WO2007108464A1 - 哺乳動物由来細胞質シアリダーゼに対する抗体 - Google Patents

哺乳動物由来細胞質シアリダーゼに対する抗体 Download PDF

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WO2007108464A1
WO2007108464A1 PCT/JP2007/055633 JP2007055633W WO2007108464A1 WO 2007108464 A1 WO2007108464 A1 WO 2007108464A1 JP 2007055633 W JP2007055633 W JP 2007055633W WO 2007108464 A1 WO2007108464 A1 WO 2007108464A1
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antibody
sialidase
amino acid
protein
seq
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Application number
PCT/JP2007/055633
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English (en)
French (fr)
Inventor
Akiko Furuya
Mitsuo Satoh
Yutaka Kanda
Katsuhiro Mori
Reiko Kamochi
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. filed Critical Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4725—Proteoglycans, e.g. aggreccan
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins

Definitions

  • the present invention relates to an antibody that binds to a mammal-derived cytoplasmic sialidase and recognizes the three-dimensional structure of a mammal-derived cytoplasmic sialidase, a method for producing a glycoprotein using the antibody, and a saccharide obtained by the method It relates to protein.
  • Sialidase is a kind of exo-type a-glycosidase that catalyzes the initial reaction of glycan degradation by removing sialic acid, a non-reducing terminal force of glycans added to glycoproteins.
  • the function of many glycoprotein molecules changes when sialic acid residues are also removed from the non-reducing end of sugar chains added to glycoproteins by sialidase. So far, sialidase derived from bacteria and viruses has been used to elucidate the function of sialidase. For details on how sialic acid is eliminated in the body of mammals, The power was not analyzed.
  • Non-patent Document 1 Non-patent Document 1
  • Non-patent Documents 2 and 3 Mammalian endogenous sialidase is localized in the cytoplasm (Non-patent document 4), lysosomal lumen (Non-patent document 5), lysosomal membrane (Non-patent document 6) and plasma membrane (Non-patent document 6). Enzymatic properties such as substrate specificity are different.
  • cytoplasmic sialidase gene (NEU2 sialidase) as the first mammalian sialidase was revealed (Non-patent document 7), followed by lysosomal sialidase (NEU1) (Non-patent document 8) and plasma membrane sialidase (NEU3) (non-patent document 7).
  • the gene of Patent Document 9) has been cloned.
  • the amino acid sequence is conserved.
  • amino acid residues involved in sialidase activity are highly conserved and have high similarity in amino acid conformation.
  • the crystal structure of Salmonella LT2-derived sialidase (Non-patent Document 10) is similar to the crystal structure of human NEU2 sialidase (Non-patent Document 11).
  • NEU2 sialidase gene encodes a single-chain polypeptide having 1679 base strength and 379 amino acid residues.
  • NEU2 sialidase has two aspartic acid box sequences, is rich in cysteine residues and
  • This enzyme is present in the cytoplasm, works near neutral pH, and uses oligosaccharides, gandariosides, and glycoproteins as substrates. In particular, it has been reported that it is highly expressed in testis and skeletal muscle and plays an important role in the differentiation of skeletal muscle cells! Speak (Non-Patent Document 12).
  • Non-patent document 13 Chinese hamster ovary (CHO) cells (Non-patent document 13), human skeletal muscle (Non-patent document 14), mouse brain (Non-patent document 15) and mouse thymus (Non-patent document 16) Isolated
  • glycoproteins that are considered to be applied to pharmaceuticals are produced using genetic recombination techniques, and are derived from mammalian cells, such as CHO cells derived from Chinese nomster ovary tissue and mouse myeloma. Manufactured using cells as host cells.
  • mammalian cells such as CHO cells derived from Chinese nomster ovary tissue and mouse myeloma.
  • CHO cells derived from Chinese nomster ovary tissue and mouse myeloma.
  • a sugar chain that can exhibit optimal pharmacological activity is not always added.
  • it is important to control sialic acid modification in the production of glycoprotein drugs because the addition of non-reducing terminal sialic acid on the sugar chain can have a significant impact on the pharmacological activity of the administered glycoprotein. is there.
  • glycoprotein drugs in which sialic acid addition is important for the expression of pharmacological activity include erythroboyetin (EPO) and tissue-type plasminogen activator (t-PA).
  • Non-patent Documents 17 to 19 The reason for this is that when sialic acid is eliminated, a galactose residue is exposed on the non-reducing end side, and is captured and rapidly degraded by the nascent glycoprotein receptor (galactose receptor) localized in the liver. Yes (Non-patent document 20).
  • Glycoprotein drugs are secreted and produced by culturing transformants that have been established by stably incorporating cDNAs encoding these glycoproteins into host cells under appropriate culture conditions.
  • Production cell strength Glycoproteins secreted into the culture medium are added with a variety of sugar chains based on the sugar chain-modifying mechanism inherent to the cell. In many cases, the non-reducing terminal side of the mature sugar chain It is modified with a negatively charged sialic acid residue.
  • the rate of addition varies depending on the production strain and culture method, and it is difficult to protect the non-reducing ends of all sugar chains with sialic acid. In the production of this glycoprotein, one of the major causes of decreasing the rate of calorie with sialic acid is the involvement of sialidase in production cells.
  • Non-patent Document 21 In the production of glycoprotein, sialidase, particularly NEU2 sialidase, leaks and accumulates in the culture medium from the cytoplasm of the production cells (Non-patent Document 21), and the glycoprotein sugar chain accumulated in the culture medium is also sial. The elimination of acid has become a component (Non-patent Document 22). This has been verified by production studies of multiple types of recombinant glycoproteins using CHO cells as hosts (Non-patent Documents 23 and 24).
  • Culture engineering techniques that have been developed so far to prevent the reduction of sialic acid addition rate include optimization of various culture parameters (Non-patent Document 25, Patent Document 1) and inhibition of sialidase. Examples thereof include a method of adding a substance having activity to a medium component (Non-patent Document 24, Patent Document 2).
  • the optimization of the culture parameters is carried out with the aim of maintaining the viability of the production cells at the highest possible level for a long period of time in the culturing process, since leakage of cytoplasmic power of sialidase occurs with decreasing cell viability.
  • This method a slight improvement in the rate of sialic acid addition to the glycoprotein is observed, but this is not a sufficient amount.
  • a method of adding a sialidase inhibitor as a medium component includes adding a specific inhibitor such as N-acetyl-2-2,3-dehydro-2-deoxyneuraminic acid (Neu5Ac2en).
  • a specific inhibitor such as N-acetyl-2-2,3-dehydro-2-deoxyneuraminic acid (Neu5Ac2en).
  • methods for adding relatively high concentrations of copper ions have been developed.
  • it is considered that there is a problem that the economic burden related to the preparation of the culture medium and waste liquid treatment is large. ing.
  • a new non-naturally occurring compound such as Neu5Ac2en for pharmaceutical production it is necessary to consider the safety of the substance itself or a derivative produced by the change of this substance during culture. Must not.
  • Non-patent Document 3 The method of inhibiting NEU2 sialidase mRNA splicing by antisense is to specifically hybridize with NEU2 sialidase mRNA based on the NEU2 sialidase cDNA sequence of the cloned CHO cells.
  • Non-Patent Document An anti-sense RNA is designed, a DNA construct for stable expression of this anti-sense RNA is introduced into glycoprotein-producing cells, and a method that can suppress the expression of NEU2 sialidase has been developed (Non-Patent Document) 26).
  • the NEU2 sialidase antisense RNA expression vector is stably introduced into CH 0 cells that produce thread-reversed DNase, thereby suppressing cytoplasmic sialidase activity to 40% and sializing the product DNase. Increases acid addition rate by up to 37%. Inhibition rate of cytoplasmic sialidase activity is insufficient.
  • Patent Document 3 As an antibody that reacts with sialidase, an antibody obtained by immunizing a partial peptide of NEU2 (Patent Document 3) has been reported. However, it is a monoclonal antibody that binds to cytoplasmic sialidase and recognizes the three-dimensional structure of mammalian cytoplasmic sialidase! None before has it been known! /.
  • Non-patent literature l Trends Biochem. Sci "10, 357-360 (1985); Glycobiology, 3, 201-217 (1993)
  • Non-Patent Document 2 J. Biochem., 107, 794-798 (1990)
  • Non-Patent Document 3 Glycoconjugate Journal vol.17,301-306 (2000)
  • Non-Patent Document 4 Journal of Biological Chemistry vol.260,6710-6716 (1985)
  • Non-Patent Document 5 European Journal of Biochemistry vol.141, 75-81 (1984)
  • Non-Patent Document 6 Journal of Biochemistry vol.107,787-793 ( 1990)
  • Non-Patent Literature 7 Journal of Biological Chemistry vol.268,26435- 26440 (1993)
  • Non-Patent Literature 8 Genes and Development vol.10,3156- 3169 (1996)
  • Non-Patent Literature 9 Journal of Biological Chemistry vol.274,5004- 5011 (1999)
  • Non-Patent Document 10 Pro ⁇ Natl.Acad.Sci.USA vol.90,9852--9856 (1993)
  • Non-Patent Document 11 Journal of Biological Chemistry vol.280, 469-475 (2005)
  • Non-Patent Document 12 Biochem.Biophys.Res.Commun.vol.221, 826-830 (1996)
  • Non-patent literature 13 Glycobiology vol.4, 367-373 (1994)
  • Non-Patent Document 14 Genomics vol.57, 137-143 (1999)
  • Non-patent document 15 Biochem.Biophys.Res.Commun.vol.258, 727-731 (1999)
  • Non-patent document 16 Biochem.Biophys.Res.Commun.vol.286, 250-258 (2001)
  • Non-Patent Literature 18 European Journal of Biochemistry 194, 457 (1990)
  • Non-Patent Literature 19 Journal of Biological Chemistry 265, 12127 (1990)
  • Non-Patent Literature 20 Blood 73, 84 (1989)
  • Non-Patent Document 21 Glycobiology vol.3, 455-463 (1993)
  • Non-Patent Document 22 BIO / TECHNOLOGY vol.13, 692 (1995)
  • Non-Patent Document 23 Biotechnology Progress vol.12, 559-563 (1996)
  • Non-Patent Document 24 Biotechnology Progress vol.20, 864-871 (2004)
  • Non-Patent Document 25 Cytotechnology vol.15, 217-221 (1994)
  • Non-Patent Document 26 Biotechnology and Bioengineering vol.60, 589-595 (1998) Patent Document 1: US Pat. No. 5,705,364
  • Patent Document 2 US Pat. No. 6,528,286
  • Patent Document 3 Japanese Translation of Japanese Patent Publication No. 8-510133
  • An object of the present invention is to recognize an anti-cytoplasmic sialidase monoclonal antibody that recognizes the three-dimensional structure of a mammal-derived cytoplasmic sialidase and neutralizes a mammal-derived cytoplasmic sialidase activity, and a glycoprotein using the antibody And a glycoprotein composition obtained by the production method.
  • the present invention relates to the following (1) to (11).
  • An anti-cytoplasmic sialidase monoclonal antibody that recognizes the three-dimensional structure of a mammal-derived cytoplasmic sialidase and neutralizes the mammal-derived cytoplasmic sialidase activity.
  • the monoclonal antibody according to (1) above which is a monoclonal antibody that binds to at least two types of mammalian cytoplasmic sialidases.
  • Cytoplasmic sialidase force The monoclonal antibody according to the above item (1) or (2), which is a protein encoded by a DNA selected from the following group forces (a) to (h).
  • cytoplasmic sialidase is a protein selected from the following group forces (a) to (1): (a) a protein having an amino acid sequence ability represented by SEQ ID NO: 5;
  • a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, and having a sialidase activity.
  • Monoclonal antibody force The antibody according to any one of (1) to (5) above, wherein the following (a) to (c) group force is also selected. (a) an antibody produced from Hypridoma;
  • a fusion antibody comprising (a) or (b).
  • Monoclonal antibody power The antibody according to any one of (1) to (6) above, which is a monoclonal antibody in which the following group powers (a) to (d) are selected.
  • a method for producing a glycoprotein composition by culturing cells characterized in that the monoclonal antibody described in (1) to (7) above, wherein the shear force is 1 is added to the culture solution
  • a method for producing a glycoprotein composition A method for producing a glycoprotein composition.
  • glycoprotein composition produced is compared with the glycoprotein composition obtained in the case where the monoclonal antibody according to any one of (1) to (7) above is not added to the culture solution.
  • the present invention provides an anti-cytoplasmic sialidase monoclonal antibody that recognizes the three-dimensional structure of a cytoplasmic sialidase derived from a mammal and neutralizes the cytoplasmic sialidase activity derived from a mammal.
  • sialic acid can be added to neutralize the activity of mammalian cytoplasmic sialidase.
  • a glycoprotein composition having a sugar chain with a high addition rate can be provided.
  • FIG. 1 Polyacrylamide gel electrophoresis image of E. coli recombinant GST-sialidase
  • FIG. 2 shows the measurement results of GST-sialidase sialidase activity.
  • GST shearidase decomposed the fluorescent substrate in a concentration-dependent manner and showed the shearidase activity with the value shown on the vertical axis. These activities were abolished by the sialidase inhibitor Neu5AC2en.
  • the reactivity in A is shown.
  • the solid line shows the reactivity to GST-sialidase, and the dotted line shows the reactivity to GST.
  • the horizontal axis of the graph represents the antiserum dilution rate, and the vertical axis represents the antibody binding activity.
  • FIG. 4 shows the reactivity of immunized rat serum obtained by immunization with E. coli expressed protein in a nodding ELISA.
  • the solid line shows the reactivity to GST-sialidase, and the dotted line shows the reactivity to GST.
  • the horizontal axis of the graph represents antiserum dilution, and the vertical axis represents antibody binding activity.
  • FIG. 5 shows the reactivity of monoclonal antibody binding ELISA.
  • the horizontal axis of the graph indicates the concentration of the purified antibody, and the vertical axis indicates the antibody binding activity.
  • FIG. 6 shows the neutralizing activity of monoclonal antibodies against GST-sialidase.
  • 1 to 3 indicate 1. Fluorescence intensity of fluorescent substrate only 2. Fluorescence intensity of GST-sialidase + fluorescent substrate 3. Fluorescence intensity of GST-sialidase + fluorescent substrate + sialidase inhibitor.
  • the horizontal axis of the right line graph shows the antibody / sialidase molar ratio, and the vertical axis shows the fluorescence intensity (sialidase activity).
  • FIG. 7 shows neutralizing activity of monoclonal antibodies against CHO-producing sialidase.
  • the results when using Ms705 pKAN-ATIII 27 culture supernatant lot 1 as CHO-producing sialidase are shown.
  • 1 to 3 are: 1. Ms705 pKAN-ATIII strain 27 culture supernatant 1 only fluorescence intensity, 2. Ms705 pKAN-ATIII strain 27 culture supernatant lot 1 + fluorescence substrate fluorescence intensity, 3. Ms705 The fluorescence intensity of pKAN-ATIII 27 strain culture supernatant lot 1 + fluorescent substrate + shearidase inhibitor is shown.
  • the horizontal axis of the line graph indicates the antibody concentration, and the vertical axis indicates the fluorescence intensity.
  • FIG. 8 shows neutralizing activity of monoclonal antibodies against CHO-producing sialidase.
  • the results when using Ms705 pKAN-ATIII 27 culture supernatant lot 2 as CHO-producing sialidase are shown. 1 to 3 in the left bar graph 1.
  • Ms705 pKAN-ATIII 27 culture supernatant 2 only fluorescence intensity
  • 3. Ms705 The fluorescence intensity of pKAN-ATIII strain 27 culture supernatant lot 2 + fluorescent substrate + shearidase inhibitor is shown.
  • the horizontal axis of the line graph indicates the antibody concentration, and the vertical axis indicates the fluorescence intensity.
  • FIG. 9 shows the neutralizing effect of monoclonal antibodies on sialidase derived from rat Myoblast cell line (A-10 strain).
  • the horizontal axis of the graph indicates the concentration of the added monoclonal antibody, and the vertical axis indicates the fluorescence intensity derived from the sialidase activity.
  • ⁇ indicates the fluorescence intensity when Neu5 Ac, a sialidase inhibitor, is added at a final concentration of 5 mM
  • ⁇ indicates the fluorescence intensity when mouse plasma-derived immunoglobulin G is added as a negative control
  • ⁇ indicates KM3627.
  • FIG. 10 shows changes in viable cell density during serum-free fed-batch culture of Ms705 ⁇ - ⁇ 27 strain, which is a cocoon-producing cell line.
  • the horizontal axis shows the number of culture days, and the vertical axis shows the viable cell density.
  • X indicates Ms705 pKAN-ATIII 27 strain
  • ⁇ indicates Ms705 ⁇ - ⁇ 27 strain with 10 ⁇ 3629 added.
  • FIG. 11 shows changes in the survival rate of Ms705 ⁇ - ⁇ 27 strain, a sputum producing cell line, during serum-free fed-batch culture.
  • the horizontal axis represents the number of culture days, and the vertical axis represents the viable cell density, viability, and the amount of soot accumulated in the culture supernatant.
  • X indicates Ms705 pKAN-ATIII 27 strain
  • ⁇ indicates Ms705 pKAN-ATIII 27 strain supplemented with 10 M monoclonal antibody KM3629.
  • FIG. 12 shows changes in the amount of sputum accumulated in the culture supernatant during serum-free fed-batch culture of the sputum-producing cell line Ms705 ⁇ ⁇ - ⁇ 27.
  • the horizontal axis represents the number of culture days, and the vertical axis represents the viable cell density, viability, and the amount of soot accumulated in the culture supernatant.
  • X is Ms705 pKAN-ATIII 27 strain
  • ⁇ is Ms705 pKAN- ⁇ 27 strain
  • 10 ⁇ The cases where the null antibody KM3629 was added are shown.
  • FIG. 13 shows changes in sialidase activity during serum-free fed-batch culture of Ms705 ⁇ - ⁇ 27 strain, a ⁇ -producing cell line.
  • a culture supernatant to which no sialidase fluorescent substrate was added was used as the knock ground.
  • the horizontal axis represents the number of days of culture, and the vertical axis represents the viable cell density, viability, and the amount of soot accumulated in the culture supernatant.
  • X represents Ms705 pKAN-ATIII 27 strain
  • ⁇ represents Ms705 pKAN-ATIII 27 strain added with 10 M monoclonal antibody KM3629.
  • FIG. 14 shows the sialic acid content of sputum in the supernatant on day 9 and day 14 of serum-free fed-batch culture of 27 strain Ms705 ⁇ M- ⁇ , which is a sputum producing cell line.
  • FIG. 15 shows changes in the density of viable cells during serum-free fed-batch culture using the spinner bioreactor of Ms705 ⁇ - ⁇ 27 strain, a sputum-producing cell line.
  • the horizontal axis indicates the number of days of culture, and the vertical axis indicates the viable cell density.
  • FIG. 16 Changes in the survival rate of Ms705 ⁇ - ⁇ 27, a ⁇ -producing cell line, during serum-free fed-batch culture using a spinner bioreactor.
  • the horizontal axis represents the number of culture days, and the vertical axis represents the survival rate.
  • FIG. 17 shows changes in the concentration of sputum accumulated in the culture supernatant during serum-free fed-batch culture using the spinner bioreactor of Ms705 ⁇ - ⁇ 27, a sputum-producing cell line.
  • the horizontal axis represents the number of days of culture, and the vertical axis represents the concentration of sputum accumulated in the culture supernatant.
  • FIG. 18 Changes in the sialidase activity in the culture supernatant of the Ms705 ⁇ M- ⁇ 27 strain, a ⁇ -producing cell line, during serum-free fed-batch culture using a spinner bioreactor.
  • As the knock ground a culture supernatant to which no sialidase fluorescent substrate was added was used.
  • the horizontal axis represents the number of days of culture, and the vertical axis represents the fluorescence intensity at an excitation wavelength of 340 and a detection wavelength of 460 nm.
  • FIG. 19 shows the number of sputum sialic acid in the culture supernatant of a sputum-producing cell line, Ms705 ⁇ - ⁇ 27, in a serum-free fed-batch culture using a spinner bioreactor.
  • the horizontal axis represents the number of culture days, and the vertical axis represents the number of sialic acids.
  • FIG. 20 shows the results of measuring the binding mode of cytosolic sialidase neutralizing antibody to GST-sialidase by the surface plasmon resonance method. 20, 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625 g / mL KM36 The sensorgram obtained when 27 or KM3629 is added to the sensor chip holding GST-sialidase is shown.
  • FIG. 21 Surface plasmon resonance method for the binding of sialidase neutralizing antibodies to GST-sialidase in the presence of peptides corresponding to the three types of loops protruding from the substrate recognition surface of cytoplasmic sialidase. The measurement results are shown.
  • FIG. 22 shows the results of surface plasmon resonance analysis of the binding of KM3629 to GST-sialidase bound to KM3627 and the binding of KM3627 to GST-sialidase bound to KM3629.
  • the broken line indicates the result when the other antibody is added in advance, and the solid line indicates the result when the other antibody is added in advance.
  • the present invention relates to an anti-cytoplasmic sialidase monoclonal antibody that recognizes the three-dimensional structure of a mammal-derived cytoplasmic sialidase and neutralizes the cytoplasmic sialidase activity derived from a mammal.
  • mammals include humans, mice, rats, hamsters and the like.
  • the cytoplasmic sialidase derived from a mammal may be a cytoplasmic sialidase derived from one type of mammal, but is preferably a cytoplasmic sialidase derived from at least two types of mammals.
