WO2007136134A1

WO2007136134A1 - 疎水性薬物内包ポリマーミセルの製造方法

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Publication number: WO2007136134A1
Application number: PCT/JP2007/060936
Authority: WO
Inventors: Yuko Amano; Yasuo Yamamoto; Yasuki Kato; Mitsunori Harada; Tatsuyuki Hayashi
Original assignee: NanoCarrier Co Ltd
Current assignee: NanoCarrier Co Ltd
Priority date: 2006-05-23
Filing date: 2007-05-23
Publication date: 2007-11-29
Anticipated expiration: 2008-11-23
Also published as: JPWO2007136134A1

Abstract

本発明は、ポリマーミセル中に疎水性薬物を内包させる方法であって、以下の段階：(1-a)前記疎水性薬物を低級アルコールに溶解または分散し、(1-b)親水性領域と疎水性領域とを有するブロックコポリマーからなる前記ポリマーミセルを含有する水性媒体を準備し、(1-c)該疎水性薬物を溶解または分散した低級アルコール溶液又は分散液と、前記ポリマーミセルを含有する該水性媒体とを混合することで、該ポリマーミセル中に該疎水性薬物を内包させる；を含んでなり、ここで前記疎水性薬物の水溶解度は、前記低級アルコール中での溶解度よりも低い、方法を提供する。

Description

疎水性薬物内包ポリマーミセルの製造方法技術分野

本発明は、エタノール等の低級アルコールを薬物導入媒体として用いることにより、疎水性薬物をポリマーミセルに内包させる方法に関する。明

背景技術書

水難溶性または疎水性の薬物の生物学的利用能を高めるべく、薬物をリボソームやポリマーミセルなどの粒子に内包した系が知られている。これらのうち、親水性ポリマーセグメントと疎水性ポリマ一セグメントを有するブロックコポリマーを用い、疎水性ポリマーセグメントと薬物との疎水性結合形成能を始めとする相互作用を介して薬物を該ポリマーのミセル中に内包する方法は、広範な薬物への適用が可能であり、しかもナノメーターサイズの非常に小さな薬物内包ポリマーミセルを提供できることから、特に関心が持たれている（特許第 2777530号）。腫瘍部位では新生血管に 200nm程度の間隙があることが知られており、ナノメーターサイズの粒子はその間隙から漏れ出し、腫瘍へ蓄積することが知られている。薬物内包ポリマーミセルはその粒子径が大きいと腫瘍への薬物の集積性が減少してしまうことが考えられる。そのため、粒子径は 200nm以下、好ましくは 150nm以下であることが望ましい。また、治療効果の観点から、ポリマーミセルに内包される薬物量は多い方が望ましい。更に、薬物は往々にして高価であり、経済的及び生産的効率を考慮すると、薬物が高い収率でポリマ一ミセル内に内包されることが所望される。

親水性セグメントおよび疎水性セグメントを有するブロックコポリマーを使用して疎水性薬物を内包したポリマーミセルの製造方法としては、薬剤の内包率の高さゃミセル粒子径の小ささの観点から

、いわゆる乾固法が有利である（特開 2003- 342 168号公報）。乾固法は、ブロックコポリマーと疎水性薬物を揮散性の有機溶媒に分散溶解して溶液を形成した後、該有機溶媒を除去し、こうして得られる残存物を水と一緒にし、次いで該残存物が水に均一分散するのに十分な時間、所定の温度で撹拌することで、制御された粒子径の薬物内包ポリマーミセルを含有する製剤を製造する。

しかしながら、乾固法は一般に薬物とポリマーミセルを長時間、例えば一晩中攪拌することを要し、また生成される薬物の内包率や粒子径も満足たる成果が得られない場合もあった。また、乾固法ではジクロロメタンやクロ口ホルムといった有機溶媒がー般に使用され、その毒性が懸念されてもいる。従って、そのような毒性の高い有機溶媒を使用することなく、薬物をブロックコポリマーに内包させる簡便な方法が所望される。発明の開示

本発明の課題は、短時間でかつ簡単に、しかも高い内包率において粒子径の小さい薬物内包ポリマーミセルの形成を可能にする方法の提供を課題とする。

本発明者は鋭意研究を重ねた結果、薬物導入媒体としてェ夕ノールゃメ夕ノールといった低級アルコールを用いることにより、親水性及び疎水性領域を有するブロックコポリマーからなるミセル内に薬物を簡単に導入出来ることを見出し、本発明を完成するに至った本願発明は以下の態様を含む。

[ 1 ] ポリマーミセル中に疎水性薬物を内包させる方法であって、以下の段階：

(1 - a)前記疎水性薬物を低級アルコールに溶解または分散し、

(l-b)親水性領域と疎水性領域とを有するブロックコポリマーからなる前記ポリマーミセルを含有する水性媒体を準備し、

(1-c)該疎水性薬物を溶解または分散した低級アルコール溶液又は分散液と、前記ポリマーミセルを含有する該水性媒体とを混合することで、該ポリマーミセル中に該疎水性薬物を内包させる；を含んでなり、ここで前記疎水性薬物の水溶解度は、前記低級ァルコール中での溶解度よりも低い、方法。

[ 2 ] 前記段階（1-c)が、前記疎水性薬物を溶解または分散した低級アルコール溶液又は分散液を、前記ポリマーミセルを含有する前記水性媒体に添加することを含んでなる、 [ 1 ] の方法。

[ 3 ] 前記段階 U-c)が、前記ポリマーミセルを含有する前記水性媒体を、前記疎水性薬物を溶解または分散した低級アルコール溶液に添加することを含んでなる、 [ 1 ] の方法。

