JP2000309543A - 抗糖尿病剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】ヒトの免疫性疾患の改善、治療、予防のための
経口摂取が可能で、マクロファージや探求等の酸化、還
元状態を制御し得る斬新な方法により、ヒトの糖尿病の
治療、改善、予防を目的とした抗糖尿病剤、特に医薬品
（輸液製剤、経口剤等）や飲食品の形態でも使用可能な
抗糖尿病剤の開発が期待される。 【解決手段】マクロファージ細胞内の酸化型及び／又は
還元型グルタチオン量を測定し、酸化型と還元型のグル
タチオンの量比を検定することにより、マクロファージ
をそれぞれ異なった機能を有する酸化型マクロファージ
と還元型マクロファージとに分類し、種々の免疫性疾患
の病態や程度をこの視点で解析し、その結果に基づき、
マクロファージの還元型グルタチオン量を変化させる作
用を有する物質を含有せしめることにより上記課題を解
決するヒトの糖尿病の治療、改善、予防を目的とした経
口摂取を可能とする抗糖尿病剤を提供することができ、
医薬品や飲食品、栄養剤、輸液製剤の形態でも使用可能
である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規抗糖尿病剤、詳し
くはマクロファージ（以下、Ｍφと略することもあ
る。）や、単球等の機能の斬新な制御作用を含み、特
に、ヒトのインスリン依存性並びに非依存性糖尿病の治
療、病態改善、予防を目的とした経口摂取可能な抗糖尿
病剤、及びこれを含む医薬品、並びに食品（医療用食
品、健康食品、更には特定保健食品等を含む。）、栄養
剤及び輸液製剤等の形態にある抗糖尿病剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】免疫系は、ウイルス、細菌等の外部から
の感染、又は自己由来細胞が異常を来たすことで生成す
る細胞（癌細胞等）による生体侵襲から自己を防衛する
ためのシステムである。しかしながら、この免疫系が異
常を来たし、過剰に働いたり、自己成分を排除する方向
に免疫系が働いたりすると共に、逆に、排除機能が不全
状態に陥ることがある。このような状態を惹起する疾患
は総称して免疫性疾患と呼ばれる。例えばアトピー性皮
膚炎、花粉症、喘息、ザルコイドーシス等の急性並びに
慢性炎症性疾患、アレルギー性疾患、慢性関節リウマ
チ、糖尿病（ＩＤＤＭ）、ＳＬＥ、慢性疲労性症候群
（CFS）等の自己免疫疾患や、肝炎、肝硬変、潰瘍性大
腸炎、クローン病等炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、癌悪液質
状態等数多くの疾患が含まれる。これら免疫性疾患の原
因は様々であるが、サイトカイン、炎症性メディエータ
ーの局所での産生を介して、特定の細胞の増殖、分化、
壊死を伴う炎症を引き起こすことを発端として全身性の
免疫不全、免疫異常、機能不全状態に至る。

【０００３】免疫を担当する細胞としてはＴリンパ球、
Ｂリンパ球がよく知られ、各々細胞性免疫、液性免疫の
担い手として多彩な機能を発揮する。一方、マクロファ
ージ／単球等は細胞性免疫及び液性免疫に深く関与する
細胞で、アレルギー、リウマチ等の免疫性疾患、癌、細
菌感染等の非自己である異物排除に深く関わっている。
マクロファージ／単球等の機能は、分泌機能、抗原呈示
を中心とした免疫調節機能、異物、老廃物の処理、貪食
機能、標的細胞の障害処理機能の４種に大別され、ＴＮ
Ｆ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＧＦβ、ＩＬ
−８、ＩＬ−１８等のサイトカイン、ネオプテリン（Ｎ
ＰＴ）、ジヒドロキシエピアンドロステン（ＤＨＥＡ）
等のホルモン様分子、ＰＧＥ２やＬＴＢ４等のアラキド
ン酸代謝産物、Ｃ５ａ，Ｃ３等の補体系分子、活性酸
素、活性窒素等、炎症像を規定する種々の分子を産生す
ることが知られている。これらの多彩な機能が単一のマ
クロファージ／単球等によって担われているのか、機能
を異にするマクロファージ／単球等集団によって担われ
ているのかは不明であり、リンパ球がその細胞表面マー
カーによって分類されその機能との対応が明確になって
いるのに対し、マクロファージ／単球等の機能の多様性
と細胞亜集団の対応については全く不明である。このた
め、上述のような炎症性、アレルギー性、免疫性疾患の
発症と病態進展に、マクロファージ／単球等は極めて重
要な役割を有しているにも拘らず、マクロファージ／単
球等の細胞亜集団の存在を想定しての機能分類のヒトの
疾患の診断、治療、病態改善、予防への応用は全く為さ
れておらず、想定されたことすらなかった。

【０００４】近年、アレルギー疾患、慢性関節リウマチ
等の自己免疫性疾患や悪性腫瘍患者において、末梢血中
のヘルパーＴ細胞亜集団のタイプの片寄りが疾患と対応
づけられつつあり、Ｔリンパ球中の亜集団であるヘルパ
ーＴリンパ球が更に２つの亜集団Ｔｈ１とＴｈ２に分類
され、その２種の存在比が生体の免疫機能の重要な指標
になることが立証されつつある。本指標を基に疾患の病
態を診断したり、その存在比を改善することにより、よ
り適切な治療法を樹立しようとの試みがなされつつあ
る。即ち、Ｂ細胞からのＩｇＥ産生を引き起こすＴｈ２
がＴｈ１より多い場合（Ｔｈ１＜Ｔｈ２）、アレルギー
性疾患が悪化することが分かってきており、Ｔｈ１／Ｔ
ｈ２を測定することにより、免疫の状態を検定したり、
Ｔｈ１＞Ｔｈ２にすることによりアレルギーを抑制しよ
うとする試みがなされつつある。逆に、Ｔｈ１が支配的
な状況で引き起こされる疾患の存在も慢性関節リウマチ
や慢性期の炎症を始め、次々に指摘されつつある。

【０００５】

【本発明が解決しようとする課題】生物材料を用いてＴ
ｈ１とＴｈ２のバランスを測定し、Ｔリンパ球を標的に
この２つの亜集団の機能を調節しようとしても、局所慢
性炎症やアレルギー性疾患の検定、診断に利用すること
には、現在のところ成功していない。最近、Ｔｈ１病や
Ｔｈ２病という言葉も用いられるが、必ずしも２者に明
確に区別できないのが実態である。

【０００６】Ｔｈ１／Ｔｈ２の存在比は、リンパ球亜集
団の指標でしかなく、リンパ球亜集団の生体内での動態
は本発明で取り扱うマクロファージや樹状細胞、クッパ
ー細胞を始めとするアクセソリー細胞と呼ばれる細胞群
の機能と実際には複雑に関わっているため、Ｔｈ１／Ｔ
ｈ２の存在比だけで疾患の病態を適切に診断し、その情
報を基に治療することは困難である。後述するが、マク
ロファージ／単球等の機能状態によってＴｈ１／Ｔｈ２
のバランスは制御されているのである。治療のためにＴ
ｈ１＞Ｔｈ２に傾斜させることを意図しても、それだけ
では複雑なサイトカインネットワークにおいては効果が
得難く、新たな診断、治療のための指標が待ち望まれて
いる。

【０００７】炎症反応に深く関与しているマクロファー
ジにおいて、酸化ストレス、サイトカイン刺激、ウイル
ス、細菌感染等の環境因子により細胞の機能が変化する
ことが判明しているが、その機能とマクロファージの細
胞亜集団分類の対応については全く不明である。それら
機能、分類において新たな知見が必要であり、それらの
知見が得られることにより、飛躍的に有用な新たな治療
方法の開発に繋がる。以上の状況下に、免疫を調整する
優れた薬剤、即ち免疫調整剤の開発が望まれ、本発明者
らはすでにこの考えに沿って新規免疫調整剤を開発し
た。（特願平９−３０３４２６号、特願平１０−３０８
３００号）。本発明は、これらのマクロファージの機
能、分類において得た新たな知見をもとに、特に糖尿病
の発生を抑制し、糖尿病の病態を改善する新規な抗糖尿
病剤を開発することをその課題とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、前記課題
解決に向けて鋭意検討した結果、次の知見を得た。即
ち、炎症の遷延化作用の強いマクロファージ（単球、ク
ッパー細胞及び樹状細胞等を含む）と、免疫調整性のマ
クロファージとの区別を、マクロファージのレドックス
状態（ポテンシャル）の相違から試み、糖尿病自然発症
動物において病態の進展とともにマクロファージのレド
ックス状態が変化することを見出し、課題解決を可能と
した。マクロファージのレドックス状態の指標としては
マクロファージ細胞内の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）
含量を採用する。

【０００９】グルタチオンは、ほ乳類のあらゆる細胞に
存在し、内因性の抗酸化物質としてよく知られ、細胞内
においてラジカルや過酸化物の除去、プロスタグランジ
ン等のエイコサノイドの代謝、生体異物の解毒、アミノ
酸輸送等多様な機能を有しているトリペプチドである。
還元型（ＧＳＨ）と酸化型（ＧＳＳＧ）が存在し、両者
間で共役サイクルを形成する。通常の細胞では、ＧＳＨ
の濃度は還元状態の方が圧倒的に多く、酸化ストレス、
特にＨ₂Ｏ₂に対して防御的に作用する。

【００１０】本発明者等は、マクロファージ中の還元型
ＧＳＨ含量を測定するとともに、ＧＳＨ含量を異にする
マクロファージの免疫機能に及ぼす効果に大きな差のあ
ること、本測定法で生体の免疫能を検定できること、そ
の酸化還元状態を経口投与可能な低分子物質で人為的に
調整できること、及び本法が疾患の治療に広範に応用で
きること、並びに食品として活用できる可能性を見出し
た（特願平９−３０３４２６号、特願平１０−３０８３
００号）。本概念に基づき、糖尿病自然発症マウスのマ
クロファージのレドックス状態について鋭意研究を進め
た結果、本発明を完成するに至った.

【００１１】図１は、本願と同一発明者等による先発明
により見出された知見に基づき、マクロファージ又は単
球、クッパー細胞及び樹状細胞等（本発明ではこれらを
併せてマクロファージと称する）の機能の相違、並び
に、Ｔｈ１及びＴｈ２バランスに及ぼす効果、更にはマ
クロファージの機能の相違によって引き起こされる免疫
抑制、悪液質状態、癌細胞の悪性化誘導の機序、局所炎
症等との関係の仮説模式図を示したもので、例えば、担
癌進行に従い、局所のＴｈ１／Ｔｈ２バランスが崩れ、
液性免疫に傾き、サイトカインレセプター複合体構成と
機能が変化し、ＧＳＨ含量の少ない酸化型マクロファー
ジが増加し、活性酸素や、ＰＧＥ２、ＩＬ−６、ＩＬ−
１０、ＩＬ−８等の炎症伝達因子の産生が高まり、全身
性の免疫抑制、悪液質状態となる。

【００１２】本発明者等は上記知見に基づき、更に研究
を重ねた結果、炎症反応に重要な役割を果たしているマ
クロファージ細胞中の酸化型グルタチオンと還元型グル
タチオンの含量を検定することにより、不均一なマクロ
ファージ集団が２つのタイプ即ち酸化型マクロファージ
と還元型マクロファージとに分類することができ、酸化
型マクロファージが免疫疾患に伴う局所慢性炎症やアレ
ルギー反応を引き起こし、液性免疫と細胞性免疫のバラ
ンスに関与するＴｈ１／Ｔｈ２バランスはマクロファー
ジの酸化／還元状態によって制御されていること、当該
マクロファージの酸化還元状態が免疫性疾患の病態に重
要な役割を果たしており当該酸化還元状態を検定し、そ
の状態を人為的に制御、修飾することにより当該疾患の
診断及び治療に役立つこと、しかもその制御が経口摂取
可能な低分子物質によって簡便に行えることを見出し
た。

