WO2007116779A1 - 新規血小板活性化マーカー及びその測定方法 - Google Patents

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WO2007116779A1
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gpvi
antibody
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sgpvi
loop
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Yoshitaka Hosaka
Katsuki Naitoh
Motoyasu Honda
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Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders

Definitions

  • the present invention relates to a novel platelet activation marker, a reagent and method for its measurement, and a novel use of the marker in the diagnosis of platelet activation / vascular endothelial injury-related diseases.
  • the first cause of death in Japan is malignant neoplasm
  • the second is heart disease
  • the third is cerebrovascular disease.
  • Most of the heart diseases and cerebrovascular diseases are thromboembolism such as myocardial infarction and cerebral infarction, and when both are combined, it is comparable to cancer death. Therefore, the prevention and treatment of thrombosis remains a major problem. In the prevention and treatment of thrombosis, it is important to control platelet activity, and anti-blood serum drugs are actively prescribed. However, its clinical effect has never reached a satisfactory level.
  • the function of platelets can be divided into two types: an adhesion reaction that binds to the subendothelial tissue of damaged blood vessels, and an agglutination reaction in which platelets stick together. In particular, the latter is accompanied by the release of the contents of the granules contained in the platelets.
  • an adhesion reaction that binds to the subendothelial tissue of damaged blood vessels
  • an agglutination reaction in which platelets stick together.
  • the latter is accompanied by the release of the contents of the granules contained in the platelets.
  • various molecules are involved in the expression of their functions, and these are used as platelet activation markers. By making effective use of this marker, the diagnosis of pathological thrombus becomes clearer, and more appropriate selection can be made regarding treatment methods.
  • P-selectin is a membrane protein that exists in the alpha granule membrane of platelets or the Weibel-Palade body of vascular endothelial cells. When these cells are stimulated, they move to the cell surface.
  • P-selectin is classified into two types: membrane-bound and soluble.
  • Membrane-bound P-selectin is detected directly using fluorescently labeled anti-P-selectin antibody and flow cytometry.
  • the expression of P-selectin in platelets may become false positives due to sample handling and it is difficult to obtain stable results.
  • soluble P-selectin can be detected by ELISA.
  • P-selectin is derived from platelets and vascular endothelial cells, its origin is a problem when measuring soluble P-selectin in plasma. .
  • microparticles When platelets are activated or physically stimulated under various circumstances, minute membrane vesicles are generated, and these membrane vesicles are called microparticles. Platelet microparticles are generally measured using flow cytometry and are important in understanding the pathophysiology of various thrombotic diseases. (1) Differences in sensitivity between devices, (2) Microparticles (3) The measurement limit is close to the size of the microparticle, (4) The antibody used Problems such as differences between facilities by type have been pointed out, and standardization of measurement methods has not been achieved.
  • Glycoprotein VI present on the platelet membrane is a collagen receptor for platelets and has been shown to play a central role in platelet activation by collagen stimulation (Hiroshi Takayama, Japan) (See Journal of Thrombosis and Hemostasis, 2003, Vol. 14, No. 2, p. 75—81).
  • anti-mouse GPVI antibody has been reported to inhibit platelet aggregation specifically for collagen stimulation and exert antithrombotic action without significantly extending bleeding time (NieswandtB. Et al., J Exp. Med., 2001., No. 194, No. 4, ⁇ ⁇ 459-469).
  • anti-human GPVI antibody also exerts antiplatelet action without causing a significant increase in bleeding time (Takayama H. et al., Blood, 2005, 106, 11, p612a). ) (WO 200 5/1 1 108 3A2). Therefore, drugs that specifically inhibit collagen-induced platelet aggregation, such as anti-GPVI antibodies, are expected to be safe and highly effective antiplatelet drugs.
  • An object of the present invention is to provide a novel platelet activation marker, its measuring reagent and method, and a novel use of the marker in the diagnosis of platelet activation / vascular endothelial injury-related diseases.
  • the present inventors established a large number of mouse hybridomas that produce antibodies against GPVI, and combined these antibodies to easily and highly sensitively detect sGPVI present in plasma.
  • GPVI present on the platelet membrane hereinafter sometimes referred to as mGPVI
  • sGPVI soluble GPVI present in body fluid
  • the first aspect of the present invention is:
  • a method for measuring GPVI in a sample, particularly sGPVI or mGPVI in a biological sample, using one or more GPVI specific binding substances preferably (la) a method for measuring soluble GPVI (sGPVI) in body fluids, particularly human body fluids, using one or more GPVI-specific binding substances;
  • GPVI-specific binding substance is an anti-GPVI antibody
  • GPVI-specific binding substance is an antibody that specifically binds to GPVI domain 1, preferably loop 2 or loop 5, more preferably loop 2.
  • (1-lb) GPVI-specific binding substance is an antibody that specifically binds to GPVI domain 2, preferably loop 9 or loop 11, more preferably loop 9,
  • (1-lc) GPVI-specific binding substance is an antibody that specifically binds to GPVI loop 2 or 9;
  • the anti-GPVI antibody that specifically binds to domain 1 of GPVI is an antibody that specifically binds to loop 2 or loop 5, preferably loop 2, of GPVI, and domain 2 of GPVI Anti-VIVI antibody that specifically binds to GPVI loop 9 or Any one of the above measurement methods, which is an antibody that specifically binds to loop 11, preferably loop 9;
  • At least an antibody that specifically binds to GPVI loop 2 is used as an immobilized antibody, and an anti-GPVI antibody that specifically binds to loop 9 is used as an immobilized antibody. Any one of the above measurement methods,
  • the non-solid phase antibody is F (ab ') 2
  • the antibody that specifically binds to loop 2 of GPVI is F1232-10-2 antibody, or the antibody that specifically binds to loop 9 of GPVI is F1232-7-1 antibody. Any of the above measuring methods,
  • the sGPVI measurement method according to any one of the above, wherein the anti-GPVI antibody that specifically binds to domain 2 of GPVI is an antibody that specifically binds to loop 9 or loop 11 of GPVI.
  • An anti-GPVI antibody that specifically binds to GPVI domain 1 is an antibody that specifically binds to loop 2 or 5 of GPVI and specifically binds to domain 2 of GPVI.
  • the anti-GPVI antibody is an antibody that specifically binds to loop 9 or loop 11 of GPVI.
  • the non-solid phase antibody is F (ab ') 2
  • the antibody that specifically binds to GPVI loop 2 is F1232-10-2 antibody, or the antibody that specifically binds to GPVI loop 9 is F1232-7-1 antibody.
  • the second aspect of the present invention is:
  • a reagent or kit for measuring GPVI in a sample particularly sGPVI or mGPVI in a biological sample, containing one or more GPVI-specific binding substances, preferably
  • the measurement sensitivity is lOOpg / ml or less, preferably 30 pg / ml or less, more preferably lOpg / ml or less, more preferably 3. Opg / ml or less, particularly preferably 1. Opg / ml or less, Any measurement reagent or kit,
  • GPVI-specific binding substance is an anti-GPVI antibody, any of the above measuring reagents or kits,
  • (2-lc) GPVI-specific binding substance is an antibody that specifically binds to loop 2 or loop 9 of GPVI,
  • the anti-GPVI antibody that specifically binds to domain 1 of GPVI is an antibody that specifically binds to loop 2 or loop 5 of GPVI, preferably loop 2, and domain 2 of GPVI
  • the anti-GPVI antibody that specifically binds to GPVI is an antibody that specifically binds to loop 9 or loop 11, preferably loop 9, of GPVI, (2-4) Any of the above-described measurement reagents or kits containing, as GPVI-specific binding substances, an antibody that specifically binds to loop 2 of GPVI and an anti-GPVI antibody that specifically binds to loop 9;
  • the antibody that specifically binds to loop 2 of GPVI is the F1232-10-2 antibody, or the antibody that specifically binds to loop 9 of GPVI is the F1232-7-1 antibody.
  • An anti-GPVI antibody that specifically binds to domain 1 of GPVI is an antibody that specifically binds to loop 2 or loop 5 of GPVI, and domain of GPVI
  • An anti-GPVI antibody that specifically binds to 2 is an antibody that specifically binds to loop 9 or loop 11 of GPVI, any of the above sGPVI measurement reagents or kits,
  • the antibody that specifically binds to GPVI loop 2 is F1232-10-2 antibody, or the antibody that specifically binds to GPVI loop 9 is F1232-7-1 antibody.
  • the third aspect of the present invention is:
  • a platelet activation marker comprising sGPVI or mGPVI.
  • sGPVI or mGPVI as a platelet activation marker.
  • a method for detecting, measuring or quantifying platelet activation or vascular endothelial injury, or a method for determining or evaluating the same including a step of detecting, measuring or quantifying sGPVI or mGPVI in a sample;
  • the sixth aspect of the present invention provides:
  • a method for diagnosing platelet activation or vascular endothelial injury-related disease, a method for determining susceptibility, or a method for evaluating risk of onset including a step of detecting, measuring or quantifying sGPVI or mGPVI in a sample,
  • (6-1) A process for detecting, measuring or quantifying GPVI, particularly sGPVI, more preferably sGPVI in human body fluid, using any of the above GPVI, especially sGPVI measurement methods, measurement reagents or measurement kits. Including a method for diagnosing the above-mentioned platelet activation or vascular endothelial injury-related disease, a method for determining susceptibility, or a method for evaluating the onset risk,
  • the disease is preferably any one selected from the group consisting of thrombotic disease or embolic disease or arteriosclerotic disease, more preferably angina, myocardial infarction, heart disease, cerebral infarction and dementia. Any one of the above-described diagnostic methods, susceptibility determination methods, or onset risk evaluation methods.
  • the seventh aspect of the present invention provides
  • An antiplatelet agent preferably an antiplatelet agent that suppresses collagen-induced platelet activation or aggregation, more preferably an anti-GPVI antibody, including a step of detecting, measuring or quantifying sGPVI or mGPVI in a sample (Remarkable) How to select patients
  • the suspected disease of the patient is platelet activation or vascular endothelial injury related disease, preferably thrombotic disease or embolic disease or arteriosclerotic disease, more preferably angina pectoris, myocardial infarction, Any one of the above screening methods, which is any one selected from the group consisting of heart disease, cerebral infarction and dementia.
  • the eighth aspect of the present invention provides
  • the suspected disease of the patient to which the drug is administered is a platelet activation or vascular endothelial injury-related disease, preferably a thrombotic disease or
  • the determination method according to any one of the above which is any one selected from the group consisting of an embolic disease or an arteriosclerotic disease, more preferably angina, myocardial infarction, heart disease, cerebral infarction and dementia.
  • the ninth aspect of the present invention provides:
  • a method for predicting the therapeutic effect or side effect of an anti-platelet drug, preferably an anti-platelet drug that suppresses collagen-induced platelet activation or aggregation comprising the step of detecting, measuring or quantifying sGPVI or mGPVI in a sample Monitoring method or prognostication method,
  • the suspected disease of the patient is platelet activation or vascular endothelial injury related disease, preferably thrombotic disease or embolic disease or arteriosclerotic disease, more preferably Or any one of the above-mentioned prediction method, monitoring method or prognosis determination method selected from the group consisting of angina pectoris, myocardial infarction, heart disease, cerebral infarction and dementia.
  • the tenth aspect of the present invention is:
  • the first aspect of the present invention is:
  • (11-1) A method for preventing or treating a disease characterized by administering an anti-GPVI antibody or GPVI-Fc, preferably an anti-GPVI antibody, to a patient diagnosed or selected by the above-described diagnostic method or screening method,
  • the disease is platelet activation or vascular endothelial injury related disease, preferably thrombotic disease or embolic disease or arteriosclerotic disease, more preferably angina, myocardial infarction, heart disease, cerebral infarction and dementia Any one of the above-mentioned prevention or treatment methods.
  • vascular endothelial injury related disease preferably thrombotic disease or embolic disease or arteriosclerotic disease, more preferably angina, myocardial infarction, heart disease, cerebral infarction and dementia Any one of the above-mentioned prevention or treatment methods.
  • the first and second aspects of the present invention are:
  • An antiplatelet drug preferably an antiplatelet drug that suppresses collagen-induced platelet activation or aggregation, for preventing or treating a disease of a patient diagnosed or selected by the diagnostic method or screening method described above
  • (12-1) characterized in that it contains an anti-GPVI antibody or GPVI-Fc, preferably an anti-GPVI antibody, for preventing or treating a disease of a patient diagnosed or selected by the above-described diagnostic method or screening method.
  • Drugs to do are characterized in that it contains an anti-GPVI antibody or GPVI-Fc, preferably an anti-GPVI antibody, for preventing or treating a disease of a patient diagnosed or selected by the above-described diagnostic method or screening method.
  • the disease is platelet activation or vascular endothelial injury related disease, preferably thrombotic disease or embolic disease or arteriosclerotic disease, more preferably angina pectoris, Any one of the above drugs selected from the group consisting of myocardial infarction, heart disease, cerebral infarction and dementia,
  • GPVI in a sample particularly sGPVI or mGPVI in a biological sample can be measured with high sensitivity.
  • Figure '1 shows the base sequence of the rat GPVI gene.
  • Figure 2 shows the alignment of the amino acid sequence of human and rat GPVI, and the position of each domain and each loop (L1-L14).
  • Figure 3 shows the alignment of the amino acid sequences of human and mouse GPVI and the positions of each domain and each loop (L1-L14).
  • Figure 4 shows the results of SDS-PAGE of recombinant rGPVI-Fc.
  • FIG. 5 shows the results of SDS-PAGE of F12I39-6-1.
  • Fig. 6 shows the results of analysis of the recognition region of anti-rat GPVI antibody.
  • FIG. 7 shows a rat soluble GPVI ELISA standard curve.
  • FIG. 8 shows a human soluble GPVI ELISA standard curve.
  • FIG. 9 shows the results of GPVI flow cytometry analysis on rat platelet membrane.
  • FIG. 10 shows the concentration of soluble GPVI in the supernatant of rat platelet-in-vitro shedding samples.
  • Figure 11 shows the results of GPVI flow cytometry analysis on monkey platelet membranes.
  • Figure 12 shows the results of GPVI Western analysis of monkey platelets.
  • Figure 13 shows the soluble form in the supernatant of the monkey platelet in vitro shedding sample.
  • Figure 14 shows the results of GPVI flow cytometry analysis of human platelets.
  • Figure 15 shows the results of GPVI Western analysis of human platelets.
  • Figure 16 shows the soluble GPVI concentration in the supernatant of the human platelet in vitro shedding sample.
  • Figure 17 shows the results of experiments using rat endotoxin-induced thrombus model animals.
  • Figure 18 (A) shows the experimental results 30 minutes after using a collagen-induced thrombus model animal.
  • Figure 18 (B) shows the experimental results after 15 minutes using a collagen-induced thrombus model animal.
  • Fig. 19 (A) shows the experimental results of the measurement of plasma soluble soluble GPVI levels using a balloon catheter intimal injury model.
  • Figure 19 (B) shows the effect of anti-GPVI antibody using a balloon catheter intimal injury model.
  • FIG. 20 shows changes in soluble GPVI in urine in rat endotoxin-induced thrombus model animals.
  • Figure 21 shows the amount of soluble GPVI in various human pathological plasmas.
  • Figure 22 shows the results of GPVI Western analysis of human platelets.
  • the present invention is described in detail below.
  • the GPVI derived animal species to be measured is not particularly limited, and mammals such as mice, rats and monkeys are preferable, but human GPVI is preferable.
  • the nucleotide and amino acid sequences of these GPVIs are known, and the amino acid sequences of mouse, rat and human GPVI are shown in FIGS.
  • mGPVI exists on the platelet surface as a transmembrane protein, and is usually a full-length GPVI molecule consisting of the amino acid sequence described above.
  • sGPVI is released from platelets for some reason, it is considered that sGPVI has been cleaved by an enzyme, particularly an enzyme derived from platelets, preferably a protease, more preferably a metalloprotease, to form a soluble form.
  • an enzyme particularly an enzyme derived from platelets, preferably a protease, more preferably a metalloprotease, to form a soluble form.
  • the molecular weight is about 55 kd on SDS-PAGE under reducing conditions, and can be detected by Western blotting using an anti-GPVI antibody.
  • a sample (hereinafter sometimes referred to as a specimen), particularly a biological sample, is not necessarily limited, and includes body fluid, cells or tissues.
  • body fluid include blood, plasma, platelet-rich plasma (PRP) ) Platelet-poor plasma (PPP), urine, etc., for example, platelets.
  • PRP platelet-rich plasma
  • PPP Platelet-poor plasma
  • urine etc., for example, platelets.
  • mGPVI it is preferably a biological sample containing platelets, particularly blood, platelet rich plasma (PRP) or platelets.
  • PRP platelet rich plasma
  • sGPVI preferred are body fluids, particularly blood, plasma, platelet poor plasma (PPP), urine and the like.
  • the animal species from which the biological sample is derived is not necessarily limited, and includes mammals such as humans, mice, rats, rabbits and monkeys, and preferably humans.
  • the method for measuring GPVI in a sample according to the first aspect of the present invention comprises measuring GPVI in a sample, particularly sGPVI or mGPVI in a biological sample, using one or more GPVI-specific binding substances.
  • the reagent or kit for measuring GPVI in the sample according to the second aspect of the present invention is characterized by containing at least one GPVI-specific binding substance.
  • the GPVI-specific binding substance includes collagen, CRP, convulxin and the like, and is preferably an anti-GPVI antibody.
  • antibodies will be described as typical examples. However, in the present invention, GPVI-specific binding substances other than antibodies can be applied to the description of antibodies within the applicable range.
  • the anti-GPVI antibody is not necessarily limited as long as it specifically recognizes or binds to GPVI, particularly sGPVI or mGPVI. Binding affinity with GPVI (Kd) ⁇ 10 17 ⁇ or less, preferably 3X10— 8 ⁇ or less, more preferably 1 ⁇ 1 ( ⁇ 8 ⁇ or less, more preferably 3 ⁇ 1 ( ⁇ 9 ⁇ or less, particularly preferably 1 ⁇ 10_ 9 ⁇ It is as follows.
  • the animal species from which the antibody is derived is not necessarily limited, and examples thereof include mammals, particularly mice, rats, hamsters, and rabbits, and may be antibodies produced by gene recombination techniques. Monoclonal antibodies and polyclonal antibodies can be applied, but the monoclonal antibodies are preferred in terms of properties such as specificity and material homogeneity.
  • the form of the antibody is not necessarily limited, and various antibodies can be applied.
  • the antibody of the present invention may be a fragment, a part or a derivative of an antibody as long as it has an activity, for example, a binding ability to GPVI.
  • fragments include Fab (Fragment of antigen binding), Fab ', (Fab,) 2, etc.
  • derivatives include single chain antibody (scFv), disulfide stabilized antibody (dsFv), diabody, sc ( Fv) 2 (see, for example, Orita T, Blood.
  • GPVI antibodies such as mouse anti-human GPVI monoclonal antibody (see W001 / 810, W002 / 80968, W02005 / 111083, etc.), rat anti-mouse GPVI monoclonal antibody (Nieswandt et al.), Rat anti-human GPVI monoclonal Antibody hGP5C4
  • An antibody in which a binding region, a binding site or an epitope is identified is preferable.
  • Specific examples include the antibodies shown in the examples and
  • Examples thereof include antibodies described in Examples of W02006 / 117910 and W02006 / 118350.
  • Various methods can be applied to the production method and identification method of such an antibody.
  • a specific site of GPVI for example, a specific domain, preferably a specific loop region, other amino acid sequence, specifically, corresponding amino acid sequence of GPVI of other animal species
  • a method of using the mutant substituted with as an antigen for immunization or an antigen for antibody identification is a specific site of GPVI, for example, a specific domain, preferably a specific loop region, other amino acid sequence, specifically, corresponding amino acid sequence of GPVI of other animal species.
  • the methods described in the examples of W02006 / 117910 or TO2006 / 118350 can be applied.
  • the recognition region of the antibody can be estimated by measuring the binding property between the substitution mutant and the antibody and the binding property between GPVI and the antibody according to a known method. Specific methods are shown in the examples.
  • binding regions preferably two different types of binding regions, preferably a combination of antibodies that do not compete with each other in binding to GPVI, for example, antibodies and domains that bind to domain 1.
  • GPVI a combination of an antibody that binds to 2 or an antibody that binds to at least part of loop 2 and an antibody that binds to at least part of loop 9
  • GPVI with high specificity, selectivity and Z or sensitivity
  • specific GPVI molecular species for example, sGPVI should be measured specifically, selectively and / or with high sensitivity. Is possible. Suitable examples are given in the examples.
  • the measurement sensitivity is not necessarily limited, but in terms of the concentration in the sample, Ing / mL or less, preferably 300 pg / ml or less, more preferably 100 pg / ml or less, more preferably 30 pg / ml or less, particularly preferably not more than 10p g / ml, very good Mashiku 3. Opg / ml, and most preferably not more than 1. 0 pg / ml.
  • the detection limit concentration is Ing / mL or less, preferably 300 pg / ml or less, more preferably 100 pg / ml or less, more preferably 30 pg / ml or less, particularly preferably 10 pg / ml or less, and most preferably 3. Opg / ml or less, most preferably 1. Opg / ml or less. That is, the detection limit concentration is Ing / mL or less, preferably 300 pg / ml or less, more preferably
  • the concentration in the sample is converted as the amount of the standard substance that creates the standard curve, for example, GPVI-Fc. You may do it. If dilution of the sample is required before measurement, the value after dilution is used.
  • the sGPVI concentration in normal human plasma was approximately 0.1 to lOng / mL (median 0.4 ng / mL) in terms of hGPVI-hFc. is there.
  • the sensitivity of the measurement system is 30 pg / ml or less, preferably 10 P g / ml or less, and more preferably is several pg / mL or less.
  • the anti-GPVI antibody may be a labeled antibody or an unlabeled antibody, but it is preferable to use at least one labeled antibody.
  • known substances and methods can be used as the labeling substance and labeling method, and radioactive substances, enzymes, fluorescent substances, chemiluminescent substances, etc. are used, and any of them can be applied.
  • the method using an enzyme-labeled antibody is preferable in that it does not require special equipment or an expensive detection device and is easy to handle.
  • the measurement principle and the like are not necessarily limited, and are generally immunoassay methods.
  • Known methods such as an enzyme antibody method, ELISA method, sandwich immunoassay method, agglutination method, Phase direct method, solid phase binding method, solution reaction method, competition method, Non-competitive methods, immunochromatography methods, flow-through methods, etc.
  • the sandwich immunoassay method particularly the sandwich ELISA method using an insoluble carrier such as a microwell plate is simple and preferable in terms of sensitivity.
  • the Sandwich immunoassay is a method in which an antibody-antigen-antibody complex is formed by using two or more types of antibodies having different sites for recognizing the protein to be measured.
  • sandwich immunoassay an insoluble carrier is usually used.
  • the first antibody to be bound to the insoluble carrier is immobilized (for use).
