WO2007148819A1

WO2007148819A1 - 植物形質転換用コスミドベクター及びその利用法

Info

Publication number: WO2007148819A1
Application number: PCT/JP2007/062720
Authority: WO
Inventors: Yoshimitsu Takakura; Toshihiko Komari; Yuji Ishida; Toshiyuki Komori; Yukoh Hiei; Toshiki Mine; Teruyuki Imayama
Original assignee: Japan Tobacco Inc.
Priority date: 2006-06-23
Filing date: 2007-06-25
Publication date: 2007-12-27
Also published as: AU2007261964A1; AU2007261964B2; CA2658926C; EP2042602A1; CA2658926A1; EP2042602A4; US20100132068A1; US20130091599A1; CN101484580B; WO2007148819A9; CN101484580A; EP2042602B1; WO2008001414A1; US8298819B2

Abstract

　本発明は、植物形質転換用の新規ベクターを提供することを目的とする。　本発明のベクターは、下記の特徴を有する全長１５ｋｂ以内のコスミドベクター。　１）ＩｎｃＰプラスミドの複製開始点を含み、他種のプラスミドの複製開始点を含まない；　２）ＩｎｃＰプラスミドのｔｒｆＡ１遺伝子を含む；　３）ＩｎｃＰプラスミドのｏｒｉＴを含む；　４）ＩｎｃＰプラスミドのｉｎｃＣ１遺伝子を含む；　５）ラムダファージのｃｏｓ部位を含み、かつ該ｃｏｓ部位はＴ－ＤＮＡの外側に位置する；　６）大腸菌ならびにアグロバクテリウム属細菌において発現する薬剤耐性遺伝子を含む；　７）アグロバクテリウム属細菌のＴ－ＤＮＡの右ボーダー配列を含む；　８）アグロバクテリウム属細菌のＴ－ＤＮＡの左ボーダー配列を含む；　９）７）と８）の間に配置される、植物において発現する、植物形質転換用選抜マーカー遺伝子を含む；そして１０）７）と８）の間に配置される、外来遺伝子をクローニングするための制限酵素認識部位を含む。

Description

明細書

植物形質転換用コスミドベクター及びその利用法

技術分野

[0001] 本発明は、植物形質転換用の新規コスミドベクター、並びにその利用法に関するものである。

背景技術

[0002] 従来より植物の形質転換を目的とした様々なベクターの開発が行われてきた。

[0003] 近年、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana)やイネ（Oryza sativa)の全ゲノム配列が解明され、植物ゲノムの研究の焦点は、塩基配列情報の蓄積力遺伝子機能の解明に移行してきた。遺伝子機能の解明においては、クローンィ匕された DNAを植物に導入し、その表現型の変化を解析する実験が必須である。その際、大きなサィズの DNAを導入することができれば、研究の効率が飛躍的に向上する。

[0004] そのため、大断片の DNAを植物へ導入することを目指した多くのベクターが開発された。代表的なものとして、 pOCAl 8 (Olszewski et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16 ： 10765- 10782)や、 pLZ〇3 (Lazo et al., 1991， Bio/Technology 9: 963- 967)のような、植物形質転換用のコスミドベクターが作成された。コスミドを使う利点は、 λ (ラムダ）ファージ由来のパッケージング反応を利用できる点にあり、これにより比較的大きなゲノム断片を容易にクローニングすることが可能である（Sambrook J. and Russell D.W. 2001. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, ^rd edn . Cold Spring Haroor Labor atory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA.)。コス^ドべクタ一とノノケーンング反応を利用するクローニングでは、ベクターと揷入断片の合計力 S40kb〜50kbとなるため、ベクターの大きさにより、揷入断片の大きさは一定の範囲内に制限され、かつ、ベクターと挿入断片の大きさは逆相関の関係にある。

[0005] pOCA18や pLZ03は、大腸菌およびァグロバタテリゥムの双方で機能する IncPプラスミドの複製開始点（oriV)を有する代表的なベクター pRK290 (Ditta et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7347- 7351)に、 T— DNAのボーダー配列や選抜マ一力一（カナマイシン耐性遺伝子）等の植物形質転換用の因子を組み込んだベクタ一である。これらのベクターは、ベクター自体のサイズが 24. 3〜30. lkbであるため、パッケージング反応を利用してクローン化できる DNAのサイズも平均で 20kb程度 (p〇CA18)、あるいは 13〜22kb (pLZ03)程度であった。これらのベクターは、 Inc Pプラスミドの複製開始点（oriV)を持つが、 pCIT103、 pCIT104などのベクター（M a et al. 1992 Gene 117: 161-167)は、 IncPプラスミドの複製開始点（oriV)に加えて、 ColEl由来の複製開始点を保有しているベクターである。また、 pC22 (Simoens et al. 1986 Nucleic Acids Res 14: 8073-8090)は、 ColEl由来の複製開始点と Riプラスミド由来の複製開始点を有するベクターである。これらの他に植物形質転換可能なコスミドベクターとして、 pMON565 (Klee et al. 1987 Mol Gen Genet 210: 282-287)、や PCLD04541 (Bent et al. 1994 Science 265: 1856- 1860)があるが、ベクター自身のサイズがそれぞれ、 24kb、 29kbであり、 25kb以上の DNA断片のクローニングには適していない。さらに、 pE4cos (16kb、 Klee et al. 1987 Mol Gen Genet 210: 282- 287)や、 pMON565、 pLZ03、 p〇CA18、 pCLD04541、 pC22などは、 cos部位が T DNA中にある構造であった。

その後、 150kb程度までの DNA断片をクローニングし、植物へ導入できるベクターとして、 BIBACヘクター (binary bacterial artificial chromosome^ Hamilton 米国特許第 5733744号、 Hamilton et al., 1996， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:99 75-9979、 Hamilton, 1997， Gene 200: 107-116)が開発された。これは、巨大な DNA 断片を保持できる BACベクターに、 T DNAのボーダー配列や選抜マーカー等の植物形質転換用の因子と、ァグロバタテリゥム用複製開始点を組み込んだものである。また、 80kb程度までの DNAをクローニングし、植物へ導入できるベクターとして、 T ACへクタ" ~ (transformation― competent bacterial artificial cnromoso me)、 pYLTAC7 (Liu et al. , 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 6535-6540.)が開発された。これは、 PIファージの複製機構を利用した大容量の PACベクター（PI — derived artificial chromosome)に、 T_ DNAのボーダー配歹 (Jや選抜マーカ一等の植物形質転換用の因子と、ァグロバタテリゥム用複製開始点を組み込んだものである。これらのベクターには、巨大外来遺伝子を安定して保持することを目的として、大腸菌ゃァグロバタテリゥムにおいて、細胞当たり単一コピーで存在するプラスミドに由来する複製開始点（ori)が組み込まれている。すなわち、大腸菌用 oriとして、 F因子の ori (BIBAC)や P1ファージの ori (TAC)力ァグロバタテリゥム用の oriとして、 Agrobacterium rhizogenesの Ri ori (BIBAC、 TACともに）が使用されている。ただし、単一コピープラスミドの複製開始点の利用は、必ずしも必須ではなぐ糸田胞あたり数コピーといわれる IncPプラスミドの複製開始点（oriV)を有するベクター pS LJ1711や、 pCLD04541力 lOOkbを越えるサイズの植物ゲノム DNA断片を、安定して保持できることが報告されている（Tao and Zhang(1998)Nucleic Acids Res 26: 4901-4909) また、これらの他に、汎用バイナリープラスミドベクター pBIl 21に、 Ri oriを導入した pBIGRZが報告されてレ、る（特開平 10— 155485)。

[0007] し力、し、このようなベクターは、 50kbをはるかに超える大きな DNA断片をクローニングすることはできるものの、そのクローニング操作は煩雑である。大きな DNAをクローユングするためには、熟練した技術と、相当の時間と労力が必要である。 BIBACを利用した形質転換には、 virGなどを過剰発現した特別なァグロバタテリゥムが必要である上、 150kbの断片の形質転換効率 (選抜カルス数/接種葉切片)も、通常の小型のベクターを利用した場合とくらべ著しく低い（Hamiltin et al.， 1996, Proc Natl Aca d Sci USA 93: 9975-9979, Shibata and Liu, 2000, Trend Plant Sci 5: 354-357)。そのため、 BIBACや TACによる大断片の植物形質転換は、ある特定の少数の大断片の例にとどまつている（例えば、 Hamiltin et al" 1996， Proc Natl Acad Sci USA 93: 99 75-9979, Liu et al., 1999, Proc Natl Acad Sci USA 96: 6535-6540, Lin et al., 20 03， Proc Natl Acad Sci USA 100: 5962-5967, Nakano et al., 2005, Mol Gen Geno mics 273: 123-129)。

[0008] なお、上述のように pCLD04541はコスミドでもあり、その大きさが 29kbであるので、 λファージ由来のパッケージング反応を利用する場合は、クローン化できる DNA 断片の大きさは、 10〜20kbである。上述のように、これ以上に大きな DNA断片をクローニングするには、パッケージング反応は利用できないため、クローニング操作は煩雑であり、相当の時間と労力を要するのである。

[0009] 近年、高等植物のゲノム研究の進展とともに、 DNA配列の多型に基づく遺伝学的マーカー、いわゆる DNAマーカーの利用が進んでいる。表現型のみが知られている高等植物の未知の遺伝子を、 DNAマーカー利用の遺伝地図情報に基づき、クローン化する、いわゆる、マップベースクローユングが盛んに試みられるようになつてきた。一般に、マップベースクローユングの基本フローは以下のとおりである。

[0010] 1.比較的小規模な分離集団を用い、汎用性の高い DNAマーカーを用いて、大まかなマッピングを行い、染色体上の候補領域を探索する。

[0011] 2.大規模な分離集団を用い、候補領域内に、新たに設計した DNAマーカーを用いて、遺伝子領域を絞り込む。

[0012] 3.遺伝子領域の塩基配列を決定し、候補遺伝子を推定する。

[0013] 4.候補遺伝子を含む DNA断片を植物に導入し、表現型に基づき、遺伝子の効果 •機能を確認する。

[0014] これまでの多くの成功例では、 3.の工程において、：!〜 3個程度に遺伝子にまで絞込み、 4.の工程では、数 kb以内の DNA断片を数個導入している場合が多レ、。しかしながら、狭い遺伝子領域にまで絞り込むことは、必ずしも容易ではない。たとえば、動原体に近い染色体領域では、交配後の遺伝子組み換え頻度が低いため、 150kb 以下には絞り込めない場合が多い。また、絞込みが可能な場合でも、 2.の工程を繰り返し実施しなければならない場合も多ぐ多大な時間を要する。また、 50kb程度にまで絞り込むことができた場合でも、 3.の工程において、表現型に関する情報と、遺伝子配列の情報とを、関連付ける有力な情報がない場合には、候補遺伝子の推定は極めて困難である。

[0015] このように、マップベースクローニングでは、ある程度の絞込み（50kb〜数百 kb)を行レ、、候補領域として、 1個ないし数個の、 BACベクターによってクローン化された D NA断片を特定するところまでは比較的容易であるが、さらに解析を進めて、実際に遺伝子を同定することは、技術的に困難な場合も多ぐ可能な場合にも多大な労力と時間を要することが多い。

特許文献 1：米国特許第 5733744号

特許文献 2：特開平 10— 155485

特許文献 3 :W〇2005Z040374

非特許文献 1： Olszewski et al, 1988, Nucleic Acids Res. 16: 10765-10782 非特許文献 2:Lazo et al., 1991, Bio/Technology 9: 963-967

非特許文献 3:Ditta et al., 1980， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7347-7351 非特許文献 4: Ma et al. 1992 Gene 117: 161-167

非特許文献 5 : Simoens et al. 1986 Nucleic Acids Res 14: 8073-8090

非特許文献 6:Klee et al. 1987 Mol Gen Genet 210: 282-287

非特許文献 7: Bent et al. 1994 Science 265: 1856-1860

非特許文献 8 : Hamilton et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9975-9979、非特許文献 9 : Hamilton, 1997， Gene 200:107-116

非特許文献 10: Liu et al., 1999， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 6535-6540 非特許文献 11 :Tao and Zhang, 1998, Nucleic Acids Res 26: 4901-4909 非特許文献 12:Shibata and Liu, 2000, Trend Plant Sci 5: 354-357

非特許文献 13: Lin et al., 2003, Proc Natl Acad Sci USA 100: 5962-5967，非特許文献 14:Nakano et al" 2005， Mol Gen Genomics 273: 123-129 非特許文献 15:Pansegrau et al.(1994) J Mol Biol 239: 623-663

非特許文献 16:Knauf and Nester 1982 Plasmid 8: 45-54

非特許文献 17:Komari et al. 1996 Plant J 10:165-174

非特許文献 18:Zambryski et al. 1980 Science 209: 1385-1391

非特許文献 19:Schmidhauser and Helinski, J. Bacteriol. 164:446-455, 1985 非特許文献 20:Winans et al. 1986 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8278-8282 非特許文献 21:Pazour et al. 1992 J.Bac 174:4169-4174

非特許文献 22: Ward et al. (1988) J Biol Chem 263: 5804-5814

非特許文献 23 : Frame et al.2002 Plant Physiol 129: 13-22

非特許文献 24: Hansen et al. 1994 ProNAS 91:7603-7607

非特許文献 25:Ishida et al. 1996 Nat Biotechnol 14:745 - 50

非特許文献 26: Close et al. 1984 Plasmid 12: 111-118

非特許文献 27: Jin et al. 1987 J Bacteriol 169: 4417-4425

非特許文献 28: Wang et al.2000 Gene 242: 105-114

非特許文献 29 : Okumura and Kado (1992) Mol Gen Genet 235: 55-63 非特許文献 30 : Christensen et al. 1992 Plant Mol Biol 18: 675-689 非特許文献 31 : Bilang et al. (1991) Gene 100: 247-250

非特許文献 32 : Hirsch and Beringer 1984 Plasmid 12: 139-141

非特許文献 33 : Konieczny and Ausubel 1993 Plant Journal 4: 403-410

非特許文献 34 : Hiei et al. (1994) Plant J 6: 271-282

非特許文献 35 : Ishida et al. (2003) Plant Biotechnology 20:57-66

非特許文献 36 : Hiei and Komari (2006) Plant Cell, Tissue and Organ Culture 85: 27

1-283

非特許文献 37 : Komori et al. (2004) Plant J 37: 315-325

非特許文献 38 : Kazama and Toriyama (2003) FEBS lett 544: 99-102

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0016] WO2005Z040374 (本明細書中にその全内容が援用される）は、ヘテロシスにおいて発現が認められる形質や量的形質を向上させることのできる、多数のゲノム D NA断片を効率良く選抜し、クローン化された DNA断片として選抜し、調製する方法を開示している。本発明者らは、 WO2005Z040374に記載の方法を用いて、農業上有益な変異をもたらすことのできる、サイズの大きレ、ゲノム DNA断片の選抜を行つていた。しかし、大腸菌に保持されているクローンをァグロバタテリゥムに移す操作については、 80%程度の成功率であった。さらに、クローンを保持したァグロバクテリウムを用いた植物を形質転換した結果、形質転換植物を得ることができたァグロバクテリウム菌株は 60%程度であった。この結果を検討し、本発明者らは、使用するべクタ一を変更することにより、 WO2005/040374の方法の効率が大きく改善されるカ検討した。しかし、現在までに知られているベクターではこの方法の効率を改善することはできなかった。

[0017] 従って、本発明の課題は、例えば WO2005/040374に記載されている方法において、比較的大きなゲノム DNA断片を選抜し、クローニングする効率を改善する、新規なベクターを提供することである。

[0018] また、本発明の課題は、好ましくは • 25〜40kb程度の大きさの DNA断片を、効率よくクローン化できる； •大腸菌、および、ァグロバタテリゥム細胞中で、安定的に保持される； .ァグロバタテリゥムに、効率よく導入することができる；

'大腸菌、及び、ァグロバタテリゥムにおける細胞当りのコピー数力 4〜5となる； 'クローン化した目的の DNA断片のみを植物、好ましくは単子葉植物、に効率よく導人すること力 Sできる。

のすベての条件を満たすベクターを提供することである。

[0019] さらに、本発明は、このようなベクターを用いて、極めて高い効率で植物に遺伝子導入を行うための遺伝子導入法を提供する。

[0020] また、本発明は、このようなベクターを用いて、マップベースクローニングを容易にかつ短時間で完了するための遺伝子領域の絞り込みを、迅速に行う手法を提供することである。

[0021] さらに、本発明は、上記ベクターと共存させることにより、形質転換効率を更に向上させることができるプラスミドを提供する。

課題を解決するための手段

[0022] コスミドベクター

本発明のコスミドベクターは、以下の条件をすベて満たす全長 15kb以内のベクタ一（以下「pLCベクター」という。）である。

[0023] 1) IncPプラスミドの複製開始点（oriV)を含み、他種のプラスミドの複製開始点を含まない；

2) IncPプラスミドの trfAl遺伝子を含む；

3) IncPフフストの origin of conjugative transfer (oriT)を含む；

4) IncPプラスミドの incCl遺伝子を含む；

5)ラムダファージの cos部位を含み、かつ該 cos部位は T—DNAの外側に位置する；

6)大腸菌ならびにァグロバクテリゥム属細菌において発現する薬剤耐性遺伝子を含む；

7)ァグロバタテリゥム属細菌の T DNAの右ボーダー配列を含む； 8)ァグロバタテリゥム属細菌の T DNAの左ボーダー配列を含む；そして

9) 7)と 8)の間に配置される、植物において発現する、植物形質転換用選抜マーカ一遺伝子を含む。；そして

10) 7)と 8)の間に配置される、外来遺伝子をクローニングするための制限酵素認識部位を含む。

[0024] 本発明のベクターは、ラムダファージの cos部位を含むコスミドベクターである。そのため、パッケージング反応により、比較的大きなゲノム断片をクローニングすることができる (Sambrook J. and Russell D. vV. 2001. Molecular Cloning, A Laboratory Manu al, 3rd edn . Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA.)。コスミドベクターのパッケージング反応を利用するクローニングでは、ベクターと揷入断片の合計が 40kb〜50kb程度となるため、ベクターの大きさにより、揷入断片の大きさは一定の範囲内に制限される。本発明のベクターは、 25〜40kb、好ましくは 30〜40kb程度までの大きさの DNA断片のクローン化を目的とするため、ベクタ一の全長は 15kb以下、好ましくは 12〜14kbである。

[0025] l) IncPプラスミドの複製開始点（oriV) : oriVは大腸菌およびァグロバタテリゥムの双方で機能する。本発明の oriVの塩基配列は、 oriVの機能、即ち、 IncPプラスミドの複製開始点の機能を有する配列であれば特に限定されない。

[0026] oriVの分子生物学的諸特性については、 Pansegrau et al.(1994) J Mol Biol 239: 6 23-663に詳細な記載があり、 Genbank/EMBLァクセッション番号 L27758 (全長 6 0099bp)の酉己歹 IJの第 12200〜： 12750番目の塩基として規定される。これは、酉己歹 IJ 番号 1の第 3451〜4002番目の塩基に相当する（oriVのコア配列）。

[0027] oriVは、 pVK102 (Knauf and Nester 1982 Plasmid 8: 45-54)などの、 IncPプラスミドカも、常法により調整することができる。例えば oriVとして、 pVK102から PCRにより増幅した 0. 9kbの DNA (配列番号 1の第 3345〜4247番目の塩基）が利用可能である。

[0028] あるレ、は、上記配列番号 1の第 3451〜4002番目、より好ましくは、第 3345〜424 7番目の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダィズする塩基配列を含んでなり、 oriVの機能を有する核酸も利用することができる。あるいは、上記配列番号 1の第 3451〜4002番目、より好ましくは、第 3345〜4247番目の塩基酉己歹 IJに少なくとも 95%、より好ましくは 97%、さらに好ましくは 99%の同一性を有する塩基配列を含んでなり、 oriV機能を有する核酸も利用することができる。

[0029] なお、当業者は配列番号 1の第 345：!〜 4002番目中のさらに短い領域も同等の機能を奏するものとして選択しうる可能性があることを認識する。発明者らは WO200 5/040374に記載の方法を用いた場合において、最終的な形質転換効率が約 50 % (80% X 60% = 48%)にとどまった原因について様々な観点から検討を行レ、、クローニングベクター _PSB200の使用が原因ではなレ、かと考えた。

