WO2008059823A1

WO2008059823A1 - Traduction et synthèse de polypeptides ayant une structure non naturelle au niveau de l'extrémité n et leur application

Info

Publication number: WO2008059823A1
Application number: PCT/JP2007/071986
Authority: WO
Inventors: Hiroaki Suga; Hiroshi Murakami; Yuki Goto; Atsushi Ohta
Original assignee: The University Of Tokyo
Priority date: 2006-11-17
Filing date: 2007-11-13
Publication date: 2008-05-22
Also published as: US8557542B2; JP5200241B2; US20110275119A1; EP2088202A1; EP2088202B1; EP2088202A4; JP2008125396A

Description

明細書

N末端に非天然骨格をもつポリペプチドの翻訳合成とその応用

技術分野

[0001] 本発明は、所望の N末端構造をもつポリペプチドの新規な合成方法に関する。

背景技術

[0002] (1)ポリペプチド（タンパク質）の生合成

ポリペプチドの生合成において、 mRNAを铸型としてポリペプチドがつくられる段階を翻訳 (translation)という。 mRNAの連続する 3塩基をコドン（codon)という。コドンはそれぞれ 1つのアミノ酸に対応する力 S、 UAA, UAG, UGAの 3つに対応するアミノ酸はなぐポリペプチド合成の終止を指定するので終止コドンと呼ばれる。一方、 mRNAの翻訳の際、最初に現れる AUGはポリペプチド合成の開始を指定するので開始コドンと呼ばれる。開始コドン以降の配列を 3塩基ずつ区切っていくと、それらが 1つ 1つのァミノ酸に対応する。

[0003] 翻訳は、ポリペプチド合成の铸型となる mRNA上に配列された各コドンを読み取る機能を担う tRNAに、関連アミノ酸が正確に対応付けられることが重要である。化学的には、アミノ酸がそのカルボキシル基の部分で特異的な tRNAの 3'末端にエステル結合することによって達成される。例えば、開始コドンに対応する開始 tRNA (initiator tR NAまたは tRNA^Met)にはメチォニンが結合し、そのアミノ基がホルミル化（-COH基が結合）されて N-ホルミルメチォニンになる（図 1A:天然における翻訳開始）。これにより、原核細胞の開始 tRNA(fMet-tRNA^Met)が合成される。メチォニンに対応するコドンは AUG—つだけである。

[0004] コドン AUGはリボソームに mRNA力、らの蛋白質翻訳を「開始」させるシグナルを送る開始コドンとしても重要である。リボソームは、 50種以上のリボソームタンパク質と数種の RNA分子 (rRNA)が集合したタンパク質合成装置であり、 mRNAの遺伝情報を読み取り、アミノ酸の重合を触媒する。リボソームは真核生物でも原核生物でも、構造も機能も極めてよく似ており、いずれも大サブユニット 1個と小サブユニット 1個がくっつ V、た数百万ダルトンの分子量を超える複合体である。 [0005] 原核細胞由来のポリペプチド合成開始の過程は、開始因子（initiation factor: IF)と呼ばれるタンパク質群が関与する多くの段階を経る。まず、メチォニンでアミノアシノレ化された開始 tRNA力メチォニン tRNAホルミルトランスフェラーゼ（MTF)により N-ホルミルメチォニン- tRNAへと変換され、それが開始因子と結合する。続いて、この開始因子 ·Ν-ホルミルメチォニン- tRNA複合体にリボソームの小サブユニットが結合し、このさらなる複合体が mRNA上にあるリボソーム結合部位（SD配歹 IJ)に結合する。さらに、この複合体が開始シグナル (AUGコドン)を探し当てると、そこに大サブユニットが結合する。同時に、複合体からは開始因子が解離し、 mRNA上にはリボソーム '開始 t RNA複合体が残る。ペプチドの翻訳合成の開始は、これらの過程を正確に経て起こるため、合成生成物の N末端は、通常ホルミルメチォニンになる。

[0006] 次いで、リボソームは mRNAに沿って 3'末端側に動きながらコドンを一つずつ翻訳し、 tRNAを使ってポリペプチドの伸長端にアミノ酸を付け加える。ポリペプチド鎖の伸長末端に付加されるアミノ酸は、そのアミノ酸が結合している tRNA分子のアンチコドンと、 mRNA鎖の次のコドンとの相補的塩基対形成によって選ばれる。こうして、 mRN Aのコドンに対応するアミノ酸が次々とペプチド結合で連結してポリペプチド合成が進行する。

(2) tRNAのアミノ酸特異性

既に述べたように、遺伝情報としての mRNAのコドンをアミノ酸に対応付けるァダプターの役割を果たすのは tRNAである。 tRNAはそれぞれに特異的なアミノ酸を結合（アミノアシル化）することにより、アダプタ一として機能する。翻訳精度の鍵を握る要因として、各 tRNAのアンチコドンとアミノ酸との間には厳密な対応関係が要請される。しかし、 tRNA及びアンチコドンが直接にアミノ酸を選択するわけではなぐ各アミノ酸に対して特異性を示すのはアミノアシル tRNA合成酵素（aminoacy卜 tRNA synthetase: ARS)であり、各 tRNA分子はそれぞれに適合した ARSを特異的に識別してアミノアシル化されることにより、正しいアミノ酸を受容する。すなわち、生体内において、 tRNA のアミノ酸特異性は tRNAと ARSとの間の特異的な分子識別によって保たれる。

[0007] 一方、このような tRNA、 ARS、アミノ酸の 3者の間の特異的な対応関係を人工的に変化させることにより、 tRNAに本来的に受容すべきアミノ酸以外のものをミスチャージさせる方法が考案されている。そのような方法の一つが、本発明者らにより試験管内分子進化を用いて創製された tRNAのァシル化反応を触媒する ARSリボザィム（ァシル化触媒 RNA、または通称「スーパーフレキシザィム」）を用いた方法である。スーパ一フレキシザィムは、任意の tRNA及び任意のアミノ酸を用いたアミノアシル化が可能であるという特徴を有する。つまり、任意の tRNAと任意のアミノ酸とを自在に結合させること力 Sできる。これは、例えば、非天然（異常）アミノ酸を導入したポリペプチドを翻訳により合成する際に非常に有用である（特許文献 1、 2、非特許文献 1、 2、 3、 4)。

(3)無細胞合成

ポリペプチドの無細胞合成とは、細胞質の抽出物から構成される遺伝情報翻訳系を人工容器内に揃えて、ポリペプチドを試験管内で合成しょうとするものである。無細胞合成では生きた生命体を利用しないので生体内の生理学的制約を受けることがなぐ遺伝子からのポリペプチド合成のハイスループット化が可能であり、さらに合成可能なアミノ酸配列の種類を劇的に拡大することができると期待されている。原理的には、無細胞ポリペプチド合成系では、遺伝情報さえあれば、翻訳酵素系の触媒機能を妨害しない限りにおいて、どのようなアミノ酸配列からなるポリペプチドでも試験管内で自在に合成することができると考えられる。さらには、遺伝情報とうまく対応させることができれば、生体内に存在しない非天然アミノ酸も用いることができる。

(4) N末端に非天然骨格を持つペプチド性化合物

天然由来のペプチド性化合物には、 N末端に変わった構造のアミノ酸が結合したものが見られる。図 2に示す例においては、 Somamides A〔図 2A〕では hexyl基、 Factor A (A54556 complex)〔図 2B〕では²，⁴， 6_h印 tatrienyl基が N末に存在する。また、生体内で発見される神経ペプチドの多くは、 N末にピログルタミン酸構造をもつ。

これらの分子は長鎖ペプチドであり、化学合成が難しぐ合成収率が低いため、高価にならざるを得ない。また、これらのペプチド配列をもとに、多様な類似体ポリぺプチドを平行合成 (ライブラリー構築）し、薬剤探索を行おうとした場合、ペプチド配列をコードする分子をビーズ上やペプチド分子上に別途化学的に標識する必要があり、技術的な煩雑さがさらに増大する。さらに、ペプチドライブラリーが枯渴した場合、全く新規に合成をし直す必要がある。他方、生細胞系であれ無細胞系であれ、人為的な翻訳系を介してこのようなペプチドが合成された例はこれまで報告されてレ、なレ、。したがって、铸型 mRNAに配列をコードし、これらの特殊ペプチド分子を翻訳合成できる技術を開発すれば、その技術的進歩性は極めて高!/、。

特許文献 1 :特表 2003— 514572

特許文献 2：特表 2005— 528090

非特許文献 1 : Η· Murakami, H. Saito, and H. Suga (2003) "A versatile tRNA aminoa cylation catalyst based on RNA" Chemistry & Biology, Vol. 10， 655-662