  • the cytoplasmic sialidase is an enzyme that exists in the cytoplasm and has an activity to catalyze the reaction of removing sialic acid from the non-reducing end of the sugar chain added to the glycoprotein! / Is included.
  • Non-reducing terminal force of sugar chain added to glycoprotein and present in the cytoplasm as an enzyme having an activity of catalyzing a reaction to remove sialic acid is, for example, producing a glycoprotein using the above-mentioned cells.
  • Examples include NEU2 sialidase.
  • NEU2 sialidase includes the following proteins (a), (b), (c), (d), (e), (1), (g) or a protein encoded by (h) DNA, Or (0, (j), (k), (1), (m), (n), (o), (p), (q) , (R), (s) or (t) protein.
  • (0) a protein having an amino acid sequence ability in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and Z or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 and having a sialidase activity;
  • DNA that hybridizes under stringent conditions is, for example, DNA such as DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2, 3, or 4 or a fragment thereof.
  • DNA obtained by using the Koguchi-1 'hybridization method or Southern blot hybridization method as a probe.
  • DNA derived from colonies or plaques is immobilized.
  • 0.1-2x concentrated SSC solution composition of 1x concentrated SSC solution is 150mM
  • hybridizable DNA examples include SEQ ID NOs: 1 and 2 DNA having at least 60% homology with the base sequence represented by 3 or 4, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, and even more preferably 90% or more Particularly preferably 95 DNA having homology of at least%, most preferably at least 98% can be mentioned.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, 6, 7 or 8 has one or more amino acid deletions, substitutions, insertions and / or additions, and has a sialidase activity.
  • Proteins are molecular 'Crowung 2nd edition, current' profile Connorez 'in' molecular ⁇ ⁇ ⁇ Biology, Nucleic 'Acid' Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proceedings 'National' Academic 'Science USA ( proc . Natl. Acad. Sci.) USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), etc.
  • it means a protein which can be obtained by introducing a site-specific mutation into DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, 6, 7 or 8.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted, inserted and / or added is one or more, and the number is not particularly limited. However, deletion, substitution, or The number can be added, for example, 1 to several tens, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and further preferably 1 to 5.
  • the protein having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, 6, 7 or 8 and having a sialidase activity is SEQ ID NO: 5, 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, particularly preferably 97% or more, most at least 80% or more of the protein having the amino acid sequence described in 6, 7 or 8
  • a protein having a homology of 99% or more and having a sialidase activity is preferable.
  • homology values described in the present invention are values calculated using a homology search program known to those skilled in the art. Examples include numerical values calculated using default parameters in 'Ob' Molecular Biology (J. Mol. Biol), 215, 403 (1990)]. For the amino acid sequence, BLAST2 [Nucleic Acid Res., 25, 3389 (1 997)]; Genome Res., 7, 649 (1997); http: // www. ncbi.nlm.nih.gOv/Education/BLASTinfo/infomation3.html] and numerical values calculated using default parameters.
  • G Cost to open gap
  • 11 for amino acid sequence
  • 2 for -E Cost to extend gap
  • -q penalty for nucleotide mismatch
  • 3 r eward for nucleotide match
  • 10 one W (wordsize) force base ⁇ ⁇ ⁇ 11 residues for lj, 3 residues for amino acid residues
  • X Dropoff (X) for blast extemsions in bits) is 20 for blastn, 25 for programs other than blastn (http: ⁇ www.ncbi.nlm.nih.gov/blastcgihelp.html)
  • 0 Software includes FASTA [Methods in Enzymology, 183, 63 (1990)].
  • the three-dimensional structure of cytoplasmic sialidase may be shifted as long as it has a three-dimensional structure equivalent to the three-dimensional structure that cytoplasmic sialidase can take in the natural state.
  • Examples of the monoclonal antibody in the present invention include the following (a) to (c).
  • a fusion antibody comprising (a) or (b).
  • a cell in which the cytoplasmic sialidase is expressed (2) a gene encoding a cytoplasmic sialidase is inserted into an expression vector, and then the expression vector is introduced into a host cell.
  • a cytoplasmic sialidase produced by a host cell is prepared as an antigen, a cell producing an antibody having antigen specificity is induced from an animal immunized with the antigen, and the cell and myeloma cell are fused.
  • Monoclonal antibodies can be obtained by culturing the hybridoma, or by administering the hybridoma to an animal, causing the animal to undergo ascites tumor, and separating and purifying the culture medium or ascites.
  • any animal to be immunized with an antigen any animal can be used as long as it can produce wild and hybridomas, but mouse, rat, wild, muster, rabbit, etc. are preferably used.
  • Antibodies produced by Hypridoma prepared by obtaining cells having antibody-producing ability from such animals, immunizing the cells with iQ vitro and then fusing with myeloma cells, and the like are also included in the antibodies of the present invention. Is included.
  • Hypridoma KM3627 is produced.
  • Hypridoma KM3627 and KM3629 were incorporated into the Patent Organism Depositary (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Japan) on October 6, 2005, based on the Budapest Treaty. Deposited as FERM BP—10432 and FERM BP 10433!
  • Examples of the recombinant antibody include a human chimeric antibody, a humanized antibody, a human antibody, an antibody produced from a hybridoma or a recombinant antibody! /, An antibody fragment containing any variable region, and the like. Including antibodies produced by genetic recombination.
  • the human chimeric antibody comprises a heavy chain variable region (hereinafter referred to as VH) and a light chain variable region (hereinafter referred to as VL) of an antibody of a non-human animal and a heavy chain constant region (hereinafter referred to as CH) of a human antibody. And an antibody consisting of a light chain constant region (hereinafter referred to as CL).
  • VH heavy chain variable region
  • VL light chain variable region
  • CH heavy chain constant region
  • CL an antibody consisting of a light chain constant region
  • the human chimeric antibody of the present invention obtains cDNA encoding VH and VL from a hyperidoma that produces a monoclonal antibody that binds to cytoplasmic sialidase and recognizes the three-dimensional structure of cytoplasmic sialidase.
  • the CH of the human chimeric antibody may be any as long as it belongs to human immunoglobulin (hereinafter referred to as hlg), but is preferably of the hlgG class, and more preferably hIgGl of the hlgG class, Any of the subclasses such as hIgG2, hIgG3, and hIgG4 can be used.
  • hlg human immunoglobulin
  • hIgG2 hIgG3
  • hIgG4 hIgG4
  • any ⁇ class can be used as long as it belongs to hlg! /, And those of the ⁇ class can be used.
  • a humanized antibody is an antibody obtained by grafting the VH and VL CDR amino acid sequences of non-human animal antibodies to the appropriate positions of the human antibody VH and VL !,, and CDR-grafted antibody! .
  • the humanized antibody of the present invention produces a monoclonal antibody that binds to cytoplasmic sialidase and recognizes the three-dimensional structure of cytoplasmic sialidase, and the amino acid sequences of CDRs of VH and VL of antibodies from animals other than humans that also produce hybridoma force.
  • the cDNA encoding the V region grafted into the VH and VL FRs of any human antibody is constructed and inserted into the expression vector for animal cells having the genes encoding the CH and CL of the human antibody, respectively.
  • An antibody expression vector is constructed and introduced into animal cells for expression and production.
  • the VH and VL FR amino acid sequences of human antibodies may be any amino acid sequences as long as they are human antibody-derived VH and VL FR amino acid sequences.
  • the CH of the human rabbit antibody is preferably hlgG class if it belongs to hlg! /, But it is preferably of hlgG class, and hlgG1, hIgG2, hIgG3 belonging to hlgG class. HIgG4 and any subclass can be used.
  • the CL of human rabbit antibody may be any of those belonging to hlg, and those of ⁇ class or e class can be used.
  • a human antibody originally refers to an antibody that naturally exists in the human body, but a human antibody phage library prepared by recent advances in genetic engineering, cell engineering, and developmental engineering techniques. Also included are antibodies obtained from antibody-producing transgenic animal power.
  • the antibody naturally occurring in the human body can be cultured by isolating human peripheral blood lymphocytes, infecting and immortalizing EB virus, etc., and cloning the lymphocytes that produce the antibody.
  • the antibody can be purified from Seiyo.
  • One human antibody phage library is a library in which antibody fragments such as Fab and scFv are expressed on the phage surface by inserting an antibody gene prepared for human B cell force into the phage gene. From the library, phages expressing an antibody fragment having a desired antigen-binding activity on the surface can be collected using the binding activity to the substrate on which the antigen is immobilized as an index. The antibody fragment can be further converted into a human antibody molecule having two complete heavy chains and two complete light chain forces by genetic engineering techniques.
  • a human antibody transgenic non-human animal refers to an animal in which a human antibody gene is incorporated into cells. Specifically, a transgenic non-human animal producing a human antibody is produced by introducing a human antibody gene into a mouse embryonic stem cell, transplanting the embryonic stem cell to an early embryo of another mouse, and generating it. Can do. In addition, human antibody genes are introduced into animal fertilized eggs. It is also possible to produce a transgenic non-human animal that produces human antibodies by generating the fertilized egg. A method for producing a human antibody from a transgenic non-human animal producing a human antibody is carried out in a normal non-human mammal, and a human antibody hyperidoma is obtained and cultured by a method for producing a hyperidoma. Human antibodies can accumulate in the culture.
  • transgenic non-human animals examples include ushi, hidge, goat, pig, horse, mouse, rat, chicken, monkey, and rabbit.
  • antibody fragment of the present invention examples include Fab, F (ab ′), Fab, and scFv.
  • Examples include peptides containing CDRs.
  • Fab is a fragment obtained by treating IgG with the proteolytic enzyme papain (cleaved at the 224th amino acid residue of the H chain), and about half of the N chain side of the H chain and the entire L chain are disulfide. It is an antibody fragment having an antigen binding activity with a molecular weight of about 50,000 bound by binding.
  • the Fab of the present invention can be obtained by treating a monoclonal antibody that binds to cytoplasmic sialidase and recognizes the three-dimensional structure of cytoplasmic sialidase with proteolytic enzyme papain.
  • the DNA encoding the antibody Fab can be inserted into a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector, and the vector is introduced into prokaryotic or eukaryotic organisms to be expressed and produced. .
  • F (ab ') is the lower part of the two disulfide bonds in the IgG hinge region separated by the enzyme pepsin.
  • F (ab ′) of the present invention binds to cytoplasmic sialidase and is cytoplasmic sialidase.
  • Monoclonal antibodies recognizing the structure of a solid can be obtained by treating with the protease pepsin.
  • the following Fab ′ can be produced by thioether bond or disulfide bond.
  • & has a molecular weight of about 50,000, which is obtained by cleaving the disulfide bond in the hinge region of (&) above.
  • Fab ′ of the present invention can be obtained by treating F (ab ′), which binds to cytoplasmic sialidase and recognizes the three-dimensional structure of cytoplasmic sialidase, with a reducing agent dithiothreitol. Also Is produced by inserting a DNA encoding the Fab ′ fragment of the antibody into a prokaryotic expression vector or a eukaryotic expression vector and introducing the vector into a prokaryotic or eukaryotic organism. Can do.
  • scFv is a VH-P-VL or VL-P-VH polypeptide in which one VH and one VL are linked using an appropriate peptide linker (hereinafter referred to as P).
  • P an appropriate peptide linker
  • the scFv of the present invention obtains cDNA encoding VH and VL of a monoclonal antibody that binds to the cytoplasmic sialidase of the present invention and recognizes the three-dimensional structure of the cytoplasmic sialidase, constructs DNA encoding scFv, It can be produced by inserting DNA into a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector and introducing the expression vector into a prokaryotic or eukaryotic organism.
  • a diabody is an antibody fragment in which scFv is dimerized, and is an antibody fragment having a bivalent antigen-binding activity.
  • the bivalent antigen binding activity can be the same, or one can be a different antigen binding activity.
  • the diabody of the present invention obtains cDNA encoding VH and VL of a monoclonal antibody that binds to the cytoplasmic sialidase of the present invention and recognizes the three-dimensional structure of the cytoplasmic sialidase, and converts the scFv-encoding DNA into the amino acid sequence of P. Is constructed so that its length is 8 residues or less, the DNA is inserted into a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector, and the expression vector is prokaryotic! Spider can be expressed and produced by introduction into eukaryotes.
  • dsFv refers to a polypeptide in which one amino acid residue in each of VH and VL is substituted with a cysteine residue, and bonded via a disulfide bond between the cysteine residues.
  • the amino acid residue to be substituted for the cysteine residue can be selected based on the three-dimensional structure prediction of the antibody according to the method shown by Reiter et al. [Protein Engineering, 7, 697 (1994)].
  • the dsFv of the present invention binds to the cytoplasmic sialidase of the present invention and obtains cDNA encoding the VH and VL of a monoclonal antibody that recognizes the three-dimensional structure of the cytoplasmic sialidase, and constructs a DNA encoding dsFv.
  • the DNA is a prokaryotic expression vector Alternatively, it can be produced by inserting into an eukaryotic expression vector and introducing the expression vector into a prokaryotic or eukaryotic organism.
  • the peptide containing CDR is constituted by including at least one region of CDR of VH or VL. Peptides containing multiple CDRs can be linked directly or via an appropriate peptide linker.
  • the peptide containing CDR of the present invention binds to the cytoplasmic sialidase of the present invention and recognizes the three-dimensional structure of cytoplasmic sialidase.
  • a DNA encoding R is constructed, inserted into a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector, and the expression vector is introduced into prokaryotic or eukaryotic organisms to be expressed from the bottom. can do.
  • the peptide containing CDR is obtained by Fmoc method (fluorylmethyloxycarbol method).
  • the monoclonal antibody of the present invention includes antibodies produced from the above-mentioned hyperidoma, and fusion antibodies in which peptides, proteins, etc. are chemically or genetically bound to recombinant antibodies.
  • the fusion antibody of the present invention binds to the cytoplasmic sialidase of the present invention and recognizes the three-dimensional structure of the cytoplasmic sialidase, the monoclonal antibody H chain or L chain N-terminal side or C-terminal side, monoclonal antibody Chemical methods such as radioisotopes, low molecular weight drugs, high molecular weight drugs, proteins, etc. on appropriate substituents or side chains in sugar chains, as well as sugar chains in monoclonal antibodies, etc. It can be manufactured from Tsujiko by combining with Jinshokan (1994)].
  • a DNA encoding a monoclonal antibody that binds to the cytoplasmic sialidase of the present invention and recognizes the three-dimensional structure of the cytoplasmic sialidase is linked to a DNA encoding the protein to be bound and inserted into the expression vector.
  • the expression vector can be produced by introducing the expression vector into an appropriate host cell for expression.
  • radioisotope examples include 131 ⁇ and 125 ⁇ , and can be bound to an antibody by, for example, the chloramine T method.
  • alkylating agents such as nitrogen mustard and cyclophosphamide, metabolic inhibitors such as 5-fluorouracil and methotrexate, daunomycin, bleomycin, mitomycin C, daunorubicin, doxorubicin and the like.
  • Anticancer agents such as antibiotics, plant anolekaloids such as vincristine, vinblastine, vindesine, hormonal agents such as tamoxifen, dexamethasone [Clinical Oncology, edited by Japanese Society of Clinical Oncology, Cancer and Chemotherapy (1996)], or Hyde mouth cortisone , Steroids such as prednisone, non-steroids such as aspirin and indomethacin, immunomodulators such as gold zomarate and persilamine, immunosuppressants such as cyclophosphamide and azathioprine, chlorfe- maleate Min, anti-inflammatory agents, such as antihistamines such as Kuremashichin etc.
  • daunomycin and antibody can be bound by binding between daunomycin and the amino group of the antibody via dartal aldehyde, or binding the amino group of daunomycin and the carboxyl group of the antibody via water-soluble carpositimide.
  • Examples of the polymer drug include polyethylene glycol (hereinafter referred to as PEG), albumin, dextran, polyoxyethylene, styrene maleic acid copolymer, polybutyropyrrolidone, pyran copolymer, and hydroxypropyl methacrylamide. It is done.
  • a method of conjugating PEG with an antibody includes a method of reacting with a PEGylation modifying reagent [Bioconjugate Pharmaceutical, Yodogawa Shoten (1993)].
  • PEGylation modifying reagents include lysine ⁇ -amino group modifiers (JP-A 61-178926), aspartic acid and glutamic acid carboxyl group modifiers (JP-A 56-23587), arginine gua- Examples thereof include a modifier for a dino group (JP-A-2-117920).
  • Examples of the protein include cyto force-in which activates immunocompetent cells, such as human interleukin 2, human granulocyte macrophage colony stimulating factor, human macrophage colony stimulating factor, and human interleukin 12.
  • toxins such as ricin and diphtheria toxin having an activity of directly damaging cancer cells can be used.
  • a fusion antibody with a protein cDNA encoding the protein is linked to cDNA encoding the antibody or antibody fragment, and DNA encoding the fusion antibody is constructed, and the DNA is used for prokaryotic or eukaryotic organisms. Inserted into an expression vector and the expression vector is either prokaryotic or eukaryotic The fusion antibody can be produced by expressing it in
  • the monoclonal antibody of the present invention include a monoclonal antibody produced by hybridoma KM3627 (FER M BP-10432) and a monoclonal antibody produced by Hypridoma KM3629 (FE RM BP-10433).
  • the present invention also relates to a method for producing a glycoprotein composition, characterized in that, in the method for producing glycoprotein by culturing cells, the above-mentioned monoclonal antibody is added to a culture solution.
  • the monoclonal antibody can be added to the culture medium as long as the host cells that produce the glycoprotein composition are cultured and grown, but the cell viability is high and the state is maintained. It is particularly preferable to add at the beginning of the culture, which is preferably added to.
  • the state of high cell viability is at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, and most preferably 100%.
  • Adding to the culture medium at the start of culture means adding the above-mentioned monoclonal antibody to the basal medium in advance, or adding the above-mentioned monoclonal antibody to the culture medium containing the seeded cells.
  • the amount of the monoclonal antibody described above added to the medium is such that the final concentration is 0.1 ⁇ g / mL to 100 mg / mL, preferably 1 ⁇ g / mL to 10 mg / mL, more preferably 10 ⁇ g / mL. ⁇ lmg / mL, more preferably 10 ⁇ g / mL to 100 ⁇ g / mL.
  • the cell culture method includes any culture method as long as it is a method capable of producing the target glycoprotein without limitation.
  • methods that can produce the target glycoprotein include batch culture, fed-batch culture, reflux culture, high-density maintenance culture, microcarrier culture, and soft agar culture.
  • a glycoprotein composition according to the present invention wherein the antibody of the present invention is added to a culture solution
  • V production methods are also included.
  • a production method using a host cell into which a gene encoding a glycoprotein has been introduced an embryonic stem cell or a fertilized egg cell of a non-human animal into which a gene encoding a glycoprotein has been introduced into an early stage of a non-human animal
  • Examples include a method of producing using cells of a transgenic non-human animal generated after transplantation into an embryo.
  • a mammal-derived cell is preferably used as long as it can be any cell that can produce a glycoprotein composition.
  • mammalian cells include Chinese nomstar ovarian tissue-derived cells (CHO cells), rat myeloma cell line YB2Z0 cells, mouse myeloma cell line NSO cells, mouse myeloma cell line SP2Z0—Agl4 cells, and Syrian cells.
  • Hamster kidney tissue-derived BHK cells (ATCC CCL-10), MDCK (ATCC CCL-34), PER-C6 TM, human NM-F9 cells, human HEK293 cells, hyperpridoma cells, human leukemia cell line Namaluba cells, embryos Examples include sex stem cells and fertilized egg cells.
  • CHO cells include CHO-K1 strain (ATCC CCL-61), CHOZdhfr- strain (ATCCCRL-9096), Pro5 strain (ATCC CRL-1781), and commercially available CHO-S strain (Invitrigen Cat # 11619). Alternatively, sub-strains obtained by acclimating these cells to a serum-free medium can be used.
  • Examples of rat myeloma cells include Y3 Agl.2.3. (ATCC CRL-1631), Y0 (ECACC N .: 85110501), YB2Z0 (ATCC CRL 1662), and mouse cells such as NS 0 (ATCC CRL-1827). , Sp2 / 0 (ATCC CRL-1581), etc., and myeloma cells or myeloma cell line hybrid cells, or substrains (ATCC CRL-1581.1) in which these strains are conditioned to serum-free medium, etc. .
  • Examples of human cells include PER. C6 (ECACC 96022940), or substrains obtained by acclimating these strains to serum-free medium.
  • cells having properties equivalent to these cells obtained by subjecting these cells to mutation treatment or cell fusion with B cells obtained by immunizing a non-human mammal with an antigen are also available. It is contained in cells derived from mammals.
  • a host cell into which a gene encoding a glycoprotein is introduced includes an N-glycoside-linked complex type sugar chain reducing terminal at the 6th position of N-acetylyldarcosamine.
  • a host cell that is resistant to a lectin that recognizes a sugar chain structure to which the first position of the amino acid is bonded for example, a composition that also has glycoprotein molecular strength having an N-glycoside-linked complex sugar chain, Of all N-glycoside-bonded complex sugar chains contained in glycan, the glycoprotein thread having a sugar chain ratio of 20% or more, wherein fucose is bound to N-acetyl darcosamine at the sugar chain reducing end.
  • Examples of the host cell having the ability to produce an adult compound include cells in which the activity of at least one protein listed below is reduced or inactivated.
