WO2007116965A1

WO2007116965A1 - グラフトポリマーとカルシウム化合物とを含む微粒子

Info

Publication number: WO2007116965A1
Application number: PCT/JP2007/057751
Authority: WO
Inventors: Masakazu Koiwa; Yoshinori Kakizawa; Takao Aoki
Original assignee: Toray Industries, Inc.
Priority date: 2006-04-12
Filing date: 2007-04-06
Publication date: 2007-10-18
Also published as: JPWO2007116965A1

Abstract

　本発明は、主鎖またはグラフト鎖のいずれかの少なくとも一方にカルボキシル基を有するグラフトポリマーと、リン酸カルシウムまたは炭酸カルシウムのうちのいずれかの少なくとも一種類のカルシウム化合物とを含む微粒子であって、グラフトポリマーのグラフト鎖がポリエチレングリコールセグメントを有する微粒子である。本発明の微粒子は、薬物の標的へのデリバリー(delivery)などに有用である。

Description

明細書

グラフトポリマーとカルシウム化合物とを含む微粒子

技術分野

[0001] 本発明は、主に、タンパク質医薬、ペプチド医薬、または、核酸医薬の製剤技術において有用な、グラフトポリマーとカルシウム化合物を含む微粒子に関する。

背景技術

[0002] ナノパーティクル (nanoparticle)、マイクロパーティクル (microparticle)、ナノスフィァ (n anosphere)、マイクロスフィァ (microsphere)あるいはマイクロカプセルなどと呼ばれる微粒子に薬剤を封入した微粒子製剤が開発され、薬物のキャリア (carrier)として用いることが検討されている。微粒子の基材としては、高分子化合物や脂質などの有機化合物および無機化合物など種々の材質が用いられて、る。

[0003] 生体適合性の無機化合物であるハイドロキシアパタイトを含む微粒子として、ポリエチレングリコールとポリアミノ酸からなるブロックコポリマーとハイドロキシアパタイトを利用した有機—無機ノ、イブリツド型 DNA内封微粒子が開示されている (特許文献 1)。開示されている技術は、 DNAとハイドロキシアパタイトとの高親和性を利用してァパタイトの結晶中に DNAを内封し、さらにブロックポリマーのカルボン酸部位とァパタイトとの高親和性を利用して結晶の表面にブロックポリマーを被覆させることにより結晶の粒径もコントロールしている。しかしながら、ブロックポリマーを使用するため、その合成に精密な制御を要し、また微粒子表面への機能修飾のための各種官能基の導入にはポリエチレングリコールの末端のみし力利用出来ず、機能修飾の自由度が低いという欠点がある。また、カルボキシル基を含む高分子化合物とリン酸カルシウム微粒子を含有することを特徴とする化粧料が開示されている (特許文献 2)。開示されて V、る技術は、微粒子製造時に沈降物の生成が認められ粒子径の分布が大き!/、と!/、う問題があることに加えて、薬物の微粒子への封入を目的としておらず、薬物の微粒子への封入は示唆されて!、な！/、。

[0004] ポリアスパラギン酸とポリエチレングリコールセグメントからなるグラフトポリマーとして、ポリハイド口キシェチルァスパルタミド誘導体が開示されており、このグラフトポリマ一を用いて調製した薬物 (パクリタキセル)を含有するポリマーミセルカその薬物活性や体内動態に与える影響について報告されている (非特許文献 1)。しかし、本報告は高分子ミセルに関するものであり、グラフトポリマーとカルシウム化合物とからなる微粒子に関する技術ではなぐまた、親水性薬物の担持には適していない。

特許文献 1：国際公開第 03Z018690号パンフレット

特許文献 2：特開 2001 - 302431号公報

非特許文献 1：ゲンナラカバラ口（Gennara Cavallaro)、外 5名、「コロイド性薬物輸送担体機構としてのポリハイド口キシェチルァスパルタミド誘導体」（Poly (hydroxyethyla spart amide; derivatives as colloidal drug carrier systems;、ンャ ~~ナルォブコントロールドリリース（Journal of Controlled Release)、 2003年、 89卷、 p.285— 295 発明の開示

[0005] 本発明は、主鎖またはグラフト鎖のいずれかの少なくとも一方にカルボキシル基を有するグラフトポリマーと、リン酸カルシウムまたは炭酸カルシウムのうちのいずれかの少なくとも一種類のカルシウム化合物とを含む微粒子であって、グラフトポリマーのグラフト鎖がポリエチレングリコールセグメントを有する微粒子である。

図面の簡単な説明

[0006] [図 1]図 1は、微粒子に封入したインシュリンをマウスに皮下投与した場合の血中インシユリン濃度の経時変化である。

[図 2]図 2は、微粒子に封入したインシュリンをマウスに皮下投与した場合の血中ダルコース濃度の経時変化である。

発明を実施するための最良の形態

[0007] 本発明は、主鎖またはグラフト鎖のいずれかの少なくとも一方にカルボキシル基を有するグラフトポリマーと、リン酸カルシウムまたは炭酸カルシウムのうちのいずれかの少なくとも一種類のカルシウム化合物とを含む微粒子であって、グラフトポリマーのグラフト鎖がポリエチレングリコールセグメントを有する微粒子である。

[0008] 主鎖またはグラフト鎖の、ずれかの少なくとも一方のカルボキシル基の酸性の水酸基が遊離することでァ-オン性カルボキシレート（〇—）となり、このカルボキシレートとカルシウム化合物との親和性により、カルシウム化合物とグラフトポリマーが複合ィ匕して形成された微粒子である。本発明において、カルボキシル基を有するとは、カルボキシレートが任意の陽イオンとともに塩として存在している形態も含まれる。陽イオンとしては、例えば、アルカリ金属イオン (Na+、 K+等）、アルカリ土類金属イオン (Ca²⁺、 Mg² +等)等が挙げられる。

[0009] 本発明において、グラフトポリマーとは、一本の主鎖に一本以上のグラフト鎖が化学的に結合されているポリマーである。

[0010] 本発明において、グラフトポリマーは、カルシウム化合物との親和性を発現するために、主鎖またはグラフト鎖のいずれかの少なくとも一方にカルボキシル基を有する。本発明にお、て、カルボキシル基を主鎖またはグラフト鎖の、ずれかの少なくとも一方に有するグラフトポリマーは、例えば、下記（1)〜（3)の公知の方法によって製造できる。

(1)カルボキシル基を有する主鎖にグラフト鎖を導入する方法。

(2)反応性基を有する主鎖にカルボキシル基を有するグラフト鎖を導入する方法。

(3)グラフトポリマーの主鎖またはグラフト鎖にカルボキシル基を導入する方法。

[0011] 本発明の微粒子は、薬剤送達用キャリア一として使用する理由から、グラフトポリマ一が生体適合性であることが好ましぐ微粒子の生体適合性という観点からは、グラフトポリマーの主鎖が生体適合性であることがとくに好ましい。ここで、「生体適合性」とは、生体内に投与後、生体組織に適合して生体への障害などを示さない性質、すなわち生体適合性を有することをいい、例えば、生体内で分解代謝されて、最終的には体外に排泄される性質を、う。

[0012] 本発明において、グラフトポリマーの主鎖またはグラフト鎖としては、脂肪族ポリエステル、ポリオルトエステル、ポリアルキレングリコール、ポリウレタン、ポリシロキサン、ポリ酸無水物、ポリエチレングリコール、ポリビュルピロリドン、ポリビュルアルコール、ポリエチレンィミン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリ一 1, 3 ジォキソラン、 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリンポリマー、ポリ 1, 3, 6 トリオキサン、ポリアミノ酸または多糖類、ある、はこれらの類縁体が好ま、。

