WO2008007581A1 - Vecteur de virus paramyxoviridae non répliquant - Google Patents

Vecteur de virus paramyxoviridae non répliquant Download PDF

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WO2008007581A1
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vector
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Jun You
Makoto Inoue
Mamoru Hasegawa
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Definitions

  • the present invention relates to a non-replicating paramyxoviridae virus vector.
  • Sendai virus vectors are cytoplasmic virus vectors (vectors in which all stages of expression are carried out in the cytoplasm), even if they are used in vivo, the loaded gene is integrated into the host chromosome. There is no concern about genotoxicity. In addition, it has many excellent performances, such as high gene transfer and expression efficiency both in vitro and in vivo, and long-term sustained expression in vitro. Therefore, SeV is expected to be used as a gene therapy 'gene vaccine', or as a gene transfer vector for applications such as antibody production and functional analysis (Non-patent Documents 1 and 2).
  • NP, P, and L which are RNP-constituting proteins of SeV vectors, are proteins necessary for the transcriptional replication of Sendai virus genome, and are essential proteins for SeV vectors. However, even if these protein genes are deleted in the genome, it is theoretically possible to reconstruct and amplify viral vector particles if these proteins are supplied externally by expression plasmids, etc. It is. Furthermore, when the reconstituted NP, P, L-deficient SeV vector infects target cells, it uses the NP, P, and L proteins carried in the particle to transcribe the mRNA of the exogenous gene on the genome, It is also possible to express foreign genes. This NP, P, L-deficient SeV vector replicates RNP because the NP, P, L genes are deleted on the genome. Can't be reborn and reborn as a non-replicating SeV vector.
  • deletion of multiple genes including L gene is expected to reduce the effects of virus-derived proteins to the maximum. Therefore, it is desirable from the viewpoint of reducing immunogenicity that a plurality of genes including L gene, for example, NP, P, and L genes are all deleted.
  • the deletion of the L gene which occupies about half the length of the genome, is expected to enable the loading of longer target genes into the genome, and the shorter the genome size, the higher the transcription efficiency. A higher expression level of the target gene can be expected.
  • the SeV vector lacking the L gene is considered to be extremely useful. However, there have been no reports on the creation of vectors lacking the L gene for paramyxoviridae virus vectors including SeV vectors.
  • Patent Document 1 WO00 / 70070
  • Patent Document 2 WO2003 / 025570
  • Non-Patent Document 2 Griesenbach U, et al., Curr Opin Mol Ther. 7 (4): 346-352. (2005)
  • Non-Patent Document 3 Molecular Therapy Volume 13, Supplement 1, May 2006, page S185
  • Non-Patent Document 4 NSV2006 (13th International Conference Negative Strand Viruses 200 6, Salamance, Spain, June 17-22nd, 2006) Abstract
  • the present invention has been made in view of the above situation, and the problem to be solved by the present invention is to produce a low immunogenic, non-replicating paramyxoviridae virus vector.
  • the inventors of the present invention who have solved the above problems have made extensive studies.
  • the present inventors have succeeded in producing a non-replicating SeV vector in which all genes of NP, P, and L proteins, which are RNP constituent proteins, are deleted from genomic RNA, and NP / P / loaded with a marker gene such as GFP.
  • L-deficient type SeV vector has high productivity (le7 CIU / ml or more), high foreign gene introduction and expression efficiency (high, high MOI infection required to obtain expression level). did.
  • the vector of the present invention reduces the amount of virus-derived protein expressed in host cells by deleting the L gene or multiple genes of NP, P, and L genes, and reduces immunogenicity in vivo administration. Can be made.
  • the vector of the present invention is extremely useful in the field of gene therapy. That is, the present invention relates to a Paramyxoviridae virus vector lacking the L gene, and more specifically, provides the following invention.
  • a viral vector comprising a complex comprising the following (a) and (b).
  • Paramyxoviridae virus () Paramyxoviridae virus () NP protein, P protein, and L protein power, which are proteins that bind to single-stranded RNA, are also selected and express one or more proteins including at least L protein
  • NP protein, P protein, and L protein power which are proteins that bind to single-stranded RNA
  • L protein power which are proteins that bind to single-stranded RNA
  • single-stranded RNA derived from Noramyxoviridae virus modified as follows
  • a viral vector comprising a complex consisting of the following (a) and (b).
  • Paramyxoviridae virus Modified to not express multiple proteins selected from NP protein, P protein, and L protein, which are proteins that bind to single-stranded RNA , (-) Strand single-stranded RNA derived from a nomyxoviridae virus
  • NP protein, P protein, and L protein which are proteins that bind to single-stranded RNA, are also selected and express one or more proteins including at least L protein
  • the NP protein, P protein, and L protein are expressed using the DNA that encodes (single stranded) single-stranded RNA or its complementary strand derived from the virus that has been modified as described above. Step of introducing into possible cells
  • NP protein, P protein, and L protein strength are also selected.
  • RNA derived from Paramyxoviridae virus modified so as not to express multiple proteins or its A step of introducing DNA encoding a complementary strand into a cell capable of expressing NP protein, P protein, and L protein
  • the protein having the function of promoting virus particle formation and release is C protein.
  • NP protein, P protein, and L protein which are proteins that bind to single-stranded RNA, are also selected and express one or more proteins including at least L protein
  • a vector in which a DNA encoding a (single-stranded single-stranded RNA or its complementary strand derived from a Nora myxoviridae virus modified as described above is inserted, an NP protein expression vector, a P protein expression vector And a step of introducing an L protein expression vector into an expressible cell
  • NP protein, P protein, and L protein strength are also selected.
  • NP protein, P protein, and L protein which are proteins that bind to single-stranded RNA, are also selected and express one or more proteins including at least L protein A complex consisting of a ( ⁇ ) strand single-stranded RNA derived from a paramyxovirus modified so as not to bind to the protein that binds to the ( ⁇ ) strand single-stranded RNA, NP protein, P protein, L Introducing into a cell expressing the protein and the envelope protein; and
  • Paramyxoviridae virus Modified to not express multiple proteins selected from NP protein, P protein, and L protein that bind to single-stranded RNA
  • ⁇ Single stranded RNA derived from paramyxovirus
  • - Introducing a protein that binds to single-stranded RNA, a powerful complex, into a cell expressing NP protein, P protein, L protein, and envelope protein;
  • a method for producing a vector for expressing a foreign gene in a target cell comprising the following steps (a) and (b):
  • NP protein, P protein, and L protein power are also selected, modified so as not to express one or more proteins including at least L protein, and loaded with foreign genes
  • a method for producing a vector for expressing a foreign gene in a target cell comprising the following steps (a) and (b):
  • NP protein, P protein, and L protein powers are also selected, derived from Noramxoviridae viruses that have been modified not to express multiple proteins and are loaded with foreign genes (single chain) Introducing DNA encoding single-stranded RNA or its complementary strand into cells capable of expressing NP protein, P protein, and L protein
  • a method for expressing a foreign gene in a target cell comprising the following steps (a) and (b):
  • the present invention provides a novel non-replicating vector using a noramyoviridae virus.
  • the paramyxovirus refers to a virus belonging to the Paramyxoviridae family or a derivative thereof.
  • Nomyxoviridae is a non-segmental negative A group of viruses with strand RNA in their genome, including Paramyx ovirinae (Respirovirus genus, also called Paramyxovirus genus), Rubravirus genus and Mobilivirus genus ) And -Pneumovirinae (including pneumoviruses and meta-humoviruses).
  • Viruses included in the Paramyxoviridae virus include, specifically, Sendai virus, Newcastle disease virus, Newcastle disease virus, Mumps virus, ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ Nores (Measles virus) ) ⁇ RS Winores (Respiratory syncytial virus) ⁇ Rinderpest winores, rin derpest virus) ⁇ Distenno winoles (distemper virus) ⁇ Sanoreno ⁇ Reinfnorenza virus (SV5), human parainfluenza virus type 1, 2, 3 etc. It is done.
  • examples are Sendai virus (SeV), human parainfluenza virus-1 (HPIV-1), human parainfl uenza virus-3 (HPIV-3), phocine distemper virus (PDV), canine distemper virus (C DV ), Dolpnin molbillivirus (DMV), peste—des—petits— ruminants virus (PDPR), measle s virus (MV), rinderpest virus (RPV), Hendra virus (Hendra), Nipah virus (Nipah), human parainfluenza virus- 2 (HPIV-2), simian parainfluenza virus 5 (SV5), human par ainfluenza virus-4a (HPIV-4a), human parainfluenza virus-4b (HPIV-4b), mumps vir us (Mumps), and Newcastle disease virus ( NDV).
  • SeV Sendai virus
  • HPIV-1 human parainfluenza virus-1
  • HPIV-3 human parainfl uenza virus-3
  • PDV
  • the virus of the present invention is preferably a virus belonging to the Paramyxovirus subfamily (including the genus Respirovirus, Rubravirus, and Mopilivirus), or a derivative thereof, more preferably the genus Respirouinores.
  • a virus belonging to (genus Respirovirus) also called Paramyxovirus
  • Derivatives include viruses in which viral genes have been altered, chemically modified viruses, etc. so as not to impair the gene transfer ability of the viruses.
  • respirovirus viruses to which the present invention can be applied include human parainfluenza virus type 1 (HPIV-1), human parainfluenza virus type 3 (HPIV-3), and ushiparainfluenza virus type 3 (BPIV-).
  • Sendai virus also called mouse parainfluenza virus type 1
  • measles virus measles virus
  • salparainfluenza virus SV5
  • monkey parainfluenza virus type 10 S PIV-10
  • the paramyxovirus is most preferably a sender virus.
  • Paramyxovirus generally contains a complex composed of RNA and protein (ribonucleoprotein; RNP) inside the envelope.
  • the RNA contained in RNP is a single-stranded (negative) single-stranded RNA that is the paramyxovirus genome, and this single-stranded RNA binds to NP protein, P protein, and L protein. Forming.
  • RNA contained in this RNP becomes a trap for transcription and replication of the viral genome (Lamb, RA, and D. Kolakofsky, 199, Paramyxoviriaae: The viruses and their replication. Pp.1177-1204.
  • Fields Virology 3rd edn. Fields, B. N "DM Knipe, and PM Howley et al. (Ed.), Raven Press, New York, NY).
  • NP, P, M, F, HN, and L genes encode nucleocapsid, phospho, matrix, fusion, hemaggluten-neuramidase, and large protein, respectively. It refers to a gene.
  • Nucleocapsid (NP) protein binds to genomic RNA and is an essential protein for genomic RNA to have saddle type activity. In general, the NP gene is sometimes referred to as “N gene”.
  • Phospho (P) protein is a phosphorylated protein that is a small subunit of RNA polymerase. Matritus (M) protein functions to maintain the viral particle structure and internal forces.
  • the fusion (F) protein is a membrane fusion protein involved in invasion into the host cell, and the hemadalun neuraminidase (HN) protein is a protein involved in binding to the host cell.
  • Large (L) protein is the large subunit of RNA polymerase.
  • Each of the above genes has an individual transcription control unit, and a single mRNA is transcribed from each gene, and a protein is transcribed.
  • a nonstructural protein (C) that is translated using a different ORF
  • a protein (V) that is created by RNA editing in the middle of reading the P protein mRNA are translated.
  • each gene in each virus belonging to the subfamily Nomyxovirus is expressed as follows in order from 3 '.
  • the accession number of the nucleotide sequence database of each gene of Sendai virus is M29343, M30202, M30203, M30204, M51331, M55565, M69046, X17218
  • P gene is M30202, M30203, M30204, M55565, M6904 6, X00583, X17007, X17008,
  • M gene is D11446, K02742, M30202, M30 203, M30204, M69046, U31956, X00584, X53056, F gene For D00152, D 11446, D17334, D17335, M30202, M30203, M30204, M69046, X00152, X02131, for HN gene D26475, M12397, M30202, M30203, M30204, M69046, X0058 6, X02808, X56131, for L gene See D00053, M30202, M30203, M30204, M69 040,
  • the viral genes encoded by other viruses are as follows: CDV, AF014953; DMV, X75961; HPIV-1, D01070; HPIV-2, M55320; HPIV-3, D10025; Mapuera, X85128; Mumps, D86172; MV, K01711; NDV, AF064091; PDPR, X74443; PDV, X75717; RPV, X68311; SeV, X00087; SV5, M81442; and Tupaia, AF079780, for the P gene, CDV, X51 869; DMV, Z47758 ; HPIV- 1, M74081; HPIV- 3, X04721; HPIV- 4a, M55975; HPIV-4b, M55976; Mumps, D86173; MV, M89920; NDV, M20302; PDV, X75960; RPV, X 68311; Se
  • the non-replicating vector of the present invention (hereinafter referred to as "the vector of the present invention") is (-) so that part or all of the protein that binds to single-stranded single-stranded RNA is not expressed. Self-replicating ability is lost due to modification of single-stranded RNA.
  • the protein that binds to the ( ⁇ ) strand single-stranded RNA is directly and / or indirectly bound to the ( ⁇ ) strand single-stranded RNA and is combined with the ( ⁇ ) strand single-stranded RNA.
  • the protein that forms the body is directly and / or indirectly bound to the ( ⁇ ) strand single-stranded RNA and is combined with the ( ⁇ ) strand single-stranded RNA.
  • the complex of the present invention includes a complex consisting of ( ⁇ ) single-stranded RNA derived from paramyxovirus and protein (NP, P, and L protein) derived from paramyxovirus that binds to it. .
  • derived from a paramyxovirus means that a paramyxovirus component (including protein and RNA) is left as it is or partly modified.
  • a protein or RNA prepared by modifying a protein or RNA of a nomyxovirus is a protein or RNA “derived from paramyxovirus”.
  • the vector of the present invention is not limited as long as it has the above characteristics.
  • the vector of the present invention may be a viral vector having an envelope protein (F, HN, and M protein) and the like and having a virus particle structure. Further, it may be an RNP vector that does not have a virus envelope and is RNP itself.
  • NP, P, and L proteins bind to (single-stranded) single-stranded RNA and perform functions essential for genomic RNA replication and protein expression.
  • NP, P, L proteins are referred to as “genomic RNA binding proteins”).
  • NP protein is a protein that binds very tightly to genomic RNA and imparts cocoon type activity to genomic RNA.
  • Genomic RNA has a cocoon activity of RNA synthesis only in a state of binding to NP protein, and has no cocoon type activity in a state of not binding to NP protein.
  • P protein binds to genomic RNA as a small subunit of RNA polymerase and L protein as a large subunit of RNA polymerase.
  • the first embodiment of the vector of the present invention is as follows: (a) Paramyxoviridae virus (single) NP protein, P protein, and L-tank that are proteins that bind to single-stranded RNA A single strand that is derived from a noxoviridae virus that has been modified so as not to express a protein that binds to one or more (-) strand single-stranded RNAs, including at least the L protein. Stranded RNA, (b) NP protein, P protein, and L protein, characterized in that it contains a complex complex.
  • the vector of the present invention is a viral particle containing a complex (RNP) consisting of a modified ( ⁇ ) single-stranded RNA (genomic RNA) and NP, P, and L proteins.
  • RNP a complex
  • the (single-stranded single-stranded RNA) contained in the vector of the present invention is modified so as not to express at least L protein.
  • the protein is also expressed in the gene force encoded in the genomic RNA by the action of the NP, P, and L proteins contained in the vector of the present invention.
  • the genome-binding protein gene containing L protein is not expressed because it is not encoded in the genomic RNA of the vector of the present invention.
  • the vector of the present invention is a non-replicating viral vector.
  • virus particles particles containing genomic RNA and RNA, ⁇ , and L proteins
  • the vector of the present invention is a non-replicating viral vector.
  • the vector of the present invention is highly safe in that it has no self-replicating ability. If you simply lack the ability to self-replicate, you can also achieve your goal by introducing mutations that impair the function of NP, P, and L proteins into NP, P, and L genes in genomic RNA. .
  • the vector of the present invention is significant in that it eliminates protein expression itself rather than expressing a protein deficient in function by introducing a mutation into the gene. That is, the vector of the present invention is a safer vector than a simple non-replicating vector in that immunogenicity is reduced.
  • the genomic RNA contained in the vector of the present invention may lack the L gene alone, but preferably, in addition to the L gene, an NP or P gene, most preferably NP, P, L It is desirable that all genes are deleted.
  • the vector of the present invention has the following advantages in that the L gene among RNA-binding protein genes is particularly deficient in the genome. Since the L gene occupies about half the length of genomic RNA, the genomic RNA of the vector of the present invention is greatly reduced in genome size due to L gene deletion. Therefore, as a first advantage, the vector of the present invention can be loaded with a longer foreign gene than when other genes are deleted. The second advantage is that higher transcription efficiency and higher expression level can be expected due to the shorter genome size. In particular, when a foreign gene is expressed by a non-replicating viral vector, the expression level of the foreign gene can be expected to increase based on self-replication of the viral vector. is important.
  • the second embodiment of the vector of the present invention is modified so that (a) a protein capable of binding to a paramyxoviridae virus (-) single-stranded RNA also does not express a plurality of selected proteins.
  • (-) single-stranded RNA derived from Paramyxoviridae virus, (b) NP protein, P protein, and L protein, and a complex that has power, are characterized by.