  • a host cell in which a gene encoding a1,6-fucosyltransferase in the host cell is knocked out is mentioned (WO02 / 31140, WO03 / 85107, WO03 / 85102).
  • the enzyme protein involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose includes any enzyme that is involved in the synthesis of sugar nucleotide GDP-fucose, which is the source of fucose to sugar chains in the cell.
  • the Examples of enzymes involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose include enzymes that affect the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose.
  • the intracellular sugar nucleotide GDP-fucose is supplied by the de novo synthesis pathway or the Salvage synthesis pathway. Therefore, all enzymes involved in these synthetic pathways are included in enzymes involved in the synthesis of intracellular GDP-fucose.
  • Enzymes involved in the de novo synthesis pathway of intracellular sugar nucleotides GDP-fucose include GDP-mannose 4,6-dehydratase (GDP-mannose 4,6-dehydratase; hereinafter referred to as GM D), (JDP keto-ri- deoxymannose 3,5- epimerase, 4,6-reductase (LJDP keto-deoxymannose 3,5-epimerase, 4,6-reductase; hereinafter referred to as Fx).
  • GDP-beta-L-fucose-pyrophosphorylase As an enzyme involved in the Salvage synthesis pathway of intracellular sugar nucleotides GDP-fucose, GDP-beta-L-focose pyrophosphorylase (GDP-beta-L-fucose-pyrophosphorylase) (Hereinafter referred to as GFPP), Fucokinase and the like.
  • Examples of the enzyme that affects the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose include the above-mentioned substances that affect the activity of enzymes involved in the intracellular sugar nucleotide GDP-fucose synthesis pathway, and substances that serve as substrates for the enzyme. Enzymes that affect structure are also included.
  • N-glycoside bond complex type N-glycoside bond complex type N-glycoside bond complex type is an enzyme protein involved in the sugar chain modification in which the 1-position of fucose is ex-linked to the 6-position of N-acetylyldarcosamine at the reducing end. Any enzyme involved in the reaction in which the 6-position of N-acetylyldarcosamine at the sugar chain reducing end and the 1-position of fucose are a-linked is included.
  • N-glycosidic complex type N-acetylyldarcosamine 6-position of the sugar chain reducing end and the enzyme involved in ⁇ -bonding of fucose 1-position are: Any enzyme that affects the reaction in which the 6th position of acetyltilcosamine and the 1st position of fucose bind to a is included. Specifically, ⁇ -1, 6-fucosyltransferase is a-L-fucosidase.
  • N-glycosidic bond As an enzyme that affects the reaction in which the 6-position of N-glycidylcolcamine at the N-glycoside-linked complex type sugar chain reducing terminal and the 1-position of fucose are a-bonded, the above-mentioned N-glycosidic bond is used. It affects the activity of the enzyme involved in the reaction of the 1-position of fucose to the 6-position of N-acetyl darcosamine at the reducing end of the complex-type sugar chain, and the structure of the substance that is the substrate of the enzyme Enzymes that provide are also included.
  • Proteins involved in transport of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose to the Golgi apparatus include intracellular sugar nucleotide GDP-protein involved in transport of fucose to the Golgi apparatus, or intracellular sugar nucleotide GDP- Any protein that affects the reaction of transporting fucose into the Golgi is included.
  • proteins involved in the transport of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose to the Golgi apparatus include the GDP-fucose transporter.
  • a protein that affects the reaction of transporting intracellular sugar nucleotides GDP-fucose into the Golgi apparatus it affects the activity of the proteins involved in the transport of intracellular sugar nucleotides GDP-fucose to the Golgi apparatus. Proteins that give or affect expression are also included.
  • N-glycoside-linked sugar chain N-acetylyldarcosamine 6-position and fucose 1-position of fucose are selected for strains that are resistant to lectins that recognize sugar-linked glycan structures. It is done.
  • any lectin that recognizes a sugar chain structure in which the 6-position of N-glycidylcolcamine at the reducing end of N-glycoside-linked sugar chain and the 1-position of fucose are a-linked any lectin that can recognize the sugar chain structure is used. Any lectin can be used.
  • Lentil lectin LCA Lientil Agglutinin derived from Lens Culinaris
  • Endumen lectin PS A Porous lectin derived from Lens Culinaris
  • Endumen lectin PS A Porous lectin derived from Lens Culinaris
  • Endumen lectin PS A Porous lectin derived from Lens Culinaris
  • Endumen lectin PS A Porous lectin derived from Lens Culinaris
  • Endumen lectin PS A Pureasum sativum-derived Pea Lectin
  • Broad bean lectin VFA Adgglutin in derived from Vicia faba
  • Hiratiyawantake Examples include lectin AAL (Lectin derived from Aleuria aurantia).
  • a cell resistant to lectin refers to a cell whose growth is not inhibited even when an effective concentration of lectin is given.
  • the effective concentration is not less than the concentration at which cells before the genome gene modification (hereinafter referred to as parent strain) cannot grow normally, and preferably the same concentration at which cells before the genome gene modification cannot grow.
  • the concentration is more preferably 2 to 5 times, still more preferably 10 times, and most preferably 20 times or more.
  • the effective concentration of a lectin whose growth is not inhibited may be appropriately determined according to the cell line.
  • the effective concentration of a normal lectin is 10 / zg / mL to 10 mg / mL, preferably 0.5 mg / mL to 2.0. mg / mL.
  • the method for producing a glycoprotein composition using cells includes a method of producing using a host cell into which a gene encoding a glycoprotein has been introduced, and a method other than a human into which a gene encoding a glycoprotein has been introduced.
  • a method of producing using a host cell into which a gene encoding a glycoprotein has been introduced includes a method of producing using a host cell into which a gene encoding a glycoprotein has been introduced, and a method other than a human into which a gene encoding a glycoprotein has been introduced.
  • the glycoprotein composition refers to a composition containing a glycoprotein molecule having a sugar chain in which a sialic acid addition site is present at the non-reducing end.
  • sugar chains that bind to asparagine N-glycoside-linked sugar chains
  • N-glycoside-linked sugar chains have a variety of structures, such as [Biochemical Experimental Method 23—Glycoprotein Sugar Chain Research Method (Academic Publication Center) Atsuko Takahashi (1989)], V Even in the case of misalignment, it has a common core structure shown in the following structural formula (I).
  • the end of the sugar chain that binds to asparagine is called the reducing end, and the opposite side is called the non-reducing end.
  • the N-glycoside-linked sugar chain is a high mannose type in which only mannose binds to the non-reducing end of the core structure, and a galactose-N-acetylcylcosamine (hereinafter referred to as Ga ⁇ GlcNAc) branch to the non-reducing end of the core structure.
  • a complex type (hereinafter also referred to as a complex type) having a structure such as sialic acid or bisecting N-acetylcylcosamine on the non-reducing end side of Ga to GlcNAc. Examples include a hybrid type having both a high mannose type and a complex type branch on the non-reducing terminal side of the structure.
  • N-acetylylgalatatosamine is bonded to the hydroxyl group of serine or threonine, and further, galactose, N-acetylyldarcosamine, N-acetylgalato Examples include samine, sialic acid, or a sugar chain to which sialic acid is bonded, a sugar chain in which xylose is bonded to a hydroxyl group of serine and j8, a sugar chain in which galactose is bonded to a hydroxyl group of hydroxylysine and j8.
  • a sugar chain in which xylose is bonded to the hydroxyl group of serine in a / 3 bond usually has a plurality of sugars bonded to the 4-position of the xylose, and a linear polysaccharide consisting of disaccharides is bonded to the end of the bonded sugar. ing.
  • examples of the substance having such a sugar chain structure include cartilage proteodalycan.
  • examples of the substance having a sugar chain structure in which galactose is ⁇ -bonded to the hydroxyl group of hydroxylysine include collagen.
  • sugar constituting the sugar chain examples include ⁇ -acetylyl darcosamine, ⁇ -acetyl galatatosamine, mannose, galactose, fucose, sialic acid, xylose, and arabinose. May be combined in order.
  • the glycoprotein composition refers to a composition having a glycoprotein molecular force having a ⁇ -glycoside-linked sugar chain or a 0-glycoside-linked sugar chain. Since there are many sugar chains that bind to glycoproteins and their sugar chain structures are diverse, there are many combinations of sugar chains in the sugar chains of glycoproteins. Accordingly, the glycoprotein composition of the present invention includes a composition composed of glycoprotein molecules combined with a single sugar chain structure, and a glycoprotein molecule combined with a plurality of different sugar chain structures. The number of sugar chains can be one or more! /.
  • the glycoprotein composition obtained by the production method of the present invention has a glycoprotein composition as compared with the glycoprotein composition obtained when the above-mentioned monoclonal antibody is not added to the culture solution.
  • a glycoprotein composition having an increased amount of sialic acid per molecule is compared with the glycoprotein composition obtained when the above-mentioned monoclonal antibody is not added to the culture solution.
  • Physiological activity includes affinity between glycoprotein and receptor, half-life time of glycoprotein in the body, change in tissue distribution after administration in blood, interaction with protein necessary for expression of pharmacological activity, etc. Can be given.
  • the composition is composed of glycoprotein molecules having ⁇ -glycoside-bonded complex type sugar chains, and all ⁇ -glycosides contained in the composition
  • a glycoprotein composition in which the proportion of sugar chains in which fucose is not bound to ⁇ -acetylcylcosamine at the sugar chain reducing end of the combined complex-type sugar chains is 20% or more is even better.
  • an antibody composition comprising an antibody molecule having an N-glycoside-bonded complex sugar chain in the Fc region, wherein the N-glycoside-bonded complex sugar chain is N-acetyl at the reducing end of the sugar chain.
  • An antibody composition having a sugar chain in which fucose is bound to darcosamine has high ADCC activity.
  • fucose is bound, and as a sugar chain, fucose is not bound to N-acetyldarcosamine on the reducing end side in the chemical formula shown above. Also, the structure of the sugar chain at the non-reducing end can be quite good!
  • the fact that fucose is not bound to N-acetylyldarcosamine at the sugar chain reducing end means that fucose is not substantially bound.
  • the glycoprotein composition to which fucose is not substantially bound specifically refers to a case where the glycoprotein composition is such that fucose is not substantially detectable in the sugar chain analysis described in 3 below. . To the extent that it cannot be detected substantially means that it is below the detection limit of measurement.
  • glycoprotein composition of the present invention examples include a glycoprotein composition described later, a glycoprotein fragment thereof, a fusion protein composition obtained by fusing two or more glycoproteins or glycoprotein fragments, and the like.
  • Glycoprotein compositions include antibodies, erythropoietin (EPO) [J. Biol. Chem., 252, 5 558 (1977)], thrombopoietin (TPO) [Nature, 369, 533 (1994)] tissue type Plasminogen activator, prolokinase, thrombomodulin, antithrombin III, a 1 antitrypsin, C1 inhibitor, haptoglobin, activated protein C, blood coagulation factor VII, blood coagulation factor VIII, blood coagulation factor IX, blood coagulation factor X, blood coagulation Factor XI, blood clotting factor XII, blood clotting factor XIII, prothrombin complex, fibrinogen, albumin, gonadotropin, thyroid stimulating hormone, epidermal growth factor (EGF), hepatocyte growth factor (HGF), keratinocyte growth factor, activin , Bone morphogenetic factor, granulocyte colony stimulating factor (G-CSF
  • V may be an antibody having such an antigen binding property! /, But an antibody that binds to a tumor-related antigen, an antibody that binds to an antigen associated with allergy or inflammation, or a cardiovascular disease An antibody that binds to an antigen, an antibody that binds to an antigen associated with an autoimmune disease, or an antibody that binds to an antigen associated with a virus or bacterial infection is preferred, and the antibody class is preferably IgG.
  • Anti-GD2 antibodies Anticancer Res., 13, 331-33 6, 1993
  • anti-GD3 antibodies Cancer Immunol. Immunother., 36, 260-266, 1993
  • Anti-GM2 antibody Anti-GM2 antibody
  • Anti-HER2 antibody Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4285-4289, 1992
  • anti-CD52 antibody Nature, 332, 323) -327, 1988
  • anti-MAGE antibody British J.
  • anti-insulin-like growth factor receptor antibody J. Neurosci. Res., 40, 647-659, 1995
  • anti-PMSA antibody J Urology, 160, 2396-24 01, 1998)
  • anti-vascular endothelial growth factor antibody Cancer Res., 57, 4593-4599, 1997)
  • anti-vascular endothelial growth factor receptor antibody Oncogene, 19, 2138- 2146, 2000
  • anti-CA125 antibody anti-17-1A antibody, anti-integrin ⁇ 3 antibody, anti-CD33 antibody, anti-CD22 antibody, anti-HLA antibody, anti-HLA-DR antibody, anti-CD20 antibody, anti-CD19 antibody
  • Examples thereof include an anti-EGF receptor antibody (Immunology Today 21 (8), 403-410 (2000)), an anti-CD10 antibody (American Journal of Clinical Pathology, 113, 374-382, 2000) and the like.
  • Antibodies that bind to antigens related to allergy or inflammation include anti-interleukin-6 antibody (Immunol. Rev., 127, 5-24, 1992), anti-interleukin-6 receptor antibody (Molecular Immunol, 31, 371-381, 1994), anti-interleukin 5 antibody (Immunol. Rev., 127, 5-24, 1992), anti-interleukin 5 receptor antibody, anti-interleukin 4 antibody (Cytokine, 3, 562-567, 1991), anti-interleukin 4 receptor antibody (J. Immunol.
  • anti-tumor necrosis factor antibody Hybridoma, 13, 183-190, 1994
  • anti-tumor necrosis factor receptor antibody Molecular Pharmacol, 58, 237-245, 2000
  • anti-CCR4 antibody Nature, 400
  • anti-chemokine antibody J. Immunol. Meth., 174, 249-257, 1994
  • anti-chemokine receptor antibody J. Exp.
  • Anti-IgE antibody anti-CD23 antibody, anti-CD11a antibody (Immunology Today, 21 (8), 403-410 (2000)), anti-CRTH2 antibody (J Immunol., 162, 1278-1286 (1999)), anti-CCR8 Examples include antibodies (W099 / 25734) and anti-CCR3 antibodies (US6207155).
  • Examples of antibodies that bind to an antigen associated with cardiovascular disease include anti-GpIIb / IIIa antibody (J. Immuno 1..152, 2968-2976, 1994), antiplatelet-derived growth factor antibody (Science, 253, 1129). -1132, 1991), anti-platelet-derived growth factor receptor antibody (J. Biol. Chem., 272, 17400-17404, 199 7) or anti-blood clotting factor antibody (Circulation, 101, 1158-1164, 2000) Can be mentioned.
  • Antibodies that bind to antigens associated with autoimmune diseases include anti-self DNA antibodies (Immunol. Letters, 72 , 61-68, 2000), anti-CDlla antibody, anti-ICAM3 antibody, anti-CD80 antibody, anti-CD2 antibody, anti-CD3 antibody, anti-CD4 antibody, anti-integrin ⁇ 4 j8 7 antibody, anti-CD40L antibody, anti-IL-2 receptor And antibodies (Immunology Today, 21 (8), 403-410 (2000)).
  • anti-gpl20 antibody As an antibody that binds to an antigen associated with virus or bacterial infection, anti-gpl20 antibody
  • cytoplasmic sialidase leaked from cultured cells, produced by genetic engineering Cytoplasmic sialidases, and purified samples that retain the sialidase activity of these cytoplasmic sialidases.
  • the cytoplasmic sialidase leaked from the cultured cells is cultured by culturing the cells using a normal cell culture method, accumulating cytoplasmic sialidase in the culture supernatant, and collecting and purifying from the culture solution. Can be prepared.
  • the genetically modified cytoplasmic sialidase can be prepared, for example, as follows using genetic engineering techniques.
  • a cytoplasmic sialidase cDNA or genomic DNA is prepared.
  • a DNA fragment of an appropriate length containing a portion encoding cytoplasmic sialidase or a portion of the non-translated region is prepared.
  • a recombinant vector is produced by inserting the prepared DNA fragment or the full length downstream of the promoter of an appropriate expression vector.
  • a transformant is obtained by introducing the recombinant vector into a host cell suitable for the expression vector.
  • Transformants are selected using the mRNA level or activity of the introduced cytoplasmic sialidase as an index.
  • the selected transformant is cultured using a normal cell culture method, cytoplasmic sialidase is accumulated in the culture supernatant, and collected and purified from the culture solution, thereby producing the antibody of the present invention.
  • Cytoplasmic sialidase used as an antigen can be prepared.
  • Any host cell can be used as long as it can express the target cytoplasmic sialidase, such as bacteria, yeast, animal cells, insect cells, and plant cells. Specific examples include host cells described in 4. below.
  • the above host cell can be replicated autonomously! /, Or can be integrated into a chromosome, and contains a promoter at a position where DNA encoding cytoplasmic sialidase can be transcribed. Used. Specifically, it is suitable for expression vectors of the type that are transcribed by DNA polymerase II or various host cells described in 4. below. Recombinant vectors can be used.
  • Examples of methods for obtaining cytoplasmic sialidase cDNA and genomic DNA include the methods described below.
  • Total RNA or mRNA is prepared from the tissues or cell strength of various host cells.
  • a cDNA library is prepared from the prepared total RNA or mRNA.
  • a degenerative primer is prepared, and a gene fragment encoding cytoplasmic sialidase is obtained by PCR using the prepared cDNA library as a cage.
  • a cDNA library can be screened to obtain DNA encoding cytoplasmic sialidase.
  • the human or non-human animal thread or tissue or cell mRNA may be a commercially available product (for example, manufactured by Clontech), and the tissue or cell strength of the human or non-human animal may also be as follows. May be prepared.
  • Examples of a method for preparing mRNA as total RNA poly (A) + RNA include an oligo (dT) -fixed cellulose column method (Molecular 'Cloung 2nd Edition).
  • mRNA can be prepared by using commercially available kits such as Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen) and Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia).
  • a cDNA library is prepared from the prepared human or non-human animal tissue or cell mRNA.
  • the cDNA library can be prepared by the method described in Molecular 'Crowing 2nd Edition, Current Protocols in Molecular Biology, A Laboratory Manual, 2nd Ed. (1989), etc., or a commercially available kit.
  • Superscript Plasmid Syste Examples include methods using m for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (manufactured by Life Technologies) and ZAP-cDNA Synthesis Kit (manufactured by STRATAGENE).
  • any phage vector, plasmid vector, etc. can be used as long as it can autonomously replicate in Escherichia coli K12.
  • ZAP Express [Stratagenes, Strategies, 5, 58 (1992)], pBluescript II SK (+) [Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989) )], ⁇ ZAP II (manufactured by STRATAGENE), gtl0, gtl l [DNA cloning, A Practical A pproach], 1, 49 (1985)], ⁇ TriplEx (Clontech), ⁇ ExCell (Pharmacia), pT7 T318U (Pharmacia), pcD2 [Mole. Cell. Biol., 3, 280 (1983)] And pUC18 [Gene, 33, 103 (1985)].
  • Escherichia coli is preferably used as a host microorganism for preparing a cDNA library. Specifically, Escherichia coli XL1-Blue MRF '[Stratagies, Strategies, 5, 81 (1992)], Escherichia coli C600 [Genetics, 39, 440 (1954)], Escherichia Escherichia coli Y1088 [Science, 222, 778 (1983)], Escherichia coli Y1090 [Science, 222, 778 (1983)], Escherichia coli NM522 [Jananore 'Ob' Molecular ⁇ Mol.
  • cytoplasmic sialidase Based on the amino acid sequence of cytoplasmic sialidase, encoding the amino acid sequence Create degenerative primers specific to the 5 'and 3' end of the predicted nucleotide sequence, and use the cDNA library as a saddle-shaped PCR method [PCR Protocols (PCR Protocols ), Academic Press (1990)], a gene fragment encoding cytoplasmic sialidase can be obtained by performing DNA amplification.
  • the obtained gene fragment is a DNA encoding cytoplasmic sialidase, for example, a commonly used nucleotide sequence analysis method such as Sanger et al.'S dideoxy method [Proceedings' Ob 'The National' Academia ⁇ By analyzing using a base sequence analyzer such as Abb PRISM377 DNA Sequencer (Applied Biosystems), such as ⁇ Ob'Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 74, 5463 (1977)] Can be confirmed.
  • a base sequence analyzer such as Abb PRISM377 DNA Sequencer (Applied Biosystems), such as ⁇ Ob'Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 74, 5463 (1977)
  • colony hybridization or plaque hybridization (molecular molecular clones) from cDNA or cDNA library synthesized from mRNA contained in tissues or cells of human or non-human animals. -2nd edition) can be used to obtain cytoplasmic sialidase DNA.
  • PCR is performed using a cDNA or cDNA library that also synthesizes mRNA force contained in tissues or cells of human or non-human animals as a saddle.
  • the cytoplasmic sialidase cDNA can also be obtained by amplification using this method.
  • the nucleotide sequence of the DNA encoding the obtained cytoplasmic sialidase can be determined by using a commonly used nucleotide sequence analysis method such as Sanger et al.'S dideoxy method [Procedidas' Ob The National Academia ⁇ ⁇ DNA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 74, 5 463 (1977)] or ABI PRISM377 DNA Sequencer (Applied Biosystems), etc.
  • the nucleotide sequence of can be determined.
  • a homology search program such as BLAST is used to search a base sequence database such as Genbank, EMBL, and DDBJ. Among them, it can be confirmed that the gene encodes cytoplasmic sialidase.