[0013] 前記（1)〜（3)の製造法により、カルボキシル基を有するグラフトポリマーを得るためには、グラフトポリマーの主鎖またはグラフト鎖がポリアミノ酸または多糖、あるいはこれらの類縁体であることが、好ましい。グラフトポリマーの主鎖がポリアミノ酸または多糖、あるいはこれらの類縁体であることが、より好ましい。

[0014] グラフトポリマーの主鎖またはグラフト鎖となるポリアミノ酸は、天然あるいは非天然であってもよい。構成アミノ酸としては、例えば、グルタミン酸、ァスパラギン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン、システィン、チロシン、フエ二ルァラニン、トリプトファンなどが好ましい。構成アミノ酸は、 1種類の重合体である力、あるいは 2種類以上のァミノ酸がブロック状あるいはランダム状に共有結合していてもよい。構成アミノ酸が、 2種類以上のアミノ酸の場合、各アミノ酸の構成比は適宜決められる。アミノ酸は、 D体、 L体、ラセミ体のいずれでもよい。

[0015] 本発明にお、て、ポリアミノ酸の構成アミノ酸としては、グルタミン酸、ァスパラギン酸、アルギニン、リジン、システィンなどが好ましぐなかでも、酸性アミノ酸であるダルタミン酸もしくはァスパラギン酸がとくに好ましい。特に、本発明の微粒子は、グラフトポリマーの主鎖が、ポリアスパラギン酸またはポリグルタミン酸であることが好まし、。

[0016] ポリグルタミン酸は、ポリ α—グルタミン酸、ポリ γ グルタミン酸の!/ヽずれでもょ、。ポリグルタミン酸の一般的な製造法は以下である。

[0017] ポリ α グルタミン酸は、カップリング法、 Ν—カルボキシ無水物 (NCA)法など化学合成法や酵素法等によって製造することができる。ポリ a グルタミン酸のェ業的製造方法は、 NCA法が広く知られている。ポリ— γ—グルタミン酸は、化学合成、酵素合成の他、納豆菌等のバチルス属の菌体を用いた培養により製造することができる。納豆菌等を用いた場合には、納豆の粘質物中に含まれるポリ— γ—ダルタミン酸を抽出することや、菌体が菌体外に分泌するポリ γ グルタミン酸を用いることができる。一般に、納豆粘質物中のポリ γ グルタミン酸やバチルス属が通常の培養条件で分泌するポリ γ グルタミン酸は、高分子量体であり、非常に粘性が高いため、用途に応じて、酸や酵素による低分子化処理をすることができる。

[0018] ポリアスパラギン酸としては、ポリ (Xーァスパラギン酸、ポリ 13ーァスパラギン酸の、ずれでもよ、。ポリアスパラギン酸の一般的な製造法は以下である。

[0019] ポリアスパラギン酸は、通常の生産方法では、ポリ α、 j8—ァスパラギン酸が得られる。ポリ α、 j8—ァスパラギン酸は、ァスパラギン酸を加熱脱水縮合した後、加水分解することにより製造する方法や、無水マレイン酸とアンモニアを加熱反応させマレイミドを経て得られる重合物を加水分解することにより製造することができる。

[0020] 多糖は、カルボン酸基を有する多糖が好ましく、ジエランガム、アルギン酸、ヒアルロン酸、カルボキシメチルセルロースなどが好ましい。さらに、多糖は、水溶性多糖を、アルカリ、特に水酸ィ匕ナトリウムで加熱処理するなどして得られるカルボキシ多糖が好ましぐ原料多糖としては、セルロース、デキストラン、デンプン、グリコーゲン、プルラン、シゾフィラン、レンチナン、ぺスタロチアン、マンナン、ァガロース、ガラクタン、了ラビナンが好ましい。

[0021] カルボン酸基を有する多糖は、カルボン酸基を有する多糖にアミノ基を有するポリエチレングリコール誘導体を脱水剤および Zまたは官能基の活性化剤を用いて縮合反応させることにより得られるグラフトポリマーが好ましい。また、グラフトポリマー主鎖となる多糖としては、デキストラン、デンプン、グリコーゲン、プルラン、シゾフィラン、レンチナン、ぺスタロチアン、マンナン、ァガロース、ガラクタン、ァラビナン、キチン、キトサンも好ましい。

[0022] 本発明の微粒子を構成するグラフトポリマーの数平均分子量は、 3000〜300000 であることが好ましい。本明細書での数平均分子量とは，分子の大きさの重み付けを考慮しない方法で算出した平均分子量であり、ポリマー末端基数の算出に用いることができる。一般には，数平均分子量は、ポリマーの末端基定量を行って求めることができるが、プルランを基準物質としてゲルパーミシヨンクロマトグラフィー（GPC)で測定したプルラン換算の分子量として求めることもできる。

[0023] 本発明は、グラフトポリマーと、カルシウム化合物とを含む微粒子であって、グラフトポリマーのグラフト鎖がポリエチレングリコールセグメントを有する微粒子である。

[0024] ポリエチレングリコールセグメントの数平均分子量は、本発明の微粒子の粒径をコントロールする上で、 100〜50000であること力 S好ましく、さらに好ましくは 2000〜20 000である。

[0025] カルボキシル基を有する主鎖またはグラフト鎖に、グラフト鎖としてポリエチレンダリコールセグメントを導入する方法としては、例えば、以下の (4)および（5)の方法が挙げられる。以下の (4)および（5)の方法は、特に、カルボキシル基を有する主鎖に、グラフト鎖としてポリエチレングリコールセグメントを導入する方法として、有用である。

[0026] (4)カルボキシル基を有する主鎖またはグラフト鎖に対して、アミノ基または水酸基を有するポリエチレングリコール誘導体を所望により脱水剤および Zまたは官能基の活性化剤を用いて縮合反応させることにより導入する方法。

[0027] (5)カルボキシル基を有する主鎖またはグラフト鎖に対して、末端の水酸基がハライド、メタンスルホ-ル基などの脱離性の高ヽ官能基で置換もしくは保護されたポリエチレングリコール誘導体を塩基存在下で反応させ導入する方法。ここで用いる塩基は、トリェチルァミン、ジイソプロピルェチルァミン、トリエタノールァミンなどの脂肪族 3 級ァミン、 N—メチルモルホリンなどの脂環式 3級ァミン、ジメチルァ-リン、ジェチルァ-リンなどの芳香族 3級ァミン、または炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸セシウムなどの無機塩が挙げられる。

[0028] 本発明の微粒子のグラフトポリマーは、主鎖が、ポリ酸性アミノ酸で側鎖がポリェチレンダリコールセグメントを有するもの力本発明の目的であるドラッグデリバリーシステム (DDS)のキャリアとして、生体適合性などの観点から、特に好ましい。

[0029] 本発明の微粒子を構成するグラフトポリマーの好ま、形態は、

グラフトポリマーが、下記の一般式 1

[0030] [化 1]

[0031] (R¹は、炭素数 1〜9の直鎖アルキレン基、または、二重結合を含む炭素数 2〜9の直鎖アルキレン基を表し、 R²は、直鎖または分岐鎖のポリエチレングリコールセグメントを表し、 R³は、 OR⁴、 SR⁵、 0 (CH ) N (R⁶)R⁷または 0 (CH ) COOR⁸を表し、 R⁴、

