 22が測定対象物 8である生体細胞に接触していないときに、振動検出センサ 28からの反射波の位相を Θ とし、軸状プローブ

1

部 22が測定対象物 8である生体細胞に接触したときにしていないときの位相を Θ とする。そして、振動検出センサ 28からの位相 Θ を有する反射波が入力されると、位

1

相シフト回路 52は、閉ループの自励発振を持続するために位相 Θ と位相 Θ の差が

1 2 ゼロとなるように働く。

[0037] 図 3において、 Θ として示されている位相—周波数特性は、軸状プローブ部 22が

1

測定対象物 8である生体細胞に接触したときにおける特性で、位相シフト回路 52を除!/、たとしたとき、つまり位相シフト回路 52を用いな!/、ときの閉ループの特性である。そして、 Θ として示されているの力位相シフト回路 52の位相一周波数特性である。したがって、位相シフト回路 52を閉ループ内に設けたときの閉ループの発振周波数 f は、図 3において Θ として示されている位相周波数特性と、 Θ として示されている

1 1 2

位相—周波数特性との交点となる。この交点において、位相シフト回路 52の入力信号の位相 Θ と出力信号の位相 Θ との差である位相差がゼロに補償され、閉ループ

1 2

は周波数 f にお!/、て発振を持続することができる。

1

[0038] 次に、軸状プローブ部 22が測定対象物 8である生体細胞に接触すると、空気と生体細胞との振動特性の相違により、振動子 26から入射された周波数 f の信号は、周

1

波数も位相も変化を受ける。位相シフト回路 52が閉ループ中にない場合には、一般的には周波数の変化は小さい。これに対し位相の変化はかなりあることが知られている。し力、しながら、位相の変化を検出する位相検出器はあまり高精度のものがないのが実情である。位相シフト回路 52は、この位相の変化を周波数変化に変換する機能を有する。

[0039] 図 3において、（ θ + Δ Θ )として示されている位相—周波数特性は、軸状プロ

1 一ブ部 22が測定対象物 8である生体細胞に接触したときにおける特性で、 Θ として示

1 されている特性と同様に、位相シフト回路 52を除いたとしたとき、つまり位相シフト回路 52を用いないときの閉ループの特性である。したがって、位相シフト回路 52を閉ループ内に設けたときの閉ループの発振周波数 f は、図 3において（ θ + Δ Θ )とし

2 1

て示されている位相周波数特性と、 Θ として示されている位相周波数特性との交点となる。この交点において、位相シフト回路 52の入力信号の位相（ θ + Δ Θ )と

1 出力信号の位相 Θ との差である位相差 Δ Θがゼロに補償され、閉ループは周波数 f におレヽて発振を持続することができる。 [0040] したがって、軸状プローブ部 22が測定対象物 8である生体細胞に接触していない状態と、接触した状態との間における位相差 Δ Θは、 θ ₂として示されている位相シフト回路 52の位相—周波数特性によって、周波数変化量 A f=f — f に変換される。こ

2 1

の変換定数 = ( A f/ Δ Θ )は、図 3から分かるように、位相シフト回路 52の特性の設定によって加減できる。このように、位相シフト回路 52は、振動子への入力波形と振動検出センサからの出力波形に位相差が生じるときは、周波数を変化させてその位相差をゼロに補償する機能を有する。なお、位相シフト回路 52のさらに詳細な内容は、上記特許文献 2において開示されている。

[0041] 再び図 2に戻り、周波数変化量算出部 54は、位相シフト回路 52から出力される周波数 f と f とから周波数変化量を算出する機能を有する。具体的には、閉ループにお

1 2

V、て測定対象物 8が含まれな!/、ときに位相シフト回路 52の作用により自励発振が生じるときの閉ループの発振周波数 f と、閉ループにおいて測定対象物 8が含まれると

1

きに位相シフト回路 52の作用により自励発振が生じるときの閉ループの発振周波数 f とを受け取って、これらの間の周波数変化量である A f = f — f を算出する機能を有する。すなわち、周波数変化量算出部 54の機能は、測定対象物 8が閉ループに含まれないときの発振周波数 f を閉ループから検出してこれを一旦記憶し、次に測定対

1

象物が閉ループに含まれるときの発振周波数 f を閉ループから検出してこれも一旦記憶し、記憶された 2つの周波数 f と f とを読み出して、その差である周波数変化量を