非特許文献 2 :蛋白質核酸酵素 (2003) Vol.48， No. l l， 1511-1518頁

非特許文献 3 :実験医学 (2004) Vol.22， No.17, 184-189頁

非特許文献 4 : H. Murakami, A. Ohta, H. Ashigai, H. Suga (2006) "The flexizyme sy stem: a highly flexible tRNA aminoacylation tool for the synthesis of nonnatural pept ides" Nature Methods 3， 357 - 359

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0009] 発明が解決しょうとする課題は、核酸によりコードされたアミノ酸配列情報の翻訳により、 N末端に非天然骨格（多様なァシル基、 D体アミノ酸、その他の非天然アミノ酸骨格など）を有するポリペプチドを生合成することである。

課題を解決するための手段

[0010] 上記課題は、本発明の、所望の N末端構造を持つポリペプチドを翻訳合成する方法により解決できる。具体的には、任意のアミノ酸による tRNAのァシル化反応を触媒する ARSリボザィムを用いることにより、開始 tRNAに Nホルミルメチォニン以外の任意のアミノ酸を結合させ、この開始 tRNAで翻訳を開始することにより、その任意のァミノ酸を N末端に有するポリペプチドが合成できる。開始 tRNAに結合させるアミノ酸としては、通常翻訳で使用される天然アミノ酸のみならず、所望の構造を有するアミノ酸を用いることができ、例えば、ァミノ基に様々なァシル基が導入されたものや、 D -アミノ酸、 /3 -アミノ酸、 γ -アミノ酸、 δ -アミノ酸、およびこれらのアミノ酸の Ν-メチル化体、ピログルタミン酸、およびァミノベンゼンカルボン酸、並びにスタチン（ /3 -ヒドロキシ - アミノ酸）およびその誘導体等の異常アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、及びそれより長鎖のペプチド、であっても開始 tRNAに結合させることができる。このような非天然骨格を有するアミノ酸で翻訳を開始することにより、 N末端に非天然骨格を有するポリペプチドを生合成することができる。

[0011] さらに、この合成方法を応用し、翻訳系においてメチォニン tRNAホルミルトランスフエラーゼ (MTF)の存在又は非存在を選択することにより、翻訳合成されるポリペプチドの N末端のホルミル化をコントロールすることができる。

[0012] すなわち、本願では以下の発明が提供される。

(1)以下の工程を含む、所望の N末端構造を持つポリペプチドを翻訳合成する方法

(a) tRNAのァシル化反応を触媒するリボザィムを提供する工程；（b)前記リボザィムによるァシル化反応の基質となる、所望の構造を持つアミノ酸基質を提供する工程； ( c)前記（a)のリボザィムを用いて、前記 (b)のアミノ酸基質で開始 tRNAのァシル化反応を行うことにより、所望の構造を持つアミノ酸でアミノアシル化された開始 tRNAを得る工程；（d)前記（c)で得られたアミノアシル化開始 tRNAを無細胞翻訳系に加えて、所望の構造を持つアミノ酸で翻訳を開始させることにより、所望の N末端構造をもつポリペプチドを得る工程。

(2)上記工程 (c)で開始 tRNAをアミノアシル化するアミノ酸力 Sメチォニン以外の通常アミノ酸である、（1)に記載の方法。

(3)上記工程 (c)で開始 tRNAをアミノアシル化するアミノ酸が異常アミノ酸である、 (1 )に記載の方法。

(4)異常アミノ酸が、ァミノ基に様々なァシル基が導入されたアミノ酸、 D-アミノ酸、 β -アミノ酸、 y -アミノ酸、 δ -アミノ酸、およびこれらのアミノ酸の Ν-メチル化体、ピログルタミン酸、スタチン（β -ヒドロキシ- γ -アミノ酸）およびその誘導体、ジペプチド、トリペプチド、及びそれより長鎖のペプチドからなる群から選択される、 (3)に記載の方法。

(5)上記工程 (b)で提供されるアミノ酸基質が、弱活性化されたアミノ酸である、 (1) に記載の方法。

(6)アミノ酸基質がアミノ酸のシァノメチルエステル、ジニトロべンジルエステル又は 4- クロ口べンジルチオエステルである、（5)に記載の方法。

(7) tRNAのァシル化反応を触媒するリボザィムカ、以下の（1)又は（2)

の!/、ずれかの RNA配列からなるリボザィムである、（1)〜（6)の!/、ずれかに記載の方法。

(8)開始 tRNAが、 5'から 3'方向に、

UCGGUUCAAAUCCGGCCCCCGCAACCA

で示される RNA配列からなる構造を有し、 NNNは任意の塩基の組合せからなるアンチコドンを表し、該アンチコドンに対応する開始コドンが、翻訳合成されるポリぺプチドの配列をコードする mRNA上に存在し、該開始コドンが所望の構造を持つアミノ酸をコードする、（1)〜（7)の!/、ずれかに記載の方法。

(9)開始 tRNA中のアンチコドン力 SCAUであり、 mRNA上の開始コドンが AUGである、（ 8)に記載の方法。

(10)開始 tRNA中のアンチコドン力 SCAU以外のアンチコドンであり、 mRNA上の開始コドンが AUG以外のコドンである、 (8)に記載の方法。

(11)無細胞翻訳系として再構成無細胞翻訳系を用いる、（1)に記載の方法。

(12)メチォニン又はメチォニル tRNA合成酵素（MetRS)を翻訳系中から除!/、て、天然の翻訳開始機構を阻害することにより、所望の N末端構造を持つポリペプチドだけが翻訳合成される、（11)に記載の方法。

(13)メチォニン tRNAホルミルトランスフェラーゼ (MTF)の存在又は非存在を選択することにより、翻訳合成されるポリペプチドの N末端のホルミル化をコントロールする、 (1 1)に記載の方法。

(14)以下の成分を含む、 N末端に非天然骨格をもつポリペプチドを翻訳合成するために使用可能なキット：（a)以下の（1)又は（2)のいずれかの RNA配列からなる、 tRN Aのァシル化を触媒する 2つのリボザィム： (b)前記リボザィムの基質となる、非天然骨格をもつアミノ酸基質；（c)開始 tRNA ;および (d)無細胞合成系。

発明の効果

[0013] 本発明にお!/、ては、 tRNAと任意のアミノ酸とを自在に結合させること力 Sできる ARSリボザィムで、開始 tRNAに所望の構造を有するアミノ酸をアミノアシル化したものを作成し、これを用いて翻訳を開始することにより、 N末に所望の構造を有するポリぺプチドを翻訳により合成することが可能であり、生体内に存在しない異常アミノ酸も用いること力 Sできる。さらに、翻訳系の制御により翻訳合成されるポリペプチドの N末端の修飾をコントローノレすることもできる。

[0014] 従って、本発明は N末に修飾が入ったポリペプチド全般に適応でき、これまで化学合成が極めて困難であった長鎖の特殊ペプチド分子を簡便且つ安価に合成すること力 Sできる。

図面の簡単な説明

[0015] [図 1]図 1は天然の（原核）翻訳系における開始 tRNAと本発明における開始 tRNAの比較を示す。図 1Aが天然における翻訳開始、図 1Bが本発明における翻訳開始を表す。

[図 2]図 2はペプチド性天然物の N末端部位にみられる特殊骨格の例を示す。図 2A は Somamides A、図 2Bは Factor A (A54556 complex),図 2Cは神経ペプチドの例（G PCR103リガンド）である。

[図 3]図 3は本発明で用いる様々な開始アミノ酸の例示である。

[図 4]図 4は本発明において使用可能な開始 tRNAを例示する。図 4Aは翻訳開始に使用している tRNAの配列（T7transcript)、図 2Bはその二次構造を示す。本図では通常の開始コドン (AUG)に相補的なアンチコドン（CAU)をもつ一般的な開始 tRNA を示している。

[図 5]図 5は天然の（原核)翻訳産物と本発明における翻訳産物の比較を示す。図 5A が天然における翻訳開始、図 5Bが本発明における翻訳開^

RNAによるもの）である。 [図 6]図 6は実施例で用いたアミノ酸誘導体（N-acyl Phe derivatives)を示す。

園 7]図 7は実施例で用いたアミノ酸誘導体を示す。上段の二つがジペプチド誘導体

、下段の二つが D-フエ二ルァラニン誘導体の例である。

[図 8]図 8は、図 6と図 7で挙げたアミノ酸誘導体のァシル化の効率を確認した結果である。レーン下の数値が収率である。（0°Cで 2時間または 4時間または 6時間）。