[ 4 ] 前記段階 U-c)において、さらに前記低級アルコール溶液又は分散液と前記水性媒体との混合物にエネルギーを与えることを含む、 [ 1 ] 〜 [ 3 ] のいずれかの方法。

[ 5 ] 前記段階（1-c)の後、さらに前記低級アルコールを除去または濃度を低下させる段階を含む、 [ 1 ] 〜 [ 4 ] のいずれかの方法

[ 6 ] ポリマーミセル中に疎水性薬物を内包させる方法であって、以下の段階：

(2-a)前記疎水性薬物及び親水性領域と疎水性領域とを有するブロックコポリマーの両者を低級アルコールに溶解または分散し、 (2-b)該疎水性薬物及びブロックコポリマーの両者を溶解または分散した低級アルコール溶液又は分散液と、水性媒体とを混合することで、該ブロックコポリマーからポリマーミセルを形成するとともに、該ミセル中に該疎水性薬物を内包させる；

を含んでなり、ここで前記疎水性薬物の水溶解度は、前記低級ァルコール中での溶解度よりも低い、方法。

[ 7 ] 前記段階（2-b)が、前記疎水性薬物及びブロックコポリマーの両者を溶解または分散した低級アルコール溶液又は分散液を、前記水性媒体に添加することを含んでなる、 [ 6 ] の方法。

[ 8 ] 前記段階（2-b)が、前記水性媒体を、前記疎水性薬物及びブロックコポリマーの両者を溶解または分散した低級アルコール溶液又は分散液に添加することを含んでなる、 [ 6 ] の方法。

[ 9 ] 前記段階（2-b)において、さらに前記疎水性薬物及びブロックコポリマーの両者を溶解または分散した水性媒体と低級アルコールとの混合物にエネルギーを与えることを含む、 [ 6 ] 〜 [ 8 ] のいずれかの方法。

[ 1 0 ] 前記段階（2-b)の後、さらに前記低級アルコールを除去または濃度を低下させる段階を含む、 [ 6 ] 〜 [ 9 ] のいずれかの方法。

[ 1 1 ] 前記水性媒体が水又は水性緩衝液である、 [ 1 ] 〜 [ 1 0 ] のいずれかの方法。

[ 1 2 ] 前記ブロックコポリマーの親水性領域がポリエチレングリコール（ P E G) である、 [ 1 ] 〜 [ 1 1 ] のいずれかの方法。

[ 1 3 ] 前記疎水性領域がアミノ酸および/又はその誘導体からなる、 [ 1 ] 〜 [ 1 2 ] のいずれかの方法。

[ 1 4 ] 前記アミノ酸および/又はその誘導体がグルタミン酸またはァスパラギン酸および又はそれらの誘導体である、 [ 1 3 ] の方法。

[ 1 5 ] 前記疎水性薬物が抗がん剤、抗菌剤、抗真菌剤、抗ウィルス剤、抗生物質、中枢神経薬、末梢神経系薬、ホルモン剤、麻酔薬及び鎮痛剤からなる群から選ばれる、 [ 1 ] 〜 [ 1 4 ] のいずれかの方法。

本発明により、短時間でかつ簡単に、しかも高い内包率において粒子径の小さい薬物内包ポリマーミセルの形成が可能となる。また、本発明において使用する空ミセルは大量調製が可能である。それ故本発明によれば大量に調製しておいた空ミセルに薬物を簡単に内包させることができるため、本発明は薬物内包ミセルのスクリー二ングにも利用できる。発明を実施するための最良の形態

本発明者は、驚くべきことに、薬物導入媒体としてエタノールやメタノールといった低級アルコールを用いることにより、親水性及び疎水性領域からなるブロックコポリマーのミセル内に薬物を、短時間でかつ簡単に、しかも高い内包率で粒子径の小さい薬物内包ポリマーミセルの形成が可能となることを見出した。

本発明は内包すべき疎水性薬物の水低級アルコール中での溶解度の違いを利用した方法である。疎水性薬物は水よりも有機溶媒中で高い溶解度を有する。従って、疎水性薬物を予め有機溶媒に溶解又は分散させておき、その後薬物の周囲を水性環境に置換して該疎水性薬物の溶解度を下げることで該疎水性薬物を高分子ポリマーミセルの疎水性部分内に内包させることができると考え、有機溶媒としてエタノールやメタノールといった低級アルコールを利用してみたところ、驚くべきことに薬物は空ミセルに混合されて瞬時にミセル内に内包されることを見出した。具体的には、本発明の方法の一つの態様は以下の段階を含む。

( 1 -a)疎水性薬物を低級アルコールに溶解または分散し、

( 1 -b)親水性領域と疎水性領域とを有するブロックコポリマーからなるポリマーミセルを含有する水性媒体を準備し、

( 1 -c)該疎水性薬物を溶解または分散した低級アルコール溶液又は分散液と、前記ポリマーミセルを含有する該水性媒体とを混合することで、該ポリマーミセル中に該疎水性薬物を内包させる。

上記段階 U -a)における「溶解または分散」の "分散" とは、低級アルコール中で溶質が均一に分散され、沈殿を生じていない状態を意味する。

上記段階（1 - b)におけるポリマーミセルの形成は、例えばブロックコポリマーを含む溶液を攪拌することで行うことができる。好ましくは、ミセルの形成には超音波、圧力および/または剪断力の如きエネルギーをかけて行う。超音波を使用する場合、例えば B i o r u p t o r (日本精機）を用い、レベル 4、氷冷しながら 1秒間欠、 5分〜 1 0分間照射することによって行うことができる。