1 2

演算するとレ、う一連の処理を行うものである。

[0042] 算出された周波数変化量 A fは、目的に応じ、接触検出部 56、硬さ算出部 58に出力される。

[0043] 接触検出部 56は、位相差をゼロに補償する周波数変化量 A fが予め任意に設定された周波数変化閾値 A f を超えたときに、探触子 20が測定対象物 8である生体細胞

0

に接触したとして接触信号を端子 46に出力する機能を有する。ここで、特性算出部 4 0の中で、硬さ算出部 58を除いた部分力図 1における制御部の接触検出モジユーノレ 66の機能に対応する。

[0044] 周波数変化閾値 Δ f は、周波数変化量算出部 54における周波数測定の分解能に

0

よって定めること力 Sできる。例えば、周波数測定の分解能が、測定誤差等を含めて、 ± 1Ηζ程度であれば、 A f を数 Hz程度に設定することができる。

0

[0045] 接触検出の手順の 1例を、図 1、図 2を用いて以下に説明する。ここでは、 XYZ移動機構 30と測定対象物 8との間の位置が適切に初期設定されているとする。その状態の後に、高さ移動機構 32によって、探触子 20を測定対象物 8である生体細胞に接触しないように十分高い位置とする。この機能は、制御部 60の高さ方向移動モジユール 64の機能によって実行される。そして、 XYZ移動機構 30によって、探触子 20 を任意の測定位置に移動させる。この機能は、制御部 60の平面内移動モジュール 6 2の機能によって実行される。その測定位置において位相シフト回路 52から出力される周波数を周波数変化量算出部 54で測定し、 f として一旦記憶する。つぎに、高さ

1

移動機構 32によって、探触子 20を下降させながら、位相シフト回路 52からの周波数 f を周波数変化量算出部 54で測定し、周波数変化量 A f = f — f を求める。周波数変化量 A fは、接触検出部 56に出力され、ここで、これを予め設定されている周波数変化閾値 A f と比較される。 Δ « Δ ί以上となると、探触子 20の先端が測定対象物

0 0

8である生体細胞に接触したと判断し、接触検出部 56は、接触信号を端子 46に出力する。これらの機能は、制御部 60の接触検出モジュール 66の機能によって実行され

[0046] 探触子 20の先端が測定対象物 8である生体細胞に接触したと判断されて接触信号が端子 46に出力されると、制御部 60は、そのときにおける高さ移動機構 32の高さ方向の位置である接触高さ位置を記憶する。この接触高さ位置は、高さ方向移動モジュール 64の移動指令の状態等から得ることができる。もちろん、別途に高さ方向移動量検出センサを用いて、接触信号に同期して、探触子 20の高さ方向の位置を検出し、これを接触高さ位置としてもよい。接触高さ位置は、相対的なものでもよぐ測定対象物 8が固定される試料台の表面の高さを基準としたものでもよい。このようにして、測定位置において、測定対象物である生体細胞に接触したときの接触高さ位置を求めることができる。

[0047] 図 2に戻り、硬さ算出部 58は、探触子 20の先端を予め任意に定めた測定高さ位置にお!/、て測定対象物 8に接触させて、周波数変化量 Δ fから測定対象物 8の硬さを算出する機能を有する。上記の接触検出部 56によって出力させる接触信号は、測定分解能を適当に上回る程度の周波数変化閾値 f に基づいているので、探触子 20

0

が測定対象物 8である生体細胞の表面に接触したことを知らせることができる力生体細胞の内部の硬さを知らせることができない。そこで、測定対象物 8である生体細胞の内部の硬さを求めるために、探触子 20は、接触高さ位置よりも深い測定高さ位置まで、測定対象物 8の内部に向けて押し付けられる。

[0048] 測定高さ位置は、基準高さ位置からの所定の高さとすることができる。例えば、測定対象物 8である生体細胞が固定される試料台の表面高さ位置を基準として、任意に設定された高さだけ高い位置を測定高さ位置とすることができる。ここで、測定対象物 8である生体細胞は、図 1に示されるように、試料台の上に透明シリコンシート 6が貝占り付けられ、その上のコラーゲンシートの上に付着している。透明シリコンシート 6の厚さ、コラーゲンシートの厚さ、生体細胞の厚さ等は、対象とする測定対象物 8のそれぞれに対応して異なり、また XY平面内で一様ではない。したがって、好ましくは、測定高さ位置は、各測定位置ごとに、接触高さ位置から所定の深さ分だけ沈ませた高さ位置とすることが好ましい。例えば、接触高さ位置から、さらに rnだけ、生体細胞の内部に向かって探触子 20の先端を沈み込ませた高さ位置を測定高さ位置とすること力 Sできる。もちろん、 1 mの値は例示であるので、これを別の値、例えば、 2 ^ 111 、 3 in等の値に設定してもよい。このように測定高さ位置の高さに探触子 20の先端を移動させる機能は、端子 46からの接触信号に基づき、高さ移動機構 32に指令を出すことで実行できる。すなわち、接触検出モジュール 66と高さ方向移動モジュール 64の協働によって実現される。