[図 9]図 9は、図 6と図 7で挙げたアミノ酸誘導体のァシル化の効率を確認した結果である。

[図 10]図 10は、図 6と図 7で挙げたアミノ酸誘導体のァシル化の効率を確認した結果である。

[図 11]図 1 1は、図 6と図 7で挙げたアミノ酸誘導体のァシル化の効率を確認した結果である。

[図 12]図 12は様々なアミノ酸でポリペプチドの翻訳合成を開始した例である。図 12A は酉 S列、図 12Bが翻訳合成の結果、図 12Cは反応条件、図 12Dは Ac、 Pen, Hex, M he等の略号で表される化学構造の説明である。

園 13]図 13は様々なアミノ酸でポリペプチドの翻訳合成を開始した例である。

[図 14]図 14は様々なアミノ酸でポリペプチドの翻訳合成を開始した例である。

[図 15]図 15は様々なアミノ酸でポリペプチドの翻訳合成を開始した例である。

[図 16]図 16は 20種類の天然アミノ酸でポリペプチドの翻訳合成を開始した例である。

[図 17]図 17は 2種類の D-アミノ酸を含むトリペプチドでの開始の例である。

園 18]図 18は通常の開始コドン以外の 4種類のコドンでも開始が可能なことを示した図である。

[図 19]図 19は、図 12〜 15で合成したペプチド翻訳産物のマススペクトルである。

[図 20]図 20は、図 12〜； 15で合成したペプチド翻訳産物のマススペクトルである。

[図 21]図 21は、図 12〜； 15で合成したペプチド翻訳産物のマススペクトルである。

[図 22]図 22は、図 12〜； 15で合成したペプチド翻訳産物のマススペクトルである。

[図 23]図 23は、図 12〜； 15で合成したペプチド翻訳産物のマススペクトルである。

[図 24]図 24は、図 12〜； 15で合成したペプチド翻訳産物のマススペクトルである。

[図 25]図 25は、図 17で示したトリペプチド（DF-DF-F)をァシル化した tRNAで翻訳反応を開始したペプチドのマススペクトルである。

発明を実施するための最良の形態

[0016] ( 1 )アミノ酸

アミノ酸は、基本的には分子内にアミノ基（一NR )とカルボキシル基（一COOH)の二つの官能基を持つ化合物を指す。アミノ酸のうち、通常の翻訳で使用されるァミノ酸は、一般構造：

[0017] [化 1]

n 0

？ II

N-C-C-OH

2 I

H

[0018] で示される（Rはアミノ酸側鎖である） a -ァミノカルボン酸ほたは置換型 α -ァミノ力ルボン酸）である、ァラニン (Ala)、バリン（Val)、ロイシン（Leu)、イソロイシン（lie)、プ口リン（Pro)、トリプトファン（Trp)、フエ二ルァラニン (Phe)、メチォニン（Met)、グリシン (Gly)、セリン（Ser)、トレオニン（Thr)、チロシン（Tyr)、システィン（Cys)、グルタミン（ Gin)、ァスパラギン (Asn)、リジン（Lys)、アルギニン (Arg)、ヒスチジン（His)、ァスパラギン酸 (Asp)、およびグルタミン酸（Glu)の 20種類の天然アミノ酸である。本明細書においては、アミノ酸には、天然アミノ酸と非天然アミノ酸の両方が含まれ、特にこれらの天然アミノ酸を通常アミノ酸とも称する。

[0019] 通常アミノ酸に対する語として、異常アミノ酸は、通常アミノ酸以外のアミノ酸を意味し、人工的に合成したものであっても、自然界に存在するものであってもよい。異常ァミノ酸の例としては、アミノ酸骨格内に付加的なメチレン基を有する β -アミノ酸、 y - アミノ酸及び δ -アミノ酸、並びに通常のアミノ酸の立体異性体である D-アミノ酸等が挙げられる。また、本明細書においては、アミノ酸の語には、アミノ酸骨格上のアミノ基やカルボキシル基が置換された構造を有する誘導体も包含し、アミノ酸のアミノ基に多様なァシル基が導入されたものや、 Ν-メチル体、スタチン（ /3 -ヒドロキシ- γ -アミノ酸）、ピログルタミン酸、ァミノベンゼンカルボン等も異常アミノ酸の例として挙げられる。さらに、ジペプチド、トリペプチド、若しくはそれより長鎖のペプチドもアミノ酸と表現する場合がある。従って、「所望の構造を有するアミノ酸」という場合には、このような本明細書における「アミノ酸」全てを包含する。以上で述べた様々なアミノ酸の代表例の化学構造式を図 3に示す。

[0020] 異常アミノ酸を含んだペプチドを「特殊ペプチド」と呼ぶ。天然から単離された特殊ペプチドの例としては、ホルモンペプチド、神経ペプチド、 Somamides A, factor A, G PCR103リガンド等が挙げられる。本発明により合成可能な特殊ペプチドはこれらの天然の特殊ペプチドを模倣した類似体に限定されず、上述の様々な異常アミノ酸を N 末に有するあらゆる特殊ペプチドが合成可能である。

(2)開始 tRNA

mRNAの翻訳の開始には、開始 tRNAと呼ばれる特定の tRNAが必要である。翻訳が始まるには、アミノアシル化された開始 tRNA力開始因子 (IF)とともにリボソームの小サブユニットに結合し、リボソームの小サブユニットが mRNA上の開始コドンに結合する力この開始コドンを認識するのが開始 tRNAである。従来技術の項で述べたように、天然においては、開始 tRNAは必ずメチォニン（原核細胞ではホルミルメチォニン）を運び、開始コドンとしては一般的にはメチォニンのコドンである AUGが用いられるため、開始 tRNAはメチォニンに対応するアンチコドンを有する。

[0021] これに対して、本発明においては、開始アミノ酸カチォニンに限定されないことが特徴である。つまり、開始 tRNAにメチォニン以外の任意のアミノ酸を結合して翻訳を開始させることが特徴である。また、本発明においては、開始コドンも AUGに限定されない。つまり、開始コドンとして他のコドンを割り当てることも可能である。従って、本発明においては開始 tRNAはメチォニンに対応するアンチコドンを有していても、他のァンチコドンで置換されていてもよい。例えば、本発明者らは AUA、 CGG、 CCG、 GGC 、 GCCのコドンでもそれらのアンチコドンをもつ開始 tRNAを用いれば、開始可能であることを確言忍している。

[0022] 以下は、本発明において使用可能な、開始コドン AUGに対応する天然の開始 tRN A (tRNA^Met)の塩基配列を示す。

CGUCGGUUCAAAUCCGGCCCCCGCAACCA-3' (酉己歹 IJ番号 1)下,锒 ¾はアンチコドン部位である。二次構造の図を図 4Bに示すので参照されたい。 [0023] 開始コドンを変える場合は、それに相補的なアンチコドンをもった tRNAを使用する。従って、開始コドンとして任意のコドン (NNN)を割り当てる場合は、開始 tRNAの配列は次のように表される。

CGUCGGUUCAAAUCCGGCCCCCGCAACCA-3' (配列番号 2)下線部の NNNは任意の塩基の組合せからなるアンチコドンを表す。 NNN以外の部分は、 tRNA^Metのボディ配列であり、開始因子（IF)の結合に必要であると考えられている。

[0024] 本発明にお!/、て、所望の N末端構造を持つポリペプチドを翻訳合成する際には、上記の NNNで表されるアンチコドンに対応する開始コドン力 S、翻訳合成されるポリぺプチドの配列をコードする mRNA上に存在し、その開始コドンがポリペプチドの N末端となる所望の開始アミノ酸をコードすることになる。

(3)開始 tRNAのアミノアシル化

tRNAのアミノアシル化は、 tRNAの 3 '末端の水酸基にアミノ酸のカルボキシル基がエステル結合する反応（ァシル化）である。アミノ酸は活性化された中間体を経由して tRNAと結合する。

[0025] 天然では、 ARSタンパク質酵素が、 ATPの加水分解と共役したアミノ酸基質の活性化 (ATPとアミノ酸から高エネルギー中間体であるアミノアシル AMPを合成する反応）と、アミノ酸基質の tRNAへの結合の 2段階の反応を触媒してアミノアシル tRNA の合成を行っている。まず、アミノ酸のカルボキシル基が AMP部分と結合して活性化され、アデニル化アミノ酸（アミノアシル AMP)となる。次に、アデニル化アミノ酸から AMPが脱離し、アミノ酸のカルボキシル基は tRNAの 3 '末端のリボースの水酸基に移される。この転移によりアミノ酸が tRNAと活性エステル結合を形成し、アミノアシル化された tRNAが生じる。活性化されたアミノ酸と tRNAとのエステル結合は、加水分解により大きな自由エネルギーを放出する高エネルギー結合であり、この結合のエネルギ一はその後のタンパク質合成の段階で、アミノ酸を共有結合でつな!/、でポリぺプチド鎖を伸長させるのに使われる。