  • the nucleotide sequence of the gene encoding cytoplasmic sialidase obtained by the above method is as follows:
  • cytoplasmic sialidase is synthesized by using a DNA synthesizer such as DNA synthesizer model 392 (manufactured by Perkin Elmer) using the phosphoramidite method. CDNA can also be obtained.
  • Examples of the method for preparing cytoplasmic sialidase genomic DNA include the methods described below.
  • genomic DNA of cytoplasmic sialidase can be obtained by using a genomic DNA library screening system (Genome Systems) or Universal GenomeWalker TM Kits (CLONTECH).
  • Examples of methods for selecting transformants using cytoplasmic sialidase activity as an index include the following methods.
  • a polyclonal antibody can be prepared by administering the antigen prepared in (1) above to an animal.
  • an antigen having an activity of catalyzing the reaction of removing sialic acid from the non-reducing end of the sugar chain added to the glycoprotein is desirable to use an antigen having an activity of catalyzing the reaction of removing sialic acid from the non-reducing end of the sugar chain added to the glycoprotein.
  • Usagi, goat, rat, mouse, hamster, etc. can be used as an animal to be administered.
  • the dose of the antigen is preferably 50- per animal: LOO ⁇ g.
  • the antigen that is covalently bound to a carrier protein such as keyhole limpet haemocyanin or bovine thyroglobulin. It can be prepared using cell culture technology or gene recombination technology as an antigen.
  • the antigen is administered 3 to 10 times every 1 to 2 weeks after the first administration. On the 3rd to 7th day after each administration, blood is collected from the fundus venous plexus and the serum reacts with the antigen used for immunization.
  • the enzyme immunoassay (ELISA): published by the medical school (1976) ), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)].
  • a polyclonal antibody can be obtained by obtaining serum from a non-human mammal whose serum showed a sufficient antibody titer against the antigen used for immunization, and separating and purifying the serum.
  • Separation and purification methods include centrifugation, salting out with 40-50% saturated ammonium sulfate, precipitation of caprinoleic acid (Antibodies, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), or DEAE. —Seprose column, anion exchange column, protein A or G column, chromatography using a genore filtration column, etc. can be used alone or in combination.
  • Rats whose serum showed a sufficient antibody titer against the antigen prepared in (1) above used for immunization are used as a source of antibody-producing cells.
  • the spleen is removed 3 to 7 days after the final administration of the antigenic substance to the rat showing the antibody titer. [0109] The spleen is shredded in MEM medium (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), loosened with tweezers, centrifuged at 1,200 rpm for 5 minutes, and the supernatant is discarded.
  • the spleen cells of the obtained precipitate fraction were treated with Tris-salt-ammonium buffer (PH 7.65) for 1-2 minutes to remove red blood cells, then washed with MEM medium 3 times. Spleen cells are used as antibody-producing cells.
  • myeloma cells cell lines obtained from mice or rats are used.
  • 8-azaguanine resistant mouse BALB / c-derived myeloma cell line P3-X63Ag8-U1 (hereinafter abbreviated as P3-U1) [Curr. Topics. Microbiol. Immunol, 81, 1 (1978), Europe J. Immunol., 6, 511 (1976)], SP2 / 0-Agl4 (SP-2) [Nature, 276, 269 (1978)], P3—X63—Ag8653 (65 3) [J.
  • MEM medium or PBS diisodium phosphate 1.83 g, monopotassium phosphate 0.21 g, salt 7.65 g, distilled water 1 Wash well with 1 liter, pH 7.2
  • Cytoplasmic sialidase a genetically modified recombinant that has an activity to catalyze the reaction of removing sialic acid from the non-reducing end of the sugar chain added to glycoprotein Cytoplasmic sialidase or a purified preparation that retains sialidase activity is specific for antigen Select a hyperidoma that responds to.
  • enzyme immunoassay include the following methods.
  • the purified sample while retaining the activity is coated on an appropriate plate, and the hyperpridoma culture supernatant or the purified antibody obtained in (d) described below is reacted as the first antibody.
  • an anti-rat or anti-mouse immunoglobulin antibody labeled with a chemiluminescent substance or a radiation compound is reacted and then reacted according to the labeling substance to react specifically with the antigen used for immunization. Selected as a high-pridoma that produces monoclonal antibodies.
  • cloning was repeated twice by limiting dilution (first time using HT medium (medium excluding HAT medium and aminopterin), and the second time using normal medium. ].
  • HT medium medium excluding HAT medium and aminopterin
  • a strain having a strong and strong antibody titer is selected as a hyperidoma strain producing the monoclonal antibody of the present invention.
  • pristane 2, 6, 10, 14-tetramethylpentadecane (Pristane) O. 5ml intraperitoneally and bred for 2 weeks] 8 ⁇ : To L0 week old mice or nude mice, (c) The obtained 5 monoclonal antibody-producing hybridoma cells 5-20 ⁇ 10 b cells of the present invention are injected intraperitoneally. Hypridoma becomes ascites tumor in 10-21 days.
  • Ascites fluid is collected from the ascites-carcinized mouse and centrifuged at 3000 rpm for 5 minutes to remove solids.
  • the monoclonal antibody can be purified and obtained by the same method as used for polyclonal.
  • the antibody subclass is determined using a mouse monoclonal antibody typing kit or a rat monoclonal antibody typing kit.
  • the protein mass is calculated from the Raleigh method or absorbance at 280 nm.
  • Recombinant antibody expression vector is an expression vector for animal cells in which DNA encoding human antibody CH and CL is incorporated. DNA encoding human antibody CH and CL in the expression vector for animal cells Can be constructed by crawling each.
  • the C region of a human antibody can be CH and CL of any human antibody, and includes, for example, CH of the ⁇ 1 subclass of human antibody and CL of the ⁇ class.
  • DNA encoding CH and CL of human antibodies it is preferable to use chromosomal DNA consisting of exons and introns, or cDNA which can use cDNA.
  • Any animal cell expression vector can be used as long as it can incorporate and express a gene encoding the C region of a human antibody. For example, pAGE107 (Cytotechnol., 3, 133 (1990)), pAGE103 (i. Biochem., 101, 1307 (1987), pHSG274 (Ge ne, 27, 223 (1984)), pKCR (Proc.
  • the promoter and enhancer used in the expression vector include SV40 early promoter i. Biochem., 1 01, 1307 (1987)], Morro-1 mouse leukemia virus LTR [: Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 960 (1987)], immunoglobulin heavy chain promoter [Cell, 41, 479 (1985) ] And Enhancer 611, 33, 717 (1983)].
  • Recombinant antibody expression vectors can be used in the type in which the antibody H chain and L chain are on separate vectors, or in the same vector (tandem type). However, it is easy to construct a recombinant antibody expression vector, to be introduced into animal cells, and to balance the expression level of antibody H and L chains in animal cells. Recombinant antibody expression vectors are preferred (CF. Immunol. Methods, 167, 271 (1994)). The recombinant antibody expression vector of the tandem type, p KANTEX93 (WO97Zl0354), pEE18 [Hybridoma, 17, 559 (1998)] and the like.
  • the constructed recombinant antibody expression vector can be used to express human chimeric antibodies and humanized antibodies in animal cells.
  • Non-human animal antibodies for example, cDNAs encoding mouse antibody VH and VL can be obtained as follows.
  • mRNA is extracted from a hybridoma cell producing a mouse antibody or the like to synthesize cDNA.
  • the synthesized cDNA is cloned into a vector such as a phage or plasmid to prepare a cDNA library.
  • a DNA encoding the C region portion or V region portion of the mouse antibody is used as a probe, and a recombinant phage or cDNA containing cDNA encoding VH or VL is isolated.
  • any animal can be used as long as it can produce a high-pridoma cell such as a mouse, rat, mouse, muster, or rabbit.
  • guanidine thiocyanate can also be used.
  • Methods for preparing mRNA from total RNA include oligo (dT) immobilized cellulose cell column method [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)].
  • kits for preparing mRNA from high predoma cells include Fast Track mRNA Isolation Kit (manufactured by Invitrogen), Quick Prep mRNA Purification Kit (manufactured by Pharmacia), and the like.
  • any vector can be used as long as it is a vector into which the cDNA synthesized by using the mRNA extracted from the hyperpridoma cell force as a cocoon can be incorporated.
  • ZAP Express [Strategies, 5, 5 8 (1992)]
  • pBluescript II SK (+) [Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1 989)]
  • ⁇ ZAPII (Stratagene)
  • gtlO gtlO
  • l gtl l DNA Cloning: A Practical Approach, I, 49 (1985)]
  • Lambda BlueMid (Clontech)
  • X ExCell pT7T3 18U (Pharmacia)
  • pcD2 [Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983) )]
  • pUC18 Gene, 33, 103 (1985)].
  • any one can be used as long as it can introduce, express and maintain the cDNA library.
  • XL 1-Blue MRF [Strategies, 5, 81 (1 992)], C600 [Genetics, 39, 440 (1954)], Y1088, Y1090 [Science, 222, 778 (1983)], NM522 Q1. Mol Biol., 166, 1 (1983)], K802 Q [. Mol. Biol., 16, 118 (1966)] 3 ⁇ 4U iM105 [Gene, 38, 275 (1985)]
  • cDN encoding VH or VL of non-human animal antibody from cDNA library A clone can be selected by using a collodium hybridization method or a plaque hybridization method using an isotope or fluorescently labeled probe [Molecula r lonmg, A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]. In addition, a primer is prepared and a cDNA or cDNA library synthesized from mRNA is used as a cage.
  • PCR method Polym erase chain reaction
  • the cDNA selected by the above method is cleaved with an appropriate restriction enzyme or the like, and then cloned into a plasmid such as pBluescript SK (-) (Stratagene), and a commonly used nucleotide sequence analysis method such as Sanger. (Sanger, F.) et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)] and the like, and a base sequence automatic analyzer such as an ALF DNA sequencer (Pharmacia).
  • a plasmid such as pBluescript SK (-) (Stratagene)
  • a commonly used nucleotide sequence analysis method such as Sanger. (Sanger, F.) et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)] and the like
  • a base sequence automatic analyzer such as an ALF DNA sequencer (Pharmacia
  • amino acid sequences of CDRs of VH and VL are compared with those of known antibodies VH and VL [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)]. Can be found. [0129] Furthermore, any database using the complete amino acid sequences of VH and VL, for example, BLAST method for SW ISS-PROT, PIR-Protein, etc. ⁇ . Mol. Biol., 215, 403 (1990)] etc. The novelty of the sequence can be examined by performing a homology search of the sequences.
  • each of the cDNAs can be cloned to construct a human chimeric antibody expression vector.
  • each cDNA encoding VH or VL of a non-human animal antibody may be obtained by using the nucleotide sequence of VH or VL of a non-human animal antibody and the 5 'end of CH or CL of a human antibody.
  • a recombinant antibody expression vector according to (1) of this section 2 which is ligated to a synthetic DNA comprising a base sequence on the side and having an appropriate restriction enzyme recognition sequence at both ends, respectively.
  • a human chimeric antibody expression vector can be constructed by cloning each of the genes encoding CH or CL upstream so that they are expressed in an appropriate form.
  • cDNAs encoding the non-human animal antibodies VH or VL were amplified by PCR using synthetic DNAs with appropriate restriction enzyme recognition sequences at both ends, respectively. It can also be cloned into the recombinant antibody expression vector described in 1.
  • a cDNA encoding the humanized antibody VH or VL can be constructed as follows. First, the amino acid sequence of the VH or VL framework region (hereinafter referred to as FR) of the human antibody to be grafted with the VH or VL CDR amino acid sequence of the target non-human animal antibody is selected. Any amino acid sequence derived from a human antibody can be used as the amino acid sequence of VH of human antibody or FR of VL. For example, human amino acid VH or VL FR amino acid sequences registered in databases such as Protein Data Bank, human antibody VH or VL FR subgroup consensus amino acid sequences [sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept.
  • the designed amino acid sequence is converted into a DNA sequence in consideration of the frequency of use of cotton in the nucleotide sequence of the antibody gene [sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)].
  • Based on the designed DNA sequence several synthetic DNAs with a length of around 100 bases are synthesized, and PCR is performed using them. In this case, it is preferable to design six synthetic DNAs for both the H and L chains, based on the PCR reaction efficiency and the length of DNA that can be synthesized.
  • the recombinant antibody expression vector constructed in (1) of this section 2 can be easily humanized.
  • CDNA encoding the VH or VL of the conjugated antibody can be cloned.
  • the amplified product is cloned into a plasmid such as pBluescript SK (-) (Stratagene), the nucleotide sequence is determined by the method described in (2) of this section 2, and the desired DNA sequence is determined.
  • a plasmid having a DNA sequence encoding the amino acid sequence of the VH or VL of the antibody is obtained.
  • Humanized antibodies can be obtained by transplanting only the VH and VL CDRs of the target non-human animal antibody into the VH and VL FRs of the human antibody, and their antigen-binding activity is higher than that of the original non-human animal antibody. [BIOZTECHNOLOGY, 9, 266 (1991)]. This is because, in the VH and VL of the original non-human animal antibody, not only CDR but also some amino acid residues of FR are directly or indirectly involved in antigen binding activity. Residual force It is considered that VH and VL of human antibodies change to different amino acid residues with the SCDR transplantation. In order to solve this problem, humanized antibodies have anti-antibodies directly within the FR amino acid sequences of VH and VL of human antibodies.
  • Modification of FR amino acid residues of human antibody VH and VL can be achieved by performing the PCR method described in (4) of this section 2 using the synthetic DNA for modification. Determine the nucleotide sequence of the amplified product after PCR by the method described in (2) of this section 2 and confirm that the target modification has been made.
  • the cDNA encoding the humanized antibody VH or VL constructed upstream of each gene encoding CH or CL of the human antibody of the recombinant antibody expression vector described in (1) of this section 2 Each can be cloned to construct a humanized antibody expression vector.
  • the recombinant antibody expression vector described in (3) and (6) of this section 2 or a modified expression vector thereof can be used for transient expression of the recombinant antibody.
  • the host cell into which the expression vector is introduced can be used in any cell that can express a recombinant antibody. Because of its high expression level, COS-7 cells (ATCC CRL 1651) Commonly used [Methods in Nucleic Acids Res., CRC press, 283 (1991)].
  • Methods for introducing expression vectors into COS-7 cells include the DEAE-dextran method [Methods in Nucleic Acids Res., CRC press, 283 (1991)], the lipofuxion method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)].
  • ELIS A method Monoclonal Antibodies—Principles and practice, Third edition , Academic Press, 996 996, Antibodies——A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988), Monoclonal Antibody Experiment Manual, Kodansha Scientific (1987)] and the like.
  • Examples of a method for introducing an expression vector into a host cell include the electopore position method [Japanese Patent Laid-Open No. 2-257891, Cytotechnology, 3, 133 (1990)].
  • any host cell capable of expressing the recombinant antibody can be used.
  • Host cells with reduced or deleted activity of proteins such as enzymes involved in sugar chain modification in which position 1 of oc binds, or proteins involved in transport of intracellular sugar nucleotides GDP-fucose to the Golgi apparatus (WO02 / 31140, WO03 / 85107, WO03 / 8510 2) and the like can also be used.
  • G418 sulfate (hereinafter referred to as G418: SIG MA) according to the method disclosed in JP-A-2-57891.
  • the transformed strain can increase the expression level of the humanized antibody using a dhfr amplification system or the like according to the method disclosed in JP-A-2-257891.
  • Recombinant antibodies can be purified from the culture supernatant of transformants using a protein A column.
  • other purification methods usually used for protein purification can be used. For example, it can be purified by combining gel filtration, ion exchange chromatography and ultrafiltration.
  • the molecular weight of the purified recombinant antibody H chain, L chain, or whole antibody molecule is expressed by polyacrylamide gel electrophoresis [hereinafter SDS-PAGE: Nature, 227, 680 (1970)] or Western blotting. [Monoclonal Antibodies ⁇ Principles and prac tic e, Third edition, Academic Press (1996), Antibodies ⁇ A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)].
  • the binding activity of the purified antibody or antibody fragment of the present invention with the antigen is determined by ELISA or fluorescent antibody method [Cancer Immunol. Immunother., 36, 373 (1993)] or surface plasmon resonance using BIAcore TM. It can be measured.
  • the enhancement of fluorescence generated when sialidase decomposes sialidase light ⁇ ' ⁇ 4-methylumbelliferyl-N--D-acetylneuraminic acid ammonium salt is used as an index.
  • a method of measuring the rate of inhibition by addition of an antibody or antibody fragment [Glycobiology vol. 3, 455-463 (1993), BIO / TECH NOLOGY vol. 13, 692 (1995)] can be used.
  • the medium supplemented with the antibody of the present invention can be prepared using a medium used for cell culture as a basal medium.
  • BME medium Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 89, 362, 1965
  • BGJb medium Exp. Cell Res., 25, 41, 1961
  • CMRL 1066 medium NY Academy of) Sciences, 5, 303, 1957
  • Glasgow MEM medium Virology, 16, 147, 1962
  • Improved MEM Zinc Opt ion medium J. National Cancer Inst., 49, 1705, 1972
  • IMDM medium In Vitro, 9 , 6, 1970
  • Medium 199 medium Proc. Soc. Exp. Biol.
  • a medium added with serum a medium added with various growth factors as serum substitutes, a medium added with factors produced by stromal cells, or a protein-free medium may be added to these media. If the cells can be cultured, embryos can be used.
  • serum-free medium supplemented with commercially available KNOCKOUT TM SR (MD Goldsborough et al .; Focus, 20, 8, 1998)
  • serum-free medium supplemented with insulin and transferrin eg, CHO-S-SFM II (GIBCOBRL), Hybridoma- SFM (GIBCO BRL), eRDF Dry Powdered Media (GIBCOBRL), UltraCULTURE TM (Bio Whittaker), UltraDOMA TM (BioWhittaker), UltraCHO TM (BioWhittaker) ), UltraMDCK TM (BioWhittaker), ITPSG medium (S. Hosoi et al .; Cytotechnology, 5, S17, 1991), ITSFn medium (A. Rizzino and C.
  • mN3 medium S. Okabe et al .; Mech. Dev., 59, 89, 1996) etc.
  • medium supplemented with cell-derived factors eg, pluripotent teratocarcinoma cell culture supernatant of PSA1 Added medium (GR Martin; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 7634, 1981) or protein-free medium (eg CD-CHO (GIBCOBRL), PFHM-II (GIBCOBRL) UltraDOM A-PF TM (manufactured by BioWhittaker) and the like.
  • cell-derived factors eg, pluripotent teratocarcinoma cell culture supernatant of PSA1 Added medium (GR Martin; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 7634, 1981
  • protein-free medium eg CD-CHO (GIBCOBRL), PFHM-II (GIBCOBRL) UltraDOM A-PF TM (man
  • basal media include EXCELL302 (manufactured by JRH Biosciences) and CHO-S-SFM IKGIBCOBRL).
  • concentration of each additive contained in the IMDM medium may be changed to 100 times to 1/100, preferably 10 times to 1/10 of the above concentration. ! /
  • the antibody of the present invention is added to these basal media at a concentration of 0.1 ngZml to 100 ⁇ g / mU, preferably lng ⁇ 1 to 10 / ⁇ gZml, more preferably 10 ngZml to 1 ⁇ gZml.
  • An added medium can be prepared.
  • an antibody that neutralizes the activity of the cytoplasmic sialidase of the present invention can be added as a 10- to 100-fold concentrated solution during cell culture without directly adding it to the basal medium.
  • a feed medium in which the antibody of the present invention is dissolved may be used, or a solution in which the antibody of the present invention is dissolved in an appropriate buffer may be used.
  • the glycoprotein composition of the present invention is produced by adding the monoclonal antibody of the present invention prepared in 1 and 2 above to a culture solution and culturing cells that produce the target glycoprotein composition. Can do.
  • glycoprotein composition is obtained from Molecular 'Crowing 2nd Edition, Current' Protocols 'in' Molecular 1 ⁇ Nylon 1 ⁇ , Antibodies, A Laboratory manual, old Spring Harbor.
  • antibody engineering Monoclonal Antibodies: principles and practice, Third Edition, Acad. Press, 1993 (hereinafter abbreviated as “monoclonal nanoreantibodies”), Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press Using the method described in at Oxford University Press, 1996 (hereinafter abbreviated as “antibody engineering”), for example, it can be obtained by expressing in a host cell as follows.
  • a cDNA encoding a glycoprotein is prepared, and a DNA fragment of an appropriate length containing a portion encoding the molecule is prepared.
  • a recombinant vector is prepared by inserting the DNA fragment or full-length cDNA into the downstream of the promoter of an appropriate expression vector.
  • a transformant producing a glycoprotein molecule can be obtained.
  • Examples of host cells include cells derived from mammals.
  • cells derived from mammals into which an enzyme related to sugar chain modification has been introduced using genetic engineering techniques can also be used as host cells.
  • An expression vector that can replicate autonomously in the above host cell or can be integrated into a chromosome and contains a promoter at a position where DNA encoding the target glycoprotein molecule can be transcribed is used. It is done.
  • cDNA can be prepared from a tissue or cell of a human or non-human animal using a probe or primer specific to the target glycoprotein. it can.
  • examples of expression vectors include pcDNAU pcD M8 (sold by Funakoshi), pAGE107 [JP 3-22979; Cytotechnology, 3, 133, (1990)] , PAS3-3 [Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075], pCDM8 [Nature, 32 9, 840, (1987)], pcDNAI / Amp (Invitrogen), pREP4 (Invitrogen), pAGElO 3 [Journal ' C. Biochemistry, 101, 1307 (1987)], pAGE210, and the like.