[0049] 探触子 20を測定高さ位置まで移動させて、その状態で位相シフト回路 52から出力される周波数 Fを測定すると、このときの周波数 Fは、接触検出の際の周波数 f と一般的には異なった値となる。この周波数 Fと、探触子 20が測定対象物 8と接触していないときの周波数 f との差である周波数変化量 A f=F — f は、測定対象物 8の硬さ

1 2 1

等の物性を反映している。そこで、周波数変化量 A fと硬さとの対応関係を予め求めておくことで、周波数変化量 A fから、その測定位置における測定対象物 8である生体細胞の硬さを算出できる。

[0050] 図 4は、予め求められた周波数変化量 A fと硬さとの対応関係の 1例を示す図である。図 4の横軸は、硬さを表すヤング率で、縦軸は位相シフト法による周波数変化量である。ここで、縦軸の周波数変化量は、接触高さ位置から測定高さ位置の間の高さ変化量で規格化してある。図 4は、ヤング率がわかっている数種類の試料を予め作成し、図 1で説明した細胞物性測定装置 10を用い、各試料について、その試料に探触子 20が接触していないときの周波数 f と、その試料に探触子 20が接触してからさ

1

らに沈ませたときの周波数 Fをそれぞれ測定し、そのときの周波数変化量 A fを求めて、作成されたものである。異なるヤング率の試料としては、透明シリコン、適当な媒体に 60%力も 100%のシリコンを混ぜたもの、適当な媒体に 2%力も 10%のゼラチンを混ぜたものを用いた。

[0051] 図 4から分かるように、ヤング率と周波数変化量 A fとの間には一定の相関関係がある。したがって、図 4のような対応関係を予めメモリ等に記憶しておくことで、周波数変化量 Δ fから、その測定位置における測定対象物 8である生体細胞の硬さを算出できる。「A f—硬さ」の対応関係は、 A fを入力することで硬さが出力される型式で記憶される。具体的には、ルックアップテーブルのような換算テーブルの型式で記憶されてもよぐ計算式の形式で記憶されていてもよい。

[0052] 硬さ算出の手順の 1例を、図 1、図 2を用いて以下に説明する。ここでは、接触検出の手順で述べたように、すでに、測定対象物 8である生体細胞の任意の測定位置に探触子 20が移動され、その測定位置で、接触が検出され、そのときの接触高さ位置が求められているものとする。その測定位置における生体細胞の硬さを求めるには、まず、接触高さ位置から所定の測定高さ位置に探触子 20を下降させる。上記の例では、接触高さ位置から; 1 mさらに下降させる。この機能は、上記のように、制御部 60 の接触検出モジュール 66と高さ方向移動モジュール 64の協働によって実行される。そして、その測定高さ位置において、位相シフト回路 52からの周波数 Fを周波数変化量算出部 54で測定し、周波数変化量 A f=F — f を求める。周波数変化量 A fは、

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硬さ算出部 58に出力され、ここで、これを予め求められている「周波数変化量 A f— 硬さ」の対応関係がメモリ等から読み出され、これを用いて、測定高さ位置における周波数変化量 A fに対応する硬さが算出される。算出された硬さデータは、端子 48 に出力される。このように、硬さ算出には、図 2における特性算出部 40の全部の要素が用いられ、その意味で、制御部 60の硬さ算出モジュール 68は、図 2における特性算出部 40の全部の要素が対応するとともに、接触検出モジュール 66の機能を一部含む。