  • the genomic RNA of the virus vector of the second embodiment can be modified as follows: it encodes L gene but does not encode two genes of NP gene and P gene! This includes, but is not limited to, any genomic RNA that has been modified to not express two or three genomic RNA binding proteins. By deleting multiple genes, the amount of virus-derived protein is reduced as compared to the case of deleting either NP or P gene. In addition, since the length of the genomic RNA is further shortened, it is possible to carry a foreign gene longer.
  • the genomic RNA of the vector of the present invention lacks part or all of the genomic RNA-binding protein gene.
  • the genomic RNA is deficient in at least L gene, preferably deficient in L gene and NP gene, or L gene and P gene, most preferably NP, P , All L genes are defective, and in the second embodiment, multiple genomic RNA binding protein genes are defective.
  • the gene encoded by genomic RNA may be a virus-derived gene sequence as it is, or some mutation may be introduced. For example, those skilled in the art can make such a minor mutation that does not impair the function of each protein by using a known method. It can be introduced to Denko.
  • site-specific mutations can be introduced by PCR or cassette mutation methods, or random mutations can be introduced by chemical reagents or random nucleotides.
  • Those skilled in the art can appropriately select the stringent hybridization conditions. For example, 25% formamide, 50% formamide under more severe conditions, 4 X SSC, 50 mM Hepes pH 7.0, 10 X Denhardt's solution, 20 g / ml denatured salmon sperm DNA in hybridization solution at 42 ° C After pre-hybridization at 1), perform hybridization at 42 ° C.
  • a polypeptide encoded by a polynucleotide isolated using such hybridization technology usually has high homology in amino acid sequence with the polypeptide encoded by the ( ⁇ ) strand RNA.
  • High homology means at least 40% or more, preferably 60% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably at least 95% or more, more preferably at least 97% or more (e.g.
  • the cytotoxicity caused by the noramyxovirus vector can be reduced by introducing a mutation into the P gene.
  • a mutation may be introduced into the RNA gene on the genome.
  • Specific examples of such mutations include substitution of SeV P protein with 511st Leu (L511) to other amino acids, or substitution ability of other (-)-strand RNA virus P protein homologous sites.
  • Amino acid mutations may be substitutions for other desired amino acids, but are preferred. Or substitution with an amino acid having a different side chain chemistry.
  • amino acids include basic amino acids (eg lysine, arginine, histidine), acidic amino acids (eg aspartic acid, glutamic acid), uncharged polar amino acids (eg glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), nonpolar Amino acids (eg alanine, norin)
  • basic amino acids eg lysine, arginine, histidine
  • acidic amino acids eg aspartic acid, glutamic acid
  • uncharged polar amino acids eg glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine
  • nonpolar Amino acids eg alanine, norin
  • substitution of an amino acid with an amino acid other than the amino acid of the group to which the amino acid belongs can be mentioned.
  • a basic amino acid is substituted with an acidic or neutral amino acid
  • a polar amino acid is substituted with a nonpolar amino acid
  • substitution to an amino acid smaller than the average molecular weight and conversely, substitution to an amino acid larger than the average molecular weight smaller than the average molecular weight, is not limited thereto.
  • substitution of L511 with Phe (L511F) can be exemplified.
  • the genomic RNA contained in the vector of the present invention may or may not encode all or part of the envelope protein gene. It may be possible to further improve the immunogenicity of the vector when administered in vivo by modifying it so that not only the genomic RNA binding protein gene but also the envelope protein gene is not expressed.
  • Envelope protein genes (M gene, F gene, HN gene) encoded by genomic RNA may be wild-type, or temperature-sensitive mutations may be introduced. Temperature sensitive mutations in the envelope protein are detailed in WO20 03/025570!
  • the genomic RNA contained in the vector of the present invention contains at least L gene force or a force that lacks a plurality of genomic RNA binding protein genes.
  • the RNP of the present invention can be produced by transcription of a positive strand or a negative strand).
  • RNP can be formed in BHK-21 or LLC-MI ⁇ cells.
  • the NP, P, and L proteins can be supplied by various methods as long as they are not supplied by viral vectors. For example Alternatively, it can be carried out by introducing an expression vector encoding each gene into cells (see Examples). Each gene may be integrated into the host cell chromosome.
  • the NP, P, and L genes that are expressed to form the RNP need not be exactly the same as the NP, P, and L genes encoded in the vector genome.
  • the amino acid sequences of the proteins encoded by these genes are not limited to the amino acid sequences of the proteins encoded by the RNP genome, so long as they bind to genomic RNA and have transcriptional replication activity into the genome in the cell. Mutations may be introduced or homologous genes of other viruses may be substituted.
  • NP, P, and L proteins are expressed in a cell when the vector is reconstituted in the cell, a viral vector that retains infectivity can be produced by incorporating these proteins into the viral vector.
  • a viral vector that retains infectivity can be produced by incorporating these proteins into the viral vector.
  • Such vectors are extremely useful for target diseases or application fields in which the effects of the vectors need to be reduced as much as possible, particularly in gene therapy.
  • a vector DNA encoding a (1) strand single-stranded RNA derived from a paramyxovirus or its complementary strand derived from a paramyxovirus, which has been modified as described above, into It can be prepared by introducing it into a cell (helper cell) that expresses the derived protein and expressing it, (b) culturing the cell, and collecting virus particles from the culture supernatant.
  • Single-stranded RNA or DNA encoding the complementary strand can also be used.
  • RNP When expressing vector DNA, RNP is formed by co-expressing NP, L, and P proteins, and the virus of the present invention is constructed.
  • a vector cDNA to be expressed in helper cells encodes (single-stranded single-stranded RNA (negative strand) or its complementary strand (positive strand) contained in the vector of the present invention.
  • (single-stranded single-stranded RNA or DNA encoding its complementary strand is ligated downstream of the T7 promoter and transcribed into RNA by ⁇ 7 RNA polymerase.
  • the vector cDNA may be cloned into a plasmid so that it can be amplified in Escherichia coli.
  • the strand to be transcribed in the cell may be a positive strand or a negative strand of the virus, but it is preferable to increase the efficiency of reconstitution so that the positive strand can be transcribed.
  • the vector cDNA is designed so that the positive strand is transcribed (SEQ ID NO: 3).
  • helper cells cells expressing NP, L and P proteins are used.
  • Helper cells are not limited to cells that express proteins (NP, L, P) that are deficient in viral vectors, but are different from genomic RNA binding proteins encoded by genes deficient in the viral vectors. It can be a cell that expresses a genomic RNA binding protein. For example, as long as replication and transcription of genomic RNA are possible, it is possible to use genomic RNA binding proteins of other paramyxoviruses.
  • genes can be expressed in helper cells by various methods unless they are derived from viral vectors.
  • a plasmid expressing a recombinant Sendai virus vector genome deficient in the L gene or a plurality of genes including the L gene can be transfected into a host cell together with NP, P / C, and L protein expression vectors.
  • Virus vector reconstitution can be performed.
  • These protein groups other than viral genomes can be used to introduce mutations if their activity in introducing nucleic acids is equal to or higher than that of the natural type, even if the amino acid sequence is not that of the virus.
  • a homologous gene of another virus may be substituted.
  • the helper cell may be a cell that expresses a protein having a function of further promoting virus particle formation and release, for example, C protein.
  • the C protein is preferably expressed in helper cells.
  • the C protein includes four proteins, C ', C, Yl and Y2, which are translated by different start codons in the same reading frame.
  • the expressed C protein may be expressed by any one or more of the above four proteins.
  • Helper cells expressing all four types of C ′, C, Yl, and ⁇ 2 are preferred as cells used for reconstitution of the viral vector of the present invention.
  • the C gene which is inconsistent with the reading gene is also deleted.
  • the C gene on genomic RNA is deficient, it is possible to express the C gene in the helper cell by introducing an expression vector encoding the C gene into the helper cell.
  • a method of expressing C protein in helper cells it is known that replication of the vector genome is suppressed in the C protein continuous expression strain (Kato A, et al., J Virol. 78, 7443-54 (2004)) Supply with sustained expression may be difficult. For example, refer to Examples described later.
  • the vector of the present invention can be amplified by reintroducing the RNP or virus into the helper cell and culturing.
  • This process consists of: (a) Paramyxoviridae virus () Proteins that bind to single-stranded RNA, NP protein, P protein, and L protein power are also selected, including at least one L protein containing at least L protein Expressed envelope protein with () strand single-stranded RNA derived from noramisovirus, and protein that binds to () strand single-strand RNA And (b) culturing the cell and recovering virus particles from the culture supernatant.
  • Paramyxoviridae virus Proteins that bind to single-stranded RNA, NP protein, P protein, and L protein power are also selected, including at least one L protein containing at least L protein Expressed envelope protein with () strand single-stranded RNA derived from noramisovirus, and protein that binds to () strand single-strand RNA And (b) cul
  • Paramyxoviridae virus Proteins that bind to single-stranded RNA (-) NP protein, P protein, and L protein are also selected.
  • RNP can be introduced into cells by forming a complex with, for example, lipofectamine or polycationic ribosome.
  • various transfer reagents can be used.
  • DOTMA Boehringer
  • Superfect QIAG EN # 301305
  • DOTAP ⁇ DOPE DOSPER (Boehringer # 1811169)
  • DOSPER Boehringer # 1811169
  • Lipofectamine 20 00 Invitrogen, and the like.
  • black-and-white quince can also be removed (Calos, MP, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015).
  • an envelope protein in addition to a viral envelope protein, for example, a polypeptide derived from an adhesion factor, a ligand, a receptor or the like that can adhere to a specific cell is included in the extracellular region.
  • a chimeric protein having a viral envelope-derived polypeptide in the intracellular region can be used. This also makes it possible to create vectors that target specific tissues.
  • the viral vector of the present invention may be, for example, a modified viral gene contained in the vector in order to reduce immunogenicity or to increase RNA transcription efficiency or replication efficiency. .
  • the vector of the present invention may contain RNA encoding a foreign gene in (single-stranded single-stranded RNA).
  • a desired gene desired to be expressed in the target cell can be used.
  • a gene for treating a target disease is inserted into the viral vector gene.
  • S transcription start
  • E transcription termination
  • an EIS sequence transcription initiation sequence, intervening sequence, transcription termination sequence
  • the expression level of the inserted foreign gene can be controlled by the type of transcription initiation sequence added upstream of the foreign gene. It can also be controlled by the position of gene insertion and the base sequence before and after the gene. For example, for Sendai virus, the inserted position is closer to the 3 'end of (single-stranded RNA) (the closer to the NP gene in the gene arrangement on the wild-type virus genome), the inserted gene. Is highly expressed.
  • the foreign gene In order to obtain high expression of the foreign gene, it is preferable to insert the foreign gene into the upstream region (3 ′ side in the minus strand) in the negative strand genome. Conversely, the insertion position is closer to the 5 'end of the negative-strand RNA, and so on ( The closer to the L gene), the lower the expression level of the inserted gene. In order to keep the expression of foreign genes low, for example, the 5'-most side of the negative strand, i.e., the wild-type virus genome, or downstream of the L gene (the negative strand, or 5 'adjacent site of the L gene). ), Or an exogenous gene is inserted upstream of the L gene (in the negative strand, 3 'adjacent to the L gene).
  • genomic promoters may be inserted together with the foreign gene.
  • the genomic promoter is not particularly limited, but an RNA polymerase I promoter can be mentioned as an example.
  • a cloning site can be designed at the insertion site.
  • the cloning site can be, for example, a recognition sequence for a restriction enzyme.
  • a foreign gene fragment can be inserted into the restriction enzyme site in the vector DNA encoding the genome.
  • the cloning site may be a so-called multicloning site having a plurality of restriction enzyme recognition sequences.
  • the vector of the present invention may retain other foreign genes.
  • Thread-replaceable Sendai virus vectors having foreign genes are described in, for example, Kato, A. et al, 1 997, EMBO J. 16: 578-587 and Yu, D. et al., 1997, Genes Cells 2: According to the description of 457-466, it can be constructed as follows.
  • a DNA sample containing a cDNA base sequence of a desired foreign gene is prepared. It is preferable that the DNA sample be confirmed as a single plasmid by electrophoresis at a concentration of 25 ng / 1 or higher.
  • a foreign gene is inserted into the DNA encoding the viral genome using the Notl site. If the target cDNA base sequence contains a Notl recognition site, use a site-specific mutagenesis method, etc. to modify the base sequence so that the encoded amino acid sequence is not changed, and remove the Notl site in advance. It is preferable to keep it.
  • the desired gene fragment from this sample is amplified and recovered by PCR.
  • Both ends of the amplified fragment are Notl sites, and a Notl restriction is added to add a copy of Sendai virus transcription termination sequence (E), intervening sequence (I), and transcription initiation sequence (S) (EIS sequence) at one end.
  • Enzyme cleavage site arrangement As a primer pair including a sequence and a transcription termination sequence (E), an intervening sequence (I), a transcription initiation sequence (S), and a partial sequence of the target gene, a forward synthetic DNA sequence and a reverse synthetic DNA sequence (antisense strand) ).
  • the forward-side synthetic DNA sequence has 5 or more nucleotides on the 5 'side to ensure cleavage by Notl (preferably 4 bases that do not include a sequence derived from the Notl recognition site of GCG or GCC. And more preferably ACTT), a Notl recognition site gcggccgc is added to the 3 ′ side, and any 9 bases as a spacer sequence or a multiple of 6 to 9 is added to the 3 ′ side.
  • a sequence corresponding to about 25 bases of ORF including the start codon ATG force of the desired cDNA is added to the 3 ′ side. It is preferable to select about 25 bases as the desired cDNA force so that the last base is G or C and use it as the 3 ′ end of the forward-side synthetic oligo DNA.
  • the reverse-side synthetic DNA sequence is selected from the 5 'side by selecting any two or more nucleotides (preferably GCG, 4 bases that do not contain a sequence derived from the Notl recognition site of GCC, more preferably ACTT). Add the Notl recognition site gcggccgc on the 'side, and add the oligo DNA of the inserted fragment to adjust the length on the 3' side.
  • the length of these oligo DNAs is designed so that the total number of bases in the Sendai virus genome is a multiple of six (the so-called “rule of six j; Kolakofski, D.
  • a complementary strand sequence of Sendai virus S sequence preferably 5′-CTTTCACCCT-3, (SEQ ID NO: 8), I Sequence, preferably 5'-AAG-3 ', complementary sequence of E sequence, preferably 5'-TTTT TCTTACTACGG-3' (SEQ ID NO: 9), and the end codon strength of the desired cDNA sequence is also reversed on the 3 'side
  • the length is selected so that the final base force or C of the complementary strand corresponding to about 25 bases is counted, and the sequence is added to make the 3 ′ end of the reverse-side synthetic oligo DNA.
  • PCR for example, a usual method using ExTaq polymerase (Takara Shuzo) can be used. This is preferably performed using Vent polymerase (NEB), and the amplified fragment of interest is digested with Notl and then inserted into the Notl site of the plasmid vector pBluescript. Confirm the base sequence of the resulting PCR product with a sequencer and select a plasmid with the correct sequence. This plasmid force also excises the insert with Notl and clones it into the Notl site of the plasmid containing the genomic cDNA that lacks the envelope gene. Plasmid vector pBluescript It is also possible to obtain recombinant Sendai virus cDNA by inserting directly into the Notl site without intervention.
  • NEB Vent polymerase
  • the viral vector cDNA of the present invention is transcribed in a test tube or in a cell, expressed separately, and combined with P or NP protein to reconstitute RNP, and the viral vector containing this RNP Can be generated.
  • a viral vector cDNA that encodes a single-stranded RNA or its complementary strand that has been modified so that it does not express part of the virus-derived protein!
  • the genes deleted in the viral vector cDNA of the present invention can be expressed by separately introducing these deleted genes into host cells.
  • the RNp is constructed by the gene encoded by the viral vector cDNA of the present invention or another expression vector, the envelope protein is expressed, and the virus particle is reconstructed, the virus particle retains infectivity. Togashi.
  • the viral vector cDNA can be introduced into the cell by the following method: (a method for preparing a DNA precipitate that can be taken up by the target cell, a G0 target cell, and There are methods such as making a complex containing DNA with low toxicity and positive charge characteristics, and (iii) instantaneously opening a hole enough to allow DNA molecules to pass through the target cell membrane.
  • various transfection reagents can be used. For example, DOTMA (Boehringer), Superfect (QIAGEN # 301305), DOTAP, DOPE, DOSPER (Boehringer # 1811 169), Lipofectamine 2000 (Invitrogen) and the like can be mentioned.
  • (I) includes, for example, the transfection method using phosphate power, and the DNA that has entered the cells by this method is taken into the phagocytic vesicles.
  • a transfection method using phosphate power the DNA that has entered the cells by this method is taken into the phagocytic vesicles.
  • DNA concentration in the precipitate mixture is 20-30 (Chen, C. and Okayama, H., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 2745) 0 (ii) is suitable for transient transfection.
  • a method of preparing a mixture of DEAE-dextran (Sigma # D-9885 MW 5 X 105) at a desired DNA concentration ratio and performing transfection is known. Many of the complexes are broken down in the endonome, so the black mouth can be carotened to enhance its effectiveness (Calos, MP, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015) .
  • the method (iii) is a method called electroporation, and has a low cell selectivity. In this respect, the method is more versatile than the 0 and GO methods. It is considered to be optimal under the optimum conditions of the shape, strength of electric field (gap between electrodes, voltage), buffer conductivity, DNA concentration, and cell density.