【００１３】本発明での酸化型マクロファージ及び還元
型マクロファージの定義は、還元型グルタチオン（ＧＳ
Ｈ）に特異的な化学試薬モノクロロバイメイン（ＭＯＮ
ＯＣＨＬＯＲＯＢＩＭＡＮＥ）と反応させることで細胞
内ＧＳＨ量を定量し、無刺激のマクロファージに比較し
てＧＳＨ含量が増加しているものを還元型マクロファー
ジ、逆に含量の低下しているものを酸化型マクロファー
ジとするものである。更に、経口摂取可能な低分子物質
をマクロファージと２〜２４時間接触させることで、Ｇ
ＳＨ含量が２ｎｍｏｌｅｓ／５×１０⁵マクロファージ
細胞以上のものを還元型マクロファージ（又は単球
等）、０．１ｎｍｏｌｅｓ／５×１０⁵マクロファージ
細胞以下のものを酸化型マクロファージとすることが好
ましい。或いは、無刺激のマクロファージのＧＳＨ含量
に比較してＧＳＨ量が２倍以上になっているのを還元型
マクロファージ、１／５以下になっているものを酸化型
マクロファージとすることもできる。

【００１４】現在、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスはＩＬ−
６、ＩＬ−１０若しくはＩＬ−４と、ＩＬ−１２が生体
内でどのような割合で産生されるかによって規定される
とされている。前者によって液性免疫に関与するＴｈ２
が、ＩＬ−１２によってＴｈ１が誘導されることが既に
知られている。しかしながら、ＩＬ−６、ＩＬ―10、Ｉ
Ｌ−１２がマクロファージから産生されることは判明し
ているが、同一のマクロファージ細胞がＩＬ−６もＩＬ
−１２もすべてＩＬ−１０産生すると仮定すると、Ｔｈ
１誘導にもＴｈ２誘導にも関与する１種のマクロファー
ジが存在することとなり、生体の免疫応答を考えるに当
り大きな矛盾にぶつかる。

【００１５】本発明者等はＧＳＨ含量の高い還元型マク
ロファージによってのみＩＬ−１２が産生されＴｈ１誘
導に働き、酸化型マクロファージによってはＩＬ−６の
産生が亢進し、Ｔｈ２が誘導されることを見出した。ま
た、Ｔｈ１サイトカインの代表であるＩＦＮγが産生さ
れてもマクロファージが酸化型に傾斜していると、ＩＦ
Ｎγの作用でＴｈ２を誘導するＩＬ−６が大量に産生さ
れることも見出された。逆に、還元型マクロファージが
存在するとＴｈ１サイトカインの代表であるＩＦＮγに
よってマクロファージの還元型形質が一層増強されるこ
とも判明した。酸化型マクロファージが誘導されている
ところにＴｈ２サイトカインの代表であるＩＬ−４が作
用すると酸化型マクロファージの形質が更に増強され
る。これらの知見は液性免疫と細胞性免疫という対局に
ある免疫応答がマクロファージの酸化還元状態によって
一義的に規定されていることを示すもので、免疫学の根
幹に関わる重要な知見である（図２参照）。この知見に
より免疫系疾患の病態診断と治療法について、従来の混
沌とした免疫性疾患治療法に代わる頗る有用で独創的な
発明を既に完成しており、この発明に基づき、糖尿病自
然発症動物について鋭意検討した結果、新しく本発明を
完成するに至った。

【００１６】即ち本発明は、マクロファージ細胞内の還
元型グルタチオン量を変化させる作用を有する物質を含
有することを特徴とする抗糖尿病剤である。更に本発明
には、マクロファージ細胞内の還元型グルタチオン量を
増加させることにより炎症性細胞の膵島浸潤を抑制する
作用、又はマクロファージ細胞内の還元型グルタチオン
量を減少させることによりＩＬ−１２産生、ＮＯ産生、
ＩＦＮγ産生を抑制し、遅延型過敏症反応を抑制する作
用を有する物質を含有することに特徴を有する抗糖尿病
剤も含まれる。本発明においてはマクロファージには単
球、クッパー細胞及び樹状細胞等も含められる。本発明
者等は前記知見に基づき更に研究を糖尿病に特化し、マ
クロファージ細胞内の還元型グルタチオン量を減少させ
たり、増加させる物質を探索し、その効果を発揮する物
質を見出し、ヒトの糖尿病に類似する病態を自然発症す
る動物モデルを作製し、医薬品としての抗糖尿病薬、医
療用食品、健康食品、特定保健食品等に用いる糖尿病治
療、予防、病態改善効果を有する食品例えば栄養剤及び
輸液製剤の開発に研究を深化発展させ、その物質として
下記の化合物を用いて、試験管内の免疫活性の抑制効
果、動物投与下における免疫抑制効果を広く検定し、更
には自発的に糖尿病を発症するＮＯＤ，ｄｂ/ｄｂマウ
スを用いて候補物質の薬効を検討し、マクロファージ及
び単球等の細胞内の還元型グルタチオン量を増加させる
及び低下させる物質としての下記に示す化合物が糖尿病
の治療、予防、病態改善に有効であることを見出した。

【００１７】本発明の抗糖尿病剤に含まれる物質として
は、一つにマクロファージの細胞内の還元型グルタチオ
ン量を増加させることによりインターロイキン１２（Ｉ
Ｌ−１２）の産生を惹起し、炎症性細胞の膵島浸潤を抑
制するものが好ましく、例えばγ−グルタミルシステイ
ン、γ−グルタミルシステインジメチルエステル及びＮ
−アセチルシステインニトロキシブチルエステル等のグ
ルタチオンの前駆体、グルタチオンモノエステル、グル
タチオンニトロキシブチルエステル及びグルタチオンジ
エステル等のグルタチオン誘導体、リポ酸（ＬＩＰＯＩ
Ｃ ＡＣＩＤ）、グリオトキシン及びその誘導体等の、
分子内にメルカプト基（ＳＨ基）を２個以上含有する化
合物、同化合物を生成する前駆体、並びにオルテン（Ｏ
ＲＴＥＮＥ）等から選択される低分子物質がより好まし
く、経口投与又は経皮投与が可能である物質が特に好ま
しい。フラボノイド及びその誘導体等の抗酸化物質のう
ち、マクロファージと接触させることでＧＳＨ含量を上
げ、ＩＬ−１２産生を上げ、ＩＬ−６の産生を下げるも
のを用いることも可能である。また、これらと併用され
る物質として、例えばβ（１−３）グルカン、サイトカ
イン等の高分子物質は、静脈内投与、ＤＤＳ（ドラッグ
デリバリーシステム）等を用いての投与において好まし
い。当該サイトカインとしては、例えばＩＬ−２、ＩＬ
−１２、ＩＬ−１８、ＩＦＮγ等のサイトカインが好ま
しく、細胞性免疫を増強したい場合にはＩＬ−２及び／
又はＩＦＮγ（インターフェロンγ）が特に好ましい。
これらの物質は１又は２以上含有することが可能であ
り、低分子の経口可能な抗糖尿病剤と高分子の静脈投与
に適した免疫調製剤を併用することでより高い効果が期
待される。

【００１８】また、本発明には、マクロファージ細胞内
の還元型グルタチオン量を減少させ、遅延型過敏症反応
を抑制し、ＩＬ−１２，ＩＦＮγ産生を抑制する作用を
有する化合物も含まれる。好ましくは、このような作用
を有する一群の化合物としては分子内にジスルフィド結
合（−Ｓ−Ｓ−）を有する化合物がよい。本発明にはな
かんずくジスルフィド結合を有する化合物がシスチン誘
導体であり、下記構造式（１）で示されるものも含まれ
る。

【００１９】

【化２】

【００２０】但し、上記式中、Ｒ¹及びＲ²はそれぞれ独
立していて、置換基を有していてもよいアルキル基、好
ましくは置換基を有していてもよい炭素数１〜１２のア
ルキル基である。特に好ましくは当該置換基がニトロキ
シ基である。更に好ましくは当該置換基を有していても
よいアルキル基がニトロキシブチル基である。Ｒ³及び
Ｒ⁴はそれぞれ独立していて、アシル基及びペプチジル
基の何れかを、それぞれ表す。尚、ペプチジル基はアミ
ノ酸残基又は複数のアミノ酸で構成されるペプチド残基
でそのカルボキシル基を介して結合する残基である。
又、ニトロキシ基とは、「−ＯＮＯ₂」を意味する。

【００２１】マクロファージ細胞内の還元型グルタチオ
ン量を増加させ、ＩＬ−１２産生を増加させることによ
り炎症性細胞の膵島浸潤を抑制すること、若しくは、並
びにマクロファージ細胞内の還元型グルタチオン量を減
少させることによりＩＬ−１２産生、ＮＯ産生、ＩＦＮ
γ産生を抑制する作用を有する物質を実際の患者に適用
するにあたっては、患者のマクロファージのレドックス
状態を診断することで適切に用いることができる。

【００２２】細胞内の還元型グルタチオン量に差のある
酸化型マクロファージ及び還元型マクロファージの２種
マクロファージの何れか一方を選択的に除去し得る物質
を含有することを特徴とする抗糖尿病剤も本発明に含ま
れる。当該物質としては、例えば、細胞毒性を有するＤ
ＮＡアルキル化剤をグルタチオンに共役させた物質、酸
化型又は還元型マクロファージ特異的抗体とマクロファ
ージに細胞毒性を有する低分子化合物並びにマクロファ
ージに取り込まれた後に細胞毒性を示す物質とを直接又
はリンカーを介して結合させた物質等がある。当該アル
キル化剤としては、例えばサイクロフォスファミド、ニ
ムスチン（ＡＣＮＵ）、マイトマイシンＣ、メルファラ
ン等がある。アルキル化剤とグルタチオンとを直接又は
リンカーを介して共有結合させることにより、グルタチ
オンＳートランスフェレース（グルタチオンＳ−トラン
スフェラーゼ）酵素が活性化されている酸化型マクロフ
ァージでは、当該酵素の働きによりＤＮＡアルキル化剤
が遊離し、酸化型マクロファージを特異的に殺傷するこ
とにより除去することができる。また、インビトロで
は、殺細胞性が無いものの酸化型又は還元型の何れかの
マクロファージ中で増大している酵素の作用により、殺
細胞性を示すようになる物質をプロドラッグとして用い
ることもできる。

【００２３】更に、本発明には、前記抗糖尿病薬として
の医薬品を含むが、前記、治療、予防、病態改善効果を
含有する経口剤の形態にあるもの、食品（医療用食品、
健康食品、特定保健食品等を含む。）、栄養剤又は輸液
製剤の形態にあるものも含まれる。食品としては、通常
の食品や、歯磨きやチューインガム等口の中に運ばれる
ものも含まれ、特に健康志向の食品に含有されるのが好
ましい。また、食品に添加する添加剤の形で用いられて
もよい。栄養剤としては、例えばビタミン剤、カルシウ
ム剤等の何れの栄養剤でもよい。輸液製剤の形態として
は、例えば高カロリー輸液の形態、生理食塩水により希
釈された形態、血液製剤等の通常用いられる輸液製剤に
含有された形態を選択することができる。

【００２４】更に詳細に述べると、本発明は好ましくは
次の通りである。

【００２５】ヒトから分離・採取した体液／細胞試料を
用いて、マクロファージ細胞内の酸化型及び／又は還元
型グルタチオン量を検定することにより、マクロファー
ジをそれぞれ異なった機能を有する酸化型マクロファー
ジと還元型マクロファージとに分類し、その存在割合を
経口摂取できる物質で人為的に制御したり、片方の（酸
化型若しくは還元型の）マクロファージを人為的に除去
することで糖尿病患者治療に有用な薬剤や病態改善、予
防に役に立つ食品、栄養剤、輸液を提供することであ
る。ヒトからの分離・採取した体液／細胞試料とは、例
えば末梢血や腹腔、胸腔、各種臓器より分離した細胞で
ある。