[0053] なお、生体細胞のような測定対象物 8は、一般的に粘弾性を有する。したがって、同じ測定高さ位置であっても、高!、位置から低レ、位置に探触子 20を沈ませて低!/、位置を測定高さ位置とする場合と、一旦探触子 20を低い位置に沈めた後、低い位置から高い位置に探触子 20を戻して高い位置を測定高さ位置とする場合とで、測定対象物 8の硬さ特性が異なることがある。そこで、測定高さ位置における硬さ測定について、この 2種類を区別するものとしてもよい。この場合には、例えば、測定対象物 8に接触しない高さから、接触を検知し、そこ力 1 μ m沈ませて、沈み状態での硬さを測定し、さらに適当な量沈ませてその後再び測定高さ位置をの位置に戻して、戻し状態での硬さを測定するものとできる。

[0054] このように、平面内移動モジュール 62の機能によって XYZ移動機構 30の動作を制御することで、測定対象物 8である生体細胞に対し、 XY平面内で探触子 20を走査させること力 Sでき、高さ方向移動モジュール 64の機能によって高さ移動機構 32の動作を制御することで、測定対象物 8について、 XY平面に対する高さ方向に探触子 20を移動させること力 Sできる。そして、さらに、接触検出モジュール 66の機能により、走査における各測定位置において探触子 20を下降させて、探触子 20が測定対象物 8の表面に接触した接触高さを検出することができる。ここで、走査における各測定位置のデータと、各測定位置における接触高さのデータとを対応付けることで、測定対象物 8である生体細胞の表面の 2次元的凹凸、すなわち 2次元的表面形状のデータを得ること力 Sできる。そして、表示のための適当な画像処理を行うことで、これを表示部 80に画像として出力することができる。この機能は、制御部 60の分布表示モジユール 70の機能によって実行される。

[0055] そして、さらに、硬さ算出モジュール 68の機能により、走査における各測定位置において探触子 20を測定高さ位置に移動させて、測定高さ位置における測定対象物 8の内部の硬さを検出することができる。ここで、走査における各測定位置のデータと、各測定位置における硬さのデータとを対応付けることで、測定対象物 8である生体細胞の硬さの 2次元的分布のデータを得ることができる。そして、表示のための適当な画像処理を行うことで、これを表示部 80に画像として出力することができる。この機能は、制御部 60の分布表示モジュール 70の機能によって実行される。

[0056] 以下に、上記の構成の細胞物性測定装置 10について、測定対象物 8の生体細胞としてガン細胞を用いて、その表面形状と硬さ分布を求めた結果を説明する。以下では、図 1、図 2の符号を用いて説明する。

[0057] 測定対象物 8としては、コラーゲンシートを貼り付けた透明シリコンシート 6を、血清 1 %の DMEM (Dulbecco Modified Eagle' s Medium)培養液に入れ、マウス由来黒色腫瘍 B16— F1株胆ガンを、 37°C、 CO 5%の雰囲気の培養器にて 2日間培養し、透明シリコン上に付着したガン細胞を用いた。このガン細胞は培養基の上にあり、生きている細胞である。図 5に、測定対象物 8であるガン細胞を実体顕微鏡で観察した様子を示す。また、図 6は、同じガン細胞におけるァクチンの局在について免疫蛍光抗体法を用い、共焦点レーザ顕微鏡にて観察した様子を示す図である。ここでは、細胞の核の周りにァクチンが存在していることが分かる。図 5からわ力、るように、測定対象物 8であるガン細胞の大きさは、平面寸法が長手方向で約 100 H m以下の小さなものである。

[0058] このガン細胞が付着した透明シートを細胞物性測定装置 10の試料台に固定し、 X YZ移動機構 30によって、高さ位置を適当に調整し、その後、 XYZ移動機構 30を制御して、測定対象物 8である生体細胞について、探触子 20を XY平面内で走査した。

[0059] ここでは、探触子 20の先端の直径 dが約 20 H mの半球状であり、ガン細胞の大きさが長手方向でも約 100 H m以下であることを考慮し、測定領域を約 60 m X約 60 μ mに設定し、その領域内で走査し、 X方向で 2 H m、 Y方向で 2 μ mのピッチで測定位置を定めた。つまり、場合によっては探触子 20の曲率半径より短い距離の測定ピッチで、測定対象物 8に対し探触子 20を移動させて走査した。そして、各測定位置において、上記の位相シフト法を用いる方法によって、接触高さを求めた。また、各測定位置において、接触高さからさらに 1 a mだけ生体細胞の内部に向かって探触子 20を押し付け、その接触高さ位置において、上記のように、位相シフト法を用いる方法によって、硬さを求めた。 [0060] 60 m X 60 mの測定領域において、 2 m X 2 mのメッシュで測定位置を設定し、各測定位置における接触高さのデータを測定位置データと関連付け、 2次元凹凸分布として表示した例を図 7に示す。図 7から、ガン細胞のテクスチャである表面の凹凸は、中央部が高く隆起し、周辺部が低く平面的になっていることが分かる。測定データによれば、中央部の高さは約 + 4 m、周辺部の高さは 1 [I mであった。

