WO2008064756A2 - Verwendung von substanzen, die den zellulären glutathion-gehalt absenken, zur herstellung eines arzneimittels zur behandlung von t-zell vermittelten autoimmunkrankheiten - Google Patents

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    • G01N33/5047—Cells of the immune system

Definitions

  • the present invention relates to the use of substances which lower the cellular glutathione content for the manufacture of a medicament for the treatment of T-cell mediated autoimmune diseases.
  • Autoimmunity is based on a specific, adaptive immune response against the body's own antigens. Normally, the immune system leaves the body's own substances unmolested and fights only foreign bodies. Autoimmunity can be thought of as a result of a breakdown in tolerance to endogenous substances and / or a defective control and regulatory mechanism of the immune system. While the exact causes of autoimmune disease are unknown, it is thought that genetic factors may play a role alongside environmental factors. T lymphocytes appear to be significantly involved in triggering the disease as they are both cytotoxic T lymphocytes as well as by activating macrophages can cause tissue damage.
  • Autoimmune diseases can be subdivided into tissue- or organ-specific as well as systemic, ie non-organ-specific autoimmune diseases.
  • the disease multiple sclerosis is an example of an organ-specific, T-cell-mediated autoimmune disease in humans.
  • T H lymphocytes are further subdivided on the basis of the cytokines they produce: while T H 1 cells synthesize interferon ⁇ (IFN- ⁇ ) and interleukin-2 (IL-2), TH2 cells instead produce interleukin-4 (IL-2). 4), interleukin-5 (IL-5), interleukin-6 (IL-6), interleukin-9 (IL-9) and interleukin-13 (IL-13).
  • T H cell population producing the cytokine IL-17 so-called T H 17 cells, has a similar inflammatory phenotype as THI cells.
  • IFN- ⁇ -producing THI cells control intracellular pathogens but, like T H I 7 cells, can cause organ-specific autoimmune diseases such as autoimmune diabetes, multiple sclerosis or psoriasis, whereas IL-4 producing TH2 cells can enhance severe organ-specific autoimmune diseases ,
  • cytokines particularly IL-12 or IL-4
  • T cell receptor-ligand interactions accessory molecules, and others.
  • the functional phenotype of dendritic cells plays (DC) play a role, which represent either THI -inducing DCl or T H 2-inducing DC2.
  • DC the cytokine IL-23
  • the cytokine IL-23 is necessary that in addition to its pl9 chain the same p40 subunit as well as IL-12.
  • IL-12 like IL-23, is also produced by DC.
  • Glutathione is a ubiquitous tripeptide composed of the nonessential amino acids glutamate, cysteine and glycine. Because of its thiol group (SH group) and the ⁇ -glutamyl bond, glutathione has a wealth of biological functions that include detoxification reactions, protein structure formation, coenzyme functions, repair of DNA damage, influence on the cell milieu and thus involvement in developmental and aging processes (aging ). Glutathione is arguably the most abundant low molecular weight thiol and is found in almost all cells at sometimes relatively high concentrations (about 5 mmol / l). Biosynthesis and degradation of the glutathione proceed via the so-called ⁇ -glutamyl cycle.
  • glutathione disulfide GSSG It is in equilibrium as the sulfhydryl buffer in the cell with the glutathione disulfide GSSG, which is formed as an oxidation product either by catalytic action of a selenium-containing glutathione peroxidase, which is reduced in the metabolism resulting hydrogen peroxide or is formed in a transhydrogenation.
  • An NADPH-dependent GSSG reductase catalyzes the reverse reaction to glutathione.
  • the object of the present invention is therefore to provide substances for the preparation of a medicament which serve for the prophylaxis and / or control of autoimmune diseases.
  • this object is achieved by providing a substance which reduces the cellular GSH level, the substance being characterized in that it is selected from the group comprising inhibitors of GSH synthesis, in particular L-buthionine sulfoximine (L-BSO) and GSH- depleting substances, especially ifosfamide, diethyl maleate or acetaminophen.
  • L-BSO L-buthionine sulfoximine
  • GSH- depleting substances especially ifosfamide, diethyl maleate or acetaminophen.
  • the inventors were able to show from their own experiments that by lowering the cellular GSH content with representatives of the mentioned substances DC the content of reactive oxygen species (ROS) increases and at the same time the production of IL-12 and IL-23 can be inhibited.
  • ROS reactive oxygen species
  • This triggers DC formation of the DC2 phenotype, thus suppressing the differentiation of IFN- ⁇ -producing T H 1 cells and IL-17 producing TH 17 cells, and instead promoting the production of IL-4 producing T ⁇ 2 cells.
  • these can not trigger organ-specific immune diseases.
  • the inventors have shown in further experiments that the use of, for example, L-BSO in experimental mice in which an experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) was triggered, the course was significantly milder, and that even some mice remained healthy. In contrast to the control group, all experimental animals given L-BSO survived.
  • EAE experimental autoimmune encephalomyelitis
  • the present invention demonstrates that the controlled lowering of the cellular GSH level, on the one hand, produces IL-12 and IL-23 production of DC and, as a result, IFN- ⁇ and IL-17 production. production of T cells can be lowered and thereby autoimmune diseases can be targeted and successfully treated.
  • inhibitors of GSH synthesis can be used, such as, for example, L-BSO, or substances which form GSH-S conjugates - and thus deplete GSH - and thereby lower the cellular GSH level and increase the cellular ROS level.
  • GSH-S-transferase genotypes are associated with the development of asthma, increased IL-4 and IgE levels and decreased detoxification capacity.
  • a typical TH2 disease of the lung is thus associated with a decreased detoxification capacity based on GSH.
  • the inventors were also able to show that GSH deprivation (by targeted administration of substances that lower the GSH level) can also influence T cell cytokine production in humans in vivo.
  • the autoimmune diseases are selected from the group comprising: multiple sclerosis, diabetes mellitus, rheumatoid arthritis, psoriasis, Crohn's disease, ulcerative colitis, celiac disease, systemic lupus erythematosus, eczema diseases, transplant rejection, graft-versus -Host reaction, granulomatous diseases, especially sarcoidosis and granuloma annulare.
  • typical T H 2- mediated diseases such as atopic asthma, allergic asthma, atopic or allergic rhinitis by a glutathione-inducing approach with pharmaceutical substances such as N-acetylcysteine.
  • multiple sclerosis in the inflammatory sites (plaques) u.a. T lymphocytes, B lymphocytes and macrophages, which is considered an indication of an autoimmune reaction.
  • T lymphocytes u.a. T lymphocytes, B lymphocytes and macrophages
  • interferon- ⁇ is currently used, in particular during the relapsing course of the disease.
  • the autoimmune disease type 1 diabetes mellitus is based on a cell-mediated chronic and irreversible destruction of the insulin-producing pancreatic beta cells, whereby a peptide presented on the beta cells is presumably recognized by autoimmune T lymphocytes, which in turn destroy the beta cells.
  • Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease in which alteration of synovial cells induces an immune response of T lymphocytes, B lymphocytes and macrophages leading to antibody formation against synovial cells. As a result, hydrolases, collagenases, and lysosomal enzymes are released, leading to the destruction of articular cartilage.
  • antiphlogistics, corticosteroids and other antirheumatics are currently used to treat the destruction of articular cartilage.
  • the invention further relates to a pharmaceutical composition containing at least one of the claimed substances together with physiologically acceptable excipients and / or excipients.
  • Such ingredients are e.g. Diluents, binders, suspending agents, lubricants, stabilizers, etc. These include, but are not limited to, e.g. Water, salt solutions, alcohols, vegetable oils, polyethylene glycols, monoglycerides, etc. An overview of such ingredients can be found, for example, in A. Kibbe: "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 3rd Ed. 2000, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press.
  • the composition will be formulated accordingly, for example in the form of capsules, depot capsules, tablets, as liquid preparations to be injected or else as formulations administered via pumps.
  • the administration can therefore also take place subcutaneously or intravenously. Administration may also be made systemically or locally and subtly, depending on the patient and the disease.
  • a combination of two or more substances lowering the GSH level may be employed.
  • the invention further relates to a method for determining the potential of pharmaceutical substances to reduce the glutathione content of cells, comprising the following steps:
  • An "in vitro" procedure of the method according to the invention for testing the potential of pharmaceutical substances means to reduce the glutathione content of cells, cells, for example antigen-presenting cells or dendritic cells, in vitro with different concentrations of the respective pharmaceutical substance to be tested After a certain incubation period, preferably after 1 hour, 2 hours, 24 hours or 48 hours, the glutathione content of the cells is then determined in comparison to control cells.
  • the cells are lysed after the incubation period and incubated on ice.
  • the lysate is then centrifuged at high speed and the supernatant used for the GSH measurement, the sediment for the protein measurement (for example, according to Lowry) prepared.
  • the cells are lysed with sulfosalicylic acid (SSA), preferably 1% sulfosalicylic acid.
  • SSA sulfosalicylic acid
  • the samples prepared in this way and a GSH standard are then diluted in a microtiter plate and the assay reaction is started by addition of a reaction mixture containing glutathione reductase. Subsequently, the increase in absorbance at 405 nm at 30 s intervals over 10 min with a microtiter plate and the glutathione content is determined using a calibration curve.
  • the GSH glutathione disulfide
  • the cell pellet is dried after lysis.
  • the determination of the protein content can be carried out preferably by the method of Lowry (see, for example, Dringen et al., "Supply by Astrocytes of CysGly as precursor for neuronal glutathione", J. Neurosci 19: 562-569).
  • the pharmaceutical substances to be tested are administered to the desired individuals (mammals). After the treatment, small pieces of tissue are then removed from the respective organs and the cells contained in these tissues / organs prepared and examined accordingly, i. Further determination of GSH and protein is carried out according to the procedure described for the in vitro method.
  • the invention relates to a method for determining the potential of pharmaceutical substances to increase the ROS content of cells, comprising the following steps:
  • ROS Reactive oxygen species
  • the fluorescent dye 2 ', 7' dichlorofluorescene diacetate (H2 DCFDA) is used.