[0030] pSB200の複製開始点は ColEl由来である力 ColEl由来の複製開始点を持つプラスミドは、大腸菌細胞あたり 30〜40コピー存在し、比較的多コピーである。 Tao a nd Zhang(1998, Nucleic Acids Res 26: 4901-4909)では、大腸菌が安定的に保持できる外来 DNAは、糸田胞当たり 1200〜1500kbと推測してレ、る。この前提によれば、 p SB200により 30〜40kbの DNAをクローンィ匕した場合、ベクターのサイズを合わせると、細胞あたり、 1200〜2000kbの DNA量となり、上記の値を超えてしまう可能性がある。他に考え得る原因の一つとして、 pSB200力 S、ァグロバタテリゥム中では、単独では複製されないプラスミドであることが挙げられる。そのため、あらかじめ pSBlとレ、う IncPプラスミドの複製開始点（oriV)を有するベクターをァグロバタテリゥムに導入しておき、 pSB200と pSBlの双方に保持されている DNA配列間での相同組換えを介して、 pSB200と pSBlの co— integrateを作成する操作を利用して、 pSB200 をァグロバタテリゥムに導入するのである。このような操作の際に、何らかの不都合な現象が起き、 PSB200の導入に失敗した場合があることは否定できない。

[0031] また、逆に、大腸菌ならびにァグロバタテリゥム中でのコピー数があまりに少ない場合には、 DNAの分析などが非効率となってしまう。

[0032] 本発明者らは以上のような考察を基に、大腸菌およびァグロバタテリゥムの双方で機能し、かつ、これらの細菌中では 4〜5コピーとなる、 IncPプラスミドの複製開始点（ oriV)を持ち、他種のプラスミドの複製開始点を含まないベクターを作製し、供試した。その結果、上記ベクターの使用により、植物の形質転換方法において、具体的には例えば WO2005/040374に記載の方法において、形質転換効率が向上することを見出し、本発明を想到した。

[0033] 2) IncPプラスミドの trfAl遺伝子： trfAl遺伝子は、 IncPプラスミドの transacting replication factorとして重要であり、 oriV がその機能を果たすために必要な遺伝子である。本発明の trfAl遺伝子の塩基配列は、 trfAlの機能、即ち、相互複製因子（transacting replication factor)の機能を有する配列であれば、特に限定されない。

[0034] 分子生物学的諸特性にっレ、ては、 Pansegrau et al.(1994) J Mol Biol 239: 623-663 に詳細に記載されており、 Genbank/EMBLァクセッション番号 L27758 (全長 60 099bp)の酉己歹 IJの第 16521〜17669番目の塩基として規定される。これは、配列番号 1の第 6323— 7471番目の塩基に相当する（trfAlのコア配列）。

[0035] TrfAlは pVK102 (Knauf and Nester 1982 Plasmid 8: 45- 54)などの、 IncPプラスミド力、常法により調整することができる。例えば trfAl遺伝子として、 pVK102から PCRにより増幅した 3. 2kbの DNA断片（配歹 IJ番号 1の第 5341〜8507番目の塩基 )が利用可能である。

[0036] あるレ、は、上記酉己歹 IJ番号 1の第 6323— 7471番目、より好ましくは、第 5341〜850 7番目の塩基配列の相補鎖にストリンジヱントな条件でハイブリダィズする塩基配列を含んでなり、 trfAl遺伝子の機能を有する核酸も利用することができる。あるいは、上記酉己歹 IJ番号 1の第 6323— 7471番目、より好ましくは、第 5341〜8507番目の塩基配列に少なくとも 95 %、より好ましくは 97 %、さらに好ましくは 99 %の同一性を有する塩基配列を含んでなり、 trfAl遺伝子の機能を有する核酸も利用することができる。

[0037] なお、当業者は配列番号 1の第 6323— 7471番目中のさらに短い領域も同等の機能を奏するものとして選択しうる可能性があることを認識する。

[0038] 3) IncPプラスミドの origin of conjugative transfer (oriT) : oriTは接合（mati ng)に関わる因子である。本発明のベクターは、大量の形質転換を効率良く行うことが目的の一つであり、そのためには大腸菌とァグロバタテリゥムの接合が必要となる、 oriTはこの接合に寄与する。本発明の oriTは、 oriTの機能、即ち、接合 (matin g)に関わる因子の機能を有する配列であれば特に限定されない。

[0039] oriTの分子生物学的諸特性については、 Pansegrau et al.(1994) J Mol Biol 239: 6 23-663に詳細な記載があり、 Genbank/EMBLァクセッション番号 L27758 (全長 6 0099bp)の酉己歹 IJの第 51097〜51463番目の塩基として規定される。 oriTは、 pVK 102 (Knauf and Nester 1982 Plasmid 8: 45-54)などの、 IncPプラスミドから、常法により調整することができる。例えば oriTとして、 pVK102から PCRにより増幅した 0. 8 kbの DNA断片（配列番号 1の第 1〜816番目の塩基）が利用可能である。

[0040] あるいは、上記配列番号 1の第:!〜 816番目の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダィズする塩基配列を含んでなり、 oriTの機能を有する核酸も利用すること力 Sできる。あるいは、上記配列番号 1の第:!〜 816番目の塩基配列に少なくとも 95%、より好ましくは 97%、さらに好ましくは 99%の同一性を有する塩基配列を含んでなり、 oriTの機能を有する核酸も利用することができる。

[0041] なお、当業者は配列番号 1の第 1— 816番目中のさらに短い領域も同等の機能を奏するものとして選択しうる可能性があることを認識する。

[0042] 4) IncPプラスミドの incCl遺伝子： incCl遺伝子は IncPプラスミドの安定性に寄与している。本発明の incCl遺伝子の塩基配列は、 incCl遺伝子の IncPプラスミドの安定性に寄与する機能を有する配列であれば、特に限定されなレ、。

[0043] この遺伝子の分子生物学的諸特性については、 Pansegrau et al.(1994) J Mol Biol 239: 623-663により、詳細な記載があり、 Genbank/EMBLァクセッション番号 L27 758 (全長 60099bp)の酉己歹 ljの第 58260〜59354番目の塩基として規定される。これは、配列番号 1の第 1179〜2273番目の塩基に相当する（incCl遺伝子のコア配列)。

[0044] IncClは、 pVK102 (Knauf and Nester 1982 Plasmid 8: 45- 54)などの、 IncPプラスミド力、常法により調整することができる。例えば incCl遺伝子として、 pVK102 力、ら PCRにより増幅した 2. lkbの DNA断片（酉己歹 IJ番号 1の第 817〜2935番目の塩基）が利用可能である。

[0045] あるレ、は、上記酉己歹 IJ番号 1の第 1179〜2273番目、より好ましくは第 817〜2935 番目の塩基配列の相補鎖にストリンジ工ントな条件でハイブリダィズする塩基配列を含んでなり、 incCl遺伝子の機能を有する核酸も利用することができる。あるいは、上記酉己歹 IJ番号 1の第 1179〜2273番目、より好ましくは第 817〜2935番目の塩基酉己列に少なくとも 95%、より好ましくは 97%、さらに好ましくは 99%の同一性を有する塩基配列を含んでなり、 incCl遺伝子の機能を有する核酸も利用することができる。

[0046] なお、当業者は配列番号 1の第 1179— 2273番目中のさらに短い領域も同等の機能を奏するものとして選択しうる可能性があることを認識する。

[0047] 5)ラムダファージの cos部位：本発明のベクターは、コスミドベクターのパッケージング反応を利用するため、ラムダファージの cos部位を有する。本発明のラムダファージの cos部位の塩基配列は、ラムダファージの cos部位の機能、即ち、コスミドベクターのパッケージング反応に寄与する機能を有する配列であれば、特に限定されない。

[0048] ラムダファージの cos部位の分子生物学的諸特性にっレ、ては、 Sambrook J. and Ru ssell D.W. (2001)により、詳細な記載があり、配列は 5 ' _ aggtcgccgccc_ 3 ' (配列番号 9)である（ラムダファージの cos部位のコア配列）。 cosは例えば pSBl l (Komari et al. 1996 Plant J 10: 165-174)のようなプラスミドから、常法により調整することができる。例えば、 pSBl l力 PCRにより増幅した 0. 4kbの DNA断片（配列番号 1の第 2936〜3344番目の塩基）が利用可能である。

[0049] あるいは、上記配列番号 9の塩基配歹 lj、より好ましくは配列番号 1の第 2936〜334 4番目の塩基配列の相補鎖にストリンジヱントな条件でハイブリダィズする塩基配列を含んでなり、ラムダファージの cos部位の機能を有する核酸も利用することができる。あるいは、上記配列番号 9の塩基配歹 lj、より好ましくは配歹 IJ番号 1の第 2936〜3344 番目の塩基配列に少なくとも 95%、より好ましくは 97%、さらに好ましくは 99%の同一性を有する塩基配列を含んでなり、ラムダファージの cos部位の機能を有する核酸も禾 IJ用すること力 Sできる。

[0050] また cos部位が T— DNAの内側に位置すると、不要な DNAが植物内に導入されることになつてしまうため、該 cos部位は T—DNAの外側に配置する。

[0051] 6)大腸菌ならびにァグロバタテリゥム属細菌において発現する薬剤耐性遺伝子は、形質転換用選抜マーカーとして用いられる。この薬剤耐性遺伝子は、例えば抗生物質耐性を付与するか、または独立栄養要求性を付与する遺伝子であり、カナマイシン耐性遺伝子、スぺクチノマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、ノ、イダロマイシン耐性遺伝子などが挙げられる力これらに限定されるものではない。

[0052] 7)、 8)ァグロバタテリゥム属細菌の T— DNAの右ボーダー配列（RB)および左ボーダー配列（LB)は形質転換に不可欠であり（Zambryski et al. 1980 Science 209: 13 85-1391)、両配列の間に外来遺伝子のクローニング部位が配置される。本発明の R B及び LBの塩基配列は、各々ァグロバタテリゥム属細菌の T—DNAの右ボーダー配列（RB)および左ボーダー配列（LB)の機能を有するものであれば特に限定されない。それぞれ例えば pSBl l (Komari et al. 1996 Plant J 10: 165-174)などのプラスミド力、常法により調製することができる。それぞれ、配列番号 2の第 13253〜： 132 77番目の塩基、同第 3479〜3503番目の塩基が利用可能である。

[0053] あるいは、それぞれ、上記配歹 1J番号 2の第 13253〜13277番目、同第 3479〜35 03番目の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダィズする塩基配列を含んでなり、各々 RB、 LBの機能を有する核酸も利用することができる。あるいは、それぞれ、上記配歹幡号 2の第 13253〜13277番目、同第 3479〜3503番目の塩基配列に少なくとも 95%、より好ましくは 97%、さらに好ましくは 99%の同一性を有する塩基配列を含んでなり、各々 RB、 LBの機能を有する核酸も利用することができる。

[0054] なお、当業者は酉己歹 IJ番号 2の第 13253〜： 13277番目、同第 3479〜3503番目中のさらに短い領域も同等の機能を奏するものとして選択しうる可能性があることを認識する。

[0055] 9) 7)と 8)の間に配置される、植物細胞内で発現する植物形質転換用選抜マーカ一遺伝子が含まれる。植物形質転換用選抜マーカー遺伝子は、特に限定されず公知の選抜マーカー遺伝子を使用できる。好ましくは、ノ、イダロマイシン耐性遺伝子、フォスフィノトリシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子のいずれかである。さらに、単子葉植物の形質転換への使用に対しては、ノ、イダロマイシン耐性遺伝子、フォスフィノトリシン耐性遺伝子のレ、ずれかが好ましレ、。

[0056] 10) 7)と 8)の間に配置される、外来遺伝子をクローニングするための制限酵素認識部位が含まれる。外来遺伝子をクローニングするための制限酵素認識部位は、特に限定されず公知の制限酵素認識部位を使用できるが、配置された認識部位と同じ認識部位が、当該ベクター上の他の部分には存在しないことが望ましい。

[0057] なお、本発明の本発明のコスミドベクター構築物において、上記:!）〜 6)の各要素にカロえ、 7)〜10)のまとまりの、全 7つの要素の順序には制限がない。また 7)と 8)の間に配置される 9)と 10)の順序には制限がなレ、。

[0058] 本願発明のコスミドベクターは、好ましくは、以下の A—Gの 1つまたは複数の条件を満たす。

[0059] A. 1)の oriVの塩基配列が以下の塩基配列を含む

i)酉己歹' J番号 1の第 3451〜4002番目、より好ましくは、第 3345〜4247番目の塩基配列；

ii)酉己歹' J番号 1の第 3451〜4002番目、より好ましくは、第 3345〜4247番目の塩基配列の相補鎖にストリンジヱントな条件でハイブリダィズする塩基配列を含んでなり、 oriVの機能を有する塩基配列；あるいは、

iii)酉己歹 IJ番号 1の第 3451〜4002番目、より好ましくは、第 3345〜4247番目の塩基配列に少なくとも 95%、より好ましくは 97%、さらに好ましくは 99%の同一性を有する塩基配列を含んでなり、 oriV機能を有する塩基配列

B. 2)の trfAl遺伝子が以下の塩基配列を含む

i)酉己歹 1J番号 1の第 6323— 7471番目、より好ましくは、第 5341〜8507番目の塩基配列；

ii)酉己歹 1J番号 1の第 6323— 7471番目、より好ましくは、第 5341〜8507番目の塩基配列の相補鎖にストリンジヱントな条件でハイブリダィズする塩基配列を含んでなり、 trfAl遺伝子の機能を有する塩基配列；

iii)酉己歹 IJ番号 1の第 6323— 7471番目、より好ましくは、第 5341〜8507番目の塩基配列に少なくとも 95%、より好ましくは 97%、さらに好ましくは 99%の同一性を有する塩基配列を含んでなり、 trfAl遺伝子の機能を有する塩基配列

C. 3)の oriTが以下の塩基配列を含む

i)配列番号 1の第 1〜816番目の塩基配列

ii)配列番号 1の第 1〜816番目の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダィズする塩基配列を含んでなり、 oriTの機能を有する塩基配列； iii)配列番号 1の第 1〜 816番目の塩基配列に少なくとも 95 %、より好ましくは 97 % 、さらに好ましくは 99%の同一性を有する塩基配列を含んでなり、 oriTの機能を有する塩基配列

D. 4)の incCl遺伝子が以下の塩基配列を含む

i)配歹幡号 1の第 1179〜2273番目、より好ましくは第 817〜2935番目の塩基配列；

ii)酉己歹' J番号 1の第 1179〜2273番目、より好ましくは第 817〜2935番目の塩基酉己列の相補鎖にストリンジヱントな条件でハイブリダィズする塩基配列を含んでなり、 inc C1遺伝子の機能を有する塩基配列；

iii)酉己歹 IJ番号 1の第 1179〜2273番目、より好ましくは第 817〜2935番目の塩基配列に少なくとも 95 %、より好ましくは 97 %、さらに好ましくは 99 %の同一性を有する塩基配列を含んでなり、 incCl遺伝子の機能を有する塩基配列

E. 5)のラムダファージの cos部位が以下の塩基配列を含む

i)配列番号 9の塩基配列、より好ましくは配列番号 1の第 2936〜3344番目の塩基配列；

ii)配列番号 9の塩基酉己列、より好ましくは配列番号 1の第 2936〜3344番目の塩基配列の相補鎖にストリンジヱントな条件でハイブリダィズする塩基配列を含んでなり、ラムダファージの cos部位の機能を有する塩基配列；

iii)配列番号 9の塩基配歹 lj、より好ましくは配列番号 1の第 2936〜3344番目の塩基配列に少なくとも 95%、より好ましくは 97%、さらに好ましくは 99%の同一性を有する塩基配列を含んでなり、ラムダファージの cos部位の機能を有する塩基配列

F. 7)のァグロバタテリゥム属細菌の T— DNAの右ボーダー配列（RB)が以下の塩基配列を含む

i)酉己歹' J番号 2の第 13253〜13277番目の塩基酉己歹

ii)配列番号 2の第 13253〜： 13277番目の塩基配列の相補鎖にストリンジヱントな条件でハイブリダィズする塩基配列を含んでなり、 RBの機能を有する塩基配列； iii)酉己歹 IJ番号 2の第 13253〜 13277番目の塩基配列に少なくとも 95 %、より好ましくは 97%、さらに好ましくは 99%の同一性を有する塩基配列を含んでなり、 RBの機能を有する塩基配列

G. 8)のァグロバタテリゥム属細菌の T DNAの左ボーダー配列（LB)が以下の塩基配列を含む

i)配歹番号 2の第 3479〜3503番目の塩基配列；

ii)配列番号 2の第 3479〜3503番目の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダィズする塩基配列を含んでなり、 LBの機能を有する塩基配列； iii)酉己歹 IJ番号 2の第 3479〜3503番目の塩基酉己歹 IJに少なくとち 95%、より好ましくは 97%、さらに好ましくは 99%の同一性を有する塩基配列を含んでなり、 LBの機能を有する塩基配列

上述した本発明のコスミドベクターが満たすべき：!）〜 10)の条件をすベて満たすことにより、

•25〜40kb、好ましくは 30〜40kb程度の大きさの DNA断片を、効率よくクローン化できる；

•大腸菌、および、ァグロバタテリゥム細胞中で、安定的に保持される；

.ァグロバタテリゥムに、効率よく導入することができる；

'大腸菌、及び、ァグロバタテリゥムにおける細胞当りのコピー数力 S、 4〜5となる；そして

•クローン化した目的の DNA断片のみを植物、好ましくは単子葉植物、に効率よく導人すること力 Sできる。

のすベての課題を満たすベクターを作製することができる。

しかし、上記の課題を見出した後であっても、このようなベクターの開発が容易ではなかった。その一因として、プラスミドの複製制御機構が極めて複雑であることがあげられる。具体的には、上記目的に最適なベクターの基本骨格として、 IncPプラスミドの複製開始点（oriV)を有するサイズの小さいプラスミド（12kbから 15kb程度）が適してレ、る。し力、しながら、その基となる 60kbの IncPプラスミドは全塩基配列が解読されているものの、プラスミドの複製ならびに細胞分裂の際の partitioningに関わる遺伝子が多数あり、その機構は極めて複雑である（Pansegrau et al. J. Mol. Biol. 239:6 23-663, 1994)。したがって、細菌中で安定に保持される小型の IncPプラスミドの複製開始点（oriV)を有するベクターの作成は、容易ではない。実際、 IncPプラスミドに由来するさまざまの大きさのプラスミドが調べられているが、概して、小型のプラスミドは不安定であり、かつ、細菌の種類によっても、その安定性は大きく異なる（Schmidha user and Helinski, J. Bacteriol. 164:446-455, 1985)。 pE4cosは、小型化によって、ァグロバタテリゥム中での安定性を欠くこととなったプラスミドの一例である。その原因については、一定の考察はなされているものの（Klee et al. 1987 Mol Gen Genet 210 ： 282-287)、解明されているとはいえなレ、。

[0061] Schmidhauser and Helinski (J. Bacteriol. 164:446-455, 1985)は、さらに、「全てのグラム陰性細菌における安定な保持を説明する、プラスミド RK2中の遺伝的な決定因子の万肯セットは存在しなレヽ ("there is no universal set of genetic determinan ts in plasmid RK2 that accounts for staole maintenance in all gram-negative bacteria ")」と述べており、小型でかつ安定なベクターの作成が極めて困難であることがわかる。なお、プラスミド RK2 (pRK2と表記されることも多い）は、代表的な IncPプラスミドのひとつである。また、このようなベクターの構築の過程では、基となるプラスミドの構成要素を、別のベクターを用いてクローン化する工程を用いる場合が多レ、。しかし、細菌のプラスミドや染色体の複製に関与する DNA断片は、クローン化が困難な場合もある。このような問題が生じた場合には、解決手段の開発も必要となり、新規べクタ一の構築が困難となるひとつの要因となる。

[0062] 限定されるわけではないが、本発明のコスミドベクター（pLCシリーズ）は下記のものを含む。

[0063] i) pLC40 (配列番号 2、図 6)

全長 13429bpのバイナリーコスミドベクターで、下記の特徴を有する。

[0064] 1) IncPプラスミドの複製開始点（oriV)を含み、他種のプラスミドの複製開始点を含まない

2) IncPプラスミドの trfAl遺伝子、 3) oriT、 4) incCl遺伝子を含む

5)ラムダファージの cos部位を含み、かつ該 cos部位は T—DNAの外側に位置する

6)大腸菌ならびにァグロバタテリゥム属細菌において発現する薬剤耐性遺伝子 np till (カナマイシン耐性遺伝子）を含む

7)ァグロバタテリゥム属細菌の T DNAの右ボーダー配列を含む

8)ァグロバタテリゥム属細菌の T DNAの左ボーダー配列を含む

9) 7)と 8)の間に配置される、植物において発現する、植物形質転換用選抜マーカ一遺伝子 hpt (ノヽイダロマイシン耐性遺伝子）を含む

10) 7)と 8)の間に配置される、外来遺伝子をクローニングするための制限酵素認識部位、例えば NspV部位を含む。

[0065] pLC40は、 p6FRGに、 pSB200PcHm (図 1)の T—DNA領域を含む領域を導入して作成した。なお、 p6FRGは図 5中に示す構造を有する全長 8507bpのコスミドべクタ一（配列表の配列番号 1)で、下記の特徴を有する。