[0026] 天然では、各アミノ酸と tRNAに特異的なアミノアシル tRNA合成酵素（ARS)により、このような tRNAのアミノアシル化反応が触媒される。開始 tRNA力 Sメチォニンを結合する反応は専用のタンパク質酵素であるメチォニル tRNA合成酵素 (MetRS)による。

[0027] これに対して、本発明にお!/、ては、 tRNAのァシル化反応を触媒することができる R NA分子である ARSリボザィムを用いて、開始 tRNAのアミノアシル化を行う。 ARSリボザィムとして本発明で使用可能なものは、所望の構造を持つアミノ酸基質を任意の tR NAにァシル化する機能を有するリボザィムである。このような ARSリボザィムは、天然の ARSタンパク質酵素とは異なり、各アミノ酸及び各 tRNAに対して特異性を持たず、本来チャージすべきアミノ酸以外の任意のアミノ酸を用いたアミノアシル化が可能となるため、開始 tRNAに任意のアミノ酸を結合することができる。

[0028] 図 1を参照して、開始 tRNAのアミノアシル化を説明する。従来技術の項でも説明したように、天然では tRNA^Metから MetRS (メチォニル tRNA合成酵素） .MTF (メチォニン tRNAホルミルトランスフェラーゼ）という 2つの蛋白質酵素が関与して合成される fMet -tRNA^Metが開始 tRNAとして働くのに対し（図 1A)、本発明では MetRSの代わりに ARS リボザィム（スーパーフレキシザィム）によって多種にわたるアミノ酸誘導体が tRNA^Met にチャージされた Xaa_tRNA^Metが開始 tRNAとして働図 1B)。

[0029] 本発明で使用される ARSリボザィムは、本発明者らにより記載された試験管内分子進化による方法に従って創製可能である (特願 2005-352243多目的ァシル触媒とその用途、および H. Murakami, A. Ohta, H. Ashigai, H. Suga (2006) "The fexizyme s ystem: a nighly flexible tRNA aminoacylation tool for the synthesis of nonnatural pep tides" Nature Methods 3， 357-359)。この方法により創製される ARSリボザィムは、天然の ARSタンパク質酵素とは異なり、アミノアシル化反応の第 1段階目である高エネルギー中間体（アミノアシル AMP)の生成の過程をスキップしてアミノ酸基質の tRNA への結合の過程のみを触媒するように進化させて得られるものであるため、アミノ酸基質としてはあらかじめ弱活性化されたアミノ酸を用いる必要がある。つまり、アミノ酸のアデ二ル化をスキップする代わりに、ァシル化が進行するカルボニル基において弱活性化されたエステル結合を持つアミノ酸誘導体を使用する。一般にァシル基の活性化は電子吸引性をもつ脱離基をエステル結合させることで達成できる力あまり強力な電子吸引性脱離基を有するエステルでは水中で加水分解が起きるばかりか、ランダムな RNAへのァシル化が併発してしまう。したがって、アミノ酸基質としては無触媒状態でこのような副反応が起きにくいように弱活性化したものを用いる必要がある。このような弱活性化は、例えば、 AMP,シァノメチルエステル、チォエステル、又は二トロ基やフッ素その他の電子吸引性の官能基をもったベンジルエステル等を使用して行うこと力 Sできる。好適なアミノ酸基質の例としては、アミノアシル-シァノメチルエステル（CME： cyanomethyl ester)、アミノアシル -ジニトロべンジルエステル（DNB： 3,5- dinitrobenzyl ester)、又はアミノアシル _4_クロ口べンジルチオエステル（CBT : p_chlor o-benzyl thioester)等が挙げられる力これらに限定されるわけではなぐ当業者であれば反応効率の高い適当な脱離基を適宜スクリーニングして用いることが可能であり、そのような適当な脱離基を有するアミノ酸基質を利用したァシル化反応も本発明の範囲に含まれることは当然である。

[0030] 本発明で使用可能な ARSリボザィムの極めて具体的な例としては、従来技術の項で前述したスーパーフレキシザィム、すなわち、

(スーパーフレキシザィム eFx：配列番号 3)

(スーパーフレキシザィム dFx：配列番号 4)

のいずれかの RNA配列からなるリボザィム、又はその変異型が挙げられる。これらのスーパーフレキシザィムやその原型であるフレキシザィムの創製にっレ、ては、特願 20 05-352243多目的ァシル触媒とその用途、および Η· Murakami, A. Ohta, H. Ashigai ， H. Suga (200b; The flexizyme system: a highly flexible tRNA aminoacylation tool f or the synthesis of nonnatural peptides" Nature Methods 3， 357—359、ならびに H. Murakami H. Saito, H. Suga (2003) "A versatile tRNA aminoacylation catalyst based on RNA" Chem. Biol. 10， 655-662に詳細に記載されている。

[0031] ARSリボザィムとしてこれらのスーパーフレキシザィム又はその変異型を用いる場合、アミノ酸基質は、スーパーフレキシザィムで認識されるように、アミノ酸側鎖または脱離基内に芳香環を有していなければならない。このようなアミノ酸基質の構造を一般式で表すと、次のようになる。

[0032] [化 2] T ヽ CM 丫ヽ0へ H :

R ：脱離基，;

；芳香族 ^¾ _:

[0033] アミノ酸基質のうち、側鎖として芳香環をもつアミノ酸のシァノメチルエステル (左の構造式）の合成については、特表 2005— 528090および Sugaら、 J. Am. Chem. Soc. 、 120、 1151— 1156, 1998に記載の方法を参照されたい。本明細書中で後述する実施例においては、シァノメチルエステル (CME)を導入した N-ァシル化ァミノ酸基質およびペプチド基質の合成の例を示した。

[0034] 脱離基として芳香環をもつアミノ酸基質 (右の構造式）の合成は、まず（1)アミンを B oc保護したアミノ酸を、ベンジル位にハロゲンを持ち芳香族に電子吸引基を持つ化合物と反応し、エステルを形成させる。次に、酸を用いて Boc保護基を除くことでァミノ酸基質を合成する。あるいは、このエステルは、（2)アミンを Boc保護したアミノ酸を、ベンジル位に水酸基を持ち芳香族に電子吸引基を持つ化合物と、一般的な縮合剤を用いて縮合させることでも合成できる。さらに（3) Boc保護したアミノ酸を活性化したものを、ベンジル位に水酸基を持ち芳香族に電子吸引基を持つ化合物と混ぜることでも合成できる。チォエステルの合成は、上記の（2)又は（3)の方法を用いて行うことができる。ただし、ベンジル位に水酸基を持ち芳香族に電子吸引基を持つ化合物の代わりに、ベンジル位にチオール基を持つ化合物を用いる。チォエステルは、活性が比較的高いので、芳香族の電子吸引基は必ずしも必要ではない。脱離基として芳香環をもつアミノ酸基質の合成についての具体的な方法は、特願 2005-352243にも既述されている。本明細書中の後述の実施例では、 D -アミノ酸、 N-メチル化アミノ酸または β -アミノ酸等の異常アミノ酸にジニトロべンジルエステル (DBE)を導入した基質の合成の例を示した。

[0035] ARSリボザィムによるァシル化反応は、溶液中で行ってもよいし、担体に固定化した ARSリボザィムを用いたカラムを用いて反応させてもよい。例えば、もし翻訳の反応スケールが 100 1以下の少ない量であれば、溶液中で ARSリボザィムによる tRNAのァシル化を行!/、、反応溶液をエタノール沈殿したペレットを適当な緩衝液（例えば 1 mMの酢酸カリウム、 pH5等）に溶解し、翻訳系に添加すれば良い。反応の条件は適宜好適な条件を選べばよいが、少量スケールの反応条件の一例としては、最終濃度で 0·5〜20 μ Μの tRNA、 0·5〜20 μ Μの ARSリボザィム、 2〜10mMのアミノ酸基質、 0 • 6Mの MgClを含む pH7.5、 0.1Mの反応緩衝液を、 0度 Cで 1時間〜 24時間、反応させるとよい。