上記段階（1 -c)では、疎水性薬物を溶解または分散した低級アルコール溶液又は分散液を、ポリマーミセルを含有する前記水性媒体に添加してもよいし、ポリマーミセルを含有する前記水性媒体を、前記疎水性薬物を溶解または分散した低級アルコール溶液に添加して混合してもよい。添加は、添加される側の溶液又は媒体などを攪拌しながら、徐々に行うのが好ましい。また混合は、混合溶液又は媒体に超音波、圧力およびまたは剪断力の如きエネルギーをかけて行ってよい。超音波を使用する場合、例えば上記ポリマーミセルの形成と同じ条件で行うことができる。

本発明の方法のもう一つの態様は以下の段階を含む。

(2-a)疎水性薬物及び親水性領域と疎水性領域とを有するブロックコポリマーの両者を低級アルコールに溶解または分散し、

(2-b)該疎水性薬物及びブロックコポリマーの両者を溶解または分散した低級アルコール溶液又は分散液と、水性媒体とを混合することで、該ブロックコポリマーからポリマ一ミセルを形成するとともに、該ミセル中に該疎水性薬物を内包させる。

上記段階（2-a)における「溶解または分散」の "分散" も、低級アルコール中で溶質が均一に分散され、沈殿を生じていない状態を意味する。

上記段階（2- b)では、疎水性薬物及びブロックコポリマーの両者を溶解または分散した低級アルコール溶液又は分散液を、水性媒体に添加してもよいし、水性媒体を、疎水性薬物及びブロックコポリマーの両者を溶解または分散した低級アルコール溶液又は分散液に添加してもよい。添加は、添加される側の溶液又は媒体などを攪拌しながら、徐々に行うのが好ましい。

上記段階（2- b)におけるミセル形成も、例えばブロックコポリマ —を含む溶液を攪拌することで行うことができ、好ましくは、ミセルの形成には超音波、圧力およびまたは剪断力の如きエネルギーをかけて行う。超音波を使用する場合、例えば上記（1 -b)におけるポリマーミセルの形成の形式と同じ条件で行うことができる。

薬物内包ポリマーミセルを調製した後に低級アルコールを除去する場合は、限外ろ過、透析などにより、所望の水性媒体に置き換えることができ、さらに、低級アルコールの揮発、超遠心などの方法によっても行うことができるがこれらの方法に限定されない。また、低級アルコールの濃度を低下させる場合は、水、緩衝液または生理食塩水などにより希釈するこどで行うことができるがこれらの方法に限定されない。また、上記の低級アルコールを除去する方法によっても、低級アルコールを希釈できることは言うまでもない。 • 低級アルコール

本発明でいう「低級アルコール」とは、疎水性薬物が水性媒体に比べその中で高い溶解度を示し、かつ水と混和するものをいい、特に限定されるわけではないが、好ましくは炭素数が 1 〜 7個、より好ましくは 1 〜 4個の低級アルコール、例えばメタノール、ェ夕ノール、プロピルアルコール、 i s o—プロピルアルコール、 t —ブチルアルコール等である。特にエタノールまたはメタノールが好ましい。

• 疎水性薬物

本発明の方法に従い、ポリマーミセルに効率よく内包できる疎水性薬物は、水溶解度が低級アルコール中での溶解度よりも低い、あらゆる薬物であつてよく、各種杭がん剤、抗菌剤、抗真菌剤、抗ゥィルス剤、抗生物質、中枢神経薬、末梢神経系薬、ホルモン剤、麻酔薬、鎮痛剤など、様々である。抗がん剤の例として、ドセ夕キセル、タミバロテン、ェキセメスタン、フルタミ等が挙げられる。中枢神経系薬の例として、プロホフール、ブコ Pーム、ビペリデン

、卜リアゾラム、ケトプロフェン、フェイト二ン、ァモバルビタール、イブプロフェン、インドメ夕シン等が挙げられる。末梢神経系薬の例として、 U ドカイン、キシロカイン、フ Dプロピオン等が挙げられる。ホルモン剤の例として、ォキセンド □ン、テストステロン、エストラジ才 —ル、マキサカルシトール等が挙げられる。その他、アルプロス夕ジル、ピレ夕ニド、フロセミ、ミコナプール、各種疎水性ビ夕ン類、ヒノキチオール等が挙げられる。尚、本発明においては、 Γ薬物」は医薬品に限定されず、生体内で生理作用を発揮する、あらゆる低分子化合物を意味するここで低分子とは分子量が 1 5 0 0以下のものをいう。

使用する薬物の量は特に制限されないが、一 nx的にはブロックコポリマーと薬物の総重量に対して、 0 . 1〜 5 0、好ましくは 0 . 1〜 3 0重量％が使用される。

• 水性媒体

本発明でいう水性媒体とは、疎水性薬物のその中での溶解度が、本発明の低級アルコール中での溶解度よりも低いあらゆる水性媒体であってよく、例えば水、生理食塩水、緩衝能を有する水性緩衝液、例えばリン酸緩衝液、炭酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液などが上げられる。特に好ましいのは水である。

• 疎水性薬物及び親水性領域と疎水性領域とを有するプロックコポリマ ―

本発明の薬物内包ポリマ —ミセルを形成するのに用いることのでさるポリマ一は、親水性領域と疎水性の領域からなるブロックコポリマ ―であり、これらのブロックコポリマーは、本発明の目的に沿う ¾のであれば、いかなる親水性領域といかなる疎水性領域とを含むものであってもよい力具体的には、次のようなものを包含する限定されるものでないが、親水性領域としては、ポ (ェチレングリ 3 —ル） [またはポリ (エチレンォキシド） ] 、ポリサッ力ラィド、ポリ（ビニルビロリドン）、ホリ（ビ一ルアルコール）、ポリ（ァクリルアミド）、ポリ（ァクりル酸）、ポリ（メタクリルァミド）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ (メタクリル酸ェステル）、ポリ（ァクリル酸エステル）、ポリァミノ酸あるいはこれらの誘導体由来の領域が挙げられる。ここでポリサッ力ライドとしては、デンプン、 rキス卜ラン、フルク夕ン、ガラク夕ン等が挙げられる。これらのうち、ポリ（エチレングリ ^ —ル）セグメン卜は片末端に種々の官能基を有するものが提供されており、また、領域の大きさも制御されたものが容易に利用でさることから、好ましい。他方、限定されるものではないが、全体として、疎水性の領域としては、酸性アミノ酸、特に、ポリ（ァスパラギン酸）及び Z又はその誘導体、ポリ（グルタミン酸）及び z又はその誘導体を挙げることができる。具体的には、限定されるものではないが、例えばポ