  • the absorption spectrum of this substance is 492 - 495nm and the emisson spectrum is in the range between 517 - 527nm.
  • oxidation of the H2DCFDA to DCFDA + H2 occurs.
  • the resulting fluorescence can be detected by flow cytometry (FLI).
  • lucigenin-enhanced chemiluminescence or celenterazine-enhanced chemiluminescence can be used.
  • dihydroethidine is also suitable for fluorimetric assays.
  • photometric methods which can be detected, for example, via the cytochrome C reduction or the NBT reduction.
  • electron spin resonance and spin trapping may also be mentioned as suitable detection methods.
  • the methods according to the invention are also referred to as "drug screening” methods and offer the possibility of selecting substances specifically with regard to their ability to lower the glutathione content of cells or to increase the ROS content, which are "positively” screened in this sense Substances can then be used as part of a therapy of the diseases listed above.
  • the method according to the invention thus represents a method for the identification of new medicaments which can either serve for the therapy of the abovementioned diseases or for the identification of anti-allergic / antisclerotic active medicaments with which TH2 diseases such as allergic / atopic asthma and allergic / atopic rhinitis or IgE-mediated diseases (allergies) or fibrosing / sclerosing diseases (scleroderma, pulmonary fibrosis, liver fibrosis) can be treated with GSH-inducing ROS-lowering pharmaceutical substances such as N-acetylcysteine.
  • TH2 diseases such as allergic / atopic asthma and allergic / atopic rhinitis or IgE-mediated diseases (allergies) or fibrosing / sclerosing diseases (scleroderma, pulmonary fibrosis, liver fibrosis)
  • GSH-inducing ROS-lowering pharmaceutical substances such as N-acetylcysteine.
  • the invention further relates to a method for determining the genetic susceptibility to develop an autoimmune disease, comprising the following steps: a) Obtaining peripheral blood leukocytes;
  • GST glutathione S-transferases
  • This method has the advantage that it can easily determine the tendency of individuals to develop autoimmune disease by detecting the glutathione S-Trasnferases.
  • peripheral blood leukocytes are obtained and genomic DNA isolated therefrom.
  • the genotypes of glutathione-S-transferases (GST) are determined by means of real-time PCR. As a result, polymorphisms can be elucidated.
  • the corresponding primer sequences for the GST families are known (see, for example, Mcllwain et al., "Glutathione S-transferase polymorphisms: cancer incidence and therapy", Oncogene (2006) 1639-1648).
  • ROI reactive oxygen intermediates
  • Another screening method can be used, for example the Affymetrix GeneChip® technology.
  • the Human Exon Array technology can now also perform high-resolution analyzes that also take into account the splicing of genes or exon clusters.
  • Such high-resolution gene arrays make it possible to accurately determine the genes for GST in patients, and thus to indicate susceptibility to autoimmune diseases or therapy with glutathione-depleting substances.
  • This genetic screening of patients for GST genotypes and the functional analysis of GSH / GGSG modulation serves to determine the susceptibility of a therapeutic response to GSH-depleting pharmaceutical substances. This is of particular interest or importance since, due to different genotypes of glutathione-S-transferases, there is a different capacity in humans to eliminate ROS or to fill in the cellular glutathione content. Thus, before initiating a therapy with the substances mentioned, the possible therapeutic response can be classified in advance.
  • FIG. 1A Flow cytometric analyzes (dichlorofluorescein): induction of ROS in BMDC by glutathione depletion with DMF or H 2 O 2 (100 ⁇ M or 250 ⁇ M), and the abolition of ROS production by exogenous addition of glutathione GSH-OEt or the glutathione inducer N-acetylcysteine (NAC).
  • Fig. IB Flow cytometric analysis (dichlorofluorescein): The induction of ROS in BMDC by DMF or L-BSO.
  • ROS such as H 2 O 2 lower the production of IL-12.
  • DC treated with DMF produced significantly less IL-12 and IL-23 compared to controls (DMSO) after stimulation with LPS.
  • Fig. 2A Determination of IL-IO, IL-12 and IL-23 in culture supernatants by ELISA:
  • the intracellular GSH content determines the phenotype of DC.
  • D C GSH high produce IL-12 and IL-23 and show a DC1 phenotype, whereas DC2 GS does not produce IL-IO but hardly IL-12 and IL-23.
  • the glutathione-depleting and DC2-inducing effect of DMF may be due to the simultaneous exogenous administration of GSH.
  • the DC replenished with GSH show a DC1 phenotype
  • Fig. 2B / C Determination of IFN- ⁇ and IL-4 by ELISA: The intracellular GSH levels determine the functional phenotype IL-12 + DC1 GSHh0Ch or IL-12-D C2 GSHnegg and thus the differentiation of TCR transgenic T Cells towards IFN- ⁇ producing ThI cells or IL-4 producing Th2 cells.
  • FIG. 2D determination of IL-17 by ELISA In the same way the intracellular GSH level determine the functional phenotype of IL-23 + DC GSHhigh or IL-23 DC2 GSHniedr '8, and thus the generation of Th-17 + cells, or Th-17 " cells.
  • the FACS images to the right show the control above, DMF below.
  • Fig. 3A / B Determination of IFN- ⁇ and IL-4 by ELISA: In viral stimulation of PLP-specific T cells following GSH deprivation, DC, like IL-4, promotes differentiation towards Th2 and inhibits the differential
  • Fig. 3C Course of EAE with and without treatment: In vitro, autoreactive T cells generated under GSH deprivation are, unlike in vitro, in the presence of IL-4, generated T H 2 cells, barely encephalitogenic.
  • FIG. 4A Course of EAE with and without treatment: The in vivo depletion of GSH by DMF (top) or L-BSO (bottom) protects actively immunized mice from the onset of severe encephalomyelitis.
  • Fig. 4B Determination of IL-4 and IFN- ⁇ : The Jn-vivo depletion of GSH promotes differentiation of autoreactive TH2 cells.
  • Fig. 5A Determination of GSH: / viral depletion of GSH in human DC by DMF.
  • Fig. 5B PASI course of 9 patients treated with Fumaderm®.
  • Fig. 5C results of cytokine analyzes of peripheral lymphocytes from blood of patients in whom T H 2 responses were induced by a GSH-lowering therapy.
  • mice Female SJL mice, C57BL / 6, OVA transgenic DO11.10-BALB / c mice and BALB / c mice were either bred or purchased (Charles River Laboratories, Harlan) and kept under specific pathogen-free conditions. The animal experiments were approved by the authorities.
  • Cellular GSH and GSSG were determined in microtiter plate assays by colorimetric methods. The cellular GHS content is determined as percent of the GSH level in freshly prepared controls or as pmol 10 6 cells. GSSG was undetectable.
  • IL-4, IL-10, IL-12 and interferon- ⁇ were determined by the ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) kit or using individual components from BD BioSciences. IL-23 in the supernatant was determined using the ELISA kit (eBioscience).
  • eBioscience For intracytoplasmic cytokine analyzes, the T cells were restimulated with PMA / ionomycin or with APC and peptide in the presence of Brefeldin A, followed by xed and permeabilized and dyed.
  • the cytokine antibodies PE labeled
  • APC antigen presenting cells
  • BMDC bone marrow
  • GM-CSF GM-CSF
  • the CD4 + T cells of DOIl.10 mice were sorted using MACS magnetic beads (Milteny Biotech). By culturing DC on day seven with either medium and DMSO or DMF for 2 hours, DC GSHh0Ch or DC GS could be generated. After a four-man After stimulation with LPS or CpG-DNA / IL-4, the DC GSHh0Ch or D C GSHlower were used to stimulate DOI1.10 T cells with 10 ⁇ g / ml ovalbumin peptide 323-339 for two days. The T cells were expanded with 50 U / ml IL-2 (Chiron Therapeutics). The cells were washed on day 10 and restimulated with fresh APC.
  • CD4 + T cells were recovered by MACS magnetic beads and stimulated with irradiated APC and PLP peptide 139-151 in the presence of L-BSO, DMF or only in medium as a control.
  • Spleen and lymph node CD4 + T cells were stimulated with PLP (Proteolipid Protein) peptide 139-151 (10 ⁇ g / ml) and irradiated SJL-APC in the presence or absence of L-BSO (0.5 mM, Sigma) for four days long stimulated, expanded for three to four days and then restimulated for cytokine production.
  • PLP Proteolipid Protein
  • L-BSO 0.5 mM, Sigma
  • ELISPOT plates (Millipore Corporation) were coated overnight at 4 ° C with anti-IFN- ⁇ or anti-IL-4 antibody, blocked after 12 h with PBS / 10% FCS and after tilting the Solution, the isolated T lymphocytes were incubated with APC and medium alone or in the presence of PLP peptide. After the incubation period, the cells were tilted, the plates washed with PBS / Tween and incubated with biotin-conjugated second antibodies. After further washes and incubation with streptavidin-alkaline phosphatase (Boehringer), the plates were incubated with developing solution. After washing with H2O, the number of spots in the ELISPOT reader (Biosys) was determined.
  • BMDC human bone marrow
  • Psoriasis Area and Severity Index Psoriasis Area and Severity Index
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • FITC fluorescein-thiocyanate
  • PE phycoerythrin
  • IFN- ⁇ IFN- ⁇
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • SEB staphylococcal enterotoxin B
  • DMF Sigma-Aldrich
  • Glutathione is a central intracellular molecule involved in many metabolic processes, such as the detoxification of reactive oxygen species (ROS).
  • ROS reactive oxygen species
  • Oxidative stress with hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) from DC can be visualized by dichlorofluorescein (DCF) ( Figure IA).
  • DCF dichlorofluorescein
  • Glutathione depletion by L-BSO results in an increase of intracellular ROS in DC (Fig. IB).
  • the glutathione S-conjugate DMF can lead to an increase of ROS to DC ( Figures 1A + B).