  • the antibody or captive antibody and the second antibody are non-solid phase. In some cases, it is called a labeled antibody when it is labeled directly or indirectly.
  • an insoluble carrier to which the first antibody is bound is prepared and used as a solid phase or a reaction site. A sample is added to the insoluble carrier on the solid phase and allowed to react.
  • the sandwich method can be used in either a two-step method (two-step method) or a one-step method (one-step method) in which an antigen and a label are added simultaneously.
  • various antibodies can be used as the immobilized antibody, and preferred are antibodies that specifically bind to domain 2, more preferably loop 9 or loop 11, particularly loop 9.
  • Various antibodies can be used as the non-solid phase antibody, and an antibody that specifically binds to domain 1, more preferably loop 2 or loop 5, and particularly loop 2 is preferable.
  • a combination of an antibody that specifically binds to loop 9 as a solid-phased antibody and an antibody that specifically binds to loop 2 as a non-solid phased antibody is preferable.
  • the San Germani immunoassay it can also be carried out in solution without using an insoluble biocarrier.
  • a method of reacting an antigen with a labeled antibody and a second labeled second binding substance in a liquid phase and measuring the interaction between the label and the second label Further, in the sandwich immunoassay method, etc., it can also be measured by a competitive method as an alternative method. In this method, an antigen-antibody complex is formed, and the measurement is performed by competing the labeled antigen or labeled antigen-like substance with the antigen in the sample.
  • the second specific binding can be used as another method.
  • Antibody-antigen-antibody-second specific binding substance complex or antibody-antigen-antibody-second specific binding substance-specific binding partner of second specific binding substance (hereinafter referred to as second specific binding partner)
  • second specific binding partner This is a method of measuring by forming a complex.
  • the combination of the second specific binding substance and the second specific binding partner include an antigen and its antibody, a ligand and its receptor, a sugar chain-containing substance and a lectin, and biotin and avidin or streptavidin.
  • an antibody against an antibody that is, a method of measuring by forming an antibody-antigen-antibody-anti-immunoglopurine antibody complex using an anti-immunoglobulin antibody, and the anti-immunoglobulin antibody and the second characteristic Using binding, anti-immunopurine antibody-antibody-antigen-antibody-secondary specificity
  • An example is a method of measuring by forming a binding substance, a second specific binding partner, or the like.
  • the second specific binding substance uses piotin and avidin or streptavidin as the second specific binding partner.
  • An example is a system in which a conjugated antibody is converted into piotin and detected with a label, particularly poly-HRP-labeled streptavidin. Specific methods are shown in the examples.
  • beads, latex particles, magnetic particles, plates, tubes, or membranes may be used as the insoluble carrier used in the sandwich immunoassay system of the present invention.
  • the material of beads, plates, or tubes include polystyrene, nylon, glass, silicon rubber, stainless steel, and plastic.
  • membrane include cellulose, cellulose derivatives, nitrocellulose, porous synthetic polymer, glass fiber, cloth, non-woven fabric, filter paper and the like.
  • beads, latex particles or magnetic particles can be used as a sphere. This is advantageous in terms of securing space during storage. Plates or tubes can be used as wells. This is advantageous in that it can be applied to commercially available automated measuring instruments and plate readers.
  • Membrene can also be used for immunochromatography and flow-through methods.
  • the antibody, the second binding substance, the second specific binding substance or its partner, or the anti-immunoglobulin antibody can be bound to the insoluble carrier by a heat adsorption method, a chemical binding method or the like.
  • the reaction such as non-specific adsorption and increasing the specificity or sensitivity of the measurement system
  • it is a substance that does not affect the measurement system against the non-adsorption surface where the above substance is not bound to the insoluble carrier It is preferable to perform a prokking treatment.
  • Substances that do not affect the measurement system include ushi serum albumin (BSA), proteins such as casein, Tween 20,
  • Examples thereof include surfactants such as NP-40.
  • Labels used in the sandwich immunoassay system kit of the present invention include peroxidases, in particular, enzymes such as horseradish rust peroxidase (HRP), alriphos phosphatase, ⁇ - ⁇ -galactosidase, oxidase and uricase.
  • HRP horseradish rust peroxidase
  • alriphos phosphatase alriphos phosphatase
  • ⁇ - ⁇ -galactosidase oxidase and uricase.
  • the Atariji -Chemical luminescent substances such as um or derivatives thereof, equorin or modified substances thereof, fluorescent substances such as FITC or lanthanide such as Pium (Eu) or samarium (Sm), dyes, gold colloids, Colored latex or isotope.
  • Enzyme labeling of antibodies, second binding substances, second specific binding substances or their partners, or anti-immunoglopurine antibodies can be performed using two-step dartaldehyde, maleic acid method, maleimide method, pyridyl disulfide This can be done by law. Labels other than enzymes can also be performed using known techniques such as thermal adsorption and chemical bonding. ⁇
  • Enzyme labeling is preferably performed by using a chromogenic substrate as exemplified above, using a conventional absorbance measurement system, and having relatively high sensitivity.
  • a chemiluminescent substance, fluorescent substance, colored label or isotope is used as a label, it can be measured with a measuring instrument appropriate for the label.
  • a fluorescent substance such as Eu, eg cryptate (Eu 3+ cribate)
  • an alophycocyanin derivative such as XL 6 6 5 is used as the second label to perform fluorescence resonance energy transfer. It can also be measured.
  • a label used for a simple measurement kit for example, a kit using an immunochromatography method or a flow-through method is preferable because a dye, gold colloid or colored latex can be visually observed.
  • particles used as an insoluble carrier in the aggregation method generally used particles such as latex, erythrocytes (for example, sheep erythrocytes), gelatin, microbeads or carbon particles can be used.
  • the measurement reagent or kit of the present invention may contain any component or component other than one or more GPVI-specific binding substances.
  • any reagent or kit As stabilizers, excipients, preservatives and other additives, and as optional components of the kit, standard substances, specimens, labeled antibodies and other buffers or diluents, and labeled antibodies with enzymes
  • standard substances e.g., chromogenic substrates, blocking agents, reaction terminators, or cleaning agents suitable for the enzyme used.
  • the diluent is not particularly limited, but a diluent containing a substance contained in the specimen is preferable.
  • the specimen is serum and blood collection for obtaining the serum is performed in the presence of EDTA or citrate
  • the same amount of EDTA or citrate be present as a diluent.
  • Standards include GPVI prepared from biological samples, especially sGPVI or mGPVI, or recombinant GPVI prepared by genetic engineering, particularly sGPVI, mGPVI, GPVI extracellular domain or GPVI extracellular domain and immunoglobulin. Fc fragment fusion protein (GPVI-Fc) etc. These can be adjusted by a known method.
  • the measurement reagent or kit of the present invention is particularly useful in the following diagnostic methods and the like.
  • sGPVI or mGPVI is affected by various platelet stimuli both in vivo and in vitro, especially fluctuations associated with platelet activation, especially quantitative fluctuations. It can be used as a biomarker for estimating the activation of platelets in the body, particularly the activation state via GPVI, that is, a platelet activation marker.
  • sGPVI in a biological sample when sGPVI in a biological sample is high, it is presumed that platelet activation is caused by some cause in the living body, particularly, a mechanism via GPVI.
  • a mechanism via GPVI For example, when the mGPVI of platelets is high, it is presumed that platelets are likely to be activated in response to platelet stimulation in vivo, particularly stimulation via GPVI. Examples of these causes, mechanisms, or stimulation include exposure of collagen in the blood vessel due to vascular endothelial injury.
  • the present invention provides a platelet activation marker comprising soluble GPVI (sGPVI) or GPVI (mGPVI) present on the platelet membrane, and the use of sGPVI or mGPVI as a platelet activation marker. .
  • sGPVI soluble GPVI
  • mGPVI GPVI
  • a method for predicting the therapeutic effect or side effect of the above-mentioned drug, a monitoring method, or a prognostic determination method including a step of detecting, measuring or quantifying sGPVI or mGPVI in a sample;
  • a reagent or kit for any of the methods of the fifth to ninth aspects of the present invention comprising one or more GPVI-specific binding substances is provided.
  • the method according to the fifth to ninth aspects of the present invention includes a step of detecting, measuring or quantifying sGPVI or mGPVI in at least a sample, particularly a biological sample, which comprises at least a sample and one or more GPVIs. Contacting with a specific binding substance. Detection, measurement, or quantification of sGPVI or mGPVI in a sample can be performed using the measurement method, measurement reagent, or kit of the present invention according to the description of the first and second aspects of the present invention.
  • the sample is derived from a patient with any disease or an individual who is likely to have a disease, compare with the measured value of a healthy person, compare with the measured value before and after onset, or treatment, especially drugs such as anti-platelet drugs It can be accompanied by a process of comparing the measured values before and after treatment with.
  • the measurement results of a plurality of normal persons are obtained in advance, and the standard values of normal persons or standard values of normal persons are standardized by taking the average value or range of the measurement results, etc. This is a step of comparing with the measured value.
  • the average value of normal persons + 2 SD or 3 SD can be used as the cut-off value to obtain the standard value of normal persons.
  • a reference value for a patient having a disease for example, thrombosis
  • a step of comparing with a measured value may be performed. This step may be performed instead of the step of comparing with the standard value of a normal person.
  • the activation of the platelets is not necessarily limited, but is preferably a platelet agonist, more preferably a GPVI specific agonist.
  • the platelet agonist include collagen, in particular, collagen existing in the intravascular subcutaneous region associated with vascular endothelial injury, and other anti-GPVI antibodies, CRP, convulxin and the like having a platelet activating action.
  • a disease associated with platelet activation or vascular endothelial injury is caused by platelet activation or aggregation, particularly platelet activation or aggregation by collagen, vascular endothelial injury, or arteriosclerotic reaction.
  • Diseases associated with or associated with them and abnormalities of the blood coagulation system for example diseases caused by or associated with the progression of the blood coagulation system.
  • diseases caused by or accompanied by thrombus or embolism or arteriosclerosis ie, thrombotic or embolic disease or arteriosclerotic disease, such as thrombosis and embolism and arteriosclerosis.
  • These diseases include not only arterial thrombosis but also venous thrombosis, and also include cerebral infarction caused by atrial fibrillation.
  • atrial fibrillation or atrial flutter and thrombosis caused by these, embolism, especially cerebral infarction, and the like.
  • obstructive thrombotic vasculitis In addition, there are obstructive thrombotic vasculitis, acute arterial occlusion, obstructive arteriosclerosis or deep vein embolism, etc.
  • Transient ischemic attack subarachnoid cerebral vasospasm, pulmonary thrombus, pulmonary embolism, vascular purpura, idiopathic thrombocytopenia purpura, thrombotic thrombocytopenic purpura, disseminated intravascular coagulation syndrome
  • thrombotic or embolic disease or arteriosclerotic disease such as thrombosis or embolism or arteriosclerosis, more preferably angina pectoris, myocardial infarction, heart disease, cerebral infarction or dementia.
  • Detection, measurement or quantification, determination or evaluation of platelet activation or vascular endothelial injury by measuring GPVI in a sample, particularly sGPVI or mGPVI in a biological sample, using the measurement method, measurement reagent or kit of the present invention Alternatively, it is possible to diagnose platelet activation or vascular endothelial injury-related diseases, determine susceptibility, or evaluate the risk of onset.
  • Their implementation involves the steps of comparing the measured values of healthy individuals, comparing the measured values before and after onset, or comparing the measured values before and after treatment, particularly treatment with drugs such as antiplatelet drugs. Is preferred.
  • the antiplatelet drug is not necessarily limited, and examples thereof include known drugs, such as aspirin, tita oral vidin, and GP I Ib Z I Ia antagonists.
  • Various antiplatelet drugs that specifically inhibit collagen-induced platelet activation or aggregation can be applied.
  • antibodies against collagen, collagen peptides, fragments and derivatives thereof for example, see W099 / 50281 etc.
  • GPVI fragments or derivatives thereof, such as GPVI-Fc (for example,
  • Anti-GPVI antibodies include known anti-GPVI antibodies such as mouse anti-human GPVI monoclonal antibodies (see W001 / 810, W002 / 80968, W02005 / 111083, etc.), rat anti-mouse GPVI monoclonal antibodies (Nieswandt et al.) Rat anti-human GPVI monoclonal antibody hGP5C4
  • scFv human toe stranded antibodies
  • W003 / see, 54020 Pihi preparative anti-human GPVI monoclonal antibody
  • Preferred examples include an antibody that suppresses collagen-induced platelet aggregation, an antibody that has a GPVI elimination effect, and an antibody that recognizes loop 9 of GPVI.
  • Specific examples include the antibodies shown in Examples of the present application and the antibodies described in Examples of W02006 / 117910 and W02006 / 118350.
  • sGPVI or mGPVI By detecting, measuring or quantifying sGPVI or mGPVI in a sample by the measurement method of the present invention, selection of patients who respond to these drugs, determination of their administration (start) time, and their therapeutic effects or Prediction of side effects, monitoring, or prognosis can be determined. In implementing them, it is preferable to involve a step of comparing the measured values of healthy persons or comparing the measured values before and after treatment, particularly treatment with drugs such as antiplatelet drugs.
  • GPVI in plasma and / or urine in secondary prevention of myocardial infarction and cerebral infarction, and peripheral arterial occlusion associated with diabetes, and select patients who showed high levels.
  • Administration of GPVI antibody or soluble GPVI-Fc is expected to show a higher efficacy rate than when patients were not selected. That is, by measuring the amount of soluble GPVI in blood and Z or urine, it is possible to select high-risk patients with thrombosis such as myocardial infarction, cerebral infarction and peripheral arterial occlusion. Patients with effective GPVI antibody or soluble GPVI-Fc can be selected.
  • primers (6 pairs) capable of amplifying each exon of the mouse GPVI gene were designed based on the information of the known mouse GPVI gene. Using these, we performed PCR using rat genomic DNA in a saddle shape, and sequenced and joined the specifically amplified gene fragments to estimate the rat GPVI gene sequence. Next, based on this sequence information, primers for rat GPVI (ratGPVI- # a, mGPVI-d) were redesigned, and rat bone marrow derived cDNA (rat bone marrow derived RNA was synthesized by reverse transcription using oligo dT primer) The rat GPVI full-length gene was amplified by PCR using the ⁇ type.
  • FIG. 1 shows the base sequence of the rat GPVI gene.
  • Rat GPV fta GGGAATTCCATGTCTCCAGCCTCACTC (SEQ ID NO: 1 3)
  • rat GPVI D1 and D2 domain 1 and domain 2 in the extracellular region of GPVI
  • the gene fragment A encoding was amplified.
  • pTK-2440 described in W02006 / 117910 and W02006 / 118350
  • mouse GPVI D3 mouse GPVI extracellular
  • a gene fragment B encoding a region other than D1 and D2 was amplified.
  • a and B are mixed to make a saddle shape, and PCR is performed again with a primer pair (rat GPVI- # a and IgGl-i), thereby connecting rat GPVI (D1 and D2) and mouse GPVI (D3).
  • the obtained gene fragment C was obtained.
  • This fragment C was digested with Eco RI on the 5 'side and Bam HI on the 3 side, and then the plasmid with the mouse Fc region (mFc) downstream of the EF promoter (pTK-2299: W02006 / 117910 and W02006 / 118350).
  • Eco RI PTK-2483 capable of expressing the rat GPVI-mFc fusion protein was constructed by insertion into the Bam HI site.
  • Rat GPVI-hFc (rGPVI-hFc), mouse GPVI—hFc (mGPVI-hFc), human GPVI—hFc (hGPVI-hFc), rGPVI-hL2, 5 -hFc (GPVI mutant protein in which loops 2 and 5 of rat GPVI-hFc are replaced with the corresponding sequences of human GPVI), rGPVI- hL9, 11- hFc (loops 9 and 11 of rat GPVI-hFc are human) GPVI mutant protein substituted with the corresponding sequence of GPVI), hGPVI-mL2-hFc (GPVI mutant protein in which loop 2 of human GPVI-hFc is replaced with the corresponding sequence of mouse GPVI), and hGPVI-mL9_hFc ( Each expression plasmid of the human GPVI-hFc loop 9 substituted with the corresponding sequence of mouse GPVI) is expressed as the known human GPVI and mouse GP
  • COS-1 cells were passaged in Dulbecco's MEM medium containing 10% fetal calf serum. Transfer reagent (FuGENE6, Roche Diag) in serum-free Dulbecco MEM medium After mixing (nostics), an appropriate amount of pTK_2483 was mixed and added to C0S-1 cells whose medium was changed to Hybridoma-SFM medium (GIBC0). In 37 ° C, 5% C0 2 presence 3 days culture after supernatant was harvested, and cultured further 3 days with fresh medium and their supernatant protein A column - purified by (Prosep vA, MILLIPORE) This was used as an antigen for the preparation of anti-lat GPVI antibody.
  • the obtained r GPVI-mFc fusion protein was analyzed by SDS-PAGE by a conventional method. Specifically, samples and molecular weight markers (Bio-Rad, Precision Plus Protein Unstained Standard) were applied to a 5-20% gradient gel, electrophoresed, and then stained with silver (Fig. 4).
  • RGPVI-hFc fusion protein mGPVI-hFc fusion protein, hGPVI-hFc fusion protein, rGPVI-hL2, 5 hFc variant protein, rGPVI-hL9, 11- hFc variant protein and hGPVI-mL9-hFc variant protein Similarly expressed and purified.
  • Alum PIERCE 12. 5 ⁇ L of CpG adjuvant 1 mg and purified rat GPVI-mFc fusion protein mixed with lOO w L as the administration antigen in ddY mice (female, 8 weeks old, SLC) 50 L was applied to each of the foot pads using a microsyringe. Eleven days later, the administered antigen 20 / zg was diluted with 50 / L of physiological saline, and 25 L each was administered into the footpad. Three days later, lymphocytes were isolated from the iliac lymph nodes, and the resulting lymphocytes were mixed with P3 X 63—Ag. 8. U1 (ATTC).
  • Hypridoma was selected by HAT medium, and one week later, the high-pridoma producing the target antibody was screened.
  • the purified rat GPVI-hFc fusion protein was diluted to 3 / g / mL with 0.076 M phosphate buffer (pH 7.4) (hereinafter referred to as PBS), and diluted to an immunoplate (Maxisorb, NUNC). ⁇ L / well was added. After an overnight reaction at 4 ° C, the plate was washed 3 times with deionized water, and PBS containing 2% Stabilgurd was added to each well for blocking.
  • the culture supernatant is added to each well and reacted at 37 ° C for 1 hour, then 0.05% Tween Washed 3 times with 20 saline.
  • Peroxidase-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody (DAK0) was diluted 1000-fold with PBS containing 10% Usagi serum, and 50 ⁇ L was added to each well. After 1 hour of reaction at 37 ° C, the plate was washed 5 times in the same manner, and TMB solution (BioFix) was added to each well. After 10 minutes of reaction at room temperature, the reaction was stopped with 0.5 M sulfuric acid solution. Absorbance at 450 nm was measured with a plate spectrophotometer (NJ-2100, Nippon Intermed).
  • the culture supernatant was adsorbed to protein A (rmp Protein A Sepharose Fast Flow, GE Healthcare Bioscience) that had been pre-washed with PBS- (Sigma), and the non-adsorbed protein was washed with PBS- The adsorbed protein was eluted with 10 X PBS- (Sigma). Thereafter, the antibody bound to protein A was eluted with 100 mM glycine monohydrochloride buffer (pH 3.0). The volume of the eluate was measured, and 1Z10 volume of 2 M Tris-HCl (pH 8.5) was immediately added to return the pH to neutral to obtain a purified antibody solution.
  • protein A rmp Protein A Sepharose Fast Flow, GE Healthcare Bioscience
  • This purified antibody solution is concentrated with a Biomax PB ultrafiltration membrane (MILLIP0RE) with a molecular weight of 30,000 using a stirring cell, and then concentrated against physiological saline (Otsuka raw food injection, Otsuka Pharmaceutical Factory). The final purified antibody solution was dialyzed. The obtained antibody was analyzed by SDS-PAGE by a conventional method. Specifically, a sample and a molecular weight marker (Bio-Rad, Precision Plus Protein Unstained Standard) were applied to a 5-20% gradient gel, electrophoresed, and then stained with silver (Fig. 5). In all of the following examples, antibodies purified by the same method were used.
  • the recognition domain of the anti-rat GPVI monoclonal antibody obtained in Example 4 was analyzed. That is, rGPVI-hFc fusion protein purified with PBS was diluted to 2 g / mL, and 50 L / well was added to immunoplate (Maxisorb, NUNC). 1 hour at 37 ° C Then, wash 5 times with ion-exchanged water, 2 ° /. PBS containing Stabi lgurd was added to each well, and 100 / i L was added to the well.
  • Example 5 the monoclonal antibody purified in Example 5 was prepared in various concentrations, added to a polypropylene plate (NUNC) and added in a well, and then the rGPVI-hFc fusion protein and hGPVI-hFc fusion protein obtained in Example 3 were used.
  • RGPVI-hL2, 5-hFc variant protein, rGPVI-hL9, 11-hFc variant protein were added at 50 ⁇ L / well and mixed. Add this mixed sample to the above-mentioned immunoplate immobilized with rGPVI-hFc fusion protein at 50 L / well, react at 37 ° C for 1 hour, and then add 5% saline solution containing 0.05% Tween 20. Washed twice.
  • Peroxidase-labeled anti-mouse kappa chain antibody (Rockland) was diluted 1000-fold with PBS containing 10% Usagi serum, and 50 iL was added to each well. After reaction at 37 ° C for 1 hour, the membrane was washed 5 times in the same manner, and TMB solution (BioFix) was added to each well. After 10 minutes of reaction at room temperature, the reaction was stopped with 0.5 M sulfuric acid solution. Absorbance at 450 nm was measured with a plate spectrophotometer (NJ-2100, Nippon Intermed).
  • one antibody (F1239-11-1) that does not decrease absorbance when rGPVI-hL2,5-hFc variant protein is added that is, an antibody that recognizes loop 2 and Z or loop 5 (F1239-11-1)
  • three antibodies (F1239-4-2, F1239-that do not decrease in absorbance when rGPVI-hL9,1 ⁇ hFc variant protein is added that is, antibodies that recognize loop 9 and Z or loop 11).
  • 6-1, F1239-22- 2 It was shown to exist (Fig. 6).
  • the above three kinds of antibodies (Fl 239 - 4 - 2, F1239-6-1, F1239-22-2) , the mouse GPVI_hFc fusion protein in the same manner was not bound.
  • loop 11 of rat GPVI and mouse GPVI are the same, it is difficult to consider that loop 11 is an important recognition region, and the above antibody has at least a part of loop 9 of rat GPVI. It is presumed that the contained structure is recognized.