【００２６】グルタチオンの測定方法としては、直接的
に酵素リサイクリング法で生化学的に酸化型又は還元型
グルタチオン含量を測定する（活性酵素実験プロトコー
ル（細胞工学別冊）、秀潤社、頁84-88,1994年、ANALYT
ICAL CHEMISTRY, VOL. 106,PP207-212, 1980; CELLULAR
IMMUNOLOGY, VOL. 164, PP73-80, 1995等参照。）のみ
ならず、間接的な測定、例えば酸化型又は還元型マクロ
ファージに対する特異的なモノクローナル抗体又はポリ
クローナル抗体を用いて測定したり、モノクロロバイメ
インのようにＧＳＨに特異的に反応し、錯体を形成し、
レーザー光励起により蛍光を発するような試薬を用いれ
ばよい。更には高速液体クロマトグラフイー（HPLC）、
ガスクロマトグラフイーを用いることも可能である。

【００２７】

【発明の実施の形態】本発明の実施の形態を更に詳しく
説明する。

【００２８】本発明におけるグルタチオンとは、別名５
−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイニルグリシンであり、
生体内に最も多く存在する、メルカプト基（ＳＨ基）を
有する化合物で、一般にＧＳＨと記述される。グルタチ
オンは、その分子の酸化状態により還元型グルタチオン
と酸化型グルタチオンに分類される。還元型グルタチオ
ンとは、前記のグルタチオン（ＧＳＨ）のことであり、
酸化型グルタチオンは、別名グルタチオンジスルフィド
と呼ばれるもので、ＧＳＳＧと記述される。

【００２９】本発明におけるマクロファージには、前述
の通り単球も含まれる。同時に、樹状細胞やクッパー細
胞と呼ばれるマクロファージの類縁細胞も含まれる。マ
クロファージは、様々なサイトカインや炎症性メディエ
ーター等の情報伝達物質をその細胞から遊離、放出する
ことが知られているが、その活性化状態、分化状態によ
り、放出されるか否か、また、放出される量が異なる。
本発明によれば、例えばマクロファージ細胞内の酸化型
グルタチオンと還元型グルタチオンとの量に着目し、酸
化型マクロファージと還元型マクロファージに分類後、
生体の免疫状態を確認して、本発明の抗糖尿病剤等によ
り、これらマクロファージの酸化還元状態のバランスを
調整することにより、生体内の免疫状態や肝機能、糖代
謝を改善し、インスリン依存性、非依存性糖尿病疾患の
治療、病態改善や予防に役立てられる。

【００３０】還元型マクロファージでは、細胞内の還元
型グルタチオンが酸化型マクロファージより相対的に多
いのに対して、酸化型マクロファージでは、還元型グル
タチオンが還元型マクロファージより相対的に少ない。
また、還元型マクロファージと酸化型マクロファージで
は、還元型ＧＳＨ含量の違いのために転写制御因子の活
性化に違いが生じ、サイトカインや炎症伝達因子の遺伝
子発現に違いが起こり、産生される炎症性サイトカイン
や炎症性メディエーターの種類や量が変化し、炎症の質
が変化する。

【００３１】酸化型マクロファージでは、ＩＬ−６、Ｉ
Ｌ−１、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＴＮＦ、過酸化水素、
スーパーオキシド、ＰＧＥ２等の炎症性サイトカイン及
びメディエータが産生されるのに対して、還元型マクロ
ファージでは、一酸化窒素（ＮＯ）、ＩＬ−１２、ＬＴ
Ｂ４等が産生される。更に、酸化型マクロファージ及び
還元型マクロファージは、刺激等により変換する。例え
ば、炎症や敗血症性ショックを誘導するＬＰＳやＰＭＡ
や、ＩＬ−４、ＴＧＦβ等のサイトカインにより人為的
に刺激することにより、還元型マクロファージは酸化型
に変換され、逆に、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、抗腫瘍性多糖
であるレンチナン（ＬＮＴ）等のβ（１−３）グルカン
やリポ酸等の抗酸化剤を添加することにより、酸化型マ
クロファージを還元型に変換することができる。このこ
とにより、糖尿病疾患の治療に応用することができる。

【００３２】インスリン依存性糖尿病病態動物において
は、早期に炎症性細胞の膵島浸潤が起こり、これら炎症
性細胞の産生するメデイエーターの作用により抗原特異
的な免疫応答なかんずく細胞性免疫が活性化され後期に
活性化された細胞性免疫を介して膵島のランゲルハンス
島が破壊されてインスリンの分泌不全に至り、糖尿病を
発症すると推定されている。発症にいたるまでの病態変
化に伴い、酸化型マクロファージ及び還元型マクロファ
ージの含まれる量が異なることが本発明において初めて
見出された。

【００３３】他の疾患においても病態によって酸化型マ
クロファージ及び還元型マクロファージの含まれる量が
異なることを本発明者らは見出している。消化管炎症疾
患モデル動物（肝炎、クローン病、潰瘍性大腸炎）より
採取したマクロファージ中の還元型グルタチオン量は、
正常動物より相対的に減少していることが、Ａｄｈｅｒ
ｅｎｔ ｃｅｌｌ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ
（ＡＣＡＳ）を用いる画像解析や酵素リサイクリング法
を用いる生化学的定量により判明した。これに対して、
糖尿病を自然発症するＮＯＤマウスにおいてはマクロフ
ァージ等の炎症性細胞の膵島浸潤時期には腹腔内マクロ
ファージ中の還元型グルタチオン量は、正常動物より相
対的に減少しており（酸化型マクロフアージ優位）、ラ
ンゲルハンス島破壊による糖尿病発症時期には、逆に腹
腔内マクロファージ中の還元型グルタチオン量は、正常
動物より相対的に増加して（還元型マクロフアージ優
位）いることが本発明において初めて判明した.このこ
とはインスリン依存性の糖尿病においてはマクロファー
ジのレドックス機能は酸化型への傾斜から、還元型への
傾斜へと病態の進展とともにスイッチのおこることを示
す。この知見は世界で始めてのものであり、免疫性疾患
としてのインスリン依存性糖尿病の治療、予防、病態改
善の手段としてマクロファージ中の還元型グルタチオン
量を修飾することが実際に有益であることを初めて見出
したものである。なかんずく、病態の変化に対応して適
切な治療手段を提供することをはじめて可能とした。本
発明になるこの知見を無視して治療を行うことは逆に病
態を悪化させる危険性をも示唆する重要な知見である。

【００３４】本発明に従えば、好ましくはマクロファー
ジの細胞内の還元型グルタチオン量を上記方法で測定し
た後に、当該マクロファージの細胞内の還元型グルタチ
オン量を変化させる作用を有する低分子化合物で経口摂
取でも活性が保持されるものを医薬品として通常の製剤
化を行い、病態をモニターしつつ連日若しくは一定の期
間をあけ患者に摂取させればよい。

【００３５】本発明での酸化型マクロファージ及び還元
型マクロファージの定義は、還元型グルタチオン（ＧＳ
Ｈ）に特異的な化学試薬モノクロロバイメインと反応さ
せることで細胞内ＧＳＨ量を定量し、無刺激のマクロフ
ァージに比較してＧＳＨ含量が増加しているものを還元
型マクロファージ、逆に含量の低下しているものを酸化
型マクロファージとするものである。更に、経口摂取可
能な低分子物質をマクロファージと２〜２４時間接触さ
せることで、ＧＳＨ含量が２ｎｍｏｌｅｓ／５×１０⁵
マクロファージ細胞以上のものを還元型マクロファー
ジ、０．１ｎｍｏｌｅｓ／５×１０⁵になっているのを
還元型マクロファージ、１／５以下になっているものを
酸化型マクロファージとすることもできる。

【００３６】マクロファージの細胞内の還元型グルタチ
オン量を増加させる作用を有する物質としては、マクロ
ファージの細胞内の還元型グルタチオン量を増加させる
ことによりインターロイキン１２の産生を惹起し、炎症
性細胞の膵島浸潤を抑制するものが好ましく、例えば、
γ−グルタミルシステイン、γ−グルタミルシステイン
ジメチルエステル、Ｎ−アセチルシステインニトロキシ
ブチルエステル等のグルタチオンの前駆体、グルタチオ
ンモノエステル、グルタチオンニトロキシブチルエステ
ル及びグルタチオンジエステル等のグルタチオン誘導
体、リポ酸（ＬＩＰＯＩＣ ＡＣＩＤ）、グリオトキシ
ン及びその誘導体等の、当該分子内にメルカプト基を２
個以上含有する化合物、同化合物を生成する前駆体、並
びにオルテン（ＯＲＴＥＮＥ）から選択される低分子物
質がより好ましく、経口投与又は経皮投与が可能であ
る。フラボノイド及びその誘導体等の抗酸化物質のう
ち、マクロファージと接触させることでＧＳＨ含量を上
げ、ＩＬ−１２産生を上げ、ＩＬ−６の産生を下げるも
のを用いることも可能である。

【００３７】マクロファージ内のＧＳＨ量を減少させる
ものとしては、好ましくは分子内にジスルフィド結合を
有する化合物で、マクロファージ細胞内の還元型グルタ
チオン量を減少させ、遅延型過敏症反応を抑制しＩＬ−
１２、ＩＦＮγ産生を抑制する作用を有する化合物が用
いられる。グルタチオン誘導体もこの中に含まれる。な
かんずくジスルフィド結合を有する化合物が好ましくは
シスチン誘導体であり、更に好ましくは下記構造式
（１）で示されるものを用いることができる。

【００３８】

【化３】

【００３９】但し、上記式中、Ｒ¹及びＲ²はそれぞれ独
立していて、置換基を有していてもよいアルキル基、Ｒ
³及びＲ⁴はそれぞれ独立していて、アシル基及びペプチ
ジル基の何れかを、それぞれ表す。

【００４０】以下に、特に本発明の抗糖尿病剤としてシ
スチン誘導体を使用する場合について説明する。還元型
グルタチオン量を減少させる作用を有する物質について
は、好ましくは前記の通りジスルフィド結合を含有する
化合物群より選択され、ＩＬ−１２産生、ＮＯ産生、Ｉ
ＦＮγ産生を抑制し、遅延型過敏症反応を抑制する作用
を有する物質を本発明においては用いることができるの
であり、前記構造式（１）に示され、マクロファージ細
胞内の還元型グルタチオン量を減少させ、遅延型過敏症
反応を抑制し、ＩＬ−１２、ＩＦＮγ、ＮＯ産生を抑制
する作用を有する化合物であれば全て本発明に使用する
シスチン誘導体に含まれる。

【００４１】この化合物の骨子としては、ジスルフイド
結合によりマクロファージ細胞内の還元型グルタチオン
が酸化されて酸化型マクロファージに誘導されるもので
あれば、式（１）において、Ｒ¹からＲ⁴を表す置換基に
は、広範な範囲のものが許容される。好ましくはＲ¹及
びＲ²はそれぞれ独立していて、置換基を有していても
よい炭素数１−１２のアルキル基、更に好ましくはニト
ロキシブチル基等の置換基を有するアルキル基を、Ｒ³
及びＲ⁴はそれぞれ独立していて、好ましくは炭素数１
−１２のアシル基、及びペプチジル基の何れかを、それ
ぞれ表す。

【００４２】シスチン誘導体として、Ｎ，Ｎ’−ジアセ
チルシスチン（(NAC)₂）、Ｎ，Ｎ’−ジプロピルシスチ
ン（(NPC)₂）、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシスチンジメチル
エステル（(NAC-OMe)₂）、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシスチ
ンジイソプロピルエステル(（NAC-OiPr）₂）、Ｎ，Ｎ’
−ジ−Ｌ−アラニルシスチンジメチルエステル（(NAlaC
-OMe)₂）、これらのニトロキシブチルエステル体等が好
ましい。

【００４３】マクロファージ（又は単球等）を９６穴マ
イクロプレートで、５×１０⁵細胞／２００μｌ／穴宛
培養し、被験物質を０．０１μＭ〜５ｍＭ添加し、 ３
７℃で５％ＣＯ₂インキュベーターで培養し、２〜２４
時間後に対照群に対し 還元型ＧＳＨ量を増加又は減少
させるものならば何れも用いることができる。２ｎｍｏ
ｌｅｓ／５×１０⁵マクロファージ細胞以上に増加させ
る物質又は０．１ｎｍｏｌｅｓ／５×１０⁵マクロファ
ージ細胞以下に減少させることもできるものが望まし
い。これらの薬剤は単独若しくはそれらの混合物として
用いることができる。その効果は摂取若しくは投与後炎
症局所や末梢血から単核球を採取し、前述の方法で細胞
内還元型グルタチオン量の治療前に対する変化を検定す
ることで判定できる。このことで抗糖尿病剤としての有
用性は明確に判定され、疾患に対して効果を有する。