  • the method (ii) is easy to operate and can examine a large number of specimens using a large amount of cells.
  • Lipofectamine 2000 Invitrogen
  • Superfect Transfection Ragent QIAu EN, Cat No. 301305
  • DOSPER Liposomal Transfection Reagent Boehringer Mannheim, Cat No. 1811169
  • the titer of the recovered virus can be determined by, for example, CIU (Cell-Infected Unit) measurement or hemagglutination activity (HA) measurement (WO00 / 70070; Kato, A. et al. , 199 ri, Genes Cells 1: 569—579; Yonemitsu, Y. & Kaneda, Y., Hemaggulutinating virus of Japan—polar— mediated gene delivery to vascular cells. Ed. By Baker AH. Molecular Biology of Vascular Diseases. Method in Molecular Medicine: Humana Process: pp. 295-306, 1999).
  • CIU Cell-Infected Unit
  • HA hemagglutination activity
  • the titer can be quantified by directly counting infected cells using the marker as an index (eg, as GFP-CIU).
  • the titer measured in this way can be handled in the same way as CIU (WO00 / 70070).
  • the recovered paramyxovirus vector can be purified to be substantially pure.
  • the purification method can be performed by a known purification / separation method or a combination thereof including filtration (filtration), centrifugation, column purification, and the like.
  • “Substantially pure” refers to the ability of the viral vector to occupy a major proportion as a component in the sample in which it is present.
  • a substantially pure viral vector will have a viral vector-derived ratio of 10% of the total protein in the sample (except for proteins added as carriers and stabilizers). % Or more, preferably 20% or more, more preferably 50% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, and further preferably 90% or more.
  • a specific method for purifying noramyxovirus for example, a method using cellulose sulfate ester or crosslinked polysaccharide sulfate ester (Japanese Examined Patent Publication No. 62-30752, Japanese Examined Publication No. 62-33879, and Japanese Examined Publication No. 62-30753). And a method of adsorbing to a sulfated-fucose-containing polysaccharide and / or a degradation product thereof (WO 97/32010) and the like.
  • the vector of the present invention is non-replicating and has high safety because L protein or the like is not expressed and the expression of virus-derived protein is greatly reduced as a whole.
  • the ability of the vector to be administered repeatedly cannot be repeated if the vector is highly immunogenic. Since the vector of the present invention has low immunogenicity, viral vectors are used. It is expected that the application range of gene therapy will expand.
  • the vector of the present invention can be prepared as a composition according to the purpose.
  • the vector can be combined with a desired pharmaceutically acceptable carrier or vehicle as required.
  • “Pharmaceutically acceptable carrier or vehicle” can be administered together with a vector and significantly introduces gene transfer by the vector. It is a material that does not interfere.
  • the vector may be saline or phosphate buffered saline (
  • compositions containing the vector can be appropriately diluted with PBS or the like.
  • the composition containing the vector may contain a carrier or a medium such as deionized water or 5% dextrose aqueous solution.
  • a carrier or a medium such as deionized water or 5% dextrose aqueous solution.
  • vegetable oils, suspending agents, surfactants, stabilizers, biocides and the like may also be contained. Preservatives or other additives can also be added.
  • Compositions containing the vectors of the present invention are useful as reagents and as medicaments.
  • a vector is prepared using a gene for treating a disease as a foreign gene, this vector can be administered to perform gene therapy.
  • the gene of the viral vector of the present invention can be applied to gene therapy by using either a gene expression by direct administration or a gene expression by indirect (ex vivo) administration. It is possible to express endogenous genes or the like that are insufficiently supplied in the body.
  • a nucleic acid encoding a protein that is not particularly limited as a foreign gene, for example, it may be a nucleic acid that does not encode a protein such as an antisense or ribozyme! /.
  • a gene encoding a bacterial or viral antigen related to an infectious disease is used as a foreign gene, immunity can be induced in the animal by administering it to the animal. That is, it can be used as a vaccine.
  • the vector of the present invention may be applied to, for example, tumors, infectious diseases, and other common diseases.
  • a gene having a therapeutic effect can be expressed in tumor cells or antigen-presenting cells (APC) such as DC cells using the vector of the present invention.
  • APC antigen-presenting cells
  • genes include cancer antigen Muc-1 or Muc-1-like mucin tandem repeat peptide (US Pat. No. 5,744,144), melanoma gplOO antigen, and the like.
  • Such gene therapy has been widely applied to breast cancer, colon cancer, spleen cancer, prostate cancer, lung cancer and the like. It is also effective to combine a site force-in type that enhances the adjuvant effect.
  • genes include i) a combination of IL-2 and single-stranded IL-12 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (15): 859 1-8596, 1999), ii) IL -2 and interferon- ⁇ (US Pat. No. 5,798,100), m) granulocyte colony-stimulating factor (GM-CSF) used alone, iv) GM-C SF and IL-4 for brain tumor treatment Combinations (J. Neurosurgery 90 (6), 1115-1124 (1999)) It is.
  • cholera for example, the cholera toxin B subunit (CTB) (Arakawa T, et al., Nature Biotechnology (1998) 16 (10): 934-8, Arak awa T, et al "Nature Biotechnology (1998) 16 (3): 292-7)
  • rabies for example, the sugar of rabies virus Protein (Lodmell DL et al., 1998, Nature Medicine 4 (8): 949-52), for cervical cancer, human papillomavirus type 6 capsid Npaku LI (J. Med. Virol, 60, 200-204 (2000)) and the like.
  • the dose of the vector varies depending on the disease, the patient's weight, age, sex, symptom, administration purpose, administration composition form, administration method, transgene, etc., but can be appropriately determined by those skilled in the art. Is possible.
  • the route of administration can be selected as appropriate, for example, transcutaneous, intranasal, transbronchial, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, intraarticular, intrathecal, or subcutaneous. It is not limited to. Nasal administration is one preferred route of administration. It can be administered locally or systemically.
  • the amount of vector administered is preferably about 10 5 ClU / ml to about 10 11 CIU / mU, more preferably about 10 7 ClU / ml to about 10 9 CIU / ml, most preferably about 1 ⁇ 10 8 ClU / ml.
  • To about 5 ⁇ 10 8 CIU / ml is preferably administered in a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the preferred dose per dose is 2 X 10 5 CIU to 2 X 10 1Q CIU can be 1 or multiple doses within the range of clinically acceptable side effects. The same applies to the number of administrations.
  • the protein dosage is, for example, 10 ng / kg to 100 / zg / kg, preferably 100 ng / kg to g / kg, more preferably 1 ⁇ g / kg. It should be in the range of kg force 5 / zg / kg.
  • an amount converted from the above dose can be administered based on the body weight ratio between the target animal and human or the volume ratio (for example, average value) of the administration target site.
  • the administration target of the composition containing the vector of the present invention include humans, monkeys, mice, and rats. This includes all mammals such as tusks, usagis, hidges, ushis, and nu.
  • FIG. 1 is a diagram showing the process of construction of pMiniSeV / M / F / HN and pMiniSeV / GFP / M / F / HN.
  • FIG. 2 is a diagram showing the process of constructing pC4C / P ( ⁇ ).
  • FIG. 3 is a photograph showing the effect of SeV C protein on the productivity of MiniSeV / GFP / M / F / HN.
  • A pCAGGS- NP (Z), pCAGGS-P (Z) / 4C (-), pCAGGS-L (TDK), or pCI cont ro or pCI-4C / P
  • BHK-21 cells are infected with MiniSeV / GFP / M / F / HN and are GFP fluorescence photographs of production cells on the 4th day.
  • B LLC-MK2 cells infected with the culture supernatant on day 4 of (A) are GFP fluorescence photographs on day 3.
  • FIG. 4 A GFP photograph showing the productivity of MiniSeV / GFP / M / F / HN 1-7 days after infection.
  • B It is a graph which shows the titer of MiniSeV / GFP / M / F / HN in the culture supernatant collect
  • FIG. 5 is a fluorescent photograph showing in vitro GFP expression by MiniSeV / GFP / M / F / HN.
  • FIG. 6 is a diagram showing the process of constructing pMiniSeV / GFP and pMiniSeV / luciferase.
  • FIG. 7 is a diagram showing the process of constructing pMiniSeV / GFP and pMiniSeV / luciferase.
  • FIG. 8 is a view showing the influence of a genomic promoter on the expression level of a MiniSeV vector.
  • FIG. 9 is a fluorescent photograph showing GFP expression by MiniSeV / GFP.
  • pSeV (+18) is a saddle type, and primers M / Not I-F (5,-aagtggcggccgcacggcgcaa tggcagatatc, 33mer ( ⁇ ⁇ number: 1)) and HN / 3 ⁇ 4ac II— R (5 ⁇ ggtaccgcggagcttcgatcgttactgattag , ⁇ ta PCR [Koyo] Not IM / F / HN-Sac II fragment was obtained (FIG. 1).
  • this fragment was treated with Notl and SacII, purified, and treated as NotI and SacII as an insert, and then the fragment containing the SeV NP / P / M / F / HN / L sequence was removed. Insertion into a pSeV (+18) vector gave P MiniSeV / M / F / HN (SEQ ID NO: 3).
  • pMiniSeV / GFP / M / F / HN (can also be written as pSeV / GFP / ⁇ / ⁇ / ⁇ L)
  • pSeV / GFP / AF treated with Not I and GFP-EIS / Not I fragment (SEQ ID NO: 4) was isolated and purified, and then inserted into a pMiniSeV / M / F / HN vector similarly treated with Not I to obtain pMiniSeV / GFP / M / F / HN (FIG. 1).
  • the GFP-E IS / Not I fragment sequence was also referred to when other target genes (GOI) were loaded.
  • the GOI-EIS / Not I fragment was amplified by PCR, treated with Not I, purified, and then inserted into the pMiniSeV / M / F / HN vector treated with Not I in the same manner, and p MiniSeV / GOI / M / F / HN Can be obtained.
  • PM iniSeV / GFP and pMiniSeV / luciferase were constructed with one promoter added upstream of the GFP gene or luciferase gene.
  • Primer Not I-GF P-N (5-agttcacgcggccgcagatcttcacgatggtgagcaagggcgaggagctg, oOmer (self column number: 10)) and GFP— Sac II— C ( 5, — caggtaccgcggagcttcgatcgttctgcacgatagggactaattacttgtacag
  • a Not I-GFP-Sac II fragment was obtained by PCR using ctcgtccatg, 65 mer (SEQ ID NO: 11)).
  • this fragment was treated with Not I and Sac II, purified, and then similarly treated with Not I and Sac II to remove pSeV (SeV NP, P, L, M, F, HN sequences containing fragments).
  • TDK TDK vector was inserted as a GFP insert to obtain pMiniSeV / GFP (SEQ ID NO: 12).
  • the primer Not I-luciferase-N (5, -atccatcgcggc cgcagatcttcacgatggaagacgccaaaacataaag, 50mer) (3rd column 3 ⁇ 4 ⁇ No .: 13)
  • Norecifev ⁇ Se- 3 ⁇ 4ac II- PCR with C o-acttactccgcggttcgatcgttctgcacgatagggactaattacacggcgatctttccgcccttc, 66mer (SEQ ID NO: 14)
  • C o-acttactccgcggttcgatcgttctgcacgatagggactaattacacggcgatctttccgcccttc, 66mer
  • SeV / luciferase (SEQ ID NO: 15) was obtained.
  • fragments were further obtained by PCR using primers 224N and GFP-Sac II-C. This fragment was treated with Kas I and Sac II and purified, and then similarly treated with Kas I and Sac II to remove the sequence containing a single promoter (Single-promoter) and inserted into the pMiniSeV / GFP vector as an insert.
  • This fragment was treated with Kas I and Sac II and purified, and then similarly treated with Kas I and Sac II to remove the sequence containing a single promoter (Single-promoter) and inserted into the pMiniSeV / GFP vector as an insert.
  • the primers Not I-luciferase-N and luciferase-Sac II- PMiniSeV / Luciferase by adding Not I and Sac II restriction enzyme sites on both sides of luciferase by PCR using C and replacing with Not I-GFP-Sac II sequence of pMini SeV / GFP
  • MiniSeV vector cDNA 1 ⁇ g / ⁇ ⁇ 5 ⁇ ⁇
  • the virus productivity was higher under the condition in which the C protein expression plasmid [pCHC / P ( ⁇ )] was introduced than the condition in which the control plasmid [pCI- neo ] that does not express C protein was introduced (FIG. 3). In addition, it became clear that it is necessary to express an appropriate amount of C protein in order to obtain high productivity.
  • HeLa cells seeded on 3e5 cells / well (12-well collagen-coated plate, IWAKI) on the day were infected with MiniSeV / GFP / M / F / HN at MOI 100, 10, 1.
  • luciferase activity was measured.
  • Wells co-infected with Helper-SeV were immunostained with anti-luciferase antibody, and the number of luciferase positive cells in each well was counted. By dividing the average value of the number of luciferase positive cells by the average value of the luciferase activity, the luciferase activity per cell can be calculated. As shown in Figure 8, a MiniSeV / luciferase vector with a single promoter
  • protein expression level (luciferase activity) per cell was found to be about 1.5 times higher.
  • the non-replicating SeV vector developed by the present inventors is high, has low introduction efficiency and low immunogenicity, and therefore can be applied to a wide range of fields such as antibody production, protein function analysis, gene therapy, and gene vaccines. Be expected.