•J ( β —ベンジルァスパルテート）、ポリ（ β 一ベンジルァスパルテー卜 —コ一ァスパラギン酸）、ポリ ( β —アルキルァスパルテー卜）、ポリ（ jS —アルキルァスパルテート一 ―ァスパラギン酸）

、ポリ ( jS —ァリルァスパルテート）、ポリ ( β ーァリルァスパルテー卜 —コ一ァスパラギン酸）、ポリ ( β —ァ •Jルァスパルテー卜

) 、ポリ（）8 —ァラルキルァスパルテート一 ―ァスパラギン酸）

、ポリ ( j8 —ァラルキルァスパルテート）、ポ U ( r —ベンジリレグル夕メート）、ポリ（ァ —ベンジルダルタメ ― h —コ一ダルタミン酸）、ポリ（ァ一アルキルグル夕メート）、ポ υ (ァーアルキルグル夕メ — トーコーダル夕ミン酸）、ポリ（ア ―ァラルキルグルタメ

― 卜）、ポリ（ァーァラルキルダルタメ一卜 ― 一グルタミン酸）

、ポリ ( ι8 _アルキルァスパルタミド―コ一ァスパラギン酸）、ポ

U ( r —ァラルキルダルタミドーコ—グル夕ン酸）などのポリ（酸性ァミノ酸誘導体）を挙げることができる

本発明で用いることのできるブロックコポリ —は、上記の親水性領域と疎水性の領域からなり、水性媒体（例えば、水または緩衝化された水もしくは水混和性溶媒、メタノール、ポリエチレングリコール、糖類、等を含有する水性溶液）中でポリマーミセルを形成しうる、それぞれの分子量を有する領域の組み合わせからなるすべてを挙げることができるが、好ましくは、親水性領域がポリ（ェチレンダリコール）からなり、疎水性の領域が上記のポリ（アミノ酸 ) 及び/又はその誘導体からなるものである。

このようなポリ（アミノ酸誘導体）セグメントは、それ自体公知の、ポリエチレングリ 3一ルーコーポリァスパラギン酸べンジルェステルまたは、小 •Jェチレンダリコール ―コーポリグルタミン酸べンジルエステルから調製することができる。ポリエチレンダリ 3— ルーコーポ ■Jァスパラギン酸ベンジルェステルまたは、ポリエチレングリコ一ル一 Π ―ポグルタミン酸べンジルエステルの調製は、肩末端が保護され、ちう一方の末端がァノ基であるポリェチレングリコール、例えば、 M e Ο ― P E G C H 2 H j C H 2 - - N H ₂を開始剤として、脱水された有機溶媒中で、 N一力ルポキシ — 13 —ベンジル— L ―ァスパルテート ( B L A ― N C A ) もしくは、 N―力ルポキシー r —ベンジル _ L ―グル夕メ一卜 ( B L G - N C A ) を所望の重合度 (ァミノ酸ュニッ卜数）となるように添加し、反応させることにより得ることがでさる

上記で得られたブロックコポ ϋマ一の末端をァセチルク口ライまたは無水酢酸よりァセチル化を施した後、アルカリ加水分解によりベンジル基を除去してポリエチレングリコールーコーポァスパラギン酸またはポリエチレングリコール一コ一ポリダル夕ン酸とした後、有機溶媒中で、所望のエステル化率となるようにベンジル

，

アルコールを添加し、縮合剤、例えば、 N— N ジシク Dへキシルカルポジイミド（D C C ) または N— N ' -ジィソプロピルカルポジイミド（D I P C I ) 存在下で反応させることにより、部分的にべンジルエステルを有するブロックコポリマ一を ί守るしとができる。

さらに、例えば、ベンジルアルコ ―ルの代わりに、 1 一ォクタノ

—ルを反応させれば、ポリエチレングリコール一ーポァスパラギン酸ォクチルエステル、ポリェチレングリコ一ル - Π一ポリダル夕ミン酸ォクチルェステルが得られ、同様に 1 一デカノ一ルを用いれば、ポリエチレングリコール— ーポリアスパラギン酸ドデシルエステルが、 1 — へキサデ力ノールを用いればポリエチレングリコール—コーポリアスパラギン酸へキサデシルエステルをそれぞれ得ることが出来る。

また、アミド結合により疎水性側鎖を導入する場合は、前述の通り、ポリエチレングリコール—コ―ポリアスパラギン酸ベンジルェステルまたは、ポリエチレングリコール— コ—ポリグルタミン酸べンジルエステルをァセチル化を施した後、アルカリ加水分解によりベンジル基を除去したカルボキシル基にアミノ基を有する疎水性側鎖を反応させるか、ポリエチレングリコール一コーポリアスパラギン酸べンジルエステルと一級アミンを有する化合物を反応させ、ァミノリシスを利用してエステル結合からアミド結合へ変換して導入することができる。