  • This DMF-induced ROS increase can be completely abolished by the addition of GSH ethyl ester (GSH-OEt) or NAC ( Figure IA).
  • ovalbumin-specific CD4 + T cells were found to be below T H 1 (CpG / anti-IL-4 or LPS) or T H 2 (IL-4) conditions primed with DC and compared with DC treated with solvent, DMF or DMF and LPS. After expansion of the T H cells with IL-2 over 10 to 12 days, the T H cells were then restimulated with fresh, irradi investigating APC and antigen. IL12 + DC GSH high , which were treated with solvent or under THI conditions, induce T H I cells that produce much IFN- ⁇ and little or no IL-4 (Fig. 2B).
  • IL-4 or DMF-treated DC induce TH2 cells that produce much IL-4 and hardly IFN- ⁇ ( Figure 2C).
  • GSH induce low IL-12 IL-4 producing T H 2 cells ( Figure 2B).
  • IL23 + DC GSHh0Ch IL-I H induce TT cells.
  • PLP proteolipid protein
  • mice were fed with DMF or L-BSO in drinking water, the control group only with drinking water. Active EAE induction was performed on day 10 with PLP peptide in Complete Freud's adjuvant (CFA) and pertussis toxin. The mice were examined daily for the course of the artificially induced disease. Administration of L-BSO or DMF reduced GSH levels in lymphoid organs and in the brain of immunized mice (not shown). PBS-fed mice developed severe EAE, while L-BSO or DMF-fed mice showed markedly milder EAE, some mice even remained healthy ( Figure 4A + B) and all mice survived.
  • CFA Complete Freud's adjuvant
  • CD4 + T cells were isolated and the cytokine production of PLP-specific T cells was measured by ELISPOT after in vitro stimulation.
  • CD4 + T cells from DMF and L-BSO fed mice displayed a T H 2-like pattern, whereas PLP-specific CD4 + cells from PBS-treated mice were identified as THI cells (Figure 4B).
  • DMF also depletes GSH in human DC in vitro (Figure 5A).
  • Figure 5A To determine whether GSH deprivation affects T cell cytokine production in humans also in vivo, interferon ⁇ and interleukin 4 production was determined by CD4 + or CD8 + T cells in 18 patients, the Fumaderm for the treatment of psoriasis.
  • Cells (antigen presenting cells or dendritic cells) are incubated with different concentrations of each pharmaceutical substance to be tested. After an incubation period of 1 h, 2 h, 24 h or 48 h, the glutathione content of the cells is then determined in comparison to control cells. For this purpose, the cells are lysed after the incubation period with 1% sulfosalicylic acid (SSA) and incubated on ice. The lysate is then centrifuged at high speed and the supernatant used for the GSH measurement, the sediment is processed for protein measurement according to Lowry.
  • SSA sulfosalicylic acid
  • the samples and the GSH standard were diluted in a microtiter plate and the assay reaction started by addition of a reaction mix containing glutathione reductase.
  • the reaction mixture was composed as follows: 92.7 ⁇ l GSH buffer (0.1 M sodium phosphate, Na 2 HPO 4 ⁇ NaH 2 PO 4 2H 2 O, Roth, Düsseldorf, Germany), 4 ⁇ l 10 mM NADPH (tetrasodium salt, AppliChem, Darmstadt, Germany), 3 ⁇ l 10 mM DTNB (5,5'-dithiobis (2-nitrobenzoic acid), Sigma), 0.64 ⁇ l glutathione reductase (GR, Roche Applied Science, Grenzach-Wyhlen, Germany).
  • the increase in absorbance is measured at 405 nm at 30 sec intervals over 10 min with a microtiter plate reader.
  • the glutathione content was below Using a calibration curve determined.
  • the GSH glutathione disulfide
  • the GSH ie the reduced form
  • the cell pellet was dried after lysis and taken up in 0.5 M NaOH.
  • the protein content was determined by the method of Lowry (see, for example, Dringen et al., "Supply by Astrocytes of CysGly as precursor for neuronal glutathione", J. Neurosci 19: 562-569) .Bovine serum albumin was used as the standard ,
  • the pharmaceutical substances to be tested can also be analyzed ex vivo for their potential to deplete GSH.
  • small pieces of tissue can be taken from the respective organs and placed in about 1 ml of 1% SSA.
  • the piece of tissue in SSA is homogenized using an ultrasound tip. Further GSH and protein determination are carried out according to the procedure described for APC and DC. The comparison to the GSH content of control cells or control tissue shows the GSH-lowering effect of the pharmaceutical substance to be tested.
  • ROS reactive oxygen species
  • H 2 DCFDA 7' dichlorofluorescein

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Substanzen, die den zellulären GSH-Level absenken, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von T-ZeIl vermittelten Autoimmunkrankheiten. Die Substanzen sind dabei ausgewählt aus der Gruppe umfassend L-BSO, Ifosfamid, Diethylmaleat, Acetaminophen oder andere Glutathion-S-Konjugat-Bildner.

Description

Verwendung von Substanzen, die den zellulären Glutathion-Gehalt absenken, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von T-ZeIl vermittelten Autoimmunkrankheiten
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Substanzen, die den zellulären Glutathion-Gehalt absenken, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von T-ZeIl vermittelten Autoimmunkrankheiten.
Autoimmunität beruht auf einer spezifischen, adaptiven Immunantwort gegen körpereigene Antigene. Normalerweise lässt das Immunsystem körpereigene Substanzen unbehelligt und bekämpft nur Fremdkörper. Autoimmunität lässt sich als Ergebnis eines Zusammenbruchs der Toleranz gegenüber körpereigenen Stoffen und/oder eines defekten Kontroll- und Regulationsmechanismus des Immunsystems auffassen. Bisher sind die genauen Ursachen für die Entstehung von Autoimmunkrankheiten zwar unbekannt, es wird jedoch vermutet, dass neben umweltbedingten auch erbliche Faktoren eine Rolle spielen. T-Lymphozyten scheinen an der Auslösung der Krankheit wesentlich beteiligt zu sein, da sie sowohl als zytotoxische T-Lymphozyten als auch durch die Aktivierung von Makrophagen Gewebeschädigungen verursachen können.
Autoimmunkrankheiten lassen sich in gewebe- oder organspezifische sowie systemische, also nicht-organspezifisch Autoimmunkrankheiten einteilen. So ist beispielsweise die Erkrankung Multiple Sklerose ein Beispiel für eine organspezifische, T-ZeIl vermittelte Autoimmunerkrankung beim Menschen.
In der Praxis ist das therapeutische Vorgehen durch den chronischen, langsam fortschreitenden Charakter der meisten Autoimmunkrankheiten limitiert. Zu Teilerfolgen führte der Einsatz von Immunsuppressiva und Corticosteroiden.
An Hand des Cytokinprofils von CD4+ T-Helfer(TH)-Zellen lässt sich der Verlauf chronischer Autoimmunkrankheiten, Allergien oder Infektionen voraussagen. Die TH- Lymphozyten werden u.a. auf der Basis der von ihnen produzierten Zytokine weiter unterteilt: Während TH1 Zellen Interferon γ (IFN-γ) und Interleukin-2 (IL-2) synthetisieren, produzieren TH2 Zellen stattdessen Interleukin-4 (IL-4), Interleukin-5 (IL-5), Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-9 (IL-9) und Interleukin-13 (IL-13). Eine weitere TH Zeil-Population, die das Zytokin IL-17 produzieren, sogennante TH17 Zellen, besitzen einen ähnlichen entzündlichen Phänotyp wie THI Zellen. IFN-γ-produzierende THI- Zellen kontrollieren intrazelluläre Pathogene, können jedoch, so wie THI 7 Zellen auch, organspezifische Autoimmunkrankheiten, wie beispielsweise Autoimmundiabetes, multiple Sklerose oder Psoriasis auslösen, wohingegen IL-4 produzierende TH2- Zellen schwere organspezifische Autoimmunkrankheiten verbessern können.
Die Differenzierung von nativen CD4+-Zellen in entweder TH1- oder TH2-Zellen wird durch Cytokine reguliert, insbesondere durch IL- 12 oder IL-4, ferner durch T-ZeIl- Rezeptor-Ligand-Interaktionen, akzessorische Moleküle und weitere. Außerdem spielt der funktionelle Phänotyp von dendritischen Zellen (DC) eine Rolle, welche entweder THI -induzierende DCl oder TH2-induzierende DC2 darstellen. Für die Entstehung von THI 7 Zellen ist das Zytokin IL-23 notwendig, dass neben seiner pl9 Kette die gleiche p40 Untereinheit wie auch IL- 12 besitzt. IL- 12 wird, wie IL-23 auch von DC produziert.
Glutathion (GSH) ist ein ubiquitär vorkommendes Tripeptid, das sich aus den nichtessentiellen Aminosäuren Glutamat, Cystein und Glycin zusammensetzt. Wegen seiner Thiolgruppe (SH-Gruppe) und der γ-Glutamylbindung besitzt das Glutathion eine Fülle von biologischen Funktionen, die Entgiftungsreaktionen, Strukturbildung von Proteinen, Coenzymfunktionen, Reparatur von DNA-Schäden, Beeinflussung des Zellmilieus und damit Beteiligung an Entwicklungs- und Alterungsprozessen (Altern) umfassen. Glutathion ist wohl das am häufigsten vorkommende niedermolekulare Thiol und wird in nahezu allen Zellen mit zum Teil relativ hohen Konzentrationen (etwa 5 mmol/1) gefunden. Biosynthese und Abbau des Glutathions verlaufen über den sog. γ-Glutamylzyklus. Es steht als Sulfhydrylpuffer in der Zelle im Gleichgewicht mit dem Glutathion-Disulfid GSSG, das als Oxidationsprodukt entweder durch katalytische Wirkung einer Selen-haltigen Glutathion-Peroxidase entsteht, wobei im Stoffwechsel anfallendes Wasserstoffperoxid reduziert wird oder in einer Transhydro- genierung gebildet wird. Eine NADPH-abhängige GSSG-Reduktase katalysiert die Rückreaktion zu Glutathion.