2 1 2 1

R⁵、 R⁶及び R⁷は、それぞれ同時に、または、別個に、水素、メチル基、ェチル基、ノルマルプロピル基、イソプロピル基、フエ-ル基、ベンジル基、または、ァセチル基を表し、 R⁸は、水素、メチル基、ェチル基、ノルマルプロピル基、イソプロピル基、 t—ブチル基、フエ-ル基、ベンジル基、または、陽イオンを表し、 1は、 2〜6の整数を表し、 mは、 1または 2の整数を表す。 )

および、下記の一般式 2

[0032] [化 2]

[0033] (R⁹は、炭素数 1〜9の直鎖アルキレン基、または、二重結合を含む炭素数 2〜9の直鎖アルキレン基を表し、 R^1Gは、直鎖または分岐鎖のポリエチレングリコールセグメントを表し、 R¹¹は、 OR¹²、 SR¹³、 0 (CH ) N (R¹⁴)R¹⁵または 0 (CH ) COOR¹⁶を表し、

2 1 2 1

R¹²、 R¹³、 R¹⁴及び R¹⁵は、それぞれ同時に、または、別個に、水素、メチル基、ェチル基、ノルマルプロピル基、イソプロピル基、フエ-ル基、ベンジル基、または、ァセチル基を表し、 R¹⁶は、水素、メチル基、ェチル基、ノルマルプロピル基、イソプロピル基、 t—ブチル基、フエ-ル基、ベンジル基、または、陽イオンを表し、 1は、 2〜6の整数を表し、 mは、 1または 2の整数を表す。 )

で表される群力選ばれる少なくとも 1種の繰り返し単位と、

下記の一般式 3

[0034] [化 3]

[0035] (R"は、水素または陽イオンを表し、 nは、 1または 2の整数を表す。 )

および、下記の一般式 4

[0036] [化 4]

[0037] (R¹⁸は、水素または陽イオンを表し、 nは 1または 2の整数を表す。 )

で表される群力選ばれる少なくとも 1種の繰り返し単位とを有するグラフトポリマーである。 R\ R⁹は、エチレン基、または、プロピレン基が好ましい。 R²、 R^1Gは、 (OCH

2

CH ) (Xは整数を表す。）で示される直鎖または分岐鎖のポリエチレングリコールセ

2

グメントであって数平均分子量が 100〜5000の範囲のものが好まし!/、。グラフト鎖の末端となる R³、 R¹¹は、水酸基 ⁴、 R¹²が水素）、メトキシ基 (R⁴、 R¹²がメチル基)、チオール基 (R⁵、 R¹³が水素）、 O (CH R¹⁴、 R¹⁵が水素、 1が 2)、 O (C

H ) NH (R⁶、 R⁷、 R"、 R¹⁵が水素、 1が 3)、 0 (CH ) COOH (R⁸、 R¹⁶が水素、 1が

2 3 2 2 2

2)、 0 (CH ) COOH (R⁸、 R¹⁶が水素、 1が 5)などが好ましい。 R¹⁷、 R¹⁸の陽イオンと

2 5

しては、アルカリ金属、アルカリ土類金属などが挙げられ、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウムなどがとくに好ましい。

[0038] 本発明の微粒子を構成するグラフトポリマーは、上記以外の単量体単位を共重合成分として含んでもよい。

[0039] 一般式 1または一般式 2で表される群力選ばれる少なくとも 1種の繰り返し単位と、一般式 3および一般式 4で表される群力選ばれる少なくとも 1種の繰り返し単位とを有する前述の化学構造を有するグラフトポリマーは、例えば、 m= lで n= lの場合には、以下の（6)の方法で製造することができ、 m= 1で、 n= 1の場合には、（7)の方法で、 m= 2で n= 2の場合には、（7)の方法で製造することができる。

[0040] (6)ポリコハク酸イミドに対して、アミノ基を有するポリエチレングリコールを反応させ

、生成したポリマーに塩基性条件にて水をカ卩え、ポリマー中の未反応のイミド環をカロ水分解することにより、グラフトポリマーを製造する方法。

[0041] ポリコハク酸イミドの製造方法は公知の方法を用いることができる。例えば、 Macro molecules, 31, 2107— 2113 (1998年）にァスパラギン酸を原料としてメシチレンとスルフォランの混溶媒中、オルトリン酸存在下 200°Cで加熱縮合させる方法が開示されている。また、特公昭 48— 20638号公報には、 85%燐酸を触媒としてロータリ一エバポレータを用いて薄膜状で反応を行うことにより、高分子量のポリコハク酸イミドを得る方法が開示されている。そして米国特許第 5057597号には、工業的にポリコハク酸イミドを得る方法として、流動床によりァスパラギン酸を加熱縮合させる方法が開示されている。

[0042] 上記のポリコハク酸イミドの製造方法において、使用するポリコハク酸イミドの数平均分子量は 1000以上 20万以下が好ましい。更に好ましくは 5千以上 10万以下である。使用するポリコハク酸イミドの数平均分子量は 1000以上 20万以下であると、得られるァスパラギン酸系共重合体力高分子としての性質を発揮しやすぐ DDS等の医療用途や他の種々の用途に、より一層好適である。さらに、使用するポリコハク酸ィミドの数平均分子量は 1000以上 20万以下であると、反応溶媒への溶解性が低下せず、反応溶液の粘度が高くなりすぎることがない。

[0043] 上記のポリコハク酸イミドにァミノ基を有するポリエチレングリコールを反応させてグラフト鎖を付加するためには、反応溶媒は、アミノ基を有するポリエチレングリコールとポリコノ、ク酸イミドの少なくともいずれか一方を溶解するものが好ましい。反応を速く行わせるためには、ポリコハク酸イミドとァミノ基を有するポリエチレングリコールの両者を溶解する溶媒を用いるのが好ましぐ例えば、ジメチルスルホキシド、 N, N ジメチルホルムアミド（DMF)、 N—メチルピロリドン、 N, N ジメチルァセトアミド、 N, N，ジメチルイミダゾリジノン、スルフォラン、およびこれらを主成分とする他の溶媒との混合溶媒が好ましく用いられる。特に好ましくは、ジメチルスルホキシドおよび DMF が用いられる。

[0044] グラフトポリマーの製造において、使用する原料 (ポリコハク酸イミド、アミノ基を有するポリエチレングリコール)および反応溶媒は、あら力じめ乾燥等により水分を除去しておくことが好ましい。これらの原料はいずれも吸湿性があるため、通常数％程度の水分を含んでいることが多い。原料と溶媒とからなる反応系に含まれる水分量は、仕込みのポリコハク酸イミドの重量に対して 18%未満であることが好ましい。さらに好ましくは 1%未満である。原料と溶媒とからなる反応系に含まれる水分量は、仕込みのポリコハク酸イミドの重量に対して 18%未満であると、反応中に副反応が起きに《、目的とする構造のグラフトポリマーを容易に得ることができる。

[0045] ポリコハク酸イミドに対するアミノ基を有するポリエチレングリコールの仕込組成比は、ポリコハク酸イミドのイミド環のモル数に対して、所望とするグラフトポリマー中のポリエチレングリコール鎖の組成比にあわせて適宜決定する。すなわち、ポリコハク酸イミドに対するアミノ基を有するポリエチレングリコールの仕込組成比が多くなると生成するグラフトポリマー中のポリエチレングリコール鎖のモル組成が上昇する。

[0046] 反応溶液のポリコハク酸イミド濃度は、一般的には、 1〜40重量％の範囲から選択される。また、使用するアミノ基を有するポリエチレングリコールに最適な濃度を選択することちでさる。