  • a Sandwich ELISA system was constructed using the mouse anti-rat GPVI antibody prepared in Example 4. That purified PBS F1239- 6 - 1 antibody was diluted to 10 g / mL, and I beam Nonopprelate ((MMaaxxiissoorrbb, NNUUNNCC)) was added at 7755 ⁇ LL // well. . After reacting with OOvveerr NNiigghhtt at 44 °° CC, it was washed and washed 55 times with Ion-ion-exchanged water, 55 %% SSttaabbiillgguurrdd, 00 ..
  • 11 %% TTwweeeenn 2200 PPBBSS containing was added to each well and 220000 LL was added to each well, which was then locked. .
  • recombination rrGGPPVVII-hhFFcc fusion protein protein used as sasanampupuru and pi standa daad is used as 00 .. 11 %% BBSSAA, 00 .. 33 MM chlorinated Nana 55 Totriliumum, 00 .. 0055 %% TTwweeeenn 2200ZZPPBBSS was used for dilution. .
  • blood plasma plasma is used as the measurement standard sampling sample, it should be diluted more than 55 times and diluted. ,,
  • TTMMBB solution ((BBiiooFFiixx)) was added to each well. . After reacting for 2200 minutes at room temperature, 00 .. 55 MM sulphuric acid
  • Figure 8 shows a standard curve created using hGPVI-hFc fusion protein as a standard. In this system obtained a difference of about 40mAbs absorbance in standard of 3 P g / mL, measurement sensitivity was at least 3 pg / ml or less.
  • Platelet rich plasma was obtained by centrifuging the citrated blood collected from normal rats at 110 X g, 25 ° (:, 15 minutes. Subsequently, ACD-A (acid- citrate-dextrose) and adjusted to pH 6.5, and then platelets were collected by centrifuging at 830 Xg and 25 ° C for 10 minutes.
  • HEPES Buffer 137 mM NaCl, 1 mM MgCl 2 , 5.5 mM Glucose, 3 mM Na3 ⁇ 4P0 4 , 10 mM HEPES, 1 mg / mL BSA was added and washed twice.
  • Platelets were suspended by adding Buffer (pH 7.3) to obtain washed platelets Convulxin (ALEXIS) and CRP (peptide synthesis product) on washed platelets to which CaCl 2 and MgCl 2 were added to 1 mM.
  • ALEXIS washed platelets Convulxin
  • CRP peptide synthesis product
  • Washed platelets were stimulated with convulxin, CRP, or ADP by the method shown in Example 9.
  • As a control only the buffer was added to the washed platelets and allowed to stand at room temperature for 1 hour. After completion of the reaction by adding Protease Inhibitor Cocktail solution containing 25 mM EDTA, washing with PBS containing 0.5% inactivated FBS and 2.5 mM EDTA (hereinafter referred to as FACS buffer), fluorescent dye R- Mouse anti-rat GPVI antibody F1239-11-1 labeled with Phycoerythrin (hereinafter referred to as PE) was added to 3 x 10 5 platelets in an amount equivalent to 0.5 / g and allowed to stand at room temperature for 30 minutes in the dark. .
  • PE fluorescent dye R- Mouse anti-rat GPVI antibody F1239-11-1 labeled with Phycoerythrin
  • a sample to which the same amount of PE-labeled mouse IgG2a K antibody was added as a reference to the isotype of PE-labeled F1239-11-1 was also prepared. After 30 minutes, platelets were washed with FACS buffer, and the GPVI expression level on the platelet membrane surface was analyzed by measuring the fluorescence intensity of platelets with a flow cytometer CYT0MICS FC500 (BECKMAN COULTER). The GPVI expression level was calculated by subtracting the PE labeled mouse IgG2 a K antibody detection result value from the PE labeled F1239-11-1 detection result value. Figure 9 shows the results.
  • Platelet rich plasma was obtained by centrifuging the citrated blood collected from normal monkeys at 115 ⁇ g, 25 ° C. for 15 minutes. Subsequently, ACD-A (acid-citrate-dextrose) was added to PRP, adjusted to pH 6.5, and then centrifuged at 830 Xg and 25 ° C for 10 minutes to collect platelets. Add HEPES Buffer (137 raM NaCl, 1 raM MgCl 2 , 5.5 mM Glucose, 3 mM Na3 ⁇ 4P0 4 , 10 mM HEPES, 1 mg / mL BSA) adjusted to pH 6.5 with ACD-A to the collected platelets And washed twice.
  • HEPES Buffer 137 raM NaCl, 1 raM MgCl 2 , 5.5 mM Glucose, 3 mM Na3 ⁇ 4P0 4 , 10 mM HEPES, 1 mg / m
  • HEPES Buffer pH 7.3 was added to suspend platelets to obtain washed platelets.
  • Convulxin ALEXIS
  • CRP peptide synthesis product
  • ADP was added to washed platelets to which CaCl 2 and MgCl 2 were added to 1 mM, and the mixture was reacted at room temperature for 1 hour to stimulate the platelets.
  • a Protease Inhibitor Cocktail solution containing 25 mM EDTA, the mixture was centrifuged at 18,000 Xg and 25 ° C for 1 minute, and the supernatant and platelet fraction were collected.
  • the washed platelets were stimulated with convulxin, CRP, or ADP by the method shown in Example 12.
  • As a control only buffer was added to washed platelets and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • a sample to which the same amount of PE-labeled human IgG4 antibody was added as an isotype reference for PE-labeled chimera F1232-37-2 and PE-labeled chimera F1232-10-1 was also prepared. 30 minutes later
  • GPVI expression level is PE labeled chimera F1232- 37-2
  • Convulxin and CRP-stimulated platelets showed a decrease in GPVI expression compared to platelets supplemented with buffer alone, but ADP-stimulated platelets did not show a decrease in GPVI expression.
  • the GPVI (hereinafter referred to as platelet GPVI) contained in the sample was detected by Western Blotting. That is, X 4 Sample Buffer in the supernatant fraction 12 / z L
  • TPBS BlockAce / 0.1% Tween 20
  • the washed platelets were stimulated with Convulxin, CRP or ADP by the method shown in Example 12, and then the supernatant was collected. Furthermore, the amount of soluble GPVI in the supernatant was measured by the method of Example 8. The results are shown in FIG. In the supernatant of platelets stimulated with Convulxin and CRP, a marked increase in soluble GPVI was observed. On the other hand, the elevation of soluble GPVI in the supernatant of platelets stimulated with ADP was extremely weak.
  • Platelet rich plasma Preparation of human PRP and platelet stimulation with Collagen, Convulxin, CRP or ADP Platelet rich plasma (PRP) by centrifugation of citrated blood collected from normal humans at 170 X g, 25 ° C for 15 minutes ) Subsequently, ACD-A (acid-citrate-dextrose) was added to PRP, adjusted to pH 6.5, and then centrifuged at 830 xg and 25 ° C for 10 minutes to collect platelets.
  • ACD-A acid-citrate-dextrose
  • HEPES Buffer (137 mM NaCl, 1 mM MgCl 2 , 5.5 mM Glucose, 3 mM NaH 2 P0 4 , 10 mM HEPES, 1 mg / mL BSA) adjusted to pH 6.5 with ACD-A on the collected platelets was added and washed twice. After washing, HEPES Buffer (pH 7.3) was added to suspend platelets to obtain washed platelets. Collagen on washed platelets supplemented with CaCl 2 and MgCl 2 to 1 mM
  • Washed platelets were stimulated with collagen, convulxin, CRP or ADP by the method shown in Example 16.
  • As a control only the buffer was added to the washed platelets and allowed to stand at room temperature for 1 hour. After completion of the reaction by adding Protease Inhibitor Cocktail solution containing 25 mM EDTA, washing with FACS buffer, and then adding chimeric anti-human GPVI antibody F1232-37-2 labeled with fluorescent dye PE to 4 x 10 5 platelets 1 / g equivalent was added to the solution and allowed to stand at room temperature for 30 minutes in the dark. A sample to which the same amount of PE-labeled human IgG4 antibody was added as an isotype control for the PE-labeled chimera F1232-37-2 was also prepared.
  • platelet GPVI contained in the platelet fraction
  • TPBS BlockAce / 0.1% Tween 20
  • Example 2 After washing the washed platelets with collagen, convulxin, CRP or ADP by the method shown in Example 16, the supernatant was collected. Furthermore, the amount of soluble GPVI in the supernatant was measured by the method of Example 8. The results are shown in FIG. A marked increase in soluble GPVI was observed in the supernatant of platelets stimulated with collagen convulxin and CRP. On the other hand, there was no increase in soluble GPVI in the supernatant of platelets stimulated with ADP. [Example 2 0]
  • endotoxin administration blood was collected from the abdominal aorta, and the platelet count was measured with an automatic blood cell counter (Sysmex Toa Medical Electronics). Plasma was separated by centrifuging the blood, and soluble GPVI was implemented.
  • soluble ICAM-1 was measured using an ELISA kit (R & D System, Rat sICAM-1 (CD54) Immunoassay). The results are shown in FIG.
  • Fig. 18 A decrease in the number of platelets was observed by administering collagen. This indicates that platelets are activated by the administration of collagen. In addition, by administering collagen, The amount of soluble GPVI and soluble ICAM-1 increased. Furthermore, the degree of decrease in the number of platelets was consistent with the degree of increase in soluble GPVI in plasma.
  • ICAM-1 level increased. This indicates that the intima was damaged by the balloon catheter. An increase in the soluble GPVI level was also observed.
  • Example 22 In the model animal described in Example 22, the effect of the anti-rat GPVI antibody was examined. That is, F1239-6-1 was subcutaneously administered to anti-rats at 3 mg / kg, and 6 days later, endometrial injury was applied by the method of Example 22. 15 days after the balloon injury, the left and right carotid arteries were collected under pentobarbital anesthesia and fixed with 10% neutral buffered formalin to prepare a paraffin block. Next, the paraffin block was sliced into slide specimens, stained with Hematoxylin-Eosin, and then observed with a microscope.
  • Fig. 19 (B).
  • Anti-rat GPVI antibody (F1239-6- 1) is found in the intima in arteriosclerosis model animals in which elevated soluble GPVI in plasma was observed. Suppressed thickening.
  • Example 25 The amount of soluble GPVI in various human pathological plasmas was measured by the method shown in Example 8. The results are shown in FIG. Patients with angina pectoris, acute myocardial infarction, heart disease, cerebral infarction and dementia Patients' plasma was higher in soluble GPVI than normal human plasma. [Example 25]
  • d dY mice female, 8 weeks old, SLC
  • lymphocytes were isolated from lymph nodes or spleen.
  • the resulting lymphocytes were mixed with P 3 X 6 3—Ag. 8.
  • Hybridomas were selected using H.AT medium, and after 1 week, the hybridomas producing the desired antibody were screened using hGPV I-hFc and hGP VI—mL9_hFc binding activity as indicators.
  • purified hGP VI—h F c or h GP VI—mL9-hFc was diluted to 1 ⁇ gZmL with D—PBS (pH 7.4) and added to an immunoplate (Maxisor, NUNC) at 50 ⁇ LZ. Then, the solid phase was prepared in the same manner as in the: ⁇ method described in Example 6.
  • Single-stranded cDNA was synthesized from hybridomas F1232-37-2 and F1232-1-10 according to a conventional method.
  • the DNA encoding the variable region of the anti-GPVI antibody was amplified by PCR using Mouse Ig-Primer Set (Novagen) with the obtained single-stranded cDNA as a cage, and the nucleotide sequence was determined.
  • the base sequences and deduced amino acid sequences of the heavy and light chain variable regions of F1232-37-2 and F1232-10-1 are shown in the sequence listing (SEQ ID NOs: 18-25).
  • Example 16 After adding only convulxin or buffer as a control to washed platelets prepared from normal humans by the method shown in Example 16, after leaving at 37 ° C for 1 hour, The supernatant fraction was collected.
  • mouse anti-human GPVI antibody F1232-7-1 or F1232- 10-2 mouse anti-human GPVI antibody F1232-7-1 or F1232- 10-2, and a polyclonal antibody using human GPVI synthetic peptide as an antigen as a primary antibody by Western Blotting. Solubilized GPVI was detected. The results are shown in FIG.
  • GPVI in a sample can be measured with high sensitivity.
  • detection, measurement, quantification, determination or evaluation of platelet activation or vascular endothelial injury by detecting, measuring or quantifying sGPVI or mGPVI using the measurement method, measurement reagent or kit of the present invention, platelets Diagnosis of diseases related to activation or vascular endothelial injury, determination of susceptibility or evaluation of risk, selection of patients who respond to antiplatelet drugs, especially anti-GPVI antibodies, determination of the timing of their administration (start), and It is possible to predict the therapeutic effects or side effects, monitor or determine the prognosis. Sequence listing free text
  • SEQ ID NO: 1 is the sequence of the primer used in the PCR reaction of Example 1.
  • SEQ ID NO: 2 is the sequence of the primer used in the PCR reaction of Example 1.
  • SEQ ID NO: 3 is the sequence of the primer used in the PCR reaction of Example 1.
  • SEQ ID NO: 4 is the sequence of the primer used in the PCR reaction of Example 1.
  • SEQ ID NO: 5 is the sequence of the primer used in the PCR reaction of Example 1.
  • SEQ ID NO: 6 is the sequence of the primer used in the PCR reaction of Example 1.
  • SEQ ID NO: 7 is the sequence of the primer used in the PCR reaction of Example 1.
  • SEQ ID NO: 8 is the sequence of the primer used in the PCR reaction of Example 1.
  • SEQ ID NO: 9 is the sequence of the primer used in the PCR reaction of Example 1.
  • SEQ ID NO: 10 is the primer sequence used in the PCR reaction of Example 1.
  • SEQ ID NO: 11 is the sequence of the primer used in the PCR reaction of Example 1.
  • SEQ ID NO: 12 is the primer sequence used in the PCR reaction of Example 1.
  • SEQ ID NO: 13 is the sequence of the primer used in the PCR reaction of Example 1.
  • SEQ ID NO: 14 is the sequence of the primer used in the PCR reaction of Example 1.
  • SEQ ID NO: 15 is the sequence of the primer used in the PCR reaction of Example 2.
  • SEQ ID NO: 16 is the sequence of the primer used in the PCR reaction of Example 2.
  • SEQ ID NO: 1 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ is the primer sequence used in the PCR reaction of Example 2.

Abstract

本発明はGPVIに対する抗体を産生するマウスハイブリドーマを多数樹立し、それらの産生する抗体を組み合わせることで、血漿中に存在するsGPVIを簡便かつ高感度で測定する方法を提供する。これにより、新規な血小板活性化マーカー、その測定試薬及び方法、ならびに血小板活性化／血管内皮傷害関連疾患の診断等における当該マーカーの新規用途が提供される。

Description

新規血小板活性化マーカー及びその測定方法 技術分野
[ 0 0 0 1 ]
本発明は、 新規な血小板活性化マーカー、 その測定試薬及び方法、 ならびに 血小板活性化/血管内皮傷害関連疾患の診断等における当該マーカーの新規用 途に関する。
明 背景技術
書
[ 0 0 0 2 ]
日本人の死亡原因第一位は悪性新生物、 第二位は心疾患、 第三位は脳血管疾 患である。 そして、 心疾患と脳血管疾患の大部分は心筋梗塞や脳梗塞などの血 栓症が占めており、 この両者を合わせると、 癌での死亡に匹敵する。 それ故、 血栓症の予防 ·治療は、 大きな問題点として残されている。 そして、 血栓症の 予防 '治療においては、 血小板活性をコントロールすることが重要であり、 抗 血小 ¾g薬が積極的に処方されている。 しかしながら、 その臨床効果は決して満 足できるレベルには達していない。
[ 0 0 0 3 ]
血小板の機能は、損傷を受けた血管部位の内皮下組織に結合する粘着反応と、 血小板同士がくっつき合う凝集反応の 2つにわけられる。 特に、 後者は血小板 に含まれている顆粒の内容物の放出を伴っている。 また、 血小板の活性化の過 程において、 様々な分子がその機能発現に関与しており、 これらは血小板活性 化マーカーとして利用されている。 そして、 このマーカーを有効に活用するこ とにより、 病的血栓に対する診断がより明確となるうえ、 治療法に関しても、 より適切な選択が可能となる。
[ 0 0 0 4 ] 従来、 血小板の活性化の指標として、 血小板の a顆粒に蓄積されている β ト口ンボグロプリンゃ血小板第 4因子の測定が行われてきた。 しかしながら、 これらは腎機能低下時に高値となる点や、 採血手技の影響などを考慮する必要 があり、 必ずしも適切なマーカーとは言いがたい。 また、 /3 トロンボグロプリ ンゃ血小板第 4因子がともに高値の場合は、 in vitroでの血小板活性化による 変化である可能性が高いので注意が必要である。 したがって、 より高感度で特 異性の高レ、血小板活性化マーカーの登場が望まれていた。
[ 0 0 0 5 ]
近年、 血小板活性化マーカーとして、 Pセレクチンの検出が利用されつつあ る （Shatti l S. J.ら、 Blood. 、 1987年、 70卷、 ρ· 307-315) (Murakami T. ら、 Eur. J. Cl in. Invest.、 1996年、 26卷、 p. 996-1003) 。 Pセレクチンは、 血小板の α顆粒膜あるいは血管内皮細胞の Weibel-Palade小体に存在する膜タ ンパク質であり、これらの細胞が刺激を受けた際に、細胞表面に移動 .してくる。 現在、 Pセレクチンは膜結合型と可溶型の 2種類のタィプに分類されている。 そして、 膜結合型の Pセレクチンは、 蛍光標識した抗 Pセレクチン抗体とフロ 一サイトメ トリ一を用いて、 直接的に検出される。 しかしながら、 血小板にお ける Pセレクチンの発現は、 試料の取り扱いにより擬陽性となることがあり、 安定した結果を得ることは難しい。 一方、 可溶型 Pセレクチンは、 サンドイツ チ ELISA法にて検出が可能である。 しかしながら、 Pセレクチンは血小板と血 管内皮細胞に由来することから、血漿中の可溶性 Pセレクチンを測定する場合、 その由来が問題となる。 .
[ 0 0 0 6 ]
血小板が種々の状況下で活性化されたり、 物理的な刺激を受けると、 微小な 膜小胞体が生成され、 この膜小胞体はマイクロパーティクルと呼ばれている。 血小板マイクロパーティクルはフローサイトメ トリーを用いて測定するのがー 般的であり、 様々な血栓性疾患の病態把握において重要であるが、 （1 ) 機器 間の感度の違い、 （2 ) マイクロパーティクル領域のゲートの囲み方、 （3 ) 測定限界がマイクロパーティクルのサイズと近いこと、 （4 ) 使用する抗体の 種類による施設間差などの問題点が指摘されており、 測定方法の標準化は達成 されていない。
[000 7]
血小板膜上に存在する糖蛋白質 VI (G PVI) は、 血小板のコラーゲン受容体 であり、 コラーゲン刺激による血小板の活性化に中心的役割を担っていること が明らかにされている （高山博史， 日本血栓止血学会誌， 2003年， 第 14 巻， 第 2号， p. 75— 8 1参照） 。 また、 抗マウス GPVI抗体は、 コラーゲ ン刺激特異的に血小板凝集を抑制し、出血時間の著明な延長をきたすことなく、 抗血栓作用を発揮することが報告されている （NieswandtB.ら、 J. Exp. Med.、 2001年.、 第 194卷、 第 4号、 ρ· 459-469参照） 。 さらに、 抗ヒト GPVI抗体も 出血時間の著明な延長をきたすことなぐ、 抗血小板作用を発揮することが報告 されている （TakayamaH.ら、 Blood、 2005年、 第 106卷、 第 11号、 p612a) (W O 200 5/1 1 108 3A2) 。 したがって、 コラーゲン惹起血小板凝集を 特異的に抑制する薬物、 例えば抗 GPVI抗体は、 安全で有効性の高い抗血小板 薬となり得ることが期待されている。
[0008]
血小板に存在している GPVIを、ウェスタンブロッティングで検出できること が報告されている （Tsuji M.'ら、 J. Biol. Chem. 1997年第 272卷 38号 p.23528- 23531) 。 また、 抗 GPVI抗体を血小板に添加すると、 GPVIが shedding し、 培養上淸中に可溶型 GPVI (sGPVI) が出現することがウェスタンプロッテ イングにより証明されている （Bergmeier W.ら、 Thromb. Haemost. 2004年、 第 91卷、 p.951 - 958) 。 この sGPVIの sheddingはメタ口プロテアーゼの作用に よるものと示唆されている。 しかしながら、 これらの現象は生体外において生 理的にはほとんど起こりえない条件下で人為的に惹起されたものであり、 実際 に生体内において、 生理的又は病態下において、 血小板 GPVIの sheddingが生 じているかは全く不明であった。 また、 ウェスタンブロッティングによる血小 板 GPVIならびに sGPVIの検出自体は、検査に供する試料の調製および検出感度 等、臨床の場において一般化するのには問題が多レ、。さらに、血小板表面の GPVI の存在量は血小板 1個あたり約 3000個と極めて微量と推定されている。 したが つて、 血栓 ·塞栓症等の診断を目的とした場合、 より簡便で特異性及び検出感 度の高い検查方法の開発が望まれている。 発明の開示
[ 0 0 0 9 ]
このように、 血小板活性化/血管内皮傷害関連疾患、 例えば血栓症等の診断 およぴ抗血小板薬のレスポンダーを選別する際において、 信頼性の高い血小板 活性化のバイオマーカー、 及び、 簡便で、 感度が高く、 安定した結果が得られ る当該バイオマーカーの測定方法又は診断方法、 並びにそれらのための試薬又 はキッ小が切望されている。
[ 0 0 1 0 ]
本発明の目的は、 新規な血小板活性化マーカー、 その測定試薬及び方法、 な らぴに血小板活性化/血管内皮傷害関連疾患の診断等における当該マーカーの 新規用途を提供するものである。
[ 0 0 1 1 ]
本発明者らは、 上記の課題を解決すべく、 GPVIに対する抗体を産生するマウ スハイプリ ドーマを多数樹立し、それらの産生する抗体を組み合わせることで、 血漿中に存在する sGPVIを簡便かつ高感度で測定することを着想した。 この着 想に基づき、銳意研究を重ねた結果、 血小板膜上に存在する GPVI (以下、 mGPVI と記載することがある） ならびに体液中に存在する可溶型 GPVI (以下、 sGPVI と記載することがある） を特異的かつ高感度で測定する方法を確立することに 成功するとともに、 これが血小板活性化マーカーとなり得ることを見出し、 本 発明を完成した。
[ 0 0 1 2 ]
以下に本発明を説明する。.