In neueren Studien (siehe Utsugi et al., 2003, J. Immunol. 171, 628-625) konnte gezeigt werden, dass Verbindungen, die dazu in der Lage sind, Glutathion-S- Konjugate zu bilden, u.a. in Macrophagen eine Lipopolysaccharid-induzierte Inter- leukin 12-Produktion unterdrücken.
Trotz der aufgezeigten Möglichkeiten zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten besteht immer noch ein großes Interesse, Alternativen zu den bisher eingesetzten Therapieansätzen zu finden, da die aufgezeigten Ansätze oftmals schwerwiegende Nebenwirkungen verursachen oder nur mit großem Aufwand und/oder hohen Kosten durchzuführen sind. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, Substanzen zur Herstellung eines Arzneimittels bereitzustellen, welches zur Prophylaxe und/oder Bekämpfung von Autoimmunkrankheiten dient.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die Bereitstellung einer den zellulären GSH-Spiegel absenkenden Substanz gelöst, wobei die Substanz dadurch gekennzeichnet ist, dass sie ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Inhibitoren der GSH- Synthese, insbesondere L-Buthioninsulfoximin (L-BSO) und GSH-depletierende Substanzen, insbesondere Ifosfamid, Diethylmaleat oder Acetaminophen.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird dadurch vollständig gelöst.
Die Erfinder konnten aus eigenen Versuchen zeigen, dass durch die Absenkung des zellulären GSH-Gehalts mit Vertretern der genannten Substanzen DC der Gehalt von reaktiven Oxygen Spezies (ROS) ansteigt und gleichzeitig die Produktion von IL-12 und IL-23 gehemmt werden kann. Dadurch wird in den DC eine Ausbildung des DC2-Phänotyps ausgelöst und so die Differenzierung von IFN-γ-produzierenden TH1 Zellen und IL- 17 produzierenden TH 17 Zellen unterdrückt, und stattdessen die Bildung IL-4-produzierender TΗ2-Zellen gefördert. Diese können im Gegensatz zu dem IFN-γ-produzierenden THl-Zellen bzw. IL-17-produzierenden TΗ17 Zellen keine organspezifischen Immunkrankheiten auslösen.
Die Erfinder haben in weiteren Versuchen gezeigt, dass durch den Einsatz von bspw. L-BSO bei Versuchsmäusen, bei welchen eine experimentelle Autoimmunenzepha- lomyelitis (EAE) ausgelöst wurde, der Verlauf deutlich milder war, und dass sogar einige Mäuse gesund blieben. Im Gegensatz zur Kontrollgruppe überlebten alle Versuchstiere, denen L-BSO verabreicht wurde.
Damit wird durch die vorliegende Erfindung zum ersten Mal gezeigt, dass durch die kontrollierte Absenkung des zellulären GSH-Spiegels zum einen die IL- 12- und IL-23 - Produktion von DC und hieraus resultierend die IFN-γ-und die IL-17-Produktion von T-Zellen gesenkt werden kann und dadurch Autoimmunkrankheiten gezielt und erfolgreich behandelt werden können.
In der vorliegenden Erfindung wird auch aufgezeigt, dass zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten zum einen Inhibitoren der GSH-Synthese eingesetzt werden können, wie bspw. L-BSO, oder aber Substanzen, die GSH-S-Konjugate bilden - und somit GSH deputieren - und dadurch den zellulären GSH-Spiegel absenken und den zelluläre ROS-Spiegel ansteigen lassen.
Untersuchungen an Patienten mit Asthma haben gezeigt, dass bestimmte GSH-S- Transferasen Genotypen mit der Entwicklung von Asthma, erhöhten IL-4 und IgE Spiegel und verminderter Detoxifikationskapazitäten einhergehen. Eine typische TH2- Erkrankung der Lunge ist somit mit einer verminderten Detoxifikationskapazität assoziiert, die auf GSH basiert.
Peterson et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1998, berichten in der genannten Publikation über Versuche bei drei immunologischen Modellen, bei welchen durch die GSH- Depletion eine Verlagerung vom typischen THl-Cytokin-Profil zu den TH2- Reaktionsschemata bewirkt werden konnte. Allerdings zeigte diese Arbeitsgruppe keinen Zusammenhang zu Autoimmunkrankheiten.
Die Erfinder konnten ferner zeigen, dass die GSH-Deprivation (durch eine gezielte Verabreichung von Substanzen, die den GSH-Level absenken) die T-ZeIl- Cytokinproduktion im Menschen auch in vivo beeinflusst werden kann.
Bei der erfindungsgemäßen Verwendung ist insbesondere bevorzugt, wenn die Autoimmunkrankheiten ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend: Multiple Sklerose, Diabetes mellitus, rheumatoide Arthritis, Psoriasis, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, Zöliakie, Systemischer Lupus Erythematodes, Ekzemkrankheiten, Transplan- tatabstoßung, Graft-versus-Host Reaktion, granulomatöse Erkrankungen, insbesondere Sarkoidose und Granuloma anulare. Im Gegenzug sollten sich typische TH2- vermittelte Erkrankungen wie atopisches Asthma, allergisches Asthma, atopische oder allergische Rhinitis durch einen Glutathion-induzierenden Ansatz mit pharmazeutischen Substanzen wie N-Acetylcystein bessern.
Insbesondere ist bevorzugt, wenn die Verwendung bei der multiplen Sklerose erfolgt.
Bei der multiplen Sklerose sind in den Entzündungsherden (Plaques) u.a. T- Lymphozyten, B-Lymphozyten und Makrophagen zu finden, was als Hinweis auf eine Autoimmunreaktion gewertet wird. Zur Therapie der multiplen Sklerose wird momentan insbesondere rekombinant hergestelltes Interferon-ß eingesetzt, insbesondere beim schubförmigen Krankheitsverlauf.
Der Autoimmunkrankheit Diabetes mellitus Typ 1 liegt eine zellulär vermittelte chronische und irreversible Zerstörung der Insulin produzierenden ß-Zellen des Pankreas zugrunde, wobei vermutlich ein auf den ß-Zellen präsentiertes Peptid von autoimmunen T-Lymphozyten erkannt wird, die ihrerseits die ß-Zellen zerstören.
Bei der rheumatoiden Arthritis handelt es sich um eine Autoimmunkrankheit, bei welcher eine Veränderung von Synovialzellen eine Immunantwort von T- Lymphozyten, B-Lymphozyten und Makrophagen induziert wird, die zur Antikörperbildung gegen Synovialzellen führt. Als Folge werden Hydrolasen, Collagenasen und lysosomale Enzyme freigesetzt, die zur Zerstörung von Gelenkknorpel führen. Eine Therapie erfolgt momentan mit Antiphlogistika, Corticosteroiden und anderen Antirheumatika.
Mit der erfindungsgemäßen Verwendung wird ein Ansatz aufgezeigt, mit welchem eine neue Alternative zur Behandlung der aufgezählten Krankheiten ermöglicht wird. Die Erfinder konnten nämlich in eigenen Versuchen zeigen, dass in Mäusen bei einer Verabreichung von u.a. L-BSO der Krankheitsverlauf einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) deutlich verbessert werden konnte. Der verbesserte Krankheitsverlauf - und dies konnten die Erfinder ebenfalls zeigen - steht in unmit- telbarem Zusammenhang mit der Absenkung des GSH-Spiegels, dem Anstieg von ROS und der damit verbundenen Differenzierung von T-Zellen in 1Η2-Zellen.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine pharmazeutische Zusammensetzung, die zumindest eine der beanspruchten Substanzen zusammen mit physiologisch verträglichen Hilfsstoffen und/oder Trägersubstanzen enthält.
Solche Inhaltsstoffe sind z.B. Verdünnungsmittel, Bindemittel, Suspensionsmittel, Schmiermittel, Stabilisatoren usw. Dazu zählen, sind aber nicht hierauf beschränkt, z.B. Wasser, Salzlösungen, Alkohole, pflanzliche Öle, Polyethylenglycole, Monoglyce- ride, etc. Eine Übersicht über derartige Inhaltsstoffe finden sich beispielsweise in A. Kibbe: "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 3. Aufl. 2000, American Pharma- ceutical Association and Pharmaceutical Press.
Je nach Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzung, also oral, parenteral, bukkal, nasal, transdermal oder intradermal, wird die Zusammensetzung entsprechend formuliert sein, also beispielsweise in Form von Kapseln, Depot-Kapseln, Tabletten, als flüssige Zubereitungen, die injiziert werden, oder aber als Formulierungen, die über Pumpen verabreicht werden. Die Verabreichung kann demnach auch subkutan oder intravenös erfolgen. Die Verabreichung kann ferner in Abhängigkeit vom Patienten und der Erkrankung, systemisch oder lokal und subtil gerichtet vorgenommen werden. In der pharmazeutischen Zusammensetzung kann darüber hinaus eine Kombination von zwei oder mehreren Substanzen, die den GSH-Level absenken, eingesetzt werden.
Ferner ist bevorzugt, wenn die Verwendung in einer Dosis von ca. 0,001 mg/kg Körpergewicht eines Patienten bis ca. 100 mg/kg Körpergewicht eines Patienten erfolgt. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Bestimmung des Potentials von pharmazeutischen Substanzen, den Glutathiongehalt von Zellen zu senken, mit den folgenden Schritten:
a) Inkubation von Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen der jeweils zu prüfenden pharmazeutischen Substanz;
b) Bestimmung des Glutathiongehalts der Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen.
Dabei ist bevorzugt, wenn das Verfahren in vitro oder ex-vivo durchgeführt wird.
Dabei bedeutet eine „in-vitro "-Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Prüfen des Potentials von pharmazeutischen Substanzen, den Glutathiongehalt von Zellen zu senken, dass Zellen, bspw. Antigenpräsentierende Zellen oder Dendritische Zellen, in vitro mit unterschiedlichen Konzentrationen der jeweils zu prüfenden pharmazeutischen Substanz inkubiert werden. Nach einer bestimmten Inkubationszeit, vorzugsweise nach 1 Stunde, 2 Stunden, 24 Stunden oder 48 Stunden wird dann der Glutathiongehalt der Zellen im Vergleich zu Kontrollezellen bestimmt.