【００４４】対象として用いることのできる疾患として
は、インスリン依存性、非依存性糖尿病やそのハイリス
クの健康状態を挙げることができる。

【００４５】本発明で取扱う抗糖尿病剤は実際の医療現
場では単独で投与することもできるが、本発明に含まれ
る経口摂取可能な抗糖尿病剤同士、若しくは、経口摂取
不可能であるが異なる作用機転でマクロファージの細胞
内の還元型グルタチオン量を変化させる他の免疫調整
剤、例えばレンチナンを代表とするβ（１−３）グルカ
ンや、インターロイキン２（ＩＬ−２）を代表とするサ
イトカイン等生体外由来並びに生体内由来の物質と混合
若しくは併用することもできる。特に、細胞性免疫を増
強したい場合にはＩＬ−２と併用したり、インターフエ
ロンγ（ＩＦＮγ）と併用すると還元型マクロファージ
より大量にインターロイキン１２（ＩＬ−１２）が生体
内で産生され本発明の効果を一層増強する。逆に、細胞
性免疫を減弱することで治療効果を意図する場合にはイ
ンターロイキン４（ＩＬ−４）やＴＧＦβ（形質転換増
殖因子β）と併用するとＩＬ−１２の産生が減弱し効果
を増強する。これらサイトカインはそれ自体がマクロフ
ァージの細胞内の還元型グルタチオン量を変化させるこ
とも本発明者らにより見出され、本発明の有用性とその
範囲を補強するものである。生体外由来の物質としては
抗体以外にもＩＬ−１２の産生や機能を阻害する物質で
あれば併用することにより更なる相乗効果が期待され
る。

【００４６】細胞内の還元型グルタチオン量に差のあ
る、即ち、還元型ＧＳＨ含量の低いマクロファージ（酸
化型マクロファージ）、若しくは高いマクロファージ
（還元型マクロファージ）の何れか一方を選択的に除去
する物質を使用することも本発明に含まれる。その際に
用いられる物質は低分子化合物、高分子化合物の何れで
もよく、中でも抗体及びその誘導体は効率的である。

【００４７】既に述べた通り、マクロファージ／単球等
の機能の多様性と細胞亜集団の対応については今まで全
く不明であった。このため、炎症性、アレルギー性、免
疫性疾患の発症と病態進展に、マクロファージ／単球等
は極めて重要な役割を有しているにも拘らず、マクロフ
ァージ／単球等細胞亜集団の存在を想定しての機能分類
のヒトの疾患の治療、改善、予防への応用は全く為され
ておらず、想定されたことすら無かった。本発明完成の
前段階として、マクロファージの還元型ＧＳＨ含量を測
定するとともに、世界で始めて、ＧＳＨ含量を異にする
マクロファージの免疫機能に及ぼす効果に大きな差のあ
ることを見出し、炎症反応に重要な役割を果たしている
マクロファージ細胞中の酸化型グルタチオンと還元型グ
ルタチオンの含量を検定することにより、不均一なマク
ロファージ集団が２つのタイプ即ち酸化型マクロファー
ジと還元型マクロファージとに分類され、酸化型マクロ
ファージが免疫疾患に伴う局所慢性炎症やアレルギー反
応を引き起こし、液性免疫と細胞性免疫のバランスに関
与するＴｈ１／Ｔｈ２バランスはマクロファージの酸化
／還元状態によって制御されていること、当該マクロフ
ァージの酸化還元状態が免疫性疾患の病態に重要な役割
を果たしていることが見出された。この２種のマクロフ
ァージの存在割合を人為的に制御するには前述の化合
物、好ましくは経口摂取可能な低分子物質を医薬品とし
て用いる以外に、何れか片方のマクロファージを選択的
に除去することも頗る有用な方法である。このことはリ
ンパ球に対する各種モノクローナル抗体が免疫抑制剤と
して上市されている事実からも明らかである。片方のマ
クロファージにのみ若しくは多量に発現されているマー
カーに対する抗体を用いればよいことは当業者には容易
に想定できるところである。

【００４８】また、細胞に対して毒性を有する物質やそ
の誘導体を用いることができるが、還元型マクロファー
ジと酸化型マクロファージの間には細胞内の各種酵素活
性に大きな違いがあるのでプロドラッグの形のもので還
元型マクロファージ若しくは酸化型マクロファージの何
れかの細胞内で選択的に細胞毒性を有する物質に変換で
きるもの等は、本発明に最も叶う。酸化型マクロファー
ジ内で活性が上昇するピリミジンヌクレオチドホスホリ
レース（ピリミジンヌクレオチドホスホリラーゼ）酵素
活性やグルタチオンーＳートランスフエレース（グルタ
チオンーＳートランスフエラーゼ）酵素活性の活用等が
その例であり、細胞毒性を有するアルキル化剤にグルタ
チオンを共役させたもの等がある。

【００４９】本発明の抗糖尿病剤が糖尿病性疾患及び同
疾患に伴う合併症に広く適用できることは、マクロファ
ージからの炎症性伝達因子の分泌を基本的なところで制
御することから明白である。例えば、非ステロイド性酸
性抗炎症剤（アスピリン等）は、プロスタグランジン産
生、遊離を抑制することでその薬効を発揮するといわれ
る。一方、ビタミンＥ等の抗酸化剤は活性酸素の産生を
抑制することで薬効を発揮する等、その作用が図１に示
す炎症性細胞たるマクロファージの多彩な機能の１局面
を制御するのみである。そのため、その効果も著明では
なく、特に慢性炎症には効果は殆ど認められない。それ
に対して本発明になる抗糖尿病剤はマクロファージの酸
化／還元状態を制御することを基本とするもので、有害
な炎症伝達因子の産生を一度に多数抑制できるものであ
る。従来の糖尿病治療剤の概念を基本から変革するもの
といえる。

【００５０】以上のように、本発明の抗糖尿病剤の医療
現場における有用な薬効は、その有用な免疫薬理活性か
らして自明であり、疾患の急性期、慢性期の何れにも、
また糖尿病疾患に随伴する合併症の予防、治療、病態改
善にも有用である。

【００５１】これらの薬剤は単独若しくはそれらの混合
物として用いることができる。その効果は摂取若しくは
投与後炎症局所や末梢血から単核球を採取し、前述の方
法で細胞内還元型グルタチオン量の治療前に対する変化
を検定し、生体の免疫活性の変動を測定することで判定
できる。

【００５２】本発明の抗糖尿病剤の投与形態としては、
注射投与、経口投与、経皮的投与等特に制限はないが、
経口投与が好ましい。有効成分である還元型グルタチオ
ン量を変化させる作用を有する物質の投与量は、患者等
投与対象者の症状や使用目的に応じて選択されるが、１
日当たり１ｍｇ〜５０００ｍｇ（経口剤）程度、好まし
くは１０〜５００ｍｇ程度である。製剤を製造する場合
は特に困難はなく、経口剤、注射剤、経皮剤等所望の剤
型において、それぞれ公知の方法を利用して製造するこ
とができる。

【００５３】以上、本発明になる抗糖尿病剤が狭義の医
薬品として如何に有用で、新規性に優れるかを説明し
た。本発明において、抗糖尿病剤は経口摂取可能な物質
をその主要成分とした場合には、その用途は、医療現場
における医薬品に限られない。即ち、ヒトマクロファー
ジ（単球、クッパー細胞及び樹状細胞等を含む）細胞内
の還元型グルタチオン量を変化させる作用を有する物質
を単独若しくは混合物として含有する医療用食品、健康
食品、特定保健食品等として食品（チューインガムや歯
磨き等の口に入れるものは全て含まれる）並びに、栄養
剤、輸液製剤の形態で提供することも可能で有り、本発
明に含まれる。医療用食品等は固形物であっても、液体
であってもよくその形態を問わない。

【００５４】適用対象としては医薬品として提供する場
合と同じである。糖尿病性疾患及び同疾患に伴う合併症
に広く適用でき、抗糖尿病作用を有する経口剤、食品例
えば栄養剤の形態、輸液製剤の形態で提供することので
きるものである。有効成分の使用量については、前記医
薬品の場合に説明した内容に準じて行うとよい。発症、
慢性化した糖尿病疾患だけでなく、糖尿病のハイリスク
の人に予防的に摂取させることを可能にする。

【００５５】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に
説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものでは
ない。

【００５６】（実施例１） ＜酸化型マクロファージ及び還元型マクロファージの機
能の検定＞ （方法）酸化型マクロファージは、ＬＰＳ（リポポリサ
ッカライド）２０μｇをマウス腹腔内に投与して誘導さ
れること、還元型マクロファージはレンチナン１００μ
ｇを同じく腹腔内に１日おきに３回投与することにより
誘導されていることが、腹腔浸出細胞をプラスチック表
面に付着させた後、モノクロロバイメイン１０μＭと３
７℃、３０分間反応させ、ＡＣＡＳで解析することで判
明した。酸化型の増量は反応産物が殆ど認められないこ
と、即ちネズミ色や青色の画像になること、還元型の増
量は赤色や黄色の画像が得られることから肉眼的に容易
に検定できる。

【００５７】そこで、腹腔浸出付着細胞を以下のように
して酸化型及び還元型に誘導して産生されるＮＯ、ＩＬ
−６、ＰＧＥ２を測定した。

【００５８】（１）材料 細胞：上記のように刺激して得られた腹腔浸出付着細
胞、即ちマクロファージを９６穴マイクロプレートに１
×１０⁵細胞／２００μｌ宛添加。 培地：フエノールレッドフリーのＲＰＭＩ１６４０：２
００μｌ／穴。 ＬＰＳ：リポポリサッカライド（シグマ社製）（由来：
Ｅ．ｃｏｌｉ）１００ｎｇ／ｍｌ。 ＩＦＮγ：１００単位／ｍｌ。

【００５９】（２）培養方法 ５％ ＣＯ₂インキュベーター中３７℃で、４８時間培
養。

【００６０】（３）測定方法 上記培養終了後、培養上清を回収し、ＩＬ−６はＩＬ−
６依存性の細胞株のＭＨ６０を用いて増殖反応で、ＰＧ
Ｅ２はエライザキットを用いて、ＮＯはグリースロイミ
ン試薬を用いて、何れも当業者が日常に行う方法で各々
の産生量を測定した。

【００６１】（結果）結果を図３に示した。図３から明
らかなように、酸化型マクロファージと還元型マクロフ
ァージとでは、産生する炎症性サイトカインＩＬ−６、
炎症性メディエーターＰＧＥ２、ＮＯの産生強度、種類
が異なることが明らかである。即ち、酸化型マクロファ
ージではＴｈ２サイトカインであるＩＬ−６の産生と免
疫抑制性でＴｈ１誘導を抑制するＰＧＥ２産生が上昇
し、ＮＯ産生は低下する。これとは対照的に還元型マク
ロファージからはＮＯの産生が上昇し、ＰＧＥ２産生や
ＩＬ−６産生は抑制される。両マクロファージの間に機
能的な差異が存在することが明確である。

【００６２】（実施例２） ＜糖尿病自然発症ＮＯＤマウス病態動物を用いた検定＞
酸化型Ｍφと還元型Ｍφにおいて、何故炎症メディエー
ターやサイトカインの産生に違いが生じるのかを物質レ
ベルで解析することは、炎症の慢性化、増悪のメカニズ
ムを解明するために重要である。一般に、外からの刺激
（リガンド等）は、細胞表面上に存在する受容体（レセ
プター）を介して細胞内に伝達する。レセプターからの
信号により、種々のキナーゼが活性化され、更に転写因
子が活性化され、転写因子が核内に移行し、標的となる
遺伝子に結合して発現する。最近の研究により、細胞内
の酸化還元系は、転写因子の活性化、核内への移行、遺
伝子との結合に関与していることが明らかとなりつつあ
る（ANNUAL REV. IMMUNOLOGY, VOL.8, PP453-475,1990,
EMBO J.,10,2247-2251, 1991)。Ｍφにおける炎症メデ
ィエーターやサイトカインのレセプターを介した遺伝子
発現系に、細胞内の酸化還元系がどのように関与してい
るかは現在のところ明らかではない。