  • Any promoter can be used as long as it can be expressed in animal cells.
  • CMV cytomegalovirus
  • SV40 early promoter SV40 early promoter
  • retrowinores examples thereof include promoters, meta-mouthone promoters, heat shock promoters, SRa promoters, and the like.
  • any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into animal cells.
  • the electoral position method [Cytote chnology, 3, 133 (1990)]
  • Calcium phosphate method [JP 2-227075]
  • lipofussion Law Proceedings ⁇ The ⁇ National ⁇ Academic ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ Mouse Embryo Laboratories Manual]
  • Method Using Particle Gun (Gene Gun) [Patent No. 2606856, Patent No.
  • the transformant obtained as described above is cultured, the target glycoprotein composition is produced in the culture supplemented with the monoclonal antibody of the present invention, and the isoprotein composition is collected from the culture. By doing so, the intended glycoprotein composition can be produced.
  • the method of culturing the transformant in a medium can be performed according to a usual method used for culturing host cells.
  • the RPMI 1640 medium [The Journal of the American American Medical Association (The Journal of the American Medical Association), 199, 519 (1967)], Eagle's MEM medium [Science, 122, 501 (1952)], Dulbecco's modified MEM medium [Virology, 8, 396 (1959) ], 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)], Whitten medium [Genetic engineering experiment] Manual-Transgenic • How to make a mouse (Kodansha) Motoya Katsaki (1987) Hota can use media such as fetal calf serum added to these media.
  • the culture is usually carried out for 1 to 7 days under conditions such as pH 6 to 8, 30 to 40 ° C, and 5% CO.
  • antibiotics such as kanamycin and penicillin may be added to the medium as needed during the culture.
  • a method for producing a glycoprotein composition a method of producing a glycoprotein composition in a host cell, Secreted or produced on the outer membrane of the host cell.
  • a more appropriate method can be selected by changing the host cells used and the structure of the glycoprotein molecule to be produced.
  • a DNA encoding a glycoprotein molecule and a DNA encoding a signal peptide appropriate for the expression of the glycoprotein molecule are inserted into an expression vector, and the expression vector is used as a host.
  • the target glycoprotein molecule can be actively secreted outside the host cell.
  • the production amount can be increased using a gene amplification system using a dihydrofolate reductase gene or the like.
  • a glycoprotein composition produced by a transformant into which a gene encoding a glycoprotein molecule has been introduced is, for example, when the glycoprotein composition is expressed in a dissolved state in a cell, The cells are collected by centrifugation, suspended in an aqueous buffer solution, and then disrupted with an ultrasonic crusher, French press, Manton Gaurin homogenizer, dynomill, etc. to obtain a cell-free extract.
  • an ordinary enzyme isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, Anion exchange chromatography using resin such as tilaminoethyl (DEAE) -Sepharose, DIAION HPA-75 (Mitsubishi Chemical), and cation using resin such as S-Sepharose FF (Pharmacia) Exchange chromatography method, hydrophobic chromatography method using resins such as butyl sepharose and ferrule sepharose, gel filtration method using molecular sieve, affinity chromatography method, chromatofocusing method, isoelectric point Using methods such as electrophoresis such as electrophoresis alone or in combination A purified preparation of the glycoprotein composition can be obtained.
  • a solvent extraction method e.g., a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method
  • the glycoprotein composition when expressed by forming an insoluble substance in the cell, the cell is similarly collected, disrupted, and centrifuged to insoluble the glycoprotein composition as a precipitate fraction. Collect body. The recovered insoluble material of the glycoprotein composition is dissolved with a protein denaturant. After the solubilized solution is diluted or dialyzed to return the glycoprotein composition to a normal three-dimensional structure, a purified preparation of the glycoprotein composition can be obtained by the same isolation and purification method as described above. I'll do it.
  • the glycoprotein composition or a derivative thereof can be recovered in the culture supernatant. That is, the culture supernatant is obtained by treating the culture by a technique such as centrifugation similar to the above, and glycoproteins are obtained from the culture supernatant by using the same isolation and purification method as described above. A purified preparation of the composition can be obtained. If the host cell already has the ability to express a glycoprotein molecule, the cell is cultured and the desired glycoprotein composition is purified from the culture. Thus, a glycoprotein composition can be produced.
  • the sugar chain structure of a glycoprotein molecule created using various cells can be performed according to the analysis of the sugar chain structure of a normal glycoprotein. For example, neutral sugars such as galactose, mannose, and fucose, amino sugars such as N-acetylyldarcosamine, and acidic sugars such as sialic acid are analyzed for sugar structure using the sugar composition analysis and two-dimensional sugar chain mapping method. Etc. can be used.
  • neutral sugar or amino sugar can be liberated by acid hydrolysis of the sugar chain with trifluoroacetic acid or the like, and the composition ratio can be analyzed.
  • composition ratio can also be analyzed by a fluorescent labeling method using 2-aminoviridine. Specifically, a sample subjected to acid-branching decomposition according to a known method [Agricultural 'and' Biological Chemistry (Agric. Biol. Chem.), 55 (1), 283-284 (1991)] Fluorescent labeling can be performed by 2-aminoviridylation, and HPLC analysis can calculate the composition ratio.
  • composition analysis of the glycan of a glycoprotein is performed by acid hydrolysis of the glycan with hydrochloric acid or sulfuric acid to release the acidic saccharide and label the released acidic saccharide to analyze the composition ratio.
  • the monosaccharides that make up the sugar chains of glycoproteins can be broadly divided into sialic acid, neutral sugars, and amino sugars.
  • the stability of released monosaccharides against acids is the order of amino acids, neutral sugars, and sialic acids. Since sialic acid is completely decomposed under conditions that cleave the glycosidic bond of amino sugar and neutral sugar, it is usually analyzed separately.
  • a sample hydrolyzed according to a known method [Chem. Pharm. Bull. 35, 687 (1987); Anal. Biochem. 179, 162-166 (1989)], for example, is commercially available.
  • L 2-diamino-4,5-methylenedioxybenzene (DMB) fluorescently labeled using a reagent kit for fluorescent labeling of sialic acid (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) and the composition ratio can be calculated by HPLC analysis it can.
  • DMB 2-diamino-4,5-methylenedioxybenzene
  • the glycoprotein composition is hydrazine-degraded to release the sugar chain from the glycoprotein molecule, and fluorescent labeling of the sugar chain with 2-aminoviridine (hereinafter abbreviated as “ ⁇ ”) [Journal After 'Ob' biochemistry (J. Biochem.), 95, 197 (1984)], the glycan is separated from excess PA reagent by gel filtration and reverse phase chromatography is performed. Then sorted Normal phase chromatography is performed for each peak of the sugar chain.
  • ⁇ 2-aminoviridine
  • mass analysis such as MALDI-TOF-MS of each sugar chain can be performed to confirm the structure estimated by the two-dimensional sugar chain mapping method.
  • the purified glycoprotein is labeled with a compound such as a radioisotope, and the strength of the binding reaction with the labeled glycoprotein receptor or interacting protein is quantitatively measured. How to do. It is also possible to measure protein-protein interactions using various devices such as Biacore's BIAcore series (J. Immnunol. Methods, 145, 229 (1991), Biomedical Biomedical Supplement, UP Series Protein Intermolecular). Interaction experiment method, Yodosha (1996)).
  • the half-life in blood or the distribution to the tissue after blood administration can be known.
  • a method for detecting the labeled substance is used.
  • a system that combines the antibody-antigen reaction specific to the glycoprotein to be detected is preferred.
  • glycoprotein composition of the present invention has a sugar chain structure with high sialic acid modification, for example, improved affinity with receptors, improved blood half-life, improved tissue distribution after administration in blood In addition, an effect such as improvement of interaction with a protein necessary for expression of pharmacological activity can be expected, and high physiological activity is exhibited.
  • the glycoprotein composition of the present invention has a longer blood half-life than the glycoprotein composition obtained when the antibody of the present invention is not added to the culture broth and cultured in sputum. .
  • These highly bioactive glycoprotein compositions are useful in the prevention and treatment of various diseases including cancer, inflammatory diseases, autoimmune diseases, immune diseases such as allergies, cardiovascular diseases, or viral or bacterial infections. It is.
  • an anticancer agent comprising a conventional glycoprotein composition as an active ingredient is characterized by suppressing the growth of cancer cells.
  • an anticancer agent comprising a glycoprotein composition obtained by the production method of the present invention as an active ingredient has a long blood half-life and can treat cancer with a sustained cell killing effect. It is more effective as a therapeutic agent than an anticancer agent comprising the glycoprotein composition.
  • glycoprotein compositions that are effective components of anticancer agents include interferon, tumor necrosis factor, and interoral chickins.
  • an immunological disease therapeutic agent comprising the glycoprotein composition obtained by the production method of the present invention as an active ingredient has a long half-life in blood and can treat an immune disease due to a sustained mediator molecule inhibitory effect. so Therefore, it is more effective than conventional therapeutic agents for immune diseases containing glycoprotein as an active ingredient.
  • the glycoprotein composition that is an active ingredient of a therapeutic drug for immune diseases include TNF receptor p75IgGlFc fusion protein and antithrombin III.
  • Cardiovascular diseases include diseases associated with thrombosis, diseases associated with bleeding such as hemophilia, and diseases associated with decreased renal function.
  • a conventional antithrombotic drug comprising a glycoprotein composition as an active ingredient is characterized by inhibiting the blood coagulation system or activating the fibrinolysis system.
  • an antithrombotic therapeutic agent comprising the glycoprotein composition obtained by the production method of the present invention as an active ingredient has a long blood half-life and can treat hemorrhage by a continuous anticoagulant action. Therefore, it is more effective than anti-thrombotic therapeutic drugs that use conventional glycoprotein as an active ingredient.
  • glycoprotein compositions that are active ingredients of antithrombotic drugs include antithrombin III, active protein C, and thrombomodulin.
  • a therapeutic agent for hemophilia comprising a conventional glycoprotein composition as an active ingredient is characterized by activating the blood coagulation system or inhibiting the fibrinolytic system.
  • a therapeutic agent for hemophilia comprising the glycoprotein composition obtained by the production method of the present invention as an active ingredient has a long blood half-life and treats hemophilia by a continuous blood coagulation action. Therefore, it is more effective than the conventional hemophilia drug containing glycoprotein as an active ingredient.
  • the glycoprotein composition that is an active ingredient of a therapeutic agent for hemophilia include various blood coagulation factors.
  • Examples of the disease accompanied by a decrease in renal function include renal anemia.
  • a conventional therapeutic agent for renal anemia comprising a glycoprotein composition as an active ingredient is characterized by having an erythrocyte increasing action.
  • a therapeutic agent for renal anemia comprising the glycoprotein composition obtained by the production method of the present invention as an active ingredient has a long blood half-life and can treat renal anemia by a continuous erythrocyte increasing action. Therefore, it is more effective than the conventional therapeutic drugs for renal anemia containing glycoprotein as an active ingredient.
  • Erythropoietin is an example of a glycoprotein composition that is an active ingredient of a therapeutic agent for renal anemia.
  • An anti-infective therapeutic agent comprising a conventional glycoprotein composition as an active ingredient has a function of suppressing the growth of cells infected with bacteria or viruses.
  • an anti-infective drug comprising a glycoprotein composition obtained by the production method of the present invention as an active ingredient has a long blood half-life and is a persistent cell infected with bacteria or viruses.
  • the growth of Infectious diseases can be treated by its inhibitory action, so it is more effective than conventional infectious agents for treating infectious diseases containing glycoproteins as effective components.
  • glycoprotein yarns that are active ingredients of infectious disease therapeutic agents include interferons and interleukins.
  • the medicament containing the glycoprotein composition of the present invention can be administered alone as a prophylactic or therapeutic agent.
  • one or more pharmacologically acceptable carriers and one or more carriers are used. It is desirable to mix them together and provide them as pharmaceutical preparations produced by any method well known in the pharmaceutical arts!
  • the route of administration can be oral administration where it is desirable to use the most effective treatment, or parenteral administration such as buccal, intratracheal, rectal, subcutaneous, intramuscular and intravenous.
  • parenteral administration such as buccal, intratracheal, rectal, subcutaneous, intramuscular and intravenous.
  • intravenous administration can be preferably mentioned.
  • dosage forms include sprays, capsules, tablets, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments, tapes, and the like.
  • Suitable formulations for oral administration include emulsions, syrups, capsules, tablets, powders, granules and the like.
  • Liquid preparations such as emulsions and syrups include sugars such as water, sucrose, sorbitol, and fructose, Daricols such as polyethylene glycol and propylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil and soybean oil, P- It can be produced using preservatives such as hydroxybenzoates and the like, flavors such as stove belly flavors and peppermint as additives.
  • Capsules, tablets, powders, granules, etc. are excipients such as lactose, glucose, sucrose and mannitol, disintegrants such as starch and sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate and talc. It can be produced using a binder such as an agent, polybulal alcohol, hydroxypropylcellulose, gelatin, a surfactant such as a fatty acid ester, a plasticizer such as glycerin, and the like as additives.
  • a binder such as an agent, polybulal alcohol, hydroxypropylcellulose, gelatin, a surfactant such as a fatty acid ester, a plasticizer such as glycerin, and the like as additives.
  • preparations suitable for parenteral administration include injections, suppositories, and sprays.
  • the injection is prepared using a carrier such as a salt solution, a glucose solution, or a mixture of both.
  • a powder injection can be prepared by freeze-drying a glycoprotein composition according to a conventional method and adding sodium chloride thereto.
  • Suppositories are prepared using a carrier such as cacao butter, hydrogenated fat or carboxylic acid.
  • the spray is prepared using a carrier that does not irritate the glycoprotein composition itself or the recipient's oral cavity and airway mucosa, and disperses the glycoprotein composition as fine particles to facilitate absorption. Is done.
  • the carrier include lactose and glycerin.
  • preparations such as aerosols and dry powders are possible.
  • the components exemplified as additives for oral agents can also be added.
  • the dose or frequency of administration varies depending on the intended therapeutic effect, administration method, treatment period, age, body weight, etc.
  • the amount of active ingredient is usually 1 ⁇ / 13 ⁇ 4 to 200 g / kg per day for an adult. is there.
  • methods for examining the biological activity of glycoprotein compositions include, in vitro experiments, methods for measuring glycoprotein receptor binding activity, methods for measuring enzyme activity of glycoprotein compositions, and glycoprotein receptor expression. Examples include in vitro tests such as methods for measuring proliferation / differentiation promoting activity using cell lines, or in vivo tests using human disease model animals.
  • PCR reaction CHO / DG44 cell-derived-25 ⁇ L reaction solution containing 5 i uL of single-stranded cDNA [1 X EX Taq Buffer (Takara Shuzo), 0.2 mM dNTP, s, 0.5 units EX Taq polymerase (Manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), 0.5 ⁇ of the above primers (SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13)] were prepared and heated at 94 ° C.
  • coli DH5a strain (Toyobo Co., Ltd.).
  • Recombinant plasmid DNA was isolated from the obtained ampicillin resistant colonies using QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen).
  • the nucleotide sequence of the PCR fragment contained in the plasmid was determined according to a conventional method using DNA Sequencer ABI PRISM 377 (manufactured by Perkin Elma Co., Ltd.), and it was confirmed that there was no base mutation associated with PCR.
  • the obtained plasmid containing NEU2 sialidase cDNA derived from Chinese nomstar ovary cells (CHO) is called pT7 blue sialidase.
  • a vector pGEX-Sialidase for expressing a dartathione S transferase (GST) fusion sialidase protein was prepared by the following procedure. Primer specific to the 5'-terminal untranslated region of cytoplasmic sialidase using the pT7 blue sialidase prepared in (1) above as a saddle type BamHIsiaFW (SEQ ID NO: 14) and a primer specific to the 3'-terminal untranslated region siaRVSall Perform polymerase chain reaction (PCR) using (SEQ ID NO: 15) No, NEU2 sialidase cDNA was amplified.
  • GST dartathione S transferase
  • BamHIsiaFW encodes the start codon in the Chinese and Muster cytoplasmic sialidase gene sequences shown in SEQ ID NO: 1.
  • the 187th force also corresponds to the 210th base, while siaRVSall encodes the stop codon from the 1303 position.
  • the sequence is complementary to the 1326th base.
  • PCR using this primer amplifies the entire cytoplasmic sialidase cDNA that can be inserted into the vector in a state where the codon frame matches that of GST.
  • PCR reaction is 50 ⁇ l reaction solution containing pT7 blue sialidase lng [1 X KOD Buffer (Toyobo), 0.2 mM dNTP, s, ImM MgCl, 2.5 units
  • the DNA fragment was ligated to the pGEX-KG vector using Ligation high (Toyobo Co., Ltd.), and the resulting recombinant plasmid DNA was used to transform E. coli DH5a strain (Toyobo Co., Ltd.).
  • pGEX-KG is a GST fusion protein expression vector modified from the multicloning site of pGEX-2T (manufactured by Pharmacia) (Analytical Biochem. (1991) 192, 262-267).
  • Recombinant plasmid DNA was isolated from the resulting ampicillin metacolonies using QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen).
  • the nucleotide sequence of the PCR fragment contained in the plasmid was determined according to a conventional method using DNA Sequencer ABI PRISM 377 (manufactured by Perkin Elma Co.), and it was confirmed that there was no base mutation associated with PCR.
  • the resulting plasmid is called pGEX-Sialidase.
  • the gene sequence of GST-sialidase encoded by this plasmid is shown in SEQ ID NO: 16.
  • E. coli DH5a carrying the plasmid pGEX-Sialidase prepared in (2) above was inoculated into 2 mL of LB medium (Difco) and cultured at 37 ° C. The next day, 1 mL of the culture solution was inoculated into 500 mL of LB medium and swirl culture was performed at 37 ° C. When the absorbance at 600 nm reached 0.6, isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside (IPTG) (manufactured by Takara Bio Inc.) was added at a final concentration of 0. ImM, followed by further overnight culture at room temperature. The next day, the cells are collected by centrifugation.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside
  • the suspension was suspended in 10 mL of B-PER Bacterial Protein Extraction Reagent (Pierce), and then disrupted 3 times for 10 minutes with an ultrasonic crusher (Sonics).
  • the E. coli lysate obtained by the above operation was centrifuged at 12,000 rpm for 20 minutes using an R-12A2 rotor (manufactured by Hitachi, Ltd.), and the supernatant was recovered and pre-treated with B-PER Bacterial Protein.
  • Glutathion Sepharose 4 Fast Flow manufactured by Falumasia
  • 1 mL washed with Extraction Reagent was added and mixed by inverting at 4 ° C for 8 hours. After 8 hours, the mixed solution of E.
  • coli lysate and Glutathion Sepharose 4 Fast Flow was transferred to a 0.8 cm diameter column, and then washed twice by passing 10 mL of PBS containing 0.1% TritonX-100 twice. After washing, 1 mL of elution buffer (50 mM Tris-HC1 pH 9.5, 10 mM reduced glutathione) was added, and GST-sialidase bound to Glutathion Sepharose 4 Fast Flow was eluted. The elution fraction was dialyzed by replacing the buffer with PBS, and the protein concentration was calculated by measuring the absorbance at 280 nm.
  • elution buffer 50 mM Tris-HC1 pH 9.5, 10 mM reduced glutathione
  • Fig. 1 shows an image of 2 g of the resulting GST-fused sialidase separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and stained with Coomassie brilliant blue (CBB).
  • CBB Coomassie brilliant blue
  • GST-sialidase O.lmg or O.Olmg obtained in (3) above was added to 0.4 mM sialidase light ⁇ ' ⁇ 4-methylumbelliferyl-N--D-acetylneuraminic acid ammonium salt (manufactured by Naito Lightesta). It was added to 60 ⁇ L of phosphate buffer ( ⁇ 7.0) containing 5 ⁇ L, and incubated at 37 ° C for 1 hour in a 96-well black ⁇ LISA plate (manufactured by Sumitomo Bakelite).
  • the value obtained by dividing the concentration of 4-methylumbelliferyl (4MU), which shows the same fluorescence value as the value obtained by subtracting the background fluorescence value from the fluorescence value obtained by this measurement, by the reaction time (h) reaction volume (mL) (nmol / h / ml) is shown in FIG. 2 as sialidase activity.
  • the concentration-dependent sialidase activity of GST-sialidase was confirmed. These activities disappeared by the addition of a casease inhibitor. Since the prepared GST fusion sialidase has sialidase activity, it was confirmed to be a recombinant protein retaining the structure necessary for activity.
  • E. coli-expressed GST-sialidase 50 ⁇ g obtained in Example 1 was added to each of aluminum hydroxide and aluminum 7-Nuunt Antibodies-A Laboratory Manual, old Spring Harbor Laboratories, p99, 1988] 2 mg and pertussis vaccine (Chiba prefectural serum Laboratory Ltd.) 1 X 10 9 cells together with the 6 Shureimesu Balb / c mice were administered by 4 Shureimesu SD rats each 3 rats. From 2 weeks after administration, 50 g of GST-sialidase was administered once a week for a total of 3 times.
  • Fig. 3 shows the binding ELISA results of the immunized mouse antiserum
  • Fig. 4 shows the binding ELISA results of the immunized rat antiserum.
  • the antisera of mouse No.2, mouse No.3, rat No.2, and rat No.3 immunized with GST-sialidase were more effective in the GST-sialidase solidified plate than in the GST solidified plate. A high reactivity was confirmed, and it was confirmed that a polyclonal antibody against cytoplasmic sialidase was produced.