本発明の第 1の態様は、
(1) 1以上の GPVI特異的結合物質を用いる、 試料中の GPVI、 特に生体試料中 の sGPVI又は mGPVIの測定方法、 好ましくは、 (la) 1以上の GPVI特異的結合物質を用いる、 体液、 特にヒ ト体液中の可溶型 GPVI (sGPVI)の測定方法、
(lb) 測定感度が 100pg/ml以下、 好ましくは 30pg/ml以下、 より好ましくは lOpg/ml以下、 さらに好ましくは 3. Opg/ml以下、 特に好ましくは 1. Opg/ml以 下である、 上記何れかの測定方法、
(1-1) GPVI特異的結合物質が抗 GPVI抗体である、 上記何れかの測定方法、
(1 - la) GPVI特異的結合物質が GPVIのドメイン 1、 好ましくは、 ループ 2又 はループ 5、 より好ましくはループ 2に特異的に結合する抗体である、 上記何 れかの測定方法、
(1- lb) GPVI特異的結合物質が GPVIのドメイン 2、 好ましくは、 ループ 9又 はループ 1 1、 より好ましくはループ 9に特異的に結合する抗体である、 上記 何れかの測定方法、
(1-lc) GPVI特異的結合物質が GPVIのループ 2またはループ 9に特異的に結 合する抗体である、 上記何れかの測定方法、
(1-2) GPVI特異的結合物質として、 結合部位の異なる 2以上の抗 GPVI抗体を 用いる、 上記何れかの測定方法、
(1-3) GPVI特異的結合物質として、 少なくとも GPVIのドメイン 1に特異的に 結合'する抗 GPVI抗体及び Z又はドメイン 2に特異的に結合する抗 GPVI抗体を 用いる、 上記何れかの測定方法、
( 1 - 3a)前記 GPVIのドメイン 1に特異的に結合する抗 GPVI抗体が GPVIのルー プ 2又はループ 5、 好ましくはループ 2に特異的に結合する抗体である、 上記 何れかの測定方法、
(1 - 3b)前記 GPVIのドメイン 2に特異的に結合する抗 GPVI抗体が GPVIのルー プ 9又はループ 1 1、 好ましくはループ 9に特異的に結合する抗体である、 上 記何れかの測定方法、
( 1 - 3c)前記 GPVIのドメイン 1に特異的に結合する抗 GPVI抗体が GPVIのルー プ 2又はループ 5、好ましくはループ 2に特異的に結合する抗体であり、かつ、 前記 GPVIのドメイン 2に特異的に結合する抗 GPVI抗体が GPVIのループ 9又は ループ 1 1、 好ましくはループ 9に特異的に結合する抗体である、 上記何れか の測定方法、
(1-4) GPVI特異的結合物質として、 少なくとも GPVIのループ 2に特異的に結 合する抗体及ぴ Z又はループ 9に特異的に結合する抗体を用いる、 上記何れか の測定方法、
(1 - 4a)少なくとも GPVIのループ 2に特異的に結合する抗体を非固相化抗体と してを用いる、 上記何れかの測定方法、
(l-4b) 少なくとも GPVIのループ 9に特異的に結合する抗 GPVI抗体を固相化 抗体として用いる、 上記何れかの測定方法、
(1- 4c)少なく とも GPVIのループ 2に特異的に結合する抗体を非固相化抗体と して、及ぴ、ループ 9に特異的に結合する抗 GPVI抗体を固相化抗体として用い る、 上記何れかの測定方法、
(l-4d) サンドイッチ免疫測定法である、 上記何れかの測定方法、
(1 - 4e) 非固相化抗体が F (ab' ) 2である、 上記何れかの測定方法、
(1- 4f) ピオチン化非固相化抗体及ぴ poly- HRP標識ストレプトァビジンで検出 する系を用いる、 上記何れかの測定方法、
(1 - 4g) 前記 GPVIのループ 2に特異的に結合する抗体が F1232-10-2抗体であ る、 または、前記 GPVIのループ 9に特異的に結合する抗体が F1232-7- 1抗体で ある、 上記何れかの測定方法、
(1-5)少なくとも GPVIのドメイン 1に特異的に結合する抗 GPVI抗体及び/又 はドメイン 2に特異的に結合する抗 GPVI抗体を用いる、 体液中、 特にヒ ト体液 中の sGPVIの測定方法、
(1- 5a)前記 GPVIのドメイン 1に特異的に結合する抗 GPVI抗体が GPVIのルー プ 2又はループ 5に特異的に結合する抗体である、 上記何れかの sGPVIの測定 方法、
(1- 5b)前記 GPVIのドメイン 2に特異的に結合する抗 GPVI抗体が GPVIのルー プ 9又はループ 1 1に特異的に結合する抗体である、 上記何れかの sGPVIの測 定方法、 (1 - 5c)前記 GPVIのドメイン 1に特異的に結合する抗 GPVI抗体が GPVIのルー プ 2又はループ 5に特異的に結合する抗体であり、 かつ、前記 GPVIのドメイン 2に特異的に結合する抗 GPVI抗体が GPVIのループ 9又はループ 1 1に特異的 に結合する抗体である、 上記何れかの sGPVIの測定方法、
(1-6)少なくとも GPVIのループ 2に特異的に結合する抗 GPVI抗体及び Z又は ループ 9に特異的に結合する抗 GPVI抗体を用いる、上記何れかの sGPVIの測定 方法、
( 1- 6a)少なくとも GPVIのループ 2に特異的に結合する抗体を非固相化抗体と してを用いる、 上記何れかの sGPVIの測定方法、
(1- 6b) 少なくとも GPVIのループ 9に特異的に結合する抗 GPVI抗体を固相化 抗体として用いる、 上記何れかの sGPVIの測定方法、
(l-6c)少なくとも GPVIのループ 2に特異的に結合する抗体を非固相化抗体と して、及ぴ、ループ 9に特異的に結合する抗 GPVI抗体を固相化抗体として用い る、 上記何れかの sGPVIの測定方法、
(l-6d) サンドイッチ免疫測定法である、 上記何れかの測定方法、
( 1 - 6e) 非固相化抗体が F (ab' ) 2である、 上記何れかの測定方法、
( l-6f) ピオチン化非固相化抗体及び poly- HRP標識ストレプトアビジンで検出 する'系を用いる、 上記何れかの測定方法、
( l-6g) 前記 GPVIのループ 2に特異的に結合する抗体が F1232- 10- 2抗体であ る、 または、 前記 GPVIのループ 9に特異的に結合する抗体が F1232- 7- 1抗体で ある、 上記何れかの測定方法、 である。 本発明の第 2の態様は、
(2) 1以上の GPVI特異的結合物質を含有する、 試料中の GPVI、 特に生体試料 中の sGPVI又は mGPVIの測定試薬又はキット、 好ましくは、
(2a) 1以上の GPVI特異的結合物質を含有する、体液、特にヒト体液中の sGPVI の測定試薬又はキット、 (2b) 測定感度が lOOpg/ml以下、 好ましくは 30pg/ml以下、 より好ましくは lOpg/ml以下、 さらに好ましくは 3. Opg/ml以下、 特に好ましくは 1. Opg/ml以 下である、 上記何れかの測定試薬又はキット、
(2-1) GPVI特異的結合物質が抗 GPVI抗体である、 上記何れかの測定試薬又は キット、
(2 - la) GPVI特異的結合物質が GPVIのドメイン 1、 好ましくは、 ループ 2又 はループ 5、 より好ましくはループ 2に特異的に結合する抗体である、 上記何 れかの測定試薬又はキット、
(2-lb) GPVI特異的結合物質が GPVIのドメイン 2、 好ましくは、 ループ 9又 はループ 1 1、 より好ましくはループ 9に特異的に結合する抗体である、 上記 何れかの測定試薬又はキット、
(2-lc) GPVI特異的結合物質が GPVIのループ 2またはループ 9に特異的に結 合する抗体である、 上記何れかの測定試薬又はキット、
(2-2) GPVI特異的結合物質として、 結合部位の異なる 2以上の抗 GPVI抗体を 含有する、 上記何れかの測定試薬又はキット、
(2-3) GPVI特異的結合物質として、 GPVIのドメイン 1に特異的に結合する抗 GPVI抗体及びドメイン 2に特異的に結合する抗 GPVI抗体を含有する、 上記何 れかの測定試薬又はキット、
(2- 3a)前記 GPVIのドメイン 1に特異的に結合する抗 GPVI抗体が GPVIのルー プ 2又はループ 5、 好ましくはループ 2に特異的に結合する抗体である、 上記 何れかの測定試薬又はキット、
(2- 3b)前記 GPVIのドメイン 2に特異的に結合する抗 GPVI抗体が GPVIのルー プ 9又はループ 1 1、 好ましくはループ 9に特異的に結合する抗体である、 上 記何れかの測定試薬又はキット、
(2- 3c)前記 GPVIのドメイン 1に特異的に結合する抗 GPVI抗体が GPVIのルー プ 2又はループ 5、好ましくはループ 2に特異的に結合する抗体であり、かつ、 前記 GPVIのドメイン 2に特異的に結合する抗 GPVI抗体が GPVIのループ 9又は ループ 1 1、 好ましくはループ 9に特異的に結合する抗体である、 上記何れか の測定試薬又はキット、 (2-4) GPVI特異的結合物質として、 GPVIのループ 2に特異的に結合する抗体 及びループ 9に特異的に結合する抗 GPVI抗体を含有する、上記何れかの測定試 薬又はキット、
(2 - 4a)少なくとも GPVIのループ 2に特異的に結合する抗体を非固相化抗体と して含有する、 上記何れかの測定試薬又はキット、
(2-4b) 少なくとも GPVIのループ 9に特異的に結合する抗 GPVI抗体を固相化 抗体として含有する、 上記何れかの測定試薬又はキット、
(2- 4c)少なくとも GPVIのループ 2に特異的に結合する抗体を非固相化抗体と して、及ぴ、ループ 9に特異的に結合する抗 GPVI抗体を固相化抗体として含有 する、 上記何れかの測定試薬又はキット、
(2-4d)サンドィツチ免疫測定法に用いる、上記何れかの測定試薬又はキット、
(2-4e) 非固相化抗体が F (ab' ) 2である、 上記何れかの測定試薬又はキット、
(2- 4f) ピオチン化非固相化抗体及び poly- HRP標識ス トレプトァビジンを含有 する、 上記何れかの測定試薬又はキット、
(2-4g) 前記 GPVIのループ 2に特異的に結合する抗体が F1232- 10- 2抗体であ る、 または、前記 GPVIのループ 9に特異的に結合する抗体が F1232-7- 1抗体で ある、 上記何れかの測定試薬又はキット、
(2-5) 少なくとも GPVIのドメイン 1に特異的に結合する抗体及び/又はドメ イン 2に特異的に結合する抗 GPVI抗体を含有する、体液中、特にヒ ト体液中の sGPVIの測定試薬又はキット、
(2 - 5a)前記 GPVIのドメイン 1に特異的に結合する抗 GPVI抗体が GPVIのルー プ 2又はループ 5に特異的に結合する抗体である、 上記何れかの sGPVIの測定 試薬又はキット、
(2- 5b)前記 GPVIの ドメイン 2に特異的に結合する抗 GPVI抗体が GPVIのルー プ 9又はループ 1 1に特異的に結合する抗体である、 上記何れかの sGPVIの測 定試薬又はキット、
(2- 5c)前記 GPVIのドメイン 1に特異的に結合する抗 GPVI抗体が GPVIのルー プ 2又はループ 5に特異的に結合する抗体であり、 かつ、前記 GPVIのドメイン 2に特異的に結合する抗 GPVI抗体が GPVIのループ 9又はループ 1 1に特異的 に結合する抗体である、 上記何れかの sGPVIの測定試薬又はキット、
(2-6) 少なくとも GPVIのループ 2に特異的に結合する抗体及び/又はループ 9に特異的に結合する抗 GPVI抗体を含有する、 上記何れかの sGPVIの測定試薬 又はキット、
(2-6a)少なくとも GPVIのループ 2に特異的に結合する抗体を非固相化抗体と してを含有する、 上記何れかの' sGPVIの測定試薬又はキット、
(2 - 6b) 少なくとも GPVIのループ 9に特異的に結合する抗 GPVI抗体を固相化 抗体として含有する、 上記何れかの sGPVIの測定試薬又はキット、
(2 - 6c)少なくとも GPVIのループ 2に特異的に結合する抗体を非固相化抗体と して、及び、ループ 9に特異的に結合する抗 GPVI抗体を固相化抗体として含有 する、 上記何れかの sGPVIの測定試薬又はキット、
(2- 6d)サンドィツチ免疫測定法に用いる、上記何れかの測定試薬又はキット、
(2-6e) 非固相化抗体が F (ab' ) 2である、 上記何れかの測定試薬又はキット、 (2-6f) ビォチン化非固相化抗体及び poly- HRP標識ストレプトアビジンを含有 する、 上記何れかの測定試薬又はキット、
(2-6g) 前記 GPVIのループ 2に特異的に結合する抗体が F1232-10- 2抗体であ る、 または、前記 GPVIのループ 9に特異的に結合する抗体が F1232- 7- 1抗体で ある、 上記何れかの測定試薬又はキット、 である。 本発明の第 3の態様は、
(3) sGPVI又は mGPVIからなる血小板活性化マーカー、 である。 本発明の第 4の態様は、
(4) 血小板活性化マーカーとしての sGPVI又は mGPVIの使用、 である。 本発明の第 5の態様は、 (5) 試料中の sGPVI又は mGPVIを検出、 測定又は定量する工程を含む、 血小板 活性化もしくは血管内皮傷害の検出、 測定又は定量するための方法、 又はそれ らの判定方法もしくは評価方法、
(5-1) 上記何れかの GPVI、 特に sGPVIの測定方法、 測定試薬又は測定キット を用いて、 GPVI、 特に sGPVI、 より好ましくはヒ ト体液中の sGPVIを検出、 測 定又は定量する工程を含む、 血小板活性化もしくは血管内皮傷害の検出、 測定 又は定量するための方法、 又はそれらの判定方法もしくは評価方法、 である。 本発明の第 6の態様は、
(6) 試料中の sGPVI又は mGPVIを検出、 測定又は定量する工程を含む、 血小板 活性化もしくは血管内皮傷害関連疾患の診断方法、 罹病性の判定方法又は発症 リスクの評価方法、
(6-1) 上記何れかの GPVI、 特に sGPVIの測定方法、 測定試薬又は測定キット を用いて、 GPVI、 特に sGPVI、 より好ましくはヒ ト体液中の sGPVIを検出、 測 定又は定量する工程を含む、 上記血小板活性化もしくは血管内皮傷害関連疾患 の診断方法、 罹病性の判定方法又は発症リスクの評価方法、
(6-2)前記疾患が、好ましくは血栓性疾患もしくは塞栓性疾患又は動脈硬化性 疾患、 より好ましくは狭心症、 心筋梗塞、 心臓病、 脳梗塞及び痴呆からなる群 から選ばれるいずれかである、 上記何れかの診断方法、 罹病性の判定方法又は 発症リスクの評価方法、 である。 本発明の第 7の態様は、
(7) 試料中の sGPVI又は mGPVIを検出、 測定又は定量する工程を含む、 抗血小 板薬、好ましくはコラーゲン惹起血小板活性化又は凝集を抑制する抗血小板薬、 より好ましくは抗 GPVI抗体が奏効 （著効） する患者の選別方法、
(7-1) 上記何れかの GPVI、 特に sGPVIの測定方法、 測定試薬又は測定キット を用いて、 試料中の GPVI、 特に sGPVI、 より好ましくはヒ ト体液中の sGPVIを 検出、 測定又は定量する工程を含む、 上記抗血小板薬、 好ましくはコラーゲン 惹起血小板活性化又は凝集を抑制する抗血小板薬、より好ましくは抗 GPVI抗体 又は GPVI- Fcが奏効する患者の選別方法、
(7-2) 前記患者の疑われる疾患が、血小板活性化もしくは血管内皮傷害関連疾 患、 好ましくは血栓性疾患もしくは塞栓性疾患又は動脈硬化性疾患、 より好ま しくは狭心症、 心筋梗塞、 心臓病、 脳梗塞及び痴呆からなる群から選ばれるい ずれかである、 上記何れかの選別方法、 である。 本発明の第 8の態様は、
(8) 試料中の sGPVI又は mGPVIを検出、 測定又は定量する工程を含む、 抗血小 板薬、 好ましくはコラーゲン惹起血小板活性化又は凝集を抑制する抗血小板薬 の投与 （開始） 時期を決定する方法、
(8-1) 上記何れかの GPVI、 特に sGPVI、 より好ましくはヒ ト体液中の sGPVIの 測定方法、 測定試薬又は測定キットを用いて、 GPVI、 特に sGPVI、 より好まし くはヒ ト体液中の sGPVIを検出、測定又は定量する工程を含む、上記決定方法、 (8-2) 前記薬剤を投与する患者の疑われる疾患が、血小板活性化もしくは血管 内皮傷害関連疾患、 好ましくは血栓性疾患もしくは塞栓性疾患又は動脈硬化性 疾患、 より好ましくは狭心症、 心筋梗塞、 心臓病、 脳梗塞及び痴呆からなる群 から選ばれるいずれかである、 上記何れかの決定方法、 である。 本発明の第 9の態様は、
(9) 試料中の sGPVI又は mGPVIを検出、 測定又は定量する工程を含む、 抗血小 板薬、 好ましくはコラーゲン惹起血小板活性化又は凝集を抑制する抗血小板薬 の治療効果もしくは副作用発現の予測方法、 モニタリング方法又は予後の判定 方法、
(9-1)上記ヒト体液中の sGPVIの測定方法、測定試薬又は測定キットを用いて、 ヒ ト体液中の sGPVIを検出、 測定又は定量する工程を含む、 上記予測方法、 モ ユタリング方法又は予後の判定方法、
(9-2) 前記患者の疑われる疾患が、血小板活性化もしくは血管内皮傷害関連疾 患、 好ましくは血栓性疾患もしくは塞栓性疾患又は動脈硬化性疾患、 より好ま しくは狭心症、 心筋梗塞、 心臓病、 脳梗塞及び痴呆からなる群から選ばれるい ずれかである、上記何れかの予測方法、モニタリング方法又は予後の判定方法、 である。 本発明の第 1 0の態様は、
(10) 1以上の GPVI特異的結合物質を含有する、 前記本発明第 5ないし 9の態 様の何れかの方法のための試薬又はキット、 である。 本発明の第 1 1の態様は、
(11) 上記診断方法又は選別方法によって、 診断又は選別された患者に抗血小 板薬、 好ましくはコラーゲン惹起血小板活性化又は凝集を抑制する抗血小板薬 を投与することを特徴とする疾患の予防又は治療方法、
(11-1)上記診断方法又は選別方法によつて、診断又は選別された患者に抗 GPVI 抗体又は GPVI - Fc、 好ましくは抗 GPVI抗体を投与することを特徴とする疾患の 予防又は治療方法、
(11 - 2) 前記疾患が血小板活性化もしくは血管内皮傷害関連疾患、 好ましくは 血栓性疾患もしくは塞栓性疾患又は動脈硬化性疾患、 より好ましくは狭心症、 心筋梗塞、 心臓病、 脳梗塞及び痴呆から選ばれるいずれかである、 上記何れか の予防又は治療方法、 である。 本発明の第 1 2の態様は、
(12) 上記診断方法又は選別方法によって、 診断又は選別された患者の疾患を 予防又は治療するための、 抗血小板薬、 好ましくはコラーゲン惹起血小板活性 化又は凝集を抑制する抗血小板薬を含有することを特徴とする薬剤、
(12-1) 上記診断方法又は選別方法によって、 診断又は選別された患者の疾患 を予防又は治療するための、 抗 GPVI抗体又は GPVI- Fc、 好ましくは抗 GPVI抗 体を含有することを特徴とする薬剤、
(12-2) 前記疾患が血小板活性化もしくは血管内皮傷害関連疾患、 好ましくは 血栓性疾患もしくは塞栓性疾患又は動脈硬化性疾患、 より好ましくは狭心症、 心筋梗塞、 心臓病、 脳梗塞及び痴呆からなる群から選ばれるいずれかである、 上記何れかの薬剤、
ό、ある。 [ 0 0 1 3 ]
本発明の測定方法、 測定試薬またはキットにより、 試料中の GPVI、 特に生体 試料中の sGPVI又は mGPVIが高感度に測定しうる。
また、 本発明の測定方法、 測定試薬またはキットを用いて、 sGPVI又は mGPVI を検出、 測定又は定量することにより、 血小板活性化もしくは血管内皮傷害の 検出、 測定、 定量、 判定もしくは評価、 血小板活性化もしくは血管内皮傷害関 連疾患の診断、 罹病性の判定もしくは発症リスクの評価、 抗血小板薬、 特に抗
GPVI抗体の奏効する患者の選別、 それらの投与 （開始） 時期の決定、 及ぴ、 そ れらの治療効果もしくは副作用発現の予測、 モニタリングもしくは予後の判定 等が可能となる。 図面の簡単な説明
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図' 1は、 ラット GPVI遺伝子の塩基配列を示す。
図 2は、ヒ ト及ぴラット GPVIのアミノ酸配列のァラインメントならびに各ド メイン及び各ループ （L1〜L14) の位置を示す。
図 3は、ヒ ト及びマウス GPVIのアミノ酸配列のァラインメントならびに各ド メイン及び各ループ （L1〜L14) の位置を示す。
図 4は、 リコンビナント rGPVI- Fcの SDS- PAGEの結果を示す。
図 5は、 F12I39- 6- 1の SDS- PAGEの結果を示す。
図 6は、 抗ラット GPVI抗体の認識領域の解析の結果を示す。
図 7は、 ラット可溶型 GPVI ELISA標準曲線を示す。
図 8は、 ヒ ト可溶型 GPVI ELISA標準曲線を示す。
図 9は、 ラット血小板膜上の GPVIフローサイトメ トリ一解析の結果を示す。 図 1 0は、ラット血小板インビト口 sheddingサンプルにおける上清中の可溶 型 GPVI濃度を示す。
図 1 1は、 サル血小板膜上の GPVIフローサイ トメ トリー解析の結果を示す。 図 1 2は、 サル血小板の GPVI ウェスタン解析の結果を示す。
図 1 3は、サル血小板インビト口 sheddingサンプルにおける上清中の可溶型
GPVI濃度を示す。
図 1 4は、 ヒ ト血小板の GPVI フローサイ トメ トリ一解析の結果を示す。 図 1 5は、 ヒ ト血小板の GPVI ウェスタン解析の結果を示す。
図 1 6は、 ヒ ト血小板インビト口 sheddingサンプルにおける上清中の可溶型 GPVI濃度を示す。
図 1 7は、 ラットェンドトキシン惹起血栓モデル動物を用いた実験結果を示 す。
図 1 8 (A) は、 コラーゲン惹起血栓モデル動物を用いた 30分後の実験結果 を示す。
図 1 8 (B) は、 コラーゲン惹起血栓モデル動物を用いた 15分後の実験結果 を示す。
図 1 9 (A) は、 バルーンカテーテル血管内膜傷害モデルを用いた、 血漿中可 溶型' GPVI量等の測定の実験結果を示す。
図 1 9 (B) は、 バルーンカテーテル血管内膜傷害モデルを用いた、 抗 GPVI 抗体の効果を示す。
図 2 0は、 ラットエンドトキシン惹起血栓モデル動物における尿中の可溶型 GPVIの変化を示す。
図 2 1は、 各種ヒ ト病態血漿の可溶型 GPVIの量を示す。
図 2 2は、 ヒ ト血小板の GPVI ウェスタン解析の結果を示す。 発明を実施するための最良の形態