[0036] 翻訳の反応スケールが 100 1を超える場合は、 ARSリボザィムの再利用を考慮し、担体に固定化した ARSボザィムを用いたほうが好都合である。担体として、例えば、樹脂、ァガロース、セファロース、磁器ビーズなどを用いることもできる力 S、特に限定されない。 ARSリボザィムを担体に固定化して反応を行わせる場合は、例えば、 Muraka mi, Η·， Bonzagni, N. J. and buga, H. (2002). Aminoacyi- tRNA synthesis by a resin -immobilized ribozyme." J. Am. Chem. Soc. 124(24): 6834- 6835に記載の方法に従つて行うことができる。反応産物であるアミノアシル化 tRNAの分離は、様々な方法で行える。一例としては、 10mM程度の EDTAを含有する緩衝液でカラムから溶出する方法がある。 ARSリボザィムを固定化した樹脂は、例えば反応バッファーで平衡化することにより、十数回リサイクノレすること力 Sできる。

[0037] ARSリボザィムによるァシル化反応についても、さらに具体的には後述の実施例を参照されたい。なお、後述の実施例では、多様なアミノ酸のァシル化を簡便に確認するため、開始 tRNAではなぐその短鎖アナログを用いた実験結果を示している。ジペプチドやトリペプチド、もしくはそれより長鎖のペプチド、 N末端に非天然骨格 (D体、 N-メチル体、 β -アミノ酸、スタチン等）を持つアミノ酸のような異常アミノ酸であっても、アミノアシノレ化できることが確認されている。

(4)翻訳

上述の方法により、 ARSリボザィムを用いてアミノアシル化された開始 tRNAを無細胞翻訳系に添加することにより、 N末端に任意のアミノ酸を有するポリペプチドを合成すること力 Sでさる。

[0038] 天然の翻訳産物ではポリペプチドの N末端はメチォニン (原核細胞ではホルミルメチォニン）に限られる力本発明では N末端にメチォニン以外のアミノ酸、様々なァシル基、 D-アミノ酸、 Nメチルアミノ酸、 β アミノ酸、スタチン、その他の特殊骨格を有する特殊ペプチドを自由自在に合成可能である。図 5に天然の翻訳産物 (図 5A)と本発明で合成可能なポリペプチドの例（図 5B)を示す (この例では様々なァシル基を有するフエ二ルァラニン誘導体が N末端に存在する）。

[0039] 無細胞合成系では生体内の制約がないため、どのようなアミノ酸配列からなるポリペプチドでも自在に合成することができ、合成可能なポリペプチドの長さにも原理的には制限はなぐ遺伝情報と対応させることができれば異常アミノ酸も用いることができる。従って、所望の構造を持つアミノ酸でアミノアシル化された開始 tRNAを系に加えて翻訳を開始することにより、所望の N末端構造を有するポリペプチドを合成可能であり、さらに、伸長反応で導入するアミノ酸も天然アミノ酸 20種類全てを利用できる。伸長用の天然アミノ酸についても、 ARSリボザィムでァシル化されたアミノアシル化 t RNAを無細胞翻訳系に添加して用いることが可能である。

[0040] 無細胞翻訳系は一般的には、リボソームタンパク質、アミノアシル tRNA合成酵素 (A RS)、リボソーム RNA、アミノ酸、 tRNA, GTP、 ATP、翻訳開始因子（IF)伸長因子（ EF)、終結因子 (RF)、およびリボソーム再生因子 (RRF)、ならびに翻訳に必要なその他の因子を含み、高効率のものとしては、大腸菌抽出液や小麦胚芽抽出液を利用した系がある。他に、ゥサギ赤血球抽出液や昆虫細胞抽出液を利用する系もある。これらは、透析を用いて連続的にエネルギーを供給することで、数百 gから数 mg/mLの蛋白質を生産する。遺伝子 DNAからの転写も併せて行うための RNAポリメレースを含む系もある。本発明では、このような無細胞翻訳系を適宜用いることができる。市販されている無細胞翻訳系として、大腸菌由来の系としてはロッシュ 'ダイァグノスティック社の RTS - 100 (登録商標）や PGI社の PURESYSTEM (登録商標）等、小麦胚芽抽出液を用いた系としてはゾィジーン社やセルフリーサイエンス社のもの等が使用できる。

[0041] さらに、系を細分化し、各要素を再構成して、より不純物の少ない翻訳系を構築することもできる。具体的な構成としては、リボソーム、 GTP、 ATP、 IF群、 EF群、 RF群、 RRF、目的のペプチド合成に最低限となる tRNA'ARS群'アミノ酸などがある。このような再構成無細胞翻訳系は、特に本発明において好適である。再構成無細胞翻訳系を用いることにより成分を任意に調節することが可能であり、開始アミノ酸もしくはぺプチドの種類を選択することに加えて、ポリペプチドの N末端修飾をさらに自在にコントローノレすること力 Sでさるようになる力、らである。

[0042] 例えば、メチォニン、又はメチォニル tRNA合成酵素（MetRS)を翻訳系中から除くことで天然の翻訳開始機構を阻害することができる。そこに所望の構造を持つアミノ酸でァシル化した開始 tRNAを加えることで、所望の N末端構造を持つペプチドだけが翻訳系中で生成する。このとき、開始 tRNAとしてはアンチコドン部分を改変した開始 t RNA^Metを使う。本発明では開始コドンは天然である AUGだけに制限されず他のコドンも開始コドンとして利用できる、すなわち、 N末アミノ酸に対して特定のコドンを割り当てることができるのである。このとき、翻訳合成されるポリペプチドをコードする核酸配列において、 mRNA上の開始コドンはァシル tRNA^Metのアンチコドンと相補的であれば（多少の効率の違いは見受けられる力原則的に何でも良い。原核細胞由来の系を用いる場合、铸型 mRNAには 5 '末端の近傍にリボソーム結合部位である SD配列が存在しさらにその下流に開始コドンが存在する必要がある。

[0043] また、再構成無細胞翻訳系を用いることで、メチォニン tRNAホルミルトランスフェラーゼ (MTF)の存在、非存在を選択でき、これによる N末端修飾のコントロールも可能である。 MTFは、原核細胞由来の系において、開始 tRNAにァシル化されたメチォ二ンのァミノ基に対し、ホルミル基を結合させる酵素である。この酵素は、一般にはメチォニンに対してホルミル化選択性があると考えられている力 S、これまでにも間接的な実験結果から、開始 tRNAに結合したフエ二ルァラニンやグルタミンなどのアミノ基に対してもホルミル基が修飾されたとする報告はあった（Mayer, C , Kohrer, C, Prusko ，し.， RajBhandary, U.L. (2003). Anticodon Sequence Mutants of Escherichia coii In itiator tRNA: Effects of Overproduction of Aminoacyl-tRNA Synthetases, Methionyl -tRNA Formy ltran sferas e , and Initiation Factor 2 on Activity in Initiation" Biochemi stry 42: 4787-4799)。本発明により、合成ペプチドの質量分析により、その直接的な実験結果が得られた。本発明では、さらに多様なアミノ酸を用いても、 N末端がホルミル化されたポリペプチドが合成できる事を発見している。

[0044] 他方、本発明者らは、 MTFを翻訳系内から除去する事で、 N末端にホルミル修飾が施されていないポリペプチドを合成できること、さらには、系内の MTFまたはそのドナ一となる基質の有無に関わらず、 N末にホルミル修飾がされて!/、な!/、ペプチドも合成できることも見出した。これまで、原核由来の開始因子では、ホルミル基もしくは類似のァシル基（ァセチル基等）の修飾が必要と考えられて!/、たが、本発明により（ARSリボザィムで様々なアミノ酸を開始 tRNAにチャージして翻訳開始をすることで）、その制限がないことが明ら力、となった。例えば、ァシル基のないアミノ酸でも翻訳を開始できるばかりか、ァミノ基に導入するァシル基には任意の Rを付けることができる（R-CO _aa -)。さらに、 Rをジペプチド、トリペプチドもしくはそれより長鎖のペプチド、又はスタチン骨格にすること、あるいはアミノ酸を D体にすることも可能であり、それらによつて翻訳開始されたペプチドにはホルミル化が進行せず、ホルミル化されてレ、な!/ヽぺプチドが合成される。

従って、本発明では、開始アミノ酸もしくはペプチドの種類、 MTFの存在下、非存在下で、翻訳合成されるポリペプチドの N末端修飾をコントロールできる。一方で、通常のアミノ酸の立体異性体である D-アミノ酸ゃジペプチド、トリペプチドを開始 tRNAに結合させ翻訳に用いた場合、 MTFが翻訳系内にあってもホルミル化が全く進行しない事も発見している。