[0066] 1) IncPプラスミドの複製開始点（oriV)を含み、他種のプラスミドの複製開始点を含まない。

[0067] 2) IncPプラスミドの trfAl遺伝子、 oriT、 incCl遺伝子、ラムダファージの cos部位を含む。

[0068] 3)大腸菌ならびにァグロバタテリゥム属細菌において発現する薬剤耐性遺伝子 np till (カナマイシン耐性遺伝子）を含む。

[0069] ii) pLC40GWH (配列番号 3、図 7)

全長 13174bpのバイナリーコスミドベクターである。 pLC40との相違点は attBl, 2 配列の挿入と RB上流域 Sspl— Ball 317bpの欠失である。 p6FRGに、 pSB200P cHmGWH (図 3)の T DNA領域を含む領域を導入して作成した。

[0070] iii) pLC40bar (配歹幡号 4、図 8)

全長 12884bpのバイナリーコスミドベクターである。主な pLC40との相違点は、植物形質転換用選抜マーカー遺伝子力 ¾ar (フォスフィノトリシン耐性遺伝子）である点と、 T—DNA上の同選抜マーカーユニット（ュビキチンプロモータ^——ュビキチンィントロン—植物形質転換用選抜マーカー遺伝子）の向きが逆である点である。 p6FR Gに、 pSB25UNpHm (図 2)の T—DNA領域を含む領域を導入して作成した。

[0071] iv) pLC40GWB (配列番号 5、図 9)

全長 13026bpのバイナリーコスミドベクターである。 pLC40との相違点は、植物形質転換用選抜マーカー遺伝子力 ¾ar (フォスフィノトリシン耐性遺伝子）である点と、 at tBl, 2配列の挿入である。 p6FRGに、 pSB200PcHmGWB (図 4)の T— DNA領域を含む領域を導入して作成した。

[0072] v) pLC40GWHkorB (配列番号 65、図 10)

全長 14120bpのバイナリーコスミドベクターである。 pLC40GWHとの相違点は、 k orB遺伝子の塩基配列が含まれる点である。 korB遺伝子は、上述の IncCl近傍に位置し、 IncClと同様に、 IncPプラスミドの安定性に寄与している。本発明の korB遺伝子の塩基配列は、 korB遺伝子の IncPプラスミドの安定性に寄与する機能を有する配列であれば、特に限定されない。

[0073] この配列の分子生物学的諸特性については、 Pansegrau et al.(1994) J Mol Biol 23 9: 623-663により、詳細な記載があり、 Genbank/EMBLァクセッション番号 L2775 8 (全長 60099bp)の酉己歹 IJの第 57187— 58263番目の塩基として規定される。これは、酉己歹 1J番号 65の第 6306〜7382番目の塩基に相当する。

[0074] korBは、 pVK102 (Knauf and Nester 1982 Plasmid 8: 45-54)などの、 IncPプラスミド力、常法により調整することができる。例えば korB遺伝子として、 pVK102から PCRにより増幅した配列（配列番号 65の第 6306— 7382番目の塩基）が利用可能である。

[0075] あるいは、上記配列番号 65の第 6306〜7382の塩基配列の相補鎖にストリンジヱントな条件でハイブリダィズする塩基配列を含み、 korB遺伝子の機能を有する核酸も禾 IJ用すること力 Sできる。あるいは、上記酉己歹 IJ番号 65の第 6306〜7382の塩基配歹 IJ に少なくとも少なくとも 95 %、より好ましくは 97 %、さらに好ましくは 99 %の同一性を有する塩基配列を含んでなり、 korB遺伝子の機能を有する核酸も利用することができる。

[0076] vi) pLCleo (配歹番号 66、図 11)

全長 14195bpのバイナリーコスミドベクターである。 pLC40GWHkorBとの相違点は、マルチクローニングサイトに PspOMI部位力またその上流に PI_SceI部位が、さらにュビキチンプロモーター上流に attB3部位がある点である。

[0077] vii) pLC40GWHvGl (酉己歹 IJ番号 7、図 13) 全長 14222bpのバイナリーコスミドベクターである。 pLC40GWHとの相違点は、 vi rG遺伝子が挿入されている点である。 pPLC40GWHの T—DNAの外側に virG遺伝子を導入して作成した。

[0078] 上記の 7種のコスミドベクター

i)配列番号 2の塩基配列力なるコスミドベクター pLC40；

ii)配列番号 3の塩基配列力、らなるコスミドベクター pLC40GWH；

iii)配列番号 4の塩基配列からなるコスミドベクター pLC40bar；

iv)配列番号 5の塩基配列からなるコスミドベクター pLC40GWB；

V)配列番号 65の塩基配列からなるコスミドベクター pLC40GWHKorB ; vi)配列番号 66の塩基配列からなるコスミドベクター pLCleo ;及び

vii)配列番号 7の塩基配列力、らなるコスミドベクター pLC40GWHvGl

と塩基配列が 100%同一でなくても、当業者はそれらと同等の機能を奏する同等物を得ることが容易に可能である。よって、これらの「同等物」も本発明のコスミドベクタ一の好ましレ、態様として含まれる。

[0079] 例えば、本発明の上記 i) -vii)の各コスミドベクター中の塩基配列において、特に上記 1) 10)の各条件に関連する構成要素（例えば、条件 1)では oriV、条件 2)では trf A1遺伝子）以外の部分の塩基配列は変更しても、コスミドベクターとして各べクターと同等の機能を奏すると考えられる。また、 D一: L0)の条件中でも、 ₆)の薬剤耐性遺伝子、 9)の植物形質転換用選抜マーカー遺伝子、及び 10)の制限酵素認識部位、については i) vii)の各コスミドベクター中の塩基配列と全く同一のものでなくても、複数の同様の機能を奏する遺伝子または制限酵素部位が知られており、当業者は適宜これらの部分について変更を加えることが可能である。

[0080] よって、本発明の i) _vii)の各コスミドベクターの「同等物」とは、好ましくは、本発明のコスミドベクターの条件 1)〜5)、 7)— 8)の各条件に関連する構成要素、好ましくは特に各条件のコア配列の塩基配列について、各コスミドベクター中の塩基配列と同一、あるいはそれらの塩基配列と、少なくとも 95%以上、 97%以上、 98%以上または 99%以上、より好ましくは 99. 5。/₀以上の同一性を有する塩基配歹 IJ、あるいは各コスミドベクターの塩基配列の相補鎖と高いストリンジヱントな条件でハイブリダィズする塩基配列であり、それ以外の部分の塩基配列にも変異を有するが、各ベクターと同様に機能し同様の効果を奏するものを意味する。より好ましくは、本発明のコスミドべクタ一の条件：！）〜 10)の各条件に関連する構成要素、好ましくは特に各条件のコア配列の塩基配列について、各コスミドベクター中の塩基配列と同一であり、それ以外の部分の塩基配列に変異を有するが、各ベクターと同様に機能し同様の効果を奏するものを意味する。

[0081] 変異の程度は特に限定されないが、「同等物」は、好ましくは、 i) _vii)の各コスミドベクターの塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダィズする塩基配列力、らなる。変異されうる塩基は、より好ましくは 1ないし複数個、さらに好ましくは 1ないし数個（例えば、公知の部位特異的変異法で変異を施しうる程度）である。

[0082] また、「同等物」は、好ましくは、 i) -vii)の各コスミドベクターの塩基配列からなる群より選択される塩基配列と、 95%以上、 97%以上、 98%以上または 99%以上、より好ましくは 99. 5%以上の同一性を有する塩基配列からなる。

[0083] 2つの核酸配列の同一性％は、視覚的検査と数学的計算により決定可能であるか、またはより好ましくは、この比較はコンピュータ 'プログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。代表的な、好ましいコンピュータ 'プログラムは、遺伝学コンピュータ 'グループ（GCG；ウィスコンシン州マディソン）のウィスコンシン'パッケ一ジ、バージョン 10· 0プログラム「GAP」である（Devereux, et al., 1984, Nucl. Acids R es.， 12: 387)。この「GAP」プログラムの使用により、 2つの核酸配列の比較の他に、 2つのアミノ酸配列の比較、核酸配列とアミノ酸配列との比較を行うことができる。ここで、「GAP」プログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（1)ヌクレオチドについての（同一物について 1、および非同一物について 0の値を含む）一元（unary)比較マトリックスの GCG実行と、 Schwartzおよび Dayhoff監修「ポリペプチドの配列および構造のアトラス（Atlas of Polypeptide Sequence and Structure)」国立バイオ医学研究財団、 353— 358頁、 1979により記載されるような、 Gribskovおよび Burgess, Nucl. Acids Res., 14: 6745, 1986の加重アミノ酸比較マトリックス；または他の比較可能な比較マトリックス；（2)アミノ酸の各ギャップについて 30のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の 1のペナルティ；またはヌクレオチド配列の各ギャップにつレヽて 50のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の 3のペナルティ；（3)ェンドギャップへのノーペナルティ：および（4)長レ、ギャップへは最大ペナルティなし、力 S 含まれる。当業者により使用される他の配列比較プログラムでは、例えば、米国国立医字ライフラリーのゥェフサイト： http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.html により使用が利用可能な BLASTNプログラム、バージョン 2. 2. 7、または UW—BL AST2. 0アルゴリズムが使用可能である。 UW- BLAST2. 0についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト： http：〃 blast.wustl.edu に記載されている。さらに、 BLASTアルゴリズムは、 BLOSUM62アミノ酸スコア付けマトリックスを使用し、使用可能である選択パラメータ一は以下の通りである：（A)低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（Woottonおよび Federhenの SEGプログラム（Computers and Chemistry, 1993)により決定される； Woottonおよび Federhe n， 1996「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Analysis of compositionall y biased regions m sequence databases Methods EnzymoL , 26り： 544- 1 麥照れたレ、）、または、短周期性の内部リピートからなるセグメント（Claverieおよび States (Co mputers and Chemistry, 1993)の XNUプログラムにより決定される）をマスクするためのフィルターを含むこと、および (B)データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意性の閾値、または E—スコア（Karlinおよび Altschul, 1990)の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差力 ¾—スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない）；好ましい E—スコア閾値の数値は 0. 5であるか、または好ましさが増える順に、 0. 25 、 0. 1、 0. 05、 0. 01、 0. 001、 0. 0001、 le— 5、 le— 10、 le— 15、 le— 20、 le — 25、 le— 30、 le— 40、 le— 50、 le— 75、または le— 100である。

[0084] 植物の形誓転換方法

本発明はまた、本発明のコスミドベクターを利用した植物の形質転換方法を提供する。具体的には、本発明の植物の形質転換方法は、本発明のコスミドベクターに植物の核酸断片が導入されたベクターを含むァグロバタテリゥム属細菌を用いて植物を形質転換する、ことを含む。

[0085] コスミドベクターに導入される核酸断片の種類は特に限定されず、ゲノム DNA断片、 cDNA断片等、任意のものを利用可能である。好ましくはゲノム DNA断片、より好ましくは植物由来のゲノム DNA断片である。限定されるわけではないが、好ましくは導入される DNA断片のサイズは、 lkb以上が好ましぐ lOkb以上の大きさが更に好ましぐさらに好ましくは 20kb以上、さらに好ましくは 25〜40kb、さらに好ましくは 30 〜40kbである。

[0086] 核酸断片の調製及びそのコスミドベクターへの導入等は、公知の方法、例えば W〇 2005/040374に記載の方法に従って行うこと力 Sでさる。

[0087] 核酸断片の供給源は特に限定されない。植物ゲノム DNA断片の場合、好ましい例として、ゲノム DNA断片の導入先植物との交配によって、ヘテロシスが生じうる植物があげられる。例えば、導入先の植物がジャポニカイネである場合は、野生イネの一種であるオリザ'ノレフィポゴンや、インディ力イネが好ましい。導入先の植物がトウモロコシの特定品種である場合は、トウモロコシの他の品種や、野生種のテオシントなどが好ましい供与元植物の例である。一般的に、類縁関係の遠い植物ほど大きなへテ口シスが観察されている。

[0088] 形質転換に用いる導入先植物は、ゲノム DNAの由来する植物とは異種の植物であってもよく、同種の異なる品種であってもよぐ同種の同一の品種であってもよい。好ましい植物の例として、イネ、大麦、小麦、トウモロコシ、ソルガム、あるいは極早生イタリアンミレットやパールミレットなどのミレット類、などの穀物、サトウキビなどの工芸作物、スーダングラス、ローズグラスなどの牧草、コーヒー、ココア、茶、タバコ、等の嗜好品を製造するための植物、野菜類、果物類、花などの観賞用植物、シロイヌナズナなどの雑草、など実質上制限無く広い範囲の植物があげられる。

[0089] 本発明のコスミドベクターは特に、生物的導入法であるァグロバタテリゥム法による形質転換効率の向上を目的として得られたものである。よって、植物の形質転換の方法は、好ましくはァグロバタテリゥム法である。し力ながら、植物の形質転換の方法として公知の他の方法の使用も除外されるわけではない。例えば、物理的導入法としてマイクロインジェクション法、エレクト口ポレーシヨン法、パーティクルガン法、シリコンカーバイド法、エアーインジェクション法など力化学的導入法としてポリエチレンダリコール法などが知られている。 [0090] ァグロバタテリゥム菌株の種類は、その抗生物質耐性が、ベクター構築時に用いる細菌用の抗生物質耐性 (遺伝子）以外であれば、特に限定されず、 LBA4404、 A2

81、 EHA105, PC2760等、公知の株を禾 IJ用可肯である。

[0091] マップベースクローニング法

また、本発明は、上記本発明のコスミドベクターを利用した、効率のよいマップべ一スクローニング法を提供する。すなわち、下記の工程を含むことを特徴とする、マップベースクローユングの方法である。

[0092] 1)植物の表現型に関与する候補遺伝子を含む BACクローンを、制限酵素により部分分解または完全分解し；

2)コスミドベクターを用いて、工程 1)で得られた DNA断片をサブクローンィ匕して、ライブラリーを構築し;そして

3)ライブラリーを構成するクローンを、個別に、植物に導入し、形質転衡直物の表現型を評価する。

[0093] 本マップベースクリーニング法においては、限定されるわけではなレ、が、工程 1)で得られた DNA断片のサイズが 25〜40kbであることが好ましレ、。また、工程 2)のコスミドベクターが上記「コスミドベクター」の項に記載のコスミドベクターであることがさらに好ましい。

[0094] 「候補遺伝子」とは、植物の表現型に関与する可能性のある遺伝子を含む一群の遺伝子である。「植物の表現型」とは、特に限定されないが、例えば、植物体全体のビガ一 (vigor)が高い、植物体および器官が大きい、収量が高い、生長速度が速い、病害'虫害に強い、乾燥 ·高温 ·低温等さまざまな環境ストレスに対して強い、特定成分の増'減、特定酵素活性の増'減、矮性化、等々、農業上有益な種々の表現型を含む。

[0095] 例えば、候補遺伝子が、 100〜200kbの複数の BACクローンに保持される DNA 断片に含まれていることが判明したとする。これらのクローンィ匕された DNAを、適当な制限酵素で部分分解または完全分解し、 40kb程度の重複断片を調製し、本発明のベクター形質転換用ベクターを用いてサブクローニングを行う。この際、サブクローン化された DNA断片の位置関係、重複の様相を詳細に調查する必要はなレ、。統計学的計算によれば 200kbクローンのとき、無作為に得られる 21個のサブクローンにより、もとの断片の任意の部位が 99%の確率で保持される（例えば、 WO2005/040 374の [0043]— [0047]参照）。

[0096] 続いて、各サブクローンを植物に導入し、独立な形質転換体を、サブクローンあたり 10個体程度作成し、遺伝子の効果を解析する。この操作により、まず、候補遺伝子を有するサブクローンを特定することにより、候補領域を 40kbに絞ることができ、さらに、 P 接するサブクローンとの実験結果と照合することにより、候補領域を極めて狭い領域にまで限定することができる。従って、候補遺伝子の同定作業の効率は大きく向上する。

[0097] さらに virG謝云 (及び virB謝云子)》禾する开拿云

本発明の植物の形質転換方法は、好ましい一態様において、以下の要素を含むァグロバタテリゥム属細菌を用いることを特徴とする。

[0098] la)本発明のコスミドベクターに植物の核酸断片が導入されたベクターに、さらにァグロバタテリゥム属細菌の virG遺伝子を導入したベクター；あるいは

lb)本発明のコスミドベクターに植物の核酸断片が導入されたベクター、及び、ァグロバクテリゥム属細菌の細胞中において IncPプラスミドと共存可能なプラスミドであつて、ァグロバタテリゥム属細菌の virG遺伝子を含むプラスミド、

並びに

2)ァグロバタテリゥム属細菌の Tiプラスミド、もしくは、 Riプラスミド。

[0099] virGは、 T DNAを植物に送り込む際に機能するァグロバタテリゥムの vir遺伝子群の一つで、 virB遺伝子などの転写因子と考えられている（Winans et al. 1986 Pro Natl. Acad. Sci. USA 83: 8278-8282)。 virGの一例として virGN54Dは、 virGタンパクの 54番目のアミノ酸がァスパラギンからァスパラギン酸に変化した変異体で、野生型 virGに比べ、 virB遺伝子の発現をより増加させる（Pazour et al. 1992 J.Bac 174 :4169-4174)。本形質転換方法において、 virG遺伝子は、好ましくは virGN54Dである。

[0100] 本発明の一態様 la)において virG遺伝子は、本発明のコスミドベクターに植物の核酸断片が導入されたベクターにさらに導入されていてよい。本発明のコスミドベクタ一が既に virG遺伝子を含む態様（例えば、 pLC40GWHvGl)の場合は、 virG遺伝子をさらに導入する必要はない。

[0101] あるいは、 virG遺伝子は、本発明のコスミドベクターとは別の独立としたプラスミド中に存在させてもよレ、。この場合、本発明の方法においてァグロバタテリゥム細菌は、コスミドベクターの他に、ァグロバタテリゥム属細菌の細胞中において IncPプラスミドと共存可能なプラスミドであって、ァグロバタテリゥム属細菌の virG遺伝子を含むプラスミドを含む (態様 lb)。

[0102] また、 Tiプラスミド、もしくは、 Riプラスミドについては、特に限定はないが、 T-DN Aが除去されたデイスアーム型のものが好ましい。

[0103] lb)のァグロバタテリゥム属細菌の virG遺伝子を含むプラスミドは、 IncWプラスミドの複製開始点を含んでもよい。好ましくは、図 14に示した構造を有する pVGWである。より好ましくは、図 15に示した構造を有する pVGW2である。

[0104] また、 lb)のァグロバタテリゥム属細菌の virG遺伝子を含むプラスミドは、さらに、ァグロバタテリゥム属細菌の virB遺伝子を含んでいても良レ、。この場合も、プラスミドは、 IncWプラスミドの複製開始点を含んでもよい。このようなプラスミドは、好ましくは pT ΟΚ47である。

[0105] ァグロバタテリゥム属細菌の virB遺伝子にっレ、ては、 Ward et al. (1988) J Biol Che m 263: 5804-5814に詳細な記載がある。例えば pSBl (Komari et al. 1996 Plant J 10 ： 165-174)などのプラスミドから、常法により調製することができる。 virBの塩基配列は、例えば、 Genbank/EMBLァクセッション番号： AB027255 (pSBl)の塩基配列のうち、第 3416から 12851番目の塩基として規定される。 virB遺伝子として、この配歹 1ほたはこの相補鎖にストリンジヱントな条件でハイブリダィズする塩基配列を含んでなる DNAを利用することができる力これらに限られるものではない。

[0106] これらの形質転換方法は、対象とする植物が、一般にァグロバタテリゥムによる形質転換では形質転換効率が低いとされる植物、例えば限定するものではないが、トウモ口コシゃダイズである場合に、より有効である。また、導入する核酸断片が、大きい場合（限定するものではなレ、が、 25〜40kbの場合)や複雑な構造を有する場合（限定するものではないが、高度反復配列を有する場合）には、ァグロバタテリゥム属細菌の virG遺伝子を含むプラスミドとして後述の pVGWを用いることが好ましい。

[0107] プラスミドベクター

トウモロコシのような形質転換が起こりにくい植物の場合、特殊な場合（Frame et al.