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以下に本発明を詳細に説明する。 本発明において、測定対象である GPVIの由来動物種は特に限定されず、哺乳 類、 例えば、 マウス、 ラット及びサルであるが、 好ましくはヒト GPVIである。 これらの GPVIのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は公知であり、 マウス、 ラ ット及びヒ ト GPVIのアミノ酸配列は図 1〜3に示されている。 mGPVIは膜貫通 蛋白質として血小板表面に存在し、 通常、 全長の GPVI分子であり、 上述のアミ ノ酸配列からなる。 sGPVIは、 血小板から何らかの原因により遊離したもので あるが、 酵素、 特に血小板由来の酵素、 好ましくは、 プロテアーゼ、 より好ま しくはメタロプロテアーゼにより切断されて可溶型となったものと考えられる。 その分子量は、 例えば、 実施例で示されるように、 還元条件下で SDS- PAGE上約 55kdであり、 抗 GPVI抗体を用いてウェスタンブロッテイング等で検出可^で める。
本発明において試料（以下、検体と記載することがある） 、特に生体試料は、 必ずしも限定されず、 体液、 細胞又は組織が含まれ、 体液としては、 例えば、 血液、 血漿、 多血小板血漿 （PRP) 乏血小板血漿 （PPP) 、 及び尿等、 細胞とし ては例えば血小板である。 mGPVIの場合、 好ましくは血小板を含有する生体試 料であり、特に、血液、多血小板血漿（PRP) 又は血小板である。 sGPVIの場合、 好ましくは体液、 特に、 血液、 血漿、 乏血小板血漿 （PPP) 及び尿等である。 ま た、 '生体試料の由来動物種は、 必ずしも限定されず、 哺乳類、 例えば、 ヒト、 マウス、 ラット、 ゥサギ及びサル等が含まれ、 好ましくはヒトである。
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本発明の第 1の態様の試料中の GPVIの測定方法は、 1以上の GPVI特異的結 合物質を用いて、 試料中の GPVI、 特に生体試料中の sGPVI又は mGPVIを測定す ることを特徴とする。 また、本発明の第 2の態様の試料中の GPVIの測定試薬又 はキットは、少なくとも 1以上の GPVI特異的結合物質を含有することを特徴と する。本発明において、 GPVI特異的結合物質は、コラーゲン、 CRP及び convulxin 等を含むが、 好ましくは、 抗 GPVI抗体である。 以下、 代表例として抗体を記載 するが、 本発明においては、 適用可能な範囲で、 抗体以外の GPVI特異的結合物 質についても抗体の記載に準ずることができる。 抗 GPVI抗体は、 特異的に GPVI、 特に、 sGPVI又は mGPVIを認識又は結合する 抗体であれば、 必ずしも限定されない。 GPVIとの結合親和性 （Kd) ヽ 10一7 Μ 以下、 好ましくは 3X10— 8Μ以下、 より好ましくは 1Χ1(Γ8Μ以下、 さらに好ましく は 3Χ1(Γ9Μ以下、 特に好ましくは 1Χ10_9Μ以下である。
抗体の由来動物種は必ずしも限定されず、 例えば、 哺乳類、 特にマウス、 ラ ット、 ハムスターもしくはゥサギ等が挙げられ、 また、 遺伝子組換え技術によ り作製される抗体であってもよい。 モノクローナル抗体及ぴポリクローナル抗 体のいずれも適用可能であるが、 特異性等の性状及び物質的な均一性の点では モノクローナノレ抗体は好ましい。
本発明において抗体の形態は、 必ずしも限定されず、 種々のものが適用可能 である。 例えば、 本発明の抗体としては、 その活性、 例えば、 GPVIとの結合能 を有する限りにおいて、抗体の断片もしくは一部又は誘導体でもよレ、。例えば、 断片としては、 Fab (Fragment of antigen binding) 、 Fab' , (Fab，）2等、 誘導 体としては、一本鎖抗体 （scFv) 、 ジスルフィ ド安定化抗体（dsFv) 、 diabody, sc (Fv) 2 (例えば、 Orita T, Blood. 2005； 105： 562- 566参照) 、 nanobody (例 えば、 Cortez-Retamozo V. , Cancer Research 64， 2853-2857, 2004参照） 及 び CDRを含有するぺプチド等が挙げられる。これらは公知の方法で作製しうる。 公知の抗 GPVI抗体、例えば、マウス抗ヒ ト GPVIモノクローナル抗体（W001/810、 W002/80968、 W02005/111083等参照） 、 ラット抗マウス GPVIモノクローナル抗 体 （Nieswandt et al. ) 、 ラット抗ヒト GPVIモノクローナル抗体 hGP5C4
(W02005/54294等参照) 、 ヒトー本鎖抗体 (scFv) (W001/810, W003/54020等 参照）及ぴヒト抗ヒト GPVIモノクローナル抗体（W005/7800)であってもよい。
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結合領域、結合部位もしくはェピトープが同定されている抗体等が好ましく、 特定のドメイン、 例えば、 ドメイン 1もしくはドメイン 2と結合する抗体、 又 は、 特定のループ、 例えば、 ループ 2もしくはループ 9の少なくとも一部を認 識する抗体が挙げられる。 具体例としては、 実施例に示された抗体ならびに
W02006/117910及ぴ W02006/118350の実施例に記载された抗体等が挙げられる。 そのような抗体の製造方法及び同定方法は種々の方法が適用でき、 公知の方法 を応用することもできるが、 好ましくは、 GPVIの特定部位、 例えば特定のドメ イン、 好ましくは特定のループ領域を他のアミノ酸配列、 具体的には、 他の動 物種の GPVIの対応するアミノ酸配列で置換した変異体を免疫用抗原又は抗体 の同定用抗原として用いる方法が挙げられ、 具体的には本願または
W02006/117910もしくは TO2006/118350の実施例に記載された方法を適用する ことができる。 また、 それらの抗体の認識領域等は、 当該置換変異体と抗体と の結合性及び GPVIと抗体との結合性を公知の方法に準じて測定することによ り推定しうる。 具体的な方法は実施例に示されている。
これらの結合領域等の同定された抗体を 1又は 2以上、 好ましくは結合領域 等の異なる 2種類、好ましくは GPVIとの結合において互いに競合しない抗体の 組合せ、 例えば、 ドメイン 1と結合する抗体及びドメイン 2と結合する抗体、 又は、 ループ 2の少なくとも一部と結合する抗体及びループ 9の少なくとも一 部と結合する抗体の組合せを用いることにより、 特異性、 選択性及ぴ Z又は感 度の高い GPVIの検出又は測定が可能であり、 特に、 複数の GPVI分子種が混在 する場合において、 その内の特定の GPVI分子種、 例えば、 sGPVIを特異的、 選 択的及び/又は高感度に測定することが可能となる。 好適な例は実施例に示さ れている。
[ 0 0 1 8 ]
本発明において、 測定感度は必ずしも限定されないが、 試料中の濃度で示し た場合、 Ing/mL以下、 好ましくは 300pg/ml以下、 より好ましくは 100pg/ml以 下、 さらに好ましくは 30pg/ml以下、 特に好ましくは 10pg/ml以下、 極めて好 ましくは 3. Opg/ml以下、 最も好ましくは 1. 0pg/ml以下である。 また、 検出限 界濃度が、 Ing/mL以下、 好ましくは 300pg/ml以下、 より好ましくは 100pg/ml 以下、 さらに好ましくは 30pg/ml以下、 特に好ましくは 10pg/ml以下、 極めて 好ましくは 3. Opg/ml以下、 最も好ましくは 1. Opg/ml以下である。 すなわち、 検出限界濃度は、 Ing/mL以下、 好ましくは 300pg/ml以下、 より好ましくは
100pg/ml以下、さらに好ましくは 30pg/ml以下、特に好ましくは 10pg/ml以下、 極めて好ましくは 3. Opg/ml以下、 最も好ましくは 1. Opg/ml以下である。 試料 中の濃度は、 標準曲線を作成する標準物質、 例えば、 GPVI- Fcの量として換算 しても良い。 また、 測定前に試料の希釈操作を要する場合は、 希釈後の値であ る。
試料、 特に血漿中の可溶型 GPVIを測定する場合は、 血漿成分の影響を受けず に特異的に血小板より遊離した GPVIを測定することが必要とされる。 したがつ て、 一般的には特異性の高い抗体を用いたサンドイッチ免疫測定法が使用され る。 そこで本発明の測定法において重要となるのは精度よく GPVIを測定するた めに、 できるだけ血漿成分の影響を減らすことであり、 その手段としては第一 に検体の希釈が選択される。 また、 影響を減らす目的で反応液中に界面活性剤 等の成分を添加することも可能であるが、 それらが測定系に影響を及ぼす可能 性がある。 従って、 精度よく GPVIを測定するためには、 検体を希釈して測定す ることが好ましく、 必然的に高感度が要求される。 実施例 8に示した方法を用 いた場合、 正常ヒ ト血漿中の sGPVI濃度は、 hGPVI- hFc量に換算して約 0. 1〜 lOng/mL (中央値 0. 4ng/mL) の範囲である。 検体を精度よく測定するには、 通 常検体を 5倍以上、 好ましくは 10倍以上、 より好ましくは 50倍以上、 さらに 好ましくは 100倍以上希釈して測定することが必要であり、 そのためには測定 系の感度は 30pg/ml以下、 好ましくは 10Pg/ml以下、 より好ましくは数 pg/mL 以下であることが望ましい。 本発明の方法、 具体的には実施例、 特に、 実施例 8で示した方法を用いれば、' 3pg/mLの標準物質で約 40mAbsの吸光度差が得ら れ、 本発明により充分な感度を得ることが可能である。
本発明の測定方法、測定試薬又はキットにおいて、抗 GPVI抗体は標識抗体又 は非標識抗体のいずれでもよいが、 少なくとも 1つの標識抗体を用いることが 好ましい。 この標識において、 標識物質及び標識方法は公知の物質及び方法を 用いることができ、 放射性物質、 酵素、 蛍光物質及び化学発光物質等が用いら れ、 いずれも適用可能である。 これらの内、 酵素標識抗体を用いる方法が特殊 な設備や高価な検出装置を必要とせず取り扱いも簡便である等の点で好ましい。 また、 標識には、 直接法と間接法があり、 いずれも適用可能である。
本発明の測定方法において、 その測定原理等は必ずしも限定されず、 一般的 には免疫測定法であり、 公知の方法、 例えば、 酵素抗体法、 ELISA法、 サンド イッチ免疫測定法、 凝集法、 固相直接法、 固相結合法、 溶液反応法、 競合法、 非競合法、 ィムノクロマト法、 フロースルー法等が挙げられ、 これらを単独又 は組み合わせて、 適用しうる （例えば、 「超高感度酵素免疫測定法」 石川栄治 著、学会出版センター （1993年） 、 「免疫測定法の新しい活用事例と診断試薬 · 治療薬開発への応用」 免疫測定法開発研究会、 経営教育出版、 酵素免疫測定法 (第 3版） 石川栄治等編、 医学書院 （1987年） 等参照） 。 また、 標識の信号を 電気化学的に測定する M E D I A法 （特開平 5 _ 2 6 4 5 5 2 ) による測定、 マイクロチップを使用したィムノアツセィ法 ( 「バイオサイエンスとインダス トリー」 第 61卷 449一 454頁 2003年） 、 時間分解蛍光免疫測定法 「アナリテ イカノレ ノ ィ才ケミス トリー (Analytical biochemistry) 」 （米国） 、 1984 年、 第 137卷、 p. 335- 343) 及びホモジーニアス免疫測定法も適用できる。 これ らの内、 サンドイッチ免疫測定法、 特に、 マイクロウェルプレート等の不溶性 担体を用いたサンドィツチ ELISA法が簡便であり、 感度の面でも好ましい。
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サンドィツチ免疫測定法は公知の技術を利用することができる。 測定法の原 理、 応用及ぴ改良法については、 例えば、 「超高感度酵素免疫測定法」 石川栄 治著、 学会出版センター （1993年） 、 「免疫測定法の新しい活用事例と診断試 薬 ·治療薬開発への応用」 免疫測定法開発研究会、 経営教育出版、 酵素免疫測 定法 （第 3版） 石川栄治等編、 医学書院 （1987年） に記載されている。
サンドィツチ免疫測定法は、 通常測定する蛋白質を認識する部位の異なる 2 種類以上の抗体を用いて抗体—抗原一抗体複合体を形成させることにより測定 する方法である。 サンドイッチ免疫測定法においては、 通常、 不溶性担体を用 いるが、 その場合、 不溶性担体に結合させる第一の抗体を固相化 （用） 抗体又 はキヤプチヤー抗体と、 第二の抗体を非固相化抗体、 液相抗体もしくは検出用 抗体又は直接的若しくは間接的に標識される場合標識抗体と呼ぶことがある。 まず、 第一の抗体が結合した不溶性担体を用意し、 固相若しくは反応場所とす る。検体を固相の該不溶性担体に添加し、反応させる。一定時間反応させた後、 洗浄して固相に特異的に結合しなかった物質を除去する。 続いて標識した第二 の抗体を添加する。 一定時間反応させた後、 洗浄して複合体を形成しなかった 標識抗体を除去し、 標識物に基づいて固相に特異的に結合した複合体の量を特 異的に定性または定量する。 サンドィツチ法は上記のように 2段階で行う方法 ( 2ステップ法） と抗原及び標識^:体を同時に加える 1段階法（1ステップ法) のいずれを使用することもできる。
本発明において、固相化抗体としては、種々の抗体を用いることができるが、 好ましくはドメイン 2、 より好ましくはループ 9又はループ 1 1、 特にループ 9に特異的に結合する抗体が挙げられる。 また、 非固相化抗体としては、 種々 の抗体を用いることができるが、 好ましくはドメイン 1、 より好ましくはルー プ 2又はループ 5、特にループ 2に特異的に結合する抗体が挙げられる。また、 これらの内、 固相化抗体としてループ 9に特異的に結合する抗体及び非固相化 抗体としてループ 2に特異的に結合する抗体の組合せが好ましい。
サンドイツチ免疫測定法において、 不溶生担体を用いずに、 溶液中で行うこ ともできる。 例えば、 抗原と標識抗体及び第二の標識した第二の結合物質を液 相中で反応させ、 該標識と該第二の標識との相互作用を測定する方法である。 また、 サンドイッチ免疫測定法等において、 別法として競合法により測定する こともできる。 抗原一抗体複合体を形成させる中で、 検体中の抗原と標識した 抗原若しくは標識した抗原類似物質を競合させることにより測定する方法であ る。
また、 サンドイッチ免疫測定法において、 さらに別法として第二の特異結合 を利用して測定することもできる。 抗体一抗原一抗体一第二の特異結合物質の 複合体若しくは抗体一抗原一抗体一第二の特異結合物質一第二の特異結合物質 の特異結合パートナー （以下、 第二の特異結合パートナーと記載することがあ る） の複合体を形成させて測定する方法である。 第二の特異結合物質一第二の 特異結合パートナーの組み合わせとしては、 抗原とその抗体、 リガンドとその レセプター、 糖鎖含有物質とレクチン、 ビォチンとアビジン若しくはストレプ トァビジン等が挙げられる。 さらに、 抗体に対する抗体、 すなわち、 抗ィムノ グロブリン抗体を利用して、 抗体一抗原一抗体—抗ィムノグロプリン抗体の複 合体を形成させて測定する方法、 また、 抗ィムノグロブリン抗体及び第二の特 異結合を利用して、 抗ィムノグロプリン抗体—抗体一抗原一抗体一第二の特異 結合物質一第二の特異結合パートナー等を形成させて測定する方法が例示され る。
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2種類の結合部位の異なる抗体を用いる本発明の好適な例としては、 第二の 特異結合物質一第二の特異結合パートナーとしてピオチンとアビジン若しくは ストレプトアビジンを用いて、 一方、 特に、 非固相化抗体をピオチン化し、 こ れを標識、特に poly - HRP標識したストレプトアビジンで検出する系が挙げられ る。 具体的な方法は実施例に示されている。
本発明のサンドイッチ免疫測定系で用いる不溶性担体は、 ビーズ、 ラテック ス粒子、 磁性粒子、 プレート、 チューブまたはメンプレン等を用いればよい。 ビーズ、プレートまたはチューブは、その材料としてポリスチレン、ナイ口ン、 ガラス、 シリコンラバー、 ステンレス、 プラスチック等が挙げられる。 メンブ レンは、 セルロース、 セルロース誘導体、 ニトロセルロース、 多孔性合成ポリ マー、 グラスファイバー、 布、 不織布、 濾紙等が挙げられる。 形状としては、 ビーズ、 ラテックス粒子または磁性粒子等は球形として用いることができる。 保存時のスペースの確保の点で有利である。 プレートまたはチューブはゥエル 形として用いることができる。 市販の自動化測定器、 プレートリーダー等に対 応可能な点で有利である。 また、 メンプレンはィムノクロマト法、 フロースル 一法に用いることができる。 抗体、 第二の結合物質、 第二の特異結合物質若し くはそのパートナー、 または抗ィムノグロブリン抗体の不溶性担体への結合は 熱吸着法、 化学結合法等により行うことができる。
また、 非特異的吸着等の反応を低減し、 測定系の特異性もしくは感度を高め る目的で、 不溶性担体に上記物質が結合していない非吸着面に対して、 測定系 に影響しない物質でプロッキング処理することが好ましい。 測定系に影響しな い物質としては、ゥシ血清アルブミン（BSA)、カゼィン等の蛋白質及び Tween20、
NP-40等の界面活性剤等が例示される。
本発明のサンドイッチ免疫測定系キットに用いる標識としては、 ペルォキシ ダーゼ、 特に、 西洋ヮサビペルォキシダーゼ (HRP) 、 アル力リフォスファタ一 ゼ、 β -Ό-ガラク トシダ一ゼ、 ォキシダーゼ及びゥリカーゼ等の酵素、 アタリジ -ゥム若しくはその誘導体、 またはェクオリン若しくはその改変体等の化学発 光物質、 F I T Cまたはユウ口ピウム （E u ) 若しくはサマリウム （S m) 等 のランタノィ ド等の蛍光物質、 色素、 金コロイ ド、 着色ラテックス、 あるいは アイソトープが挙げられる。
例えば酵素としてペルォキシダーゼを用いる場合は、発色基質として 3， 3 ' ， 5， 5 ' —テトラべンジジンまたは 1 , 2—フエ二レンジァミン等が、 アル力 リフォスファターゼを用いる場合は、 発色基質として 4一二トロフエ-ルフォ スフェート等が、 - D-ガラク トシダーゼを用いる場合は、 発色基質として 2— ニトロフエニル . β - D-ガラク トシド等が例示される。
抗体、 第二の結合物質、 第二の特異結合物質若しくはそのパートナー、 また は抗ィムノグロプリン抗体への酵素標識は、 二段階ダルタルアルデヒ ド法、 過 ョ一ソ酸法、 マレイミ ド法、 ピリジル ·ジスルフィ ド法等により行うことがで きる。 酵素以外の標識についても熱吸着法、 化学結合法等の公知の技術を利用 して行うことができる。 ·
酵素標識は、 上記に例示される様な発色基質を用いれば、 通常の吸光度測定 系を用いて測定でき、 また感度も比較的高く好ましい。 化学発光物質、 蛍光物 質、 着色標識若しくはアイソトープを標識として用いる場合は、 その標識に応 じた'測定機器により測定できる。 また、 E u、 例えばクリプテート （E u 3+ ク リブテート） 等の蛍光物質を用いる場合は、 第二の標識として X L 6 6 5等の ァロフィコシァニン誘導体を用いて、 蛍光共鳴エネルギー転移を測定すること もできる。 また、 簡易な測定キット、 例えィムノクロマト法、 フロースルー法 を利用したキットに用いる標識は、 色素、 金コロイ ド若しくは着色ラテックス が視覚的にも観察可能であるので好ましい。 凝集法で不溶性担体として用いら れる粒子としては、 ラテックス、 赤血球 (例えば羊赤血球) 、 ゼラチン、 マイ クロビーズまたはカーボン粒子等、 一般に用いられている粒子を使用すること ができる。
[ 0 0 2 1 ]
本発明の測定試薬又はキットは、 1以上の GPVI特異的結合物質以外に任意の 構成成分又は構成要素を含有してもよい。 例えば、 測定試薬又はキッ トの任意 の構成成分として、 安定化剤、 賦形剤又は保存剤等の添加剤、 また、 キットの 任意の構成要素として、 標準物質、 検体若しくは標識抗体等の緩衝液若しくは 希釈剤、 標識抗体に酵素が使われる場合の酵素に適した発色基質、 ブロッキン グ剤、反応停止剤または洗浄剤等が例示される。希釈剤は、特に限定はないが、 検体に含まれる物質を含む希釈剤が好ましい。 検体が血清であり、 その血清を 入手するための採血を E D T Aやクェン酸存在下で行われた場合、 希釈剤とし ても同量の E D T Aやクェン酸が存在することが好ましい。 例えば、 希釈剤中 に E D T Aを 0 . 2〜 l m g /m 1含むことが好ましい。 標準物質としては、 生体試料から調製した GPVI、 特に、 sGPVIもしくは mGPVI、 又は、 遺伝子工学 的に調製した組換 GPVI、 特に、 sGPVI、 mGPVI、 GPVI細胞外ドメインもしくは GPVI細胞外ドメインとィムノグロブリンの Fc断片との融合蛋白質 （GPVI - Fc) 等である。 これらは公知の方法で調整しうる。
本発明の測定試薬又はキットは、以下の診断方法等において特に有用である。
[ 0 0 2 2 ]
後述の実施例で示されるように、 sGPVI又は mGPVIは生体内及び生体外にお ける種々の血小板刺激による影響、 特に血小板の活性化に伴って変動、 特に量 的な変動を示すことから、 生体内における血小板の活性化、 特に GPVIを介した 活性化の状態を推定するバイオマーカー、 すなわち、 血小板活性化マーカーと して利用しうる。
具体的には、 例えば、 生体試料中の sGPVIが高値である場合、 生体内で何ら かの原因、 特に、 GPVIを介した機序により血小板の活性化が惹起されているこ とが推定される。 また、 例えば、 血小板の mGPVIが高値である場合、 生体内に おける血小板刺激、 特に、 GPVIを介した刺激に対して血小板が活性化されやす い状態にあることが推定される。 これらの原因、 機序又は刺激としては、 血管 内皮傷害による血管内皮下のコラーゲンの露出等が挙げられる。
すなわち、 本発明は、 可溶型 GPVI (sGPVI) 又は血小板膜上に存在する GPVI (mGPVI)からなる血小板活性化マーカー、血小板活性化マーカーとしての sGPVI 又は mGPVIの使用を提供する。 .