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Description

明 細 書
非複製型パラミクソウィルス科ウィルスベクター
技術分野
[0001] 本発明は、非複製型パラミクソウィルス科ウィルスベクターに関する。
背景技術
[0002] センダイウィルスベクター（SeVベクター）は細胞質型ウィルスベクター（発現の全段 階が細胞質で行われるベクター）であることから、 in vivoで使用しても、搭載遺伝子が 宿主染色体へ組み込まれて遺伝毒性を生じる心配は全くない。また、 in vitroと in viv oの両方において高い遺伝子導入、発現効率が得られることや、 in vitroでは長期持 続発現が可能であることなど、いくつもの優れた性能を有している。そのため SeVは、 遺伝子治療 '遺伝子ワクチン、あるいは抗体産生や機能解析への応用など遺伝子導 入ベクターとしての多くの応用 *利用が期待されている（非特許文献 1、 2)。
[0003] し力しながら、センダイウィルスベクターを用いて外来遺伝子を発現させる場合、搭 載した外来遺伝子と同時にウィルス構造蛋白（特に転写複製に必要な RNP構成蛋白 である NP, P, L蛋白）も発現するため、生体への応用において、免疫原性を惹起する 可能性が考えられる。近年、種々のタイプの遺伝子欠損型 SeVベクターが開発された 。例えば、ウィルス RNP構成蛋白以外の M,F,HN蛋白質を、それぞれ単独あるいは複 数欠損させたタイプがある（特許文献 1, 2)。これらの遺伝子欠損型 SeVベクターでは 免疫原性の低減が見られたが、依然残っていることが予想された。
[0004] SeVベクターの RNP構成蛋白である NP, P, Lは、センダイウィルスゲノムの転写複製 に必要な蛋白質であり、本来、 SeVベクターに必要不可欠な蛋白質である。しかし、こ れらの蛋白遺伝子をゲノム上欠損させた場合であっても、これらの蛋白が発現プラス ミドなどにより外部から供給されれば、ウィルスベクター粒子を再構成'増幅させること は理論上可能である。さらに、再構成された NP, P, L欠損 SeVベクターが標的細胞へ 感染すると、粒子内に持ち込んでいる NP, Pおよび L蛋白を利用して、ゲノム上の外 来遺伝子の mRNAを転写し、外来遺伝子を発現させることも可能である。この NP, P, L欠損 SeVベクターはゲノム上 NP, P, L遺伝子が欠損されているため、 RNPを複製す ることができず、非複製 SeVベクターに生まれ変わる。
[0005] ゲノム上、 NP, P, Lのいずれか一つをゲノム上欠損させれば、 RNPの複製ができな くなり（あるいは極端に減少し)、非複製 SeVベクターになり得る。これまでに、非複製 S eVベクターを作製する目的で、 NP蛋白遺伝子を単独で欠失させたベクター、 P蛋白 遺伝子を単独で欠失させたベクターを構築した報告がある（非特許文献 3、 4)。しか し、 L蛋白が RNAポリメラーゼ活性本体であることを考えると、 P遺伝子や NP遺伝子を ゲノムから単独に欠失させるのではなぐ L遺伝子あるいは L遺伝子を含む複数の遺 伝子を欠失させることにより、非複製型ベクターの特徴をより確実なものにすることが できると考えられる。また、 L遺伝子を含む複数の遺伝子の欠失は、ウィルス由来蛋 白による影響を最大限に減らすことができるものと期待される。したがって、 L遺伝子 を含む複数の遺伝子、例えば NP, P, L遺伝子全てを欠損することが、免疫原性低減 の観点からは望ましい。また、ゲノム長の約半分の長さを占める L遺伝子の欠失は、よ り長い目的遺伝子のゲノムへの搭載を可能にすることが期待され、さらに、ゲノムサイ ズが短くなるほど、転写効率が高ぐより高い目的遺伝子の発現量が期待できる。こ のように、 L遺伝子を欠損させた SeVベクターは極めて有用であると考えられる。しか しながら、 SeVベクターを含むパラミクソウィルス科ウィルスベクターについて、 L遺伝 子を欠損させたベクターを作製した報告はこれまでにない。
特許文献 1： WO00/70070
特許文献 2： WO2003/025570
非特許文献 l : Bitzer M, et al.， J Gene Med. 5(7):543- 553 (2003)
非特許文献 2 : Griesenbach U, et al.， Curr Opin Mol Ther.7(4):346-352. (2005) 非特許文献 3 : Molecular Therapy Volume 13, Supplement 1, May 2006, page S185 非特許文献 4 : NSV2006 (13th International Conference Negative Strand Viruses 200 6, Salamance, Spain, June 17- 22nd, 2006)要旨集
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明は上記状況に鑑みてなされたものであり、本発明が解決しょうとする課題は 、免疫原性の低 、非複製型パラミクソウィルス科ウィルスベクターを作製することであ る。
課題を解決するための手段
上記課題を解決すベぐ本発明者らは、鋭意研究を重ねた。本発明者らは、 RNP構 成蛋白である NP, P, Lタンパク質の遺伝子をゲノム RNAから全て欠損させた非複製 型 SeVベクターの作製に成功し、 GFPなどマーカー遺伝子を搭載した NP/P/L欠損タ イブ SeVベクターにおいて、高い生産性（le7 CIU/ml以上）と高い外来遺伝子の導入 及び発現効率 (高 、発現量を得るには高 MOI感染することが必要）力得られることを 確認した。本発明のベクターは、 L遺伝子、または NP,P,L遺伝子の複数の遺伝子を 欠損させることにより、宿主細胞内で発現するウィルス由来のタンパク質量が低減し、 in vivo投与における免疫原性を低下させることができる。本発明のベクターは、とりわ け、遺伝子治療の分野において極めて有用である。すなわち、本発明は、 L遺伝子を 欠損したパラミクソウィルス科ウィルスベクターに関し、より具体的には下記の発明を 提供するものである。
(1)下記 (a)および (b)からなる複合体を含む、ウィルスベクター。
(a)パラミクソウィルス科ウィルス ( )鎖一本鎖 RNAに結合するタンパク質である NPタ ンパク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質力も選択される、少なくとも Lタンパク質を 含む 1または複数のタンパク質を発現しな 、ように改変された、ノ ラミクソウィルス科ゥ ィルスに由来する（ )鎖一本鎖 RNA
(b) NPタンパク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質
(2)下記 (a)および (b)からなる複合体を含む、ウィルスベクター。
(a)パラミクソウィルス科ウィルス ( )鎖一本鎖 RNAに結合するタンパク質である NPタ ンパク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質カゝら選択される、複数のタンパク質を発現 しないように改変された、ノ ミクソウィルス科ウィルスに由来する（-)鎖一本鎖 RNA
(b) NPタンパク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質
(3)パラミクソウィルス科ウィルスに由来する（-)鎖一本鎖 RNA力 NPタンパク質、 P タンパク質、および Lタンパク質を発現しないように改変されている、上記（1)または（ 2)に記載のベクター。
(4)パラミクソウィルス科ウィルスに由来する（一）鎖一本鎖 RNA力 パラミクソウィルス 科ウィルスのエンベロープタンパク質の少なくとも一つを発現する、上記（1)から（3) の！、ずれかに記載のベクター。
(5)パラミクソウィルス科ウィルスに由来する（-)鎖一本鎖 RNA力 Mタンパク質、 Fタ ンパク質、 HNタンパク質を発現し、 NPタンパク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質を 発現しないように改変されている、上記 (4)に記載のベクター。
(6) (一）鎖一本鎖 RNAがセンダイウィルスに由来する、上記（1)から（5)のいずれか に記載のベクター。
(7) (一）鎖一本鎖 RNAがさらに外来遺伝子を搭載している、上記（1)から（6)のいず れかに記載のベクター。
(8)上記（1)から (7)の 、ずれかに記載のベクターに含まれる（一）鎖一本鎖 RNAま たはその相補鎖をコードする DNA。
(9)下記 (a)および (b)の工程を含む、上記（1)に記載のベクターの製造方法。
(a)パラミクソウィルス科ウィルス ( - )鎖一本鎖 RNAに結合するタンパク質である NPタ ンパク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質力も選択される、少なくとも Lタンパク質を 含む 1または複数のタンパク質を発現しな 、ように改変された、ノ ラミクソウィルス科ゥ ィルスに由来する（一）鎖一本鎖 RNAまたはその相補鎖をコードする DNAを、 NPタン パク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質を発現可能な細胞に導入する工程
(b)該細胞を培養し、その培養上清カゝらウィルス粒子を回収する工程
(10)下記 (a)および (b)の工程を含む、上記（2)に記載のベクターの製造方法。
(a) NPタンパク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質力も選択される、複数のタンパク 質を発現しな ヽように改変された、パラミクソウィルス科ウィルスに由来する（―）鎖一 本鎖 RNAまたはその相補鎖をコードする DNAを、 NPタンパク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質を発現可能な細胞に導入する工程
(b)該細胞を培養し、その培養上清カゝらウィルス粒子を回収する工程
(11) NPタンパク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質を発現可能な細胞力 さらにゥ ィルス粒子形成と放出を促進する機能を有するタンパク質を発現可能である、上記（ 9)または（10)に記載の製造方法。
(12)ウィルス粒子形成と放出を促進する機能を有するタンパク質が、 Cタンパク質で ある、上記（11)に記載の方法。
(13)下記 (a)および (b)の工程を含む、上記（1)に記載のベクターの製造方法。
(a)パラミクソウィルス科ウィルス ( - )鎖一本鎖 RNAに結合するタンパク質である NPタ ンパク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質力も選択される、少なくとも Lタンパク質を 含む 1または複数のタンパク質を発現しな 、ように改変された、ノ ラミクソウィルス科ゥ ィルスに由来する（一）鎖一本鎖 RNAまたはその相補鎖をコードする DNAが挿入され たベクター、 NPタンパク質発現ベクター、 Pタンパク質発現ベクター、および Lタンパク 質発現ベクターを発現可能な細胞に導入する工程
(b)該細胞を培養し、その培養上清カゝらウィルス粒子を回収する工程
(14)下記 (a)および (b)の工程を含む、上記（2)に記載のベクターの製造方法。
(a) NPタンパク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質力も選択される、複数のタンパク 質を発現しな ヽように改変された、パラミクソウィルス科ウィルスに由来する（―）鎖一 本鎖 RNAまたはその相補鎖をコードする DNAが挿入されたベクター、 NPタンパク質 発現ベクター、 Pタンパク質発現ベクター、および Lタンパク質発現ベクターを細胞に 導入する工程
(b)該細胞を培養し、その培養上清カゝらウィルス粒子を回収する工程
(15)下記 (a)および (b)の工程を含む、上記（1)に記載のベクターの製造方法。
(a)パラミクソウィルス科ウィルス ( - )鎖一本鎖 RNAに結合するタンパク質である NPタ ンパク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質力も選択される、少なくとも Lタンパク質を 含む 1または複数のタンパク質を発現しないように改変されたパラミクソウィルスに由 来する（-)鎖一本鎖 RNA、および該（-)鎖一本鎖 RNAと結合するタンパク質、から なる複合体を、 NPタンパク質、 Pタンパク質、 Lタンパク質、およびエンベロープタンパ ク質を発現する細胞に導入する工程、および
(b)該細胞を培養し、その培養上清カゝらウィルス粒子を回収する工程、を含む方法。
(16)下記 (a)および (b)の工程を含む、上記（2)に記載のベクターの製造方法。
(a)パラミクソウィルス科ウィルス ( - )鎖一本鎖 RNAに結合するタンパク質である NPタ ンパク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質カゝら選択される、複数のタンパク質を発現 しないように改変されたパラミクソウィルスに由来する（-)鎖一本鎖 RNA、および該（ -)鎖一本鎖 RNAと結合するタンパク質、力もなる複合体を、 NPタンパク質、 Pタンパ ク質、 Lタンパク質、およびエンベロープタンパク質を発現する細胞に導入する工程、 および
(b)該細胞を培養し、その培養上清カゝらウィルス粒子を回収する工程、を含む方法。
(17)下記 (a)および (b)の工程を含む、標的細胞に外来遺伝子を発現させるための ベクターを製造する方法。
(a) NPタンパク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質力も選択される、少なくとも Lタン ノ ク質を含む 1または複数のタンパク質を発現しな 、ように改変され、かつ外来遺伝 子を搭載した、ノ ミクソウィルス科ウィルスに由来する（-)鎖一本鎖 RNAまたはそ の相補鎖をコードする DNAを、 NPタンパク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質を発 現可能な細胞に導入する工程
(b)該細胞を培養し、その培養上清カゝらウィルス粒子を回収する工程
(18)下記 (a)および (b)の工程を含む、標的細胞に外来遺伝子を発現させるための ベクターを製造する方法。
(a) NPタンパク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質力も選択される、複数のタンパク 質を発現しないように改変され、かつ外来遺伝子を搭載した、ノ ラミクソウィルス科ゥ ィルスに由来する（一）鎖一本鎖 RNAまたはその相補鎖をコードする DNAを、 NPタン パク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質を発現可能な細胞に導入する工程
(b)該細胞を培養し、その培養上清カゝらウィルス粒子を回収する工程
(19)下記 (a)および (b)の工程を含む、外来遺伝子を標的細胞にお!、て発現させる 方法。
(a)上記（7)記載のベクターを製造する工程
(b)上記（7)記載のベクターを標的細胞に導入する工程
[0008] 〔発明の実施の形態〕
本発明は、ノ ラミクソウィルス科ウィルスを利用した、新規な非複製型ベクターを提 供する。
[0009] 本発明にお 、てパラミクソウィルスとはパラミクソウィルス科（Paramyxoviridae)に属 するウィルスまたはその誘導体を指す。ノ ミクソウィルス科は、非分節型ネガティブ 鎖 RNAをゲノムに持つウィルスのグループの 1つで、パラミクソウィルス亜科（Paramyx ovirinae) (レスピロウィルス属（パラミクソウィルス属とも言う）、ルブラウィルス属、およ びモービリウィルス属を含む）および-ユーモウイノレス亜科 (Pneumovirinae) (ニュー モウィルス属およびメタ-ユーモウィルス属を含む）を含む。パラミクソウィルス科ウイ ルスに含まれるウィルスとして、具体的にはセンダイウィルス (Sendai virus),ニュー力 ッスノレ病ウイノレス (Newcastle disease virus) ^おたふく力ぜゥイノレス (Mumps virus) ^淋 诊ヮ ノレス (Measles virus) ^ RSウイノレス (Respiratory syncytial virus) ^牛疫ウイノレス、 rin derpest virus) ^ジステンノ ーウイノレス (distemper virus) ^サノレノ《ラインフノレェンザウイ ルス（SV5)、ヒトパラインフルエンザウイルス 1, 2, 3型等が挙げられる。より具体的には 、例 は Sendai virus (SeV)、 human parainfluenza virus- 1 (HPIV- 1)、 human parainfl uenza virus- 3 (HPIV- 3)、 phocine distemper virus (PDV)、 canine distemper virus (C DV)、 dolpnin molbillivirus (DMV)、 peste—des—petits— ruminants virus (PDPR)、 measle s virus (MV)、 rinderpest virus (RPV)、 Hendra virus (Hendra)、 Nipah virus (Nipah)、 h uman parainfluenza virus- 2 (HPIV- 2)、 simian parainfluenza virus 5 (SV5)、 human par ainfluenza virus- 4a (HPIV- 4a)、 human parainfluenza virus- 4b (HPIV- 4b)、 mumps vir us (Mumps),および Newcastle disease virus (NDV)などが含まれる。本発明のウィル スは、好ましくはパラミクソウィルス亜科（レスピロウィルス属、ルブラウィルス属、およ びモーピリウィルス属を含む）に属するウィルスまたはその誘導体であり、より好ましく はレスピロウイノレス属 (genus Respirovirus) (パラミクソウイノレス属 (Paramyxovirus)とも 言う）に属するウィルスまたはその誘導体である。誘導体には、ウィルスによる遺伝子 導入能を損なわないように、ウィルス遺伝子が改変されたウィルス、および化学修飾 されたウィルス等が含まれる。本発明を適用可能なレスピロウィルス属ウィルスとして は、例えばヒトパラインフルエンザウイルス 1型（HPIV-1)、ヒトパラインフルエンザウイ ルス 3型（HPIV-3)、ゥシパラインフルエンザウイルス 3型（BPIV-3)、センダイウィルス ( Sendai virus;マウスパラインフルエンザウイルス 1型とも呼ばれる)、麻疹ウィルス、サ ルパラインフルエンザウイルス (SV5)、およびサルパラインフルエンザウイルス 10型（S PIV-10)などが含まれる。本発明においてパラミクソウィルスは、最も好ましくはセンダ ィウィルスである。 [0010] パラミクソウィルスは、一般に、エンベロープの内部に RNAとタンパク質からなる複 合体（リボヌクレオプロテイン； RNP)を含んでいる。 RNPに含まれる RNAはパラミクソゥ ィルスのゲノムである（一）鎖（ネガティブ鎖）の一本鎖 RNAであり、この一本鎖 RNAが 、 NPタンパク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質と結合し、 RNPを形成している。この RNPに含まれる RNAがウィルスゲノムの転写および複製のための铸型となる（Lamb, R.A., and D. Kolakofsky, 199り, Paramyxoviriaae： The viruses and their replication. pp.1177- 1204. In Fields Virology, 3rd edn. Fields, B. N" D. M. Knipe, and P. M. H owley et al. (ed.), Raven Press, New York, N. Y.)。
[0011] パラミクソウィルスの「NP、 P、 M、 F、 HN、および L遺伝子」とは、それぞれヌクレオキ ャプシド、ホスホ、マトリックス、フュージョン、へマグルチュン-ノイラミ-ダーゼ、およ びラージタンパク質をコードする遺伝子のことを指す。ヌクレオキヤプシド (NP)タンパ ク質は、ゲノム RNAに結合し、ゲノム RNAが铸型活性を有するために不可欠なタンパ ク質である。一般に、 NP遺伝子は「N遺伝子」と表記されることもある。ホスホ (P)タン パク質は、 RNAポリメラーゼの小サブユニットであるリン酸化タンパク質である。マトリツ タス (M)タンパク質は、ウィルス粒子構造を内側力も維持する機能を果たす。フュー ジョン（F)タンパク質は、宿主細胞への浸入にかかわる膜融合タンパク質であり、へマ ダルチュンーノイラミニダーゼ (HN)タンパク質は宿主細胞との結合にかかわるタンパ ク質である。ラージ (L)タンパク質は、 RNAポリメラーゼの大サブユニットである。上記 各遺伝子は個々の転写制御ユニットを有し、各遺伝子から単独の mRNAが転写され 、タンパク質が転写される。 P遺伝子からは、 Pタンパク質以外に、異なる ORFを利用し て翻訳される非構造タンパク質 (C)と、 Pタンパク質 mRNAを読み取り途中の RNA編集 により作られるタンパク質 (V)が翻訳される。ノ ミクソウィルス亜科に属する各ウィル スにおける各遺伝子は、一般に、 3'から順に、次のように表記される。