  • Example 2 The mouse (or rat) spleen cell obtained in (1) and the myeloma cell obtained in Reference Example 1 (6) were mixed at a ratio of 10: 1, and described in Reference Example 1 (7) below. A high pre-dorman was prepared according to the above method.
  • mice Seven-week-old female nude mice (ICR) treated with pristane were injected intraperitoneally with 5-20 ⁇ 10 6 cells / mouse of the mouse hybrid obtained in Example 2 (2). Ten to 21 days later, ascites collected in the abdominal cavity was collected from mice in which the hyperidoma became ascites cancer. Ascitic fluid was collected from 1 to 8 mL per animal.
  • Binding activity (binding ELISA)
  • Example 2 It was carried out according to the method shown in Reference Example 1 (4). However, the purified antibodies (KM3627, KM3628, KM3629, KM3630, and KM3631) obtained in Example 2 (3) were diluted to 10, 1, 0.1, 0.01, and 0.001 / zg / mL as the primary antibody. A thing was used. As shown in FIG. 5, all purified antibodies showed specific binding activity to GST-sialidase.
  • Example 2 the purified antibody obtained in Example 2 (3) was used in place of the immunized animal antiserum and Hypridoma culture supernatant.
  • the purified antibody was diluted with GST-sialidase so that the molar ratio was 100, 10, 1, 0.1, 0.01.
  • neutralization activity against GST-sialidase was observed with all purified antibodies.
  • Example 2 ⁇ Production Using the culture supernatant of CHO cells, it was confirmed whether the purified antibody obtained in Example 2 (3) neutralized the cytoplasmic sialidase that also leaked the cell force.
  • a As Till-producing CHO cells the sputum-producing cell line Ms705 pKAN-ATIII 27 (FERM BP-10089) described in WO2005 / 035563 was used.
  • Ms705 pKAN-ATIII strain 27 was cultured in the medium, and the culture supernatant on day 14 of culture was used for the neutralizing activity against leaked sialidase in the method shown in Reference Example 1 (5) Measured according to
  • the culture supernatant on the 14th day of culture is the culture solution on the 14th day of the fed batch culture in which the above-mentioned sputum producing cells were subjected to a spinner reactor (manufactured by ABLE) having a culture tank volume of 1 L.
  • Fig. 7 (Lot 1) and Fig. 8 (Lot 2) show the results of measurement using the obtained culture supernatant in different lots. In all experiments, neutralizing activity against CHO-producing sialidase was observed with all purified antibodies.
  • the cells were cultured in a medium (Invitrogen) and grown to confluence. After the cells were detached from the incubator by trypsin treatment, the cells were washed with Dulbecco's PBS buffer (Invitrogen). A portion of the washed cell suspension was collected, and the viable cell density was measured using a cell auto-counter ViCELL (manufactured by Beckman Coulter) to confirm that the cell viability was 95% or more. .
  • Washed cells are uniformly suspended in 150 ⁇ L Dulbecco's PBS buffer with 1.25 x 10 6 viable cells, dispensed into microcentrifuge tubes (Eppendorffne earth), and frozen at -80 ° C overnight. I let you. The next day, the microcentrifuge tube was left at room temperature for 30 minutes to thaw the cell suspension. After the cell suspension was completely thawed, it was centrifuged at 15000 rpm at 4 ° C for 15 minutes using a microcentrifuge (manufactured by TOMY). The supernatant cell lysate was collected in a new microcentrifuge tube and stored on ice.
  • the final concentrations of the five monoclonal antibodies were 100 / zg / ml, 1 ⁇ g / ml, and O ⁇ g / m1.
  • 50 ⁇ L of cell lysate supplemented with 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) was added to the sialidase inhibitor ⁇ -Acety ⁇ 2,3-dehydro- 2-deox y.
  • -Wells supplemented with neuraminic acid (Neu5AC2en) (Fluka) to a final concentration of 5 mM were prepared.
  • sialidase fluorescent substrate 4-methylumbelliferyl—N——D-acetylneuraminic acid ammonium salt prepared at a concentration of 4 mM was added to each well of the 96-well microwell plate at 5 L / well.
  • the solution was dispensed, a lid was placed on the plate, and the mixture was reacted at 37 ° C for 2 hours in a carbon dioxide incubator (manufactured by TABAI).
  • Serum-free fed-batch culture was carried out by using the Ms705 pKAN-ATIII strain 27 established in Example 3 by the following procedure.
  • MTX manufactured by SIGMA
  • L-glutamine manufactured by Invitrogen
  • SIGMA 3,3,5- Triiodo-L-thyronine
  • EX- CELL302 medium containing 100 nmol / L Pluronic F-68 (Invitrogen) at a concentration of 0.1%
  • D (+)-glucose Nacalai Testa
  • JRH serum-free fed-batch culture medium
  • Amino acids (L-alanin 0.177 g / L, L-arginine, prepared at a higher concentration than the usual addition concentration) Monohydrochloric acid 0.593g / L, L-asparagine monohydrate 0.177g / L, L-aspartic acid 0.212g / L, L-cystine dihydrochloride 0.646g / L, L-glutamic acid 0.530g / L, L-glutamine 5.84 g / L, glycine 0.212 g / L, L-histidine monohydrochloride dihydrate 0.297 g / L, L-isoleucine 0.742 g / L, L-leucine 0.742 g / L, L-lysine monosalt Acid 1.031g / L, L-methionine 0.212g / L, L-Feralan 0.466g / L, L-proline 0.283g / L, L-serine 0.297g /
  • the solution was diluted 100 times with 1 L of distilled water), and dispensed into a 96-well plate (Nunc) at 100 ⁇ L / well.
  • the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 to 2 hours, and the inside of the well was washed with 0.05% Tween20-PBS, and then 1% BSA-PBS was dispensed with 100 / well and stored frozen.
  • Specimens and standards with known concentrations were diluted to an appropriate concentration using 1% BSA-PBS, dissolved at room temperature, and BSA-PBS in the tool was removed.
  • the solution was dispensed with L / well and allowed to stand at room temperature for 1-2 hours.
  • the sputum detection antibody solution was dispensed at 100 ⁇ L / well and allowed to stand at room temperature for about 1 hour.
  • 0.05% Tween20-PBS was injected several times at 350 L / well to wash the well. Dispense the ABTS solution containing 0.1% H 0 with 50 ⁇ L / well to develop the color.
  • Color development was stopped by dispensing 50% L / well of% SDS solution. Using a microplate reader, the absorbance was measured at a wavelength of excitation 415 nm / absorption 490 and the soot content was calculated.
  • Example 5 (1) 10 ⁇ g / mL of the monoclonal antibody ⁇ 3629 was added to the initial culture medium of the ⁇ -producing cell line and the Ms705 pKAN-ATII I 27 strain, and the Erlenmeyer flask was added. Serum free batch culture was performed. On day 0, 3, 6, 9, 12, and 14 after the start of culture, collect 2 to 4 mL of the culture solution, and the viable cell density (cells / mL), viability, ⁇ Concentration (mg / mL) and sialidase activity were measured. In addition, the number of sialic acids contained at the sugar chain end bound to the produced koji was measured using the culture solution on day 9 and day 14 of the culture.
  • the viable cell density and viability are the dye exclusion method using 0.4% trypan blue solution (manufactured by Invitrogen), and the soot concentration is the soot amount described in this section (2).
  • the sialidase activity was determined by the method for measuring the sialidase activity described in Reference Example 1 (5), and the sialic acid content was measured using anion exchange HPLC (Shimadzu Corporation).
  • Fig. 10 shows the viable cell density
  • Fig. 11 shows the survival rate
  • Fig. 12 shows the production volume
  • Fig. 13 shows the sialidase activity in the culture supernatant
  • Fig. 14 shows the sialic acid content.
  • the monoclonal antibody KM3629 has the effect of suppressing the elimination of sialic acid from sputum by neutralizing intracellular sialidase activity.
  • Serum-free fed-batch culture was performed using the Ms705 pKAN-ATIII strain 27 established in Example 3 in the same manner as described in Example 5 (1).
  • Ms705 pKAN-ATIII 27 strain was suspended in a serum-free Fuedbachi culture medium so that the viable cell density was 2.5 ⁇ 10 5 cells / mL, and the cell suspension was seeded in a 1 L spinner bioreactor.
  • Serum-free fed-batch culture was performed under conditions of a temperature of 35 ° C. and a stirring speed of 85 rpm, and KM3629 prepared in Example 2 was added at a final concentration of 1 mg / mL on the third day after the start of the culture. Performed on the 3rd, 5th, 7th, 9th, and 11th days after the start of the culture to reduce the consumption of amino acids, etc.
  • Fig. 15 shows the viable cell density
  • Fig. 16 shows the survival rate
  • Fig. 17 shows the production volume
  • Fig. 18 shows the sialidase activity in the culture supernatant
  • Fig. 19 shows the number of sialic acids.
  • the sialidase activity in the culture supernatant was suppressed throughout the 14-day culture period.
  • Figure 19 It was confirmed that the number of sialic acids in the cocoons produced was high!
  • the above indicates that monoclonal antibody ⁇ 3629 suppresses sialic acid elimination from glycoproteins by neutralizing sialidase activity even in culture using spinner reactors that mimic actual industrial production methods. Show that it is effective.
  • the affinity of the anti-sialidase antibodies ⁇ 3627 and ⁇ 3629 obtained in Example 2 for sialidase as an antigen was measured using a surface plasmon resonance method (SPR method). Analysis by the SPR method was performed as follows using a BiacoreTlOO system (Biacore). First, an anti-GST antibody was immobilized on flow cell 1 and flow cell 2 of Biacore S series sensor chip CM5 so that the binding amount was 13,000 RU. GST Capture Kit (Biacore) was used for the solid phase.
  • the dissociation constant for the binding of each antibody to GST-sialidase was calculated from a curve obtained by plotting the binding equilibrium value (RU value) at each antibody concentration against the antibody concentration. The results are shown in FIG. Biacore T100 evaluation software (Biacore) was used for the calculation. Further, Ka (l / Ms) is KM3267 is 2.27 X 10 5, KM3629 is 2.08 X 10 5, Kd (l / s) is KM3267 is 2.45 X 10, KM3629 was 2.22 X 10- 6. Therefore, KM3627 and KM3629 have 1.1 X 10- 9 M Contact and 1.1 X 10- 11 M dissociation constant (KD), that are attached to Shiaridaze with very high affinity becomes bright et force It was.
  • KD dissociation constant
  • Asp L-aspartic acid
  • Asx L-aspartic acid or L-asparagine
  • Glx L-glutamic acid or L-glutamine
  • Trt Trityl
  • Fmoc-Ser (t-Bu) -OH Na-9-fluorenylmethyloxycarbonyl-O-t-butyl-L-serine
  • Fmoc-Thr (t-Bu) -OH N a—9-funoleolenyl methenoreoxycarbonyl—O—t—butyl—L-thread
  • Fmoc- Lys (Boc)-OH N -9-Fluoro-rumethyloxycarbonyl- N ⁇ -1-butinoreoxycarbonyl-L-lysine
  • Fmoc- Asn (Trt)-OH N a -9-Fluorenylmethyloxycarbonyl- N ⁇ -tritinole- L-asno lagin
  • Fmoc-Asp (0-t-Bu) -OH Na-9-fluorenylmethyloxycarbol-L-aspartic acid- ⁇ -t-butyl ester
  • Fmoc-Glu (0-t-Bu) -OH N ⁇ —9—Fluoreninoremethinoreoxycarbo-nore—L-gnoletamic acid- ⁇ -t-butyl ester
  • Fmoc- Arg (Pmc)-OH N a -9-Fluorenylmethyloxycarbonyl- Ng- 2, 2,5, 7,8- Pentamethylchroman-6-sulfol- L-arginine
  • Fmoc-Tyr (t-Bu) -OH N ⁇ —9—Fluorore-noremethinoreoxycanolepool—O—t—Butinore— L-tyrosine
  • reaction solvents reaction reagents, and the like.
  • the ⁇ 1 and ⁇ 2 regions are not fixed in the structure of apo-type Neu2 to which no substrate is bound, and are considered to have a relatively random and flexible structure.
  • the structure was confirmed in the body, suggesting that it is an important site for sialidase activity, which changes its structure by substrate binding. From this, it was considered that it is suitable as an antigen site aiming at neutralization activity of sialidase.
  • the structure of the third domain loop has been confirmed for both the apo type and the substrate complex type, and the force is clearly protruding to the protein surface force side of the substrate recognition surface. The possibility of sterically hindering the substrate from entering the active center was suggested.
  • SEQ ID NO: 9 is an amino acid sequence in which a Cys residue is added to the N-terminus of the amino acid sequence corresponding to amino acid sequence Nos. 37 to 52 of the cheese hamster Neu2 for the purpose of binding to a resin used for synthesis.
  • SEQ ID NO: 10 is the amino acid sequence corresponding to amino acid sequence numbers 106 to 125 of Chinese Noom Star Neu2.
  • SEQ ID NO: 11 is an amino acid sequence corresponding to amino acid sequence numbers 180 to 196 of Chineseno and Muster Neu2.
  • step (d) Fmoc- Asp (0-1-Bu) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-His (Trt) -OH, Fmoc-Glu (0-t-Bu) -OH, Fmoc — Asp (0— t— Bu) — OH, Fmoc— Thr (t— Bu) — OH, Fm oc- Lys (Boc)-OH, Fmoc- Thr (t- Bu)-OH, Fmoc- Leu- OH, Fmoc- Arg (Pmc) -OH, Fmoc- Lys (Boc) -OH, Fmoc-Glu (0-1-Bu) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Phe-OH ), (E), (b), (c) were repeated in this order.
  • KLH Keyhole limpet hemo cianin; manufactured by Wako Pure Chemical Industries
  • PBS PBS
  • MBS N- (m-Maleimidobenzoyloxy) succinimide
  • Peptide lmg obtained by dissolving 2.5 mg of KLH-MBS in 0.1 M sodium phosphate buffer (PH7.0) after removing free MBS with a gel filtration column such as Sephadex G-25 column previously equilibrated with PBS And stirred for 3 hours at room temperature. After the reaction, dialyzed with PBS was used as an immunogen.
  • PH7.0 sodium phosphate buffer
  • the spleen was chopped in a MEM (Minimum Essential Medium) medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical), loosened with a pin set, and centrifuged (1200 rpm, 5 minutes). The resulting precipitate fraction was supplemented with Tris monosalt diamine buffer (PH7.6) and treated for 1 to 2 minutes to remove erythrocytes. The resulting precipitate fraction (cell fraction) was washed 3 times with MEM medium and used for cell fusion.
  • MEM Minimum Essential Medium
  • PH7.6 Tris monosalt diamine buffer
  • the conjugates 1 to 3 obtained in Reference Example 1 (1) were each conjugated with thyroglobulin.
  • the preparation method is as described in Reference Example 1 (2), but SMCC [4- (N-Maleimidomethyl) -cyclyl is used as a cross-linking agent instead of MBS. ohexane-1-carboxylic acid N-hydroxysuccinimidoester; manufactured by Sigma Co.] was used.
  • the conjugate prepared as described above was dispensed into a 96-well ELISA plate (manufactured by Grainer) at 10 ⁇ / 1 ⁇ 2 50 L / well and allowed to stand at 4 ° C. for adsorption.
  • GST-sialidase is added to a 96-well ELISA plate (Grainer Co., Ltd.) at 5 ⁇ g / mL, 50 ⁇ L / It was dispensed in holes and left to stand overnight at 4 ° C for adsorption.
  • BSA bovine serum albumin
  • PBS Dulbecco phosphate buffer
  • Tween-PBS Peroxidase-labeled Usagi anti-mouse (or rat) immunoglobulin
  • ABTS 2.2-azinobis (3-ethylbenzothiazole-6-sulfonic acid) ammonium] substrate solution [lmmol / L ABTS — 0.1 mol / L citrate buffer (pH 4 .2), 0.1% H2O2]
  • the color was developed, and the absorbance at OD415 nm was measured using a plate reader (Emax; manufactured by Molecular Devices).
  • Sialidase 3 ⁇ 4: Photosubstrate 0.4 mM 4-methylumbelliferyl-N- — D—acetylneura minic acid ammonium salt (Nacalai Testa) 5 ⁇ L / well, incubated at 37 ° C for 1 hour, 0.2 M glycine (pH 10) was dispensed at 140 L / well to stop the reaction. Reaction stop After stopping, using a fluorescent plate reader ARVO (manufactured by Perkin Elmer), the intensity of the 460 nm fluorescence wavelength with an excitation wavelength of 340 nm was measured for 0.1 second. The value obtained by dividing the background fluorescence value from the fluorescence value obtained by this measurement was defined as the sialidase activity.
  • the mouse spleen cells obtained in Reference Example 1 (3) and the myeloma cells obtained in Reference Example 1 (6) were mixed at 10: 1 and centrifuged (1200 rpm, 5 minutes). After loosening the cells of the obtained precipitate fraction, mix 10 8 solutions of polyethylene glycol-1000 (PEG-lOOOO) lg, MEM medium lmL, and dimethyl sulfoxide 0.35 mL at 37 ° C with stirring. 0.5 mL per mouse spleen cell was added, and 1 mL of MEM medium was added several times to the suspension every 1 to 2 minutes, and then the MEM medium was added so that the total volume became 50 mL.