[ 0 0 2 3 ] また、 sGPVI又は mGPVIを検出、 測定又は定量することにより、 血小板活性 化もしくは血管内皮傷害関連疾患の診断等を行なうことができる。 すなわち、 本発明は、
試料中の sGPVI又は mGPVIを検出、 測定又は定量する工程を含む、 血小板活 性化もしくは血管内皮傷害の検出、 測定又は定量するための方法、 又はそれら の判定方法もしくは評価方法 （本発明の第 5の態様） 、
試料中の sGPVI又は mGPVIを検出、 測定又は定量する工程を含む、 血小板活 性化もしくは血管内皮傷害関連疾患の診断方法、 罹病性の判定方法又は発症リ スクの評価方法 （本発明の第 6の態様） 、
試料.中の sGPVI又は mGPVIを検出、 測定又は定量する工程を含む、 抗血小板 薬、 好ましくはコラーゲン惹起血小板活性化又は凝集を抑制する抗血小板薬、 より好ましくは抗 GPVI抗体が奏効する患者の選別方法（本発明の第 7の態様）、 試料中の sGPVI又は mGPVIを検出、 測定又は定量する工程を含む、 上記の薬 剤の投与 （開始） 時期を決定する方法 （本発明の第 8の態様） 、
試料中の sGPVI又は mGPVIを検出、 測定又は定量する工程を含む、 上記の薬 剤の治療効果もしくは副作用発現の予測方法、 モニタリング方法又は予後の判 定方法 （本発明の第 9の態様） 、
1·以上の GPVI特異的結合物質を含有する、前記本発明の第 5ないし 9の態様 の方法のいずれかのための試薬又はキット （本発明の第 1 0の態様） 、 を提供する。
[ 0 0 2 4 ]
上記本発明の第 5〜 9の態様の方法は、 少なくとも試料、 特に生体試料中の sGPVI又は mGPVIを検出、 測定又は定量する工程を含むが、 これは、 少なくと も、 試料と 1以上の GPVI特異的結合物質を接触させる工程を含む。 試料中の sGPVI又は mGPVIの検出、 測定又は定量は、 本発明の測定方法、 測定試薬又は キットを用いて、 上記本発明の第 1及び 2の態様の記载に準じて行なうことが できる。
[ 0 0 2 5 ] 試料が任意の疾患の患者又は疾患の恐れのある個体由来である場合、 健常人 の測定値との比較、 発症前後の測定値との比較、 もしくは、 治療、 特に抗血小 板薬等の薬剤による治療の前後の測定値の比較を行なう工程を伴うことができ る。 例えば、 予め複数の正常人の測定結果を求めておき、 その測定結果の平均 値若しくは範囲をとる等により標準化した正常人の値または正常人の値の範囲 を、 正常人の標準値として、 測定した値と比較する工程である。 例えば、 正常 人の平均値 + 2 S Dまたは 3 S Dをカツトオフ値として正常人の標準値を求め ればよい。 また、 予め疾患、 例えば、 血栓症患者の基準値を求めておいて、 測 定した値と比較する工程を行ってもよい。 この工程を正常人の標準値と比較す る工程の代わりに行ってもよい。 これらの測定及び又は測定値の比較を行なう ことで、 上記した本発明第 5〜 9の態様の方法を効率的に実施することができ る。
[ 0 0 2 6 ]
本発明において、 前記血小板の活性化は、 必ずしも限定されないが、 好まし くは血小板ァゴニス ト、 より好ましくは、 GPVI特異的ァゴニス トによるもので ある。 当該血小板ァゴニス トとしては、 コラーゲン、 特に、 血管内皮障害に伴 う血管内皮下に存在するコラーゲンが挙げられ、 その他に、 血小板活性化作用 を有する抗 GPVI抗体、 CRP及び convulxin等が挙げられる。
[ 0 0 2 7 ]
本発明において、 血小板活性化もしくは血管内皮傷害と関連する疾患は、 血 小板の活性化もしくは凝集、 特にコラーゲンによる血小板の活性化もしくは凝 集、 血管内皮傷害、 又は、 動脈硬化性の反応に起因する、 又はそれらを伴う疾 病及び血液凝固系の異常、 例えば、 血液凝固系の宂進に起因するもしくはそれ を伴う疾患を含む。 特に、 血栓もしくは塞栓又は動脈硬化に起因する又はそれ らを伴う疾患、 すなわち、 血栓性もしくは塞栓性疾患又は動脈硬化性疾患、 例 えば、 血栓症及び塞栓症ならびに動脈硬化症等である。 これらの疾患には、 動 脈性血栓症のみならず、 静脈性血栓症も含まれ、 また、 心房細動に起因する脳 梗塞も含まれる。 具体的には、 狭心症、 心筋梗塞、 血栓溶解療法時、 経皮的冠動脈内腔拡張術 施行時、 ステント施行時、 バイパス手術施行時もしくは人工血管施行時の、 ま たはこれらの後の血管内皮肥厚、 血管再狭窄、 狭心症もしくは心筋梗塞、 等が 挙げられる。さらに、心房細動もしくは心房粗動及ぴこれらに起因する血栓症、 塞栓症、 特に脳梗塞、 等が挙げられる。 その他、 閉塞性血栓性血管炎、 急性動 脈閉塞症、 閉塞性動脈硬化症または深部静脈 栓症等があり、 脳梗塞 （ァテロ ーム性血栓性梗塞、 ラクナ梗塞、 心原性梗塞） 、 一過性脳虚血発作、 くも膜下 出血後の脳血管攣縮、 肺血栓、 肺塞栓症、 血管性紫斑病、 特発性血小板減少性 紫斑病、 血栓性血小板減少性紫斑病、 播種性血管内凝固症候群、 血液体外循環 時 （血液透析） の血液凝固防止、 全身性エリテマトーデス、 多発性動脈炎、 抗 リン脂質抗体症候群、 紫斑病性腎炎、 糖尿病に伴う内皮細胞傷害、 糖尿病性腎 炎、 糖尿病性網膜症、 腎塞栓、 移植治療に伴う合併症 （肝静脈閉塞症、 移植片 対宿主病） 等が挙げられる。 好ましくは、 血栓性もしくは塞栓性疾患又は動脈 硬化性疾患、例えば、血栓症もしくは塞栓症又は動脈硬化症、より好ましくは、 狭心症、 心筋梗塞、 心臓病、 脳梗塞又は痴呆である。
本発明の測定方法、 測定試薬又はキットを用いて、 試料中の GPVI、 特に生体 試料中の sGPVI又は mGPVIを測定することにより、 血小板活性化もしくは血管 内皮傷害の検出、 測定又は定量、 判定もしくは評価、 又は、 血小板活性化もし くは血管内皮傷害関連疾患の診断、 罹病性の判定もしくは発症リスクの評価が 可能である。 それらの実施においては、 健常人の測定値との比較、 発症前後の 測定値との比較、 又は、 治療、 特に抗血小板薬等の薬剤による治療の前後の測 定値の比較を行なう工程を伴うことが好ましい。
本発明において、抗血小板薬は必ずしも限定されず、公知の薬剤が挙げられ、 例えば、 ァスピリ ン、 チタ口ビジン、 G P I I b Z I I I aアンタゴニスト等 が挙げられる。 また、 コラーゲン惹起血小板活性化又は凝集を特異的に抑制す る抗血小板薬としては、 種々のものが適用可能である。 例えば、 コラーゲンに 対する抗体、 コラーゲンペプチド、 その断片及び誘導体 （例えば、 W099/50281 等参照） 、 GPVI、その断片もしくはそれらの誘導体、例えば、 GPVI- Fc (例えば、
W001/810、 W003/104282等参照） などが挙げられる。 好ましくは、 抗 GPVI抗体 または GPVI - Fc、 より好ましくは抗 G P VI抗体である。 抗 GPVI抗体としては、 公知の抗 GPVI抗体、例えば、マウス抗ヒ ト GPVIモノクローナル抗体（W001/810、 W002/80968, W02005/111083等参照） 、 ラット抗マウス GPVIモノクローナル抗 体 （Nieswandt et al. ) 、 ラット抗ヒト GPVIモノクローナル抗体 hGP5C4
(W02005/54294等参照） 、 ヒ トー本鎖抗体 （scFv) (W001/810、 W003/54020等 参照） 及ぴヒ ト抗ヒト GPVIモノクローナル抗体 （W005/7800) を使用しうる。 好ましくは、 コラーゲン惹起血小板凝集を抑制する抗体、 G P VI消失作用を有 する抗体、 GPVIのループ 9を認識する抗体が挙げられる。 具体例としては、 本 願実施例に示された抗体ならびに W02006/117910及ぴ W02006/118350の実施例 に記載された抗体等が挙げられる。
本発明の測定方法等により試料中の sGPVI又は mGPVIを検出、 測定又は定量 することで、 これらの薬剤の奏効する患者の選別、 それらの投与 （開始） 時期 の決定、 及び、 それらの治療効果もしくは副作用発現の予測、 モニタリングも しくは予後の判定等が可能となる。 それらの実施においては、 健常人の測定値 との比較、 または、 治療、 特に抗血小板薬等の薬剤による治療の前後の測定値 の比較を行なう工程を伴うことが好ましい。
[ 0 0 2 8 ]
心筋梗塞や脳梗塞の 2次予防や、 糖尿病に伴う末梢動脈閉塞症において血漿 中および/あるいは尿中の可溶型 GPVIを測定し、 高値を示した患者を選別し、 このような患者に抗 GPVI抗体あるいは可溶型 G P V I - F c を投与すると、 患 者を選別しなかった場合に比べ、 高い有効率を示すと予想される。 すなわち、 血中および Zあるいは尿中の可溶型 GPVI量を測定することにより、 心筋梗塞、 脳梗塞および末梢動脈閉塞症、 等の血栓症の高リスク患者を選別すること、 さ らには抗 GPVI抗体や可溶型 G P V I - F cが有効である患者を選別することが できる。
[ 0 0 2 9 ]
PCI施行後に血漿中および/あるいは尿中の可溶型 GPVI量を測定する。 可溶 型 GPVI量が高値を示している期間、抗血小板療法を継続した場合と継続しなか つた場合を比較すると、 継続した方がしなかった場合に比べ心血管イベントの 発症率は低いと予想される。 すなわち、 血漿中および/あるいは尿中の可溶型 GPVI量を測定することにより、 血栓症発症リスクを評価し、 抗血小板薬の投薬 期間を決めることができる。 実施例
[ 0 0 3 0 ]
以下の実施例により本発明を更に詳述するが、 本発明はこれら実施例に限定 して理解されるべきものではない。 [実施例 1 ]
[ 0 0 3 1 ]
ラット GPVI遺 fe子のクローニング
先ず、 公知であるマウス GPVI遺伝子の情報を基に、 マウス GPVI遺伝子の各 ェクソンをそれぞれ増幅可能なプライマー （6対） を設計した。 これらを用い て、 ラットゲノム DNAを铸型とした PCRを行い、 特異的に増幅された遺伝子断 片をシークェンスし、つなぎあわせることで、 ラット GPVI遺伝子配列を推定し た。 次に、 この配列情報に基づいてラット GPVI用プライマー （ratGPVI- # a， mGPVI-d) を再設計し、 ラット骨髄由来 cDNA (ラット骨髄由来 RNAを、 オリゴ dTプライマーを用いて逆転写して合成） を铸型とした PCRで、 ラット GPVI全 長遺伝子を増幅した。 増幅産物をゲルから抽出し、 pT7 - Blue (T)ベクター （タカ ラバイオ） に TAクローユングした後、 塩基配列を決定した。 推定した配列と同 じことを確認し、 このプラスミ ドを pTK-2478とした。 図 1にラット GPVI遺伝 子の塩基配列を示す。 表 1 第 1 - .クソン rat GPVI- a CCCTCAGCGCATCCTGTTCCTAT (配列番号 1 )
rat GPVI-c TTTCCCAGGTCACCTTCAGGACT (S3列番号 2 )
第 2、 3ェクソン rat GPVI - f TTAAGGGAGTCTCTAGCCTCTG (配列番号 3 )
mGPVI-g GTTTAGCATACACACCTGTAGCAATTAGCT
(配列番号 4 )
第 4ェ ■クソン rat GPVI-j CCTGTTTCCTGTCTTTAATAGAG (配列番 * 5〉
rat GPVI - 1 CCTTGCCCACACCTCTGACTCC (配列番号 6 )
第 5ェ .クソン rat GPVI - m GTCAGAAAATCAAGTCACAGAAATG (配列番号 7 )
rat GPVI-o TTCAGACACATTTGTAGTAGAAC (配列番号 8 )
第 6ェクソン rat GPVI-r GGAGCACTTGGGATGAACTGTCA (配列番号 9 )
rat GPVI-s GAGAAACCCATCCTCTTGCCAC (gB列番号 1 0 )
第 7ェクソン rat GPVI-v GCTTCACAAGCATATGAGCACGTG (配列番号 1 1 )
rat GPVI-w ATTATAGCTCTATAGATTCCATG (配列番号 1 2 )
全長 . rat GPVト fta GGGAATTCCATGTCTCCAGCCTCACTC (配列番号 1 3 )
mflPVI-d CCAAGTTATTTCTAGGCCAGTGG (配列番号 1 4 )
[実施例 2 ]
[ 0 0 3 3 ]
ラット GPVI (D1D2)マウス GPVI (D3) -マウス Fc融合蛋白質 （rGPVI- mFc) 発現プ ラスミ ドの構築
pTK- 2478を錡型とし、 プライマー対 （rat GPVI- # aおよび rat GPVI-# t) で PCRを行うことで、 ラッ ト GPVIの D1および D2 (GPVIの細胞外領域のドメイ ン 1およびドメイン 2 ) をコードする遺伝子断片 Aを増幅した。 同様に、 pTK-2440 (W02006/117910及び W02006/118350に記載） を铸型とし、 プライマ 一対（rat GPVI_# sおよび IgGl- i)で PCRを行うことで、マウス GPVIの D3 (GPVI の細胞外ドメインで、 D1および D2以外の領域） をコードする遺伝子断片 Bを 増幅した。 次に Aおよび Bを混合して铸型とし、 プライマ一対 （rat GPVI-# a および IgGl- i) で再度 PCRを行うことで、 ラッ ト GPVI (D1および D2)とマウス GPVI (D3)が連結された遺伝子断片 Cを得た。 この断片 Cの 5'側を Eco RI、 3， 側を Bam HIで切断後、 マウス Fc領域 （mFc) を EFプロモーターの下流に有す るプラスミ ド （pTK - 2299 : W02006/117910及び W02006/118350に記載） の Eco RI および Bam HI部位に挿入することで、 ラット GPVI- mFc融合蛋白質を発現可能 な pTK- 2483を構築した。
[ 0 0 3 4 ]
表 2
IgGl-i CCAGGAGTTCAGGTGCTGGGCACGGTGGGC (SB列番号 1 5 )
rat GPVHs GTGGTTACTGGACCCTCTGCCACTCCCAGC (配列番号 1 6 )
rat GPVI- #t GCTGGGAGTGGCAGAGGGTCCAGTAACCAC (配列番号 1 7 )
[ 0 0 3 5 ]
なお、 mFcをヒ ト Fc領域（hFc) に置き換えたラット GPVI- hFc (rGPVI- hFc)、 マウス GPVI— hFc (mGPVI-hFc)、 ヒ ト GPVI— hFc (hGPVI-hFc)、 rGPVI- hL2, 5- hFc (ラッ ト GPVI- hFcのループ 2、 5をヒ ト GPVIの対応する配列で置換した GPVI 変異体蛋白質） 、 rGPVI- hL9, 11- hFc (ラット GPVI- hFcのループ9、 11をヒ ト GPVIの対応する配列で置換した GPVI変異体蛋白質） 、 hGPVI- mL2- hFc (ヒ ト GPVI - hFcのループ 2をマウス GPVIの対応する配列に置換した GPVI変異体蛋白 質） 及び. hGPVI - mL9_hFc (ヒ ト GPVI- hFcのループ 9をマウス GPVIの対応する 配列に置換した GPVI変異体蛋白質） の各発現プラスミ ドを、 公知のヒ ト GPVI 及びマウス GPVIの配列、図 1のラット GPVIの配列ならぴにヒ ト及びラット GPVI のアミノ酸配列のアラインメント （図 2) 又はヒ ト及びマウス GPVIのアミノ酸 配列のアラインメント （図 3) に示された各ループのアミノ酸配列に基づいて、 公知の方法 （W001/810、 W003/54020, W02005/7800等参照） を参考に、 実施例 2と同様の手法で作製した。
[実施例 3 ]
[ 0 0 3 6 ]
rGPVI- mFc融合蛋白質の発現および精製
COS- 1細胞は 10%牛胎児血清入りのダルべッコ MEM培地で継代した。 無血清 のダルべッコ MEM培地にトランスフエクション試薬 （FuGENE6、 ロシュダイァグ ノスティ ックス)を混和後、 pTK_2483を適量混和し、 Hybridoma - SFM培地（GIBC0) に培地交換した C0S-1細胞に添加した。 37°C、 5% C02存在下で、 3日間培養後 上清を回収し、 新たな培地でさらに 3日間培養し、 それらの上清をプロテイン Aカラム（Prosep - vA、 MILLIPORE)にて精製したものを抗ラッ ト GPVI抗体作製用 の抗原とした。 得られた r GPVI - mFc融合蛋白質を定法にて SDS- PAGEで解析し た。すなわち、 5— 20%のグラジェントゲルにサンプルと分子量マーカー（Bio- Rad、 Precision Plus Protein Unstained Standard) をアプライし、 電気泳動した後、 銀染色した （図 4) 。
なお、 rGPVI-hFc融合蛋白質、 mGPVI-hFc融合蛋白質、 hGPVI-hFc融合蛋白質、 rGPVI-hL2， 5 hFc改変体蛋白質、 rGPVI-hL9， 11- hFc改変体蛋白質および hGPVI-mL9-hFc改変体蛋白質も同様に発現及び精製した。
[実施例 4 ]
[ 0 0 3 7 ]
抗ラット GPVIモノクローナル抗体の作製
Alum (PIERCE) 12. 5 μ Lと CpGアジュバント 1 mgと精製ラッ ト GPVI - mFc融 合蛋白質 を混合し、 lOO w Lとした投与抗原を ddYマウス（メス、 8週令、 SLC) 'の両足のフットパッド内にマイクロシリンジを用いて、 それぞれ 50 L投 与した。 11 日後、 投与抗原 20 /z gを 50 / Lの生理食塩水で希釈し、 フッ トパッ ド内に各 25 Lずつ投与した。 3日後、 腸骨リンパ節よりリンパ球を分離し、 得られたリンパ球を P3 X 63— Ag. 8. U1 (ATTC) と混合した後、 ポリエチレング リコールを用いて安東民衛 ·千葉丈 Z著 「単クローン抗体実験操作入門」 （講 談社） にしたがって細胞融合を行った。 HAT培地によりハイプリ ドーマを選択 し、 1週間後、 目的の抗体を産生しているハイプリ ドーマをスクリーニングし た。 すなわち、 0. 076 Mリン酸緩衝液 （pH 7. 4) (以下 PBSと記載） で精製ラ ット GPVI-hFc融合蛋白質を 3 / g/mLに希釈し、ィムノプレート（Maxisorb、NUNC) に 50 μ L/ゥエル添加した。 4°Cで Over Night反応後、 イオン交換水で 3回洗浄 し、 2% Stabilgurdを含む PBSを各ゥエルに 100 μ L添加しブロッキングを行つ た。次に培養上清を各ゥエルに添加し、 37°Cで 1時間反応させた後、 0. 05% Tween 20を含む生理食塩水で 3回洗浄した。 ペルォキシダーゼ標識抗マウスィムノグ ロブリン抗体 （DAK0) を、 10%ゥサギ血清を含む PBSで 1000倍に希釈し、 各ゥ エルに 50 μ L添加した。 37°Cで 1時間反応後、同様に 5回洗浄し TMB溶液（BioFix) を各ゥエルに添加した。 室温で 10分間反応後、 0. 5 M硫酸溶液で反応を停止し た。 プレート分光光度計 （NJ- 2100、 日本インターメッド） で 450 nmの吸光度 を測定した。 精製ラット GPVI - hFc融合蛋白質と反応した細胞を選択し、 限界希 釈法によりクローニングを行った。 11日後、 同様にスクリ一二ングを行い、 精 製ラット GPVI - hFc融合蛋白質と反応する抗体を産生するハイプリ ドーマを 1ァ クローン取得した （表 3 ) 。
[ 0 0 3 8 ]
表 3
Figure imgf000035_0001
[実施例 5 ]
[ 0 0 3 9 ]
ハイプリ ドーマが産生する抗体の調製
以後の操作は特に記載が無い限り 4。Cにて実施した。 マウスハイプリ ドーマ 培養液を、プレフィルタ一として Ι μ πιの孔径を有するカプセルカートリッジフ ィルター （東洋濾紙株式会社） '、 本フィルタ一として 0. 22 μ πιの孔径を有する フルォロダインフィルター （PALL) およびミリパック 200 (MILLIP0RE) をそれ ぞれ用い、室温にて清澄化し培養上清を得た。この培養上清を予め PBS- (Sigma) にて平 fiィ匕したプロテイン A (rmp Protein A Sepharose Fast Flow, GE Healthcare バイオサイエンス） に吸着させ、 非吸着蛋白質を PBS-にて洗浄後、 非特異的に 吸着している蛋白質を 10 X PBS- (Sigma) にて溶出した。 その後、 プロティ A に結合している抗体を、 100 mMグリシン一塩酸バッファー （pH 3. 0) にて溶出 した。 溶出液の容量を測定し、 直ちに 1Z10容量の 2 M Tris-HCl (pH 8. 5) を 添加し、 pHを中性に戻し精製抗体溶液とした。 この精製抗体溶液を、 攪拌式セ ルを用いて、分子量力ット 30, 000のバイォマックス PB限外濾過膜（MILLIP0RE) により濃縮した後、 生理食塩液 （大塚生食注、大塚製薬工場） に対して透析し、 最終的な精製抗体溶液とした。 得られた抗体を定法にて SDS-PAGEで解析した。 すなわち、 5— 20%のグラジェントゲルにサンプルと分子量マーカー （Bio-Rad、 Precision Plus Protein Unstained Standard) をアプライし、 電気泳動した後、 銀染色した （図 5) 。 なお、 以下の実施例では、 全て、 同様の方法で精製した 抗体を使用した。
[実施例 6 ]
[ 0 0 4 0 ]
抗ラット GPVI抗体の認識領域