レスピロウィルス属 N P/C/V M F HN - L
ルブラウィルス属 N P/V M F HN (SH) L
モービリウィルス属 N P/C/V M F H - L
[0012] 例えばセンダイウィルスの各遺伝子の塩基配列のデータベースのァクセッション番 号は、 N遺伝子については M29343, M30202, M30203, M30204, M51331, M55565, M69046, X17218, P遺伝子については M30202, M30203, M30204, M55565, M6904 6, X00583, X17007, X17008、 M遺伝子については D11446, K02742, M30202, M30 203, M30204, M69046, U31956, X00584, X53056、 F遺伝子については D00152, D 11446, D17334, D17335, M30202, M30203, M30204, M69046, X00152, X02131、 H N遺伝子については D26475, M12397, M30202, M30203, M30204, M69046, X0058 6, X02808, X56131、 L遺伝子については D00053, M30202, M30203, M30204, M69 040, X00587, X58886を参照のこと。またその他のウィルスがコードするウィルス遺伝 子を例示すれば、 N遺伝子については、 CDV, AF014953; DMV, X75961; HPIV- 1, D01070; HPIV— 2, M55320; HPIV— 3, D10025; Mapuera, X85128; Mumps, D86172; MV, K01711; NDV, AF064091; PDPR, X74443; PDV, X75717; RPV, X68311; SeV, X00087; SV5, M81442;および Tupaia, AF079780, P遺伝子については、 CDV, X51 869; DMV, Z47758; HPIV- 1, M74081; HPIV- 3, X04721; HPIV- 4a, M55975; HPIV- 4b, M55976; Mumps, D86173; MV, M89920; NDV, M20302; PDV, X75960; RPV, X 68311; SeV, M30202; SV5, AF052755;および Tupaia, AF079780, C遺伝子につい ては CDV, AF014953; DMV, Z47758; HPIV- 1. M74081; HPIV- 3, D00047; MV, AB 016162; RPV, X68311; SeV, AB005796;および Tupaia, AF079780, M遺伝子につ いては CDV, M12669; DMV Z30087; HPIV- 1, S38067; HPIV- 2, M62734; HPIV- 3, D00130; HPIV- 4a, D10241; HPIV- 4b, D10242; Mumps, D86171; MV, AB012948; NDV, AF089819; PDPR, Z47977; PDV, X75717; RPV, M34018; SeV, U31956;およ び SV5, M32248, F遺伝子については CDV, M21849; DMV, AJ224704; HPN- 1, M 22347; HPIV— 2, M60182; HPIV— 3, X05303, HPIV— 4a, D49821; HPIV— 4b, D49822; Mumps, D86169; MV, AB003178; NDV, AF048763; PDPR, Z37017; PDV, AJ22470 6; RPV, M21514; SeV, D17334;および SV5, AB021962, HN (Hまたは G)遺伝子に ついては CDV, AF112189; DMV, AJ224705; HPIV- 1, U709498; HPIV- 2. D000865 ； HPIV— 3, AB012132; HPIV— 4A, M34033; HPIV-4B, AB006954; Mumps, X99040; MV, K01711; NDV, AF204872; PDPR, X74443; PDV, Z36979; RPV, AF132934; Se V, U06433;および SV-5, S76876、 L遺伝子については CDV, AF014953; DMV, AJ 608288; HPIV— 1, AF117818; HPIV— 2, X57559; HPIV— 3, AB012132; Mumps, AB04 0874; MV, K01711; NDV, AY049766; PDPR, AJ849636; PDV, Y09630; RPV.Z3069 8;および SV-5, D13868が例示できる。但し、各ウィルスは複数の株が知られており、 株の違いにより上記に例示した以外の配列からなる遺伝子も存在する。
[0013] 本発明の非複製型ベクター（以下において、「本発明のベクター」と称す）は、（一） 鎖一本鎖 RNAに結合するタンパク質の一部または全部が発現しないように（-)鎖一 本鎖 RNAが改変されていることにより、 自己複製能を喪失している。本発明において (-)鎖一本鎖 RNAと結合するタンパク質とは、該（-)鎖一本鎖 RNAと直接および/ま たは間接に結合し、該（-)鎖一本鎖 RNAと複合体を形成するタンパク質のことを言う 。本発明の複合体には、パラミクソウィルスに由来する（-)鎖一本鎖 RNAおよびそれ に結合するパラミクソウィルスに由来するタンパク質 (NP、 P、および Lタンパク質)から なる複合体が含まれる。本発明において、「パラミクソウィルスに由来する」とは、パラ ミクソウィルスの構成物（タンパク質、 RNAを含む）がそのままの状態で、または一部を 改変された状態であることを意味する。例えば、ノ ミクソウィルスのタンパク質または RNAを改変して調製されたタンパク質または RNAは、「パラミクソウィルスに由来する」 タンパク質または RNAである。本発明のベクターは、上記特徴を有する限り、その種 類は問わない。例えば、本発明のベクターは、エンベロープタンパク質（F、 HN、およ び Mタンパク質)等を有し、ウィルス粒子の構造をとるウィルスベクターであってもよ い。また、ウィルスエンベロープを有さない、 RNP自体である RNPベクターであっても よい。
[0014] パラミクソウィルス科ウィルスにおいて NP,P,Lタンパク質は、（一）鎖一本鎖 RNAと結 合し、ゲノム RNA複製およびタンパク質発現に不可欠な機能を果たす (以下にぉ ヽて 、場合により、 NP,P,Lタンパク質を、「ゲノム RNA結合タンパク質」と称す)。 NPタンパク 質は、ゲノム RNAと非常に強固に結合し、ゲノム RNAに铸型活性を付与するタンパク 質である。ゲノム RNAは、 NPタンパク質との結合状態においてのみ RNA合成の铸型 活性を有し、 NPタンパク質と結合しない状態では铸型活性は全く有しない。 Pタンパ ク質は RNAポリメラーゼの小サブユニットとして、 Lタンパク質は RNAポリメラーゼの大 サブユニットとして、ゲノム RNAに結合する。そのためパラミクソウィルス科ウィルスで は、 NP、 P、 Lタンパク質のうち一つでも欠ければ、ゲノム RNA複製は起こらない。 [0015] このような本発明のベクターの第一の態様は、（a)パラミクソウィルス科ウィルス（一） 鎖一本鎖 RNAに結合するタンパク質である NPタンパク質、 Pタンパク質、および Lタン ノ ク質力も選択される、少なくとも Lタンパク質を含む一以上の（-)鎖一本鎖 RNAに 結合するタンパク質を発現しないように改変された、ノ ミクソウィルス科ウィルスに由 来する（一）鎖一本鎖 RNA、（b) NPタンパク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質、力も なる複合体を含むことを特徴とする。本発明のベクターは、改変された（-)鎖一本鎖 RNA (ゲノム RNA)と NP、 P、 Lタンパク質からなる複合体（RNP)を含む、ウィルス粒子 である。第一の態様において、本発明のベクターに含まれる（一）鎖一本鎖 RNAは、 少なくとも Lタンパク質を発現しな 、ように改変されて 、る。本発明のベクターを宿主 に感染させると、本発明のベクター中に含まれる NP、 P、 Lタンパク質の働きによって、 ゲノム RNA中にコードされている遺伝子力もタンパク質が発現する。しかし、 Lタンパク 質を含むゲノム結合タンパク質遺伝子は、本発明のベクターのゲノム RNA中にコード されていないために発現しない。したがって、自己の複製であるウィルス粒子（ゲノム RNAならびに ΝΡ,Ρ,および Lタンパク質を含む粒子）を形成することはできない。すな わち、本発明のベクターは、非複製型のウィルスベクターである。本発明のベクター に外来遺伝子を搭載させて宿主に感染させた場合には、外来遺伝子は宿主細胞内 で発現するが、本発明のベクターから自己複製能を有するウィルス粒子は産生され ない。
[0016] このように本発明のベクターは、自己複製能を有しない点で、安全性が高いといえ る。単に自己複製能を欠損させるのであれば、 NP、 P、 Lタンパク質の機能を損なう変 異をゲノム RNA中の NP、 P、 L遺伝子に導入することにより、 目的を達成することも可 能である。しかし、本発明のベクターは、遺伝子に変異を導入して機能を欠損したタ ンパク質を発現させるのではなぐタンパク質発現そのものをなくしている点に意味が ある。すなわち、本発明のベクターは、免疫原性が軽減されている点で、単なる非複 製型ベクターよりもさらに安全性が高いベクターである。この観点からいえば、本発明 のベクターに含まれるゲノム RNAは、 L遺伝子単独を欠損していてもよいが、好ましく は L遺伝子の他に NPまたは P遺伝子、最も好ましくは、 NP、 P、 L遺伝子全てを欠損し ていることが望ましい。 [0017] 本発明のベクターは、 RNA結合タンパク質遺伝子のうち、とりわけ L遺伝子をゲノム 上欠損している点で、以下のような利点を有する。 L遺伝子はゲノム RNAの約半分も の長さを占めるため、本発明のベクターのゲノム RNAは、 L遺伝子欠損によってゲノム サイズが大幅に短縮されている。そのため、第一の利点として、本発明のベクターは 、他の遺伝子を欠損させた場合よりも、より長い外来遺伝子の搭載が可能である。第 二の利点としては、ゲノムサイズが短くなつたことにより、より高い転写効率、より高い 発現量が期待できる。特に、非複製型ウィルスベクターによって外来遺伝子を発現さ せる場合、ウィルスベクターの自己複製に基づく外来遺伝子発現量の増大が見込め な 、ため、高 、タンパク質発現量を確保するためには高 、転写効率が重要である。
[0018] 本発明のベクターの第二の態様は、（a)パラミクソウィルス科ウィルス（-)鎖一本鎖 RNAに結合するタンパク質力も選択される複数のタンパク質を発現しな 、ように改変 された、パラミクソウィルス科ウィルスに由来する（-)鎖一本鎖 RNA、（b) NPタンパク 質、 Pタンパク質、および Lタンパク質、力もなる複合体を含むことを特徴とする。第二 の態様のウィルスベクターのゲノム RNAは、一例を示せば、 L遺伝子はコードするが N P遺伝子と P遺伝子の 2つの遺伝子をコードしな!、ように改変されて!、るゲノム RNAを 挙げることができるが、これに限られず、 2または 3のゲノム RNA結合タンパク質を発現 しないように改変されているゲノム RNAは、すべて含まれる。複数の遺伝子を欠損さ せることにより、 NPまたは Pいずれか一つの遺伝子を欠損させる場合よりも、ウィルス 由来のタンパク質量が低減される。また、ゲノム RNAの長さがより短縮されるため、より 長 、外来遺伝子の搭載が可能となる。
[0019] 本発明のベクターのゲノム RNAは、上述のとおり、ゲノム RNA結合タンパク質遺伝子 の一部または全部を欠損している。第一の態様においては、ゲノム RNAは、少なくと も L遺伝子が欠損しており、好ましくは L遺伝子と NP遺伝子、または L遺伝子と P遺伝 子が欠損しており、最も好ましくは、 NP、 P、 L遺伝子全てが欠損しており、第二の態 様においては、複数のゲノム RNA結合タンパク質遺伝子が欠損している。一方、ゲノ ム RNAにコードされて ヽる遺伝子は、ウィルス由来の遺伝子配列そのままであっても よいが、何らかの変異が導入されていてもよい。例えば、当業者であれば、各タンパ ク質の機能を損なわな 、ような軽微な変異を、公知方法によってゲノム RNA上の各遺 伝子に導入することができる。例えば、 PCR法やカセット変異法等により部位特異的 に変異を導入したり、化学試薬やランダムヌクレオチド等によりランダム変異を導入す ることが可能である。上記ストリンジェントなハイブリダィゼーシヨン条件は、当業者で あれば適宜選択することができる。例えば、 25%ホルムアミド、より厳しい条件では 50 %ホルムアミド、 4 X SSC、 50mM Hepes pH7.0、 10 Xデンハルト溶液、 20 g/ml変性 サケ精子 DNAを含むハイブリダィゼーシヨン溶液中、 42°Cで一晚プレハイブリダィゼ ーシヨンを行った後、 42°Cでー晚ハイブリダィゼーシヨンを行う。その後の洗浄は、「lx SSC、 0.1% SDS、 37°C」程度で、より厳しい条件としては「0.5xSSC、 0.1% SDS、 42°C」 程度で、さらに厳しい条件としては「0.2xSSC、 0.1% SDS、 65°C」程度の洗浄液および 温度条件で実施することができる。このようなハイブリダィゼーシヨン技術を利用して 単離されるポリヌクレオチドがコードするポリペプチドは、通常、上記 (-)鎖 RNAがコー ドするポリペプチドとアミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、少 なくとも 40%以上、好ましくは 60%以上、さらに好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上、さらに好ましくは少なくとも 95%以上、さらに好ましくは少なくとも 97%以上 (例えば、 98から 99%)の配列の相同性を指す。アミノ酸配列の同一性は、例えば、 K arlin and Altschulによるアルゴリズム BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2 268, 1990、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993)によって決定することが できる。このアルゴリズムに基づいて開発された BLASTX(Altschul et al. J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990)によってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータ一はたとえ ば score = 50、 wordlength = 3とする。 BLASTと Gapped BLASTプログラムを用いる場 合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的 な手法は公知である (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
また、 P遺伝子に変異を導入することにより、ノ ラミクソウィルスベクターによる細胞 障害性を低下できることが知られている。本発明のベクターのゲノム RNAが P遺伝子 をコードする場合、ゲノム上の RNA遺伝子にこのような変異が導入されていてもよい。 このような変異としては、具体的には、 SeV P蛋白質の 511番目の Leu (L511)の他のァ ミノ酸への置換、または他の (-)鎖 RNAウィルス P蛋白質の相同部位の置換力 例とし て挙げられる。アミノ酸変異は、所望の他のアミノ酸への置換であってよいが、好まし くは、側鎖の化学的性質の異なるアミノ酸への置換である。例えばアミノ酸は、塩基 性アミノ酸 (例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（例えばァスパラギ ン酸、グルタミン酸）、非荷電極性アミノ酸（例えばグリシン、ァスパラギン、グルタミン 、セリン、スレオニン、チロシン、システィン）、非極性アミノ酸（例えばァラニン、ノ リン
、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フエ二ルァラニン、メチォニン、トリプトファン）、 13 分岐アミノ酸（例えばスレオニン、パリン、イソロイシン）、および芳香族アミノ酸（例え ばチロシン、フエ-ルァラニン、トリプトファン、ヒスチジン）などのグループに分類する ことができるが、あるアミノ酸について、そのアミノ酸が属するグループのアミノ酸以外 のアミノ酸に置換することなどが挙げられる。具体的には、塩基性アミノ酸であれは、 酸性または中性アミノ酸への置換、極性アミノ酸であれは非極性アミノ酸への置換、 2 0種の天然のアミノ酸の平均分子量より大き 、分子量を持つアミノ酸であれば、その 平均分子量より小さ!ヽアミノ酸への置換、逆にその平均分子量より小さ!ヽアミノ酸であ れば、それより大きいアミノ酸への置換などが挙げられるが、それに限定されない。具 体的には、 L511の Pheへの置換 (L511F)などが例示できる。
[0021] 本発明のベクターに含まれるゲノム RNAは、エンベロープタンパク質遺伝子を全て コードしていてもよぐ一部または全部のエンベロープタンパク質遺伝子をコードして いなくてもよい。ゲノム RNA結合タンパク質遺伝子のみならず、エンベロープタンパク 質遺伝子も発現しないように改変することで、ベクターを in vivo投与したときの免疫原 性をさらに改善できる可能性がある。ゲノム RNAにコードされるエンベロープタンパク 質遺伝子 (M遺伝子、 F遺伝子、 HN遺伝子）は野生型であってもよいが、温度感受性 変異が導入されていてもよい。エンベロープタンパク質の温度感受性変異は、 WO20 03/025570に詳述されて!ヽる。
[0022] 本発明のベクターに含まれるゲノム RNAには、少なくとも L遺伝子力 または、複数 のゲノム RNA結合タンパク質の遺伝子が欠損している力 NP、 P、および Lタンパク質 の存在下でこのゲノム RNA (ポジティブ鎖またはネガティブ鎖）を転写させることにより 、本発明の RNPを製造することができる。 RNPの形成は、例えば BHK-21または LLC- MI^細胞などで行わせることができる。 NP、 P、および Lタンパク質の供給は、ウィルス ベクターにより供給されるものでない限り、種々の方法により行うことができる。例えば 、各遺伝子をコードする発現ベクターを細胞に導入することにより行われ得る（実施 例参照)。また、各遺伝子は宿主細胞の染色体に組み込まれていてもよい。 RNPを形 成させるために発現させる NP、 P、および L遺伝子は、ベクターのゲノムにコードされ る NP、 P、および L遺伝子と完全に同一である必要はない。すなわち、これらの遺伝 子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、 RNPゲノムがコードするタンパク質のアミ ノ酸配列そのままでなくとも、ゲノム RNAと結合し、細胞内でゲノムへの転写複製活性 を持つ限り、変異を導入してもよぐあるいは他のウィルスの相同遺伝子で代用しても よい。
[0023] 細胞内でベクターを再構成させる時に NP、 P、および Lタンパク質を細胞に発現させ れば、これらタンパク質がウィルスベクターに取り込まれ、感染性を保持するウィルス ベクターを生産することができる。このようなベクターは、一度細胞に感染すると、細 胞内 RNPによりゲノム RNAからタンパク質を発現させることはできても、それ自身は L 遺伝子等を持たないため、初めと同じような複製能を持つウィルスを再度生産するこ とはできない。このようなベクターは、特に遺伝子治療などの中でも、ベクターの影響 を極力減らす必要のある対象疾患あるいは応用分野に対して極めて有用である。