[0047] ポリコハク酸イミドとァミノ基を有するポリエチレングリコールとの反応は、特に触媒を使用しなくとも進行するが、必要に応じて塩基性の触媒を使用しても良い。使用できる触媒として、トリメチルァミン、トリェチルァミン、トリプロピルァミン、トリブチルァミン、ジイソプロピルェチルァミン、トリエタノールァミン、トリエチレンジァミン（DABCO)等の脂肪族 3級ァミン、 N—メチルモルホリン等の脂環式 3級ァミン、ジメチルァ-リン、ジェチルァ-リン等の芳香族 3級ァミンおよびテトラメチルダァ-ジン等が挙げられ、これらは単独でまたは組み合わせて使用できる。

[0048] ポリコハク酸イミドとァミノ基を有するポリエチレングリコールとの反応の反応温度は、 0〜100°Cが好ましい。さらに好ましくは 20〜80°Cである。反応温度が 0〜100°C であると、反応の進行が早ぐポリコハク酸イミドが反応系中の不純物と副反応をおこさず、アミノ基を有するポリエチレングリコールが変性しないので、好ましい。

[0049] 上記のァミノ基の反応を繰り返し行うことにより、異なる末端基を有するポリエチレングリコールセグメントを複数導入することも可能である。

[0050] ポリコハク酸イミドカもグラフトポリマーを製造する場合、ポリエチレングリコール鎖を導入したポリマーに対し、カルボキシル基を有するアミンをポリマー中の未反応イミド環部位に作用させることにより、主鎖にカルボキシル基を導入できる。反応溶媒、反応温度、および反応濃度などの反応条件については、ポリコハク酸イミドにポリエチレングリコールアミンを導入する上記方法と同様である。 [0051] ポリコハク酸イミド中の未反応イミド環を加水分解する方法としては、グラフト鎖を導入したポリマーに対し塩基を作用させる手法が一般的に用いられる。塩基の具体例としては、水酸化ナトリウム、水酸ィ匕カリウム、水酸化リチウム等のアルカリ金属水酸化物、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸リチウム等のアルカリ金属炭酸塩、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等のアルカリ金属炭酸水素塩、酢酸ナトリウム、酢酸カリゥム等のアルカリ金属酢酸塩、シユウ酸ナトリウム等の有機カルボン酸アルカリ金属塩等が挙げられる。

[0052] (7)ポリアスパラギン酸またはポリグルタミン酸に対して、アミノ基を有するポリエチレングリコールを縮合反応させることにより、グラフトポリマーを製造する方法。

[0053] ポリアスパラギン酸またはポリグルタミン酸と、アミノ基を有するポリエチレングリコールとの縮合反応において、縮合反応に関与するァミノ基、カルボキシル基などの官能基は公知の方法で活性ィ匕してぉ、てもよく、縮合反応の際にカルボキシル基の活性化を行っても良い。官能基の活性ィ匕は自体公知の方法により行えばよぐこのような方法としては、例えば、原料のカルボン酸の活性ィ匕エステル〔置換フエノール類 (例えば、ペンタクロロフエノール、 2, 4, 5—トリクロ口フエノール、 2, 4—ジ-トロフエノール、 p— -トロフエノールなど）、 N—置^ミド類（例えば、 N—ハイドロキシー5—ノルボルネン一 2, 3—ジカルボキシイミド、 N—ハイドロキシスクシンイミド、 N—ハイドロキシ—1, 2, 3—べンゾトリアゾールなど）などとのエステル〕を形成させる方法、原料のカルボン酸に対するカルボン酸無水物、アジドなどを形成させる方法、酸クロライド法、酸化還元法（向山法）、混合酸無水物法、活性化剤として N, N—ジシクロへキシルカルボジイミド法、 N, N—ジシクロへキシルカルボジイミド、ウッドワード試薬 K、またはべンゾトリアゾール— 1—ィル—ォキシ—トリス（ジメチルァミノ） -ホスホ-ゥムへキサフルォロホスフェイト（ΒΟΡ試薬）を用いる方法などが挙げられる。

[0054] 上記縮合反応は、通常反応を阻害しない溶媒中で行うことができる。このような溶媒としては、ジメチルホルムアミドなどのアミド類、テトラヒドロフラン、ジォキサンなどのェ一テル類、ジクロロメタン、クロ口ホルムなどのハロゲン化炭化水素類、エタノール、メタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、酢酸ェチルなどのエステル類、 Ν-メチルピロリドン、 Ν-メチルモルホリン、水などが挙げられる。反応温度は、好ましくは 30°C〜50°C、さらに好ましくは 0°C〜40°Cである。反応時間は、例えば、 10分〜 24時間である。

[0055] 上記の製造方法 (6)、 (7)のようにして製造した本発明の微粒子を構成するグラフトポリマーの精製は、再沈殿法、透析法、限外濾過法など一般的な精製方法により行うことができる。

[0056] 本発明の微粒子は、グラフトポリマー存在下でカルシウム化合物を析出させることにより 1工程で製造することができる。カルシウム化合物の析出は、例えば、カルシウム化合物を構成するイオンおよび対イオンとなるイオンを含む溶液を冷却または濃縮する方法、カルシウム化合物を構成するイオンを含む溶液と対イオンとなるイオンを含む溶液の 2溶液を反応させる方法、または、カルシウム化合物を構成するイオンを含む溶液の pHを変化させる方法によって行うことができる力このうち 2溶液を反応させる方法が好ましい。 2溶液の反応に際しては、一般に 30分以内に、好ましくは 5分以内、さらに好ましくは 1分以内に 2溶液を混合して反応させることにより微粒子が形成される。ここに示す時間は、混合開始して力終了するまでの時間を指す。この際、添加あるいは混合時間が短い程、得られる微粒子の全体直径は小さくなる。また、反応時における撹拌は、それぞれの成分が反応液中で速やかに均一となることが望ましいので、実質的に反応に用いる溶液が滴下するとほぼ同時に系内に分散する程度の撹拌速度が好ましぐ反応中は継続して撹拌することが好ましい。なお、 2溶液に含まれる反応性成分は所望の比率で含まれていることが望ましい。反応温度は、 4 〜60°C程度が好ましい。さらに好ましくは、反応温度は、 20〜40°Cである。

[0057] 本発明の微粒子を構成するカルシウム化合物としては、グラフトポリマーのカルボキシル基に親和性を有するものが好ましぐグラフトポリマーとの複合ィ匕により粒子内に親水性薬物を封入、あるいは、吸着させる役割を有する。具体的には、生体に高い適合性を有するカルシウム化合物が好ましヽ。

[0058] 本発明の微粒子を構成するカルシウム化合物は、リン酸カルシウムまたは炭酸カルシゥムのうちのいずれかの少なくとも一種類のカルシウム化合物である。

[0059] 本発明にお!/、て「リン酸カルシウム」とは、カルシウムイオン（Ca²⁺)とリン酸イオン（P O ^3_)とから形成される塩を意味する。本発明で用いるリン酸カルシウムは、ァモルファスリン酸カルシウム、第一リン酸カルシウム（Ca (H PO ) )、第二リン酸カルシウム（

2 4 2

CaHPO )、第三リン酸カルシウム（Ca (PO ) )、ハイドロキシアパタイト（（Ca (OH

4 3 4 2 10

) ) (PO ) )などが好ましぐ特に、ハイドロキシアパタイトが好ましい。

2 4 6

[0060] 「リン酸カルシウム」は、カルシウムとリン酸以外の成分を含有していても良い。「リン酸カルシウム」に含有される可能性のある成分としては、例えば、炭酸イオン、金属ィオンが挙げられる。カルシウムイオンとリン酸イオンの含有割合としては、カルシウムィオンとリン酸イオンが反応してハイドロキシアパタイト（Ca (OH) ) (PO ) を生成す