さらに、はじめに所望のアミド化率になるように有機溶媒中で 1 一才クチルァミンなどをポリエチレングリコール—コーポリアスパラギン酸べンジルエステルに添加して一定時間反応させた後、未変換のべンジルエステルに対して大過剰量の 1 , 8 —ジァミノォク夕ンなどを加えることにより、疎水性基の末端がァミノ基で置換された疎水性側鎖とァミノ基で置換されていない疎水性側鎖が混在するポリ（ァノ酸誘導体）セグメントにすることもでさる。エステル化又はァド化の割合は、ァミノ酸ュニッ卜数全体に対して 4 0 % 1 0 0 である。ァスパラギン酸、ダル夕ミン酸は、いずれかの光学活性型のものであるか、それらの混合物であることができる以上の親水性セグメントと疎水性のセグメン卜は、それ自体既知の例えば、ェステル結合、アミド結 A

α ィミノポロ □ 、灰素一炭素結

、エーテル結合等で連結されうる。

特に、製造容易であり、本発明で都合よく使用できるブロックコポリマーとしては、下記式（ I ) および（ I I ) で示すことのできるものを挙げることができる。

R, WCH,CH,^ (COCHNHKCOR₇CHNm R₂

( I )

(CH₂) _y (CH₂) _y

C=0 C=0

R₅ R₅ Re R₆

または

上記各式中 R,および R₃は、それぞれ独立して、水素原子または保護されていてもよい官能基が置換したもしくは未置換の低級アルキル基を表し、 R₂は水素原子、飽和もしくは不飽和の C ,〜 C₂₉脂肪族カルボニル基またはァリールカルボ二ル基を表し、 R₄は水酸基、飽和もしくは不飽和の C ,〜 C_{3 Q}脂肪族ォキシ基またはァリールー低級アルキルォキシ基を表し、 R₅は— O—または— NH—を表し、 R₆は、水素原子、フエニル基、 ― （C H₂) ₄—フエニル基、未置換もしくは、アミノ基またはカルボキシル基で置換された C ₄〜 C _{I 6}アルキル基、またはベンジル基を表し、 R₇はメチレン基またはエチレン基を表し、 nは 1 0〜 2 5 0 0の整数であり、 Xは 1 0〜 3 0 0 となる整数であり、 mは 0〜 3 0 0 となる整数であり（但し、 mが存在する場合、（C O C HNH) のユニットと（C O R ₇ C H N H) のユニット、又は（NH C H C O) と（NH C H R₇ C O) のユニットはランダムに存在し、 R ₆は 1つのブロックコポリマー内の各アミノ酸ュニッ卜において任意に選択可能であるカ^ R ₆が水素原子である場合、 x +mの全体の 6 0 %未満である）、 y は 1又は 2の整数を表し、は— NH―、 —〇 _、 - O - Z - N H―、 — C O _、 — C H₂ _、 _ 0— Z— S— Z—および— O C〇 - Z - N H - (ここで、 Zは独立して C ,〜 C₆アルキレン基である。）からなる群より選ばれる連結基を表し、 L₂がー O C O— Z— C O—および一 NH C〇— Z _ C〇 _ (ここで、 Zは独立して C , 〜 C₆アルキレン基である。）から選択される連結基を表す。保護されていてもよい官能基としては、ヒドロキシル基、ァセタール基、ケタール基、アルデヒド基、糖残基等が挙げられる。 R,および R₃が保護されていてもよい官能基が置換した低級アルキル基を表す場合の親水性セグメントは、例えば、 W〇 9 6 / 3 3 2 3 3、 W 〇 9 6 / 3 2 4 3 4、 WO 9 7 / 0 6 2 0 2に記載の方法に従うことができる。低級アルキルとは炭素数が例えば 7個以下、好ましくは 4個以下の直鎖又は分枝鎖アルキル基を意味し、例えばメチル基、ェチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基などが含まれる。

形成した薬物内包ポリマーミセルについて、必要であれば、それを含有する水性溶液を孔径 0. 2 2 ； mの親水性フィルターでろ過する。 0. 2 2 mのフィル夕一は、通常、注射剤（静脈注射用、動脈注射用、筋肉注射用、腹腔内注射用、等）の調製に際して、使用されることが公知である。薬物内包ポリマーミセル水溶液は、 0 . 2 2 imのフィルターを用いて除菌ろ過しても、極めて高収率で除菌済み薬物内包ポリマーミセル水溶液を得ることができる。すなわち、本発明によれば、注射剤が効率よく提供できる。このような注射剤は、本発明の好適な態様の一つとして、各種の糖類および/ または各種のポリエチレングリコール（マクロゴール）を、低級ァルコールの濃度を低下させたおよびまたは除去した除菌ろ過前の薬物内包ポリマーミセル水溶液（または水性溶液）に加える工程をさらに含んでなる方法により製造できる。限定されるものでないが、使用できる糖類としては、マルトース、トレハロース、キシリトール、グルコース、スクロース、フルクトース、ラクトース、マン二トールおよびデキストリン等が挙げられ、使用できるポリェチレングリコールとしては、分子量が約 1 0 0 0〜約 3 5 0 0 0であつて、例えば、マクロゴール 1 0 0 0、 1 5 4 0、 4 0 0 0、 6 0 0 0、 2 0 0 0 0および 3 5 0 0 0等が挙げられる。こうして、本発明によれば、注射剤中で薬物内包ポリマーミセルを安定化しうる助剤を注射剤に簡易、かつ、安全に加えることができる。

このような注射剤は簡易、かつ、安全に製造できるだけでなく、それらを凍結乾燥した場合には、乾燥製剤を水または水性溶液を用いて薬物内包ポリマーミセル含有溶液に再溶解または再構成するときでも、ミセル粒子間での凝集がほとんど起こらない注射液が提供できる。