2002 Plant Physiol 129: 13-22)を除いて、 T— DNAが組込まれた標準的なバイナリ一ベクターではァグロバタテリゥムによる形質転換の効率は極めて低レ、。これまでに、バイナリーベクターと、 virG遺伝子の変異体である virGN54D遺伝子が組込まれた別のプラスミドをァグロバタテリゥム中に共存させることで、トウモロコシでは一過的発現の効率上昇が（Hansen et al. 1994 ProNAS 91 :7603-7607)、また、 virGと virBを組込んだバイナリーベクターによるトウモロコシの高効率形質転換系が報告されている（Ishida et al. 1996 Nat Biotechnol 14:745-50)。

[0108] しかしながら、バイナリーベクターに、 virG,あるいは virGN54Dが組込まれたプラスミドをァグロバタテリゥム中で共存させることにより、トウモロコシ形質転換効率を上昇させた例は、これまでに報告されていない。

[0109] 本発明のコスミドベクター（pLCベクター）（IncPプラスミド）も、トウモロコシの形質転換に関し、さらなる形質転換効率の向上が期待される。 IncPプラスミドと共存可能なプラスミドとして、例えば IncWプラスミド（Close et al. 1984 Plasmid 12: 111-118)がある。これまで報告されている、 virGが導入された IncWベクターは、 pBR322 oriなど他のプラスミドの複製開始点が含まれ、サイズが大きい。例えば pTOK47は、 IncW ( pSa) oriと pBR322 oriが含まれ（さらに virGの他に virBも含まれる）、全長はおよそ 28kbである（Jin et al. 1987 J Bacteriol 169: 4417-4425)。また、 pYW48は、 Inc W (pSa) oriと pBR322 oriが含まれ（virGの他に virAも含まれる）、全長は 15. 5 kbである（Wang et al. 2000 Gene 242: 105-114)。このようなベクターも本発明の形質転換方法に使用することが可能である。ただし長いベクターであるため、例えば大断片を組込んだ PLCベクターと共存させた場合、細菌中における安定性に問題を生じる恐れがあり、 pLCベクターと共存でき、 virGを含み、かつサイズの小さいベクターが望まれる。

[0110] これを解決する手段として、本発明では、上記本発明のコスミドベクターと共存させることにより、形質転換効率を更に向上させることができる小型のプラスミドベクターを提供する。

[0111] 本発明のプラスミドベクターは、下記の条件をすベて有するベクターである。

[0112] 1) IncWプラスミドの複製開始点を含み、他のプラスミドの複製開始点を含まない；

2) IncWプラスミドの複製に必要な repA遺伝子を含む

3)大腸菌ならびにァグロバタテリゥム属細菌において発現する薬剤耐性遺伝子を含む

4)ァグロバタテリゥム属細菌の virG遺伝子を含む

1)本発明の IncWプラスミドの複製開始点の塩基配列は、 IncWプラスミドの複製開始点としての機能を有する配列であれば、特に限定されなレ、。

[0113] IncWプラスミドの複製開始点の分子生物学的諸特性については、 Okumura an d Kado (1992 Mol Gen Genet 235: 55-63)に詳細な記載があり、 Genbank/EMB Lァクセッション番号： U30471 (全長 5500bp)の第 2170〜2552番目の塩基として規定される。これは、配列番号 8の第 2832〜3214番目の塩基に相当する。

[0114] IncWプラスミドの複製開始点は、 pTOK47 (Jin et al. 1987 J Bacteriol 169: 4417- 4425)などの、 IncWプラスミドから、常法により調整することができる。例えば、 pTOK 47力ら PCRにより、後述の IncWプラスミドの複製に必要な repAとともに増幅した 2. 7kbの DNAのうち、配列番号 8の第 2832〜3214番目の塩基））が利用可能である

[0115] あるいは、上記配列番号 8の第 2832〜3214番目の塩基配列の相補鎖にストリンジヱントな条件でハイブリダィズする塩基配列を含んでなり、 IncWプラスミドの複製開始点の機能を有する核酸も利用することができる。あるいは、上記配列番号 8の第 28 32〜3214番目の塩基配列に少なくとも 95%、より好ましくは 97%、さらに好ましくは 99 %の同一性を有する塩基配列を含んでなり、 IncWプラスミドの複製開始点の機能を有する核酸も利用することができる。

[0116] なお、当業者は配列番号 8の第 2832〜3214番目中のさらに短い領域も同等の機能を奏するものとして選択しうる可能性があることを認識する。

[0117] 2) 本発明の repA遺伝子の塩基配列は、 IncWプラスミドの複製に必要な repA遺伝子として機能を有する配列であれば、特に限定されない。 IncWプラスミドの複製に必要な repAの分子生物学的諸特性にっレ、ては、 Okumura and Kado (1992) Mol Gen Genet 235: 55-63に詳細な記載があり、 Genbank/EM BLァクセッション番号： U30471 (全長 5500bp)の第 1108〜2079番目の塩基として規定される。これは、配列番号 8の第 1770〜2741番目の塩基に相当する。

[0118] IncWプラスミドの複製に必要な repAは、 pTOK47 (Jin et al. 1987 J Bacteriol 169 ： 4417-4425)などの、 IncWプラスミドから、常法により調整することができる。例えば、 pT〇K47から PCRにより、前述の IncWプラスミドの複製開始点とともに増幅した 2 . 7kbの DNAのうち、配列番号 8の第 1770〜2741番目の塩基が利用可能である。

[0119] あるいは、上記配列番号 8の第 1770〜2741番目の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダィズする塩基配列を含んでなり、 IncWプラスミドの複製に必要な repA遺伝子として機能を有する核酸も利用することができる。あるいは、上記酉己歹 IJ番号 8の第 1770〜2741番目の塩基酉己歹 IJに少なくとち 95%、より好ましくは 97 %、さらに好ましくは 99%の同一性を有する塩基配列を含んでなり、 IncWプラスミドの複製に必要な repA遺伝子として機能を有する核酸も利用することができる。

[0120] なお、当業者は配列番号 8の第 1770〜2741番目中のさらに短い領域も同等の機能を奏するものとして選択しうる可能性があることを認識する。

[0121] 3)大腸菌ならびにァグロバタテリゥム属細菌において発現する薬剤耐性遺伝子は、形質転換用選抜マーカーとして用いられる。この薬剤耐性遺伝子は、例えば抗生物質耐性を付与するか、または独立栄養要求性を付与する遺伝子であり、カナマイシン耐性遺伝子、スぺクチノマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、ノ、イダロマイシン耐性遺伝子などが挙げられる力これらに限定されるものではない。

[0122] 4)ァグロバタテリゥム属細菌の virG遺伝子については、 Winans et al. (1986) Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 83: 8278-8282に、 virGN54Dについては、 Pazour et al. (1992 ) J. Bacteriol. 174: 4169-4174、 Hansen et al. 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 : 7603-7607に詳細な記載がある。 virGは、 virBや virEなど他の vir遺伝子群の転写調節（活性化）因子である。 virGは virAからの調節（リン酸化）を受けて活性化するが、 virGN54Dは、この調節を受けず、常に活性化した状態にある変異体である。 pT OK47 (Jin et al. 1987 J Bacteriol 169: 4417-4425)などのプラスミドから、 virG遺伝子については常法により、 virGN54Dについては変異導入により調製することができる。例えば、 pT〇K47から PCRにより増幅した lkbの virG DNA (配列番号 7の第 4 024〜5069番目の塩基）、 pT〇K47から PCRによる変異導入により増幅'調製した lkbの virGN54D DNA (配列番号 8の第 1〜 1080番目の塩基）を利用可能である

[0123] あるいは、これらの相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダィズする塩基配列を含んでなり、ァグロバタテリゥム属細菌の virG遺伝子の機能を有する核酸、あるいは、これらの塩基配列に少なくとも 95%、より好ましくは 97%、さらに好ましくは 99%の同一性を有する塩基配列を含んでなり、ァグロバタテリゥム属細菌の virG遺伝子の機能を有する核酸も利用可能である。

[0124] 本発明のプラスミドベクターは、好ましくは全長が 10kb以内、更に好ましくは 5kb以内である。

[0125] 限定されるわけではないが、本発明のプラスミドベクターは好ましくは、図 14に記載の構造を有する pVGWベクターである。より好ましくは、図 15に示した構造を有する p VGW2である。 pVGW、 pVGW2は、上記の 1)—4)の条件を全て満たしたベクターである。配列番号 8に記載の pVGWの全長は 4531bpであり、また配列番号 67に記載の PVGW2の全長は 4836bpであり、下記の特徴を有する。

1) IncWプラスミドの複製開始点を含み、他のプラスミドの複製開始点を含まない、

2) IncWプラスミドの複製に必要な repA遺伝子を含む

3)大腸菌ならびにァグロバクテリゥム属細菌において発現する薬剤耐性遺伝子であるゲンタマイシン耐性遺伝子を含む

4)ァグロバタテリゥム属細菌の virGN54D遺伝子を含む

各コンポーネントのうち、 IncWプラスミドの複製開始点と IncWプラスミドの複製に必要な repA遺伝子は同時にクローニング、またゲンタマイシン耐性遺伝子と virGN54 D遺伝子はそれぞれクローニングした後、 3つの DNA断片（4つのコンポーネント）全てを組み上げて作成した。

[0126] 本発明のプラスミドベクターは、上記 2つの 2種のプラスミドベクター pVGW、 pVG W2と塩基配列が 100%同一でなくても、当業者はそれらと同等の機能を奏する同等物を得ることが容易に可能である。よって、これらの「同等物」も本発明のプラスミドドベクターの好ましい態様として含まれる。

[0127] 例えば、本発明の各プラスミドベクター中の塩基配列において、特に上記 1) -4) の各条件に関連する構成要素（例えば、条件 1)では IncWプラスミドの複製開始点）以外の部分の塩基配列は変更しても、プラスミドベクターとして各ベクターと同等の機能を奏すると考えられる。また、 1)—4)の条件中でも、 3)の薬剤耐性遺伝子についてはの各プラスミドベクター中の塩基配列と全く同一のものでなくても、複数の同様の機能を奏する遺伝子が知られており、当業者は適宜これらの部分について変更をカロえることが可能である。

[0128] よって、本発明の各プラスミドベクターの「同等物」とは、好ましくは、本発明のプラスミドベクターの条件 D〜₂₎、 ₄₎の各条件に関連する構成要素の塩基配列について、各プラスミドベクター中の塩基配列と同一、あるいはそれらの塩基配列と、少なくとも 9 5%以上、 97%以上、 98%以上または 99%以上、より好ましくは 99. 5%以上の同一性を有する塩基配歹 IJ、あるいは各プラスミドベクターの塩基配列の相補鎖と高いストリンジェントな条件でハイブリダィズする塩基配列であり、それ以外の部分の塩基配歹 IJにも変異を有するが、各ベクターと同様に機能し同様の効果を奏するものを意味する。より好ましくは、本発明のプラスミドベクターの条件：!）〜 4)の各条件に関連する構成要素の塩基配列について、各プラスミドベクター中の塩基配列と同一であり、それ以外の部分の塩基配列に変異を有するが、各ベクターと同様に機能し同様の効果を奏するものを意味する。

[0129] 変異の程度は特に限定されないが、「同等物」は、好ましくは各プラスミドベクターの塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダィズする塩基配列からなる。変異されうる塩基は、より好ましくは 1ないし複数個、さらに好ましくは 1ないし数個（例えば、公知の部位特異的変異法で変異を施しうる程度）である。

[0130] また、「同等物」は、好ましくは、各プラスミドベクターの塩基配列からなる群より選択される塩基配列と、 95。/₀以上、 97。/₀以上、 98%以上または 99%以上、より好ましくは 99. 5%以上の同一性を有する塩基配列からなる。 [0131] なお、本明細書中で「ストリンジェントな条件下」とは、中程度または高程度にストリンジェントな条件においてハイブリダィズすることを意味する。具体的には、中程度にストリンジェントな条件は、例えば、 DNAの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、 Sambrookら, Molec ular Cloning: A Laboratory Manual，弟 3片及，第 6-7早, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001に示され、そしてニトロセルロースフィルターに関し、 5 X SSC、 0. 5% S DS、 1. OmM EDTA (pH8. 0)の前洗浄溶液、約 40_ 50°Cでの、約 50%ホルムアミド中または無しの、 2 33〇_6 33〇（または約42。〇での約50%ホルムァミド中の、スターク溶液（Stark' s solution)などの他の同様のハイブリダィゼーシヨン溶液）のハイブリダィゼーシヨン条件、および例えば、約 40。C_ 60°C、 0. 5 -6 X SS C、 0. 1% SDSの洗浄条件の使用が含まれる。好ましくは中程度にストリンジヱントな条件は、約 50°C、 6 X SSCのハイブリダィゼーシヨン条件（及び洗浄条件）を含む。高ストリンジェントな条件もまた、例えば DNAの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。

[0132] 一般に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度および/または低い塩濃度でのハイブリダィゼーシヨン（例えば、約 65°C、 6 X SSCなレ、し 0. 2 X SSC、好ましくは 6 X SSC、より好ましくは 2 X SSC、最も好ましくは 0. 2 X SSCのハイブリダィゼーシヨン）および/または洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダィゼーシヨン条件、およびおよそ 65。C— 68。C、 0. 2 X SSC、 0. 1 % SDSの洗浄を伴うと定義される。ハイブリダィゼーシヨンおよび洗浄の緩衝液では、 SSC (1 X SSCは、 0. 15M NaClおよび 15mM クェン酸ナトリウムである）に SSPE (1 X SSPEは、 0. 15M NaCl、 10mM NaH P〇、および 1. 25mM EDTA、 pH7. 4である）を

2 4

代用することが可能であり、洗浄はハイブリダィゼーシヨンが完了した後で 15分間行う。

[0133] また、プローブに放射性物質を使用しない市販のハイブリダィゼーシヨンキットを使用することもできる。具体白勺には、 ECL direct labeling & detection system (Amersham社製）を使用したハイブリダィゼーシヨン等が挙げられる。ストリンジヱントなハイブリダィゼーシヨンとしては、例えば、キット中の hybridization bufferに Bio eking試薬を 5% (w/v)、 NaClを 0· 5Mになるように加え、 42°Cで 4時間行い、洗浄は、 0. 4% SDS、 0. 5xSSC中で、 55。Cで 20分を二回、 2xSSC中で室温、 5分を一回行う、という条件が挙げられる。

[0134] pVGWは小型で安定なことを特徴とする。具体的には、 pLCと共存させることにより、特に大断片を用レ、た場合、及び Zあるいは宿主としてトウモロコシを使用する場合の、形質転換効率の向上に有効である。 pLC以外の一般のベクターと共存させる場合も、トウモロコシ等を形質転換する場合の形質転換効率の向上に有用である。発明の効果

[0135] 本発明のベクター（pLCベクター）により、公知のベクターでは達成できなかった下記の効果が得られる。

[0136] ' 25〜40kb、好ましくは 30〜40kb程度の大きさの DNA断片を、効率よくクローン化できる；

•大腸菌、および、ァグロバタテリゥム細胞中で、安定的に保持される； .ァグロバタテリゥムに、効率よく導入することができる；

'クローン化した目的の DNA断片のみを植物、好ましくは単子葉植物、に効率よく導入することができる（pSBベクターの形質転換効率が 60%であったのに対し、 pLC ベクターの形質転換効率は 90%)。

[0137] 本発明の pLCベクターと pVGWベクターとを同時に用いることにより、トウモロコシなど、形質転換が比較的困難な植物への遺伝子導入も、効率よく行うことができる。

[0138] 本発明の pLCベクターを利用して、マップベースクローニングを行うことにより、少ない労力と短時間で、候補遺伝子の部位を絞り込むことができる。

[0139] 本発明は、マッピング情報が極めて乏しい場合にも、大きな効果を発揮する。例えば、ある染色体の末端部に候補遺伝子が存在する、という情報のみであったとする。たとえば、染色体一本全体が 40Mbとすると、末端部は、 2Mb程度と考えてよい。整列化された BACライブラリー（BACコンテイダ）があれば、 BACへの挿入断片の平均を 150 kbとして、 20個程度の BACクローンにより、この領域を網羅できる。したがつて、各 BACから、 20サブクローンを作成するとして、全部で 400断片、 4000個体の組換え体を作出すれば、短時間で候補遺伝子をほぼ特定することができる。このように、本発明の技術を用いることになり、従来の技術からは考えることができないほど、わずかな労力と時間により、遺伝子の特定ができるのである。

本発明の熊様

本発明は、好ましくは以下の態様を含む。

[態様 1]

下記の特徴を有する全長 15kb以内のコスミドベクター

1) IncPプラスミドの複製開始点（oriV)を含み、他種のプラスミドの複製開始点を含まない；

2) IncPプラスミドの trf A1遺伝子を含む；

3) IncPフフストの origin of conjugative transfer (oriT)を含む；

4) IncPプラスミドの incCl遺伝子を含む；

5)ラムダファージの cos部位を含み、かつ該 cos部位は T DNAの外側に位置する；

7)ァグロバタテリゥム属細菌の T DNAの右ボーダー配列を含む；

8)ァグロバタテリゥム属細菌の T DNAの左ボーダー配列を含む；

9) 7)と 8)の間に配置される、植物において発現する、植物形質転換用選抜マーカ一遺伝子を含む；そして

[態様 2]

植物形質転換用選抜マーカー遺伝子が、ハイグロマイシン耐性遺伝子、フォスフィノトリシン耐性遺伝子及びカナマイシン耐性遺伝子からなるグループから選択される、態様 1記載のコスミドベクター。

[態様 3] IncPプラスミドの korB遺伝子を含む、態様 1又は 2に記載のコスミドベクター。

[態様 4]

以下の：

配列番号 2の塩基配列からなるコスミドベクター pLC40若しくはその同等物；配列番号 3の塩基配列からなるコスミドベクター pLC40GWH若しくはその同等物；配列番号 4の塩基配列からなるコスミドベクター pLC40bar若しくはその同等物；配列番号 5の塩基配列からなるコスミドベクター pLC40GWB若しくはその同等物；配列番号 65の塩基配列からなるコスミドべクター 1^ 400 1¾：0 若しくはその同等物；

配列番号 66の塩基配列からなるコスミドベクター pLCleo若しくはその同等物；及び配列番号 7の塩基配列からなるコスミドベクター pLC40GWHvGl若しくはその同等物

からなるグループから選択される、態様 1ないし 3のいずれか 1項に記載のコスミドべクタ一。

[態様 5]

以下の：

配列番号 2の塩基配列からなるコスミドベクター pLC40；

配列番号 3の塩基配列からなるコスミドベクター pLC40GWH；

配列番号 4の塩基配列からなるコスミドベクター pLC40bar；

配列番号 5の塩基配列からなるコスミドベクター pLC40GWB；

配列番号 65の塩基配列からなるコスミドべクター 1^ 400 ^11^0 ；

配列番号 66の塩基配列からなるコスミドベクター pLCleo；及び

配列番号 7の塩基配列からなるコスミドベクター pLC40GWHvGl

からなるグノレープから選択される、態様 4に記載のコスミドベクター。

[態様 6]

態様 1ないし 5のいずれ力、 1項に記載のコスミドベクターに植物の核酸断片が導入された発現ベクターを含むァグロバクテリゥム属細菌を用いて植物を形質転換する、ことを含む、植物の形質転換方法。 [態様 7]

導入されている核酸断片のサイズが 25〜40kbである、態様 6に記載の形質転換方法。

[態様 8]

植物の形質転換において、以下の要素を含むァグロバタテリゥム属細菌を用いることを特徴とする、態様 6または 7に記載の形質転換方法；

la)態様 1ないし 5のいずれか 1項に記載のコスミドベクターに植物の核酸断片が導入されたベクターに、さらにァグロバタテリゥム属細菌の virG遺伝子を導入したベクタ一；あるいは

lb)態様 1ないし 5のいずれ力、 1項に記載のコスミドベクターに植物の核酸断片が導入されたベクター、及び、ァグロバタテリゥム属細菌の細胞中において IncPプラスミドと共存可能なプラスミドであって、ァグロバタテリゥム属細菌の virG遺伝子を含むブラスミド、

並びに

[態様 9]

la)または lb)のァグロバタテリゥム属細菌の virG遺伝子力 virGN54Dである、態様 8記載の形質転換方法。

[態様 10]

lb)のァグロバタテリゥム属細菌の virG遺伝子を含むプラスミド力 IncWプラスミドの複製開始点を含む、態様 8記載の形質転換方法。

[態様 11]

lb)のァグロバタテリゥム属細菌の virG遺伝子を含むプラスミド力図 14に示した構造を有する pVGW、または図 15に示した構造を有する pVGW2である、態様 10記載の形質転換方法。

[態様 12]

lb)のァグロバタテリゥム属細菌の virG遺伝子を含むプラスミド力さらに、ァグロバクテリゥム属細菌の virB遺伝子を含む、態様 8記載の形質転換方法。 [態様 13]

lb)のァグロバタテリゥム属細菌の virG遺伝子を含むプラスミド力 IncWプラスミドの複製開始点を含む、態様 12記載の形質転換方法。

[態様 14]

lb)のァグロバタテリゥム属細菌の virG遺伝子を含むプラスミド力 pTOK47である、態様 13記載の形質転換方法。

[態様 15]