(5)キット

上述の方法を用いた、 N末端に非天然骨格をもつポリペプチドを翻訳合成するために使用可能なキット化製品も本発明の範囲に含まれる。キットの最低限の内容としては、

(a)以下の（1)又は（2)の!/、ずれかの RNA配列からなる、 tRNAのァシル化を触媒する 2つのリボザィム：

(それぞれ担体に固定化されてレ、てもよレ、）

(b)前記リボザィムの基質となる、非天然骨格をもつアミノ酸基質

(c)開始 tRNA

(d)無細胞合成系

を含んでいればよいが、さらに、反応緩衝液、反応容器、使用説明書等を含んでいてもよい。

[0046] なお、本発明の実施のための材料及び方法は、特に断らないかぎり、化学及び分子生物学の技術分野でよく知られる慣用の方法に従って、様々な一般的な教科書や専門的な参考文献に記載されて!/、る方法を用いる。分子生物学につ!/、ての参考文献としては、 ί列えば Sambrookら， Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第 2版， Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,ニューヨーク州 (1989)および Ausubelら, Current Protocols In Molecular Biology, Greene Publishing Associat es (1992)，およひ、Harlowおよび Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,し old Spring Harbor，ニューヨーク州 (1999)等を参照されたい。

[0047] 上述した発明の内容を以下の実施例によってさらに詳しく説明する力これは例示であり本発明の範囲はこれに限定されない。明細書及び特許請求の範囲の記載に基づき種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に p¾よれ。

実施例

[0048] 以下に記載する実施例では ARSリボザィムとしては、スーパーフレキシザィムを使用し、翻訳系としては、 cDNAからの転写系を含む原核生物由来の再構成無細胞合成系を用いた。

[0049] 1. アミノ酸某晳の合成

この実施形態では、スーパーフレキシザィムによるァシル化反応の基質となる、弱活性化されたエステル結合を持つアミノ酸基質（以下、単に「基質」と記載することもある）の合成を記載する。スーパーフレキシザィムにより認識されるために、基質は分子内に芳香環を有する必要があった。脱離基に芳香族を用いる場合、エステル結合は、チォエステルで活性化（CBT)、もしくは芳香族に電子吸引性の官能基を持ったもの（DBE)を使用して活性化した。芳香族を側鎖に持つアミノ酸やペプチドについては、シァノメチルエステル（CME)で活性化した。

[0050] 1. 1. D—アミノ醉、 N-メチル化アミノ醉、 β -了ノ醉

標題のアミノ酸に DBEを導入した基質の合成の一般的な方法を、 D-セリン DBEの例で説明する。 α -Ν-Boc-D-セリン（384 mg， 1.87 mmol)、トリエチノレアミン（207 mg， 2.05 mmol)および 3, 5-ジニトロべンジノレクロリド（324 mg， 1.50 mmol)を 0.4mlのジメチルホルムアミドに加えて混合し、室温で 12時間攪拌した。反応後、ジェチルエーテル ( 15ml)を加え、溶液を 0.5 M HC1 (5 mL x 3)、 4 % NaHCO (5 mL x 3)およびブライン（5 mL xl)で洗浄し、硫酸マグネシウムで有機層の中の水を除いてから、減圧下で溶媒を減圧留去した。クルードな残渣を 4M塩酸/酢酸ェチル（3 ml)に溶解し、室温で 20分静置した。反応後、ジェチルエーテル（3mL)を加えて溶媒を減圧留去する操作を 3回繰り返し、余分の HC1を除いた。ジェチルエーテル（3mUを加えて沈殿させ、沈澱を濾過により回収して全体で 35 %の収率で産物を得た（170 mg， 0.53 mmol )。 NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ 8.83 (s， 1H)， 8.70 (s， 2H)， 8.44 (br， 3H)， 5.56 (s， 2H)， 4.07 (d， J = 4.6 Hz, 1H)， 2.22 (m， 1H)， 1.00 (d， J = 7.0 Hz, 3H)， 0.97 (d， J = 6.9 Hz, 3H).

1 . 2. N_ "シノレイ hT"ミノ醉

CMEを導入した N-ァシル化アミノ酸基質（N-ァシル-アミノアシル -CME)の合成の一般的な方法を、 N-ァセチル -Phe-CMEの例で説明する。フエ二ルァラニン（33 mg， 0.20 mmo)、酢酸 N-ヒドロキシスクシンイミド（38 mg， 0.24 mmol)および NaHCO (50 mg， 0.60 mmol)を 50%ジォキサン水溶液（0.3ml)に加えて混合し、室温で 1時間攪拌した。反応後、溶媒を減圧留去してジォキサンを除き、酢酸ェチル (3 mL x2)で溶液を洗浄した。水層を 1M HC1で酸性にし、溶液を酢酸ェチル（3 mL x2)で抽出し、硫酸マグネシウムで有機層の中の水を除いてから、減圧下で溶媒を減圧留去した。残渣（N-ァセチル -Phe-OH)を、ジメチルホルムアミド（0.2ml)にトリエチルァミン（24 mg，

1.2 mmol)およびクロロアセトニトリル（0. 1 mL)を加えたものと混合し、反応混合物を室温で 1 2時間攪拌した。反応後、ジェチルエーテル（9 ml)を加え、 1M塩酸（3 mL x

3)、飽和 NaHCO (3 mL x 3)およびブライン（5 mL xl )で溶液を洗浄し、硫酸マグネシゥムで有機層の中の水を除いてから、減圧下で溶媒を減圧留去した。クルードな残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフフィ一により精製し、 N -ァセチル -Phe-CME (28 mg， 55%)を得た。

1 . 3. ペプチド基電ペプチドは全て Fmoc化学を利用した固相合成により合成した。 N-Fmocアミノ酸 (N- 保護アミノ酸）は渡辺化学工業株式会社（日本)力も購入したものを用いた。

[0052] CMEを導入したペプチド基質（ペプチド- CME)の合成の一般的な方法の例として、 H-^DPhe-^DPhe-Phe-CMEの合成を説明する。まず、 H- ^DPhe-^DPhe-Phe_OHを、 WAN G-alko-レジン (0.15 mmolスケール、渡辺化学工業社製）を用いて固相合成した。得られたトリペプチド（H_ ^DPhe- ^DPhe- Phe- OH)、 Boc O (35 mg， 0.16 mmol)および NaH CO (13 mg， 0.16 mmol)を 50%ジォキサン水溶液（0.5 mL)に加えて混合し、室温で 1

3

時間攪拌した。次いで、反応混合物を減圧留去してジォキサンを除き、酢酸ェチル（

3 mL x2)で溶液を洗浄した。水層を 1M HC1で酸性にし、溶液を酢酸ェチル（3 mL x 2)で抽出し、硫酸マグネシウムで有機層の中の水を除いてから、減圧下で溶媒を減圧留去した。残渣（Boc-^DPhe-^DPhe-Phe_OH)を、ジメチルホルムアミド（0.2ml)にトリェチルァミン（16 mg， 0.16 mmol)およびクロロアセトニトリル（0.1 mL)と加えたものと混合し、反応混合物を室温で 12時間攪拌した。反応後、ジェチルエーテル (9 ml)を加え、 1M塩酸（3 mL X 3)、飽和 NaHCO (3 mL x 3)およびブライン（5 mL xl)で溶液

3

を洗浄し、硫酸マグネシウムで有機層の中の水を除いてから、減圧下で溶媒を減圧留去した。クルードな残渣を 4M塩酸/酢酸ェチル（2 ml)に溶解し、室温で 20分静置した。ジェチルエーテル (3 ml)を加えて溶媒を減圧留去する操作を 3回繰り返し、余分の HC1を除いた。ジェチルエーテル（3 ml)を加えて沈殿させ、沈澱を濾過により回収して全体で 43%の収率で産物を得た（35 mg)。

[0053] 2. RNAの合成

オリゴヌクレオチドは全て Operon社（日本）から購入した。以下のプライマーを用いて増幅した铸型 DNAから in vitroの転写により tRNA^Met を合成した。

cau

[0054] PI : 5'— GTAAT ACGAC TCACT ATAGG CGGGG TGGAG CAGCC TGGTA GC

TCG TCGG-3' (配列番号 5)

P2: 5'-GAACC GACGA TCTTC GGGTT ATGAG CCCGA CGAGC TACCA GG

CT-3' (配列番号 6)

P3: 5'- GCATA TGTAA TACGA CTCAC TATAG- 3' (配列番号 7)

P4: 5'— TGGTT GCGGG GGCCG GATTT GAACC GACGA TCTTC GGG—3' (酉己列番号 8)

P5 : 5'- TGGTT GCGGG GGCCG GATTT- 3' (配列番号 9)

まず、 PIと P2とをァニールさせ、 Taq DNAポリメレースにより伸長した。得られた産物を PCR反応緩衝液で 20倍に希釈し、 P3および P4をそれぞれ 5'および 3'プライマーとして用いて増幅した。さらに、産物を 200倍に希釈して、 P3および P5をそれぞれ 5' および 3'プライマーとして用いて増幅して tRNA^Met に相当する DNAを得た。次いで、 cau