10 2 4 6 るのに必要な当量より、過剰な量でカルシウムイオンが存在することが好ましい。具体的には、 Ca²⁺対 PO ^3_は、モル比で 50〜200対 1であることが好ましい。カルシウム

4

イオンとリン酸イオンがモル比で 50〜200対 1で存在すると、グラフトポリマーが、都合良ぐリン酸カルシウムと相互作用し、結合もしくは架橋または吸着されやすい。力ルシゥムイオンとリン酸イオンがモル比で 50〜200対 1であると、グラフトポリマーおよび薬物とが、適度に、リン酸カルシウムと相互作用し、結合もしくは吸着されるので好ましい。特に、リン酸カルシウムがハイドロキシアパタイトの場合は、カルシウムイオンとリン酸イオンがモル比で 50〜200対 1であることがより好ましい。

[0061] 本発明のカルシウム化合物を含む微粒子の製造法としては、例えば、

(A)薬物、カルシウムイオンおよび必要に応じて緩衝剤を含む第一の水溶液を調製し、独立して、

(B)本グラフトポリマー、リン酸イオンおよび必要に応じて緩衝剤を含む第二の水溶液を調製し、

(C)前記第一の水溶液と第二の水溶液を、ノ、イドロキシアパタイトが生成するのに十分な条件下で混合する

ことにより調製できる。なお、第二の水溶液には塩ィ匕ナトリウムなどの塩を含めることができ、使用する場合の緩衝剤は、最終分散液の pHを 6. 8〜7. 8に調製することができるように選ぶことがとくに好ましい。また、製造時のカルシウムイオン濃度は、好ましくは、 60mM〜300mMであり、リン酸イオン濃度は、 0. 4mM〜： LOmMであることが好ましい。

[0062] 具体的には、グラフトポリマーに、塩ィ匕カルシウムなどのカルシウムイオン水溶液とリン酸イオン水溶液とを、攪拌下で、一般に 30分以内に、好ましくは 5分以内、さらに好ましくは 1分以内に混合して反応させることにより得ることができる。ここに示す時間は、カルシウムイオン水溶液とリン酸イオン水溶液とが添加あるヽは混合開始してから終了するまでの時間を指す。また、反応時における撹拌は、それぞれの成分が反応液中で速やかに均一となることが望ましいので、実質的に反応に用いる溶液が滴下するとほぼ同時に系内に分散する程度の撹拌速度が好ましぐ反応中は継続して撹拌することが好ましい。なお、本発明におけるカルシウムイオンは、リン酸イオンと反応する際に、所望の比率で含まれていることが望ましい。リン酸イオンに対する力ルシゥムイオンの比率は、好ましくは、 1. 67当量以上、更に好ましくは 10当量以上、更に好ましくは 25当量以上である。反応温度は 4〜60°C程度が好ましい。さらに好ましくは 20〜40°Cである。

[0063] 本発明の微粒子は、平均粒子径が lnm〜10 μ mの微粒子が好ましい。また、平均粒子径が 10〜300nmの微粒子であることがとくに好ましい。平均粒子径は、レーザ一散乱型粒度分布計（たとえば、 Microtrac AS VR/Microtrac - HRA (9320 — X100) )を用いて直接測定する。微粒子の形状は、例えば、球状、楕円状、不定形の、ずれであってもよ!/、。

[0064] 本発明の微粒子は、薬物を含有していても良い。薬物としては、本発明の微粒子は、親水性薬物を含有する微粒子を含有してなる医薬組成物として使用することが好ましい。親水性薬物としては、低分子化合物、タンパク質、ペプチド、 DNA、 RNA、または修飾核酸が例示される。本発明の微粒子を含有する医薬組成物は、親水性薬物力タンパク質、ペプチド、 DNA、 RNA、または修飾核酸のいずれ力から選択される微粒子を含有してなる医薬組成物であることが好ましい。

[0065] 本発明の医薬組成物で使用される親水性薬物のうち、生理活性タンパク質としては、ペプチドホルモン、サイト力イン、酵素タンパク質、抗体などがある。例えば、副甲状腺ホルモン（PTH)、カルシトニン、インスリン (インシュリン）、アンギオテンシン、グル力ゴン、ガストリン、成長ホルモン、プロラタチン (黄体刺激ホルモン）、ゴナドトロピン（性腺刺激ホルモン）、サイロトロピックホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、バソプレシン、ォキシトシン、プロチレリン、黄体形成ホルモン（LH)、コルチコトロピン、ソマトロピン、チロトロピン（甲状腺刺激ホルモン）、ソマトスタチン（成長ホルモン刺激因子）、視床下部ホルモン（GnRH)、 G?CSF、エリスロポエチン、 HGF、 EGF、 VEGF、インターフェロン α、インターフェロン、インターフェロン _Ί、インターロイキン類、 FGF (線維芽細胞増殖因子)類、 BMP (骨形成蛋白）類、スーパーオキサイドジスムターゼ（SOD)、ゥロキナーゼ、リゾチーム、ワクチン等をあげることができる。これら生理活性タンパク質は、天然のタンパク質またはペプチドであつても、その配列の一部を改変した誘導体であってもよ、。

[0066] 本発明の親水性薬物を包含する微粒子は、該親水性薬物を微粒子を形成するための反応液に添加しておくことで製造することが出来る。例えば、グラフトポリマーとハイドロキシアパタイトからなる微粒子の場合には、カルシウム水溶液にインシュリンなどの親水性薬物を添加し、さらに、グラフトポリマーを溶解させたリン酸水溶液を添加し、攪拌、静置することにより、親水性薬物内包微粒子を調製することができる。

[0067] 本発明の微粒子は、グラフトポリマー、無機物以外の物質を含んでいても良い。本発明の微粒子に含有される物質は、例えば、微粒子粒径、微粒子構造、微粒子の安定性、グラフトポリマーの安定性に影響を与える物質を添加することができる。また、本発明の微粒子を含む医薬組成物は、例えば、薬物の安定性、薬物の生理活性に影響を与える物質を添加することができる。

[0068] 本発明の微粒子に添加できる添加物は、微粒子内、微粒子外のいずれの場所に存在していても良い。本発明の微粒子に添加できる添加物は、例えば、緩衝剤、抗酸化剤、塩、ポリマーまたは糖であることができる。

[0069] 本発明の微粒子に添加できる添加物は、例えば、水、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビュルアルコール、ポリビュルピロリドン、カルボキシビ-ルポリマ一、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリゥム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、メチルセルロース、ェチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（HSA)、マン-トール、ソルビトール、ラタトース、医薬添加物として許容される界面活性剤などが挙げられる。 [0070] 本発明の微粒子を含有する医薬組成物は、本発明の微粒子を含有する医薬組成物と薬学的に許容される添加剤からなる粉末形態、あるいは、医薬品組成物と水等の媒体との混合物や多糖類、水等の媒体および該媒体以外の薬学的に許容される基剤との混合物等からなる液状形態、さらには、粒子製剤を薬学的に許容される基剤との組み合わせにより固形ィ匕または半固形ィ匕した形態をとることができる。

[0071] 前記基剤としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機物質が挙げられ、例えば賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤、吸収促進剤等が挙げられる。