下記の工程を含むことを特徴とする、マップベースクローユングの方法

1)植物の表現型に関与する候補遺伝子を含む BACクローンを、制限酵素により部分分解または完全分解し；

3)ライブラリーを構成するクローンを、個別に、植物に導入し、形質転對直物の表現型を評価する。

[態様 16]

工程 1)で得られた DNA断片のサイズが 25〜40kbである、態様 15に記載のマツプベースクローユングの方法。

[態様 17]

2)のコスミドベクターが態様 1 5のいずれか 1項に記載のコスミドベクターである態様 16に記載のマップベースクローニングの方法。

[態様 18]

下記の特徴を有するプラスミドベクター；

1) IncWプラスミドの複製に必要な因子を含み、他のプラスミドの複製開始点を含まない；

2) IncWプラスミドの複製に必要な repA遺伝子を含む；

3)大腸菌ならびにァグロバタテリゥム属細菌において発現する薬剤耐性遺伝子を含む；そして

4)ァグロバタテリゥム属細菌の virG遺伝子を含む。 [態様 19]

全長が 10kb以内である、態様 18のプラスミドベクター。

[態様 20]

ァグロバタテリゥム属細菌の virG遺伝子が virGN54Dである態様 19記載のプラスミドベ々々^ ~

[態様 21]

以下の：

配列番号 8に記載の塩基配列からなるプラスミドベクター pVGW若しくはその同等物；及び

配列番号 67に記載の塩基配列からなるプラスミドベクター pVGW2若しくはその同等物

からなるグループから選択される、態様 18ないし 20のいずれか 1項に記載のプラスミドべ々ター

[態様 22]

配列番号 8に記載の塩基配列からなるプラスミドベクター pVGW。

[態様 23]

配列番号 67に記載の塩基配列からなるプラスミドベクター pVGW2。

[態様 24]

態様 18ないし 23のいずれ力 1項に記載のプラスミドベクターを含むァグロバクテリウム属細菌を用いて植物を形質転換する、ことを含む、植物の形質転換方法。

図面の簡単な説明

[図 1]図 1は、ベクター pSB200PcHmの模式図である。

[図 2]図 2は、ベクター pSB25UNpHmの模式図である。

[図 3]図 3は、ベクター pSB200PcHmGWHの模式図である。

[図 4]図 4は、ベクター pSB200PcHmGWBの模式図である。

園 5]図 5は、ベクター pLC40の構築手順を示した図である。

[図 6]図 6は、ベクター pLC40の模式図である。

[図 7]図 7は、ベクター pLC40GWHの模式図である。 [図 8]図 8は、ベクター pLC40barの模式図である。

[図 9]図 9は、ベクター pLC40GWBの模式図である。

[図 10]図 10は、ベクター pLC40GWHkorBの模式図である。

[図 11]図 11は、ベクター pLCleoの模式図である。

[図 12]図 12は、ベクター pLCSBGWBSWaの模式図である。

[図 13]図 13は、ベクター pLC40GWHvGlの模式図である。

[図 14]図 14は、ベクター pVGWの模式図である。

[図 15]図 15は、ベクター pVGW2の模式図である。

[図 16]図 16は、 pLCベクターによるゲノム DNA断片のクローユングの結果を示す。テオシントゲノム DNA断片の例を示す。 Ml :マーカー（1 kb ladder)、 M2:マーカー（ λ -Hindlll)、番号：クローン番号、矢印： pLC40GWHのバンドの位置（13.2 kb)。テオシントライブラリーから 11個のクローンのプラスミド DNAを精製した。プラスミドインサートの両端にあるマルチクローニング部位の制限酵素 Hindlllと Saclで切断し、ァガロースゲル (0. 8%)電気泳動に供した。

[図 17]図 17は、ゲノム DNA断片のイネへの導入の結果を示す（B断片中央部）。 M : マーカー、 Yu :ユキヒカリ、 Ru :オリザ'ノレフィポゴン、 Transgeni 形質転換イネ（二個体)。形質転換イネでは、ユキヒカリに由来するバンドに加え、オリザ'ルフィポゴン由来のバンドが検出された。

実施例

[0142] 以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾 ·変更を加えることができ、それらも本発明の技術的範囲に含まれる。

[0143] 実施例 1 PLCシリーズのコスミドベクターの構築

下記の手順において、分子生物学的実験手法は、特に指定しない限り、 Sambrook J. and Russell D.W. 2001. Molecularし lomng, A Laboratory Manual, 3rd edn.し old Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA.に従った。

[0144] 1) T— DNA領域の構築

pSB200 (WO2005/040374)の EcoRV部位に Paclリンカ一 (gttaattaac) (酉己歹 IJ番号 10)を揷人し、 pSB200Pacを構築した。 pSB25 (Ishida et al. 1996)のカリフラワーモザイクウィルス 35Sプロモーターをトウモロコシのュビキチンプロモータ一（Christensen et al. 1992 Plant Mol Biol 18: 675-689)に変換した pSB25Uを構築した。制限酵素 NspVおよびホーミングエンドヌクレアーゼ I Seelの認識部位を有するアダプター HinNspISceRV、 HinNspISceFW (表 1)をアニーリングさせた。この一部を、ポリヌクレオチドキナーゼ（PNK、 Amersham社）を用いて、リン酸化した。これを pSB200Pacの Sacl部位、並びに pSB25Uの Hindlll部位に常法に従いクローニングした。完成したプラスミドを、それぞれ、 pSB200PacHml、および、 pSB 25UNpHmlと命名した。

[0145] pSB200PacHml、および、 pSB25UNpHmlの Spel部位に、ホーミングエンドヌクレアーゼ I— Ceul部位が組み込まれたアダプター SpeICeuRV、 SpelCeuFW (表 1)を導入した。この操作で pSB200Pacの Sacl部位、 Spel部位にそれぞれ、ホーミングエンドヌクレアーゼ部位 I— Scel、 I— Ceulを挿入したベクター pSB200PcHm (図 1)、 PSB25Uの Hindlll部位、 Spel部位にそれぞれ、ホーミングエンドヌクレアーゼ部位 I— Scel (+ NspV site)、 I— Ceulを挿入したベクター pSB25UNpH m (図 2)を完成した。 I— Scel、 I— Ceulによる切り出しを確認し、 ABI PRISM蛍光シークェンサ一（Model 310 Genetic Analyzer , Perkin Elmer社製）を使用して、塩基配列チェックを行い、単一アダプターの挿入を確認した。これらのベクタ一では、 I— Scel 選抜マーカーユニット LB— I— Ceulを切り出すことができる。

[0146] [表 1]

表 1

ブライマー名配列長さ

H i nNsp l S ceRV 5' -AgC TTT CgA ATA ess ATA ACA see TAA T- 3' 28 mer

H i nNs I S ceFW 5' - AgC TAT TAC CCT gTT ATC CCT ATT CgA A - 3' 28 mer

Spe l CeuRV 5' CTA gTA ACT ATA ACg gTC CTA Agg TAg CgA C-3' 31 mer

Spe l CeuFW 5' -CTA ggT CgC TAC CTT Agg ACC eTT ATA gTT A-3' 31 mer 上から順に配列番号 2 3— 2 6

次に、 pSB200PcHmを BamHIで消化し、ハイグロマイシン耐性遺伝子（hpt)を除去した後、平滑化を行った。これを、 aatRl _ccdB_Cm_aatR断片（Invitroge n)とライゲーシヨンし、大腸菌 DB3. 1に導入してクロラムフエ二コール耐性コロニーを選抜し、 Destinationベクター、 pDEST3342を作成した。次に、 BP反応により p D〇NR/Zeoプラスミド（Invitrogen)へマーカー遺伝子を導入するため、 aatB配列を含む以下のプライマーを合成した（大文字が aatB配列）。

[0147] [表 2]

表 2

プライマー名配列長さ aa tBl-HPT ggg gAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTc aa t gag a ta t ga aaa age c 49me r

HPT-aatB2 ggg gAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTc t a t tec t t t gcc e tc gga cga g 52mer aatBl-bar ggg gAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTc c a t gga ccc aga acg acg c 49mer bar-aa tB2 ggg gAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTt cc t aga cgc gtg aga tea g 49mer 上から順に配列番号 2 7— 3 0

Hpt遺伝子の増幅には、铸型 DNAとして Bilang et al. (1991) Gene 100: 247-250 に記載の hpt遺伝子を用いた。プライマーとして aatBl _HPT、 HPT_ aatB2を、フォスフイノトリシン耐性遺伝子（bar)の増幅には铸型 DNAとして pSB25 (Ishida et al. 1996)を、プライマーとして aatBl _bar、 bar_ aatB2を用いた（表 2)。 PCRは、 ΙΟΟ μ Ιの反応液中に錡型 DNA 10ng、 25pmolesのプライマーを加え、サイクノレ数は 35とした。反応終了後、エタノール沈殿により産物を回収して、 BP Clonase Enzyme Mixキット（Invitrogen)添付のプロトコールに従って BP反応（25°C、 6時間）を行レ、、大腸菌 DH5ひへ導入し、抗生物質 Zeocin入りの low salt LAプレート上で目的プラスミドが組み込まれた大腸菌を選抜した。制限酵素分析を行い最終的に得られたプラスミドについて、塩基配列の確認を行い、それぞれ pENT— HPT wtおよび pENT— barを完成した。

[0148] 先に作成した Destination vector (pDEST3342)および entry vector (pENT — HPTwtおよび pENT— bar)を用いて、 LR反応により最終目的プラスミドの作成を行った。 GATEWAY LR Clonase Enzyme Mixキット添付のプロトコールに従レ、、 20 i 1の反応 ί夜 (Destination vectorおよび entry vectorを各々 300ng使用 )中、 25°Cで 4時間反応させた後、大腸菌 DH5 aへエレクト口ポレーシヨンで導入した。スぺクチノマイシン添加の LAプレート上に生育したコロニーよりプラスミド DNAを調整し、制限断片パターンにより候補クローンを選抜した。塩基配列解析により aatB 配列および HPT遺伝子配列または bar遺伝子配列が組み込まれていることを確認し、各々 pSB200PcHmGWH (図 3)、および pSB200PcHmGWB (図 4)と命名した [0149] 2)コスミドベクター pLC40の構築

IncPプラスミド pVK102 (Knauf and Nester, Plasmid 8: 45-54, 1982)の oriVを含む DNA断片、 oriTを含む DNA断片、 incC2遺伝子を含む DNA断片、 trfAl遺伝子を含む DNA断片、 pBI121由来の nptlll遺伝子、および、 pSBl l由来の cosを含む DNA断片を増幅させる PCRプライマーとして〇riV3' ClaFW、 OriV5' PvNhEc, OriT5 ' BglRV、 OriT3 ' SpEcFW、 InC5， XbRV、 InC3， BgEcFW 、 R5， XhoIR V、 R3，BmEcFW、 121KIII5 ' NspV、 121KIII3' Sall、 COS5，BmRV、 COS3' MunFWを設計し、 Pyrobest DNA Polymerase (Takara社製）を用いて PCR反応を行った (表 3)。

[0150] 各プライマーには後に使用する制限酵素部位が組み込まれている。 trfAl遺伝子以外の PCR産物、即ち、 pVK102由来の oriVを含む DNA断片（884bp)、 oriTを含む DNA断片（810bp)、 incCl遺伝子を含む DNA断片（2118bp)、 pBI121由来の nptlll遺伝子を含む DNA断片（1087bp)、 pSBl l由来の cosを含む DNA断片を、それぞれベクター pCR2. ΙΤορο Blunt (Invitrogen社製）にクローニングした。その結果、 oriVを含む DNA断片には、公開データベース（Genbank accessi on L27758)中の対応する塩基配列と比較すると、 2個の塩基置換と 1個の塩基付加が見つかった。これらの変異は铸型プラスミドにも見つ力たので、原因は PCRによる変異ではなぐ铸型プラスミドが公開データベース中の配列とは異なる塩基配列を有していたものであった。 oriT 、 incCl遺伝子、 cosはデータベースの塩基配列と全く同一であった。なお、 trfAl遺伝子は、単独ではクローニングできなかった。そこで以下の方法で構築を進めた。

[0151] oriVを含む DNA断片がクローン化されたプラスミドを、制限酵素 EcoRI、 Clalで消化し、 0. 9kb断片を純化した。同様に oriTを含む DNA断片を EcoRIと BglII、 nptll Iを含む DNA断片を NspVと Sailで消ィ匕、精製した。また、 trfAl遺伝子を含む DN A断片に関しては PCR産物をエタノール沈殿した後、 Xholと BamHIで消化して、精製した。これら 4断片（oriV、 trfAl遺伝子、 nptIII、 oriT)に関して、ライゲーシヨン反応を行い、 4断片をまとめて一度にクローユングした。完成したプラスミド (pVRKT と命名）の塩基配列の解析を行ったところ、公開データベース（Genbank accessio n L27758)中の対応する塩基配列と比較すると、 trfAl遺伝子を含む DNA断片にフレームシフトを伴う変異が検出されたが，铸型とした pVK102にも同様の変異が見つかり、原因は PCRによるものではなぐ铸型とした pVK102には公開データべ一ス中の配列とは異なる塩基配列が含まれていたものと結論した。

[0152] 完成した 4断片を含むプラスミド pVRKTを EcoRI、 Spelで消ィ匕し、ここへ incCl遺伝子が組み込まれたプラスミドを EcoRI、 Xbalで消化して回収した incCl遺伝子を含む DNA断片を揷入した。完成したプラスミドをさらに、 EcoRI、 Bglllで消化し、 co sを含む DNA断片が組み込まれたプラスミドを Munl、 BamHIで消化して回収した c osを含む DNA断片を導入し、 oriVを含む DNA断片、 trfAl遺伝子を含む DNA断片、 nptlllを含む DNA断片、 oriTを含む DNA断片、 incCl遺伝子を含む DNA断片、 cosを含む DNA断片の 6断片からなる低コピーベクターの骨格 p6FRG (約 8.5 kb)が完成した (配列表の配列番号 1)。以上のクローニング手順を模式図 5にまとめた。 p6FRGプラスミドの PvuII, Nhel部位へ、 pSB200PcHmの T— DNA領域（Ss pi— Spel断片）を組込み、ベクター pLC40を完成した（図 6、配列表の配列番号 2)。

[0153] [表 3]

表 3

プライマー名配列標的遺伝子長さ

121KI 115'NspV 5' - TCg TTC gAA Kg ATA CTA TgT TAT ACg CCA AC-3' nptl 11 32 mer

I21KI 113' Sal 1 5'- ATC gTC gAC TgC ACg AAT ACC AgC gAC CC-3' 29 mer

C0S5'BmRV 5' ggg ggA TCC TTC CAT TgT TCA TTC CAC ggA C-3' os 31 mer

C0S3'MunFW 5'- ggg CAA TTg ACA TgA ggT TgC CCC gTA TTC -3' 30 er

0riV3'ClaFW 5'- gAT ATC gAT AgC gTg gAC TCA Agg CTC TC-3' oriV 29 mer

0riV5' PvNhEc 5' - AAA gAA TTC gCT AgC CAg CTg gCg CTg CCA TTT TTg ggg Tg-3' 41 mer

R5'XhDlRV 5'- AAA CTC gAg CAg CCg AgA ACA TTg gTT CC-3' trfAl 29 mer

R3'BmEcFW 5' - TAg gAA TTC ggA TCC AAA ACA ACT gTC AAA gCg CAC- 3' 36 mer

0riT5' BglRV 5'- Cg丁 AgA TCT ggC gCT Cgg TCT TgC CTT g-3' or iT 28 mer

0riT3' SpEcFW 5'- TgT gAA TTC ACT AgT gAT ATT CCA CAA AAC AgC Agg g-3' 37 mer

InCS'Xb V 5'- CCg TCT AgA TTC gAg CCA Cgg Tag Cgg C-3' incC2 2S mer lnC3'BgEcFW 5' - CTT gAA TTC AgA TCT TCT Cgg Cgg CgA TCA CgA C-3' 34 mer 上から順配列番号 3 1 -42

3)その他の pLCシリーズのコスミドベクターの構築

PLC40GWH

pSB200PcHmGWHの骨格部にある 2つの Ball部位のうち、 RBの左側にある部位はメチル化のため、切断されない。そこで pSB200PcHmGWHを一旦大腸菌株 GM48に導入し、同部位のメチル化を除去してから以下の実験に用いた。 pSB200 PcHmGWHを Ball、 Spelで処理し T— DNAを含む領域を切り出し、上述の 6FRG の PvuII、 Nhel部位にクローニングし、 pLC40GWHを完成した（図 7、配列表の配列番号 3)。 pLC40との相違点は attBl , 2配列の挿入と RB上流域 Sspl— Ball 31 7bpの欠失である。

[0154] pLC40bar. PLC40GWB. PLC40GWBSW

pSB25UNpHm, pSB200PcHmGWBを制限酵素 Spel、 Ssplで消化、 T— D NAを含む部分を回収した。これらの断片を、 p6FRGの PvuII、 Nhel部位にクローユングし、それぞれ pLC40bar (図 8、配列表の配列番号 4)、 pLC40GWB (図 9、配列表の配列番号 5)を完成した。 pSB200PcHmGWBを NspVで処理し、平滑末端ィ匕、脱リン酸化した。ここへ pSwalリンカ一（表 4)を組み込んだ（pSB200PcHmGW BSW)。このプラスミドを制限酵素 Spel、 Ssplで消ィ匕、 T—DNAを含む部分を回収した。これらの断片を、 p6FRGの PvuII、 Nhel部位にクローニングし、 pLC40GWB swを完成した。

[0155] DLC40： 35S— IGUS、 DLC40GWB： 35S— IGUS

ベクター pSB24 (Komari et al. 1996)を制限酵素 HindIII、 EcoRIで処理し、 35S プロモータ一- I-GUS遺伝子 NOSターミネータ一力なる DNA断片を切り出した。さらに Klenow処理で平滑末端化した後、 3. lkb断片を精製、回収した。上述のコスミドベクター PLC40を制限酵素 NspVで処理し、 Klenow酵素により平滑末端化した後、脱リン酸化し、精製した。また、 PLC40GWBSWを制限酵素 Swalで処理し、脱リン酸化した後、ゲル精製した。これらのベクターに、上記の GUS遺伝子を含む D NA断片を導入し、それぞれ pLC40 : 35S— IGUS、 pLC40GWB : 35S— IGUSを作成した。

[0156] pLC40GWHKorB

pLCベクターの IncClのクローニング領域を広げ、 korB遺伝子を含むようなベクタ一 pLC40GWHKorBを構築した。 IncP系プラスミド pVK102の IncCl-KorBを含む DNA断片を増幅するプライマー、 IncC3 'BgEcFw (上述）、 IncC/KorB-Xba # 1 (表 4)を設計した。各プライマーには後で使用する制限酵素部位が組み込まれている。 PCR反応は以下のように行った。 50 μ 1の反応液中に、 pVK102プラスミド D NA500ng、 10 X PyrobestBuffer II 5 μ 1、 2. 5mM each dNTPs 4 μ 1、 primer 50pmoles、 Pyrobest DNA Polymerase (Takara社製) 0. 5 μ 1をそれぞれ含み、 Mastercyclergradient (eppendorf社）を用いて、 96°C 3分を 1回、 96°C 1分、 55°C 1分、 72°C 2分 30秒を 10回行った。その結果、 IncCl— korBの PCR産物（ 3065bp)が増幅されたので、これをベクター pCR2. ΙΤορο Blunt (Invitrogen社製）にクローユングした。ライゲーシヨン反応はベクターキット添付の説明書きに従つた。大腸菌 DH5ひにエレクト口ポレーシヨン法を用いて DNAを導入し、抗生物質ゼォシン（25 μ g/ml)を含んだ 2 X YT寒天培地上で 37°Cでー晚培養した。生育したコロニーを铸型に、 IncCl—KorB増幅に用いたのと同じプライマーセットでコロニーダイレクト PCRを行レ、、候補クローンを選抜した。 PCR条件は 20 μ 1の反応液中に、 1 0 X Extaq Buffer 2 μ丄、 2. 5mM each dNTPs 1. 6 μ 1、 primer 5 pmoles、 Ext aq DNA Polymerase (Takara社製) 0. 4 μ 1をそれぞれ含むよう調整し、反応液にコロニーを懸濁した上で Wastercycler gradientを用いて、 96°C 3分を 1回、 96°C 1分、 55°C 1分、 72°C 2分 30秒を 30回行った。その結果、約 3kbの PCR産物が増幅されたものを候補クローンとした。これらのクローンに関して ABI PRISM蛍光シータエンサー (Model 3100 Genetic Analyzer, Applied Biosystems社製)で、塩基配列を決定した。その結果、 IncCl - KorBの塩基配列はデータベースのものとまったく同一であった。