  • PEG-lOOOO polyethylene glycol-1000
  • an anticytoplasmic sialidase monoclonal antibody that recognizes the three-dimensional structure of a cytoplasmic sialidase derived from a mammal and neutralizes the cytoplasmic sialidase activity derived from a mammal, the antibody in a culture solution It is possible to provide a method for producing a glycoprotein composition characterized by being added. Sequence listing free text

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Abstract

本発明により、哺乳動物由来の細胞質シアリダーゼの立体構造を認識し、かつ哺乳動物由来の細胞質シアリダーゼ活性を中和する抗細胞質シアリダーゼモノクローナル抗体が提供される。また、該抗体を用いることにより、シアル酸が付加された糖鎖を有する糖蛋白質組成物を製造する方法が提供される。

Description

明 細 書
哺乳動物由来細胞質シァリダーゼに対する抗体
技術分野
[0001] 本発明は、哺乳動物由来細胞質シァリダーゼに結合し、かつ哺乳動物由来細胞質 シァリダーゼの立体構造を認識する抗体、該抗体を用いた糖蛋白質の製造方法、お よび該製造方法により得られる糖蛋白質に関する。
背景技術
[0002] シァリダ一ゼは糖蛋白質に付加した糖鎖の非還元末端力 シアル酸を除去するこ とによって糖鎖分解の初発反応を触媒するェキソ型 aーグリコシダーゼの一種であ る。シァリダーゼによって糖蛋白質に付加した糖鎖の非還元末端カもシアル酸残基 が除去されると多くの糖蛋白質分子の機能が変化する。これまで、シァリダ一ゼの機 能を解明するには、細菌やウィルス由来のシァリダーゼが用いられてきたため、哺乳 動物の生体内でシアル酸がどのように脱離されるのかにっ ヽては詳 、解析がなさ れていな力つた。し力しながら、近年、哺乳動物の内在性シァリダーゼ力 糖鎖分解 の最初の反応をつ力さどることによって、糖鎖修飾されている生体分子の異化分解を 調節し、立体構造や受容体による認識機構、細胞接着や免疫機構などに影響を与 えるなどの、多くの重要な細胞機能を制御することが明らかとなった (非特許文献 1)。
[0003] 哺乳動物には、細菌やウィルスのシァリダ一ゼとは異なる、少なくとも 4種のシァリダ ーゼが存在する (非特許文献 2、 3)。哺乳動物の内在性シァリダーゼは、細胞質 (非 特許文献 4)、リソソーム内腔 (非特許文献 5)、リソソーム膜 (非特許文献 6)および形 質膜 (非特許文献 6)に局在し、互いに基質特異性などの酵素学的な性状が異なつ ている。
最初の哺乳動物シァリダーゼとして細胞質シァリダーゼ遺伝子 (NEU2シァリダーゼ )の構造が明らかになり（非特許文献 7)、次いでリソソ一ムシァリダ一ゼ (NEU1) (非 特許文献 8)と形質膜シァリダーゼ (NEU3) (非特許文献 9)の遺伝子がクローユング された。微生物が起源であるシァリダーゼ含め、各種シァリダーゼのアミノ酸配列の 相同性はそれほど高くな 、が、複数のァスパラギン酸ボックス（Ser-X-Asp-X- Gly-X - Thr-Trp)配列の存在や、 N末端付近の Phe-Arg-Ile-Pro配列、および 2つのァスパ ラギン酸ボックス配列の間に位置する Va卜 Gly-X- Gly配列など、共通に見出されるァ ミノ酸配列が保存されている。さらに、シァリダーゼ活性に関与するアミノ酸残基が高 度に保存されており、アミノ酸立体構造に高い類似性がある。例えば、サルモネラ LT 2由来シァリダーゼの結晶構造 (非特許文献 10)は、ヒト NEU2シァリダーゼの結晶構 造 (非特許文献 11)と類似して ヽる。
[0004] NEU2シァリダーゼ遺伝子は、 1679塩基力もなり 379アミノ酸残基力もなる一本鎖ポリ ペプチドをコードしている。 NEU2シァリダーゼには、 2個のァスパラギン酸ボックス配 列が存在し、システィン残基や |8シート構造に富み、微生物由来シァリダーゼと類似 した立体構造をとることが知られている。本酵素は細胞質に存在し、中性 pH付近で 働き、オリゴ糖、ガンダリオシド、糖蛋白質を基質としている。特に、精巣や骨格筋に 高発現し、骨格筋細胞の分化に重要な役割を果たすことが報告されて！ヽる (非特許 文献 12)。 NEU2シァリダーゼについては、チャイニーズハムスター卵巣（CHO)細胞 (非特許文献 13)、ヒト骨格筋 (非特許文献 14)、マウス脳 (非特許文献 15)およびマ ウス胸腺 (非特許文献 16)力 遺伝子が単離されて 、る。
[0005] 一般に、医薬への応用が考えられている糖蛋白質の多くは、遺伝子組換え技術を 用いて作製され、哺乳動物由来の細胞、例えばチャイニーズノヽムスター卵巣組織由 来の CHO細胞やマウスミエローマ細胞などを宿主細胞として用い製造されて 、る。し 力しながら、発現させた糖蛋白質の糖鎖構造は宿主細胞や培養方法によって異なる ため、現状では、必ずしも最適な薬理活性が発揮できるような糖鎖が付加されている とは限らない。特に、糖鎖の非還元末端シアル酸の付加は、投与した糖蛋白質の薬 理活性に大きな影響を与える場合があるため、糖蛋白医薬品の製造において、シァ ル酸修飾を制御することは重要である。
[0006] シアル酸付加が薬理活性の発現に重要な糖蛋白医薬品としては、具体的には、ェ リスロボイエチン（EPO)や組織型プラスミノーゲンァクチベータ (t- PA)などがあげら れる。
これら糖蛋白医薬品は、患者の静脈あるいは皮下に注射あるいは点滴によって投 与されるが、糖鎖の非還元末端に付加されたシアル酸が糖蛋白質の血中半減期の 維持に重要な役割を果たしており、シアル酸の脱離により血中半減期が大きく損なわ れることが知られている (非特許文献 17〜 19)。この理由は、シアル酸を脱離させると 非還元末端側にガラクトース残基が露出し、肝臓などに局在するァシァ口糖蛋白質 受容体 (ガラタトース受容体）に捕捉され速やかに分解されるためである (非特許文献 20)。
[0007] 糖蛋白医薬品は、宿主細胞にそれら糖蛋白質をコードする cDNAを安定的に組込 んで榭立した形質転換体を、適当な培養条件で適当な期間培養することにより分泌 生産させる。生産細胞力 培養液中に分泌された糖蛋白質には、細胞が固有に有 する糖鎖修飾機構に基づいて多様な糖鎖が付加され、多くの場合、成熟した糖鎖の 非還元末端側は負電荷を有するシアル酸残基で修飾されている。しかしながら、そ の付加率は、生産株や培養方法によって幅が生じてしまい、全ての糖鎖の非還元末 端をシアル酸で保護すること難しい。この糖蛋白質の製造において、シアル酸付カロ 率を低下させる大きな原因の一つに生産細胞が有するシァリダーゼの関与があげら れる。
[0008] シァリダーゼ、特に、 NEU2シァリダーゼは、糖蛋白質の製造において、生産細胞の 細胞質より培養液中に漏出蓄積し (非特許文献 21)、培養液中に蓄積した糖蛋白質 の糖鎖カもシアル酸を脱離させて 、ることが分力つてきた (非特許文献 22)。このこと は、 CHO細胞を宿主とした複数種類の遺伝子組換え糖蛋白質の生産研究によって 検証されている (非特許文献 23、 24)。
[0009] これまでに開発されたシアル酸付加率の低下を防止するための培養工学的な手法 としては、各種培養パラメーターの最適化 (非特許文献 25、特許文献 1)や、シァリダ ーゼ阻害活性を有する物質を培地成分に添加する手法 (非特許文献 24、特許文献 2)などが挙げられる。培養パラメーターの最適化は、シァリダーゼの細胞質力 の漏 出が細胞の生存率低下に伴っておこるため、培養工程において生産細胞の生存率 をできるだけ高いレベルで長期間維持することを目的に行われる。しかしながら、この 方法では、糖蛋白質へのシアル酸付加率の向上が若干観察されるものの十分な量 ではない上、糖蛋白質のシアル酸付加率が高める培養パラメーターと糖蛋白質の生 産性を高める培養パラメーターとがー致しないため、糖蛋白質へのシアル酸付加率 を優先させた場合には生産性を犠牲にしなくてはならないという問題が生じる。また、 シァリダーゼ阻害剤を培地成分として添加する手法にっ 、ては、 N-ァセチル -2,3-デ ヒドロ- 2-デォキシノイラミン酸 (Neu5Ac2en)などの特異的阻害剤を添加する方法や、 比較的高濃度の銅イオンを添加する方法などが開発されているが、いずれの方法も 糖蛋白質の製造に用いるには培地の調製や廃液処理に関する経済的負担が大きい ことが問題とされている。さらに、 Neu5Ac2enのような天然には存在しない新規化合物 を医薬品製造に用いる場合には、このような物質自身やこの物質が培養中に変化し て生じる誘導体の、生体に対する安全性も考慮しなくてはならない。
[0010] 糖蛋白質を生産する細胞力 漏出するシァリダーゼを制御する細胞工学的な手法 としては、アンチセンスによって NEU2シァリダーゼ mRNAのスプライシングゃ mRNA の翻訳を阻害する方法、相同組換えによってゲノム上 NEU2遺伝子座を破壊すること が知られている（特許文献 3)。アンチセンスによって NEU2シァリダーゼ mRNAのスプ ライシングゃ翻訳を阻害する方法にっ 、ては、クローユングされた CHO細胞の NEU2 シァリダーゼ cDNA配列 (非特許文献 13)をもとに、 NEU2シァリダーゼ mRNAと特異 的にハイブリダィズするアンチセンス RNAを設計し、このアンチセンス RNAを安定発 現させるための DNAコンストラクトを糖蛋白質生産細胞に導入し、 NEU2シァリダーゼ の発現を抑制することができる方法が開発されている (非特許文献 26)。具体的には 、 NEU2シァリダーゼアンチセンス RNA発現ベクターを、糸且換え DNaseを生産する CH 0細胞に安定的に導入することにより、細胞質シァリダーゼ活性を 40%まで抑制し、 生産物 DNaseのシアル酸付加率を最大で 37%上昇させた力 細胞質シァリダーゼ活 性の抑制率が不充分である。
[0011] シァリダーゼに反応する抗体としては、 NEU2の部分ペプチドを免疫して得られた抗 体 (特許文献 3)が報告されている。しかしながら、細胞質シァリダーゼに結合し、か つ哺乳動物由来の細胞質シァリダーゼの立体構造を認識するモノクローナル抗体に つ！ヽてはこれまでに知られて 、な！/、。
非特許文献 l :Trends Biochem. Sci" 10, 357-360 (1985); Glycobiology, 3, 201-217 (1993)
非特許文献 2 : J. Biochem., 107, 794-798 (1990) 非特許文献 3 : Glycoconjugate Journal vol.17,301- 306 (2000)
非特許文献 4 Journal of Biological Chemistry vol.260,6710- 6716 (1985) 非特許文献 5 : European Journal of Biochemistry vol.141, 75- 81 (1984) 非特許文献 6 Journal of Biochemistry vol.107,787- 793 (1990)
非特許文献 7 Journal of Biological Chemistry vol.268,26435- 26440 (1993) 非特許文献 8 : Genes and Development vol.10,3156- 3169 (1996) 非特許文献 9 Journal of Biological Chemistry vol.274,5004-5011 (1999) 非特許文献 10 : Pro^Natl.Acad.Sci.USA vol.90,9852- 9856 (1993) 非特許文献 11 Journal of Biological Chemistry vol.280, 469-475 (2005) 非特許文献 12 : Biochem.Biophys.Res.Commun.vol.221, 826-830 (1996) 非特許文献 13 : Glycobiology vol.4, 367-373 (1994)
非特許文献 14 : Genomics vol.57, 137-143 (1999)
非特許文献 15 : Biochem.Biophys.Res.Commun.vol.258, 727-731 (1999) 非特許文献 16 : Biochem.Biophys.Res.Commun.vol.286, 250-258 (2001) 非特許文献 17 Journal of Biological Chemistry 264, 35 (1989)
非特許文献 18 : European Journal of Biochemistry 194, 457 (1990) 非特許文献 19 Journal of Biological Chemistry 265, 12127 (1990) 非特許文献 20 : Blood 73, 84 (1989)
非特許文献 21 : Glycobiology vol.3, 455-463 (1993)
非特許文献 22 : BIO/TECHNOLOGY vol.13, 692 (1995)
非特許文献 23 : Biotechnology Progress vol.12, 559-563 (1996)
非特許文献 24 : Biotechnology Progress vol.20, 864-871 (2004)
非特許文献 25 : Cytotechnology vol.15, 217-221 (1994)
非特許文献 26 : Biotechnology and Bioengineering vol.60, 589-595 (1998) 特許文献 1：米国特許第 5705364号
特許文献 2：米国特許第 6528286号
特許文献 3：特表平 8-510133号
発明の開示 発明が解決しょうとする課題
[0012] 本発明の目的は、哺乳動物由来の細胞質シァリダーゼの立体構造を認識し、かつ 哺乳動物由来の細胞質シァリダーゼ活性を中和する抗細胞質シァリダーゼモノクロ ーナル抗体、該抗体を用いた糖蛋白質の製造方法および該製造方法により得られ た糖蛋白質組成物を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0013] 本発明は以下の（1)〜（11)に関する。
(1) 哺乳動物由来の細胞質シァリダーゼの立体構造を認識し、かつ哺乳動物由来 の細胞質シァリダーゼ活性を中和する抗細胞質シァリダーゼモノクローナル抗体。
(2) 抗細胞質シァリダーゼモノクローナル抗体力 少なくとも 2種類の哺乳動物由来 の細胞質シァリダーゼに結合するモノクローナル抗体である、上記（1記載のモノクロ ーナノレ抗体。
(3) 細胞質シァリダーゼ力 以下の（a)〜（h)力もなる群力も選ばれる DNAがコード する蛋白質である、上記（1)または（2)項に記載のモノクローナル抗体。
(a)配列番号 1で表される塩基配列力 なる DNA;
(b)配列番号 2で表される塩基配列力 なる DNA；
(c)配列番号 3で表される塩基配列力 なる DNA；
(d)配列番号 4で表される塩基配列力 なる DNA；
(e)配列番号 1で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA;
(f)配列番号 2で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA;
(g)配列番号 3で表される塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件でハイブリダ ィズし、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA;
(h)配列番号 4で表される塩基配列力もなる DNAとストリンジェントな条件でハイブリダ ィズし、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA。
(4) 細胞質シァリダーゼが、以下の （a)〜(1)力 なる群力 選ばれる蛋白質である 、上記（1)または（2)に記載のモノクローナル抗体。 (a)配列番号 5で表されるアミノ酸配列力もなる蛋白質；
(b)配列番号 6で表されるアミノ酸配列力もなる蛋白質；
(c)配列番号 7で表されるアミノ酸配列力もなる蛋白質；
(d)配列番号 8で表されるアミノ酸配列力もなる蛋白質；
(e)配列番号 5で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつシァリダーゼ活性を有する 蛋白質；
(f)配列番号 6で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつシァリダーゼ活性を有する 蛋白質；
(g)配列番号 7で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつシァリダーゼ活性を有する 蛋白質；
(h)配列番号 8で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつシァリダーゼ活性を有する 蛋白質；
(i)配列番号 5で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質；
(j)配列番号 6で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質；
(k)配列番号 7で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質；
(1)配列番号 8で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質。
(5) 細胞質シァリダーゼ力 NEU2である上記（1)〜（4)のいずれか 1項に記載のモ ノクローナル抗体。
(6) モノクローナル抗体力 以下の（a)〜（c)力もなる群力も選ばれる抗体である、 上記（1)〜（5)の 、ずれか 1項に記載の抗体。 (a)ハイプリドーマから生産された抗体；
(b)遺伝子組換え抗体；
(c) (a)または (b)を含む融合抗体。
(7) モノクローナル抗体力 以下の（a)〜（d)力もなる群力も選ばれるモノクローナ ル抗体である、上記（1)〜（6)の 、ずれか 1項に記載の抗体。
(a)ハイプリドーマ KM3627 (FERM BP— 10432)が産生するモノクローナル抗体；
(b)ハイブリドーマ KM3629 (FERM BP— 10433)が産生するモノクローナル抗体；
(c)ハイプリドーマ KM3627 (FERM BP— 10432)が産生するモノクローナル抗体が 結合するェピトープに結合するモノクローナル抗体；
(d)ハイプリドーマ KM3629 (FERM BP— 10433)が産生するモノクローナル抗体が 結合するェピトープに結合するモノクローナル抗体。
(8) 細胞を培養し糖蛋白質組成物を製造する方法にお!ヽて、上記（1)〜（7)の 、 ずれ力 1項に記載のモノクローナル抗体を培養液中に添加することを特徴とする、糖 蛋白質組成物の製造方法。
(9) 細胞を培養し糖蛋白質組成物を製造する方法において、上記（1)〜（7)のい ずれ力 1項に記載のモノクローナル抗体を培養開始時に添加することを特徴とする、 上記 (8)記載の糖蛋白質組成物の製造方法。
(10) 製造される糖蛋白質組成物が、上記（1)〜（7)のいずれか 1項に記載のモノ クローナル抗体を培養液中に添加しな 、場合に得られる糖蛋白質組成物に比べて、 糖蛋白質 1分子あたりのシアル酸付加量が増加している糖蛋白質組成物である、上 記（8)または（9)に記載の方法。
(11) 上記（8)〜（ 10)の 、ずれか 1項に記載の方法を用いて製造される糖蛋白質 組成物。
発明の効果
本発明は、哺乳動物由来の細胞質シァリダーゼの立体構造を認識し、かつ哺乳動 物由来の細胞質シァリダーゼ活性を中和する抗細胞質シァリダーゼモノクローナル 抗体を提供する。本発明のモノクローナル抗体を糖蛋白質の製造方法に用いること により、哺乳動物由来の細胞質シァリダーゼの活性を中和するため、シアル酸の付 加率が高い糖鎖を有する糖蛋白質組成物を提供することができる。
図面の簡単な説明
[図 1]大腸菌組み換え GST-シァリダーゼのポリアクリルアミドゲル電気泳動像を示す
[図 2]GST-シァリダーゼのシァリダーゼ活性測定結果を示す。 GSTシァリダ一ゼは濃 度依存的に蛍光基質を分解し、縦軸に示す値のシァリダーゼ活性を示した。これら 活性はシァリダーゼ阻害剤である Neu5AC2enによって消失した。
[図 3]大腸菌発現蛋白の免疫により得られた被免疫マウス血清のバインディング ELIS
Aにおける反応性を示す。実線は GST-シァリダーゼに対する反応性、点線は GSTに 対する反応性を示す。グラフの横軸は抗血清の希釈率、縦軸は抗体の結合活性を 示す。
[図 4]大腸菌発現蛋白の免疫により得られた被免疫ラット血清のノインデイング ELISA における反応性を示す。実線は GST-シァリダーゼに対する反応性、点線は GSTに対 する反応性を示す。グラフの横軸は抗血清の希釈、縦軸は抗体の結合活性を示す。
[図 5]モノクローナル抗体のバインディング ELISAにおける反応性を示す。グラフの横 軸は精製抗体の濃度、縦軸は抗体の結合活性を示す。
[図 6]モノクローナル抗体の GST-シァリダーゼに対する中和活性を示す。左の棒ダラ フにおいて 1から 3はそれぞれ 1.蛍光基質のみの蛍光強度 2. GST-シァリダーゼ +蛍 光基質の蛍光強度 3. GST-シァリダーゼ +蛍光基質 +シァリダーゼ阻害剤の蛍光強度 を示す。右の折れ線グラフの横軸は抗体/シァリダーゼモル比、縦軸は蛍光強度 (シ ァリダーゼ活性)を示す。
[図 7]モノクローナル抗体の CHO産生シァリダーゼに対する中和活性を示す。 CHO 産生シァリダーゼとして Ms705 pKAN-ATIII 27株培養上清ロット 1を用いた時の結果 を示す。左の棒グラフにおいて 1から 3はそれぞれ 1. Ms705 pKAN-ATIII 27株培養上 清ロット 1のみの蛍光強度、 2. Ms705 pKAN-ATIII 27株培養上清ロット 1 +蛍光基質 の蛍光強度、 3. Ms705 pKAN-ATIII 27株培養上清ロット 1 +蛍光基質 +シァリダ一 ゼ阻害剤の蛍光強度を示す。折れ線グラフの横軸は抗体濃度、縦軸は蛍光強度を 示す。 [図 8]モノクローナル抗体の CHO産生シァリダーゼに対する中和活性を示す。 CHO 産生シァリダーゼとして Ms705 pKAN-ATIII 27株培養上清ロット 2を用いた時の結果 を示す。左の棒グラフにおいて 1から 3はそれぞれ 1. Ms705 pKAN-ATIII 27株培養上 清ロット 2のみの蛍光強度、 2. Ms705 pKAN-ATIII 27株培養上清ロット 2 +蛍光基質 の蛍光強度、 3. Ms705 pKAN-ATIII 27株培養上清ロット 2 +蛍光基質 +シァリダ一 ゼ阻害剤の蛍光強度を示す。折れ線グラフの横軸は抗体濃度、縦軸は蛍光強度を 示す。
[図 9]モノクローナル抗体のラット Myoblast細胞株 (A-10株）由来シァリダーゼに対す る中和効果を示す。グラフの横軸は添加したモノクローナル抗体の濃度、縦軸はシァ リダーゼ活性に由来する蛍光強度を示す。図中參はシァリダーゼ阻害剤である Neu5 Acを終濃度 5mMで添加したときの蛍光強度、■は陰性対照としてのマウス血漿由来 ィムノグロブリン Gを添カ卩したときの蛍光強度、◊は KM3627を添加したときの蛍光強 度、口は KM3628を添加したときの蛍光強度、△はモノクローナル抗体 KM3629を添 加したときの蛍光強度、〇はモノクローナル抗体 KM3630を添加したときの蛍光強度 、 Xはモノクローナル抗体 KM3631を添カ卩したときの蛍光強度、をそれぞれ示す。
[図 10]ΑΤΠΙ生産細胞株である Ms705 ρΚΑΝ-ΑΤΠΙ 27株の、無血清フエドバッチ培養 中の生細胞密度の変化を示す。横軸には培養日数を、縦軸には生細胞密度をそれ ぞれ示す。図中 Xは Ms705 pKAN-ATIII 27株を、▲は Ms705 ρΚΑΝ- ΑΤΠΙ 27株に 10 μ Μ ΚΜ3629を添加した場合をそれぞれ示す。
[図 11]ΑΤΠΙ生産細胞株である Ms705 ρΚΑΝ-ΑΤΠΙ 27株の、無血清フエドバッチ培養 中の生存率の変化を示す。横軸には培養日数を、縦軸には生細胞密度、生存率、 培養上清中に蓄積された ΑΤΠΙ量をそれぞれ示す。図中 Xは Ms705 pKAN-ATIII 27 株を、▲は Ms705 pKAN-ATIII 27株に 10 Mモノクローナル抗体 KM3629を添カロし た場合をそれぞれ示す。
[図 12]ΑΤΠΙ生産細胞株である Ms705 ρΚΑΝ-ΑΤΠΙ 27株の、無血清フエドバッチ培養 中の、培養上清中に蓄積された ΑΤΙΠ量の変化を示す。横軸には培養日数を、縦軸 には生細胞密度、生存率、培養上清中に蓄積された ΑΤΙΠ量をそれぞれ示す。図中 Xは Ms705 pKAN-ATIII 27株を、▲は Ms705 pKAN- ΑΤΠΙ 27株に 10 μ Μモノクロ一 ナル抗体 KM3629を添カ卩した場合をそれぞれ示す。
[図 13]ΑΤΠΙ生産細胞株である Ms705 ρΚΑΝ-ΑΤΠΙ 27株の、無血清フエドバッチ培養 中のシァリダーゼ活性の変化を示す。ノ ックグラウンドには、シァリダーゼ蛍光基質を 添加しない培養上清を用いた。横軸には培養日数を、縦軸には生細胞密度、生存 率、培養上清中に蓄積された ΑΤΠΙ量をそれぞれ示す。図中 Xは Ms705 pKAN-ATIII 27株を、▲は Ms705 pKAN-ATIII 27株に 10 Mモノクローナル抗体 KM3629を添 加した場合をそれぞれ示す。
[図 14]ΑΤΠΙ生産細胞株である Ms705 ρΚΑΝ-ΑΤΠΙ 27株の、無血清フエドバッチ培養 9日目および 14日目の上清中の ΑΤΠΙのシアル酸含有率を示す。
[図 15]ΑΤΠΙ生産細胞株である Ms705 ρΚΑΝ-ΑΤΙΠ 27株の、スピナ一バイオリアクター を用いた無血清フエドバッチ培養中の生細胞密度の変化を示す。横軸には培養日 数を、縦軸には生細胞密度を示す。
[図 16]ΑΤΠΙ生産細胞株である Ms705 ρΚΑΝ- ΑΤΙΠ 27株の、スピナ一バイオリアクター を用いた無血清フエドバッチ培養中の生存率の変化を示す。横軸には培養日数を、 縦軸には生存率を示す。
[図 17]ΑΤΠΙ生産細胞株である Ms705 ρΚΑΝ-ΑΤΙΠ 27株の、スピナ一バイオリアクター を用いた無血清フエドバッチ培養中の、培養上清中に蓄積された ΑΤΠΙ濃度の変化を 示す。横軸には培養日数を、縦軸には培養上清中に蓄積された ΑΤΙΠ濃度を示す。
[図 18]ΑΤΠΙ生産細胞株である Ms705 ρΚΑΝ- ΑΤΙΠ 27株の、スピナ一バイオリアクター を用いた無血清フエドバッチ培養中の、培養上清中のシァリダーゼ活性の変化を示 す。ノックグラウンドには、シァリダーゼ蛍光基質を添加しない培養上清を用いた。横 軸には培養日数を、縦軸には励起波長 340 應、検出波長 460 nmでの蛍光強度を示 す。
[図 19]ΑΤΠΙ生産細胞株である Ms705 ρΚΑΝ- ΑΤΙΠ 27株の、スピナ一バイオリアクター を用いた無血清フエドバッチ培養中の、培養上清中の ΑΤΙΠシアル酸数を示す。横軸 には培養日数を、縦軸にはシアル酸数を示す。