Für die Bestimmung des Glutathiongehalts werden die Zellen nach der Inkubationszeit lysiert und auf Eis inkubiert. Das Lysat wird anschließend hochtourig zentrifu- giert und der Überstand für die GSH-Messung verwendet, das Sediment für die Proteinmessung (bspw. nach Lowry) aufbereitet. Dabei ist bevorzugt, wenn die Zellen mit Sulfosalicylsäure (SSA), vorzugsweise von 1 % Sulfosalicylsäure, lysiert werden.
Die so aufbereiteten Proben und ein GSH-Standard werden anschließend in einer Mikrotiterplatte verdünnt und die Assay-Reaktion durch Zugabe von einem Reakti- onsmix, der Glutathionreduktase enthält, gestartet. Anschließend wird der Anstieg der Extinktion bei 405 nm in 30 s Intervallen über 10 min mit einem Mikrotiterplat- tenleser gemessen, und der Glutathiongehalt unter Benutzung einer Kalibrierungskurve ermittelt.
Dabei ist bevorzugt, dass, wenn der Glutathiondisulfid- (GSSG-) Gehalt der Zellen, also die oxidierte Form von Glutathion gemessen wird, das GSH, also die reduzierte Form, in der Probe mit bspw. 2-Vinylpyridin bei einem pH zwischen 5 und 7 maskiert wird. Zur Messung des Proteingehaltes jeder Probe wird das Zellpellet nach der Lyse getrocknet. Die Bestimmung des Proteingehalts erfolgt kann vorzugsweise nach der Methode nach Lowry erfolgen (siehe bspw. Dringen et al., „Supply by Astrocytes of CysGly as Precursor for neuronal Glutathione", J. Neurosci 19:562-569).
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ex-vivo werden die zu prüfenden pharmazeutischen Substanzen den gewünschten Individuen (Säugetiere) verabreicht. Nach der Behandlung werden dann aus den jeweiligen Organen kleine Gewebestücke entnommen und die in diesen Geweben/Organen enthaltene Zellen aufbereitet und entsprechend untersucht, d.h. die weitere GSH- und Proteinbestimmung erfolgt entsprechend dem Vorgehen wie für das in vitro- Verfahren beschrieben.
Der Vergleich zum GSH-Gehalt von Kontrollzellen bzw. Kontrollgewebe zeigt in einem letzten Schritt jeweils die GSH-senkende Wirkung der zu prüfenden pharmazeutischen Substanz.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Potentials von pharmazeutischen Substanzen, den ROS-Gehalt von Zellen zu steigern, mit den folgenden Schritten:
a) Inkubation von Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen der jeweils zu prüfenden pharmazeutischen Substanz;
b) Färben der Zellen mit zumindest einem Chemilumineszenz- oder Fluoreszenzstoff, zur Bestimmung des Potentials, ROS zu induzieren. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren werden reaktive Sauerstoffspezies (ROS) gemessen. Hierzu wird vorzugsweise der Fluoreszenzfarbstoff 2', 7' Dichlorofluores- cein-Diacetat (H2 DCFDA) verwendet. Das Absorptionsspektrum dieser Substanz beträgt 492 - 495nm und das Emissonsspektrum liegt im Bereich zwischen 517 - 527nm. Bei Induktion von Zellstress z.B. durch die Gabe von ROS verursachenden Reagenzien, kommt es zu einer Oxidation des H2DCFDA hin zu DCFDA+H2 Die dabei entstehende Fluoreszenz kann mittels Durchflusszytometrie detektiert werden (FLl).
Alternativ kann bspw. eine Lucigenin-verstärkte Chemilumineszenz oder eine Coe- lenterazin-verstärkte Chemilumineszenz eingesetzt werden. Für Fluorimetrische Assays ist neben 2', 7' Dichlorofluorescein-Diacetat (H2 DCFDA) auch Dihydroethidi- um geeignet. Ferner können auch photometrische Verfahren eingesetzt werden, die bspw. über die Cytochrom C-Reduktion oder die NBT-Reduktion detektierbar sind. Alternativ sind auch Elektronen Spin Resonanz und Spin Trapping als geeignete Nachweisverfahren zu nennen.
Die erfindungsgemäßen Verfahren werden auch als „Drug-Screening"-Verfahren bezeichnet und bieten die Möglichkeit, Substanzen gezielt hinsichtlich ihrer Fähigkeit auszuwählen, den Glutathiongehalt von Zellen zu senken, bzw. den ROS-Gehalt zu steigern. Die in diesem Sinne „positiv" gescreenten Substanzen können dann im Rahmen einer Therapie der weiter oben aufgeführten Krankheiten eingesetzt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren stellt somit eine Methode zur Identifizierung neuer Medikamente dar, die entweder zur Therapie der weiter oben genannten Krankheiten dienen können, oder zur Identifizierung von Anti-allergischen/antisklerotischen wirksamen Medikamenten, mit welchen TH2 Erkrankungen wie allergi- sches/atopisches Asthma und allergische/atopische Rhinitis oder IgE-vermittelten Erkrankungen (Allergien) oder fibrosierende/sklerosierende Erkrankungen (Sklerodermie, Lungenfibrose, Leberfibrose) mit GSH induzierenden, ROS-senkenden pharmazeutischen Substanzen wie N-Acetylcystein behandelt werden können.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zu Bestimmung der genetischen Suszepti- bilität, eine Autoimmunkrankheit zu entwickeln, mit den folgenden Schritten: a) Gewinnung von peripheren Blutleukozyten;
b) Isolierung der genomischen DNA aus den peripheren Blutleukozyten;
c) Ermittlung der Genotypen der Glutathion-S-Transferasen (GST) mittels Real-Time-PCR und/oder Gen-Chips.
Dieses Verfahren bietet den Vorteil, dass auf einfache Weise die Neigung von Individuen, eine Autoimmunkrankheit zu entwickeln, über die Ermittlung der Glutathion- S-Trasnferasen bestimmt werden kann.
Hierzu werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren periphere Blutleukozyten gewonnen und hieraus genomische DNA isoliert. Mittels real-time PCR werden die Genotypen der Glutathion-S-Transferasen (GST) ermittelt. Dadurch können Polymorphismen aufgeklärt werden. Die entsprechenden Primersequenzen für die GST- Familien sind bekannt (siehe bspw. Mcllwain et al., „Glutathion S-transferase poly- morphisms: cancer incidence and therapy", Oncogene (2006) 1639-1648).
Der Metabolismus und die Detoxifikation von reaktiven Oxygen Intermediaten (ROI) ist teilweise abhängig von den Mitgliedern der GST Familie, insbesondere GSTMl, GSTTl, und GSTPl. Menschen, die homozygot für GSTMl oder GSTTl null Gene sind, können theoretisch langsamer ROI beseitigen und sind so einem höheren Risiko von intrazellluärem Zellschaden durch ROS ausgesetzt. Neue Untersuchungen haben gezeigt, dass GSTMl and GSTPl adjuvante Effekte bei der Entstehung von allergischem Asthma besitzen. Die PCR-basierte Ermittlung der GST-Genotypen kann daher eine genetische Suszeptibilität für die Entwicklung von Autoimmunerkrankungen ermitteln und gleichzeitig auch Hinweise für den sinnvollen Einsatz Glutathion- depletierender Substanzen geben.
Neben der PCR kann auch eine weitere Screening Methode eingesetzt werden, bspw. die Affymetrix GeneChip® Technologie. Durch die Einführung der Human Exon Array Technologie können nun auch hochauflösende Analysen durchgeführt werden, die auch das Splicen von Genen bzw. Exon Cluster berücksichtigen. Solche hochauflösenden Gene Arrays ermöglichen es, die Gene für die GST bei Patienten genau zu ermitteln, und so Suszeptibilität für Autoimmunerkrankungen oder Therapie mit Glutathion-depletierenden Substanzen hinweisend zu bestimmen.
Dieses Genetische Screening von Patienten hinsichtlich der GST Genotypen und die funktionelle Analyse der GSH/GGSG-Modulation dient der prätherapeutischen Bestimmung der Suszeptibilität für ein therapeutisches Ansprechen auf GSH- depletierende pharmazeutische Substanzen. Dies ist von besonderem Interesse bzw. Wichtigkeit, da beim Menschen aufgrund verschiedener Genotypen der Glutathion- S-Transferasen eine unterschiedliche Kapazität vorliegt, ROS zu beseitigen bzw. den zellulären Glutathion-Gehalt aufzufüllen. So kann vor Einleitung einer Therapie mit den genannten Substanzen das mögliche therapeutische Ansprechen vorher eingestuft werden.
Weitere Vorteile ergeben sich aus den Figuren und dem nachfolgenden Beispiel.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Ausführungsbeispiele der Erfindung werden in den nachfolgenden Figuren und in den Beispielen näher erläutert. Es zeigen:
Fig. IA Flusszytometrische Analysen (Dichlorofluorescein): Induktion von ROS in BMDC durch Glutathion Depletion mit DMF oder H2O2 (lOOμM oder 250μM), sowie die Aufhebung der ROS Produktion durch exogene Zugabe von Glutathion GSH-OEt bzw. dem Glutathion-Induktor N-Acetylcystein (NAC). Fig. IB Flusszytometrische Analysen (Dichlorofluorescein): Die Induktion von ROS in BMDC durch DMF oder L-BSO.
Fig. IC Bestimmung von IL-12 und IL-23 in Kulturüberständen mittels ELISA: ROS wie H2O2 senken die Produktion von IL-12. Mit DMF behandelte DC produzieren deutlich weniger IL-12 und IL-23 im Vergleich zu Kontrollen (DMSO) nach Stimulation mit LPS.