[0157] 次に、前述のプラスミド pVRKTを EcoRI、 Spelで消ィ匕し、ここへ IncCl—KorBが組み込まれたプラスミドを EcoRI、 Xbalで消化して回収した IncCl—KorB断片を揷入した。完成したプラスミドをさらに、 EcoRI、 Bglllで消化し、前述の cos断片（Muni — BamHI断片）を組み込み、 oriV、 trfAl、 nptIII、 oriT、 IncCl -KorB, cosの 6 断片力、らなるプラスミド P6FRG2が完成した。 p6FRG2プラスミドの PvuII, Nhel部位へ PSB3342GWH由来の T—DNA領域（Ball— Spel断片）を組込み、ベクター pL C40GWHKorBとした（図 10、配列番号 65)。

[0158] pLC40GWHKorBPI

クローユングされているゲノム大断片をそのままの形で切り出せるよう、マルチクローユングサイト上流にホーミング酵素 PI_ SceIの認識部位を追加した。 pLC40GWH KorBを Hindlllで消化し、 PI— Seelアダプター（PI— SceIFw、 PI— SceIRv、表 4) を組み込んだものを pLC40GWHKorBPIとした。

[0159] DLC40GWHKorBPIattB3

PLC40GWHの選抜マーカーのプロモーターを Gatewayシステムにより任意のものと交換できるよう、ュビキチンプロモーター上流に attB3サイトを追加した。 pLC40

GWHKorBPIを I— Seelで消化し、 attB3アダプター（attB3Fw、 attB3Rv、表 4) を組み込んだものを pLC40GWHKorBPIattB3とした。

[0160] pLCleo

Notlで消化したゲノム断片をクローニングできるよう、マルチクローニングサイトに P spOMI(NotIと同じ粘着末端を生成）の認識部位を作成し、同時にュビキチンイントロン内にある Apal (PspOMIのネオシゾマー）の認識部位を破壊した。 pLC40GW HKorBPIattB3を Apalと Nhelで消化し、 Apalm— Nhelアダプター（ApaIm_Nh eIFw、 Apalm— NheIRv、表 4)を組み込んだものを pLC40GWHKorBPIattB3A palmとした。このプラスミドを Hindlllと NspVで消化し、 Hindlll— PspOMI— NspV アダプター（HindIII— Psp〇MI—NspVFw、 Hindlll - PspOMI - NspVRv,表 4) を組み込んで pLCleoを完成した（図 11、配列表の配列番号 66)。

[0161] [表 4]

表 4

プライマ一/アダプタ一名配列（5' -3' ) 長さ lncC/KorB-Xba#1 CGG TCT AGA GTG CGC AGC AGC TCG TTA TC 29 raer

AGC TAT CTA TGT CGG GTG CGG AGA AAG AGG TAA TGA AAT GGC A 43ner

PI-ScelRv AGC TTG CCA TTT CAT TAC CTC TTT CTC CGC ACC CGA CAT AGA T 43mer attB3F CAG GGT AAT CAA CTT TGT ATA ATA AAG TTG ATA A 34ner attB3 v CAA CTT TAT TAT ACA AAG TTG ATT ACC CTG TTA T 34mer

Apalra-Nhe!Fw GGGTAGTTCTACTTCTGTTCATGTTTGTGTTAGATCCGTGTTTGTGTTAGATCCGTGCTG 60mer

Apalra-NhelRv

CTAGCGCCGGATCTAACACAAACACGGATCTAACACAAACATGAACAGAAGTAGAACTACCCGGCC 66mer

Hindi 11-PspOMI- ■NspVFw AGC TTG GGC CCT T 13mer

Hindl 11-PspOMI- ■NspVRv AGG GCC CA 8mer 上から順に配列番号 68- 76

p6FRGSwKp

p6FRGを PvuII処理し、脱リン酸化した。 Swalおよび Kpnlの認識部位を有するァダプター SwaIKpnIRV、 SwalKpnIFW (表 5) DNAをァ二一リングさせた。この一部を、 PNK(Amersham)を用いて、リン酸ィ匕した。この Swal— Kpnlリンカ一を、 p6 FRGの PvuII部位に組み込み、 p6FRGSwKpを完成した。 Kpnl部位は次のステツプのァグロバクテリウムの菌株 A281に由来する virB遺伝子および virG遺伝子を有する DNA断片のクローニング用、 Swal部位はさらに次のステップの T— DNAクローユング用に設計した。

[表 5]

表 5

リンカ一/アダプター名称 K列長さ

pSwal リンカ一 tgg-3¹ 12 mer

SwalKpnlRV 5' - cca 111 aa£ Ϊ tgg tac egg- 3, 18 mer

SwalKpnlFW 5' -ccg gta cca t tt aaa tgg -3' 18 mer

上から順に配列番号 43-45

^6FRGSVR^6FRGSVRF

ベクター pSBl (Komari et al.1996)を Kpnlで消化し、 virB遺伝子と virG遺伝子を含む 14.8kbの DNA断片を回収した。この断片を、 p6FRGSwKpを Kpnl処理し、脱リン酸化したベクターへ組み込み、 P6FRGSVRならびに p6FRGSVFを完成した

[0163] PLCSBGWBSW

pSB200PcHmGWBSWを Spel、 Ssplで消化し、 T_ DNA領域を含む DNA断片を、 Klenow酵素により平滑末端化した。この断片を p6FRGSVRを Swal消化して、脱リン酸化したベクターに組み込み、 pLCSBGWBSWを完成した（図 12、配列表の配列番号 6)。本ベクターは全長およそ 28kbの低コピーベクターであり、ァグロバタテリゥムの菌株 A281に由来する virB遺伝子と virG遺伝子を含んでおり、トウモロコシの形質転換に使用できると考えられる。また cos部位が組み込まれているため、パッケージング反応によって 10〜20kb程度の DNAが容易にクローニングできる。

[0164] 4) virG組み込み型 pLCベクター

PLC40シリーズのコスミドベクターによる植物形質転換の効率を向上させる手段として、下記の手順により、 pLC40GWHベクターに virG遺伝子を組み込んだベクタ一 pLC40GWHvGを構築した。

[0165] virG遺伝子の調製

virG遺伝子（プロモーター、構造遺伝子、 3'領域を含む）を増幅するプライマー vir GProSm、 virGTerSmを設計、合成した。これらのプライマーと铸型 DNAとして pT ΟΚ47 (Jin et al. 1987 J Bacteriol 169: 4417-4425)を用いて、 virG遺伝子を PCRによって増幅した。その結果、およそ lkbの PCR産物が増幅された。この一部を、上記の同様の方法で、ベクター pCR2. ΙΤορο (Invitrogen社製）にクローニングし、塩基配列を確認した。 VirG遺伝子の DNA配列には、 NspV部位がある。この制限部位は後のベクターでクローニング部位として用いる。そこで、この部位を、 PCRによる変異導入で消去した。 NspV部位 (ttcgaa)中の一つ目のアデニンをグァニンに変化させた（ttcgga)プライマー virGonNspVRV、およびその相補配歹 iJvirGonNspVFW を設計、合成した。 VirGonNspVFWと virG遺伝子プロモーター上流にセットしたプライマー _virGProSpe、ならびに virGonNspVRVと virG遺伝子ターミネータ一下流にセットしたプライマー virGTerSpeの 2組のプライマー組合せで PCRを行った。铸型として PCR2. ΙΤοροにクローニングされた virG遺伝子を用いた。その結果、前者の組合せでおよそ 400bpの産物力後者の組合せでおよそ 600bpの産物が増幅された。これらの産物を精製し、次の PCR反応の铸型に用いた。精製された 2種類の P CR産物を铸型に、先のプライマー virGProSpe、 virGTerSpeを用いて PCR反応を行った。その結果、およそ lkbの PCR産物が増幅された。 PCR産物を pCR2. ΙΤορ oベクターにクローニングし、塩基配列を決定し、変異導入 (ttcgaa→ttcgga)を確認した。

[0166] また、同様に変異無し virG遺伝子を virGProSpe、 virGTerSpeを用いて PCRで増幅し、 pCR2. ΙΤοροにクローニングし、塩基配列を確認した。 PCRに用いたプライマ一を表 6にまとめた。

[0167] [表 6]

表 6

名称配列 5' -3' 長さ

v i rGProSm TCA ATA CCC ggg gTA ACC TCg AAg CgT TTC AC 32me r v i rGTerSm Tgg TgA CCC ggg ACC TAT Cgg AAC CCC TCA C 31 me r v i rGProSpe TCA ATA ACT AgT gTA ACC TCg AAg CgT TTC AC 32mer v i rGTerSpe Tgg TgA ACT AgT ACC TAT Cgg AAC CCC TCA C 31 me r v i rGonNspV V CTT gAg ATC gTT Cgg AAT CTg 21 me r i rGonNspVFW CAe ATT CCg AAC gAT CTC AAg 21 me r 上から順に配列番号 4 6 - 5 1

£LC40GWHvGl、 j)LC40GWHvGCl ベクター PLC40GWHを制限酵素 PvuIIで消化し、脱リン酸化した。ここへ Spelリンカー（GACTAGTC、 Takara社製）を導入し、 pLC40GWHSpeを作成した。このプラスミドを制限酵素 Spelで消化し、脱リン酸化した。ここへ、変異導入を施した上記 virG遺伝子をベクターから Spelで切り出したおよそ lkbの断片を揷入し、 pLC40G WHvGl (図 13、配列表の配列番号 7)を作成した。また同様に、変異無し virG遺伝子を、 pLC40GWHSpeへ導入し、 pLC40GWHvGClを作成した。

[0168] PLC40GWHVG1： 35S— IGUS、 pLC40GWHvGCl： 35S— IGUS

上記と同様に、ベクター pSB24 (Komari et al. 1996)を制限酵素 HindIII、 EcoRI で処理し、 GUS遺伝子を含む DNA断片を切り出し、 Sgf I - Hindlll - EcoRI - Sgf Iの並びのマルチクローニング部位をもつベクターの同制限部位にクローニングした。完成したプラスミドを Sgflで消化し、 GUS遺伝子を含む DNA断片を回収した。この時点で、 GUS遺伝子を含む DNA断片の両端は Sgfl部位である。上述コスミドベクタ一 pLC40GWHvGlを制限酵素 Paclで処理し、脱リン酸化した。ここへ 3. 1 kb S gfl断片（GUS遺伝子を含む DNA断片）をクローニングし、 pLC40GWHvGl： 35S — IGUSを完成した。また同様に、 35S— IGUS— NOSを、 pLC40GWHvGClへ導入し、 pLC40GWHvGCl : 35S— IGUSを作成した。

[0169] 5) pLCと共存可能な virG組み込みベクター

DVGW

pT〇K47は、 virGおよび virBを含むおよそ 28kbの大型の IncWプラスミドである（J in et al. 1987 J Bacteriol 169: 4417-4425)。そこで、より小さなサイズで、かつ pLCベクタ一と共存できる複製開始点 IncW ori、 virG遺伝子、ならびに選抜マーカー遺伝子を有するベクター（pVGWと命名）を設計、構築した。

[0170] pTOK47 (Jin et al. 1987 J Bacteriol 169: 4417-4425)由来の IncW oriを含む断片を増幅するプライマー pSa5，EcT22、 pSa3，BglII、 pPHlJI (Hirsch and Beringer 1984 Plasmid 12: 139-141)由来のゲンタマイシン耐性遺伝子（ゲンタマイシンァセチルトランスフェラーゼ）を増幅するプライマー Gm5， Bm、 Gm3 ' Xh_ 2ndを設計した (表 7)。各プライマーには後で使用する制限酵素部位が組み込まれている。铸型としてそれぞれ、 pTOK47、 pPHlJIを用いた。 Pyrobest DNA Polymerase (Ta KaRa社製）を用いて PCRを行った。その結果、 IncW oriを含む断片としておよそ 2 . 7kbの DNA力ゲンタマイシン耐性遺伝子としておよそ 0. 7kbの DNAが増幅され

[0171] 一方、 pTOK47由来の virGの 54番目のアミノ酸残基を PCRによる変異導入で N から Dに変える（virGN54D、 Hansen et al. 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 760 3-7607)プライマー virGN54DFW、およびその相補配歹 [JvirGN54DRVを設計した。 virGN54DFWと virG遺伝子プロモーターの 5，側にセットしたプライマー virGPro Sal、ならびに virGN54DRVと virG遺伝子ターミネータ一の 3'側にセットしたプライマー virGTerPstの二組のプライマーセット（表 7)で PCRを行った。錡型として ρΤΟ Κ47プラスミドを用いた。その結果、前者の組み合わせでおよそ 0. 4kb、後者の組み合わせでおよそ 0. 7kbの産物が増幅された。これらの産物を精製したものを铸型とし、先のプライマー virGProSal、 virGTerPstを用レ、、さらに PCR反応を行った。その結果、およそ 1. lkbの産物（virGN54D)が増幅された。

[0172] IncW oriを含む断片、ゲンタマイシン耐性遺伝子、ならびに virGN54Dの PCR 産物を pCR— Blunt II-TOPO vector (Invitrogen社）にクローニングした。塩基配列を決定し、公開配列（Genbank/EMBLァクセッション番号： U30471)と比較した結果、 IncW oriを含む断片には 6塩基の欠失があった力この欠失は铸型に用いた PTOK47にも見つかった。一方、ゲンタマイシン耐性遺伝子はデータベースの塩基配列と完全に一致した。 virGN54Dは目的の位置に変異導入が確認された

[0173] IncW oriを含む断片がクローニングされたプラスミドを EcoT22I、 Bglllで消化、 2 . 7kb断片を回収した。同様にゲンタマイシン耐性遺伝子を BamHIと XhoI、 virGN 54Dを Sailと Pstlで消化し、各フラグメントを精製した。これらの 3断片をまとめてライゲーシヨン反応（Bglllと BamHI、 Xholと Sall、 Pstlと EcoT22Iはそれぞれ同じ付着末端）を行い、 pVGWを完成した（図 14、配列表の配列番号 8)。

[0174] [表 7] 表 7

名称配列長さ pSa5'EcT22 5' -aaa atg cat ggc atg ttt aac aga ate tg-3¹ 29mer pSa3'Bgl f I 5' -ttt aga tct act cgt tcg egg age tgg-3' 27mer

Gtn5' Bm 5' -aaa gga tec ttc atg get tgt tat gac tg-3' 29mer

Gm3' Xh-2^nd 5' -tgc etc gag aca at t tac cga aca act ccg-3' 30mer virGN54DFW 5' -cga cct aaa tct aga tea aca ac-3' 23mer viGN54DRV 5' -gtt gtt gat cta gat tta ggt cg-3' 23mer virGProSal 5' -ttt gtc gac cat agg cga tct cct taa tc-3' 29mer i rGTerPst 5' -aaa ctg cag gtg aag agg gac cta tcg g-3' 28mer 上から順に配列番号 52 - 59

DVGW2

pVGWの利便性を一層高めるため、ゲンタマイシン耐性遺伝子のプロモーター領域を広げ、さらにクローニングサイトを組み込んだベクター PVGW2を構築した。ブラスミド pPHlJIのゲンタマイシン耐性遺伝子を増幅するプライマー、 BamSmaGmPro 、 NhelsiteGmRv,および pVGWの virG— IncW領域を増幅するプライマー、 'Msc Isite_virG5'Fw (以上表 8)、 'pSa3' Bglll (前述)を設計した。各プライマーには制限酵素部位が組み込まれている。 PCR反応は以下のように行った。 50 μΐの反応液中に、錡型プラスミド DNAlng、 2 X Prime STAR Max Premix (Takara社製） 25 μ 1、 primer 15 pmoles それぞれ' a—み、 Mastercycler gradient (eppendorf社) を用レヽて、 98°C 30秒を 1回、 98。C 10秒、 55°C 5秒、 72°C 1分を 35回行った。その結果、ゲンタマイシン耐性遺伝子（826bp)および virG— IncW領域 (3840bp)の P CR産物が増幅された。ゲンタマイシン耐性遺伝子についてはベクター pCR_Blunt II— TOP〇（Invitrogen社製）にクローニングし、エレクト口ポレーシヨン法を用いて大腸菌 TOP10(Invitrogen社)へ導入した。抗生物質カナマイシン (50 /i g/ml)を含んだ LB寒天培地上で 37°Cでー晚培養し、得られたコロニーからプラスミドを精製した。これらのクローン (pCR— Gm)に関して ABI PRISM蛍光シークェンサ一（Mo del 3100 Genetic Analyzer, Applied Biosystems社製）で塩基配列を決定し、 PCRエラーによる変異のないことを確認した。プラスミド pCR— Gmを BamHI、 P vullで消化して Gm断片を回収し、 Bglllで消化した virG— IncW断片（片端は Bglll 末端、もう片端は平滑末端）とライゲーシヨンした。得られたクローンはエレクトロボレーシヨン法により大腸菌 TOP10へ導入し、抗生物質ゲンタマイシン（30/i g/ml)を含んだ LB寒天培地上で選抜した。生じたコロニーからプラスミドを精製し、シークェンサ一により PCRエラーがないことを確認して pVGW2を完成した（図 15、配列表の配列番号 67)。

[表 8]

表 8

名称配列長さ

BamSmaGtnP ro 5 ' -AAA GGA TCC CGG GTT GAC ATA AGC CTG TTC GGT TCG-3 ' 36me r

Nhe l s i t eGm v 5 ' -AAA GCT AGC AAT TTA CCG AAC AAC TCC GCG G_3 ' 31 mer

Msc 1 s i t e-v i rGs Fw 5 ' -AAA TGG CCA TAG GCG ATC TCC TTA ATC AAT - 3' 30mer 上から順に配列番号 7 7 - 7 9

実施例 2 わ LCベクタ一による大断片のクローニング

pLC40、 pLC40GWH、 pLCleo、 pLC40GWHvGl、 pSB200、 pSB200PcH mGW、または pSB25Uで作製した、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana, ec otype： Colombia)、野生ィネ ·オリザノレフィポゴン (Oryza rufipogon)、スーダングフス (Sorghum sudanense)、極早生ィタリアンミレット (Setaria italica)、テオシント Zea diploperenms;、ノヽーノレレット (Pennise um typhoideum)、ノヒ/ グフス (Paspalum notatum Fluggeノ^ ίりび ίこサトゥキヒ (Saccharum ofiicmar urn)のライブラリーを例に記載する。

[0176] 1)ゲノム DNAの調製

温室で育成した播種後およそ一ヶ月の植物体の若葉約 5gを乳鉢を用いて液体窒素下で粉砕した後、 CTAB法でゲノム DNAを精製した。収量は DNAでおよそ 500 〜600 μ gであった。植物ゲノム DNA 1 μ g当たり 0. 02〜0. 06Uの Taql酵素で部分分解した。部分分解後、 10〜40%のショ糖密度勾配遠心により、 30〜45kbのゲノム DNA断片が含まれる画分を回収した。

[0177] 2)ベクターの調製

コスミドベクター pLC40、 pLC40GWH, pLCleo, pLC40GWHvGl , pSB200、 pSB200PcHmGW、 pSB25U を制限酵素NspV (T〇YOB〇）で完全消化し、脱リン酸化した後、精製した。

[0178] 3)パッケージング反応を用いたクローニング

上記の調製後のベクターとゲノム DNA断片のライゲーシヨン反応を行レ、、さらに、 G igaPack III XL Packaging extractを用いて、室温で 2時間パッケージング反応を行った。反応後、大腸菌 GeneHogs (Invitrogen)を用いて、培養を行った。その結果、表 7に示すように、いずれの植物種、ベクターの組み合わせにおいても 1〜 10万 cfu (colony— forming— unit)のライブラリーを作製することが出来た（表 9)。

[表 9] 植物種ベクターライプラリー cf u

シロイヌナズナ PLC40 約 80000

pSB200PcHmGWH 約 100000

オリザルフィポゴン PLC40GWH 約 20000

PSB200 約 50000

極早生イタリアンミレツ卜 PLC40GWH 約 20000

pSB200PcHmGWH 約 20000

サトウキビ PLC40GINH 約 50000

pLC40GWHvGl 約 50000

スーダングラス PLC40GWH 約 50000

pSBZOOPcHmGWH 約 30000

パールミレツ卜 PLC40GWH 約 20000

テオシン卜 PLC40GWH 約 100000

pSB25UNpHm 約 20000

バヒアグラス pLC I eo 約 10000

4)クローニングされたゲノム DNA断片の解析

各ライブラリー 12〜24個のクローンからプラスミドを精製し、インサートの両端にあるマルチクローニング部位の制限酵素 Hindlllと Saclで切断したところ、 pSB200、 pS B25UNpHm、 pSB200PcHmGWの場合、解析した全てのクローンでベクター（9 . 2力、ら 9. 8kb)に木目当するノンド力 S、 pLC40、 pLC40GWH, pLCIeo, pLC40G WHvGlの場合、解析した全てのクローンでベクター（13. 2〜： 14. 2kb)に相当するバンドが現れた。各クローンのインサートの制限断片長を合計すると、クローニングされた大断片の長さの範囲は、 25kb〜45kbで、 pSBベクターの場合平均でおよそ 40 kb、 pLCベクターの場合は平均でおよそ 35kbであった。図 16にテオシントゲノム DN A/pLC40GWHの例を示す。