[0072] 本発明の微粒子を含有する医薬組成物は、緩衝剤、抗酸化剤、塩、ポリマーまたは糖を含む微粒子を含有してなることが好ましい。また、安定化剤、酸化防止剤、溶解補助剤、界面活性剤、吸収促進剤、 pH調節剤および分散剤など薬学的に許容される基剤を添加することができる。

[0073] 本発明の微粒子を分散させて液体状態の医薬組成物とするための媒体としては、水、水溶液または水混和性液体を用いることが好ましぐ例えば、グリセリンまたはポリエチレングリコール等、もしくは薬学的に許容される非水溶媒が用いられる。水溶液は非等張性または等張性溶液のいずれであってもよい。水溶液としては、水と 1種もしくは複数種の他の成分、例えば、グリセリン、マンノース、ダルコール、フルクトース、キシロース、トレハロース、マンニット、ソルビット、キシリットもしくはポリエチレングリコールのような他のポリオールまたは塩ィ匕ナトリウムのような電解質を混合して調製されるものが例示される。非水溶媒としては、ァセチルグリセリン脂肪酸エステル、液糖、ォレイン酸、オレンジ油、還元麦芽糖水ァメ、タエン酸トリエチル、高果糖液糖、高ブドウ糖水ァメ、小麦胚芽糖、サフラワー油、サフラワー油脂肪酸、蛇油、ジメチルポリシロキサン、ショウキヨゥ油、大豆レシチン、中鎖脂肪酸トリグリセリド、天然ビタミン E、トリァセチン、トリオレイン酸ソルビタン、ピぺ口-ルブトキシド、ヒマヮリ油、フィチン酸、フタル酸ジェチル、フタル酸ジブチル、ブチルフタリルブチルダリコレート、ブドウ糖果糖液糖、ポリソルベート、水ァメ、ミリスチン酸オタチルドデシル、綿実油、モノォレイン酸ソルビタン、酪酸ェチル、リン酸、レモン油が例示される。

[0074] 本発明の微粒子を含有する医薬組成物の投与方法および応用分野は、多岐の利用が可能である。例えば、投与方法としては、経口投与、非経口投与、経腸投与、経肺投与、局所投与 (鼻、皮膚、眼)または体腔投与等が利用できる。

実施例

[0075] 以下に実施例を示す。

[0076] [参考例 1]グラフトポリマー（1)の合成

グラフトポリマー（1)を、下記に記載した手法に従って合成した。

[0077] 1 - 1.ポリスクシイミドの合成

L—ァスパラギン酸（20. 7g、0. 155mol)とオルトリン酸（7. 8mmol)をメシチレン (46g)およびスルフォラン（20g)の混合溶媒に懸濁させ、アルゴンガス雰囲気下ディーンスタークを用いた共沸条件にて加熱還流した。 4. 5時間後溶媒を減圧留去し、得られた残渣を水（200mL)で 3回洗浄後、さら〖こメタノール (200mL)で洗浄した。得られた固体を減圧下 85°Cで乾燥し、ポリスクシイミド（15. 5g)を得た。本ポリマーの数平均分子量は 5960であった。（GPC— MALSによる測定：カラム東ソー T SK-gel a—M、 DMF系溶媒、 MALS Wyatt社製 DAWN EOS)。

[0078] 1 - 2.中間体の合成

ポリスクシイミド（0. 5g)を N, N—ジメチルホルムアミド（7. 5mL)に懸濁後、メトキシー PEG—プロピルァミン（数平均分子量： 5000) (0. 5g)を加え、 50°Cで 24時間攪拌した。反応混合液を水による透析によって 3度精製後、残存液を凍結乾燥し、中間体 (0. 87g)を得た。

[0079] 1 - 3.グラフトポリマーの合成

中間体 (0. 3g)を水（7. 5mL)に溶解後、 1Nの水酸化ナトリウム水溶液を滴下していった。滴下するたびに pHが上昇し、滴下をとめると pHがゆっくり下がった。 pHが 1 3を越えないように滴下の速度を調整しながらゆっくりと加水分解を続け、数時間後、滴下をやめても pHが下がらなくなったところで加水分解終了とした。反応混合液を水による透析によって精製後、残存液を凍結乾燥し、グラフトポリマー（1) (0. 34g)を得た。

[0080] [実施例 1]グラフトポリマー（1)とハイドロキシアパタイトからなる粒子の調製

カルシウム水溶液（2. 5M 塩化カルシウム）、リン酸水溶液（6. OmM リン酸水素ニナトリウム、 140mM 塩ィ匕ナトリウム、 50mM 4— (2— HydroxyethyD piperazi ne - 1 - ethanesulf onic acid水溶液、 pH7. 2)を調製した。 4mLのカルシウム水溶液を 36mLの純水で希釈したもの lmLずつを、ポリプロピレン製チューブに分注した。これらに対して、グラフトポリマー（1)を溶解させた lmLリン酸水溶液を添加し、数秒激しく攪拌した。その後、一晩 37°Cで静置し微粒子を調製した。該微粒子の平均粒子径は、（装置 Zetasizer3000HSA (MALVERN INSTRUMENTS) )を使用し、動的光散乱法で測定した。得られたデータは CONTIN法およびヒストグラム法によって解析し、平均粒子径を算出した。

[0081] <結果 >

グラフトポリマー（1)の濃度が 2. 5mgZmL以上において、微粒子が形成が確認された。平均粒子径は、グラフトポリマー濃度が 2. 5mgZmLのときに 81. 8nmであり、ポリマーの濃度上昇と共に平均粒子径は小さくなり、ポリマー濃度 4〜： LOmgZmL において 47. 6nm力ら 48. 9nmの範囲となり、ほぼ一定となった（表 1)。

[0082] [実施例 2]グラフトポリマー（1)を表面修飾したインシュリン内封ノヽイドロキシァパタイト粒子の調製

カルシウム水溶液（2. 5M 塩化カルシウム）、リン酸水溶液（6. OmM リン酸水素ニナトリウム、 140mM 塩ィ匕ナトリウム、 50mM 4- (2 -HydroxyethyD piperazi ne - 1 - ethanesulf onic acid水溶液、 pH7. 2)を調製した。 0. 5mLのカルシウム水溶液を 4. 5mLのインシュリン溶液を添カ卩したもの lmLずつ（インシュリン濃度 10 0 μ gZmLもしくは 500 μ g/mL)を、ポリプロピレン製チューブに分注した。これらに対してグラフトポリマー（1)を溶解させた lmLリン酸水溶液を添加し、数秒激しく攪拌した。その後、一晩 37°Cで静置し微粒子を調製した。該微粒子の平均粒子径は、 (装置 Zetasizer3000HS A (MALVERN INSTRUMENTS) )を使用し、動的光散乱法で測定した。得られたデータは CONTIN法およびヒストグラム法によって解祈し、平均粒子径を算出した。

[0083] <結果 >

グラフトポリマー（1)の濃度が 3, 4, 5mgZmLにおいて、微粒子の形成が確認された。インシュリン濃度が 100 μ g/mL, 500 μ gZmLのいずれの場合において、微粒子の平均粒子径は大きく変化せず、平均粒子径は、 57. 2-76. 5nmとなった (表 1)。

[0084] [表 1]