[0024] 本発明のウィルスベクターを再構成するには、通常、（a)パラミクソウィルスの NPタ ンパク質、 Pタンパク質および Lタンパク質のうち、 Lタンパク質を含む 1または複数のタ ンパク質を発現しな 、ように改変された、パラミクソウィルスに由来する（ ）鎖一本鎖 RNAまたはその相補鎖をコードするベクター DNAを、該（一）鎖一本鎖 RNAと結合す るパラミクソウィルスに由来のタンパク質を発現する細胞 (ヘルパー細胞）に導入して 発現させ、（b)該細胞を培養し、その培養上清からウィルス粒子を回収することにより 調製することができる。または、上記 (a)において、「NPタンパク質、 Pタンパク質、およ び Lタンパク質力も選択される、複数のタンパク質を発現しないように改変された、パ ラミクソウィルス科ウィルスに由来する（一）鎖一本鎖 RNAまたはその相補鎖をコード する DNA」を、用いることもできる。ベクター DNAを発現させる時に、 NP、 L、および Pタ ンパク質を共発現させておくことで RNPが形成され、本発明のウィルスが構築される。
[0025] ヘルパー細胞で発現させるベクター cDNAは、本発明のベクターに含まれる（一）鎖 一本鎖 RNA (ネガティブ鎖)またはその相補鎖 (ポジティブ鎖）をコードして 、る。例え ば、（一）鎖一本鎖 RNAまたはその相補鎖をコードする DNAを T7プロモーターの下流 に連結させ、 Τ7 RNAポリメラーゼにより RNAに転写させる。ベクター cDNAは、大腸 菌で増幅できるようにプラスミドにクローユングされていてもよい。細胞内で転写させる 鎖は、ウィルスのポジティブ鎖でもネガティブ鎖でもよいが、ポジティブ鎖が転写され るようにすることが再構成の効率を上げるためには好ましい。例えば、本発明の実施 例ではポジティブ鎖が転写されるように、ベクター cDNAを設計している（配列番号 3)
[0026] ヘルパー細胞としては、 NP、 Lおよび Pタンパク質を発現する細胞が用いられる。へ ルパー細胞は、ウィルスベクターにおいて欠損しているタンパク質 (NP、 L、 P)を発現 する細胞に限定されず、該ウィルスベクターにおいて欠損している遺伝子がコードす るゲノム RNA結合タンパク質とは異なる、ゲノム RNA結合タンパク質を発現する細胞 でありうる。例えば、ゲノム RNAの複製、転写が可能な限り、他のパラミクソウィルスの ゲノム RNA結合タンパク質を用いることも可能である。
[0027] これらの遺伝子は、ウィルスベクターによるものでない限り種々の方法によりへルパ 一細胞内で発現させることができる。例えば、 L遺伝子または L遺伝子を含む複数の 遺伝子が欠損した組換えセンダイウィルスベクターゲノムを発現するプラスミドを、 NP 、 P/Cおよび Lタンパク質の発現ベクターと共に宿主細胞にトランスフエクシヨンするこ とにより、ウィルスベクターの再構成を行うことができる。また、例えば、 L遺伝子が染 色体に組込まれた宿主細胞を用いて製造することも可能と考えられる。ウィルスゲノ ム以外力 供給されるこれらのタンパク質群は、そのアミノ酸配列はウィルス由来の配 列そのままでなくとも、核酸の導入における活性が天然型のそれと同等かそれ以上 ならば、変異を導入したり、あるいは他のウィルスの相同遺伝子で代用してもよい。
[0028] ヘルパー細胞は、さらにウィルス粒子形成と放出を促進する機能を有するタンパク 質、例えば、 Cタンパク質を発現する細胞であってもよい。 Cタンパク質は、本発明の ウィルスベクターの高い生産性を得るためには、ヘルパー細胞において Cタンパク質 が発現していることが好ましい。センダイウィルスにおいて Cタンパク質には、同一読 み枠上でそれぞれ異なる開始コドンによって翻訳される 4種のタンパク質、 C'、 C、 Yl 、 Y2が含まれる。本発明のウィルスベクターの再構成においてヘルパー細胞中で発 現する Cタンパク質は、上記 4種のタンパク質のうち、いずれか 1種でも複数種が発現 していてもよいと考えられる。 C'、 C、 Yl、 Υ2の 4種全てが発現するヘルパー細胞は、 本発明のウィルスベクターの再構成に用いる細胞として好ましい。本発明のウィルス ベクターにお 、てゲノム RNAカゝら Ρ遺伝子を欠損させた場合、 Ρ遺伝子と読み枠違 ヽ の C遺伝子も欠損することになる。ゲノム RNA上 C遺伝子が欠損する場合は、 C遺伝 子をコードする発現ベクターをヘルパー細胞に導入することにより、ヘルパー細胞内 で C遺伝子を発現させることが可能である。但し、 Cタンパク質をヘルパー細胞中で 発現させる方法としては、 C蛋白質の持続発現株ではベクターゲノムの複製が抑制さ れることが知られているため（Kato A, et al.， J Virol. 78, 7443-54 (2004))持続発現 での供給は難しい可能性があり、例えば、後述する実施例を参照することができる。
[0029] RNPまたはウィルスが形成されれば、この RNPまたはウィルスを上記のヘルパー細 胞に再度導入して培養することにより、本発明のベクターを増幅することができる。こ の過程は、 (a)パラミクソウィルス科ウィルス ( )鎖一本鎖 RNAに結合するタンパク質 である NPタンパク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質力も選択される、少なくとも Lタ ンパク質を含む一以上のタンパク質を発現しな 、ように改変された、ノ ラミクソウィル スに由来する（ ）鎖一本鎖 RNA、および該 ( )鎖一本鎖 RNAと結合するタンパク質 、力もなる複合体を、エンベロープタンパク質を発現する細胞に導入する工程、およ び (b)該細胞を培養し、その培養上清カゝらウィルス粒子を回収する工程、を含む。ま たは、（a)パラミクソウィルス科ウィルス（-)鎖一本鎖 RNAに結合するタンパク質であ る NPタンパク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質力も選択される、複数のタンパク質 を発現しな ヽように改変されたパラミクソウィルスに由来する（ ）鎖一本鎖 RNA、およ び該（-)鎖一本鎖 RNAと結合するタンパク質、力もなる複合体を、 NPタンパク質、 P タンパク質、 Lタンパク質、およびエンベロープタンパク質を発現する細胞に導入する 工程、および (b)該細胞を培養し、その培養上清カゝらウィルス粒子を回収する工程、 を含む。
[0030] RNPを細胞に導入するには、例えばリポフエクトァミンやポリカチォニックリボソーム などと共に複合体を形成させて導入することが可能である。具体的には、種々のトラ ンスフエクシヨン試薬が利用できる。例えば、 DOTMA(Boehringer) , Superfect (QIAG EN #301305)、 DOTAPゝ DOPE, DOSPER (Boehringer #1811169)、 Lipofectamine 20 00 (Invitrogen)などが挙げられる。エンドソーム中での分解を防ぐため、クロ口キンを カロえることもできる（Calos, M.P., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015)。
[0031] エンベロープタンパク質としては、ウィルスのエンベロープタンパク質以外にも、例 えば、特定の細胞に接着しうるような、接着因子、リガンド、受容体等由来のポリぺプ チドを細胞外領域に有し、ウィルスエンベロープ由来のポリペプチドを細胞内領域に 有するキメラタンパク質などを用いることが可能である。これにより、特定の組織を標 的とするベクターを作り出すこともできる。また、本発明のウィルスベクターは、例えば 、免疫原性を低下させるために、または、 RNAの転写効率や複製効率を高めるため に、ベクターに含まれるウィルス遺伝子が改変されたものであってもよい。
[0032] 本発明のベクターは、（一）鎖一本鎖 RNA中に外来遺伝子をコードする RNAを含み うる。外来遺伝子としては、標的細胞中で発現させたい所望の遺伝子を用いることが 可能である。例えば、遺伝子治療などを目的とする場合には、該ウィルスベクター遺 伝子に対象となる疾患の治療用遺伝子を挿入する。ウィルスベクター遺伝子に外来 遺伝子を導入する場合は、例えば、センダイウィルスベクター遺伝子においては、転 写開始 (S)配列と転写終結 (E)配列との間などに、ゲノムの総塩基数が 6の倍数となる ように考慮して配列を挿入することが必要である（Journal of Virology, Vol.67, No.8, 1993, p.4822-4830) o外来遺伝子は、ウィルスの各遺伝子の前または後ろに挿入す ることができる（実施例参照)。前後の遺伝子の発現を妨げないようにするため、外来 遺伝子の前または後ろに適宜 E-I-S配列 (転写開始配列一介在配列一転写終結配 列)またはその部分を挿入する。挿入した外来性遺伝子の発現量は、外来遺伝子の 上流に付加する転写開始配列の種類により調節することができる。また、遺伝子挿入 の位置、また遺伝子の前後の塩基配列により調節しうる。例えば、センダイウィルスに ぉ 、ては、挿入位置が（一）鎖 RNAの 3'端に近 、ほど（野生型ウィルスのゲノム上の 遺伝子配置においては、 NP遺伝子に近いほど）、挿入された遺伝子の発現量が高 い。外来遺伝子の高い発現を得るためには、外来遺伝子をネガティブ鎖ゲノムにお いて上流領域 (マイナス鎖においては 3'側）に挿入することが好ましい。逆に、挿入位 置がネガティブ鎖 RNAの 5'端に近 、ほど（野生型ウィルスのゲノム上の遺伝子配置に おいては、 L遺伝子に近いほど）、挿入された遺伝子の発現量が低くなる。外来遺伝 子の発現を低く抑えるためには、例えばネガティブ鎖の最も 5'側、すなわち野生型ゥ ィルスゲノムにぉ 、ては L遺伝子の下流 (ネガティブ鎖にぉ 、ては L遺伝子の 5'隣接 部位）、または L遺伝子の上流 (ネガティブ鎖においては L遺伝子の 3'隣接部位）に外 来遺伝子を挿入する。また外来遺伝子と共に、一つまたは複数のゲノムプロモーター を挿入していてもよい。本発明において、ゲノムプロモーターは特に制限されるもの ではないが、一例として RNAポリメラーゼ Iプロモーターを挙げることができる。 RNAポ リメラーゼ Iを細胞内で発現する細胞を生産細胞として用いる場合には、 RNAポリメラ ーゼ Iを外来ベクターにより供給する必要がなぐその供給分のコストが省かれる。そ の上で、 T7系と同様に遺伝子の高い発現効率が実現できる。外来遺伝子を容易に 挿入できるようにするために、挿入部位にクローユングサイトを設計することができる。 クロー-ングサイトは、例えば制限酵素の認識配列とすることができる。ゲノムをコード するベクター DNA中の当該制限酵素部位に外来遺伝子断片を挿入することができる 。クロー-ングサイトは、複数の制限酵素認識配列を有する、いわゆるマルチクロー ユングサイトとしてもよい。本発明のベクターは、このように他の外来遺伝子を保持し ていてもよい。
[0033] 外来遺伝子を有する糸且換えセンダイウィルスベクターは、例えば、 Kato, A. et al, 1 997, EMBO J. 16: 578- 587及び Yu, D. et al., 1997, Genes Cells 2: 457- 466の記載 に準じて、次のようにして構築することができる。
[0034] まず、所望の外来遺伝子の cDNA塩基配列を含む DNA試料を用意する。 DNA試料 は、 25ng/ 1以上の濃度で電気泳動的に単一のプラスミドと確認できることが好まし い。以下、外来遺伝子を Notl部位を利用してウィルスゲノムをコードする DNAに挿入 する場合を例にとって説明する。目的とする cDNA塩基配列の中に Notl認識部位が 含まれる場合は、部位特異的変異挿入法などを用いて、コードするアミノ酸配列を変 化させないように塩基配列を改変し、 Notl部位を予め除去しておくことが好ましい。こ の試料カゝら所望の遺伝子断片を PCRにより増幅回収する。増幅された断片の両端が Notl部位とし、さらに一端にセンダイウィルスの転写終結配列 (E)、介在配列 (I)及び 転写開始配列（S) (EIS配列）のコピーを付加するために、 Notl制限酵素切断部位配 列及び転写終結配列 (E)、介在配列 (I)及び転写開始配列 (S)と目的遺伝子の一 部の配列を含むプライマー対として、フォワード側合成 DNA配列及びリバース側合成 DNA配列 (アンチセンス鎖)を作成する。
[0035] 例えば、フォワード側合成 DNA配列は、 Notlによる切断を保証するために 5'側に任 意の 2以上のヌクレオチド (好ましくは GCG、 GCCの Notl認識部位由来の配列が含ま れない 4塩基、更に好ましくは ACTT)を選択し、その 3'側に Notl認識部位 gcggccgcを 付加し、さらにその 3'側にスぺーサー配列として任意の 9塩基または 9に 6の倍数を加 えた数の塩基を付加し、さらにその 3'側に所望の cDNAの開始コドン ATG力もこれを 含めて ORFの約 25塩基相当の配列を付加した形態とする。最後の塩基は Gまたは C となるように該所望の cDNA力も約 25塩基を選択してフォワード側合成オリゴ DNAの 3' の末端とすることが好ましい。
[0036] リバース側合成 DNA配列は 5'側から任意の 2以上のヌクレオチド (好ましくは GCG、 GCCの Notl認識部位由来の配列が含まれない 4塩基、更に好ましくは ACTT)を選択 し、その 3'側に Notl認識部位 gcggccgcを付加し、さらにその 3'側に長さを調節するた めの挿入断片のオリゴ DNAを付カ卩する。これらのオリゴ DNAの長さは、センダイウィル スゲノムの総塩基数が 6の倍数になるように塩基数を設計する（ 、わゆる「6のルール (rule of six) j ;Kolakofski, D. et al.， J. Virol. 72:891-899, 1998)。さらに挿入断片の 3'側にセンダイウィルスの S配列の相補鎖配列、好ましくは 5'-CTTTCACCCT-3，（配 列番号 8)、 I配列、好ましくは 5'-AAG-3'、 E配列の相補鎖配列、好ましくは 5'-TTTT TCTTACTACGG- 3' (配列番号 9)、さらにその 3'側に所望の cDNA配列の終始コドン 力も逆に数えて約 25塩基相当の相補鎖の最後の塩基力 または Cになるように長さ を選択して配列を付加し、リバース側合成オリゴ DNAの 3'の末端とする。
[0037] PCRは、例えば、 ExTaqポリメラーゼ（宝酒造）を用いる通常の方法を用いることがで きる。好ましくは Ventポリメラーゼ (NEB)を用いて行 、、増幅した目的断片は Notlで 消化した後、プラスミドベクター pBluescriptの Notl部位に挿入する。得られた PCR産 物の塩基配列をシークェンサ一で確認し、正しい配列のプラスミドを選択する。この プラスミド力も挿入断片を Notlで切り出し、エンベロープ遺伝子を欠損するゲノム cDN Aを含むプラスミドの Notl部位にクロー-ングする。またプラスミドベクター pBluescript を介さずに Notl部位に直接挿入し、組換えセンダイウィルス cDNAを得ることも可能で ある。
[0038] 本発明のウィルスベクター cDNAは、これを試験管内または細胞内で転写させ、別 途発現するし、 P、 NPタンパク質と結合させることにより、 RNPを再構成させ、この RNP を含むウィルスベクターを生成させることができる。ウィルス由来タンパク質の一部を 発現しな!、ように改変された（ ）鎖一本鎖 RNAまたはその相補鎖をコードするウィル スベクター cDNAからウィルス粒子を再構成する方法は、公知の方法を参考にして実 施することができる（W097/16539号； W097/16538号； Durbin, A.P. et al., 1997, Vir ology 235: 323-332; Whelan, S.P. et al" 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388
-8392; Schnell. M.J. et al" 1994, EMBO J. 13: 4195-4203; Radecke, F. et al" 1995
, EMBO J. 14: 5773-5784; Lawson, N.D. et al" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 447
7-4481; Garcin, D. et al., 1995, EMBO J. 14: 6087-6094; Kato, A. et al., 1996, Ge nes Cells 1: 569—579; Baron, M.D. and Barrett, T" 1997, J. Virol. 71: 1265—1271;
Bridgen, A. and Elliott, R.M., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 15400—15404)。 特に、改良された方法は有効に機能する（WO2005/071092)。本発明のウィルスべク ター cDNAにおいて欠失させた遺伝子は、これら欠失させた遺伝子を、宿主細胞に 別途導入して発現させることができる。本発明のウィルスベクター cDNAまたは別の発 現ベクターにコードされた遺伝子によって、 RNpを構築させ、エンベロープタンパク質 を発現させて、ウィルス粒子を再構築すれば、該ウィルス粒子は感染性を保持するこ とがでさる。
また、 RNP複合体自体を RNAベクターとして細胞に導入するには上記のように、リポ フエクトァミンやポリカチォニックリボソームなどと共に複合体を形成させて細胞に導 入することも可能である。
[0039] ウィルスベクター cDNAを細胞内に導入する方法には、次のような方法、（0目的の細 胞が取り込めるような DNA沈殿物を作る方法、 G0目的の細胞による取りこみに適し、 かつ細胞毒性の少ない陽電荷特性を持つ DNAを含む複合体を作る方法、 (iii)目的 の細胞膜に、 DNA分子が通り抜けられるだけに十分な穴を電気パルスによって瞬間 的に開ける方法などがある。 [0040] (ii)としては、種々のトランスフエクシヨン試薬が利用できる。例えば、 DOTMA (Boehri nger)、 Superfect (QIAGEN #301305)、 DOTAP、 DOPE, DOSPER (Boehringer #1811 169)、 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)などが挙げられる。（i)としては例えばリン酸力 ルシゥムを用いたトランスフエクシヨン法が挙げられ、この方法によって細胞内に入つ た DNAは貧食小胞に取り込まれる力 核内にも十分な量の DNAが入ることが知られ ている（Graham, F.L. and Van Der Eb, J., 1973, Virology 52: 456; Wigler, M. and Si lverstein, S.， 1977, Cell 11: 223) 0 Chenおよび Okayamaはトランスファー技術の最適 化を検討し、 1)細胞を共沈殿物のインキュベーション条件を 2〜4% CO 、 35°C、 15
2
〜24時間、 2) DNAは直鎖状より環状のものが活性が高ぐ 3)沈殿混液中の DNA濃 度が 20〜30
Figure imgf000023_0001
る（Chen, C. and Okay ama, H.， 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 2745) 0 (ii)の方法は、一過的なトランスフエクシヨン に適している。古くは DEAE-デキストラン（Sigma #D-9885 M.W. 5 X 105 )混液を所 望の DNA濃度比で調製し、トランスフエクシヨンを行う方法が知られている。複合体の 多くはエンドノームの中で分解されてしまうため、効果を高めるためにクロ口キンをカロ えることもできる（Calos, M.P., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015)。（iii)の方 法は電気穿孔法と呼ばれる方法で、細胞選択性がな 、と 、う点で (0や GOの方法に比 ベて汎用性が高い。効率はパルス電流の持続時間、パルスの形、電界（電極間のギ ヤップ、電圧）の強さ、バッファーの導電率、 DNA濃度、細胞密度の最適条件下で良 いとされている。
[0041] 以上、 3つのカテゴリーの中で (ii)の方法は操作が簡便で多量の細胞を用いて多数 の検体を検討することができる。本発明においては、好適に用いうるトランスフエクショ ン試薬として Lipofectamine 2000 (Invitrogen)、 Superfect Transfection Ragent (QIAu EN, Cat No. 301305)、また【ま DOSPER Liposomal Transfection Reagent (Boehringer Mannheim, Cat No. 1811169)を挙げることができる。
[0042] 回収されたウィルスの力価は、例えば CIU (Cell-Infected Unit)測定または赤血球 凝集活性 (HA)の測定することにより決定することができる (WO00/70070; Kato, A. et al., 199り, Genes Cells 1: 569—579; Yonemitsu, Y. & Kaneda, Y., Hemaggulutinating virus of Japan— liposome— mediated gene delivery to vascular cells. Ed. by Baker AH. Molecular Biology of Vascular Diseases. Method in Molecular Medicine: Humana Pr ess: pp. 295-306, 1999)。また、 GFP (緑色蛍光タンパク質）などのマーカー遺伝子を 搭載したベクターについては、マーカーを指標に直接的に感染細胞をカウントするこ とにより力価を定量することができる（例えば GFP-CIUとして)。このようにして測定し た力価は、 CIUと同等に扱うことができる（WO00/70070)。