次にヒトゲノム（Human Genomic DNA， Male、 Promega社製、品番 G1471 )を Taqlで部分分解、 30〜40kb断片を調製、ベクター pLC40GWHにクローニングした。任意の 12クローンに関し、ヒトゲノム断片を含む大腸菌からプラスミド DNAを精製し、インサート両端の塩基配列を解読、データベースサーチを行った。データべ一スは NCBIの GenBank (http : //www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)を用レ、、 BLASTによる相同性検索を行った。その結果、単離した 12クローン中 11クローンが、それぞれ、データベース中のヒトゲノム断片を含む 11種類の単一クローンの中に含まれることが分かった。反復配列を含む 1クローンを除き、残り 10クローンに関して、データベース中のヒトゲノム配列と相同性を有する部分から、クローユングしたヒトゲノム断片の長さを推定すると、 28023bp、 31645bp、 38265bp、 39599bp、 319 65bp、 32631bp、 34727bp、 36925bp、 38794bp、 34364bpとなった。平均すると 34693. 8bpとなり、上述の植物ゲノムをクローユングした場合と良く一致した。

[0181] 次にクローン化した植物ゲノム DNA断片の両末端の塩基配列を決定した。得られた 300〜600塩基の配列データに関して、 NCBIの GenBank (http： //www. nc bi. nlm. nih. gov/BLAST/)および、北京 genomics instituteのデータべ一ス（http : //btn. genomics, org. cn: 8080/rice/)を用いて BLASTによる相同性検索を行った。その結果、オリザ'ノレフィポゴン、ァラビドプシスの場合、その全てのクローンで少なくとも lOObp以上の範囲にわたり、それぞれ、イネ、ァラビドプシスのゲノム配列と 87〜： 100%の相同性を示した。その他の植物種のライブラリーにおいても、イネ、ァラビドプシス、トウモロコシ、ソルガム、等の配列と有意な相同性を示した。

[0182] 実施例 3 三菌株接合法によるァグロバタテリゥムへの導入

1)三菌株接合法によるァグロバタテリゥムへの導入とその効率

植物ゲノム断片が導入された各ベクターは、下記のように、三菌株接合法によって、ァグロバタテリゥムに移行させた。

[0183] i) pLC40シリーズのコスミドベクター

PLC40シリーズのコスミドベクターは、カナマイシン（Km)とハイグロマイシン（Hm) 耐性である。宿主大腸菌として、 GeneHogs™(Invitrogen)を用いた。三菌株接合の際のへルパープラスミドとして、 pRK2073 (スベタチノマイシン（Sp)耐性）を用いた。ヘルパープラスミドの宿主大腸菌は HB101を用いた。ァグロバタテリゥム菌株は LBA4404 (薬剤耐性なし)を用いた。 [0184] まず適量のパッケージング反応希釈液を大腸菌 GeneHogs™に感染させ、 Km (5 0 μ g/mL)を含む LA培地に塗布し、 23°Cで 3日間培養した。出現したコロニー中の菌を爪楊枝を用いて、 Kmを含む LA培地に塗布し、 28°Cで 2晚培養した。一方 L BA4404は AB培地に塗布し、 25°Cで 5日間培養した。 HB10l/pRK2073は Sp ( 50 μ g/mL)を含む LAに塗布し、 37°Cで 2晚培養した。このように培養した、ゲノム断片をクローン化した PLC40シリーズのコスミドベクターを含む GeneHogs™、 LBA 4404、 HB10l/pRK2073の三菌株を NA培地上で混合し、 28°C—晚培養した。三菌株の混合物全量を 250 μ 1の滅菌水に懸濁し、 5 μ 1を Km (50 μ g/mL)と Hm (25 μ g/mL)を含む AB培地に塗布し、 28°Cで 7日間培養した。得られた組換えァグロバタテリゥムを植物形質転換実験に供試した。なお、この単一コロニーを Kmと H mを含む AB培地で再培養し、生育したコロニーの一部を薬剤を含む LA培地に塗布したところ、大腸菌はほとんど増殖してこないことが判明した。

[0185] ii) pSB200シリーズのコスミドベクター

PSB200シリーズのコスミドベクターは Spと Hm耐性である。宿主大腸菌として、 Ge neHogs™ (Invitrogen)を用いた。ヘルパープラスミドとして pRK2013 (Km耐性）を用いた。ヘルパープラスミドの宿主大腸菌として HB101を用いた。ァグロバクテリウム菌株として pSBlを含む LBA4404 (テトラサイクリン (Tc)耐性）を用いた。

[0186] まず適量のパッケージング反応希釈液を大腸菌 GeneHogに感染させ、 Sp (50 μ g /mL)を含む LA培地にて、 23°Cで 3日間培養した。コロニーを爪楊枝で拾い、 Sp を含む LA培地に塗布し、 28°Cで 2晚培養した。一方 LBA4404/pSBlは Tc (15 μ g/mL)を含む AB培地に塗布し、 25°Cで 5日間培養した。 HB101/pRK2013 は Km (50 μ g/mL)を含む LA培地に塗布し、 37°Cで 2晚培養した。このように培養した、ゲノム DNA断片をクローン化した pSB200シリーズのコスミドベクターを含む G eneHogs™、 LBA4404/pSBl , HB10l/pRK2013を、 NA培地上で混合し、 2 8°C1晚培養した。三菌株混合物全量を 250 μ ΐの滅菌水に懸濁し、 25 z l¾rSp (50 μ g/mL)、 Hm (25 μ g/mL)を含む AB培地に塗布し、 28°Cで 7日間培養した。得られた組換えァグロバクテリゥムを植物形質転換実験に供試した。

[0187] iii) pCLD04541 Texas A&M大学の Dr. Hongbin Zhangから入手した 2種類の、ベクター pCL D04541を用いて作成された、ゲノムライブラリー（イネ品種 C〇39のゲノム、並びにァラビドプシス ecotype Colombia、ともに平均インサート長 110 kb、宿主大腸菌は DH10B)を用いて三菌株接合を行った。 pCLD04541ベクターは Kmと Tc耐性である。ヘルパープラスミドとして pRK2073を用レ、、ヘルパープラスミドの宿主大腸菌として HB101を用いた。ァグロバタテリゥム菌株として LBA4404を用いた。

[0188] pCLD04541ライブラリーの各クローンを含む大腸菌を、 Tc (10 μ g/mL)を含む LAに塗布し、 28°Cで 2晚培養した。一方、 LBA4404は AB培地に塗布し、 25°Cで 5日間培養した。 HB10l/pRK2073は Sp (50 μ g/mL)を含む LAに塗布し、 37 °Cで 2晚培養した。このように培養した、ゲノム DNA断片をクローン化した pCLD045 41を含む DH10B、 LBA4404, HB10l/pRK2073を、 NA培地上で混合し、 28 °Cで 1晚培養した。三菌株混合物全量を 250 μ 1の滅菌水に懸濁し、数 μ 1を Km (25 μ g/mL)含む AB培地に塗布し、 28°Cで 7日間培養した。得られた組換えァグロバクテリゥムを植物形質転換実験に供試した。

[0189] 以上のようにして、 pLC40シリーズのコスミドベクター、 pSB200シリーズのコスミドベクター、および、 pCLD04541ベクターを用いて作成されたライブラリーに含まれるゲノムクローンを、ァグロバタテリゥムへ導入した。これらの三菌株接合の全容、ならびに三菌株接合の効率は表 7の通りである。 pLC系ベクターの場合、 97%の三菌株接合効率、 pSB系ベクターの場合、 79%の三菌株接合効率、 pCLD04541の場合、 9 3%の三菌株接合効率で、 pLC系ベクターが最も高かった (表 10)。

[0190] [表 10]

表 1 0

DNA供与植物ベクタ一三菌株接合に組換えァグロパクテリゥム効率 06) 用いたクローンが得られたクローンの数 b/a の数 (a) (b)

<pLC40シリーズのコスミドベクター >

オリザルフィポゴン PLC40 GWH 5657 5469 96. 7 シロイヌナズナ PLC40 1532 1410 92. 0 スーダングラス PLC40 GWH 2301 2Z01 95. 7 イタリアンミレツト pLC40 GWH 2521 2405 95. 4 テ才シン卜 PLC40 GWM 10739 10593 98. 6 バヒアグラス PLC 1 st» 334 383 99. 7 合計 23134 22461 97. 1

<pSB200シリーズのコスミドベクター >

オリザルフィポゴン P SB200 10375 7504 72. 3 シロイヌナズナ pSB200PcHniGWH 1332 1 1 79 38. 5 スーダングラス pSB200PcHmGWH 2096 2031 96. 9 イタリアンミレット pSB200PcHmGWH 2336 2032 87. 0 i 161 39 12746 79. 0

ィンディ力イネ C039 pCLD04541 149 127 85. 2 シロイヌナズナ pCLD04541 192 190 99. 0 合計 341 31 7 93. 0

2)ゲノム DNAの安定性

各クローンに保持されているゲノム DNA断片力ァグロバタテリゥムに伝達されているか否かを解析するため、ゲノム DNA断片全体をプローブに用いたサザンハイプリダイゼーシヨンを行った。大腸菌、およびァグロバタテリゥムから常法に従いプラスミド DNAを抽出し、制限酵素 HindIII、 Saclで消化した。次に消化物の一部をァガロースゲル電気泳動で分画し、ナイロンメンブレンフィルター HybondN+に転写した。次にこのメンブレンに対し、大腸菌由来のプラスミドの HindIII、 Sacl消化物の一部（ェタノール沈殿、 TEに再溶解したもの）を ECL— rabelling kit (アマシャム）を用いてラベルし、これをプローブとしたハイブリダィゼーシヨンを行った。ハイブリダィゼーション、洗浄、シグナル検出は ECL添付のキットに従った。ルフィポゴン断片が pLC40G WHにクローニングされた 4種のプラスミドを用いた結果、その全てにおいて大腸菌からァグロバタテリゥムへのゲノム DNA断片の移行が確認された。

14 DLCベクターによるのイネ拿云

1)イネ形質転換とその効率

i)イネ形質転換方法

イネ品種にはゆきひかりを用レ、、未熟胚にァグロバタテリゥムを感染させた。イネの形質転換については、特願 2003- 293125に記載の方法によった。ただし、ァグロバタテリゥム接種の前処理として、無菌的に取り出したすべての未熟胚に遠心処理を実施した。具体的には、未熟胚を lmlの滅菌水の入ったエツペンドルフチューブへ移し、 20000 X gで 10分間処理を行った（25°C)。選抜薬剤としてハイグロマイシン Bを用い、選抜培地、再分化培地および発根培地にそれぞれ 50mgZl添加した。

PLC40シリーズのコスミドベクター、 pSB200シリーズのコスミドベクターの場合、ァグロバクテリウム 1菌株（1種類の DNA断片）にっき 1未熟胚へ接種した。一方、 pCLD 04541の場合、ァグロバタテリゥム 1菌株（1種類の DNA断片）にっき 2未熟胚へ接種した。なお選抜薬剤にはパロモマイシンを用レ、、 400〜800mg/lの濃度で選抜培地、再分化培地および発根培地へ添加した。

[0192] ii)植物ゲノム断片のイネへの導入

表 11に形質転換の結果を示した。 pSB200シリーズのコスミドベクターの場合、 59 . 1 %~62. 7%の菌株からハイグロマイシン耐性個体を得た。それに対し、 pLC40 シリーズのコスミドベクターでは 86. 6%〜95. 4%の菌株から形質転換体を得ることができた。ゲノム DNAを供与した 3種類の植物（オリザ'ルフイボゴン、スーダングラス、極早生イタリアンミレット）のいずれにおいても、 pLC40シリーズのコスミドベクターを用いた場合の方が、 24%〜36%、効率が高かった。一方、 pCLD04541ベクターの場合は、 41〜53. 4%とレヽぅ低い効率であった。これらのこと力ら、 pLC40シリーズのコスミドベクターは PSB200シリーズのコスミドベクターや pLCD04541に比べ、ゲノム DNA断片を効率良くイネに導入できるベクターであると考えられた。

[0193] 次に、通常の大きさの遺伝子発現ユニットの形質転換効率を調べるため、導入する DNA断片が GUS遺伝子の場合における、ベクターの比較試験を行った。各 25個のゆきひかり未熟胚を供試して実施した結果、 pSB134 (W〇2005Z017169)力 S未熟胚当たり平均 11. 7個体のハイグロマイシン耐性再生個体が得られたのに対して、 pLC40 : 35S _IGUSでは平均 11. 5個の再生個体が得られた。

[0194] [表 11] pSBまたは pLCベクターを用いたランダム植物ゲノム断片のィネへの導入結果ゲノム供与植物ベクターァゲ ΠΛ' テリゥムによる導入を Mゲ Π7イシン耐性個体を再 B/A (¾) 試みたゲノム断片数（A) 生したゲノム断片数（B) 才リザルフィポゴン pSBZOO 22 6 1327 59.1 オリザルフィポゴン PLC40G H 2271 216S 95.4 スーダングラス pSB200PcHmGWH 1997 1252 62.7 スーダングラス PLC40G H 1760 1524 86.6 イタリアンミレツ卜 pSB200PcHmGWH 1940 1200 61.9 イタリアンミレツ卜 PLC40GWH 2285 1986 86.9 バヒアグラス pLCI eo 18 16 88.9 インディ力イネ C039 PCLD04541 156 G4 41.0 シロイヌナズナ PCLD04541 189 101 53.4

2)大断片導入の確認

i)断片の両端外側の PCR

形質転換体 11個体とゆきひかりの若葉から、上述の方法を用いてゲノム DNAを抽出した。これらの DNAに対して下表の 2組のプライマーを用いて、 PCRを行った。 pS B200_9531F、 pSB200_4Rfま RB〜ゲノム DNA断片までのの 139bpの領域を増幅させるプライマーである。 HPTinRV、 HPTinFWはハイグロマイシン耐性遺伝子の内部を増幅させるプライマーである（表 12)。 PCRは 35サイクル行った。その結果、対照のゆきひかりからは両プライマーともに、 PCR産物が得られなかったのに対して、形質転換体では HPTinRV、 HPTinFWの場合、 11個体全てで産物が増幅された。また、 pSB200— 9531F、 pSB200— 4Rでは、 11個対中 10個体にぉレヽて PCR産物が得られた。このこと力ら、 pLCベクターで形質転換された植物体の大多数において、ゲノム DNA断片の両端外側が導入されていることが明らかとなり、ゲノム DNA断片の導入が確認できた。

[表 12]

表 1 2

名称 i^J 長さ

PSB200-9531F 5 - ctg aag gcg gga aac gac aat ctg - 3 24tner pSB200-4R 5' - get tgc t a gtg get cct tea acg -3' 24tner pSB200-170R 5' - aac tgc act tea aac aag tgt gac - 3' 24mer

HPTinRV 5' -tat gtc ctg egg gta aat ag-3' 20 mer

HPTinFW 5' -_ ttg_ttg gag ccg aaa tec _β-3' 19— mer 上から順に配列番号 60— 6 4

ii)断片両末端と内部配列の PCR PLC40GWHベクターを用いてゆきひかりへの導入を試みた 3種類のオリザルフィポゴン断片 (A、 B、 Cと呼ぶ）について、 TO植物を 2個体ずつ供試して、各断片の両末端と中央部が導入されているか否かを、 PCRにより分析した。 PCR条件は、 94°C で 2分間処理した後、 94°Cで 30秒間の熱変性、 60°Cで 30秒間のァニ—リング、 60 °Cで 30秒間の伸長反応からなるサイクルを 35回繰り返し、最後に 72°Cで 2分間処理することとした。

[0196] A断片の RB側を検出するためには、 pSB200_ 9531Fと A断片に特異的なプライマー（5 ' _ gtt aat ttc ttg tga tcg aag gac _ 3' (酉己歹 lj番号 11) )による P CR (PCRl)を行った。 A断片の中央部を検出するためには、 A断片に対応する日本晴配列 AP004667 (データベース検索により同定）とオリザルフィポゴン配列との間で見出した塩基配列多型を利用して、 CAPS法（Konieczny and Ausubel 1993 Plant Journal 4: 403-410)により PCR検定を行った。具体的には、 2種類のプライマー（5， — ggg att ctt tat get ggg ttt agg— 3 ' (酉己歹 lj番号 12)および 5 — gca age aat acc tct gtt atg ctg— 3 ' (配列番号 13) )により PCR (PCR2)を行い、産物を Ssplで消化した。 HPT側を検出するためには、 pSB200— 170Rと A断片に特異的なプライマー（5，—gtt ttc aga tgg cga cct cag ctt tg— 3 ' (配列番号 14) )による PCR (PCR3)を行った。

[0197] B断片および C断片についても、同様のマーカー検定を行った。即ち、 B断片の RB 側を検出するためには、 pSB200— 9531Fと B断片に特異的なプライマー（5'— ca g gtg get tta ttc etc etc tea— 3 ' (配列番号 15) )による PCRを行った。 B 断片の中央部を検出するためには、 B断片に対応する日本晴配列 AP005967 (データベース検索により同定）とオリザルフィポゴン配列との間で見出した塩基配列多型を利用して、 CAPS法により PCR検定を行った。具体的には、 2種類のプライマー (5 — ccg aaa gtt cgt ggg caa tgc cta— 3 (酉 ΰ歹 U番号 16ノぉよび 5 — gcc ate ctt age ata tga gtg gca_ 3 ' (配列番号 17) )により PCRを行レ、、産物を Haelllで消化した。 B断片の HPT側を検出するためには、 pSB200— 170Rと B 断片に特異的なプライマー（5 ' _ggc tat tta cgt ggc atg tta cgt_ 3 ' (配列番号 18) )による PCRを行った。また、 C断片の RB側を検出するためには、 pSB2 00— 9531Fと C断片に特異的なプライマー（5 '—tcg taa gtc tac ttc cct tt a cga- 3 ' (配列番号 19) )による PCRを行った。 C断片の中央部を検出するためには、 C断片に対応する日本晴配列 AL713907 (データベース検索により同定）とォリザルフィポゴン配列との間で見出した塩基配列多型を利用して、 CAPS法により PC R検定を行った。具体的には、 2種類のプライマー（5 ' _ cca aac cac ate ctt a ta gtg tgc— 3 ' (配歹幡号 20)および 5 '—cct cat tgc atg egg tea cta c - 3 ' (配列番号 21) )により PCRを行レ、、産物を Hinflで消化した。 C断片の HPT側を検出するためには、 PSB200— 170Rと C断片に特異的なプライマー（5 '— gca g gg tat taa tcg ate aac acc _ 3 ' (酉己歹 lj番号 22) )による PCRを行った。

[0198] B断片の分析結果を図 17に、また A〜C断片の分析結果を表 13にまとめた。 A断片については調べた 2個体の形質転換体では、大断片全体が導入されたものは得られなかったものの、中央と片端、もしくは両端の導入が検出された個体が得られた。一方、 B断片および C断片については、調査した 2個体のうちの 1個体力オリザルフイボゴン断片の全体、即ち両端部および中央部を保有することが示された。以上の結果から、 pLCベクターによって、 25〜40kbのサイズの植物ゲノム断片を、植物に導入できることが確認された。

[0199] [表 13]

表 1 3

断片 TO植物 RB側中央 HPT側

A 1 - + +

2 + - +

B 1 + + —

2 + + +

C 1 - - -

2 + + +

+：オリザルフィポゴン断片が検出された

一：オリザルフィポゴン断片が検出されなかった。実施例 5 OLC40シリーズのコスミドベクターによるトウモロコシの形晳転換 1) し〇と丁〇1：47、または pLCと pVGWとの共存

トウモロコシの形質転換は、通常のバイナリーベクターでは特殊な方法（Frame et al . (2002) Plant Physiol 129: 13_22)を除き、形質転換効率が非常に低いため、その効率を上げるには vir遺伝子を含むベクターが必要である（Ishida et al. 1996 Nat Biote chnol 14:745-50)。 pLC40シリーズのコスミドベクターは通常のバイナリーベクターであるので、 vir遺伝子を利用して、形質転換効率を向上させる技術が必要である。そこで、まず、 pLC40シリーズのコスミドベクター（IncPプラスミド）と細菌の中で共存でき、かつ vir遺伝子を発現するベクター pTOK47 (Jin et al. 1987 J Bacteriol 169: 44 17-4425)、ならびに本発明で新規に構築した pVGWを利用した。 pTOK47は、ァグロバクテリウムの菌株 Α281に由来する virB遺伝子と virG遺伝子を含む DNA断片（ Kpnl 14. 8kb断片）を有し、 IncPプラスミドと共存できる IncWプラスミドである。また、 pVGWは、変異型 virG (virGN54D)を持ち IncW oriを有するプラスミドである