Fig. ID Colorimetrische Bestimmung des GSH-Gehalts und ELISA-Bestimmung des IL-12-Gehalts: DMF, aber auch MMF und L-BSO führen zu einer deutlichen Abnahme des intrazellulären GSH Gehalts und damit verbunden zu einer deutlich verminderten Kapazität IL-12 zu produzieren.
Fig. 2A Bestimmung von IL-IO, IL-12 und IL-23 in Kulturüberständen mittels ELISA: Der intrazelluläre GSH-Gehalt bestimmt den Phänotyp der DC. DC GSHhoch produzieren IL-12 und IL-23 und zeigen einen DCl Phänotyp, wohingegen DC2GSHnledrig zwar IL-IO produzieren, aber kaum IL-12 und IL- 23. Der Glutathion-depletierende und DC2-induzierende Effekt von DMF kann durch die gleichzeitige exogene Gabe von GSH vollständig aufgehoben werden. Die mit GSH wieder aufgefüllten DC zeigen einen DCl Phänotyp
Fig. 2B/C Bestimmung von IFN-γ und IL-4 mittels ELISA: Die intrazellulären GSH- Level bestimmen den funktionellen Phänotyp IL-12+DClGSHh0Ch oder IL-12- DC2 GSHniedri g und so die Differenzierung von TCR-transgenen T Zellen in Richtung IFN-γ produzierender ThI Zellen oder IL-4 produzierender Th2 Zellen.
Fig. 2D Bestimmung von IL-17 mittels ELISA: In gleicher Weise bestimmen die intrazellulären GSH-Level den funktionellen Phänotyp von IL-23+DCGSHhoch oder IL-23 DC2GSHniedr'8 und somit die Generierung von Th-17+ Zellen oder Th-17" Zellen. Die FACS Abbildungen rechts zeigen oben die Kontrolle, unten DMF.
Fig. 3A/B Bestimmung von IFN-γ und IL-4 mittels ELISA: In virro-Stimulation von PLP-spezifischen T-Zellen nach GSH-Deprivation der DC fördert ähnlich wie IL-4 die Differenzierung in Richtung Th2 und hemmt die Differenzie
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Fig. 3 C Verlauf der EAE mit und ohne Behandlung: In vitro, unter GSH- Deprivation generierte, autoreaktive T-Zellen sind, ähnlich wie in vitro, in Anwesenheit von IL-4, generierte TH2 Zellen, kaum enzephalitogen.
Fig. 4A Verlauf der EAE mit und ohne Behandlung: Die lh-vivo-Depletion von GSH durch DMF (oben) oder L-BSO (unten) schützt aktiv immunisierte Mäuse vor dem Ausbruch einer schweren Enzephalomyelitis.
Fig. 4B Bestimmung von IL-4 und IFN-γ: Die Jn-vivo-Depletion von GSH fördert die Differenzierung von autoreaktiven TH2 Zellen.
Fig. 5A Bestimmung von GSH: /«-virro-Depletion von GSH in menschlichen DC durch DMF.
Fig. 5B PASI Verlauf von 9 Patienten, die mit Fumaderm® behandelt wurden.
Fig. 5 C Ergebnisse der Cytokinanalysen peripherer Lymphozyten aus Blut von Patienten, bei welchen durch eine GSH-senkende Therapie TH2-Antworten induziert wurden.
Beispiel I
1. Material und Methoden 1.1 Versuchstiere
Weibliche SJL Mäuse, C57BL/6, OVA transgene DO11.10-BALB/c Mäuse und BALB/c Mäuse wurden entweder aufgezüchtet oder gekauft (Charles River Laboratories, Harlan) und unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen gehalten. Die Tierversuche waren behördlich genehmigt.
1.2 Zur Messung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) in DC und APC wurde der Fluoreszenzfarbstoff 2', 7' Dichlorofluorescein (H2 DCFDA, Molecular Pro- bes, Eugene, USA) verwendet. 5 x 105 DC wurden in ImI RPMI-Medium (ohne Mercaptoethanol) 60 min bei 37°C im Brutschrank mit 1 % DMSO oder 10 μg/ml DMF +/- NAC(ImM) oder GSX(ImM) vorinkubiert. Nach dieser Vorinkubation wurde lμM/ml H∑DCFDA zugegeben und die Zellen für weitere 30min bei 37°C inkubiert. Innerhalb einer Stunde wurde die entstandene Fluoreszenz mittels Durchflusszytometrie detektiert (FLl).
1.3 Glutathionbestimmung
Zelluläres GSH und GSSG wurde in Mikrotiterplatten-Assays mittels colorimetrischer Verfahren bestimmt. Der zelluläre GHS-Gehalt wird als Prozent des GSH-Levels in frisch präparierten Kontrollen bestimmt oder als pmol 106 Zellen. GSSG war nicht detektierbar.
1.4 Cytokinassays
IL-4, IL-10, IL- 12 und Interferon-γ wurden mittels des ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)-Sets oder unter Verwendung einzelner Komponenten von BD BioSciences bestimmt. IL-23 im Überstand wurde mit Hilfe des ELISA Sets (eBioscience) bestimmt. Für intrazytoplasmatische Zytokinanalysen wurden die T Zellen mit PMA/Ionomycin oder mit APC und Peptid restimuliert in Anwesenheit von Brefeldin A, im Anschluss fi- xiert und permeabilisiert und gefärbt. Für die Oberflächenfärbung wurden anti-CD4 oder KJ 1-26 Antikörper verwendet, die Zytokin- Antikörper (PE markiert) stammten alle von BD Pharmingen.
1.5 Antigen präsentierende Zellen
Als Antigen präsentierende Zellen (APC) wurden T-zell depletierte Milzzellen von syngenen Mäusen verwendet. Dendritische Zellen (DC), die aus Knochenmark gewonnen wurden (BMDC) und mit GM-CSF kultiviert wurden, wurden am Tag 7 der Kultur für die jeweiligen Versuche verwendet. Für den Versuch wurden jeweils eine gleiche Anzahl an APC entweder mit dem Medium alleine, mit L-BSO (C8Hi8N2O3S, 0,5 mM), Dimethylsul- foxid DMSO (C2H6OS), Dimethylfumarat DMF (C6H8O4, gelöst in DMSO, 70 μM), oder Calcium-Monomethylfumarat (MMF; CadoHioOβ, 200 μM) kultiviert. Alle Substanzen bis auf MMF (Fumapharm) wurden von Sigma- Aldrich bezogen. Zu den jeweils angegebenen Zeiten (siehe unten) wurden die Zellen entweder direkt hinsichtlich ihres GSH-Gehalts analysiert, zur T-Zell-Stimulierung verwendet oder mit Escherichia coli Lipopolysacchari- den 055. B5 (Sigma-Aldrich) oder CpG-DNA 1668 (MWG Biotech) und IL-4 (Stratmann) zur IL-2-Produktion stimuliert. Um den GSH-Level wieder anzuheben, wurde 1 mM GSH-OEt (Ci2H21N3O6S; Sigma-Aldrich) oder ImM NAC (Sigma-Aldrich) hinzugefügt. Die GSH-Speicher in Mäusen wurden durch Fütterung mit DMF oder MMF depeltiert, in Menschen durch Behandlung mit Fumaderm.
1.6 T-Zellen und T-Zellstimulation
Die CD4+-T-Zellen von DOIl.10 Mäusen wurden mittels MACS- Magnetbeads (Milteny Biotech) sortiert. Durch eine Kultivierung von DC an Tag sieben mit entweder Medium und DMSO oder DMF für 2 Stunden konnten DCGSHh0Ch oder DCGSHnledrig generiert werden. Nach einer vierstün- digen Stimulation mit LPS oder CpG-DNA/IL-4 wurden die DCGSHh0Ch oder DC GSHniedri g zur Stimulierung von DOIl.10 T-Zellen mit 10 μg/ml Ovalbu- minpeptid 323-339 über zwei Tage eingesetzt. Die T-Zellen wurden mit 50 U/ml IL-2 (Chiron Therapeutics) expandiert. Die Zellen wurden am Tag 10 gewaschen und mit frischem APC restimuliert. Die Analyse erfolgte mit den Überständen nach 24 h. Aus mit PLP-Peptid immunisierten SJL- Mäusen wurden CD4+-T-Zellen mittels MACS-Magnetbeads gewonnen und mit bestrahlten APC und PLP Peptid 139-151 stimuliert in Anwesenheit von L-BSO, DMF oder nur in Medium als Kontrolle.
1.7 PLP-spezifische T-Zellen und EAE
Milz- und Lymphknoten-CD4+ T-Zellen wurden mit PLP (Proteolipid Protein) Peptid 139-151 (10 μg/ml) stimuliert und bestrahlten SJL-APC in Gegenwart oder Abwesenheit von L-BSO (0,5mM, Sigma) vier Tage lang stimuliert, für drei bis vier Tage expandiert und anschließend zur Cyto- kinproduktion restimuliert. (Das Proteolipid-Protein ist das häufigste Myelinprotein im zentralen Nervensystem und spielt als Autoantigen eine wichtige Rolle bei der Entstehung der Multiplen Sklerose). Anschließend wurden 107 sham- (Kontrolle) oder L-BSO-behandelte T-Zellen intraperitoneal in naive SJL Mäuse injiziert und die sich dadurch entwickelnde EAE beobachtet. Zur Behandlung von aktiv induzierter EAE wurden SJL-Mäuse mit 75ng in 4mg/ml Complete Freund's Adjuvanz (CFA) immunisiert, anschließend 200 μg Pertussistoxin intraperitoneal injiziert und die Mäuse bezüglich der Entwicklung der EAE beobachtet. Die Hälfte der Gruppe wurde mit DMF 0,3mg/ml (Fluka) oder L-BSO 0,15mg/ml im Trinkwasser 14 Tage lang täglich gefüttert. Zur Cytokinanalyse von PLP-spezifischen T Zelllen wurden die drainierenden Lymphknoten der SJL-Mäuse 6 Tage nach der Immunisierung entnommen und CD4+ T Zellen Antigenspezi- fisch analyseirt (ELISPOT). Hierzu wurden ELISPOT Platten (Millipore Corporation) über Nacht bei 4°C mit anti-IFN-γ oder anti-IL-4 Antikörper beschichtet, nach 12h mit PBS/10% FCS geblockt und nach Abkippen der Lösung wurden die isolierten T-Lymphozyten mit APC und Medium allein oder in Anwesenheit von PLP Peptid inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurden die Zellen abgekippt, die Platten mit PBS/Tween gewaschen und mit biotinkonjugierten Zweitantikörpern inkubiert. Nach erneuten Waschgängen und Inkubation mit Streptavidin-Alkalische Phosphatase (Boehringer) wurden die Platten mit Entwicklungslösung inkubiert. Nach Waschen mit H2O wurden die Anzahl der Spots im ELISPOT Reader (Bio- sys) bestimmt.