実施例 4で得られた抗ラット GPVIモノクローナル抗体の認識ドメインの解析 を行った。 すなわち PBSで精製 rGPVI - hFc融合蛋白質を 2 g/mLに希釈し、 ィ ムノプレート （Maxisorb、 NUNC) に 50 L/ゥエル添加した。 37°Cで 1時間反 応後、イオン交換水で5回洗浄し、 2°/。Stabi lgurdを含む PBSを各ゥエルに 100 /i L 添加しプロッキングした。 次に実施例 5で精製したモノクローナル抗体を各種 濃度に調製しポリプロピレンプレート （NUNC) に 50 しノウエルで添加し、 さ らに実施例 3で得られた rGPVI- hFc融合蛋白質、 hGPVI - hFc融合蛋白質、 rGPVI- hL2， 5- hFc改変体蛋白質、 rGPVI-hL9， 11-hFc改変体蛋白質をそれぞれ 50 μ L/ゥエルで添加し混合した。本混合サンプルを rGPVI-hFc融合蛋白質で固 相した上記のィムノプレートに 50 L/ゥエルで添加し、 37°Cで 1時間反応さ せた後、 0. 05% Tween 20を含む生理食塩水で 5回洗浄した。 ペルォキシダーゼ 標識抗マウスカッパ鎖抗体 （Rockland) を 10%ゥサギ血清を含む PBSで 1000倍 に希釈し、 各ゥエルに 50 i L添加した。 37°Cで 1時間反応後、 同様に 5回 ¾浄 し TMB溶液 （BioFix) を各ゥエルに添加した。 室温で 10分間反応後、 0. 5 M硫 酸溶液で反応を停止した。プレート分光光度計（NJ - 2100、 日本ィンターメッド） で 450 nmの吸光度を測定した。 その結果、 rGPVI- hL2, 5 - hFc改変体蛋白質を添 加した時に吸光度が低下しない抗体、 つまりはループ 2及び Z又はループ 5を 認識している抗体が 1種類 （F1239-11 - 1) 、 また rGPVI - hL9， 1卜 hFc改変体蛋白 質を添加した時に吸光度が低下しない抗体、 つまりはループ 9及び Z又はルー プ 11を認識している抗体が 3種類 （F1239- 4- 2、 F1239 - 6- 1、 F1239 - 22- 2) 存在 する事が示された（図 6)。なお、上記の 3種類の抗体（Fl239-4- 2、 F1239-6-1 , F1239-22-2) は、 同様の方法においてマウス GPVI_hFc融合蛋白質とは結合しな かった。 さらに、 ラット GPVIとマウス GPVIのループ 11のアミノ酸配列は同一 であることを併せて考察すると、 ループ 11が重要な認識領域とは考えにくく、 上記の抗体は少なくともラット GPVIのループ 9の一部を含有する構造を認識し ていると推定される。
[実施例 7 ]
[ 0 0 4 1 ]
ラット可溶型 GPVIの ELISA法による測定
実施例 4にて作製したマウス抗ラット GPVI抗体を用いてサンドィツチ ELISA 系を構築した。 すなわち PBSで精製 F1239-6- 1抗体を 10 g/mLに希釈し、 ィム ノノププレレーートト （（MMaaxxiissoorrbb、、 NNUUNNCC)) にに 7755 μμ LL//ゥゥエエルルでで添添加加ししたた。。 44°°CCでで OOvveerr NNiigghhtt でで反反応応ししたた後後、、 イイオオンン交交換換水水でで 55回回洗洗浄浄しし、、 55%% SSttaabbiillgguurrdd、、 00.. 11%% TTwweeeenn 2200をを 含含むむ PPBBSSをを各各ゥゥエエルルにに 220000 LL添添加加ししププロロッッキキンンググししたた。。次次ににササンンププルル及及ぴぴススタタ ンンダダーードドととししてて用用いいるる組組換換ええ rrGGPPVVII -- hhFFcc融融合合蛋蛋白白質質をを 00.. 11%% BBSSAA、、 00.. 33 MM塩塩化化ナナ 55 トトリリウウムム、、 00.. 0055%% TTwweeeenn 2200ZZPPBBSSをを用用いいてて稀稀釈釈ししたた。。 ままたた、、 測測定定ササンンププルルととしし てて血血漿漿をを用用いいるる場場合合はは 55倍倍以以上上でで稀稀釈釈しし、、
Figure imgf000038_0001
、、
3377°°CCでで 22時時間間攪攪拌拌ししななががらら反反応応''ささせせたた後後、、 00.. 0055%% TTwweeeenn 2200をを含含むむ生生理理食食塩塩水水でで 55回回洗洗浄浄ししたた。。 BBiioottiinn標標識識ししたた FF11223399-- 77-- 11 FF ((aabb'' )) 22抗抗体体をを 2200%% PPoollyy-- HHRRPP DDIILLUUEENNTT ((FFiittzzggeerraalldd)) 、、 00.. 33 MM塩塩化化ナナトトリリウウムム、、 00.. 0055%% TTwweeeenn 2200をを含含んんだだ PPBBSSににてて稀稀
1100 釈釈しし、、 各各ゥゥエエルルにに 5500 //zz LL添添加加ししたた。。 3377°°CCでで 11時時間間攪攪拌拌ししななががらら反反応応ささせせたた後後、、 同同様様にに 55回回洗洗浄浄ししたた。。 次次いいでで PPOOLLYY-- HHRRPP8800--SSttrreeppttaavvii ddiinn ((FFiittzzggeerraalldd)) をを 2200%% PPoollyy-- HHRRPP DDIILLUUEENNTT,, 00.. 0055%% TTwweeeenn 2200をを含含むむ PPBBSSににてて稀稀釈釈しし、、 各各ウウエエノノレレにに 5500 //zz LL 添添加加ししたた。。 3377°°CCでで 3300分分攪攪拌拌ささせせななががらら反反応応ささせせたた後後、、同同様様のの方方法法でで 66回回洗洗浄浄しし、、 TTMMBB溶溶液液 （（BBiiooFFiixx)) をを各各ゥゥエエルルにに添添加加ししたた。。 室室温温でで 2200分分間間反反応応後後、、 00.. 55 MM硫硫酸酸
1155 溶溶液液でで反反応応をを停停止止ししたた。。 ププレレーートト分分光光光光度度計計 （（NNJJ-- 22110000、、 日日本本イインンタターーメメッッドド)) でで 445500 nnmmのの吸吸光光度度をを測測定定ししたた。。 図図 77にに rrGGPPVVII-- hhFFcc融融合合蛋蛋白白質質をを標標準準品品ととししてて用用 いいてて作作成成ししたた標標準準曲曲線線をを示示すす。。
[[実実施施例例 88 ]]
2200 [[ 00 00 44 22 ]]
ヒヒ トト可可溶溶型型 GGPPVVIIのの EELLIISSAA法法にによよるる測測定定
ママウウスス抗抗ヒヒ トト GGPPVVII抗抗体体をを用用いいててササンンドドィィツツチチ EELLIISSAA系系をを構構築築ししたた。。すすななわわちち PPBBSSでで精精製製 FF11223322--77-- 11抗抗体体をを 1100 gg//mmLLにに希希釈釈しし、、 ィィムムノノププレレーートト （（MMaaxxii ssoorrbb、、 NNUUNNCC)) にに 7755 μμ 11//ゥゥエエルル添添加加ししたた。。 44°°CCでで OOvveerr NNiigghhttでで反反応応後後、、 イイオオンン交交換換水水 2255 でで 55回回洗洗浄浄しし、、 55%% SSttaabbiillgguurrdd,, 00.. 11%% TTwweeeenn 2200をを含含むむ PPBBSSをを各各ウウエエノノレレにに 220000 μμ LL 添添加加ししププロロッッキキンンググししたた。。 次次ににササンンププルル及及びびススタタンンダダーードドととししてて用用いいるる組組換換ええ hhGGPPVVII--hhFFcc融融合合蛋蛋白白質質をを 00.. 11%% BBSSAA、、 00.. 33 MM塩塩化化ナナトトリリウウムム、、 00.. 0055%% TTwweeeenn 2200//PPBBSS をを用用いいてて稀稀釈釈ししたた。。 ままたた測測定定ササンンププルルととししてて血血漿漿をを用用いいるる場場合合はは 55倍倍以以上上でで稀稀 釈釈しし、、 * ''添添加加しし、、 3377°°CCでで 22時時間間攪攪拌拌ささせせななががらら反反応応ささ せた後、 0. 05% Tween 20を含む生理食塩水で 5回洗浄した。 Biotin標識した F1232-10-2 F (ab，）2抗体を 20% Poly-HRP DILUENT (Fitzgerald) 、 0. 3 M塩化 ナトリゥム、 0. 05% Tween 20を含んだ PBSにて稀釈し、 各ゥエルに 50 ^ L添加 した。 37°Cで 1時間、 攪拌しながら反応させた後、 同様に 5回洗浄した。 次い で POLY- HRP80-Streptavidin (Fitzgerald)を 20% Poly-HRP DILUENT, 0. 05% Tween 20を含んだ PBSにて稀釈し、 各ゥエルに 50 添加した。 37°Cで 30分間、 攪 拌しながら反応させた後、 同様の方法で 6回洗浄し、 TMB溶液 （BioFix) を各 ゥエルに添加した。 室温で 20分間反応後、 0. 5 M硫酸溶液で反応を停止した。 プレート分光光度計 （NJ - 2100、 日本インターメッ ド） で 450 nmの吸光度を測 定した。 図 8に hGPVI- hFc融合蛋白質を標準品として用いて作成した標準'曲線 を示す。 本系では 3Pg/mLの標準品において約 40mAbsの吸光度の差が得られ、 測定感度は少なくとも 3pg/ml以下であった。
[実施例 9 ]
[ 0 0 4 3 ]
ラット PRPの調製および convulxin、 CRPあるいは ADPによる血小板刺激
正常ラットから採血したクェン酸加血を 110 X g、 25° (：、 15分間遠心分離する ことにより多血小板血漿 （Platelet Rich Plasma； PRP) を得た。 引き続き、 PRP に ACD— A (acid-citrate-dextrose) を添カ卩し、 pH 6. 5に調整した後、 830 X g、 25°Cで 10分間遠心分離することにより血小板を回収した。 回収した血小板に ACD-Aで pH 6. 5に調整した HEPES Buffer (137 mM NaCl、 1 mM MgCl2、 5. 5 mM Glucose, 3 mM Na¾P04、 10 mM HEPES, 1 mg/mL BSA) を添加して 2回洗浄した。 洗浄後、 HEPES Buffer (pH 7. 3) を添加して血小板を懸濁し、 洗浄血小板とした。 CaCl2、 MgCl2を 1 mMとなるように添加した洗浄血小板に convulxin (ALEXIS) 、 CRP (ぺ プチド合成品）あるいは ADPを添加し、室温において 1時間反応させ血小板を刺 激した。 25 mM EDTAを含む Protease Inhibitor Cocktail溶液を添加して反応 を終了した後、 18，000 X g、 25°Cで 1分間遠心分離し、 上清画分おょぴ血小板画 分を回収した。 [実施例 1 o ]
[ 0 0 4 4 ]
ラット血小板 GPVI発現のフロサイトメ トリーによる測定
実施例 9に示した方法で、洗浄血小板を convulxin、 CRPあるいは ADPで刺激 した。 対照として洗浄血小板にバッファーのみを添加し、 室温において 1時間 静置した。 25 mM EDTAを含む Protease Inhibitor Cocktail溶液を添加して反 応を終了した後、 0. 5%非働化 FBSならびに 2. 5 mM EDTAを含む PBS (以下、 FACS バッファー） で洗浄後、 蛍光色素 R-Phycoerythrin (以下、 PE) で標識したマ ウス抗ラット GPVI抗体 F1239 - 11- 1を 3 X 105個の血小板に対して 0. 5 / g相当 添加して室温、 遮光下で 30分静置した。 PE標識 F1239- 11 - 1のアイソタイプ対 照として、 PE標識マウス IgG2a K 抗体を同量添加した試料も併せて調製した。 30分後、 FACSバッファーで血小板を洗浄後、 フローサイトメーター CYT0MICS FC500 (BECKMAN COULTER) で血小板の蛍光強度を測定することにより血小板膜 表面上の GPVI発現量について解析した。なお、 GPVI発現量は、 PE標識 F1239- 11- 1 検出結果値から PE標識マウス IgG2a K抗体検出結果値を差し引いて算出した。 図 9に結果を示す。 Convulxin (CVX) および CRP刺激血小板ではバッファーの みを添加した血小板と比較して、 顕著な GPVI発現量の減少が認められた、 ADP 刺激血小板では GPVI発現量の低下は認められなかつた。 [実施例 1 1 ]
[ 0 0 4 5 ]
ラット PRPの可溶型 GPVI量の ELISAによる測定
実施例 9に示した方法で、洗浄血小板を convulxin、 CRPあるいは ADPで刺激 した後、 上清画分を回収した。 さらに、 実施例 7の方法により、 上清中の可溶 型 GPVI量を測定した。 図 10に結果を示す。 Convulxinおよび CRPで刺激した 血小板の上清中において、顕著な可溶型 GPVI量の上昇が認められた。一方、 ADP で刺激した血小板の上清中における可溶型 GPVI量の上昇は微弱であった。
[実施例 1 2 ] [ 0 0 4 6 ]
サル PRPの調製および Convulxin、 CRPあるいは ADPによる血小板刺激
正常サルから採血したクェン酸加血を 115 X g、 25°C、 15分間遠心分離するこ とにより多血小板血漿 （Platelet Rich Plasma ; PRP) を得た。 、 引き続き、 PRP に ACD- A (acid-citrate-dextrose) を添加し、 pH 6. 5に調整した後、 830 X g、 25°Cで 10分間遠心分離することにより血小板を回収した。 回収した血小板に ACD-Aで pH 6. 5に調整した HEPES Buffer (137 raM NaCl, 1 raM MgCl2, 5. 5 mM Glucose, 3 mM Na¾P04、 10 mM HEPES, 1 mg/mL BSA) を添加して 2回洗浄した。 洗浄後、 HEPES Buffer (pH 7. 3) を添加して血小板を懸濁し、 洗浄血小板とした。 CaCl2、 MgCl2を 1 mMとなるように添加した洗浄血小板に convulxin (ALEXIS) 、 CRP (ぺ プチド合成品）あるいは ADPを添加し、室温において 1時間反応させ血小板を刺 激した。 25 mM EDTAを含む Protease Inhibitor Cocktail溶液を添加して反応 を終了した後、 18，000 X g、 25°Cで 1分間遠心分離し、 上清および血小板画分を 回収した。
[実施例 1 3 ]
[ 0 0 4 7 ]
サル血小板 GPVI発現のフローサイ トメ一ターによる測定
実施例 12に示した方法で、 洗浄血小板を convulxin、 CRPあるいは ADPで刺 激した。 対照として洗浄血小板にバッファーのみを添加し、 室温において 1時 間静置した。 25 raM EDTAを含む Protease Inhibitor Cocktail溶液を添加して 反応を終了した後、 FACSバッファーで洗浄後、 蛍光色素 PEで標識したキメラ 抗ヒト GPVI抗体 F1232-37-2あるいはキメラ抗ヒ ト GPVI抗体 F1232- 10-1を 4 X 105個の血小板に対して l g相当添加して室温、 遮光下で 30分静置した。 PE標識キメラ F1232-37- 2および PE標識キメラ F1232- 10-1のアイソタイプ対 照として PE標識ヒ ト IgG4抗体を同量添加した試料も併せて調製した。 30分後、
FACSバッファーで血小板を希釈後、 フローサイトメーター CYT0MICS FC500
(BECKMAN COULTER) で血小板の蛍光強度を測定することにより血小板膜表面上 の GPVI発現量について解析した。なお、 GPVI発現量は、 PE標識キメラ F1232- 37- 2 あるいは PE標識キメラ F1232 - 10-1検出結果値から PE標識ヒト IgG4抗体検出 結果値を差し引いて算出した。 結果を図 11に示す。 Convulxinおよび CRP刺激 血小板ではバッファーのみを添加した血小板と比較して、 GPVI発現量の減少が 認められたが、 ADP刺激血小板では GPVI発現量の低下は認められなかった。
[実施例 1 4 ]
[ 0 0 4 8 ]
サル血小板 GPVI量のウェスタンプロッティングによる測定
実施例 12に示した方法で、 洗浄血小板を convulxin、 CRPあるいは ADPで刺 激した後、上清画分および血小板画分を回収し、上清画分に含まれる可溶型 GPVI および血小板画分に含まれる GPVI (以下、 血小板 GPVI) を Western Blotting 法により検出した。 すなわち上清画分 12 /z Lに X 4 Sample Buffer
(+ β -mercaptoethanol Protease 丄 nnibitor し ocktail (Roche)、 Phosphatase
Inhibitor Cocktail (PIERCE) ) を 4/i L添加した。 血小板画分は 1. 9 X 106個血 小板相当/ となるように X 1 Sample Buffer (+ β -mercaptoethano Protease
Inhibitor Cocktail (Roche 、 Phosphatase Inhibitor Cocktail (PIERCE) ) ¾r 添加し、 99°Cで 5分間熱処理した。 熱処理したサンプルを 5 - 20%の濃度勾配ポ リアクリルアミ ドゲル （ATT0) に、 1 レーンあたり上清画分は全量、 血小板画 分は 16 i Lアプライした後に、 ゲル一枚につき定電流 30 mAで通電し電気泳動 した。 ブロッテイングは常法に従い、 セミ ドライ法により低蛍光のメンブレン
(Immobilon-FL PVDF, MILLIP0RE) に転写した。 ブロッテイング後、 BlockAce
(大日本製薬株式会社） を用いて 4°Cで一晩ブロッキングした。 さらに、 10%
BlockAce/0. 1% Tween 20を含む PBS (TPBS) で希釈した一次抗体 （ヒ ト GPVI合 成べプチドを抗原としたポリクローナル抗体） を添加し、 室温で 1時間、 反応 させた。 TPBSで洗浄した後、 10% BlockAce/TPBSで希釈した二次抗体
(Anti-Rabbit Igs HRP) を添加し、 室温で 30分間反応させた。 TPBSで洗浄し
7こ後、 ECL Plus (Amershara Biosciences)およぴ Typhoon9410 (Araersham
Biosciences) を用いて可溶型 GPVIおよび血小板 GPVIの検出を行なった。 結果 を図 12に示す。 Convulxinおよび CRPで刺激した血小板では、顕著な血小板 GPVI の減少が認められた。 また、 Commlxinおよび CRPで刺激した血小板では著明 な可溶型 GPVIの上昇が認められた。一方 ADPで刺激した血小板では血小板 GPVI 発現量に大きな変動は認められず、 可溶型 GPVIも検出されなかった。 [実施例 1 5 ]
[ 0 0 4 9 ]
サル PRPの可溶型 GPVI量の ELISAによる測定
実施例 12に示した方法で、 洗浄血小板を Convulxin、 CRPあるいは ADPで刺 激した後、 上清を回収した。 さらに、 実施例 8の方法により、 上清中の可溶型 G P V I量を測定した。 結果を図 13に示す。 Convulxinおよび CRPで刺激した 血小板の上清中において、顕著な可溶型 GPVI量の上昇が認められた。一方、 ADP で刺激した血小板の上清中における可溶型 GPVIの上昇は極めて微弱であった。
[実施例 1 6 ]
[ 0 0 5 0 ]
ヒト PRPの調製および Collagen、 Convulxin, CRPあるいは ADPによる血小板刺 正常ヒトから採血したクェン酸加血を 170 X g、 25°C、 15分間遠心分離するこ とにより多血小板血漿 （Platelet Rich Plasma ; PRP) を得た。 引き続き、 PRP に ACD— A (acid-citrate-dextrose) を添加し、 pH 6. 5に調整した後、 830 X g、 25°Cで 10分間遠心分離することにより血小板を回収した。 回収した血小板に ACD-Aで pH 6. 5に調整した HEPES Buffer (137 mM NaCl、 1 mM MgCl2、 5. 5 mM Glucose, 3 mM NaH2P04、 10 mM HEPES, 1 mg/mL BSA) を添加して 2回洗浄した。 洗浄後、 HEPES Buffer (pH 7. 3) を添加して血小板を懸濁し、 洗浄血小板とした。 CaCl2 および MgCl2を 1 mMとなるように添加した洗浄血小板に collagen
(collagenreagent' Horm' Nycomed) 、 convulxin (ALEXIS) 、 CRP、ペプチド合 成品）あるいは ADPを添加し、 室温において 1時間反応させ血小板を刺激した。
25 mM EDTAを含む Protease Inhibitor Cocktail溶液を添加して反応を終了し た後、 18， 000 X g、 25°Cで 1分間遠心分離し、上清および血小板画分を回収した。 [実施例 1 7 ]
[ 0 0 5 1 ]
ヒ ト血小板 GPVI発現のフローサイトメ一ターによる測定
実施例 16に示した方法で、 洗浄血小板を collagen、 convulxin, CRPあるい は ADPで刺激した。 対照として洗浄血小板にバッファーのみを添加し、 室温に おいて 1時間静置した。 25 mM EDTAを含む Protease Inhibitor Cocktail溶液 を添加して反応を終了した後、 FACSバッファーで洗浄後、 蛍光色素 PEで標識 したキメラ抗ヒ ト GPVI抗体 F1232- 37 - 2を 4 X 105個の血小板に対して 1 / g相 当添加して室温、 遮光下で 30分静置した。 PE標識キメラ F1232- 37- 2のァイソ タイプ対照として PE標識ヒ ト IgG4抗体を同量添加した試料も併せて調製した。 30分後、 FACSバッファ一で血小板を希釈し、 フローサイ トメーター CYT0MICS FC500 (BECKMAN COULTER) で血小板の蛍光強度を測定することにより血小板膜 表面上の GPVI発現量について解析した。 なお、 GPVI発現量は、 PE標識キメラ F1232- 37- 2検出結果値から PE標識ヒ ト IgG4抗体検出結果値を差し引いて算出 した。 結果を図 14に示す。 Collagen刺激血小板で、 GPVI発現量の減少が認め られた。 Convulxinおよび CRPで刺激した血小板では、 GPVI発現がほとんど消 失していた。 一方、 ADP刺激した血小板では GPVI発現量の低下は認められなか つた。
[実施例 1 8 ]
[ 0 0 5 2 ]
ヒト血小板 GPVI量のウェスタンプロッティングによる測定
実施例 16に示した方法で、 洗浄血小板を collagen, convulxin, CRPあるい は ADPで刺激した後、 上清画分および血小板画分を回収し、 上清画分に含まれ る可溶型 GPVIおよび血小板画分に含まれる GPVI (以下、血小板 GPVI)を Western
Blotting法により検出した。 すなわち上清画分 l2 w Lに X 4 Sample Buffer