【００６３】（サイトカイン、刺激剤）マウスＩＦＮγ
には、ゲンザイム社製のリコンビナント体を用いた。ヒ
トＩＬ−２及びヒトＩＬ−６には、味の素社製のリコン
ビナント体を用いた。ヒトＩＬ−１２には、ファーミン
ジェン社製のリコンビナント体を用いた。

【００６４】ＬＰＳには、ディフコ社製のＥ．Ｃｏｌ
ｉ．０５５；Ｂ５由来のものを用いた。レンチナンとし
ては、味の素社で製造した製剤品を用いた。

【００６５】（使用したマウス）インスリン依存性糖尿
病病態動物としてのＮＯＤマウスは日本クレアより購入
し、主として雌マウスを実験に供した。対照として用い
た野生型マウスは、日本チヤールスリバァー（ＣＲＪ）
より購入したＩＣＲマウスを用いた。インスリン非依存
性糖尿病病態動物としては日本クレアより購入したｄｂ
/ｄｂマウスを用いた。

【００６６】（腹腔Ｍφの採取）腹腔細胞の採取は、エ
ーテルにより犠牲死させたマウスの腹腔内に、氷冷した
５ｍｌのフェノールレッドフリーのＤＭＥＭ培地（日研
生物社製）を２２ゲージの針を付けた注射筒により注入
し、しごいた後、培地を抜き取ることにより行った。

【００６７】（ＩＬ−６の定量）１×１０⁶個のＭφに
刺激剤を添加し、３７℃のＣＯ₂インキュベーターにて
２日間培養した。遠心後培養上清を採取した。

【００６８】ＩＬ−６の定量は、ＩＬ−６に依存的に増
殖するマウスハイブリドーマＭＨ６０細胞を用いて行っ
た（EUR.J.IMMUNOL.,VOL. 18, PP 951, 1988)。１０％
ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培地で１×１０⁵個／ｍｌに調製し
たＭＨ６０細胞液１００ μｌに、培養上清１００μｌ
を添加し、３７℃のＣＯ₂インキュベーターにて、 ２日
間培養した。その後、同培地にて５ｍｇ／ｍｌの濃度に
調製したＭＴＴ（シグマ社製）を１０μｌ加え、３７℃
にて５時間反応させた。反応終了後遠心し、上清を１６
０μｌ取り除き、塩酸−プロパノールを１００μｌ加え
て、ピペットマンで懸濁することにより細胞を溶解し
た。溶解後直ちに５７０ｎｍの吸光度をイムノメーター
（バイオラッド社製）により測定した。

【００６９】（ＮＯ₂−濃度の測定）１×１０⁶個のＭφ
に刺激剤を添加し、３７℃のＣＯ₂インキュベーターに
て２日間培養した。遠心後培養上清を採取した。

【００７０】１００μｌの培養上清に、５０ｍｇ／ｍｌ
の濃度に蒸留水で調製したグリースロイミン試薬（和光
純薬社製）を１００μｌ加えて室温で１５分間反応させ
た。反応終了後、５４０ｎｍの吸光度を測定した。尚、
スタンダードとして、ＮａＮＯ₂を用いた。

【００７１】（ＡＣＡＳによる細胞内ＧＳＨの検出）Ｃ
ｈａｍｂｅｒｅｄ ｃｏｖｅｒｇｌａｓｓ（Ｎｕｎｃ社
製、＃１３６４３９）に、ＲＰＭＩ１６４０培地（フェ
ノールレッドフリー）にて調製した３×１０ ⁵個／ｍｌ
の細胞懸濁液を３００μｌ入れ、３７℃のＣＯ₂インキ
ュベーターにて２時間培養した。同培地にて洗浄後、同
培地にて調製した１０μＭのモノクロロバイメイン（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｌｏｂｅ社製）を３００μｌ添加
し、３７℃のＣＯ₂インキュベーターに入れ、３０分反
応させた後、ＡＣＡＳにて蛍光 強度を測定した。尚、
ＡＣＡＳではＵＶレーザーを用いた。

【００７２】（ＩＬ−１２の定量）ＩＬ−１２定量は、
ヒトＴ細胞株２Ｄ６細胞を用いたバイオアッセイで行っ
た(J.LEUKOCYTE BIOLOGY, VOL 61, PP346, 1997)。

【００７３】５００ｐｇ／ｍｌのリコンビナントヒトＩ
Ｌ−１２、５０μＭの２−メルカプトエタノール、１０
％ＦＣＳ（牛胎児血清）を含むＲＰＭＩ１６４０培地に
て培養しておいた２Ｄ６細胞をチューブに移し、ＩＬ−
１２を除いた同培地にて３回遠心洗浄し、細胞濃度を１
×１０⁵／ｍｌに調製した。予め５０μＭの２−メルカ
プトエタノール、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０
培地により系列希釈したサンプルを１００μｌづつ入れ
た９６穴平底プレートに、細胞懸濁液を１００μｌづつ
加えた。その後、３７℃、５％ＣＯ₂インキュベーター
に入れ、４８時間培養した。最後の６時間で、3Ｈ−Ｔ
ｄＲをパルスした（５０μＭの２−メルカプトエタノー
ル、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地により、
３７０ｋＢｑ／ｍｌに調製したものを５０μｌづつ添
加）。細胞をハーベストし、βカウンター（マトリック
ス９６；パッカード社製）で放射活性を測定した。

【００７４】（ＮＯＤマウスより調製したＭφのＧＳＨ
濃度の測定）前述の方法で腹腔細胞を調製し、ＭＣＢ試
薬を用いたＡＣＡＳにより、細胞内ＧＳＨ量を解析し
た。対照のマウスに比べ、３−５週令のＮＯＤマウスに
おいては、還元型グルタチオンの量は著明に減少し、発
症マウスにおいては逆に著明に増大した。

【００７５】（ＮＯＤマウスより調製したＭφの機能）
野生型マウスと、ＮＯＤマウスより腹腔細胞を調製し、
ＬＰＳ、ＩＬ−２、ＩＦＮγ及びその組み合わせにより
刺激し、ＮＯ産生及びＩＬ−１２産生能を測定した。Ｉ
Ｌ−１２産生に関しては、無刺激では何れのマウスでも
殆ど産生がみられないが、ＬＰＳとＩＦＮγ刺激の組み
合わせにおいて、３−５週令のＮＯＤマウスにおいて
は、産生は認められず、発症マウスにおいては産生が認
められた。ＮＯ産生は３−５週令のＮＯＤマウスにおい
ては、対照の３−４分の１に低下し、発症マウスにおい
ては逆に対照の２−３倍に産生量は増大した。このこと
は、ここに用いたＮＯＤ病態動物は炎症性細胞の膵島浸
潤時期には酸化型マクロファージが優位でＴｈ２主流の
液性免疫が亢進し、Ｔｈ１によって担われる細胞性免疫
が低下していることを示す。一方、ランゲルハンス島の
破壊による糖尿病発症、インスリン分泌不全状態の時期
には還元型マクロファージが優位でＴｈ１主流の細胞性
免疫が亢進し、Ｔｈ２によって担われる液性免疫が低下
していることを示す。病態動物モデルにおいても、本発
明の抗糖尿病剤提供や適用に必要な疾患の病態診断が独
創的で、有意義であることを明確に示す例である。

【００７６】（実施例３） ＜ＮＯＤマウスにおける還元型グルタチオン測定による
検定＞ （方法）ＮＯＤマウス及び対照マウスの腹腔から採取し
たマクロファージの酸化型及び還元型の検定を行った。
マウスに生理食塩水５ｍｌを腹腔内注射し、腹腔内マク
ロファージを採取し３×１０⁶個／ｍｌになるように１
０％牛胎児血清含有フエノールレッドフリーの ＲＰＭ
Ｉ１６４０培地に懸濁し、１００μｌ宛Ｌａｂ−Ｔｅｋ
Ｃｈａｍｂｅｒ Ｓｌｉｄｅ（ＮＵＮＣ社製、＃１３６
４３９）に添加し、３７℃、５％ＣＯ₂条件下、３時間
培養し、浮遊細胞を除去した後、血清非含有の上記培地
を２００μｌ添加し、次いでモノクロロバイメイン（Ｍ
ＯＮＯＣＨＬＯＲＯＢＩＭＡＮＥ＝ＭＣＢ）を１０μＭ
になるように添加し、３０分間反応させ、ＡＣＡＳ装置
（ＭＥＲＩＤＩＥＮ社製）にてＵＶ吸収を基に画像解析
した。

【００７７】（結果）ＡＣＡＳ法により、還元型グルタ
チオンを定量した結果、対照マウスに比べ、３−５週令
のＮＯＤマウスにおいては、還元型グルタチオン含量が
減少したマクロファージ、即ち酸化型マクロファージが
相対的に増量した。酸化型マクロファージが増量してい
るため、上記マクロファージ培養上清中のＩＬ−６が著
明に増量していた（対照マウスの１２０ｐｇ／ｍｌに対
して、４３０ｐｇ／ｍｌ）。発症マウスにおいては還元
型グルタチオン含量が増加したマクロファージ、即ち還
元型マクロファージが相対的に増量した。数多くのパラ
メーターを測定しなくてもマクロファージの酸化還元状
態をグルタチオンの含量を測定することで糖尿病患者の
病態、免疫機能診断等のための検定を簡便且つ的確に行
うことができることを示す。このこのことにより、本発
明の抗糖尿病剤の使用に当たり、以上のマクロファージ
分類方法により、糖尿病患者の病態、免疫機能診断等の
ための検定を行うことができる。

【００７８】（実施例４） ＜３−５週令ＮＯＤマウスへの薬剤投与による還元型マ
クロファージの誘導＞４週令のＮＯＤマウスに、毎日１
ｍｇ／０．５ｍｌ／ｈのグルタチオンエチルエステルを
１日おきにゾンデを用いて５回経口投与した。そのマウ
スより実施例３と同様の方法で腹腔内細胞を採取し、腹
腔内マクロファージを採取し３×１０ ⁶個／ｍｌになる
ように１０％牛胎児血清含有フエノールレッドフリーの
ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、１００μｌ宛Ｌａｂ−
ＴｅｋＣｈａｍｂｅｒ Ｓｌｉｄｅ（ＮＵＮＣ社製、＃
１３６４３９）に添加し、３７℃、５％ＣＯ₂条件下、
３時間培養し、浮遊細胞を除去した後、血清非含有の上
記培地を２００μｌ添加し、次いでモノクロロバイメイ
ンを１０μＭになるように添加し、３０分間反応させ、
ＡＣＡＳ装置（ＭＥＲＩＤＩＥＮ社製）にてＵＶ吸収を
基に画像解析した。

【００７９】（結果）ＡＣＡＳ法により、還元型グルタ
チオンを定量した結果、対照生理食塩水投与群ＮＯＤマ
ウスに比べ、グルタチオンエチルエステル投与のＮＯＤ
マウスでは、還元型グルタチオン含量が減少したマクロ
ファージ、即ち酸化型マクロファージが相対的に減量し
た。還元型マクロファージが増量しているため、上記マ
クロファージ培養上清中のＩＬ−６が著明に減量してい
た（対照マウスの３８００ｐｇ／ｍｌに対して、４６０
ｐｇ／ｍｌ）。マクロフアージのレドックス状態がグル
タチオンエチルエステルの経口投与で改善できることが
判明した。同様の作用はγ−グルタミルシステインジメ
チルエステルの腹腔内投与（２ｍｇ/０．５ｍｌ/匹、４
週令より１日おき５回投与）、Ｎ−アセチルシステイン
ニトロキシブチルエステルの腹腔内（０．５ｍｇ/０．
５ｍｌ/匹、４週令より１日おき５回投与）、経口投与
（１ｍｇ/０．５ｍｌ/匹、４週令より１日おき５回投
与）、グルタチオンモノエチルエステル（２ｍｇ/０．
５ｍｌ/匹、４週令より１日おき５回投与、腹腔内、経
口）、グルタチオンニトロキシブチルエステル０．５ｍ
ｇ/０．５ｍｌ/匹、４週令より１日おき５回投与、腹腔
内、経口）及びグルタチオンジエチルエステル（２ｍｇ
/０．５ｍｌ/匹、３週令より１日おき６回投与、腹腔
内、経口）の経口、腹腔内投与、リポ酸（ＬＩＰＯＩＣ
ＡＣＩＤ）の腹腔内投与（４ｍｇ/０．５ｍｌ/匹、４
週令より１日おき５回投与）でも認められた。