[0085] [参考例 2]グラフトポリマー（2)の合成

グラフトポリマー（2)を、下記に記載した手法に従って合成した。

[0086] 2- 1.活性化エステルの合成

ポリグルタミン酸（分子量： 15, 000〜50, 000) (200mg)、 N—ヒドロキシスクシイミド（18mg)および 1ーェチルー 3—（3 ジメチルァミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（30mg)をジメチルスルホキシド (4ml)に溶解し、室温で 20時間攪拌した。反応溶液にアセトン（10ml)と n—へキサン（15ml)を加え、生成物をオイルアウト（沈殿）させた。上清を取り除いた後、再度アセトン（5ml)と n—へキサン（5ml)を加え沈殿物を洗浄した。上清を取り除き、沈殿物を減圧下室温で乾燥し、活性ィ匕エステル (200 mg)を得た。

[0087] 2— 2.グラフトポリマー（2)の合成

活性化エステル（200mg)を N, N ジメチルホルムアミド（5mL)に溶解後、メトキシ PEG プロピルアミン（分子量： 5000) (200mg)をカ卩え、室温で 3日間攪拌した。反応混合液を水による透析によって 3度精製後、残存液を凍結乾燥し、グラフトポリマ—（2) (256mg)を得た。

[0088] [実施例 3]グラフトポリマ—（2)とハイドロキシアパタイトからなる粒子の調製カルシウム水溶液（2. 5M 塩化カルシウム）、リン酸水溶液（3. OmM リン酸水素ニナトリウム、 140mM 塩ィ匕ナトリウム、 50mM 4— (2— HydroxyethyD piperazi ne - 1 - ethanesulf onic acid水溶液、 pH7. 2)を調製した。 5mLのカルシウム水溶液を 45mLの純水で希釈したもの 1. 5mLずつを、ポリプロピレン製チューブに分注した。これらに対して、グラフトポリマ一を溶解させた 1. 5mLリン酸水溶液 (グラフトポリマー濃度 320ugZmL、リン酸濃度 1. 5mM)を添加し、数秒激しく攪拌した。その後、一晩 37°Cで静置し粒子を調製した。該微粒子の平均粒子径は、（装置 Zet asizer3000HS A (MALVERN INSTRUMENTS) )を使用し、動的光散乱法で測定した。得られたデ―タは CONTIN法およびヒストグラム法によって解析し、平均粒子径を算出した。

[0089] <結果 >

ポリマー濃度が 160ugZmLで、粒径 350nmの粒子が形成された。

[0090] [実施例 4]グラフトポリマ—（2)とハイドロキシアパタイトからなる粒子の調製

カルシウム水溶液（2. 5M 塩化カルシウム）、リン酸水溶液（3. OmM リン酸水素ニナトリウム、 140mM 塩ィ匕ナトリウム、 50mM 4- (2 -HydroxyethyD piperazi ne - 1 - ethanesulf onic acid水溶液、 pH7. 2)を調製した。 5mLのカルシウム水溶液を 45mLの純水で希釈したもの 1. 5mLずつを、ポリプロピレン製チューブに分注した。これらに対してグラフトポリマ一を溶解させた 1. 5mLリン酸水溶液 (グラフトポリマー濃度 640ugZmL、リン酸濃度 1. 5mM)を添加し、数秒激しく攪拌した。その後、一晩 37°Cで静置し粒子を調製した。該微粒子の平均粒子径は、（装置 Zetas izer3000HSA (MALVERN INSTRUMENTS) )を使用し、動的光散乱法で測定した。得られたデ―タは CONTIN法およびヒストグラム法によって解析し、平均粒子径を算出した。

[0091] <結果 >

最終ポリマー濃度 320ugZmLで、粒径 500nmの粒子が形成された。

[0092] [実施例 5]グラフトポリマー（2)を表面修飾したインシュリン内封ノヽイドロキシァパタイト粒子の調製

カルシウム水溶液（2. 5M塩化カルシウム）、リン酸水溶液（3. OmMリン酸水素二ナトリウム、 140mM 塩ィ匕ナトリウム、 50mM 4 - ( 2 - Hydroxyethyl) piperazine - 1 -ethanesulfonic acid水溶液、 pH7. 2)を調製した。 0. 5mLのカルシウム水溶液を 4. 5mLのインシュリン溶液に添カロしたもの 1. 5mLずつ（インシュリン濃度 50 ugZmL)を、ポリプロピレン製チューブに分注した。これらに対してグラフトポリマ一（ 2)を溶解させた 1. 5mLリン酸水溶液 (グラフトポリマー濃度 200ugZmL、リン酸濃度 1. 5mM)を添加し、数秒激しく攪拌した。その後、一晩 37°Cで静置し粒子を調製した。該微粒子の平均粒子径は、（装置 Zetasizer3000HSA (MALVERN INSTRUMENTS) )を使用し、動的光散乱法で測定した。得られたデータは CON TIN法およびヒストグラム法によって解析し、平均粒子径を算出した。インシュリン内包率は、 HPLC測定により決定した。

[0093] <結果 >

最終ポリマー濃度 lOOugZmLで、粒径 200nmの粒子が形成された。インシュリン内包率は、約 60%であった。

[0094] [実施例 6]グラフトポリマー（2)を表面修飾したインシュリン内封ノヽイドロキシァパタイト粒子の調製

カルシウム水溶液（2. 5M塩化カルシウム）、リン酸水溶液（3. OmMリン酸水素二ナトリウム、 140mM 塩ィ匕ナトリウム、 50mM 4 - ( 2 - Hydroxyethyl) piperazine - 1 -ethanesulfonic acid水溶液、 pH7. 2)を調製した。 0. 5mLのカルシウム水溶液を 4. 5mLのインシュリン溶液に添カロしたもの 1. 5mLずつ（インシュリン濃度 50 ugZmL)を、ポリプロピレン製チューブに分注した。これらに対してグラフトポリマ一（ 2)を溶解させた 1. 5mLリン酸水溶液 (グラフトポリマー濃度 250ugZmL、リン酸濃度 1. 5mM)を添加し、数秒激しく攪拌した。その後、一晩 37°Cで静置し粒子を調製した。該微粒子の平均粒子径は、（装置 Zetasizer3000HSA (MALVERN INSTRUMENTS) )を使用し、動的光散乱法で測定した。得られたデータは CON TIN法およびヒストグラム法によって解析し、平均粒子径を算出した。

[0095] <結果 >

最終ポリマー濃度 125ugZmLで、粒径 134nmの粒子が形成された。

[0096] [実施例 7]グラフトポリマー（2)を表面修飾したインシュリン内封ノヽイドロキシァパタイト粒子の調製

カルシウム水溶液（2. 5M塩化カルシウム）、リン酸水溶液（3. OmMリン酸水素二ナトリウム、 140mM 塩ィ匕ナトリウム、 50mM 4 - ( 2 - Hydroxyethyl) piperazine - 1 -ethanesulfonic acid水溶液、 pH7. 2)を調製した。 0. 5mLのカルシウム水溶液を 4. 5mLのインシュリン溶液に添カロしたもの 1. 5mLずつ（インシュリン濃度 50 ug/mL)を、ポリプロピレン製チューブに分注した。これらに対して、グラフトポリマ一 (2)を溶解させた 1. 5mLリン酸水溶液 (グラフトポリマー濃度 300ugZmL、リン酸濃度 1. 5mM)を添加し、数秒激しく攪拌した。その後、一晩 37°Cで静置し粒子を調製した。該微粒子の平均粒子径は、（装置 Zetasizer3000HSA (MALVERN INSTRUMENTS) )を使用し、動的光散乱法で測定した。得られたデータは CON TIN法およびヒストグラム法によって解析し、平均粒子径を算出した。