[0200] pT〇K47 (テトラサイクリン耐性）を、三菌株接合法により、ァグロバタテリゥム LBA4 404または EHA105 (Purdue Universityの Stanton Gelvin博士から譲受）に導入した。このァグロバタテリゥムからプラスミドを抽出し、制限酵素分析で pTOK47 の存在を確認した。さらに完成した LBA4404/pT〇K47、または EHA105/pTO K47 (Tc耐性）に、三菌株接合法により、 pLC40 : 35S— IGUS、または、 pLC40G WB : 35S— IGUSを導入した。これらのァグロバタテリゥムを、 LBA4404/pT〇K4 7/pLC40： 35S— IGUS、 LBA4404/pTOK47/pLC40GWB： 35S— IGUS 、 EHA105/pTOK47/pLC40 : 35S - IGUS , EHA105/pTOK47/pLC40 GWB : 35S— IGUSと記載する。ァグロバタテリゥムからプラスミド DNAを抽出し、 P CRによる分析を行い、 VirG, RB、 hptまたは bar、 GUS遺伝子の存在確認を行った

[0201] 同様にして、 pVGWをエレクト口ポレーシヨン法でァグロバタテリゥム LBA4404に導入し、ゲンタマイシン（Gm 50 μ g/mL)でコロニーを選抜した。完成した LBA440 4/pVGWに、三菌株接合法により、 pLC40 : 35S _IGUS、または、 pLC40GWB : 35S— IGUSを導入した。これらのァグロバタテリゥムを、 LBA4404/pVGW/pL C40： 35 S _ IGUS、 LBA4404/pVGW/pLC40GWB： 35 S _ IGUSと記載する。ァグロバタテリゥムコロニー（Kmと Gm耐性）を直接、 PCR分析に供試し、 VirG, hp tまたは bar、 GUS遺伝子の存在確認を行った。

[0202] さらに、 IncP プラスミドである pBI121由来の pIG121Hm (Hiei et al. (1994) Plant J 6: 271-282)を、 LB4404/pTOK47に導入して、ァグロバタテリゥム LB4404/p TOK47/pIG121Hmを作成し、トウモロコシ形質転換実験の対照とした。

[0203] 2)トウモロコシの形質転換

大きさ約 1. 2mmのトウモロコシ未熟胚（品種: A188)を温室栽培した植物から無菌的に取り出し、ァグロバタテリゥム懸濁用液体培地（LS _inf， Ishida et al. 1996) に浸漬した。 46°C、 3分間の熱処理後、同液体培地で未熟胚を 1回洗浄した。次に 1 5, 000 rpm、 4°C、 10分間の遠心処理を行った後、未熟胚を、各菌株を約 lxlO⁹ cfu/mlで懸濁した LS _inf培地（ァセトシリンゴン 100(Mを含む）に浸漬後、共存培地（LS—AS (Ishida et al. 1996 Nat Biotechnol 14:745-50)に AgN〇、 CuSO を添加）に置床した。 25°C、暗黒下で 3日間培養後、一部の未熟胚について GUS分析を行った。

[0204] 共存培養後の未熟胚をハイグロマイシンあるいはフォスフィノスライシンを含む選抜培地（Ishida et al. (2003) Plant Biotechnology 20:57-66)に置床し培養した。増殖したカルスを小片に切り取り、ハイグロマイシン（Hm)あるいはフォスフィノスライシン（ PPT)を含む再分化培地（Ishida et al. 1996 Nat Biotechnol 14:745-50)に置床し、照明下で培養した。 2週間後、 Hmあるいは PPTに抵抗性を示す再分化植物の調査を行った。

[0205] まず、各種菌株を A188未熟胚に接種し、共存培養 3日目に GUS遺伝子の一過性の発現を観察した。対照の LBA4404/pSB134を接種した未熟胚では広い範囲で GUS遺伝子の発現がみられた。これに対し、 LBA4404/pLC40 : 35S— IGUSを接種した未熟胚ではほとんどのものが発現を示さず、ごく小さいスポット状の発現をするものが僅かにみられた。宿主を EHA105にした場合も発現の増大はみられなかつた。 LBA4404/pT〇K47ZpLC40 : 35S— IGUS、 LBA4404/pLC40GWH vGl : 35S— IGUS、 LBA4404/pVGW/pLC40 : 35S -IGUS, LBA4404/p VGW/pLC40GWB : 35S— IGUSでは、 LBA4404/pSB134 には劣るものの、ほとんどの未熟胚で GUS遺伝子の発現を示すスポットが観察され、ァグロバタテリゥム菌株 A281由来の virB遺伝子と virG遺伝子を含むプラスミドの共存、または、 vir GN54Dを含むプラスミドの共存、あるレ、は virG遺伝子を付加することによる遺伝子導入効率の向上が確認された。また、 pLC40GWHvGl:35S— IGUSと、 pLC40 GWHvGCl： 35S— IGUSでは、 GUS遺伝子の発現に差異はなぐ NspV認識部位除去のための 1塩基置換は virG活性に影響しないことが明らかとなった。

[0206] 次に、共存培養後の未熟胚を Hmあるいは PPTを含む選抜培地、再分化培地で培養し、形質転換植物の作出を試みた。 EHA105を宿主とした場合、 pLCSBGWBS Wベクターでは ρρτ抵抗性植物は全く得られなかった。し力、し、 LBA4404を宿主とした場合、 pLCSBGWBSWベクターは同菌株を宿主としたスーパーバイナリーべクター pSB131 (T—DNA領域に GUS遺伝子と bar遺伝子が配置されている、 Ishida et al.1996 Nat Biotechnol 14:745-50)と同様の効率で PPTに抵抗性を示す植物が得られた (表 14)。

[0207] 一方、 LBA4407/pT〇K47ZpLC40GWB:35S— IGUSにおレ、ても、スーパ一バイナリーベクター pSBl 31と同様に高い効率で PPT抵抗性植物の得られることが明らかとなった。また、選抜マーカー遺伝子をハイグロマイシン耐性遺伝子とした場合でも、 ρΤ〇Κ47と共存させた pLC40シリーズのコスミドベクター（pLC40:35S — IGUS)ではハイグロマイシン抵抗性植物が得られた (表 13)。また、 virG遺伝子を組み込んだ pLC40GWHvGlにおいても、スーパーバイナリーベクター pSBl 34 (T DNA領域に GUS遺伝子とハイグロマイシン耐性遺伝子が配置されてい >る、 Hiei a nd Komari 2006 Plant Cell, Tissue and Organ Culture 85: 271-283)と同レベルの効率を得ることができた (表 14)。

[0208] [表 14]

表 1 4 トウモロコシ形質転換結果

未熟胚数再分化率験菌株選抜接種 (A) 再分化 (B)

1 LBA4404 (pLCSBGWBSW) PPT 46 10 21,7

EHA105 (pLCSBGHIBSW) PPT 46 0 0

LBA4404 (pSB13i) PPT 45 9 20.0

1 LBA4404 (pLC40GWB:35S-IGUS) PPT 56 0 0

LBA4404 (pLC40GWB:35S-IGUS PPT 57 u 24.6

/pT0K47)

LBA4404 (pSBUl) PPT 59 19 32.2

3 LBA4404(pLC40:35S-IGUS) Hm 43 0 0

LBA4404(pLC40:35S-IGUS /pT0K47) Hm 44 2 4.5

LBA4404(plG1Z1Hm) Hm 42 0 0

LBA4404(plG1ZlHra/pT0K47) Hm 42 0 0

4 LBA4404(pLC40GWHvG1) Hm 59 5 8.5

LBA4404(pSBI34) HfH 57 5 3.8

PPT：フォスフィノスライシン、 Hm :ハイグロマイシン続いて、 pVGWのトウモロコシ形質転換への影響を調べるために、 LBA4404/p LC40 : 35S-IGUS, LBA4404/pVGW/pLC40： 35S -IGUS, LBA4404 /pVGW/pLC40GWB : 35S— IGUS、 LBA4404/pSB134でトウモロコシを形質転換し、再分化個体の GUS発現を解析した。その結果、 pLC40 : 35S_IGUSでは GUS発現個体数は 0% (0/16)であった一方で、 pVGWを共存させた pLC40 : 3 5S _IGUS、同 pLC40GWB : 35S _IGUSでは、接種未熟胚当たりの GUS発現個体数の比率がそれぞれ 40% (6/15)、 30% (6/20)に達し、スーパーバイナリーベクター PSB134の 41. 2% (7/17)と同レべノレであった。口ち、 pVGWを用レ、ることによって、 pLCベクターによる高効率トウモロコシ形質転換を実現することができた

[0209] さらに、 pLCベクターと pVGWベクターの共存による、植物ゲノム断片のトウモロコシへの形質転換を試みた。ベクター pLC40GWBの NspV部位に、スーダングラスのゲノム断片（30— 35kb)をランダムにクローニングした。得られた大腸菌のプラスミドを、三菌系接合によって、 pVGWを有するァグロバタテリゥム（LBA4404)に移行させた。こうして、スーダングラスのゲノム断片が組み込まれた PLC40GWBと pVGW の両方のプラスミドを有するァグロバタテリゥムを作成し、トウモロコシ未熟胚（品種: A 188)に接種した。形質転換細胞の選抜を行ったところ、接種した 27断片のうち、 17 断片で再分化植物が得られた (表 15)。このことから、 pLCと pVGWの共存により、植物ゲノム断片をトウモロコシに効率的に形質転換できることが示された。

[0210] 以上の結果から、例えば pT〇K47のような、ァグロバタテリゥム菌株 A281由来の vi rB遺伝子と virG遺伝子を有する DNA断片を含むプラスミドを共存させることで、あるレ、は、例えば pVGWのような、 virG N54D遺伝子を含むプラスミドを共存させることで、また、例えば pLC40GWHvGlのような virG遺伝子を pLCベクターに組込むことによってトウモロコシの形質転換を効率的に行えることが示された。

[0211] [表 15]

表 1 5 pLC/pVGWベクタ一系を用いたランダム植物ゲノム断片のトウモロコシへの導入結果ゲノム供与植物菌株ァゲ ΠΛ'クテリウムによる導入を ΡΡΤ耐性個体を再生した Β/Α (¾) 試みたゲノム断片数（《ゲノム断片数（Β)

スーダングラス LBA4404 (pLC40G B/pVGW) 27 17 63. 0 実施例 6 PLCベクターを用いた、 BACクローンからの目的遺伝子の単離

Komori et al.(2004) (Plant J 37: 315-325)は、イネ品種 IR24から単離した PPR791 遺伝子を細胞質雄性不稔系統に導入すると稔性が回復することを見出し、 PPR791 が稔性回復遺伝子 Rf—1であることを証明した。 PRR791遺伝子は、以前に Kazama and Toriyama (2003) (FEBS Lett 544: 99-102)によって Rf_ 1候補と報告されてレヽたイネ品種 Milyang23の PPR8— 1遺伝子と同一であった。そこで、 PPR8— 1遺伝子が由来する Milyang23の BACクローン〇SIMBb0046F08をクレムソン大学から入手し、当該 BACから Rf _ 1を単離するモデル実験を行った。

[0212] まず、 High Purity Plasmid Midiprep System (Mariigen社）を用いて、 OSIM Bb0046F08力、らプラスミドを抽出した。そのプラスミドを Taqlで部分分解し、ショ糖密度勾配超遠心により 30kb付近の DNA断片を回収した。この DNA断片と、 pLC4 0GWHを BstBI消化し CIP処理を行ったベクター、または pSB200を BstBI消化し C IP処理を行ったベクターとを、 DNA Ligation Kit < Mighty Mix> (タカラバイォ）を用いてライゲーシヨンした。得られたコンストラクトはエレクト口ポレーシヨン法により大腸菌に導入し、適当な抗生物質（50 μ g/mlカナマイシンまたはスぺクチノマイシン）を含む LBプレート上で形質転換体のコロニーを得た。次に、得られたプラスミド中の Rf— 1遺伝子の有無を調べるため、これらのコロニーを铸型にして、 Rf— 1遺伝子に設計したプライマー（WSF7T7R1及び IR50226R、表 16)を用いたダイレクト P CR (実施例 1、 3)を参照）を行い、約 2kbの増幅産物が得られるものを Rf— 1ポジテイブクローン、当該産物の増幅が見られないものを Rf— 1ネガティブクローンとして選別した。この PCRスクリーニングにおけるポジティブクローンの出現率は pLC40GW Hコンストラクトで 5/39 (12. 8%)、 pSB200コンストラクトで 6/96 (6. 3%)であつた。即ち目的遺伝子のクローニング効率は、 pLCベクターの方力 pSBに比較して、およそ 2倍の高さであった。

[0213] pLC40GWHコンストラクトからポジティブクローンを 1つ、ネガティブクローンを 2つ選抜し、また、 pSB200コンストラクト力、ポジティブクローンを 1つ、ネガティブクローンを 2つ選抜して、三菌株接合法により大腸菌からァグロバタテリゥムへ移行させた。得られたァグロバタテリゥムを、 Komori et al.(2004)に記載された方法により、細胞質雄性不稔系統である MSコシヒカリに感染させた。得られた形質転換イネを馴化後、温室で栽培した。登熟期に、各個体から標準的な穂を採取し、稔実率を調査した。その結果、 Rf-1を含まないコンストラクト（pLC— 7、 pLC— 1 1、 pSB— 1、 pSB— 7)力らの形質転換個体は、不稔であった一方で、 Rf _ lを包含するコンストラクト pLC _ 8、 pSB _ 37からは稔実個体が得られた (表 17)。

[0214] 以上の結果から、目的遺伝子を包含している BACの DNAから、植物形質転換用コスミドベクターを用いてライブラリーを作成し、植物に導入した後、期待する表現型を示す植物を選抜することにより、効率的に目的遺伝子を同定できることが実証された。

[0215] [表 16] 表 1 6

プライマー名称配列長さ

IKSF7T7R1 5' -AGT GTG TGG CAT GGT GCA TTT CCG- -3 ' 24me r

I R50226 5' -CTC TAC AGG ATA CAC GGT GTA AGG- -3 ' 24ne r 上から順に配列番号 8 0— 8 1

[0216] [表 17]

表 1 7 各コンストラクトによる稔性回復

コンストラクト R f-1の有 (+)無 (-) 解析個体数稳実個体数

PLC- 8 + 6 4

pLC-7 - 9 0

pLC-1 1 - 8 0

pSB-37 + 9 6

pSB-1 - 9 0

pSB-7 - 9 0 以上のことから、 pLCベクター系の特徴として、

1. 25〜40kb程度の DNAを容易にクローニングできること；、

2.細菌の中で安定であること；そして

3.植物、特に単子葉植物を高い効率で形質転換できること

が挙げられる。 pLC系ベクターは、機能ゲノミタス分野で、中型 DNAを扱うベクターとして有用である。

Claims

請求の範囲

[1] 下記の特徴を有する全長 15kb以内のコスミドベクター

2) IncPプラスミドの trf A1遺伝子を含む；

3) IncPフフストの origin of conjugative transfer (oriT)を含む；

4) IncPプラスミドの incCl遺伝子を含む；

[2] 植物形質転換用選抜マーカー遺伝子が、ハイグロマイシン耐性遺伝子、フォスフィノトリシン耐性遺伝子及びカナマイシン耐性遺伝子からなるグループから選択される、請求項 1記載のコスミドベクター。

[3] IncPプラスミドの korB遺伝子を含む、請求項 1又は 2に記載のコスミドベクター。

[4] 以下の：

配列番号 2の塩基配列からなるコスミドベクター pLC40若しくはその同等物；配列番号 3の塩基配列からなるコスミドベクター pLC40GWH若しくはその同等物；配列番号 4の塩基配列からなるコスミドベクター pLC40bar若しくはその同等物；配列番号 5の塩基配列からなるコスミドベクター pLC40GWB若しくはその同等物；配列番号 65の塩基配列からなるコスミドべクター 1^ 400 ^11^0 若しくはその同等物；配列番号 66の塩基配列からなるコスミドベクター pLCleo若しくはその同等物；及び配列番号 7の塩基配列からなるコスミドベクター pLC40GWHvGl若しくはその同等物

力なるグノレープから選択される、請求項 1ないし 3のいずれか 1項に記載のコスミド

[5] 以下の：

配列番号 2の塩基配列からなるコスミドベクター pLC40；

配列番号 3の塩基配列からなるコスミドベクター pLC40GWH；

配列番号 4の塩基配列からなるコスミドベクター pLC40bar；

配列番号 5の塩基配列からなるコスミドベクター pLC40GWB；

配列番号 65の塩基配列からなるコスミドべクター 1^ 400 1¾：0 ；配列番号 66の塩基配列からなるコスミドベクター pLCleo；及び

配列番号 7の塩基配列からなるコスミドベクター pLC40GWHvGl

力なるグノレープから選択される、請求項 4に記載のコスミドベクター。

[6] 請求項 1ないし 5のいずれ力 1項に記載のコスミドベクターに植物の核酸断片が導入された発現ベクターを含むァグロバタテリゥム属細菌を用いて植物を形質転換する、ことを含む、植物の形質転換方法。

[7] 導入されている核酸断片のサイズが 25〜40kbである、請求項 6に記載の形質転換方法

[8] 植物の形質転換において、以下の要素を含むァグロバタテリゥム属細菌を用いることを特徴とする、請求項 6または 7に記載の形質転換方法；

la)請求項 1ないし 5のいずれか 1項に記載のコスミドベクターに植物の核酸断片が導入されたベクターに、さらにァグロバタテリゥム属細菌の virG遺伝子を導入したベクタ一；あるいは

lb)請求項 1ないし 5のいずれ力、 1項に記載のコスミドベクターに植物の核酸断片が導入されたベクター、及び、ァグロバタテリゥム属細菌の細胞中において IncPプラスミドと共存可能なプラスミドであって、ァグロバタテリゥム属細菌の virG遺伝子を含むプラスミド、並びに

la)または lb)のァグロバタテリゥム属細菌の virG遺伝子力 virGN54Dである、請求項 8記載の形質転換方法。

lb)のァグロバタテリゥム属細菌の virG遺伝子を含むプラスミド力 IncWプラスミドの複製開始点を含む、請求項 8記載の形質転換方法。

lb)のァグロバタテリゥム属細菌の virG遺伝子を含むプラスミド力図 14に示した構造を有する pVGW、または図 15に示した構造を有する pVGW2である、請求項 10記載の形質転換方法。

lb)のァグロバタテリゥム属細菌の virG遺伝子を含むプラスミド力さらに、ァグロバクテリゥム属細菌の virB遺伝子を含む、請求項 8記載の形質転換方法。

lb)のァグロバタテリゥム属細菌の virG遺伝子を含むプラスミド力 IncWプラスミドの複製開始点を含む、請求項 12記載の形質転換方法。

lb)のァグロバタテリゥム属細菌の virG遺伝子を含むプラスミド力 pTOK47である、請求項 13記載の形質転換方法。

2)コスミドベクターを用いて、工程 1)で得られた DNA断片をサブクローン化して、ライブラリーを構築し;そして

工程 1)で得られた DNA断片のサイズが 25〜40kbである、請求項 15に記載のマップベースクローユングの方法。

2)のコスミドベクターが請求項 1ないし 5のいずれ力、 1項に記載のコスミドベクターである請求項 16に記載のマップベースクローユングの方法。

下記の特徴を有するプラスミドベクター；

2) IncWプラスミドの複製に必要な repA遺伝子を含む；

3)大腸菌ならびにァグロバクテリゥム属細菌において発現する薬剤耐性遺伝子を含む；そして

4)ァグロバタテリゥム属細菌の virG遺伝子を含む。

[19] 全長が 10kb以内である、請求項 18のプラスミドベクター。

[20] ァグロバタテリゥム属細菌の virG遺伝子力 irGN54Dである請求項 19記載のプラスミドベクター。

[21] 以下の：

力なるグループから選択される、請求項 18ないし 20のいずれか 1項に記載のプラスミドベクター。

[22] 配列番号 8に記載の塩基配列からなるプラスミドベクター pVGW。

[23] 配列番号 67に記載の塩基配列からなるプラスミドベクター pVGW2。

[24] 請求項 18ないし 23のいずれか 1項に記載のプラスミドベクターを含むァグロバクテリウム属細菌を用いて植物を形質転換する、ことを含む、植物の形質転換方法。