凍結乾燥製剤が上記のような作用効果を奏するには、凍結乾燥前の溶液における糖類は、その最終濃度が 0. 1〜 1 5 % (w/ V ) になるように加え、ポリエチレングリコールはその最終濃度が 0. 5〜 1 0 % (w/ V ) になるように加えるのがよい。通常、ブロックコポリマーと糖類またはポリエチレングリコールとの割合は、それぞれ重量で 1 ： 1〜 1 ： 1 0または 1 ： 0. 5〜 1 ： 1 0である以下に比較例、実施例を示し、本発明を具体的に示す。

以下においては、ポリエチレングリコール一ポリ（ )8—べンジル一 Lーァスパラギン酸）ブロックコポリマーを A、ポリエチレングリコール—ポリ（ァ—ベンジルー L—グルタミン酸）ブロックコポリマーを Gと略す。また、例えばブロックコポリマーの P E G鎖の平均分子量 1 2， 0 0 0、ポリアミノ酸鎖 4 0残基、ポリアミノ酸側鎖のベンジル基の導入率が 6 0 %の場合、各ブロックコポリマーの後に、 .1 2 — 4 0 ( 6 0 ) と表記する。従って、例えばポリェチレングリコール一ポリ（ j8 —ベンジル一 L—ァスパラギン酸）ブロックコポリマーの P E G鎖の平均分子量が 1 2， 0 0 0、ポリアミノ酸鎖が 4 0残基、ポリアミノ酸側鎖のベンジル基の導入率が 6 0 %の場合、 A12-40 (60)と表記する。実施例

ぐ実施例 1 : エタノール法— 1 >

ブロックコポリマー、 A12- 40 (100)、 A12-40 (60) , G12- 40 (100)、 G12-40 (60)をそれぞれ 20mg各スクリュー管に秤量し、水 3mLを添加した後、超音波処理（レベル 4、 1秒間欠 10分、日本精機）を行い空ミセルとした。この各空ミセル溶液 2mLを撹拌しておき、そこへェ夕ノールに溶解したドセタキセル（3.5mg/mL) 200uLを徐々に添加し、再度超音波処理を行いドセタキセル内包ミセルとした（ポリマ —対ドセタキセルの重量比 5 (w/w)、最終エタノール濃度 10 (v/v ) ) 。

調製したミセルの粒子径は、 NIC0MP (商標） 380ZLS (PSS - NIC0 MP) にて測定し、ガウス分布、または Nicomp 分布の強度の平均値を用いた。内包率は、ミセルを MILLEX (登録商標） - GV PVDF, 0.22u m (Millipore) にてろ過し、ろ液を超遠心分離（ 200, 000g、 1時間、 20で）した。ろ過前サンプル、ろ液、超遠心分離後の上清の 280π mにおける吸光度を分光光度計にて測定した。ドセタキセルの最大吸光度は 280nmであり、ブロックコポリマーも 280nmの吸光がみられるため、内包率は以下の方法によって求めた。

ろ過前サンプル、ろ液および同時にコントロールとして同条件で調製した空ミセル溶液のそれぞれを 50% (v/v)ァセトニトリルで 20〜 200倍に希釈し、ポリマーミセルを崩壊させた。同様に、超遠心分離後の上清を 50% (v/v)ァセトニトリルで希釈した。

上記ろ液中のポリマーミセルを崩壊させた液の 280nmにおける吸光度から上記空ミセル溶液中のポリマーミセルを崩壊させた液の 28 Onmにおける吸光度を差し引き、ろ液中のドセタキセルに由来する 2 80nmにおける吸光度を求めた。更に、ろ液にはエタノールが含まれるためミセルに内包されていないドセタキセルがわずかに溶解していることから、超遠心分離後の上清の 50% (v/v)ァセトニトリル希釈液の 280nmにおける吸光度を測定した。それぞれの吸光度をドセタキセルの検量線に当てはめ、得られた値に希釈率を乗算してそれぞれの液中のドセタキセル量を求めた。

ミセルに内包されたドセタキセル量は、ろ液中のドセタキセル量から超遠心分離後の上清中のドセタキセル量を差し引いて求めた。

またろ過前サンプル中のポリマーミセルを崩壊させた液の 280nm における吸光度から、空ミセル溶液中のポリマーミセルを崩壊させた液の 280nmにおける吸光度を差し引き、検量線からろ過前サンプルのドセ夕キセル量を求めた。内包率は、ミセルに内包されたドセタキセル量をろ過前サンプルのドセタキセル量で除し求めた。

内包率）

=ミセルに内包されたドセタキセル量 Zろ過前サンプルのドセ夕キセル量 X 100

調製したドセタキセル内包ミセルの粒子径および内包率を表 1 に示した。表 1 (エタノール法- 1により調製したドセタキセル内包ミセル)

<実施例 2 ：エタノール法 _ 1 >

ドセタキセルの代わりにインドメタシンを用いた以外は実施例 1 と同様の条件でミセル調製を行い、粒子径を測定し、以下の方法により内包率を求めた。インドメ夕シンの最大吸光度は 320nmであり、ブロックコポリマーも 320nmに吸光がみられるため、ろ過前サンプル、ろ液、空ミセル溶液のそれぞれを 5 (U (v/v)ァセトニトリルで 20〜 200倍に希釈しポリマーミセルを崩壊させ、それぞれの 320ηπιにおける吸光度を測定した。同様に、超遠心分離後の上清を 50% (v/v) ァセトニトリルで 20〜200倍に希釈し 320ηηιにおける吸光度を測定し、実施例 1 と同様の方法により、インドメ夕シンの検量線から内包率を求めた。その結果を表 2 に示した。

(エタノ一ル法- 1により調製したィンドメ夕シン内包ミセル)