【００８０】（実施例５） ＜ザルコイドーシス疾患患者から採取したマクロファー
ジの検定とその酸化状態の還元状態への変換＞ザルコイ
ドーシス（類肉腫症）の疾患の患者の末梢血及び胸腔内
より常法により分離・採取した単核球中に含まれるマク
ロファージの酸化型及び還元型マクロファージの量を酵
素リサイクリング法により、還元型グルタチオン（ＧＳ
Ｈ）及び酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）の量を生化学
的に測定することにより検定を行った。対照としては健
常人の末梢血を用いた。

【００８１】（材料）健常人の末梢血及びザルコイドー
シス患者の末梢血をヘパリン採血或は患者の気管支に経
気管支鏡（ＢＲＯＮＣＨＯＦＩＢＥＲ）的に１５０ｍｌ
の生理食塩水を注入し、７５ｍｌを回収して、何れもフ
ィコールーハイペーク（ＬＹＭＰＨＯＰＲＥＰ）で分離
精製した単核球を１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４
０倍地に懸濁し、３回洗浄後、ガラスシャーレに３０分
間付着させたマクロファージ／単球画分を用いた。この
後、５ｍＭのＮーアセチルシステイン（ＮＡＣ）を添加
して３時間培養する群及び培地成分のみの群を調製し
た。シャーレからの分離にはラバーポリースマンを用い
た。５×１０⁶個のマクロファージについて以下のよう
に検定を実施した。

【００８２】（方法）還元型と酸化型のグルタチオンの
測定は前述の酵素リサイクリング法によった。

【００８３】（サンプル調製）ＰＢＳにて洗浄した細胞
のペレットに、冷やした５ｍＭＥＤＴＡを含む０．１Ｍ
リン酸バッファー、ｐＨ７．５により調製したＴｒｉｔ
ｏｎＸ−１００を１００μｌ添加し、５分間室温に放置
して細胞を溶解した。０．１ＭのＨＣｌを１５μｌ添加
し、更に５０％ ｓｕｌｆｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃ
ｉｄ（ＳＳＡ）溶液を１５μｌ添加して混合後、１２，
０００ｒｐｍで５分間遠心して上清を採取し［＊］、総
グルタチオン濃度（ＧＳＨ＋ＧＳＳＧ）の測定サンプル
とした。

【００８４】（測定法）０．５ｍＭＥＤＴＡを含む１０
ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．５を５９０μｌ、６ｕ
／ｍｌの濃度に同バッファーで調製したグルタチオンリ
ダクターゼ（ベーリンガーマンハイム社製）を１００μ
ｌ、５％ＮａＨＣＯ₃にて調製した４ｍＭのＮＡＤＰＨ
（シグマ社製）を５０μｌ、サンプルを１０μｌ加え
て、３７℃にて５分間インキュベートし、５ｍＭＥＤＴ
Ａを含む０．１Ｍリン酸バッファー、ｐＨ７．５により
調製した１０ｍＭの５，５’−ｄｉｔｈｉｏ−ｂｉｓ
（２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）（ＤＴＮ
Ｂ；シグマ社製）溶液を５０μｌ加えて、３７℃におけ
る４１２ｎｍの吸光度の経時的変化を分光光度計により
測定した。尚、標準サンプルとして、ＧＳＨ（シグマ社
製）をサンプルと同じ調製法で調製して用いた。別途、
酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）量のみを測定し−−上
記＊印の後に、２μｌの２ービニルピリジン（東京化成
社製）を添加し、室温で１分間混和しｐＨを７．５に調
製後、室温に６０分間放置し、測定サンプルとし、同様
に測定する−−総グルタチオン量より差し引くことで還
元型グルタチオン（ＧＳＨ）量を求めた。

【００８５】（結果）患者の末梢血中の還元型と酸化型
グルタチオンの量はＧＳＳＧ ５．２９μＭ、ＧＳＨ
２０．４５μＭと還元型ＧＳＨが還元型が約８０％で、
依然として優位であるが（健常人においては９０％以上
が還元型ＧＳＨである）、胸腔内マクロファージでは還
元型ＧＳＨが１．４５μＭであり、酸化型ＧＳＳＧが１
５．８５μＭと酸化型が約８６％とその存在比が完全に
逆転することが判明した。ＮＡＣ添加群においては、還
元型ＧＳＨが２０．４５μＭであり、酸化型ＧＳＳＧが
４．３２μＭと酸化型が急激に減少し、還元型の比率が
８０％を超え、末梢血レベルに回復した。このことは、
本疾患において酸化型マクロファージが病態形成に大き
な位置を占めること、その病態がＮＡＣ投与で改善でき
ることを示し、本発明の効果は単に病態動物に留まら
ず、糖尿病患者やそのハイリスクの人においても有用で
あることを示唆するものである。

【００８６】（実施例６） ＜還元型、酸化型マクロファージからのＩＬ−１２産生
の差異＞Ｔ細胞の分化過程、選択過程、機能発現過程に
異常があると、生体の免疫系が破綻することから、免疫
系の中心的役割は、Ｔ細胞により担われていると考えら
れる。Ｔ細胞の亜集団の一つであるヘルパーＴ細胞（Ｔ
ｈ）は、リンホカインを産生することにより、免疫担当
細胞や炎症性細胞を制御している細胞であるが、最近、
Ｔｈは、産生するリンホカインの種類により、更にＴｈ
１とＴｈ２の２種類に分けられ、それぞれが異なった免
疫機能を担っているという考えが提唱されている（J. I
MMUNOL., VOL. 136, PP 2348, 1986)。即ち、Ｔｈ１
は、Ｉ Ｌ−２やＩＦＮγを産生し、細胞性免疫の調節
の主体であり、Ｔｈ２はＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６
やＩＬ−１０を産生し、液性免疫の調節の主体であり、
生体内の免疫調節の恒常性は、Ｔｈ１とＴｈ２のバラン
スにより保たれているとする考えである。通常は、Ｔｈ
１／Ｔｈ２バランスがどちらかに傾くと、それを是正す
ることにより恒常性が維持されるが、何らかの原因によ
りバランスが是正されない状態が持続すると免疫病が発
症すると考えられている。Ｔｈ１とＴｈ２は、Ｔｈ０と
いう段階からそれぞれに分化するが、Ｔｈ０からＴｈ１
への分化にはＭφの産生するＩＬ−１２が重要であり(I
MMUNOLOGY TODAY, VOL.335, PP 14, 1993)、Ｔｈ０から
Ｔｈ２への分化にはＮＫＴ細胞が産生するＩＬ−４が重
要である(J.EXP. MEDICINE, VOL.179, PP 1285, 199
4)。

【００８７】Ｍφのレドックス状態の相違によりＭφ機
能が異なることは前出の各実施例より明らかである。Ｍ
φには、ＧＳＨ量の相違から酸化型Ｍφと還元型Ｍφの
２種類のＭφが存在し、ＮＯやＩＬ−６産生パターンが
異なる。Ｔｈ０からＴｈ１への分化を誘導し、Ｔｈ１／
Ｔｈ２バランス制御の鍵の分子であるＩＬ−１２の主な
産生細胞はＭφと考えられるが、その詳細な解析はこれ
まで報告されていない。ＩＬ−１２の産生は、酸化型Ｍ
φと還元型Ｍφで異なるのか否かは、免疫病の発症メカ
ニズムの観点からも興味深い点である。本発明者等は、
ＩＬ−１２が還元型Ｍφからのみ産生することを見出す
とともに、ＩＬ−１２と同じくＴｈ１／Ｔｈ２バランス
制御を行っていると考えられているＩＬ−４が、酸化型
Ｍφ、還元型Ｍφに作用し、Ｔｈ２側へシフトさせてい
ることを見出した。本発明の完成に先立って得られたこ
れらの知見を基に、Ｍφのレドックス状態が、Ｔｈ１／
Ｔｈ２バランスを制御していることを示し、本発明を使
用する上で免疫系疾患の病態診断に如何に有用かを説明
する。

【００８８】（ＩＬ−１２は還元型Ｍφから産生され
る）実施例１において、レンチナン（ＬＮＴ）を腹腔内
注射して調製したＭφは、ＧＳＨ量の高い還元型であ
り、ＬＰＳを腹腔内注射して調製したＭφは、ＧＳＨ量
の低い酸化型であることを示した。ＬＮＴ誘導ＭφとＬ
ＰＳ誘導Ｍφにおいて、ＩＬ−１２産生能が異なるか否
かを検討した。ＬＰＳとＩＦＮγの刺激により、ＬＮＴ
誘導Ｍφでは著明なＩＬ−１２産生（１３１２ｐｇ／ｍ
ｌ）がみられたが、ＬＰＳ誘導Ｍφ及び対照のレジデン
トＭφでは産生がみられなかった（図４）。次に、細胞
内ＧＳＨ量を変化させる物質を腹腔内注射して調製した
Ｍφを用いて同様の解析を行った。細胞内ＧＳＨ量を増
加させる物質であるグルタチオンモノエチルエステル
（ＧＳＨ−ＯＥｔ）、低下させる物質であるマレイン酸
ジエチルエステル（ＤＥＭ）をそれぞれ投与し調製した
Ｍφでは、ＧＳＨ−ＯＥｔ投与マウス由来Ｍφでのみ、
ＬＰＳとＩＦＮγ刺激によりＩＬ−１２が産生された
（３５７０ｐｇ／ｍｌ）。これらの結果は、細胞内のＧ
ＳＨ量の多い還元型Ｍφでのみ、ＩＬ−１２が産生され
ることを示す。

【００８９】（還元型ＭφからのＩＬ−１２産生は、細
胞内ＧＳＨ量を低下させることにより抑制される）細胞
内のＧＳＨ量の多い還元型Ｍφでのみ、ＩＬ−１２が産
生されることを示したが、この産生は、Ｍφを酸化型に
することにより抑制されるか否かを検討した。即ち、レ
ンチナン誘導Ｍφを、ＤＥＭ刺激することにより、ＩＬ
−１２の産生が抑制されるかを解析した。その結果、レ
ンチナン誘導ＭφからのＩＬ−１２産生（８２８ｐｇ／
ｍｌ）は、ＤＥＭを添加することにより、完全に抑制さ
れる（０ｐｇ／ｍｌ）ことが明らかとなった。即ち、Ｄ
ＥＭ処理により細胞内の還元型グルタチオンを枯渇さ
せ、還元型Ｍφを酸化型Ｍφへと変換することにより、
ＩＬ−１２産生は抑制されることが示唆された。

【００９０】（ＩＬ−４は、還元型ＭφからのＩＬ−１
２産生を抑制する）ＩＬ−４は、Ｍφに作用し、抑制的
に働くとされているサイトカインである。ＩＬ−４は、
Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスの制御においても、ＩＬ−１２
と相対する作用を有していると考えられている。そこ
で、ＩＬ−４が、還元型ＭφからのＩＬ−１２産生に対
し、抑制的に作用するか否かを検討した。ＬＮＴ誘導Ｍ
φからのＩＬ−１２産生及びＧＳＨ投与マウス由来Ｍφ
からのＩＬ−１２産生ともに、ＩＬ−４で前処理するこ
とによりは著明に抑制することが明らかとなった（各々
１５８０ｐｇ／ｍｌより３７０ｐｇ／ｍｌへ、４９０ｐ
ｇ／ｍｌより２５８ｐｇ／ｍｌへ）。即ち、ＩＬ−４は
Ｍφに作用し、ＩＬ−１２産生を抑制することにより、
Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスをＴｈ２側にシフトしている可
能性が示唆された。この際、ＩＬ−４はＭφ中の還元型
グルタチオン量を著明に減少させることがＡＣＡＳによ
る画像解析で判明した。