1.8 DC aus menschlichem Knochenmark (BMDC) (CD14+) wurden durch MACS (Miltenyi Biotech) isoliert und sieben Tage lang mit IL-4 (500 U/ml, R & D Systems) und GM-CSF (Granulocyten-Monocyten-Kolonie stimulierender Faktor) (1000 U/ml (Immunonex)) inkubiert. GSX Bestimmung wie unter 1.3.
1.9 Psoriasis-Therapie und klinische Evaluation
Patienten mit schwerer Psoriasis wurden mit Fumaderm® (Hermal) therapiert. Die Schwere der Krankheit der Patienten wurde unter Verwendung des "Psoriasis Area and Severity Index" (PASI) bestimmt.
1.10 Ex-vivo-Cytokinanalyse von menschlichen T Zellen
Das ex vivo-Cytokinmuster der T-Zellen wurde zu den angegebenen Zeiten (siehe unten) bestimmt, und zwar jedesmal dann, wenn bei den Fuma- derm-Patienten die Routineblutanalyse durchgeführt wurde. PBMC wurden aus heparinisiertem Blut durch Fikollgradientenzentrifugation isoliert und direkt mit Phorbolmyristat-Acetat (PMA); 5 ng/ml) und Ionomycin (0,5 μg/ml) in Gegenwart von Brefeldin A (3 μg/ml) (jeweils von Sigma) vier Stunden lang stimuliert. Anschließend wurde eine Oberflächenfärbung mit Fluoreszin-Thiocyanat(FITC)-konjugierten monoklonalen Anti- körpern - entweder gegen CD4 oder CD8 - und eine intrazelluläre Färbung mit Phycoerythrin(PE)-konjugiertem monoklonalen Antikörpern gegen IL-4 oder IFN-γ (BD PharMingen) gemäß dem Protokoll der Hersteller durchgeführt. Ferner wurden Isotypenkontrollen für die Festsetzung der Fenster durchgeführt. Die Proben wurden mit einem FACScan (BD BioS- ciences) analysiert. Für die in vitro-Untersuchungen der T-Zellen wurden PBMC mit 100 ng/ml Staphylokokkenenterotoxin B (SEB) in Gegenwart oder Abwesenheit von DMF (Sigma-Aldrich) drei Tage lang stimuliert und anschließend die Zellen mit IL-2 expandiert. An Tag 13 wurden die Zellen mit PMA und Ionomycin stimuliert und der intrazelluläre IL-4 oder Inter- feron-γ-Gehalt wurde durch FACS-Analyse bestimmt.
2. Ergebnisse
Glutathion ist ein zentrales intrazelluläres Molekül, das an vielen metabolischen Prozessen wie der Detoxifikation von intrazellulären Sauerstoffradikalen (Reactive oxygen species, ROS) beteiligt ist. Oxidativer Stress mit Wasserstoffperoxid (H2O2) von DC kann durch Dichlorofluorescein (DCF) sichtbar gemacht werden (Fig. IA). Glutathion-Depletion durch L-BSO führt zu einem Anstieg von intrazellulären ROS in DC (Fig. IB). Ebenso kann der Glutathion-S-Konjugatbildner DMF zu einem Anstieg von ROS in DC führen (Fig. 1A+B). Dieser DMF-induzierte ROS Anstieg kann durch Zugabe von GSH Ethylester (GSH-OEt) oder NAC komplett aufgehoben werden (Fig. IA). Die Zugabe von DMF, MMF oder L-BSO induziert ROS in DC und depletiert gleichzeitig den intrazellulären Glutathionspiegel von DC (Fig. ID). Diese DC zeigen eine starke Suppression der IL- 12 Produktion (Fig. 1C+D). Neben IL-12 wird auch die Produktion von IL-23 durch den intrazellulären Glutathion Gehalt bestimmt (Fig. IC). Eine Glutathion- Depletion in DC mit DMF senkt die LPS-induzierte IL-23 Produktion in aus Knochenmark kultivierten DC bis zu 10.000-fach (Fig. IC). Gleichzeitig induziert DMF einen Anstieg der IL-IO Produktion in DC. Um auszuschließen, dass die einzelnen Verbindungen irgendwelche pharmakologischen Effekte auf die IL-12-Synthese bewirken, wurde der intrazelluläre GSH-Verlust durch Hinzufügung von exogenem GSH-OEt verhindert. Die Inhibierung der intrazellulären GSH-Deprivation hob wiederum die IL-12-Suppression (Fig. 2A) auf, was beweist, dass die DC einen GSH^-Status benötigen, um IL-12 zu produzieren. Die Zugabe von NAC zeigte die gleichen Effekte wie GSH-OEt (nicht gezeigt).
Die Zugabe von GSH-OEt zu DMF stellte außerdem die IL-23 Produktion in DC wieder her und erniedrigte die IL-IO Produktion in DC (Fig. 2A). Diese Ergebnisse zeigen, dass der GSH Gehalt den DC Phänotyp und die Zytokinproduktion bestimmt.
Um zu zeigen, dass der durch DMF veränderte DC Phänotyp in der Lage ist, auch die T Zell Antwort zu beeinflussen wurden Ovalbumin- spezifische CD4+ T Zellen unter TH1 (CpG/anti-IL-4 oder LPS) oder TH2 (IL- 4) Bedingungen mit DC geprimt und mit DC verglichen, die mit Lösungsmittel, DMF oder DMF und LPS behandelt wurden. Nach Expansion der TH Zellen mit IL-2 über 10-12 Tage wurden die TH Zellen dann mit frischen, irradiierten APC und Antigen restimuliert. IL12+ DCGSHhoch, die mit Lösungsmittel oder unter THI Bedingungen behandelt wurden, induzieren THI Zellen, die viel IFN-γ und kein oder kaum IL-4 produzieren (Fig. 2B). IL-4 oder DMF behandelte DC induzieren dagegen TH2 Zellen, die viel IL-4 und kaum IFN-γ produzieren (Fig. 2C). Sogar unter THI Bedingungen (DMF und LPS) induzieren GSHniedrisiL12- DC IL-4 produzierende TH2 Zellen (Fig. 2B). Außerdem induzieren IL23" DCGSHnledrl« nach Stimulation mit LPS IL-17TH Zellen, wohingegen IL23+ DCGSHh0Ch IL-I T TH Zellen induzieren.
In einem anderen System, in dem T Zellen verwendet wurden, die gegen ein Gehirn-spezifisches Protein gerichtet sind (Proteolipid Protein, PLP) fördert die in vztro-Stimulation dieser PLP-spezifischen T-Zellen unter GSH- Deprivation mit DMF ähnlich wie IL-4 die Differenzierung in Richtung Th2 und hemmt die Differenzierung von ThI und Th-17 (Fig. 3A und B).
Da die Induktion des TH2-Phänotyps die Fähigkeit der CD4+ T-Zellen, Autoimmunkrankheiten in immunkompetenten Mäusen zu induzieren, beeinträchtigen könnte, wurde gefolgert, dass GSHπfaW*IL12- DC2 die Fähigkeit autoreaktiver CD4+-T-Zellen, die Krankheit zu induzieren, abschwächen könnten. Für die nachfolgenden Versuche wurden Lymphozyten aus SJL Mäuse zweimal mit PLP Peptid stimuliert, und zwar entweder in Gegenwart oder Abwesenheit von L-BSO, DMF oder MMF. Nach der zweiten Stimulation wurden 107 Lymphozyten in naive SJL-Mäuse injiziert. Die Ergebnisse dieser Studien sind in Fig. 3C exemplarisch für L-BSO gezeigt. Autoreaktive T Zellen, die mit L-BSO in vitro generiert wurden, also unter GSH""** Bedingungen, waren kaum noch in der Lage eine EAE in vivo zu induzieren. Dagegen lösten in vitro differenzierte ThI Zellen oder Th Zellen, die nur mit PLP Peptid und APC ohne weitere Stimulantien aktiviert wurden eine schwere Enzephalomyelitis aus. In Anwesenheit von DMF oder MMF generierte PLP-spezifische T Lymphozyten waren auch nicht in der Lage eine schwere Enzephalomyelitis auszulösen (nicht gezeigt).
Um ferner zu untersuchen, ob die GSH-Deprivation die Differenzierung und Pathogenizität von autoreaktiven T-Zellen auch in vivo beeinflussen kann, wurden Mäuse mit DMF oder L-BSO im Trinkwasser gefüttert, die Kontrollgruppe nur mit Trinkwasser. Eine aktive EAE Induktion erfolgte am Tag 10 mit PLP-Peptid in Complete Freud's Adjuvanz (CFA) und Pertussistoxin. Die Mäuse wurden täglich auf den Verlauf der künstlich ausgelösten Krankheit untersucht. Durch die Verabreichung von L-BSO oder DMF konnten die GSH-Level in lymphoiden Organen und im Hirn von immunisierten Mäusen gesenkt werden (nicht gezeigt). PBS-gefütterte Mäuse entwickelten eine schwere EAE, während L-BSO oder DMF- gefütterte Mäuse eine deutlich mildere EAE zeigten, einige Mäuse sogar ge- sund blieben (Fig. 4A+B) und alle Mäuse überlebten. 6 Tage nach Immunisierung wurden die drainierenden Lymphknoten der Mäuse analysiert. Dabei wurden die CD4+ T-Zellen isoliert und die Cytokin-Produktion von PLP-spezifischen T-Zellen mittels ELISPOT nach in vitro Stimulation gemessen. CD4+-T-Zellen von DMF- und L-BSO gefütterten Mäusen zeigten ein TH2-ähnliches Muster, wohingegen PLP-spezifische CD4+-Zellen von PBS-behandelten Mäusen als THl-Zellen identifiziert wurden (Fig. 4B).