T7 RNAポリメレースを用いて、 DNA産物を転写し、 10%変性 PAGEにより精製した。得られた tRNA^Met を水に溶解し、濃度を 200 a Mに調整した。

cau

[0055] 同様に、スーパーフレキシザィムも in vitro転写法により合成した。具体的には、特願 2005-352243多目的ァシル触媒とその用途、および Η· Murakami, A. Ohta, H. As higai, H. Suga (2006) he flexizyme system: a nighly flexible tRNA aminoacylation t ool for the synthesis of nonnatural peptides Nature Methods 3， 357-359に gel載の方法を用いて行った。

[0056] 3. tRNAのァシル化の確認

本実施形態では、多様なアミノ酸によるァシル化を簡便に確認するため、開始 tRN A (tRNA^Met )の代わりに、その短鎖アナログに相当するマイクロへリックス (microheli

cau

χ)またはミニへリックス（minihelix)を用いてァシル化反応を行い、反応後の溶液はァミノァシル化の効率を確認するために酸性条件下でのアクリルアミド電気泳動分析を行った。 Minihelix (または microhelix)に由来するバンドがアミノアシル化されると移動度力 ^s遅くなる。 Minihelix (または microhelix)のバンドとァシル化 minihelix (または micro helix)のバンドの強度を比較することでアミノアシル化効率が決定できる。

[0057] ァシル化反応は、 0. 1 M Hepes- buffer (pH 7.5)、 0. 1 M C1, 600 mM MgCl 中で 20 a Mスーパーフレキシザィム（dFxまたは eFx) 5 L、 20 μ Μ tRNAアナログ（ microhelixまたは minihelix)、および 5 mM基質を 20 % DMSOに加えて、 0°Cで 2〜6 時間反応させた。その詳細な手順としては、まず、 40 M tRNAアナログを 0.2 M He pes-K buffer pH 7.5, 0.2 M C1 (2.5 μ L)にカロえ、 95 ° Cで 3分加熱し、 5分間で 25 ° Cまで冷却した。 MgCl (3 M, 1 ^ L)およびスーパーフレキシザィム (200 μ Μ, 0.5 μ L)を加え、混合物を 25 ° Cで 5分静置した。基質（DMSO中 25 mM, 1 μ L)を加えることにより tRNAアナログのァシル化反応を開始し、氷上で 2時間静置した。 0.6 M酢酸ナトリウム、 _PH 5を 15 L加えることにより反応を停止した。エタノール沈殿後、 70% エタノールで洗浄したペレットを 2 H Lの 10 mM酢酸ナトリウム、 pH 5に溶解した。反応後の溶液を酸性条件下、 20%の変性 PAGE (50 mM酢酸ナトリウム、 6 M尿素）で解析した。

[0058] 添付の図面で示す実験結果は、基質として N-ァシル基のついた Phe誘導体（図 6 〜7)その他を用いた例である。ァシル化の結果を図 8〜； 1 1に示す。ここでは多種のアミノ酸誘導体が効率よくスーパーフレキシザィムによってアシノレ化されることが確認、された。

[0059] 例示された基質の略称の意味は次の通りである。 F =フエ二ルァラニン（Phe)、 OH -F =ヒドロキシ -deamino-フエ二ルァラニン、 Ac =ァセチル、 N3Ac =アジド-ァセチノレ、 oxP = 4-ォキソ-ペンタノィル、 Pen =ペンタ _4_エノィル， Hex =へキサノィル， P yl =ペンタ -5-イノィル， CBA =カルボキシ-ベンジルァミン， Mhe = 5_メチル-へキサノィノレ， Mim =メレイミド， PyE =パイ口グルタミン， ^DPhe = D-フエ二ルァラニン

4. 翻訳

本実施形態では、様々なアミノ酸によりァシル化された開始 tRNAを、無細胞翻訳系に加えて翻訳を開始することにより、所望の N末端骨格を持つポリペプチドの翻訳合成を行った。

[0060] 翻訳系は、 cDNAからの転写系を含む原核生物由来の再構成無細胞タンパク質合成系である PGI社の PURESYSTEM (登録商標）を用いた。必要最低限のアミノ酸のみを含んだ翻訳反応混合物にァシル化 tRNAを加えた。この時、生成するペプチドの検出のため C¹⁴でラベルされた Aspを加えていた。翻訳反応後、 tricine-SDS PAGEで解析した。

[0061] まず、翻訳反応で用いるァシル化開始 tRNAを調整した。 0.1 M Hepes- buffer pH

7.5, 0.1 M C1, 600 mM MgCl 中で、 20 μ Mスーパーフレキシザィム（dFxまたは eFx) 15 L、 20 M tRNA^Met ，および 5 mM基質、 20 % DMSOとを 0°Cで 2〜6時

CAU

間反応させた後、エタノール沈殿を行い、目的のアミノ酸でァシル化された開始 tRN A (tRNA^Met またはそのアンチコドンを変えた変異体）を単離した。その詳細な手順としては、 40 M tRNA^Asn (または変異体）を 0.2 M Hepes- buffer pH 7.5, 0.2 M

CUA

CI (7.5 [I L)に加え、 95 ° Cで 3分加熱し、 5分間で 25 ° Cまで冷却した。 MgCl (3 M, 3 L)およびスーパーフレキシザィム (200 μ Μ, 1.5 L)を加え、混合物を 25 ° Cで 5分静置した。基質（DMSO中 25 mM， 3 L)を加えることによりァシル化反応を開始し、氷上で 2時間静置した。ァシル化反応後、 0.6 M酢酸ナトリウム（pH 5)を 45 し加えることにより反応を停止し、エタノール沈殿により RNAを回収した。ペレットを 7 0%エタノールと 0.1 M酢酸ナトリウム（pH 5)で 2回洗浄し、 70%エタノールで 1回洗浄してァシル化開始 tRNAを得た。ァシル化開始 tRNAは、翻訳混合物に添加する直前に 0.5 しの 1 mM酢酸ナトリウムに溶解した。

[0062] ペプチドの翻訳合成は、 PURE systemを用いて、 0.04 μ M cDNAおよび 3 mM ED TA、伸長反応用の必要最低限のアミノ酸として 200 の Thr， Tyr, Lysまたは Thr ， Gly, Phe, Tyr, Lysおよび 50 Mの [¹⁴C]_Asp、ならびに 120 μ Mのァシル化 tRN A^Met を翻訳反応混合物に添加して行った。 37°Cで 1時間翻訳反応をさせた後、 tr

CAU

icine-SDS PAGEで解析した。

[0063] 結果を図 12〜； 18に示す。図 18以外は、いずれの例も N末端の開始コドンはメチォニンのコドン (ATG)、開始 tRNAは tRNA^Asn を用いたものを示すが（铸型 cDNA配列

CUA

は図中に YG1または YG 10として示した）、これら以外の cDNA配列でも翻訳合成反応に関し特に制限はないと思われた。また、本実施形態では示していないが、 YG 1のぺプチド配列の中央の Fをサプレッサー tRNAで読みとることでペプチド配列の真ん中にも非天然アミノ酸を導入可能である（F前後の T及び Gはスぺーサ一として配置してある）。ペプチドの C末端には精製用のタグとして FLAG配列が存在する。

[0064] 図 12〜； 15は図 6〜7で挙げたアミノ酸誘導体をチャージさせた開始 tRNAを用いてペプチドが翻訳されるかを確認した実験である。

[0065] 図 12では、ペプチド合成を様々な脂肪酸様ァシル基をもったフエ二ルァラニンで開始した。ここでは cDNA配列として YG1を利用し、必要最低限のアミノ酸として Thr, G1 y, Phe, Tyr, Lysを加えている。

[0066] [化 3] YG 1； ATG ACG ACG ACG TTC CGG GGC ACG ACG flag M T T T F G G T Ί FLAG

[0067] メチォニンを系中に加えたポジティブコントロール (wt)では確かにバンドが現れ、ぺプチド合成が行われたことを示している。一方メチォニン非存在下、開始 tRNAを加えなかったり（-tRNA)、ァシル化して!/、ない開始 tRNAを加えた（Noaa)ネガティブコント口ールではバンドが現れず、ペプチド合成が阻害されていることが確認できる。様々な脂肪酸様ァシル基をもったフエ二ルァラニンでァシル化した開始 tRNAを加えた場合にはペプチド合成が見られ、これらフエ二ルァラニン誘導体で翻訳反応が開始したことが示唆される。

[0068] 図 13では、図 12と同じく YG1を cDNAとし、様々なァシル基をもったフエ二ルァラ二ンで翻訳開始させた。ここではァシル基として、翻訳後に化学的に修飾可能な官能基を持つもの (^N3AeF (アジド基）、 ^PylF (アルキン）、。 ^xPF (ケト基）、 ^MimF (マレイミド基)）を用いた。