【００９１】（ＩＬ−４は、ＮＯ産生を抑制し、ＩＬ−
６産生を亢進する）還元型Ｍφは、酸化型Ｍφに比較し
てＩＦＮγ刺激でのＮＯ産生が亢進し、逆にＩＬ−６産
生は抑制される。ＩＦＮγは、Ｔｈ１細胞から産生され
るサイトカインとして知られており、ＩＬ−４がＩＦＮ
γによるＮＯ産生及びＩＬ−６産生に対し、どのような
作用を示すか、それぞれのＭφを用いて解析した。ＩＬ
−４で前処理したＭφ（レジデント、ＬＰＳ誘導、ＬＮ
Ｔ誘導）にＩＦＮγを作用させ、ＮＯ産生量を測定した
ところ、ＩＬ−４で処理していないＭφに比較して、Ｉ
Ｌ−４処理したＭφからのＮＯ産生は有意に抑制され
た。また、ＧＳＨ−ＯＥｔ刺激により細胞内ＧＳＨ量を
増加させたＭφ及びＤＥＭ刺激により細胞内ＧＳＨ量を
低下させたＭφをＩＬ−４で前処理後、ＩＦＮγとＬＰ
Ｓを作用させてＮＯ産生量を測定したところ、ＩＬ−４
未処理に比較して、著明にＮＯ産生が抑制された。

【００９２】一方、ＩＬ−６産生は、レジデントＭφ、
ＬＰＳ誘導Ｍφ、ＬＮＴ誘導Ｍφ何れともＩＬ−４によ
り前処理することにより、ＩＦＮγでの産生が著しく亢
進した。更に、ＧＳＨ−ＯＥｔ刺激により細胞内ＧＳＨ
量を増加させたＭφ及びＤＥＭ刺激により細胞内ＧＳＨ
量を低下させたＭφをＩＬ−４で前処理後、ＩＦＮγを
作用させてＩＬ−６産生量を測定したところ、ＩＬ−４
未処理に比較して、著明にＩＬ−６産生が亢進された。
これらの結果より、ＩＬ−４は、細胞内還元型グルタチ
オン量を減少させることにより、酸化型マクロファージ
を誘導し、ＩＦＮγ刺激によるＮＯ産生を抑制し、ＩＬ
−６産生を亢進することが明らかとなった。このこと
は、ＩＬ−４はＩＦＮγの作用、即ちＴｈ１型の作用と
考えられるＮＯ産生を抑制し、本来ＩＦＮγは弱い作用
であったＩＬ−６産生誘導を亢進させ、Ｔｈ２型の作用
を増強させる活性を有していることを示すものである。
本知見は本発明になる抗糖尿病剤の有用性を科学的に証
明するものである。

【００９３】（実施例７） ＜経口摂取ＮＡＣとＩＬ−２の併用によるＩＬ−１２産
生の増強＞ＤＢＡ／２♀の８週令のマウスに実施例６同
様の方法で水道水を自由飲水させる群とＮＡＣ１ｍｇ／
ｍｌ濃度の水道水を自由飲水させる２群を作り、更に各
々の群にヒトリコンビナントＩＬ−２：２μｇ／０．５
ｍｌ／ｈを１日２回隔日に２週間腹腔内投与を併用する
群を設定した。１４日目に実施例６同様にＭφからのＩ
Ｌ−１２産生量を検定した。

【００９４】（調製したＭφのＧＳＨ濃度の測定）それ
ぞれの処置を受けたマウスの腹腔細胞を調製し、ＭＣＢ
試薬を用いたＡＣＡＳにより、細胞内ＧＳＨ量を解析し
た。対照のマウス（水道水自由飲水群）に比べ、ＮＡＣ
溶解水道水自由飲水群及びＩＬ−２投与群において、還
元型グルタチオンの量は著明に増加し、還元型Ｍφの画
像を示した。ＮＡＣ溶解水道水自由飲水にＩＬ−２投与
を併用する群においては何れの単独群よりも還元型グル
タチオンの量は更に増加し、還元型Ｍφの誘導における
併用効果がＡＣＡＳ画像解析で明瞭に認められた。併用
群では、全てのＭφ中に還元型グルタチオンの量の増加
が認められた（単独処置群の増量が４０−５０％のＭφ
に認められることと対照的である）。

【００９５】（各群より調製したＭφの機能）４群、そ
れぞれのマウスより腹腔細胞を調製し、ＬＰＳ＋ＩＦＮ
γにより刺激し、ＮＯ産生、ＩＬ−６産生、及びＩＬ−
１２産生能を測定した。単独投与、併用群の３群何れも
対照群に対して還元型マクロファージが増量しているた
め、上記マクロファージ培養上清中のＩＬ−６量が減少
した（対照マウスの１２４０ｐｇ／ｍｌに対して、ＮＡ
Ｃ溶解水道水自由飲水群３２０ｐｇ／ｍｌ、ＩＬ−２投
与群５２０ｐｇ／ｍｌ、ＮＡＣ溶解水道水自由飲水にＩ
Ｌ−２投与を併用する群６７ｐｇ／ｍｌ）。ＩＬ−６が
Ｔｈ２を誘導する主たるサイトカインであること考える
と、これらのＮＡＣ経口摂取にＩＬ−２なるサイトカイ
ンの注射による併用で生体のＴｈ１／Ｔｈ２バランスが
より強力に制御できることを明確に示す。ＮＯ産生の増
強パターンはＩＬ−６産生と逆相関した。ＩＬ−１２産
生については、対照マウスの０ｐｇ／ｍｌに対して、Ｎ
ＡＣ溶解水道水自由飲水群６２０ｐｇ／ｍｌ、ＩＬ−２
投与群９４６ｐｇ／ｍｌ、ＮＡＣ溶解水道水自由飲水に
ＩＬ−２投与を併用する群２３８６ｐｇ／ｍｌと著明な
併用効果が認められた。本発明が、サイトカイン類との
併用で、免疫系疾患としての糖尿病の著しい病態改善に
有益な抗糖尿病剤として独創的で、有意義であること示
す。

【００９６】（実施例８） ＜(NAC-OMe)_{2 、}投与による酸化型マクロファージの誘導
＞酸化型マクロファージは (NAC-OMe)₂２０μｇ／0.5m
l／h、若しくは アセチルグリオトキシン１０μｇ／0.5
ml／h をd１、d２にマウス腹腔内に投与して誘導される
こと、還元型マクロファージは NAC 2 mｇ／0.5ml／h
を同じく腹腔内にd１、d２投与することにより誘導され
ていることが、投与終了後20時間後に腹腔浸出細胞を採
取し、プラスチック表面に付着させた後、モノクロロバ
イメイン１０μＭと３７℃、３０分間反応させ、ＡＣＡ
Ｓで解析することで判明した。酸化型の増量はモノクロ
ロバイメインとの反応産物が殆ど認められないこと、即
ちネズミ色や青色の画像になること、還元型の増量は赤
色や黄色の画像が得られることから肉眼的に容易に検定
できる。免疫抑制作用のよく知られるステロイド剤の代
表であるデキサメサゾン40 μｇ／0.1ml／hを マウス背
部皮下にd１、d２に投与して２０時間後に誘導されるマ
クロファージは殆どネズミ色の画像になること、即ち酸
化型マクロファージが強力に誘導されることが判明し
た。一方、N-アセチルシステイン（NAC）２ｍｇ投与後
２０時間目の腹腔浸出細胞を採取して同様に検定したと
ころ赤色や黄色の画像が得られ還元型マクロファージが
誘導されることが確認された。同様に酸化型マクロフア
ージの誘導されることは、シスチン誘導体である、Ｎ，
Ｎ’−ジアセチルシスチンニトロキシブチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシスチンジメチルエステル（(NAC
-OMe)₂）、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシスチンジイソプロピ
ルエステル(（NAC-OiPr）₂）、Ｎ，Ｎ’−ジ−Ｌ−アラ
ニルシスチンジメチルエステル（(NAlaC-OMe)₂）の腹腔
内投与（各々２０μｇ／0.5ml／h、週２回３週間投与、
週令９−１１）でもＡＣＡＳにより確認された。

【００９７】＜(NAC-OMe)₂、アセチルグリオトキシン投
与によって誘導されたマクロフアージからのＮＯ、ＩＬ
−６産生＞そこで、腹腔浸出付着細胞を以下のように培
養し、培養上清に産生されるＮＯ、ＩＬ−１２を測定し
た。ＩＬ−６産生量は刺激剤不在下の自発産生量を測定
した。

【００９８】（１）材料 細胞：上記のように刺激して得られた腹腔浸出付着細胞
即ちマクロフアージを９６穴マイクロプレートに１Ｘ１
０⁵細胞／２００μｌ宛添加 培地：フエノールレッドフリーのRPMI1640 ２００μｌ
／穴 ＬＰＳ：リポポリサッカライド（シグマ社製）（由来：
E.coli）１００ｎｇ／ｍｌ ＩＦＮγ：１００単位／ｍｌ

【００９９】（２）測定方法 （腹腔Ｍφの採取）腹腔細胞の採取は、エーテルにより
犠牲死させたマウスの腹腔内に、氷冷した５ｍｌのフェ
ノールレッドフリーのＤＭＥＭ培地（日研生物社製）を
２２ゲージの針を付けた注射筒により注入し、しごいた
後、培地を抜き取ることにより行った。

【０１００】（ＩＬ−６の定量）実施例２の場合と同様
に定量した。

【０１０１】(ＮＯ₂−濃度の測定)実施例２の場合と同
様に測定した。

【０１０２】(ＡＣＡＳによる細胞内ＧＳＨの検出)実施
例２の場合と同様に検出した。

【０１０３】(ＩＬ−１２の定量)実施例２の場合と同様
に定量した。

【０１０４】（結果）マクロフアージからのＮＯ、ＩＬ
−６、ＩＬ−１２産生の抑制効果についての結果を表１
に示す。

【０１０５】

【表１】

【０１０６】表１から明らかなように、(NAC-OMe)₂、ア
セチルグリオトキシン投与により誘導された酸化型マク
ロファージでは、産生される炎症性サイトカインＩＬ−
６、ＮＯ、ＩＬ−１２の産生量が変動することが明らか
である。即ち、薬剤投与で得られた酸化型マクロファー
ジではＩＬ−６の産生は増強され、臓器障害性に働くＮ
Ｏ産生も細胞性免疫を増強するＩＬ−１２産生も低下す
る。この効果は典型的免疫抑制剤であるステロイドのデ
キサメサゾンより強いか同等である。これと対照的にＮ
−アセチルシステイン（NAC）により誘導される還元型
マクロファージからはＮＯの産生、ＩＬ−１２の産生が
上昇し、ＩＬ−６産生は抑制される。

【０１０７】（実施例９） ＜卵白アルブミン抗原に対する遅延型過敏症反応の抑制
効果＞(NAC-OMe)₂、(NAC)₂２０μｇ／0.5ml／h、NAC、
デキサメサゾンを実施例８と同様にd１からd５まで連日
投与、抗原として卵白アルブミンとコンプリートH３７R
aアジュバント(DIFCO)１：１懸濁液１００μl（含む２
５０μg卵白アルブミン）を感作抗原としてd２に背部皮
下に投与、惹起抗原としてd８に左耳に皮下投与し２４
時間の左耳の腫脹厚を右耳と比較した。

【０１０８】卵白アルブミン抗原に対する遅延型過敏症
反応の抑制効果についての結果は表２に示す通りであ
り、(NAC-OMe)₂、(NAC)₂投与によって卵白アルブミン抗
原に対する遅延型過敏症反応は著明に抑制された。この
ことはこれらの物質の投与により細胞性免疫が抑制され
たことを示す。