[0061] 図 8は、同じ測定領域において、各測定位置における硬さのデータを測定位置データに関連付け、 2次元的硬さ分布として表示した例である。図の中で、 Sとあるのは相対的に硬さ値が低ぐ柔ら力、いことを示し、 Hとあるのは相対的に硬さ値が高ぐ硬いことを示す。図 8から分かるように、硬さ分布は、中央部の柔らかい部位、その外側の硬い部位、周辺部の柔らかい部位に分けることができる。測定データによれば、中央部の柔らかい部位のヤング率は、約 150kPa、その外側の硬い部位のヤング率は、約 300kPa、周辺の柔らかい部位のヤング率は、約 50kPaであった。

[0062] 図 7と図 8とを参照すると、このガン細胞は、中央の隆起している部分が柔らかぐその周辺に硬い部分があることが分かる。図 5の実体顕微鏡の観察結果も参照すると、中央部の柔らかい部位がガン細胞に対応するものと考えられる。また、図 6の組織画像を算用すると、ヤング率の高い部位と低い部位とは、細胞の核とァクチンにそれぞれ対応するものと考えられる。

[0063] このように、図 1の細胞物性測定装置 10によれば、位相シフト法を用いることで、測定対象物である微小な生体細胞について、表面凹凸、及び、細胞内部の硬さ分布を測定すること力できた。上記のように、実験に使用した生体細胞は、培養基の上の生きたガン細胞である。このように、生きた生体細胞について、表面凹凸、及び、細胞内部の硬さ分布を測定することができた。

Claims

請求の範囲

[1] 測定対象物である生体細胞に超音波を入射する振動子と、測定対象物からの反射波を検出する振動検出センサとを有する探触子と、

測定対象物に対し、探触子を XY平面内の任意の位置に相対的に移動させる平面内移動機構と、

測定対象物に対し、探触子を XY平面に対する高さ方向に相対的に移動させる高さ移動機構と、

探触子に増幅器とともに直列に接続され、振動子への入力波形と振動検出センサ力、らの出力波形に位相差が生じるときは、周波数を変化させてその位相差をゼロに補償する位相シフト回路と、

位相差をゼロに補償する周波数変化量が予め任意に設定された周波数変化閾値を超えたときに、探触子が測定対象物に接触したとして接触信号を出力する接触検出部と、

接触信号が出力されたときの高さ移動機構の高さ方向の位置を、探触子が測定対象物に接触した接触高さとして出力する接触高さ出力部と、

測定対象物に対する探触子の XY平面内の移動位置と、その移動位置における接触高さとに基づいて、測定対象物である生体細胞の 3次元表面形状を表示する表面形状表示手段と、

を備えることを特徴とする細胞物性測定装置。

[2] 請求の範囲 1に記載の細胞物性測定装置にお!/ヽて、

位相差をゼロに補償したときの周波数変化量と硬さとの関係を予め求めておき、探触子の先端を予め任意に定めた測定高さにおいて測定対象物に接触させ、位相差をゼロに補償する周波数変化量から測定対象物の硬さを出力する硬さ出力部と、測定対象物に対する探触子の XY平面内の移動位置と、その移動位置における測定対象物の硬さとに基づいて、測定対象物である生体細胞の 2次元的硬さ分布を表示する硬さ分布表示手段と、

を備えることを特徴とする細胞物性測定装置。

[3] 請求の範囲 1に記載の細胞物性測定装置にお!/ヽて、探触子は、

振動子と振動検出センサとを含む本体部と、

本体部に接続され細長く延び、曲率半径が 5 m以上 20 m以下の先端部を有する軸状プローブ部と、

を有していることを特徴とする細胞物性測定装置。

請求の範囲 3に記載の細胞物性測定装置において、

平面内移動機構は、探触子の曲率半径より短い距離の測定ピッチで、測定対象物に対し探触子を移動させることを特徴とする細胞物性測定装置。