[0069] 図 14では、同じく YG1を cDNAとし、カルボキシ -ベンジルァミンでァシル化したフエ二ルァラニン (^GBAF)で翻訳開始させた。このように立体的に大きなァシル基でも翻訳反応を開始させることができた。

[0070] 図 15では、同じく YG1を cDNAとし、様々なフエ二ルァラニン誘導体で翻訳開始させた。ここではペプチドホルモンの N末端に頻繁にみられるピログルタミン酸 (^PyEF) · 及び D-アミノ酸である D-フエ二ルァラニン（^DPheF)でァシル化したフエ二ルァラニンを用いた。さらに、これまで用いてきたものは L体のフエ二ルァラニンであった力 D体のフエ二ルァラニン (^DF)や N-ァシル化された D -フエ二ルァラニン (^PenDF)でも翻訳開始可能であることがわかった。

[0071] 図 16は、 20種類の天然アミノ酸をそれぞれアミノアシル化した開始 tRNAをポリぺプチドの翻訳合成に用いた例を示す。その結果、一部 (Pro, Glu， Arg)を除いた全てのアミノ酸で翻訳開始が可能であった。（ここでは cDNAとして YG10を用いた。 )

[0072] [化 4] YG 1 0;

ATG AAC AAG AAC ACG ACG flag

K K T T FLAG

[0073] 図 17ではトリペプチドをァシル化した開始 tRNA (開始ぺプチジル- tRNA)でも翻訳開始が可能であることを示した。（ここでは cDNAとして YG10を用いた。）2種類の Dァミノ酸が含まれて!/、る点が重要である。

[0074] 図 18は、通常の開始コドン以外の 4種類のコドンでも開始が可能なことを示した図である。天然の開始 tRNAの配列中のアンチコドン部分を AUGから AUA' CGG · CCG · GGO GCCへと変換した開始 tRNAとそれに対応する開始コドンを持つ cDNA配列を用いて翻訳開始反応を行った。実験ではアミノ酸をチャージしていない tRNA(-aa，ネガティブコントロール)と、 Met, Tyr, Proをそれぞれチャージした tRNAを用いた。 Proは図 16で示した 20種類の天然アミノ酸中で何故か開始できないアミノ酸の一つで、開始コドンを変えることでも開始が可能とはならなかった力 S、他のアミノ酸では問題なく翻訳開始できた。この実験により天然の開始コドン (AUG)以外の配列も開始コドンとして割り当てることが可能であることが分かった。

[0075] 以上より、多種の N-ァシルアミノ酸、及び D-アミノ酸、ならびに特殊骨格を含むポリペプチド骨格などが N末端に存在するペプチドを翻訳によって合成できること、開始コドンの改変が可能であることが確認された。

[0076] 5. ペプチドのマススペクトル彻 I定

ペプチド翻訳産物の分子量をマススペクトル測定により確認した。上述の方法で [¹⁴ C]_Aspの代わりに Aspを用いて反応を行ってペプチドを翻訳合成した後、生成物の C末端に付加させた FLAGタグ配列を利用し、生成物の翻訳混合物からの単離を行つた。単離には SIGMA社力も発売されている ANTI-FLAG (登録商標） M2ァガロースを用いた。単離物を MALDI-MSで解析し、生成物の分子量が予想される分子量と一致すること及び、望まれな!/、不純物 (N末端にホルミルメチォニンが含むペプチドなど )が混入して!/、な!/、ことを確認した。

[0077] 結果を図 19〜25に示す。図 19〜24は図 12〜； 15で合成された種々の N末端骨格を持つポリペプチドのマススペクトルであり、図 25は図 17で示したトリペプチド開始産 [0078] [化 5コ

^{YC 1 ATG} ACG ACG ACC TTC GCG GGG ACC ACQ flag

F-F T T T F G G T 1 FLAG

[0079] 予測されるポリペプチドの分子量と観測された分子量とがー致し、さらに、マススぺクトルに目的物の単一ピークし力、観測されないことから、目的のボリペプチドのみが合成され、天然の翻訳開始機構を経て得られたペプチド等が混入していないことが明らカ、となった。

[0080] さらに、 N末端アミノ基のホルミル化について新たな知見が得られた。図 22において、 ^GBAF (フエ二ルァラニンにベンジルァミンをァシル化した誘導体）で開始した翻訳産物（図 14)の N末端は MTFの存在下でもホルミル化されなかったことが示された。また、図 23において、ジペプチドを開始 tRNAに結合させて翻訳に用いた場合にホルミル化されないことが示された。また、図 24において、 D-アミノ酸を N末に有するポリぺプチドも何ら問題なく翻訳合成されたことが確認され、さらに、 D体フエ二ルァラニン (^D F)の N末端がホルミル化されなかったことも示された。なお、 L体フエ二ルァラニンで開始した場合のホルミル化は確認されている。

Claims

請求の範囲

[1] 所望の N末端構造を持つポリペプチドを翻訳合成する方法であって、

(a) tRNAのァシル化反応を触媒するリボザィムを提供する工程：

(b)前記リボザィムによるァシル化反応の基質となる、所望の構造を持つアミノ酸基質を提供する工程；

(c)前記（a)のリボザィムを用いて、前記（b)のアミノ酸基質で開始 tRNAのァシル化反応を行うことにより、所望の構造を持つアミノ酸でアミノアシル化された開始 tRNAを得る工程；

(d)前記（c)で得られたアミノアシル化開始 tRNAを無細胞翻訳系に加えて、所望の構造を持つアミノ酸で翻訳を開始させることにより、所望の N末端構造をもつポリぺプチドを得る工程

を含む、前記方法。

[2] 工程 (c)で開始 tRNAをアミノアシル化するアミノ酸力 Sメチォニン以外の通常アミノ酸である、請求項 1に記載の方法。

[3] 工程 (c)で開始 tRNAをアミノアシル化するアミノ酸が異常アミノ酸である、請求項 1 に記載の方法。

[4] 異常アミノ酸力ァミノ基に様々なアシノレ基が導入されたアミノ酸、 D-アミノ酸、 β - アミノ酸、 γ -アミノ酸、 δ -アミノ酸、およびこれらのアミノ酸の Ν-メチル化体、ピロダルタミン酸、スタチン（β -ヒドロキシ- γ -アミノ酸）およびその誘導体、ジペプチド、トリぺプチド、及びそれより長鎖のペプチドからなる群から選択される、請求項 3に記載の方法。

[5] 工程 (b)で提供されるアミノ酸基質が、弱活性化されたアミノ酸である、請求項 1に記載の方法。

[6] アミノ酸基質がアミノ酸のシァノメチルエステル、ジニトロべンジルエステル又は 4-クロロべンジルチオエステルである、請求項 5に記載の方法。

[7] tRNAのァシル化反応を触媒するリボザィム力以下の（1)又は（2) のいずれかの RNA配列からなるリボザィムである、請求項 1〜6のいずれ力、 1項に記載の方法。

開始 tRNA力 5'から 3 '方向に、

UCGGUUCAAAUCCGGCCCCCGCAACCA

で示される RNA配列からなる構造を有し、 NNNは任意の塩基の組合せからなるアンチコドンを表し、該アンチコドンに対応する開始コドンが、翻訳合成されるポリぺプチドの配列をコードする mRNA上に存在し、該開始コドンが所望の構造を持つアミノ酸をコードする、請求項 1〜7のいずれか 1項に記載の方法。

[9] 開始 tRNA中のアンチコドン力 SCAUであり、 mRNA上の開始コドンが AUGである、請求項 8に記載の方法。

[10] 開始 tRNA中のアンチコドン力 SCAU以外のアンチコドンであり、 mRNA上の開始コドンが AUG以外のコドンである、請求項 8に記載の方法。

[11] 無細胞翻訳系として再構成無細胞翻訳系を用いる、請求項 1に記載の方法。

[12] メチォニン又はメチォニル tRNA合成酵素（MetRS)を翻訳系中から除レ、て、天然の翻訳開始機構を阻害することにより、所望の N末端構造を持つポリペプチドだけが翻訳合成される、請求項 11に記載の方法。

[13] メチォニン tRNAホルミルトランスフェラーゼ (MTF)の存在又は非存在を選択することにより、翻訳合成されるポリペプチドの N末端のホルミル化をコントロールする、請求項 11に記載の方法。

[14] N末端に非天然骨格をもつポリペプチドを翻訳合成するために使用可能なキットであつて

(c)開始 tRNA (d)無細胞合成系を含む、前記キット。