【０１０９】

【表２】

【０１１０】（実施例１０） ＜３−６週令のマクロフアージが酸化状態にあり炎症性
細胞の膵島浸潤の起こる時期のＮＯＤマウスへの薬剤投
与効果＞日本クレアより購入したNODマウスを自家繁殖
させインスリン依存性糖尿病を高率に自然発症するNOD
マウスコロニーを樹立し、本コロニーから得られた雌の
NODマウスを実験に供した。週令３週令から６週令ま
で、週に３回、合計９回にわたり、薬剤を経口、若しく
は腹腔内投与し糖尿病発症を尿糖の陽性、陰性で週に１
回追跡した。尿糖の判定にはウロペーパー（山之内製薬
製BMテストグルコース５０００）を用いた。結果を表３
に示す。

【０１１１】

【表３】 (イ) １８週令目、（ロ）２２週令目、特記の無いもの
は腹腔内投与

【０１１２】以上の結果は、３−６週令のマクロフアー
ジが酸化状態にあり炎症性細胞の膵島浸潤の起こる時期
のＮＯＤマウスでは還元型マクロフアージを誘導するγ
−グルタミルシステイン、γ−グルタミルシステインジ
メチルエステル、Ｎ−アセチルシステインニトロキシブ
チルエステル等のグルタチオンの前駆体、グルタチオン
モノエステル、グルタチオンニトロキシブチルエステル
及びグルタチオンジエステル等のグルタチオン誘導体、
レンチナン等のβ（１−３）グルカンの投与により糖尿
病自然発症の抑制されることを明白に示す薬効実験の結
果である。一回投与量については、（ＮＡＣ）₂、（Ｎ
ＡＣＯＭｅ）₂は20μｇ／匹、ＮＡＣ、ＧＳＨＯＥｔは
２ｍｇ／匹、レンチナンは０．１ｍｇ／ｋｇである。

【０１１３】（実施例１１） ＜３−６週令のマクロフアージが酸化状態にあり炎症性
細胞の膵島浸潤の起こる時期及び９−１１週令のＮＯＤ
マウスへの薬剤投与効果＞日本クレアより購入したNOD
マウスを自家繁殖させインスリン依存性糖尿病を高率に
自然発症するNODマウスコロニーを樹立し、本コロニー
から得られた雌のNODマウスを実験に供した。週令３週
令から６週令まで、週に３回、週令９週令から１１週令
まで週に２回合計１５回にわたり、薬剤を経口、若しく
は腹腔内投与し糖尿病発症を尿糖の陽性、陰性で週に１
回追跡した。尿糖の判定にはウロペーパー（山之内製薬
製BMテストグルコース５０００）を用いた。結果を表4
に示す。

【０１１４】

【表４】 ２２週令目に判定を行った。

【０１１５】以上の結果は、３−６週令のマクロフアー
ジが酸化状態にあり炎症性細胞の膵島浸潤の起こる時期
並びに９−１１週令における還元型マクロフアージの誘
導される時期の双方にわたる投与では還元型マクロフア
ージを誘導するγ−グルタミルシステイン、γ−グルタ
ミルシステインジメチルエステル、Ｎ−アセチルシステ
インニトロキシブチルエステル等のグルタチオンの前駆
体、グルタチオンモノエステル、グルタチオンニトロキ
シブチルエステル及びグルタチオンジエステル等のグル
タチオン誘導体、レンチナン等のβ（１−３）グルカン
の投与により、膵島への炎症性細胞の浸潤が抑制された
結果、膵島炎や糖尿病の自然発症が抑制されることを明
白に示す薬効実験の結果である。

【０１１６】（実施例１２） ＜９−１１週令のマクロフアージが還元状態にあるＮＯ
Ｄマウスへの薬剤投与効果＞日本クレアより購入したNO
Dマウスを自家繁殖させインスリン依存性糖尿病を高率
に自然発症するNODマウスコロニーを樹立し、本コロニ
ーから得られた雌のNODマウスを実験に供した。週令9週
令から11週令まで、週に３回、合計9回にわたり、薬剤
を経口、若しくは腹腔内投与し、糖尿病発症を尿糖の陽
性、陰性で週に１回追跡した。尿糖の判定にはウロペー
パー（山之内製薬製BMテストグルコース５０００）を用
いた。結果を表５に示す。

【０１１７】

【表５】 ２２週令目に判定、投与量については実施例１１と同様
である。

【０１１８】以上の結果は、９−１１週令のマクロフア
ージが還元状態にあるＮＯＤマウスへの薬剤投与におい
ては、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシスチン（(NAC)₂）、Ｎ，
Ｎ’−ジプロピルシスチン（(NPC)₂）、Ｎ，Ｎ’−ジア
セチルシスチンジメチルエステル（(NAC-OMe)₂）、Ｎ，
Ｎ’−ジアセチルシスチンジイソプロピルエステル(（N
AC-OiPr）₂）、Ｎ，Ｎ’−ジ−Ｌ−アラニルシスチンジ
メチルエステル（(NAlaC-OMe)₂）、これらのニトロキシ
ブチルエステル体等、前記構造式（１）に示され、マク
ロファージ細胞内の還元型グルタチオン量を減少させ、
遅延型過敏症反応を抑制し、ＩＦＮγ、ＩＬ−１２産生
を抑制する作用を有する化合物に薬効が認められるとい
う事実を明白に示す。

【０１１９】（実施例１３） ＜ｄｂ/ｄｂマウスにおける薬剤効果＞日本クレアより
購入したｄｂ/ｄｂマウスを自家繁殖させインスリン非
依存性糖尿病を高率に自然発症するｄｂ/ｄｂマウスコ
ロニーを樹立し、本コロニーから得られた雄のｄｂ/ｄ
ｂマウスを実験に供した。週令４週令から９週令まで、
週に３回、合計１８回にわたり、薬剤を腹腔内投与し、
インスリン非依存性糖尿病の病態改善効果を飽食時血糖
にて週に１回追跡した。結果を表６に示す。

【０１２０】

【表６】 投与量は実施例１１と同様である。

【０１２１】以上の結果は、インスリン非依存性糖尿病
を高率に自然発症するｄｂ/ｄｂマウスへの投与では還
元型マクロフアージを誘導するγ−グルタミルシステイ
ン、γ−グルタミルシステインジメチルエステル、Ｎ−
アセチルシステインニトロキシブチルエステル等のグル
タチオンの前駆体、グルタチオンモノエステル、グルタ
チオンニトロキシブチルエステル及びグルタチオンジエ
ステル等のグルタチオン誘導体、レンチナン等のβ（１
−３）グルカンの投与により、血糖値の低下が有意にも
たらされ、これらの物質がグルコースの筋肉、脂肪細胞
への取り込み不全によるインスリン非依存性の糖尿病に
対しても病態改善効果を有することを明白に示す薬効実
験の結果である。その作用機作は不明であるが、肝機能
の改善若しくはホスファターゼに対する阻害作用等が薬
理効果の因と推定される。

【０１２２】

【発明の効果】本発明の抗糖尿病剤により、マクロファ
ージ（単球、クッパー細胞及び樹状細胞等を含む。）の
機能の斬新な制御が可能となり、特にヒトのインスリン
依存性糖尿病、インスリン非依存性糖尿病、同疾患に随
伴する合併症、同疾患のハイリスク状態の治療、病態改
善、予防を可能とする。特に、経口摂取することがで
き、医薬品や、飲食品、栄養剤及び輸液製剤の形態とし
ても使用可能である。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、想定される、マクロファージの機能の
相違並びにＴｈ１及びＴｈ２による免疫抑制、悪液質状
態、癌細胞の悪性化誘導の機序、局所炎症等との関係の
仮説模式図を示す。

【図２】図２は、酸化型、還元型マクロファージの存在
比がＴｈ１型、Ｔｈ２型サイトカインの選択的な産生制
御を介して免疫機能を制御していることを説明したもの
である。本発明者等の新しい知見に基づくものであり、
マクロファージの酸化還元状態がｉｎ ｖｉｖｏにおけ
る免疫能の傾きを増幅する要になっていることを示す。

【図３】図３は、実施例１における両マクロファージの
機能の検定の結果を表す図で、酸化型マクロファージ及
び還元型マクロファージにおける機能の差を示したグラ
フである。

【図４】図４は、ＬＮＴ誘導ＭφとＬＰＳ誘導Ｍφにお
いて、ＩＬ−１２産生能が異なるか否かを検討した結果
を表す図で、酸化型、還元型マクロファージによってＴ
ｈ１サイトカインであるＩＬ−１２の産生量が全く異な
り、ＩＬ−１２は還元型グルタチオン含量の高い還元型
マクロファージからのみ産生されることを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/00 ６４３ Ａ６１Ｋ 31/00 ６４３Ｄ 31/22 31/22 31/235 31/235 Ｆターム(参考） 4B018 MD07 ME03 4C076 AA12 BB01 BB17 CC03 CC21 DD70 EE41 4C084 AA17 BA01 BA08 BA14 BA15 BA26 BA27 BA31 DA01 MA01 MA02 NA14 ZC352 4C206 AA01 AA02 JA58 JA62 MA01 MA02 MA04 MA13 NA14 ZB08 ZC35

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】マクロファージ細胞内の還元型グルタチオ
   ン量を変化させる作用を有する物質を含有することを特
   徴とする抗糖尿病剤。
2. 【請求項２】当該物質が、当該マクロファージ細胞内の
   還元型グルタチオン量を増加させることにより炎症性細
   胞の膵島浸潤を抑制するものである請求項１に記載の抗
   糖尿病剤。
3. 【請求項３】当該物質が、γ−グルタミルシステイン、
   γ−グルタミルシステインジメチルエステル及びＮ−ア
   セチルシステインニトロキシブチルエステル等のグルタ
   チオンの前駆体、グルタチオンモノエステル、グルタチ
   オンニトロキシブチルエステル及びグルタチオンジエス
   テル等のグルタチオン誘導体、リポ酸（ＬＩＰＯＩＣＡ
   ＣＩＤ）、グリオトキシン及びその誘導体等の、分子内
   にメルカプト基を２個以上含有する化合物、同化合物を
   生成する前駆体、オルテン（ＯＲＴＥＮＥ）、並びにフ
   ラボノイド及びその誘導体等の抗酸化物質から選択され
   る少なくとも１種を含むものである請求項２に記載の抗
   糖尿病剤。
4. 【請求項４】β（１−３）グルカン及びサイトカインか
   ら選択される少なくとも１種を含む請求項２及び３何れ
   かに記載の抗糖尿病剤。
5. 【請求項５】当該物質が、マクロファージ細胞内の還元
   型グルタチオン量を減少させることによりＩＬ−１２産
   生、ＮＯ産生、ＩＦＮγ産生を抑制し遅延型過敏症反応
   を抑制するものである請求項１に記載の抗糖尿病剤。
6. 【請求項６】当該物質が、分子内にジスルフィド結合を
   有する化合物である請求項５に記載の抗糖尿病剤。
7. 【請求項７】当該ジスルフィド結合を有する化合物が下
   記構造式（１）で示される化合物である請求項６に記載
   の抗糖尿病剤。 【化１】 但し、上記式中、Ｒ¹及びＲ²はそれぞれ独立していて、
   置換基を有していてもよいアルキル基を、Ｒ³及びＲ⁴は
   それぞれ独立していて、アシル基及びペプチジル基の何
   れかを、それぞれ表す。
8. 【請求項８】当該置換基を有していてもよいアルキル基
   が、ニトロキシブチル基である請求項７に記載の抗糖尿
   病剤。
9. 【請求項９】細胞内の還元型グルタチオン量に差のある
   酸化型マクロファージ及び還元型マクロファージの２種
   のマクロファージの何れか一方を選択的に除去し得る物
   質を含有する請求項１に記載の抗糖尿病剤。
10. 【請求項１０】当該物質が、細胞毒性を有するＤＮＡア
    ルキル化剤にグルタチオンを共役させた物質又は前駆体
    としてマクロファージに取り込まれた後に細胞毒性を示
    す物質である請求項９に記載の抗糖尿病剤。
11. 【請求項１１】飲食品、栄養剤及び輸液製剤の何れかの
    形態にある請求項１〜１０何れかに記載の抗糖尿病剤。