[0043] 回収したパラミクソウィルスベクターは実質的に純粋になるよう精製することができる 。精製方法はフィルトレーシヨン (濾過）、遠心分離、およびカラム精製等を含む公知 の精製 ·分離方法またはその組み合わせにより行うことができる。「実質的に純粋」と は、ウィルスベクター力 それが存在する試料中の成分として主要な割合を占めるこ とを言う。典型的には、実質的に純粋なウィルスベクターは、試料中に含まれる全タ ンパク質 (但しキャリアーや安定剤として加えたタンパク質は除く）のうち、ウィルスべク ター由来のタンパク質の割合が 10%以上、好ましくは 20%以上、より好ましくは 50%以 上、好ましくは 70%以上、より好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上を占め ることにより確認することができる。ノ ラミクソウィルスの具体的な精製方法としては、 例えばセルロース硫酸エステルまたは架橋ポリサッカライド硫酸エステルを用いる方 法 (特公昭 62-30752号公報、特公昭 62-33879号公報、および特公昭 62-30753号公 報）、およびフコース硫酸含有多糖および/またはその分解物に吸着させる方法 (WO 97/32010)等を例示することができる。
[0044] 本発明のベクターは、非複製型であり、かつ Lタンパク質等が発現せずに、ウィルス 由来タンパク質の発現が全体として大幅に削減されていることから、高い安全性を有 する。特に、遺伝子治療用途で使用する場合は、ベクターの免疫原性が高いと、ベタ ターを繰り返して投与することができなくなる力 本発明のベクターは低免疫原性で あることから、ウィルスベクターを用いた遺伝子治療の応用範囲が広がるものと期待さ れる。
[0045] 本発明のベクターは目的に応じた組成物として調製することができる。ベクターを含 む組成物の製造においては、ベクターは必要に応じて薬理学的に許容される所望の 担体または媒体と組み合わせることができる。「薬学的に許容される担体または媒体」 とは、ベクターと共に投与することが可能であり、ベクターによる遺伝子導入を有意に 阻害しない材料である。例えばベクターを生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水（
PBS)などで適宜希釈して組成物とすることができる。またベクターを含む組成物は、 脱イオン水、 5%デキストロース水溶液等の担体または媒体を含んでいてもよい。さら に、その他にも、植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、殺生物剤等が含有されて いてもよい。また保存剤またはその他の添加剤を添加することができる。本発明のベ クタ一を含む組成物は試薬として、および医薬として有用である。
[0046] 外来遺伝子として疾患の治療用遺伝子を用いてベクターを調製すれば、このべク ターを投与して遺伝子治療を行なうことが可能となる。本発明のウィルスベクターの 遺伝子治療への応用としては、直接投与による遺伝子発現、間接 (ex vivo)投与によ る遺伝子発現のいずれの方法によっても、治療効果を期待できる外来遺伝子もしく は患者の体内で供給が不足している内在遺伝子等を発現させることが可能である。 外来遺伝子としては特に制限はなぐタンパク質をコードする核酸に加え、例えば、ァ ンチセンスまたはリボザィムなどのタンパク質をコードしな 、核酸であってもよ!/、。
[0047] 外来遺伝子として、感染症に関する細菌またはウィルスの抗原をコードする遺伝子 を用いれば、これを動物に投与することにより、該動物において免疫を誘導すること ができる。即ち、ワクチンとして利用することができる。
[0048] ワクチンとして用いる場合、例えば腫瘍、感染症、およびその他の一般的な疾患に 対し本発明のベクターを適用することが考えられる。例えば腫瘍治療としては、腫瘍 細胞、または DC細胞などの抗原提示細胞 (APC)に本発明のベクターを用いて治療 効果を有する遺伝子を発現させることができる。このような遺伝子としては、癌抗原 M uc-1または Muc-1様ムチンタンデムリピートペプチド（米国特許第 5,744,144号）、メ ラノーマ gplOO抗原などが挙げられる。このような遺伝子による治療は、乳癌、結腸癌 、脾臓癌、前立腺癌、肺癌等、幅広い応用が示されている。また、アジュバント効果を 高めるサイト力イン類を組み合わせることも有効である。このような遺伝子としては、例 えば i) IL- 2と一本鎖 IL- 12との組み合わせ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (15): 859 1-8596, 1999)、 ii) IL-2とインターフェロン- γ (米国特許第 5,798, 100号）、 m)単独で 用いられる顆粒球コロニー刺激因子 (GM-CSF)、 iv)脳腫瘍を治療対象とした GM-C SFと IL- 4の組み合わせ (J. Neurosurgery 90 (6), 1115-1124 (1999))などが挙げら れる。
[0049] 感染症の治療としては、インフルエンザにお!、ては、例えば強毒株 H5N1型ェン ベロープ、日本月 炎においては、例えばエンベロープキメラ（Vaccine, vol. 17, No. 1 5-16, 1869-1882 (1999))、エイズにおいては、例えば HIV gagまたは SIV gagタンパ ク質（J. Immunology (2000) vol. 164, 4968- 4978)、 HIVエンベロープタンパク質の経 口投与による鎖クチン治療、ポリ乳酸-ダリコール共重合体に包んでの投与 (Kaneko, H. et al., Virology 267: 8-16 (2000))、コレラにおいては、例えばコレラ毒素の Bサブ ユニット（CTB) (Arakawa T, et al., Nature Biotechnology (1998) 16(10): 934-8、 Arak awa T, et al" Nature Biotechnology (1998) 16(3): 292- 7)、狂犬病においては、例え ば狂犬病ウィルスの糖タンパク（Lodmell DL et al., 1998, Nature Medicine 4(8):949- 52)、子宮頸癌においては、ヒトパピローマウィルス 6型のカプシドタンパク LI (J. Med. Virol, 60, 200-204 (2000))などが挙げられる。
[0050] ベクターの投与量は、疾患、患者の体重、年齢、性別、症状、投与目的、投与組成 物の形態、投与方法、導入遺伝子等により異なるが、当業者であれば適宜決定する ことが可能である。投与経路は適宜選択することができるが、例えば経皮的、鼻腔内 的、経気管支的、筋内的、腹腔内、静脈内、関節内、脊髄腔内、または皮下等に行 われうるがそれらに限定されない。経鼻投与は好ましい投与経路の一つである。また 局所あるいは全身に投与し得る。投与されるベクター量は好ましくは約 105 ClU/mlか ら約 1011 CIU/mUより好ましくは約 107 ClU/mlから約 109 CIU/ml、最も好ましくは約 1 X 108 ClU/mlから約 5 X 108 CIU/mlの範囲内の量を薬学上容認可能な担体中で投 与することが好ましい。ヒトにおいては 1回当たりの投与量は 2 X 105 CIU〜 2 X 101Q CIUが好ましぐ投与回数は、 1回または臨床上容認可能な副作用の範囲で複数回 可能であり、 1日の投与回数についても同様である。本発明のベクターを用いて製造 されたタンパク質製剤であれば、タンパク質の投与量は例えば、 10ng/kgから 100 /z g/ kg、好ましくは 100ng/kgから g/kg、より好ましくは 1 μ g/kg力 5 /z g/kgの範囲で あるとよい。ヒト以外の動物についても、例えば目的の動物とヒトとの体重比または投 与標的部位の容積比 (例えば平均値)で上記の投与量を換算した量を投与すること ができる。本発明のベクターを含む組成物の投与対象としては、ヒト、サル、マウス、ラ ット、ゥサギ、ヒッジ、ゥシ、ィヌなど全ての哺乳動物が含まれる。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書 に組み入れられる。
図面の簡単な説明
[0051] [図 l]pMiniSeV/M/F/HNと pMiniSeV/GFP/M/F/HNの構築の過程を示す図である。
[図 2]pCト 4C/P (-)の構築の過程を示す図である。
[図 3]MiniSeV/GFP/M/F/HNの生産性における SeVの C蛋白質の影響を示す写真で ある。（A) pCAGGS- NP (Z)、 pCAGGS- P (Z)/4C( -)、 pCAGGS- L (TDK)と、 pCI cont roほたは pCI-4C/P (-)のどちらかを導入した BHK- 21細胞に MiniSeV/GFP/M/F/HN を感染させ、 4日目の生産細胞の GFP蛍光写真である。 (B) (A)の 4日目の培養上清 を LLC- MK2細胞に感染させ 3日目の GFP蛍光写真である。
[図 4] (A)感染後 1〜7日の MiniSeV/GFP/M/F/HNの生産性を示す GFP写真である 。 （B) 1〜7日に回収した培養上清における MiniSeV/GFP/M/F/HNのタイターを示す グラフである。
[図 5]MiniSeV/GFP/M/F/HNによる in vitroでの GFP発現を示す蛍光写真である。
[図 6]pMiniSeV /GFPと pMiniSeV /ルシフェラーゼの構築の過程を示す図である。
SP SP
[図 7]pMiniSeV /GFPと pMiniSeV /ルシフェラーゼの構築の過程を示す図である。
DP DP
[図 8]MiniSeVベクターの発現量に対するゲノムプロモーターの影響を示す図である。
[図 9]MiniSeV /GFPによる GFP発現を示す蛍光写真である。
SP
実施例
[0052] 以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制 限されるものではない。
〔材料と方法〕
1 プラスミド構篛
1.1 pMiniSeV/M/F/HN (pSeV/ Δ ΝΡ/ Δ Ρ/ Δ Lと記すこともできる）
[0053] 先ず、 pSeV(+18)を铸型として、プライマー M/Not I- F(5， - aagtggcggccgcacggcgcaa tggcagatatc、 33mer (酉歹 号： 1))と HN/¾ac II— R(5 ― ggtaccgcggagcttcgatcgttctgca cgatagggactaattattaagactcggccttgcataatttag、
Figure imgf000027_0001
ヽた PCR【こよ り Not I-M/F/HN-Sac II fragmentを得た（図 1)。次に、この断片を Notlと SacIIで処理 、精製し、インサートとして、同様に Not Iと Sac IIで処理した後、 SeVの NP/P/M/F/HN /L配列を含む断片を取り除いた pSeV (+18)ベクターに挿入し、 PMiniSeV/M/F/HN ( 配列番号: 3)を得た。
[0054] 1.2 pMiniSeV /GFP/M/F/HN (pSeV/GFP/ Δ ΝΡ/ Δ Ρ/ Δ Lと記すこともできる） pSeV/GFP/ A Fを Not I処理し、 GFP- EIS/Not I fragment (配列番号： 4)を分離、精 製した後、同様に Not Iで処理した pMiniSeV/M/F/HNベクターに挿入し、 pMiniSeV/ GFP/M/F/HNを得た（図 1)。ほかの目的遺伝子 (GOI)を搭載する場合にも、 GFP- E IS/Not I fragmentの配列を参照した。 PCRで GOI- EIS/Not I fragmentを増幅し、 Not I 処理、精製した後、同様に Not Iで処理した pMiniSeV/M/F/HNベクターに挿入し、 p MiniSeV/GOI/M/F/HNを得ることができる。
[0055] 1.3 pCI-4C/P (-)
先ず、 pSeV(+18)を铸型として、プライマー EcoR I- 4C/P (-) - F (5， - acttgaattcacggc ttcggctacacttaccgcctggatcaagatgccttcattc、 55mer (酉歹 号： 5) )と EcoR I— 4C/P (—ノー R (5， - cgaggcggccgcttactcttgcactatgtg、 30mer (配列番号： 6) )を用いた PCRにより Ec oR I-4C/P (-) -EcoRI fragment (配列番号： 7)を得た（図 3)。次に、この断片を EcoR I で処理、精製し、インサートとして、同様に EcoR Iで処理、精製した pCI-neoベクター に挿入し、 PCト 4C/P (-)を得た。
[0056] 2 MiniSeV/GFP/M/F/HN(SeV/GFP/ Δ NP/ Δ Ρ/ Δ L 記するこ もできる)の再構 鎏
2.1 準備
1)細胞：前日〜 8e5 BHK-21 cells/well (6-ゥエルプレート）
2) 20%FBS/opti-MEM [Cat No. 31985—070, Lot No. 1183337, Invitrogen社] (P&S 無添加）
3) opti-MEM (原液）
[0057] 2.2 トランスフエクヨン溶液準備
1) DNA溶液（1ゥエルあたり）
opti-MEM (無添加原液） 300 μ 1 pCAGGS-NP (Z) , 1 μ g/ μ \ 0.5 μ \
pCAGGS-P (Z)/4C (-) , 1 μ §/ μ ΐ 0.5 μ \
pCAGGS-L (TDK), 1 μ g/ μ \ 2.0 μ \
pCAGGS- Τ7, 1 ^ g/ μ \ 1.0 μ \
pMiniSeV/GFP/M/F/HN cDNA, 1 g/ 1 5 μ \
2) LipofectAMlNE 2000 reagent [Cat No. 11668-019, Lot No. 1188609, Invitrogen 社]溶液（1ゥエルあたり）
opti-MEM (無添加原液） 300 μ 1
LipofectAMINE2000 18 μ \
3) 2)の LipofectAMlNE 2000 reagent溶液を準備した 5分後、 1)の DNA溶液と混合し、 室温で 20-30分置いた。
[0058] 2.3 opti-MEM (原液)で 1回洗浄、 0.6 ml/wellの 20%FBS/opti- MEMを添カ卩した後、 0.5 ml/wellの上記トランスフエクヨン溶液を細胞へ添カ卩した。
[0059] 2.4 37°Cで 6時間培養した後、 1.2 ml/well 10%FBS/G- MEMを添カ卩した。翌日、 VP- S FMで 1回洗浄した後、 2.5 μ g/ml Trypsin/VP- SFMをカ卩えて培養した。以後毎日培 地交換を行った。また、 4-6日の上清 (P0ウィルス溶液)を回収し、生産細胞 (P0力も P 1へウィルス継代）へ感染させ、ウィルスの生産を行った。生産細胞は 1日前に pCAG GS-NP (Z), pCAGGS- P (Z)/4C (-) , pCAGGS- L (TDK), pCト 4C/P (-)を導入した BH K-21細胞を用いた。
[0060] 3 DMiniSeV /GFPと pMiniSeV /ルシフヱラーゼの構築
SP SP
GFP遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子の上流に、プロモーターを 1つ付加した pM iniSeV /GFPおよび pMiniSeV /ルシフェラーゼを構築した。
SP SP
SP： Single— promoterの cDNA配列：
5 -accaaacaagagaaaaaacatgtatgggatatgtaatgaagttatacaggattttagggtcaaagtatccaccctga ggagcaggttccagaccct , (96 nt) (酉己列番号： 20)
図 6- Aに示したように、市販の GFPプラスミドをテンプレートとして、 Primer Not I- GF P- N (5 - agttcacgcggccgcagatcttcacgatggtgagcaagggcgaggagctg, oO mer (酉己列番号： 10) )と GFP— Sac II— C (5，— caggtaccgcggagcttcgatcgttctgcacgatagggactaattacttgtacag ctcgtccatg, 65 mer (配列番号： 11) )を用いた PCRで Not I- GFP- Sac II断片を得た。 次にこの断片を Not Iと Sac IIで処理、精製した後、同様に Not Iと Sac IIで処理し、 SeV の NP,P,L,M,F,HN配列を含む断片を除いた pSeV(TDK)ベクターに GFPインサートとし て挿入し、 pMiniSeV /GFP (配列番号： 12)を得た。
SP
[0061] 一方、図 6- Bに示したように、プライマー Not I-ルシフェラーゼ- N (5， - atccatcgcggc cgcagatcttcacgatggaagacgccaaaaacataaag, 50mer (目 3列 ¾·号： 13) )とノレシフエフ ~~セ- ¾ac II- C (o - acttactccgcggttcgatcgttctgcacgatagggactaattacacggcgatctttccgcccttc, 66mer (配列番号： 14) )を用いた PCRでルシフェラーゼの両側に Not Iと Sac II制限酵 素サイトを付力卩し、 pMiniSeV /GFPの Not I- GFP- Sac II配列と入れ替えることで pMini
SP
SeV /ルシフェラーゼ（配列番号： 15)を得た。
SP
[0062] 4 DMiniSeV /GFPi^MiniSeV /ルシフ ラーゼの構築
DP DP
GFP遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子の上流に、プロモーターを 2つ付加した pM iniSeV /GFPおよび pMiniSeV /ルシフェラーゼを構築した。
DP DP
DP： Double— promoterの cDNA配列：
accaaacaagagaaaaaacatgtatgggatatgtaatgaagttatacaggattttagtgtcaaagtaTccaccctgagg agcaggttccagaccct I aaaaaacatgtatgggatatgtaatgaagttatacaggattttagggtcaaagtatccacc ctgaggagcaggttccagaccct, (GP58A (96 nt) + GPdl2 (84 nt)) (配列番号： 21)
図 7-Aに示したように、 pMiniSeV /GFPをテンプレートとして、それぞれプライマー
SP
224N (5 ' - ataccgcatcaggcgccattcg, 22 mer (配列番号： 16) )と (GP58A- GPdl2)R (5， - gttttttagggtctggaacctgctcctcagggtggatactttgacactaaaatcctg, o mer (酉己列番号： 1 1 ))を用いた PCRで得られた断片、およびプライマー（GP58A- GPdl2)F (5，- ggttccaga ccctaaaaaacatgtatgggatatg, 34 mer (配列番号： 18) )と GFP- Sac II- C (配列番号： 11 )を用いた PCRで得られた断片を精製した。これらの断片をテンプレートとして、さらに プライマー 224Nと GFP- Sac II- Cを用いた PCRにより断片を得た。この断片を Kas Iと Sac IIで処理、精製した後、同様に Kas Iと Sac IIで処理してシングルプロモーター (Sin gle-promoter)を含む配列を除 、た pMiniSeV /GFPベクターにインサートとして挿入
SP
し、 pMiniSeV /GFP (配列番号： 19)が得られた。
DP
[0063] 図 7-Bに示したように、プライマー Not I-ルシフェラーゼ- Nとルシフェラーゼ -Sac II- Cを用いた PCRでルシフェラーゼの両側に Not Iと Sac II制限酵素サイトを付け、 pMini SeV /GFPの Not I- GFP- Sac II配列と入れ替えることで pMiniSeV /ルシフェラーゼ
DP DP
が得られた。
[0064] 5 MiniSeVベクター _(MiniSeV /_GFPュ MiniSeV /ルシフェラーゼ L MiniSeV /GFP. .