(+ β -mercaptoethanolN Protease Inhibitorし ocktail (Rocheノ 、 Phosphatase
Inhibitor Cocktail (PIERCE) ) を 4 // L添加した。 血小板画分は 1. 9 X 106個血 zj、板相当/ i Lとなるように X I Sample Buffer (+ β一 mercaptoethanol Protease Inhibitor Cocktai l (Roche) Phosphatase Inhibitor Cocktai l (PIERCE) ) を添加し、 99°Cで 5分間熱処理した。 熱処理したサンプルを 5- 20%の濃度勾配 ポリアクリルアミ ドゲル （ATT0) に、 1レーンあたり上清画分は全量、 血小板 画分は 16 /i Lアプライした後に、 ゲル一枚につき定電流 30 mAで通電し電気泳 動した。 ブロッテイングは常法に従い、 セミ ドライ法により低蛍光のメンブレ ン （I obi lon-FL PVDF MILLIP0RE) に転写した。 プロッティング後、 BlockAce
(大日本製薬株式会社） を用いて 4°Cでー晚ブロッキングした。 さらに、 10% BlockAce/0. 1% Tween 20を含む PBS (TPBS) で希釈した一次抗体 （ヒ ト GPVI合 成ぺプチドを抗原としたポリク口ーナル抗体） を添加し、 室温で 1時間、 反応 させた。 TPBSで洗浄した後、 10% BlockAce/TPBSで希釈した二次抗体
(Anti-Rabbit Igs HRP) を添加し、 室温で 30分反応させた。 TPBSで洗浄した 後、 ECL Plus (Amersham Biosci ences)およひ Typhoon9410 (Amersnam
Biosci ences) を用いて可溶型 GPVIおよび血小板 GPVIの検出を行った。 結果を 図 15に示す。 Convulxinおよび CRPで刺激した血小板では顕著な血小板 GPVI の減少が認められた。 また、 Col lagen Convulxinおよび CRPで刺激した血小 板では可溶型 GPVIの上昇が認められた。一方 ADPで刺激した血小板では血小板 GPVI'の大きな変動は認められず、 可溶型 GPVIも検出されなかった。 [実施例 1 9 ]
[ 0 0 5 3 ]
ヒ ト PRPの可溶型 GPVI量の ELISAによる測定
実施例 16に示した方法で、 洗浄血小板を Col lagen, Convulxin, CRPあるい は ADPで刺激した後、 上清を回収した。 さらに、 実施例 8の方法により、 上清 中の可溶型 GPVI量を測定した。 結果を図 16に示す。 Col lagen Convulxinお よび CRPで刺激した血小板の上清中において、著明な可溶型 GPVI量の上昇が認 められた。 一方、 ADPで刺激した血小板の上清中における可溶型 GPVIの上昇は 認められなかった。 [実施例 2 0 ]
[ 0 0 5 4 ]
ラットエンドトキシン惹起血栓モデル動物における血漿中可溶型 GPVI量の測 塞
雌性 Wistarラットをペントバルビタールナトリウム （50 mg/kg) で麻酔し、 ^右大腿静脈よりエンドトキシンを 20 mg/kgの用量で2時間、 あるいは 40 mg/kg の用量で 4時間、 持続静脈内投与した。 エンドトキシン投与終了時に、 腹部大 動脈より採血し、 血小板数を自動血球数測定装置 （Sysmex 東亜医用電子） に て測定した、 また、 血液を遠心することにより血漿を分離し、 可溶型 GPVIを実 施例 7に記載した方法で、 可溶型 ICAM- 1は ELISAキット （R&D System, Rat sICAM-1 (CD54) Immunoassay) を用いて測定した。 結果を図 17に示す。 エンド トキシンを投 ·することにより、 血小板数の低下が認められた。 このことは、 エンドトキシンの投与により血小板の活性化が生じていることを示している。 また、 ェンドトキシンを投与することにより、血漿中の可溶型 GPVI量おょぴ可 溶型 ICAM- 1量が上昇した。
[実施例 2 1 ]
[ 0 0 5 5 ]
( 1 )ラットコラーゲン惹起血栓モデル動物における血漿中可溶型 GPVI量の測 塞
雄性 SDラッ トをペントバルビタールナトリウム （50 mg/kg) で麻酔し、 右大 腿静脈よりコラーゲンを 0. 5 mg/kgの用量で 15分間持続静脈内投与した。 コラ 一ゲン投与開始より 30分後に、頸静脈より採血し、血小板数を自動血球数測定 装置 （SySmex、 東亜医用電子） にて測定した。 また、 血液を遠心することによ り血漿を分離し、 可溶型 GPVIを実施例 7に記載した方法で、 可溶型 ICAM-1は
ELISAキット （R&D System、 Rat sICAM - 1 (CD54) Immunoassay) を用いて測定し た。 結果を図 18 (A) に示す。 コラーゲンを投与することにより、 血小板数の 低下が認められた。 このことは、 コラーゲンの投与により血小板の活性化が生 じていることを示している。 また、 コラーゲンを投与することにより、 血漿中 の可溶型 GPVI量ならびに可溶型 ICAM- 1が上昇した。 さらに、 血小板数の低下 の程度と血漿中の可溶型 GPVI量の上昇の程度は一致した。
同様に、 雄性 SDラットをペントバルビタールナトリウム （50 mg/kg) で麻酔 し、 右大腿静脈よりコラーゲンを 0. 1 mg/kgの用量で急速静脈内投与した。 コ ラーゲン投与 15分後、 30分後、 および 60分後に頸静脈より採血し、 血小板数 を自動血球数測定装置 （SysmeX、 東亜医用電子） にて測定した。 また、 血液を 遠心することにより血漿を分離し、可溶型 GPVIを実施例 7に記載した方法で測 定した。 結果を図 18 (B) に示す。 血小板数の低下は軽微であつたが、 血漿中 の可溶型 GPVI量はコラーゲン投与より 15分で速やかに上昇した。
[ 0 0 5 6 ]
( 2 ) ラットコラーゲン惹起血栓モデル動物における GPVI抗体の効果
雄性 SDラットに抗ラット GPVI抗体 （F1239- 6- 1) を投与した。 6日後にコラ 一ゲンを 0. 8 mg/kgの用量で急速静脈内投与した。 コラーゲンを投与してから 15分まで、生死を観察した。結果を表 4に示す。抗ラット GPVI抗体（F1239-6-1) は、 血漿中の可溶型 GPVI量が上昇する血栓モデル動物において、 0. 3 mg/kg以 上の用量で動物の死亡を完全に抑制した。
従って、 本発明の測定方法等により血漿中の sGPVIを測定することで、 疾患 の発症前に、 血小板活性化もしくは血管内皮傷害の検出、 測定又は定量をおこ なうこと、、血栓症等の血小板活性化もしくは血管内皮傷害関連疾患を診断する こと、 及び治療対象患者を選別することが可能であると考えられる。 また、 こ れらの患者に抗 GPVI 抗体等の抗血小板薬を投薬することで高い有効率が得ら れると考えられる。 表 4
群 生存数/例数
生理食塩水 0 1 5
F1239-6- 1 0. 1 mg/kg 7
F1239-6-1 0. 3 mg/kg 7 7
F1239-6-1 1. 0 mg/kg 8 8 [実施例 2 2 ]
[ 0 0 5 7 ]
( 1 ) ラットバルーン傷害モデル動物における血漿中可溶型 GPVI量の測定 雄性 SDラットを 45 mg/kgのペントパルビタールナトリゥムの腹腔内投与に より麻酔し、 頸部および大腿部を切開した。 大腿動脈にバルーンカテーテルを 挿入し、 先端を左頸動脈の内外類動脈分岐部まで導いた。 バルーンカテーテル が頸動脈内にあることを確認した後、 バルーン内に空気を注入してバルーンを 膨らませた。 バルーンを膨らませた状態で、 大動脈弓までバルーンカテーテル を引き抜いた。この作業を 3回繰り返すことにより、血管内膜に傷害を与えた。 翌日、 ペントバルビタールナトリウム 45 mg/kg腹腔内投与麻酔下で腹部大動脈 より、 クェン酸加血液を採取し、 血漿を取得した。 血漿中の可溶型 GPVI量は実 施例 7に記載した方法で、 可溶型 ICAM-1は ELISAキット （R&D System, Rat sICA -1 (CD54) Immunoassay) を用いて測定した。 結果を図 19 (A) に示す。 バ ルーンカテーテルで血管内膜に傷害を与えることにより、 血漿中の可溶型
ICAM-1量が上昇した。 このことは、 バルーンカテーテルにより血管内膜が傷害 を受けたことを示している。 また、 可溶型 GPVI量の上昇も認められた。
[Ό 0 5 8 ]
( 2 ) ラットバルーン傷害モデル動物における抗 GPVI抗体の効果
実施例 22に記載したモデル動物において、 抗ラット GPVI抗体の効果を検討 した。 すなわち、 抗ラットに F1239- 6- 1を 3 mg/kgで皮下投与し、 6 日後に実 施例 22の方法で血管内膜傷害を加えた。 バルーン傷害より 15 日後にペントバ ルビタール麻酔下において左右の頸動脈を採取して 10%中性緩衝ホルマリンで 固定し、 パラフィンブロックを作製した。 次にパラフィンブロックを薄切して スライド標本を作製し、 Hematoxylin- Eos in染色をおこなった後、 顕微鏡を用 いて観察した。'すなわち、 観察した像を CCDカメラを用いてデジタル画像とし て記録し、 これを画像解析ソフト WinROOFを用いて解析し、 内膜および内中膜 の断面積を算出した。結果を図 19 (B) に示す。抗ラット GPVI抗体（F1239-6- 1) は血漿中の可溶型 GPVIの上昇が認められた動脈硬化モデル動物において、内膜 の肥厚を抑制した。
従って、 本発明の測定方法等により血漿中の sGPVIを測定することで、 疾患 の発症前に、 血小板活性化もしくは血管内皮傷害の検出、 測定又は定量をおこ なうこと、 動脈硬化性疾患等の血小板活性化もしくは血管内皮傷害関連疾患を 診断すること、 及び治療対象患者を選別することが可能であると考えられる。 また、これらの患者に抗 GPVI抗体等の抗血小板薬を投薬することで高い有効率 が得られると考えられる。
[実施例 23 ]
[0059]
ラットエンドトキシン惹起血栓モデル動物における尿中可溶型 GPVI量の測定 雌性 Wistarラットをペントバルビタールナトリウム （50 mg/kg) で麻酔し、 右大腿静脈よりエンドトキシンを 40 mg/kgの用量で 4時間、 持続静脈内投与し た。 エンドトキシン投与終了時に、 尿を取得し、 実施例 7の方法を用いて尿中 可溶型 GPVIを測定した。 結果を図 20に示す。 エンドトキシンを投与すること により尿中においても可溶型 GPVI量の上昇が認められた。
[実施例 24]
[0060]
各種ヒト病態血漿の可溶型 GPVI量の測定
各種ヒト病態血漿中の可溶型 GPVI量を、 実施例 8に示した方法で測定した。 結果を図 21に示す。 狭心症、 急性心筋梗塞、 心臓病、 脳梗塞および痴呆の疾患 患者血漿は、 正常ヒ ト血漿に比較して可溶型 GPVIが高値であった。 [実施例 25 ]
[0061]
抗ヒ ト GPVIモノクローナル抗体の作製
精製 hGP V I - mF c 20 μ gをフロインド完全アジュバント （D I F C
O)又は A 1 um(P I ERCE)及ぴオリゴ C p Gと混合し、投与抗原とした。 d dYマウス （メス、 8週令、 S LC) に 2回投与し、 3日後、 リンパ節又は 脾臓より リンパ球を分離した。 得られたリンパ球を P 3 X 6 3—Ag. 8. U 1 (ATT C) と混合した後、 ポリエチレングリコール （PEG 1 50 O、 S i gma) を用いて安東民衛，千葉丈/著 「単クローン抗体実験操作入門」 （講 談社、 p 83) にしたがって細胞融合を行った。 H.AT培地によりハイブリ ド 一マを選択し、 1週間後目的の抗体を産生しているハイプリ ドーマを hGPV I- hFc及び hGP V I— mL9_hFcに対する結合活性を指標としてスクリー二 ングした。 すなわち、 精製 hGP V I— h F cまたは h GP V I— mL9-hFcを D— PB S (p H 7. 4) で 1 μ gZmLに希釈し、 ィムノプレート （Ma x i s o r , NUNC) に 50 μ LZゥヱル添加し、 実施例 6の記載の:^法と 同様にして固相化した。 次に培養上清を各ゥエルに添加し室温で 1時間反応さ せた後、 実施例 6に記載の方法と同様にしてペルォキシダーゼ標識抗マウスィ ムノグロブリン抗体 （DAKO、 P 26 0) を用いて反応を行い、 吸光度を測 定した。 その結果、 精製 hGPV I-hF cと結合し （吸光度 1以上） 、 hGP V I— mL9- hFcとは結合しない （吸光度 0. 5以下） 抗体を産生している細胞 を選択し、 常法に従いクローニングした。 8〜1 0日後、 同様にスクリーニン グを行い、 L9特異的マウス抗ヒト GPV I抗体を産生するハイブリ ドーマを得 た。'実施例 4と同様に、 得られたハイプリ ドーマを培養し、 モノクローナル抗 体を精製した。 各抗体の GPVI結合活性を、 上記 E L I S A法における吸光度が 0. 5以下を一、 0. 5〜： 1. 0までを十、 1. 0〜2. 0を + +、 2. 0以 上を + + +として、 表示した （表 5) 。
同様の手法を用いて、 L2特異的マウス抗ヒ ト G P V I抗体を産生するハイブ リ ドーマ（F1232 - 10- 1及ぴ同一クローン由来と考えられる F1232- 10-2)を得た。 [ 0 0 6 2 ]
表 5
Figure imgf000051_0001
[実施例 2 6 ]
[ 0 0 6 3 ]
抗 G P V I抗体の可変領域ァミノ酸配列の決定
常法に従い、ハイブリ ドーマ F1232-37-2及び F1232- 10- 1より一本鎖 cDNAを 合成した。 得られた一本鎖 cDNAを铸型とした Mouse Ig - Primer Set (Novagen) による PCRで抗 GPVI抗体の可変領域をコードする D N Aを増幅し、その塩基配 列を決定した。 各ハイプリ ドーマにより産生されるモノクローナル抗体
F1232-37-2及び F1232- 10-1の重鎖及び軽鎖可変領域の塩基配列及ぴ推定され るアミノ酸配列を配列表に示した （配列番号 1 8— 2 5 ) 。
[実施例 2 7 ]
[ 0 0 6 4 ]
抗 GPVI抗体のヒト可溶型 GPVI認識能の確認
実施例 16に示した方法で正常ヒトから調製した洗浄血小板に convulxinも しくは対照としてバッファーのみを添加し、 37°Cにおいて 1時間静置した後、 上清画分を回収した。 実施例 18に示した方法で、 マウス抗ヒト GPVI抗体であ る F1232-7-1 もしくは F1232- 10- 2、 およびヒト GPVI合成べプチドを抗原とし たポリクローナル抗体を一次抗体として Western Blotting法によりヒト可溶化 型 GPVIの検出を行った。 結果を図 22に示す。 F1232- 7- 1および F1232- 10- 2は ヒ ト GPVI合成べプチドを抗原としたポリクローナル抗体と同様に convulxinで 刺激した洗浄血小板の上清画分試料において、ヒ ト可溶型 GPVIの存在を確認す る事が可能であった。 また、 バッファーのみを添加した洗浄血小板の上清画分 試料では、 F1232 - 7- 1、 F1232-10-2ならびにヒ ト GPVI合成べプチドを抗原とし たポリクローナル抗体によってヒ ト可溶型 GPVIは検出されなかった。このこと 力ゝら、ヒ ト可溶型 GPVIの ELISA法で使用している F1232 - 7- 1および F1230- 10-2 はヒト可溶化型 GPVIを認識していると考えられた。 産業上の利用可能性
[ 0 0 6 5 ]
本発明の測定方法、 測定試薬またはキットにより、 試料中の GPVI、 特に生体 試料中の sGPVI又は mGPVIが高感度に測定しうる。 また、 本発明の測定方法、 測定試薬またはキットを用いて、 sGPVI又は mGPVIを検出、 測定又は定量する ことにより、 血小板活性化もしくは血管内皮傷害の検出、 測定、 定量、 判定も しくは評価、 血小板活性化もしくは血管内皮傷害関連疾患の診断、 罹病性の判 定もしくは発症リスクの評価、抗血小板薬、 特に抗 GPVI抗体の奏効する患者の 選別、 それらの投与 （開始） 時期の決定、 及び、 それらの治療効果もしくは副 作用発現の予測、 モニタリングもしくは予後の判定等が可能となる。 配列表フリーテキスト
[ 0 0 6 6 ]
配列番号 1は実施例 1の PCR反応に用いたプライマーの配列である。
配列番号 2は実施例 1の PCR反応に用いたプライマーの配列である。
配列番号 3は実施例 1の PCR反応に用いたプライマーの配列である。
配列番号 4は実施例 1の PCR反応に用いたプライマ一の配列である。 配列番号 5は実施例 1の PCR反応に用いたプライマーの配列である。 配列番号 6は実施例 1の PCR反応に用いたプライマーの配列である。 配列番号 7は実施例 1の PCR反応に用いたプライマーの配列である。 配列番号 8は実施例 1の PCR反応に用いたプライマーの配列である。 配列番号 9は実施例 1の PCR反応に用いたプライマーの配列である。 配列番号 1 0は実施例 1の PCR反応に用いたプライマーの配列である。 配列番号 1 1は実施例 1の PCR反応に用いたプライマーの配列である。 配列番号 1 2は実施例 1の PCR反応に用いたプライマ一の配列である。 配列番号 1 3は実施例 1の PCR反応に用いたプライマーの配列である。 配列番号 1 4は実施例 1の PCR反応に用いたプライマーの配列である。 配列番号 1 5は実施例 2の PCR反応に用いたプライマーの配列である。 配列番号 1 6は実施例 2の PCR反応に用いたプライマーの配列である。 配列番号 1 Ίは実施例 2の PCR反応に用いたプライマーの配列である。

Claims

請 求 の 範 囲
I . 1以上の GPVI特異的結合物質を用いる、 ヒ ト体液中の可溶型 GPVI (sGPVI) の測定方法。
2 . 測定感度が 30pg/ml以下である、 請求項 1の測定方法。
3 . GPVI特異的結合物質が GPVIのループ 2またはループ 9に特異的に結合す る抗体である、 請求項 1又は 2の測定方法。
4 . GPVI特異的結合物質として、 結合部位の異なる 2以上の抗 GPVI抗体を用 いる、 請求項 1ないし 3の何れかの測定方法。
5 . GP.VI特異的結合物質として、 少なくとも GPVIのドメイン 1に特異的に結 合する抗 GPVI抗体及びドメイン 2に特異的に結合する抗 GPVI抗体を用いる、 請求項 4の測定方法。
6 . GPVI特異的結合物質として、 GPVIのループ 2に特異的に結合する抗体及ぴ ループ 9に特異的に結合する抗体を用いる、 請求項 4または 5の測定方法。
7 .サンドィツチ免疫測定方法である、請求項 3ないし 6の何れかの測定方法。
8 . 1以上の GPVI特異的結合物質を含有する、 ヒ ト体液中の sGPVIの測定用の 試薬又はキット。 .
9 . 測定感度が 30pg/ml以下である、 請求項 8の試薬又はキット。
1 0 . GPVI特異的結合物質が GPVIのループ 2またはループ 9に特異的に結合 する抗体である、 請求項 8又は 9の試薬又はキット。
I I . GPVI特異的結合物質として、 結合部位の異なる 2以上の抗 GPVI抗体を 含有する、 請求項 8ないし 1 0の何れかの試薬又はキット。
1 2 . GPVI特異的結合物質として、 少なくとも GPVIのドメイン 1に特異的に 結合する抗 GPVI抗体抗体及びドメイン 2に特異的に結合する抗 GPVI抗体を含 有する、 請求項 8ないし 1 1の何れかの試薬又はキット。
1 3 . GPVI特異的結合物質として、 GPVIのループ 2に特異的に結合する抗体及 ぴループ 9に特異的に結合する抗体を含有する、 請求項 8ないし 1 2の何れか の試薬又はキット。
1 4 . サンドイッチ免疫測定法に用いる、 請求項 8ないし 1 3何れかの試薬又 はキット。
1 5 . 請求項 1ないし 1 4の何れかの sGPVIの測定方法、 測定試薬又は測定キ ットを用いて、 ヒ ト体液中の sGPVIを検出、 測定又は定量する工程を含む、 血 小板活性化もしくは血管内皮傷害の検出、 測定又は定量するための方法。
1 6 . 請求項 1ないし 1 4の何れかの sGPVIの測定方法、 測定試薬又は測定キ ットを用いて、 ヒ ト体液中の sGPVIを検出、 測定又は定量する工程を含む、 血 小板活性化もしくは血管内皮傷害関連疾患の診断方法。
1 7 . 前記疾患が血栓性疾患もしくは塞栓性疾患又は動脈硬化性疾患である、 請求項 1 6の診断方法。
1 8 . 前記疾患が狭心症、 心筋梗塞、 心臓病、 脳梗塞及び痴呆からなる群から 選ばれるいずれかである、 請求項 1 6又は 1 7の診断方法。
1 9 . 請求項 1ないし 1 4の何れかの sGPVIの測定方法、 測定試薬又は測定キ ットを用いて、 ヒト体液中の sGPVIを検出、 測定又は定量する工程を含む、 コ ラーゲン惹起血小板活性化又は凝集を抑制する抗血小板薬が奏効する患者の選 別方法。
2 0 . 前記抗血小板薬が抗 GPVI抗体又は GPVI-Fcである、請求項 1 9の選別 方法。
2 1 . 前記患者の疑われる疾患が血小板活性化もしくは血管内皮傷害関連疾患 である、 請求項 1 9又は 2 0の選別方法。
2 2 . 前記患者の疑われる疾患が血栓性疾患もしくは塞栓性疾患又は動脈硬化 性疾患である、 請求項 1 9ないし 2 1の何れかの選別方法。
2 3 . 前記患者の疑われる疾患が狭心症、 急性心筋梗塞、 心臓病、 脳梗塞及び 痴呆からなる群から選ばれるいずれかである、 請求項 1 9ないし 2 2の何れか の選別方法。
2 4 . 請求項 1ないし 1 4の何れかの sGPVIの測定方法、 測定試薬又は測定キ ットを用いて、 ヒ ト体液中の sGPVIを検出、 測定又は定量する工程を含む、 コ ラーゲン惹起血小板活性化又は凝集を抑制する抗血小板薬の投与時期を決定す る方法。
2 5 . 請求項 1ないし 1 4の何れかの sGPVIの測定方法、測定試薬又は測定キ ットを用いて、 ヒト体液中の sGPVIを検出、 測定又は定量する工程を含む、 コ ラーゲン惹起血小板活性化又は凝集を抑制する抗血小板薬の治療効果もしくは 副作用発現の予測方法、 モニタリング方法又は予後の判定方法。
2 6 . 1以上の GPVI特異的結合物質を含有する、請求項 1 5ないし 2 5の何れ かの方法のための試薬又はキット。
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