<実施例 3 ：エタノール法一 1 >

ドセタキセルの代わりにひ -トコフエロールを用いた以外は実施例 1 と同様の条件でミセル調製を行い、粒子径を測定し、以下の方法により内包率を求めた。ひ— トコフエロールの最大吸光度は 29 In mであり、ブロックコポリマーも 291nmに吸光がみられるため、ろ過前サンプル、ろ液、空ミセル溶液のそれぞれを 50% (v/v>ァセトニトリルで 20〜 200倍に希釈しポリマーミセルを崩壊させ、それぞれの 2 91nmにおける吸光度を測定した。同様に、超遠心分離後の上清を 50 % (v/v)ァセトニトリルで 20〜200倍に希釈し 291nmにおける吸光度を測定し、実施例 1 と同様の方法により、 α _ トコフエロールの検量線から内包率を求めた。その結果を表 3に示した。

(エタノ一ル法 - 1により調製した α-トコフエロール内包ミセル)

ぐ実施例 4 ：エタノール濃度の影響 >

ブロックコポリマー、 A12- 40 (100)、 G12- 40 (100)をそれぞれ 20mg 各スクリュー管に秤量し、水 3mLを添加した後、超音波処理を行い空ミセルとした。この各空ミセル溶液 2mLを撹拌しておき、そこへエタノールに溶解したドセタキセル（7. Omg/mL) lOOuLを徐々に添加し、再度超音波処理を行いドセタキセル内包ミセルとした（ポリマー対ドセタキセルの重量比 5% (w/w)、最終エタノール濃度 55Uv/ v) ) 。同様に、 A12- 40 (100)、 G12-40 (100)をそれぞれ 20mg秤量し、それに対し水 2.4mLを添加し、超音波処理を行った。そのうち各 1. 6mLにドセタキセル（1.8mg/niL) 400uLを徐々に添加し、再度超音波処理を行った（最終エタノール濃度 20¾(v/v) ) 。また A12-40U00) 、 G12- 40 (100)をそれぞれ 20mg秤量し、それに対し水 2. lmLを添加し、超音波処理を行った。そのうち各 1.4mLにドセタキセル（1.2mg /mL) 6OO11Lを徐々に添加し、再度超音波処理を行った（最終ェ夕ノール濃度 30% (v/v) ) 。

調製したミセルの粒子径および内包率を、実施例 1 と同様に求めた。ただし、超遠心分離は最終エタノール濃度力 s'5% (v/v)の際には 2 00, OOOg, 1時間、 20 、最終エタノール濃度が 20および 30% (v/v)の際には 500， 000g、 1時間、 20でとした。その結果を表 4に示した。

(ドセタキセル内包ミセルのエタノ一ル濃度の影響)

<実施例 5 ：エタノール濃度の影響 >

ドセタキセルの代わりにインドメ夕シンを用いた以外は実施例 4 と同様の条件でミセル調製を行い、粒子径を測定、内包率を実施例 2に記載の方法により求めた。その結果を表 5に示した。表 5 (インドメ夕シン内包ミセルのエタノール濃度の影響)

<実施例 6 ：エタノール法一 2〉

ブロックコポリマ一、 A12-40 (100)、 G12- 40 (100)、 G12-40 (60)をそれぞれ 20mg各スクリユー管に秤量し、水 3mLを添加した後、超音波処理を行い空ミセルとした。エタノールに溶解したドセタキセル (3.5mg/mL) 200uLを撹拌しておき、そこへ各空ミセル溶液 2mLを徐々に添加し、再度超音波処理を行いドセタキセル内包ミセルとした（ポリマー対ドセタキセルの重量比 5 (w/w)、最終エタノール濃度 10% (v/v) ) 。調製したミセルの粒子径および内包率を実施例 1 と同様に求め、その結果を表 6 に示した。

(エタノール法- 2により調製したドセタキセル内包ミセル)

<実施例 7 ：エタノール法 _ 2 >

ドセタキセルの代わりにインドメ夕シンを用いた以外は実施例 6 と同様の条件でミセル調製を行い、粒子径を測定し、実施例 2 に記載の方法により内包率を求めた。その結果を表 7 に示した。

(エタノール法- 2により調製したインドメ夕シン内包ミセル)

<実施例 8 ：エタノール法一 3 >

ブロックコポリマ一、 A 12- 40 ( 100)、 G 12-40 ( 100) , G 1 2-40 (60)をそれぞれ 20mg各スクリユー管に秤量し、さらにドセタキセル各 l mg を秤量し、エタノール 300uLを添加して 40でに加温することで分散溶解した。これを撹拌しておき、そこへ水 3mLを徐々に添加した後、超音波処理を行った。これをドセタキセル内包ミセルとした（ポリマー対ドセタキセルの重量比 5% (w/w)、最終エタノール濃度 10% (v/v) ) 。調製したミセルの粒子径および内包率を実施例 1 と同様に求め、その結果を表 8 に示した。 (エタノール法- 3により調製したドセタキセル内包ミセル)

ぐ実施例 9 ：エタノール法一 3 >

ドセタキセルの代わりにインドメ夕シンを用いた以外は実施例 8 と同様の条件でミセル調製を行い、粒子径を測定し、実施例 2 に記載の方法により内包率を求めた。その結果を表 9 に示した。

(エタノール法 _3により調製したインドメタシン内包ミセル)

ぐ比較例 1 ：乾固法 >

ブロックコポリマー、 A12-40 (100)、 A12-40 (60)、 G12-40 (100) , G12-40 (60)をそれぞれ 20mg各スクリュー管に秤量し、さらにドセ夕キセル各 lmgを秤量し、ジクロロメタン lmLを添加して溶解した。これを窒素ガスにより乾燥させ、さらにデシケ一夕内で減圧乾燥を行った。そこへ水 3mLを添加し、 4でにて一晩撹拌した後、超音波処理を行うことでドセタキセル内包ミセルとした（ポリマー対ドセタキセルの重量比 5 (w/w)) 。調製したミセルの粒子径および内包率を実施例 1 と同様に求め、その結果を表 1 0 に示した。表 1 0 (乾固法により調製したドセタキセル内包ミセル)