[0097] <結果 >

最終ポリマー濃度 150ugZmLで、粒径 89nmの粒子が形成された。

[0098] [実施例 8]グラフトポリマー（2)を表面修飾したインシュリン内封ノヽイドロキシァパタイト粒子の調製

カルシウム水溶液（2. 5M塩化カルシウム）、リン酸水溶液（3. OmMリン酸水素二ナトリウム、 140mM 塩ィ匕ナトリウム、 50mM 4 - ( 2 - Hydroxyethyl) piperazine - 1 -ethanesulfonic acid水溶液、 pH7. 2)を調製した。 0. 5mLのカルシウム水溶液を 4. 5mLのインシュリン溶液に添カロしたもの 1. 5mLずつ（インシュリン濃度 50 ugZmL)を、ポリプロピレン製チューブに分注した。これらに対してグラフトポリマ一（ 2)を溶解させた 1. 5mLリン酸水溶液 (グラフトポリマー濃度 400ugZmL、リン酸濃度 1. 5mM)を添加し、数秒激しく攪拌した。その後、一晩 37°Cで静置し粒子を調製した。該微粒子の平均粒子径は、（装置 Zetasizer3000HSA (MALVERN INSTRUMENTS) )を使用し、動的光散乱法で測定した。得られたデータは CON TIN法およびヒストグラム法によって解析し、平均粒子径を算出した。

[0099] <結果 >

最終ポリマー濃度 200ugZmLで、粒径 117nmの粒子が形成された。

[0100] [実施例 9]グラフトポリマー（2)を表面修飾したインシュリン内封ノヽイドロキシァパタイト粒子の調製

カルシウム水溶液（2. 5M塩化カルシウム）、リン酸水溶液（3. OmMリン酸水素二ナトリウム、 140mM 塩ィ匕ナトリウム、 50mM 4 - ( 2 - Hydroxyethyl) piperazine - 1 -ethanesulfonic acid水溶液、 pH7. 2)を調製した。 0. 5mLのカルシウム水溶液を 4. 5mLのインシュリン溶液に添カロしたもの 1. 5mLずつ（インシュリン濃度 50 ug/mL)を、ポリプロピレン製チューブに分注した。これらに対して、グラフトポリマ一 (2)を溶解させた 1. 5mLリン酸水溶液 (グラフトポリマー濃度 500ugZmL、リン酸濃度 1. 5mM)を添加し、数秒激しく攪拌した。その後、一晩 37°Cで静置し粒子を調製した。該微粒子の平均粒子径は、（装置 Zetasizer3000HSA (MALVERN INSTRUMENTS) )を使用し、動的光散乱法で測定した。得られたデータは CON TIN法およびヒストグラム法によって解析し、平均粒子径を算出した。

[0101] <結果 >

最終ポリマー濃度 250ugZmLで、粒径 196nmの粒子が形成された。

[0102] [実施例 10]グラフトポリマー（2)を表面修飾したインシュリン内封ノヽイドロキシァパタイト粒子の調製

カルシウム水溶液（2. 5M塩化カルシウム）、リン酸水溶液（3. OmMリン酸水素二ナトリウム、 140mM 塩ィ匕ナトリウム、 50mM 4 - ( 2 - Hydroxyethyl) piperazine - 1 -ethanesulfonic acid水溶液、 pH7. 2)を調製した。 0. 5mLのカルシウム水溶液を 4. 5mLのインシュリン溶液に添カロしたもの 1. 5mLずつ（インシュリン濃度 50 ugZmL)を、ポリプロピレン製チューブに分注した。これらに対してグラフトポリマ一（ 2)を溶解させた 1. 5mLリン酸水溶液 (グラフトポリマー濃度 600ugZmL、リン酸濃度 1. 5mM)を添加し、数秒激しく攪拌した。その後、一晩 37°Cで静置し粒子を調製した。該微粒子の平均粒子径は、（装置 Zetasizer3000HSA (MALVERN INSTRUMENTS) )を使用し、動的光散乱法で測定した。得られたデータは CON TIN法およびヒストグラム法によって解析し、平均粒子径を算出した。

[0103] <結果 >

最終ポリマー濃度 300ugZmLで、粒径 234nmの粒子が形成された。

[0104] [実施例 11]グラフトポリマー（2)を表面修飾したインシュリン内封ノヽイドロキシァパタイト粒子の動物皮下投与による薬理評価

11 - 1.グラフトポリマー（2)を表面修飾したインシュリン内封ハイドロキシアパタイト粒子の調製

カルシウム水溶液（2. 5M塩化カルシウム）、リン酸水溶液（3. OmMリン酸水素二ナトリウム、 140mM 塩ィ匕ナトリウム、 50mM 4 - ( 2 - Hydroxyethyl) piperazine - 1 -ethanesulfonic acid水溶液、 pH7. 2)を調製した。 0. 5mLのカルシウム水溶液を 4. 5mLのインシュリン溶液に添カロしたもの 1. OmLずつ（インシュリン濃度 50 ug/mL)を、ポリプロピレン製チューブに分注した。これらに対して、グラフトポリマ一 (2)を溶解させた 1. OmLリン酸水溶液 (ポリマー濃度 lOOugZmL)を添加し、数秒激しく攪拌した。その後、一晩 37°Cで静置し粒子を調製した。調製後、遠心操作 (18 800G、 30分）により粒子を沈降させた後、上澄みを除き、凍結乾燥を行った。インシユリン内封率は、上澄み中のインシュリン濃度を ELISAにより測定することで求めた (4 9%)。粒径は約 5mmであった。

[0105] 11 2.微粒子の皮下投与実験

凍結乾燥した微粒子に 800uLの PBSを添カ卩し 30分静置した後、 150uLを 12時間絶食した雄の BALB/cマウスの背部皮下に投与した。尾部より経時採血し、血中ダルコース濃度を、富士ドライケム及び血中グルコース濃度測定スライド GLU—WIII (富士フィルム）を用いて測定した。血中インシュリン濃度は、 ELISAにより測定した。参照実験としては、遊離インシュリンを皮下投与した。

[0106] <結果 >

遊離インシュリンを投与した場合と比較して、微粒子に内封した場合は血中インシュリン濃度が持続することが明らかとなった (図 1)。また、血中グルコース濃度も、遊離インシュリンでは十数時間で元の値に戻ったのに対して、微粒子化したものでは約 3 5時間後であった（図 2)。

産業上の利用可能性

[0107] 本発明は、グラフトポリマーとカルシウム化合物を含んでなる新たな形態の微粒子である。本発明の微粒子を構成するグラフトポリマーは合成が容易である。本発明の微粒子は、安価で容易に合成できるグラフトポリマーを用いて製造することができる。本発明の微粒子は、主鎖またはグラフト鎖の置換基を変換することにより様々な機能修飾が可能であることから、薬物の標的へのデリバリー (delivery)などに有用である。特に、本発明の微粒子は、主に、タンパク質医薬、ペプチド医薬、または、核酸医薬の製剤技術にぉ、て有用である。

Claims

請求の範囲 [1] 主鎖またはグラフト鎖の、ずれかの少なくとも一方にカルボキシル基を有するグラフトポリマーと、リン酸カルシウムまたは炭酸カルシウムのうちのいずれかの少なくとも一種類のカルシウム化合物とを含む微粒子であって、グラフトポリマーのグラフト鎖がポリエチレングリコールセグメントを有する微粒子。 [2] グラフトポリマーの主鎖力ポリアスパラギン酸またはポリグルタミン酸である請求項 1 に記載の微粒子。 [3] リン酸カルシウム力ハイドロキシアパタイトである請求項 1に記載の微粒子。 [4] グラフトポリマーが、下記の一般式 1

[化 1]