DMF depletiert GSH auch in menschlichen DC in vitro (Fig. 5A). Um zu bestimmen, ob die GSH-Deprivation die T-Zell-Cytokinproduktion in Menschen auch in vivo beeinflusst, wurde die Interferon γ- und Interleukin 4-Produktion durch CD4+- oder CD8+-T-Zellen in 18 Patienten bestimmt, die Fumaderm zur Behandlung von Psoriasis erhielten.
Durch die Versuche konnte gezeigt werden, dass eine anhaltende klinische Besserung der Krankheit stark mit zunächst einem Anstieg in der IL-4- Produktion einherging und anschließend mit einem Absenken der IFN-γ- Produktion von CD4+-Zellen, was zu einem ständig unterdrückten IFN- γ/IL-4-Verhältnis in der CD4+-T-Zellpopulation führte (Fig. 5B: Psoriasis Area and Severity Index (PASI) und Fig. 5C: Verhältnis der Interferon-γ- /IL-4+-CD4+ T-Zellen in PBMC während der Fumaderm®-Therapie).
Durch die von den Erfindern durchgeführten Versuche konnte also gezeigt werden, dass intrazelluläre GSH-Level durch drei vollkommen unterschiedliche Ansätze moduliert werden konnten: Zum einen wurden die GSH-Speicher durch Einsatz von Thiol-depletierenden Agenzien geleert; ferner wurde die GSH-Synthese mit L-BSO inhibiert und außerdem die intrazellulären GSH-Level mit GSH-OEt selektiv wiederhergestellt. Insgesamt konnte durch diese drei Ansätze gezeigt werden, dass durch den intrazellulären GSH-Level die DC-Differenzierung in entweder GSHh0ChIL-12+ DCl oder GSHmcdri^IL-12- DC2 geleitet werden konnte. Diese Regulierung ist - zumindest teilweise - ein essentieller Schritt in der IL12-Produktion. Die Unterschiede in der IL-12-Produktion erklären auch die Eigenschaft von GSHhocΛDCl oder GSHmeriri*DC2 zur Induktion von jeweils TH1 oder TH2.
Mit der vorliegenden Erfindung, also der gezielten Absenkung des zellulären GSH-Level durch bestimmte Substanzen, wird daher ein neuer Ansatz für die Therapie von Autoimmunkrankheiten dargelegt, sowie für Krankheiten allgemein, die sich durch die Absenkung des GSH-Levels behandeln lassen.
Beispiel II
Zum Überprüfen des Potentials von pharmazeutischen Substanzen, den Glutathion- gehalt von Zellen zu senken, wurde folgendes Verfahren durchgeführt: Zellen (Anti- genpräsentierende Zellen oder Dendritische Zellen) werden mit unterschiedlichen Konzentrationen der jeweils zu prüfenden pharmazeutischen Substanz inkubiert. Nach einer Inkubationszeit von Ih, 2h, 24h oder 48h wird dann der Glutathionge- halt der Zellen im Vergleich zu Kontrollezellen bestimmt. Die Zellen werden hierzu nach der Inkubationszeit mit 1 % Sulfosalicylsäure (SSA) lysiert und auf Eis inkubiert. Das Lysat wird anschließend hochtourig zentrifugiert und der Überstand für die GSH- Messung verwendet, das Sediment für die Proteinmessung nach Lowry aufbereitet.
Die Proben und der GSH-Standard wurden in einer Mikrotiterplatte verdünnt und die Assay-Reaktion durch Zugabe von einem Reaktionsmix, der Glutathionreduktase enthält, gestartet. Der Reaktionsmix war folgendermaßen zusammengesetzt: 92,7 μl GSH-Puffer (0,1 M Natriumphosphat, Na2HPO4 u NaH2PO4 2H2O, Roth, Karlsruhe, Deutschland), 4 μl 10 mM NADPH (Tetranatriumsalz, AppliChem, Darmstadt, Deutschland) , 3 μl 10 mM DTNB (5,5'-Dithiobis (2-Nitrobenzoesäure), Sigma), 0,64 μl Glutathionreduktase (GR, Roche Applied Science, Grenzach-Wyhlen, Deutschland). Der Anstieg der Extinktion wird bei 405 nm in 30 s Intervallen über 10 min mit einem Mikrotiterplattenleser gemessen. Der Glutathiongehalt wurde unter Benutzung einer Kalibrierungskurve ermittelt. Um den Glutathiondisulfid- (GSSG-) Gehalt der Zellen, also die oxidierte Form von Glutathion zu messen, musste das GSH, also die reduzierte Form, in der Probe mit 2-Vinylpyridin bei einem pH zwischen 5 und 7 maskiert werden. Zur Messung des Proteingehaltes jeder Probe wurde das Zellpellet nach der Lyse getrocknet und in 0,5 M NaOH aufgenommen. Die Bestimmung des Proteingehalt erfolgte nach der Methode nach Lowry (siehe bspw. Dringen et al., „Supply by Astrocytes of CysGly as Precursor for neuronal Glutathio- ne", J. Neurosci 19:562-569). Bovines Serumalbumin wurde als Standard benutzt.
Die zu prüfenden pharmazeutischen Substanzen können auch ex-vivo auf ihr Potential GSH zu depletieren analysiert werden. Nach Behandlung von Versuchsmäusen können hierzu aus den jeweiligen Organen kleine Gewebestücke entnommen und in etwa 1 ml 1% SSA gelegt werden. Das Gewebestück in SSA wird mit Hilfe einer Ultraschallspitze homogenisiert. Die weitere GSH und Proteinbestimmung erfolgt entsprechend dem Vorgehen wie für APC und DC beschrieben. Der Vergleich zum GSH Gehalt von Kontrollzellen bzw. Kontrollgewebe zeigt die GSH-senkende Wirkung der zu prüfenden pharmazeutischen Substanz.
Beispiel HI
Zur Überprüfung des Potentials von pharmazeutischen Substanzen, den ROS zu induzieren, wurde folgende Verfahren entwickelt: Zur Messung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) bei Zellen wird der Fluoreszenzfarbstoff 2', 7' Dichlorofluorescein (H2 DCFDA) verwendet. Das Absorptionsspektrum der Substanz beträgt 492 - 495nm und das Emissonsspektrum liegt im Bereich zwischen 517 - 527nm. Bei Induktion von Zellstress z.B. durch die Gabe von ROS verursachenden Reagenzien, kommt es zu einer Oxidation des H2DCFDA hin zu DCFDA+H2. Die dabei entstehende Fluoreszenz kann mittels Durchflusszytometrie detektiert werden (FLl).

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von Substanzen, die den zellulären Glutathion-Gehalt-absenken, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von T-ZeIl vermittelten Autoimmunkrankheiten, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend L-BSO, Ifosfamid, Diethylmaleat oder Ace- taminophen.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Verwendung bei T-ZeIl vermittelten Autoimmunkrankheiten erfolgt, die ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Multiple Sklerose, Diabetes mellitus, rheumatoide Arthritis, Psoriasis, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, Zöliakie, Systemischer Lupus Erythematodes, Ekzemkrankheiten, Transplantatabstoßung, Graft-versus- Host Reaktion, granulomatöse Erkrankungen, insbesondere Sarkoidose und Granuloma anulare.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Absenkung des zellulären Glutathion-Levels.
4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Verwendung der Substanz mit physiologisch verträglichen Hilfsstoffen und/oder Trägersubstanzen erfolgt.
5. Verwendung nach einem derAroprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass eine Kombination aus zwei oder mehreren Substanzen, die den zellulären GIu- tathion-Level absenken, eingesetzt wird.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Verwendung mit einer täglichen Dosis von ca. 0,001 mg/kg Körpergewicht eines Patienten bis ca. 100 mg/kg Körpergewicht eines Patienten erfolgt.
7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel zur oralen, parenteralen, bukkalen, nasalen, transdermalen, intradermalen Verabreichung geeignet ist.
8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel in Form einer Kapsel,, Depot-Kapsel, Tablette oder Einheitsdosis einer Injektion hergestellt wird.
9. Verfahren zur Bestimmung des Potentials von pharmazeutischen Substanzen, den zellulären Glutathiongehalt zu senken und/oder den zellulären ROS- Gehalt zu steigern, mit den folgenden Schritten:
a) Inkubation von Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen der jeweils zu prüfenden pharmazeutischen Substanz;
b) Bestimmung des Glutathiongehalts der Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren in vitro erfolgt.
11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren ex- vivo erfolgt.
12. Verfahren zur Bestimmung des Potentials von pharmazeutischen Substanzen, den ROS-Gehalt von Zellen zu steigern, mit den folgenden Schritten:
a) Inkubation von Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen der jeweils zu prüfenden pharmazeutischen Substanz; b) Färben der Zellen mit zumindest einem Fluoreszenz- oder Chemilumi- neszenzfarbstoff, insbesondere mit 2', 7' Dichlorofluorescein (H2 DCFDA), zur Bestimmung des Potentials, ROS zu induzieren.
13. Verfahren zu Bestimmung der genetischen Suszeptibilität, eine Autoimmunkrankheit zu entwickeln, mit den folgenden Schritten:
a) Gewinnung von peripheren Blutleukozyten;
b) Isolierung der genomischen DNA aus den peripheren Blutleukozyten;
c) Ermittlung der Genotypen der Glutathion-S-Transferasen (GST) mittels Real-Time-PCR und/oder Gen-Chips.
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