SP SP DP
MiniSeV /ルシフェラーゼ）の再構築及び生産
DP
5.1 準備
1)細胞：前日〜 8e5 BHK-21 cells/well (6-ゥエルプレート）
2) 20%FBS/opti-MEM [Cat No. 31985—070, Lot No. 1183337, Invitrogen社] (P&S 無添加）
3) opti-MEM (原液）
[0065] 5.2 トランスフエクヨン溶液準備
1) DNA溶液（1ゥエルあたり）
opti-MEM (無添加原液） 300 μ 1
pCAGGS-NP (Z) , 1 μ g/ μ \ 0.5 μ \
pCAGGS-P (Z)/4C (-) , 1 μ §/ μ ΐ 0.5 μ \
pCAGGS-L (TDK), 1 μ g/ μ \ 2.0 μ \
pCAGGS-M (Ζ), 1 g/ 1 1.0 μ \
pCAGGS— F5R, 1 ^ g/ ^ 1 1.0 μ \
pCAGGS-HN(Z), 1 g/ 1 1.0 μ \
pCAGGS- T7, 1 ^ g/ μ \ 1.0 μ \
MiniSeVベクター cDNA, 1 μ g/ μ \ 5 μ \
2) LipofectAMlNE 2000 reagent [Cat No. 11668-019, Lot No. 1188609, Invitrogen 社]溶液（1ゥエルあたり）
opti-MEM (無添加原液） 300 μ 1
LipofectAMINE2000 21 μ \
3) 2)の LipofectAMlNE 2000 reagent溶液を準備した 5分後、 1)の DNA溶液と混合し、 室温で 20-30分置いた。
[0066] 5.3 opti-MEM (原液)で 1回洗浄、 0.6 ml/wellの 20%FBS/opti- MEMを添カ卩した後、 0.5 ml/wellの上記トランスフエクヨン溶液を細胞へ添カ卩した。
[0067] 5.4 上記細胞を 37°Cで 6時間培養した後、 1.2 ml/well 10%FBS/G- MEMを添カ卩した。
翌日、 VP- SFMで 1回洗浄した後、 2.5 μ g/ml Trypsin/VP- SFMをカ卩えて培養した。 以後毎日培地交換を行った。また、 3-6日の上清 (P0ウィルス溶液)を回収し、生産細 胞（P0から P1へウィルス継代）へ感染させ、ウィルスの生産を行った。生産細胞はウイ ルス感染の 1日前に pCAGGS- NP (Z), pCAGGS- P (Z)/4C (-) , pCAGGS- L (TDK), p CI- 4C/P (-) , pCAGGS-M(Z), pCAGGS- F5R, pCAGGS- HN(Z)を導入した BHK- 21細 胞を用いた。
[0068] 〔実施例 1〕 MiniSeV/GFP/M/F/HNの生産性における SeVの C蛋白質の影響
前日 2e5 cells/well (12- well collagen-coated plate, IWAKI)で播いた BHK- 21細胞 に Lipofectamine 2000試薬を用いて、 pCAGGS- NP (Z), pCAGGS- P (Z)/4C (-) , pCA GGS-L (TDK)と pCI control或いは pCI- 4C/P (-)を導入した。翌日 MiniSeV/GFP/M/ F/HNを種ウィルスとして感染させた後、 Trypsin (最終濃度 2.5 g/ml)を含む VP-SF M培地を用いてウィルスの生産を行った。感染後 4日目に生産細胞の GFP蛍光写真 を撮影した。また、この 4日目の培養上清を回収して、新鮮な LLC-MK2細胞 (24-well plate)へ感染させ、 3日目の GFP蛍光写真を撮影した。
C蛋白質発現プラスミド [pCHC/P (-)]を導入した条件では C蛋白質を発現しないコ ントロールプラスミド [pCI-neo]を導入した条件より高 、ウィルス生産性が得られた（図 3)。また、高い生産性を得るには適量の C蛋白質を発現させる必要があることが明ら カゝになった。
[0069] 〔実施例 2〕 MiniSeV/GFP/M/F/HNの生産
前日 8e5 cells/well (6- well collagen-coated plate, IWAKI)で播いた BHK- 21細胞へ Lipofectamine 2000試薬を用いて、 pCAGGS— NP (Z), P (Z)/4C(— ), L (TDK)と pCI— 4C /P (-)を導入した。翌日 MiniSeV/GFP/M/F/HNを種ウィルスとして感染させた後、 Try psin (最終濃度 2.5 g/ml)入りの VP- SFM培地を用いてウィルスの生産を行った。感 染後 1〜7日、毎日 GFP蛍光写真を撮影、培養上清を回収、培地交換を行った。 1〜7 日回収した培養上清を CIU Assayを行った。
図 4に示したように、 3-6日の培養上清から le7 GFP-CIU/ml以上の非常に高いタイ ターの MiniSeV/GFP/M/F/HNが回収された。
[0070] 〔実施例 3〕 MiniSeV/GFP/M/F/HNによる in vitro発現
当日 3e5 cells/well (12- well collagen-coated plate, IWAKI)で播いた HeLa細胞へ M iniSeV/GFP/M/F/HNを MOI=100, 10, 1で感染させた。また、 MiniSeV/GFP/M/F/H Nを ΜΟΙ=1と SeVagp55/dFを MOI=5で共感染させた。感染後 1日目、 2日目の GFP写 真を撮影した。
図 5に示したように、 MiniSeV/GFP/M/F/HN単独 ΜΟΙ=1で感染した場合弱い GFP 発現しか見られなかった力 MOI=100で感染した場合、 Helper- SeV (SeVagp55/ Δ F) 共感染 (複製型 SeVに相当）に近いレベルの GFP発現が確認された。
[0071] 〔実施例 4〕 MiniSeVベクターの発現量に対するゲノムプロモーターの影響
前日 2e5 cells/well (12- well collagen-coated plate, IWAKI)で播いた LLC- MK細胞
2 へ MiniSeV /ルシフェラーゼと MiniSeV /ルシフェラーゼを単独感染（n=3)または Hel
SP DP
per-SeV (MOI10)とそれぞれ共感染 (n=3)させた。感染後 2日目、単独感染させた well 力も細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性を測定した。 Helper-SeVと共感染させた Well を抗ルシフェラーゼ抗体を用いて免疫染色し、各 wellのルシフェラーゼ陽性細胞数を 計測した。ルシフヱラーゼ活性の平均値でルシフヱラーゼ陽性細胞数の平均値を割 ると、細胞あたりのルシフェラーゼ活性を算出することができる。図 8に示したように、 シングルプロモーター (Single- promoter)を有する MiniSeV /ルシフェラーゼベクター
SP
の方が、ダブルプロモーター (Double- promoter)を有する MiniSeV /ルシフェラーゼと
DP
比べて、細胞あたりの蛋白発現量 (ルシフェラーゼ活性）が約 1.5倍高いことが分かつ た。
[0072] 〔実施例 5〕 MiniSeV /GFPによる GFP発現
SP
前日 2e5 cells/well (12- well collagen-coated plate, IWAKI)で播いた LLC- MK細胞
2 へ MiniSeV /GFPを単独感染または Helper- SeV (MOI10)と共感染させ、 2日目に GF
SP
P蛍光を観察し、写真撮影を行った。図 9に示したように、 MiniSeVベクター単独感染 の方が Helper-SeVと共感染した場合と比べて GFP発現が弱 ヽものの、単独感染でも 明確な GFP発現細胞が観察された。
産業上の利用可能性 本発明者らが開発した非複製 SeVベクターは高 、導入効率と低!、免疫原性を有し ているため、抗体作製、蛋白機能解析、遺伝子治療、遺伝子ワクチンなど幅広い分 野への応用が期待される。

Claims

請求の範囲
[1] 下記 (a)および (b)からなる複合体を含む、ベクター。
(a)パラミクソウィルス科ウィルス ( )鎖一本鎖 RNAに結合するタンパク質である NPタ ンパク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質力も選択される、少なくとも Lタンパク質を 含む 1または複数のタンパク質を発現しな 、ように改変された、ノ ラミクソウィルス科ゥ ィルスに由来する（ )鎖一本鎖 RNA
(b) NPタンパク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質
[2] 下記 (a)および (b)からなる複合体を含む、ベクター。
(a)パラミクソウィルス科ウィルス ( )鎖一本鎖 RNAに結合するタンパク質である NPタ ンパク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質カゝら選択される、複数のタンパク質を発現 しないように改変された、ノ ミクソウィルス科ウィルスに由来する（-)鎖一本鎖 RNA
(b) NPタンパク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質
[3] パラミクソウィルス科ウィルスに由来する（-)鎖一本鎖 RNA力 NPタンパク質、 Pタン パク質、および Lタンパク質を発現しないように改変されている、請求項 1または 2に記 載のベクター。
[4] パラミクソウィルス科ウィルスに由来する（一）鎖一本鎖 RNA力 パラミクソウィルス科ゥ ィルスのエンベロープタンパク質の少なくとも一つを発現する、請求項 1から 3のいず れかに記載のベクター。
[5] パラミクソウィルス科ウィルスに由来する（一)鎖一本鎖 RNA力 Mタンパク質、 Fタンパ ク質、 HNタンパク質を発現し、 NPタンパク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質を発現 しな 、ように改変されて 、る、請求項 4に記載のベクター。
[6] (一）鎖一本鎖 RNAがセンダイウィルスに由来する、請求項 1から 5のいずれかに記載 のベクター。
[7] (一）鎖一本鎖 RNAがさらに外来遺伝子を搭載している、請求項 1から 6のいずれか に記載のベクター。
[8] 請求項 1から 7のいずれかに記載のベクターに含まれる（一）鎖一本鎖 RNAまたはそ の相補鎖をコードする DNA。
[9] 下記 (a)および (b)の工程を含む、請求項 1に記載のベクターの製造方法。 (a)パラミクソウィルス科ウィルス ( )鎖一本鎖 RNAに結合するタンパク質である NPタ ンパク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質力も選択される、少なくとも Lタンパク質を 含む 1または複数のタンパク質を発現しな 、ように改変された、ノ ラミクソウィルス科ゥ ィルスに由来する（一）鎖一本鎖 RNAまたはその相補鎖をコードする DNAを、 NPタン パク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質を発現可能な細胞に導入する工程
(b)該細胞を培養し、その培養上清カゝらウィルス粒子を回収する工程
[10] 下記 (a)および (b)の工程を含む、請求項 2に記載のベクターの製造方法。
(a) NPタンパク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質力も選択される、複数のタンパク 質を発現しな ヽように改変された、パラミクソウィルス科ウィルスに由来する（―）鎖一 本鎖 RNAまたはその相補鎖をコードする DNAを、 NPタンパク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質を発現可能な細胞に導入する工程
(b)該細胞を培養し、その培養上清カゝらウィルス粒子を回収する工程
[11] NPタンパク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質を発現可能な細胞力 さらにウィルス 粒子形成と放出を促進する機能を有するタンパク質を発現可能である、請求項 9また は 10に記載の製造方法。
[12] ウィルス粒子形成と放出を促進する機能を有するタンパク質が、 Cタンパク質である、 請求項 11に記載の方法。
[13] 下記 (a)および (b)の工程を含む、請求項 1に記載のベクターの製造方法。
(a)パラミクソウィルス科ウィルス ( )鎖一本鎖 RNAに結合するタンパク質である NPタ ンパク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質力も選択される、少なくとも Lタンパク質を 含む 1または複数のタンパク質を発現しな 、ように改変された、ノ ラミクソウィルス科ゥ ィルスに由来する（一）鎖一本鎖 RNAまたはその相補鎖をコードする DNAが挿入され たベクター、 NPタンパク質発現ベクター、 Pタンパク質発現ベクター、および Lタンパク 質発現ベクターを発現可能な細胞に導入する工程
(b)該細胞を培養し、その培養上清カゝらウィルス粒子を回収する工程
[14] 下記 (a)および (b)の工程を含む、請求項 2に記載のベクターの製造方法。
(a) NPタンパク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質力も選択される、複数のタンパク 質を発現しな ヽように改変された、パラミクソウィルス科ウィルスに由来する（―）鎖一 本鎖 RNAまたはその相補鎖をコードする DNAが挿入されたベクター、 NPタンパク質 発現ベクター、 Pタンパク質発現ベクター、および Lタンパク質発現ベクターを細胞に 導入する工程
(b)該細胞を培養し、その培養上清カゝらウィルス粒子を回収する工程
[15] 下記 (a)および (b)の工程を含む、請求項 1に記載のベクターの製造方法。
(a)パラミクソウィルス科ウィルス ( )鎖一本鎖 RNAに結合するタンパク質である NPタ ンパク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質力も選択される、少なくとも Lタンパク質を 含む 1または複数のタンパク質を発現しないように改変されたパラミクソウィルスに由 来する（-)鎖一本鎖 RNA、および該（-)鎖一本鎖 RNAと結合するタンパク質、から なる複合体を、 NPタンパク質、 Pタンパク質、 Lタンパク質、およびエンベロープタンパ ク質を発現する細胞に導入する工程、および
(b)該細胞を培養し、その培養上清カゝらウィルス粒子を回収する工程、を含む方法。
[16] 下記 (a)および (b)の工程を含む、請求項 2に記載のベクターの製造方法。
(a)パラミクソウィルス科ウィルス ( )鎖一本鎖 RNAに結合するタンパク質である NPタ ンパク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質カゝら選択される、複数のタンパク質を発現 しないように改変されたパラミクソウィルスに由来する（-)鎖一本鎖 RNA、および該（ -)鎖一本鎖 RNAと結合するタンパク質、力もなる複合体を、 NPタンパク質、 Pタンパ ク質、 Lタンパク質、およびエンベロープタンパク質を発現する細胞に導入する工程、 および
(b)該細胞を培養し、その培養上清カゝらウィルス粒子を回収する工程、を含む方法。
[17] 下記 (a)および (b)の工程を含む、標的細胞に外来遺伝子を発現させるためのベタ ターを製造する方法。
(a) NPタンパク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質力も選択される、少なくとも Lタン ノ ク質を含む 1または複数のタンパク質を発現しな 、ように改変され、かつ外来遺伝 子を搭載した、ノ ミクソウィルス科ウィルスに由来する（-)鎖一本鎖 RNAまたはそ の相補鎖をコードする DNAを、 NPタンパク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質を発 現可能な細胞に導入する工程
(b)該細胞を培養し、その培養上清カゝらウィルス粒子を回収する工程
[18] 下記 (a)および (b)の工程を含む、標的細胞に外来遺伝子を発現させるためのベタ ターを製造する方法。
(a) NPタンパク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質力も選択される、複数のタンパク 質を発現しないように改変され、かつ外来遺伝子を搭載した、ノ ラミクソウィルス科ゥ ィルスに由来する（一）鎖一本鎖 RNAまたはその相補鎖をコードする DNAを、 NPタン パク質、 Pタンパク質、および Lタンパク質を発現可能な細胞に導入する工程
(b)該細胞を培養し、その培養上清カゝらウィルス粒子を回収する工程
[19] 下記 (a)および (b)の工程を含む、外来遺伝子を標的細胞にお!、て発現させる方法
(a)請求項 7記載のベクターを製造する工程
(b)請求項 7記載のベクターを標的細胞に導入する工程
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