ぐ比較例 2 ：乾固法 >

ドセタキセルの代わりにインドメ夕シンを用いた以外は比較例 1 と同様の条件でミセル調製を行い、粒子径を測定し、実施例 2 に記載の方法で内包率を求めた。その結果を表 1 1 に示した。

(乾固法により調製したインドメ夕シン内包ミセル)

ぐ比較例 3 ：分散法 >

ブロックコポリマー、 A 12-40 ( 100)、 A 12-40 (60) , G 12-40 ( 100) , G 12- 40 (60)をそれぞれ 20mg各スクリユー管に秤量し、水 3mLを添加し 4でにて撹拌した。ドセタキセル 10mgをジクロロメタン l mLに溶解し、そのうち l OOuLを撹拌している各ポリマー分散溶液 3mL中に添加し、激しく撹拌した。その後、スクリユー管の蓋をとり、一晩撹拌しながらジクロロメ夕ンを揮発させ、超音波処理を行ったものをドセタキセル内包ミセルとした（ポリマー対ドセタキセルの重量比 5% (w/w) ) 。調製したミセルの粒子径および内包率を実施例 1 と同様に求め、その結果を表 1 2 に示した。 (分散法により調製したドセタキセル内包ミセル)

<比較例 4 ：分散法 >

ドセタキセルの代わりにインドメ夕シンを用いた以外は比較例 3 と同様の条件でミセル調製を行い、粒子径を測定し、実施例 2 に記載の方法で内包率を求めた。その結果を表 1 3 に示した。

(分散法により調製したインドメ夕シン内包ミセル)

Claims

請求の範囲

1 . ポリマーミセル中に疎水性薬物を内包させる方法であって、以下の段階：

( 1 -a)前記疎水性薬物を低級アルコールに溶解または分散し、

( 1 -b)親水性領域と疎水性領域とを有するブロックコポリマーからなる前記ポリマーミセルを含有する水性媒体を準備し、

( 1 -c)該疎水性薬物を溶解または分散した低級アルコール溶液又は分散液と、前記ポリマーミセルを含有する該水性媒体とを混合することで、該ポリマーミセル中に該疎水性薬物を内包させる；を含んでなり、ここで前記疎水性薬物の水溶解度は、前記低級ァルコール中での溶解度よりも低い、方法。

2 . 前記段階（1 - c)が、前記疎水性薬物を溶解または分散した低級アルコール溶液又は分散液を、前記ポリマーミセルを含有する前記水性媒体に添加することを含んでなる、請求項 1 記載の方法。

3 . 前記段階（1 - c)が、前記ポリマーミセルを含有する前記水性媒体を、前記疎水性薬物を溶解または分散した低級アルコール溶液に添加することを含んでなる、請求項 1記載の方法。

4 . 前記段階 - c)において、さらに前記低級アルコール溶液又は分散液と前記水性媒体との混合物にエネルギーを与えることを含む、請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の方法。

5 . 前記段階（1 -c)の後、さらに前記低級アルコールを除去または濃度を低下させる段階を含む、請求項 1 〜 4のいずれか 1項に記載の方法。

6 . ポリマーミセル中に疎水性薬物を内包させる方法であって、以下の段階：

(2 - a)前記疎水性薬物及び親水性領域と疎水性領域とを有するブロックコポリマーの両者を低級アルコールに溶解または分散し、

(2-b)該疎水性薬物及びブロックコポリマーの両者を溶解または分散した低級アルコール溶液又は分散液と、水性媒体とを混合することで、該ブロックコポリマーからポリマーミセルを形成するとともに、該ミセル中に該疎水性薬物を内包させる；

7 . 前記段階（2- b)が、前記疎水性薬物及びブロックコポリマーの両者を溶解または分散した低級アルコール溶液又は分散液を、前記水性媒体に添加することを含んでなる、請求項 6記載の方法。

8 . 前記段階（2-b)が、前記水性媒体を、前記疎水性薬物及びブロックコポリマーの両者を溶解まこは分散した低級アルコール溶液又は分散液に添加することを含んでなる、請求項 6記載の方法。

9 . 前記段階（2-b)において、さらに前記疎水性薬物及びブロックコポリマーの両者を溶解または分散した水性媒体と低級アルコールとの混合物にエネルギーを与えることを含む、請求項 6〜 8のいずれか 1項に記載の方法。

10. 前記段階（2-b)の後、さらに前記低級アルコールを除去または濃度を低下させる段階を含む、請求項 6〜 9のいずれか 1項に記載の方法。

1 1 . 前記水性媒体が水又は水性緩衝液である、請求項 1〜 1 0のいずれか 1 項記載の方法。

1 2. 前記ブロックコポリマーの親水性領域がポリエチレングリコール（ P E G ) である、請求項 1 〜 1 1 のいずれか 1項に記載の方法。

1 3. 前記疎水性領域がアミノ酸および/又はその誘導体からなる、請求項 1 〜 1 2のいずれか 1項に記載の方法。

14. 前記アミノ酸および/又はその誘導体がダルタミン酸またはァスパラギン酸および Z又はそれらの誘導体である、請求項 1 3 に記載の方法。

15. 前記疎水性薬物が抗がん剤、抗菌剤、抗真菌剤、抗ウィルス剤、抗生物質、中枢神経薬、末梢神経系薬、ホルモン剤、麻酔薬及び鎮痛剤からなる群から選ばれる、請求項 1〜 1 4のいずれか 1項に記載の方法。