[図 20]細胞質シァリダーゼ中和抗体の GST-シァリダーゼにする結合様式を表面ブラ スモン共鳴法にて測定した結果を示す。 20、 10、 5、 2.5、 1.25、 0.625 g/mLの KM36 27または KM3629を GST-シァリダーゼを保持したセンサーチップに添カ卩した際に得ら れるセンサーグラムを示して 、る。
[図 21]細胞質シァリダ一ゼの基質認識面に突出して存在する 3種類のループ部分に 相当するペプチド存在下における、シァリダーゼ中和抗体の GST-シァリダーゼへの 結合様式を表面プラスモン共鳴法にて測定した結果を示す。
[図 22]KM3627が結合した GST-シァリダーゼに対する KM3629の結合および、 KM362 9が結合した GST-シァリダーゼに対する KM3627の結合を表面プラスモン共鳴法にて 解析した結果を示す。破線は他方の抗体をあらカゝじめ添加してぉ ヽた場合の結果を 、実線は他方の抗体をあら力じめ添加しておかな力つた場合の結果をそれぞれ示す 発明を実施するための最良の形態
[0016] 本発明は、哺乳動物由来の細胞質シァリダーゼの立体構造を認識し、かつ哺乳動 物由来の細胞質シァリダーゼ活性を中和する抗細胞質シァリダーゼモノクローナル 抗体に関する。
本発明において、哺乳動物としては、ヒト、マウス、ラット、ハムスターなどがあげられ る。
[0017] 本発明において、哺乳動物由来の細胞質シァリダーゼは、 1種類の哺乳動物由来 の細胞質シァリダーゼでもよいが、少なくとも 2種類の哺乳動物由来の細胞質シァリ ダーゼであることが好まし 、。
本発明において、細胞質シァリダーゼとしては、細胞質に存在し、かつ糖蛋白質に 付加した糖鎖の非還元末端からシアル酸を除去する反応を触媒する活性を有する 酵素であれば!/、かなる酵素も包含される。
[0018] 細胞質に存在し、かつ糖蛋白質に付加した糖鎖の非還元末端力 シアル酸を除去 する反応を触媒する活性を有する酵素としては、例えば、上述の細胞を用いて糖蛋 白質を製造した場合に培地中に漏出してくるシァリダーゼがあげられ、具体的には、
NEU2シァリダーゼなどがあげられる。
本発明において、 NEU2シァリダーゼとしては、下記 (a)、（b)、（c)、（d)、（e)、（1)、（g)ある いは (h)の DNAがコードする蛋白質、または下記 (0、（j)、（k)、（1)、（m)、（n)、（o)、（p)、 (q) 、（r)、（s)あるいは (t)の蛋白質などがあげられる。
(a)配列番号 1で表される塩基配列からなる DNA;
(b)配列番号 2で表される塩基配列力 なる DNA；
(c)配列番号 3で表される塩基配列力 なる DNA；
(d)配列番号 4で表される塩基配列力 なる DNA；
(e)配列番号 1で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA;
(D配列番号 2で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA;
(g)配列番号 3で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でハイブリダ ィズし、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA;
(h)配列番号 4で表される塩基配列力もなる DNAとストリンジェントな条件でハイブリダ ィズし、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA。
または、
(0配列番号 5で表されるアミノ酸配列力 なる蛋白質；
(j)配列番号 6で表されるアミノ酸配列力 なる蛋白質；
(k)配列番号 7で表されるアミノ酸配列力 なる蛋白質；
(1)配列番号 8で表されるアミノ酸配列力 なる蛋白質；
(m)配列番号 5で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつシァリダーゼ活性を有する 蛋白質；
(n)配列番号 6で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつシァリダーゼ活性を有する 蛋白質；
(0)配列番号 7で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつシァリダーゼ活性を有する 蛋白質；
(P)配列番号 8で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつシァリダーゼ活性を有する 蛋白質；
(q)配列番号 5で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質；
(r)配列番号 6で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列力もな り、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質；
(s)配列番号 7で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列からな り、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質；
(t)配列番号 8で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列力 な り、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質。
本発明にお!/、て、ストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNAとは、例えば、 配列番号 1、 2、 3または 4で表される塩基配列を有する DNAなどの DNAまたはその一 部の断片をプローブとして、コ口-一'ハイブリダィゼーシヨン法あるいはサザンブロッ トハイブリダィゼーシヨン法などを用いることにより得られる DNAを意味し、具体的には 、コロニーあるいはプラーク由来の DNAを固定化したフィルターを用いて、 0.7〜1Mの 塩化ナトリウム存在化、 65°Cでノヽイブリダィゼーシヨンを行った後、 0.1〜2倍濃度の SS C溶液（1倍濃度の SSC溶液の組成は、 150mM塩ィ匕ナトリウム、 15mMクェン酸ナトリウ ムよりなる）を用い、 65°C条件化でフィルターを洗浄することにより同定できる DNAをあ げることができる。ハイブリダィゼーシヨンはモレキユラ一'クロー-ング（Molecular Clo ningノ ,A Laboratory manual, second edition, Cold Spring Haroor Laboratory Press, 1989 (以下モレキュラー 'クローユング第 2版と略す）、カレント 'プロトコールズ'イン' モレキュフー 'ノィォロン一 (Current Protocols in Molecular Biology), John Wiley & S ons, 1987- 1997 (以下、カレント'プロトコールズ'イン'モレキュラ^ ~ ·バイオロジーと略 す)、ディーェヌエー'クロー-ング (DNA Cloning 1)： Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995)などに記載されている方法に準 じて行うことができる。ハイブリダィズ可能な DNAとしては具体的に、配列番号 1、 2、 3 または 4で表される塩基配列と少なくとも 60%以上の相同性を有する DNA、好ましく は 70%以上、より好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上、特に好ましくは 95 %以上、最も好ましくは 98%以上の相同性を有する DNAをあげることができる。
[0020] 本発明において、配列番号 5、 6、 7または 8で表されるアミノ酸配列において 1以上 のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ シァリダーゼ活性を有する蛋白質とは、モレキュラー 'クローユング第 2版、カレント'プ 口トコーノレズ 'イン'モレキュラ^ ~ ·バイオロジー、ヌクレイック 'アシッド 'リサーチ（Nuclei c Acids Research) , 10, 6487 (1982)、プロシーディングス'ナショナル'アカデミック' サイエンス.ユーエスエー (proc. Natl. Acad. Sci.) USA, 79, 6409 (1982)、ジーン（Ge ne), 34, 315 (1985)、などに記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番 号 5、 6、 7または 8で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする DNAに部位 特異的変異を導入することにより取得できる蛋白質を意味する。欠失、置換、挿入お よび/または付加されるアミノ酸の数は 1個以上でありその数は特に限定されないが、 上記部位特異的変異導入法などの周知の技術により、欠失、置換、もしくは付加でき る程度の数であり、例えば、 1〜数十個、好ましくは 1〜20個、より好ましくは 1〜10個、 さらに好ましくは 1〜5個である。
[0021] また本発明にお 、て、配列番号 5、 6、 7または 8で表されるアミノ酸配列と 80%以上 の相同性を有し、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質とは、配列番号 5、 6、 7また は 8に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と少なくともと 80%以上、、好ましくは 85% 以上、より好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 95%以上、特に好ましくは 97%以上 、最も好ましくは 99%以上の相同性を有し、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質で ある。
[0022] 本発明に記載される相同性の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の 相同性検索プログラムを用いて算出される数値であって、塩基配列については BLAS T [ジャーナル'ォブ 'モレキュラ^ ~ ·バイオロジー (J. Mol. Biol), 215,403 (1990)]にお いてデフォルトパラメーターを用いて算出される数値などがあげられる。アミノ酸配列 については、 BLAST2 [ヌクレイック 'アシッド'リサーチ (Nucleic Acid Res.), 25, 3389 (1 997)] ;ゲノム'リサーチ (Genome Res.), 7, 649 (1997) ; http://www.ncbi.nlm.nih.gOv/E ducation/BLASTinfo/infomation3. html]においてデフォルトパラメータを用いて算出さ れる数値などがあげられる。デフォルトパラメータ一としては、 G(Cost to open gap)が 塩基配列の場合は 5、アミノ酸配列の場合は 11、 -E(Cost to extend gap)が塩基配列 の場合は 2、アミノ酸配列の場合は 1、 -q(penalty for nucleotide mismatch)カ 3、— r(r eward for nucleotide match)力 1、一 e(expect value)力 10、一 W (wordsize)力塩基酉己歹 lj の場合は 11残基、アミノ酸残基の場合は 3残基、 - y(Dropoff (X) for blast extemsions i n bits)が blastnの場合は 20、 blastn以外のプログラムでは 25である（http：〃 www.ncbi. nlm.nih.gov /blastcgihelp.html)0また、アミノ酸配列の解析ソフトとしては FASTA [メソ ッズ'イン'ェンザィモロジ一（Methods in Enzymology), 183, 63 (1990)]などもあげら れる。
[0023] 本発明にお 、て、細胞質シァリダーゼの立体構造とは、細胞質シァリダーゼが天然 状態でとりうる立体構造と同等の立体構造を有して 、れば 、ずれでもよ 、。
本発明におけるモノクローナル抗体としては、以下の (a)〜(c)などがあげられる。
(a)ハイプリドーマから生産された抗体；
(b)遺伝子組換え抗体；
(c) (a)または (b)を含む融合抗体。
[0024] ハイプリドーマは、例えば（1)上記の細胞質シァリダーゼが発現された細胞、（2)細 胞質シァリダーゼをコードする遺伝子を発現ベクターへ挿入した後に該発現ベクター を宿主細胞へ導入し、該宿主細胞により生産させた細胞質シァリダーゼなどを抗原と して調製し、該抗原を免疫した動物より抗原特異性を有する抗体を生産させる細胞 を誘導し、該細胞と骨髄腫細胞とを融合させることにより、調製することができる。モノ クローナル抗体は、該ハイブリドーマを培養する力、あるいは該ハイブリドーマを動物 に投与して該動物を腹水癌化させ、該培養液または腹水を分離、精製することにより 取得することができる。
[0025] 抗原を免疫する動物としてはノ、イブリドーマを作製することが可能であれば、いかな るものも用いることができるが、マウス、ラット、ノ、ムスター、ラビットなどが好適に用いら れる。またこのような動物から抗体産生能を有する細胞を取得し、該細胞に iQ vitro で免疫を施した後に、骨髄腫細胞と融合して作製したハイプリドーマが生産する抗体 なども本発明の抗体に包含される。
[0026] 本発明のモノクローナル抗体の具体例としては、ハイプリドーマ KM3627が産生する モノクローナル抗体、ハイプリドーマ KM3629が産生するモノクローナル抗体があげら れる。ハイプリドーマ KM3627および KM3629は平成 17年 10月 6日付でブタペスト条 約に基づき独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター (日本国茨 城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6)に FERM BP— 10432および FERM BP 10433として寄託されて!、る。
[0027] 遺伝子組換え抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体または、ハイプリ ドーマから生産される抗体あるいは遺伝子組換え抗体の!/、ずれかの可変領域を含 む抗体断片など、遺伝子組換えにより製造される抗体を包含する。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体の重鎖可変領域 (以下、 VHと表記する） および軽鎖可変領域 (以下、 VLと表記する）とヒト抗体の重鎖定常領域 (以下、 CHと 表記する）および軽鎖定常領域 (以下、 CLと表記する）とからなる抗体を ヽぅ。
[0028] 本発明のヒト型キメラ抗体は、細胞質シァリダーゼに結合し、かつ細胞質シァリダ一 ゼの立体構造を認識するモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマより、 VHおよ び VLをコードする cDNAを取得し、ヒト抗体の CHおよび CLをコードする遺伝子を有 する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構 築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
[0029] ヒト型キメラ抗体の CHとしては、ヒトイムノグロブリン (以下、 hlgと表記する）に属す ればいかなるものでもよいが、 hlgGクラスのものが好適であり、さらに hlgGクラスに属 する hIgGl、 hIgG2、 hIgG3、 hIgG4といったサブクラスのいずれも用いることができ る。また、ヒト型キメラ抗体の CLとしては、 hlgに属すればいずれのものでもよぐ κク ラスある!/、は λクラスのものを用いることができる。
[0030] ヒト化抗体は、ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDRのアミノ酸配列をヒト 抗体の VHおよび VLの適切な位置に移植した抗体を!、 、、 CDR移植抗体とも!、う。 本発明のヒト化抗体は、細胞質シァリダーゼに結合し、かつ細胞質シァリダーゼの 立体構造を認識するモノクローナル抗体を産生するノ、イブリドーマ力も産生されるヒト 以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDRのアミノ酸配列を、任意のヒト抗体の VH および VLの FRに移植した V領域をコードする cDNAを構築し、ヒト抗体の CHおよ び CLをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト 化抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造するこ とがでさる。
[0031] ヒト抗体の VHおよび VLの FRのアミノ酸配列は、ヒト抗体由来の VHおよび VLの F Rのアミノ酸配列であれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、 Protein Data Bankなどのデータベースに登録されて!、るヒト抗体の VHおよび VLの FRの ノ酸酉己歹1 J、ま 7こ ίま： sequences oi Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)などに記載の、ヒト抗体の V Hおよび VLの FRの各サブグループの共通アミノ酸配列などが用いられる。
[0032] ヒトイ匕抗体の CHとしては、 hlgに属すれば!/、かなるものでもよ!/、が、 hlgGクラスのも のが好適であり、さらに hlgGクラスに属する hlgG 1、 hIgG2、 hIgG3、 hIgG4といつ たサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒトイ匕抗体の CLとしては、 hlgに属 すればいずれのものでもよく、 κクラスあるいはえクラスのものを用いることができる。
[0033] ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、最近の遺伝子工学的、 細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリ 一およびヒト抗体産生トランスジエニック動物力 得られる抗体なども含まれる。
ヒト体内に天然に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、 EBウィル スなどを感染させ不死化し、クローニングすること〖こより、該抗体を産生するリンパ球 を培養でき、培養上清中より該抗体を精製することができる。
[0034] ヒト抗体ファージライブラリ一は、ヒト B細胞力も調製した抗体遺伝子をファージ遺伝 子に挿入することにより Fab、 scFvなどの抗体断片をファージ表面に発現させたライ ブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標 として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を表面に発現しているファージを回収 することができる。該抗体断片は、さらに、遺伝子工学的手法により 2本の完全な H鎖 および 2本の完全な L鎖力もなるヒト抗体分子へも変換することができる。
[0035] ヒト抗体トランスジヱニック非ヒト動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物 をいう。具体的には、マウス胚性幹細胞ヘヒト抗体遺伝子を導入し、該胚性幹細胞を 他のマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体を産生するトランスジェ ニック非ヒト動物を作製することができる。また、動物の受精卵にヒト抗体遺伝子を導 入し、該受精卵を発生させることにヒト抗体を産生するトランスジエニック非ヒト動物を 作製することもできる。ヒト抗体を産生するトランスジヱニック非ヒト動物からのヒト抗体 の作製方法は、通常のヒト以外の哺乳動物で行われて 、るハイプリドーマ作製方法 によりヒト抗体ハイプリドーマを得、培養することで培養物中にヒト抗体を蓄積させるこ とがでさる。
[0036] トランスジエニック非ヒト動物は、ゥシ、ヒッジ、ャギ、ブタ、ゥマ、マウス、ラット、ニヮト リ、サル又はゥサギ等があげられる。
本発明の抗体断片としては、 Fab、 F (ab' )、 Fab，、 scFv
2 、 diabody, dsFvおよび
CDRを含むペプチドなどがあげられる。
Fabは、 IgGを蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（H鎖の 22 4番目のアミノ酸残基で切断される）、 H鎖の N末端側約半分と L鎖全体がジスルフィ ド結合で結合した分子量約 5万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
[0037] 本発明の Fabは、細胞質シァリダーゼに結合し、かつ細胞質シァリダーゼの立体構 造を認識するモノクローナル抗体を蛋白質分解酵素パパインで処理して得ることが できる。または、該抗体の Fabをコードする DNAを原核生物用発現ベクターあるいは 真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入 すること〖こより発現させ、製造することができる。
[0038] F (ab' ) は、 IgGのヒンジ領域の 2個のジスルフイド結合の下部を酵素ペプシンで分
2
解して得られた、 2つの Fab領域力 Sヒンジ部分で結合して構成された、分子量約 10万 の抗原結合活性を有するフラグメントである。
本発明の F (ab' ) は、細胞質シァリダーゼに結合し、かつ細胞質シァリダ
2 一ゼの立 体構造を認識するモノクローナル抗体を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得るこ とができる。または、下記の Fab'をチォエーテル結合あるいはジスルフイド結合させ、 作製することができる。
[0039] & は、上記 （& ） のヒンジ領域のジスルフイド結合を切断した分子量約 5万の
2
抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明の Fab'は、細胞質シァリダーゼに結合し、かつ細胞質シァリダーゼの立体 構造を認識する F (ab' ) を還元剤ジチオスレィトール処理して得ることができる。また は、該抗体の Fab'断片をコードする DNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核 生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入する こと〖こより発現させ、製造することができる。
[0040] scFvは、 1本の VHと 1本の VLとを適当なペプチドリンカ一（以下、 Pと表記する）を 用いて連結した、 VH— P—VLないしは VL— P—VHポリペプチドで、抗原結合活 性を有する抗体断片である。
本発明の scFvは、本発明の細胞質シァリダーゼに結合し、かつ細胞質シァリダ一 ゼの立体構造を認識するモノクローナル抗体の VHおよび VLをコードする cDNAを 取得し、 scFvをコードする DNAを構築し、該 DNAを原核生物用発現ベクターある いは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生 物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
[0041] diabodyは、 scFvが二量体ィ匕した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗 体断片である。二価の抗原結合活性は、同一であることもできるし、一方を異なる抗 原結合活性とすることもできる。
本発明の diabodyは、本発明の細胞質シァリダーゼに結合し、かつ細胞質シァリダ ーゼの立体構造を認識するモノクローナル抗体の VHおよび VLをコードする cDNA を取得し、 scFvをコードする DNAを Pのアミノ酸配列の長さが 8残基以下となるように 構築し、該 DNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿 入し、該発現ベクターを原核生物ある！ゝは真核生物へ導入することにより発現させ、 製造することができる。
[0042] dsFvは、 VHおよび VL中のそれぞれ 1アミノ酸残基をシスティン残基に置換したポ リペプチドを該システィン残基間のジスルフイド結合を介して結合させたものをいう。 システィン残基に置換するアミノ酸残基は Reiterらにより示された方法 [Protein En gineering, 7, 697 (1994) ]に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択するこ とがでさる。
[0043] 本発明の dsFvは、本発明の細胞質シァリダーゼに結合し、かつ細胞質シァリダ一 ゼの立体構造を認識するモノクローナル抗体の VHおよび VLをコードする cDNAを 取得し、 dsFvをコードする DNAを構築し、該 DNAを原核生物用発現ベクターある いは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生 物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
[0044] CDRを含むペプチドは、 VHまたは VLの CDRの少なくとも 1領域以上を含んで構 成される。複数の CDRを含むペプチドは、直接または適当なペプチドリンカ一を介し て結合させることができる。
本発明の CDRを含むペプチドは、本発明の細胞質シァリダーゼに結合し、かつ細 胞質シァリダーゼの立体構造を認識するモノクローナル抗体の VHおよび VLの CD
Rをコードする DNAを構築し、該 DNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生 物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入す ること〖こより発現させ、製造することができる。
[0045] また、 CDRを含むペプチドは、 Fmoc法（フルォレ-ルメチルォキシカルボ-ル法）
、 tBoc法 (t ブチルォキシカルボニル法)などの化学合成法によって製造することも できる。
また、本発明のモノクローナル抗体は、上述のハイプリドーマから生産された抗体、 遺伝子組換え抗体に、ペプチド、蛋白質などを化学的あるいは遺伝子工学的に結合 させた融合抗体を包含する。
[0046] 本発明の融合抗体は、本発明の細胞質シァリダーゼに結合し、かつ細胞質シァリ ダーゼの立体構造を認識するモノクローナル抗体の H鎖あるいは L鎖の N末端側あ るいは C末端側、モノクローナル抗体中の適当な置換基あるいは側鎖、さらにはモノ クローナル抗体中の糖鎖などに放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、 蛋白質などを化学的手法 [抗体工学入門、金光修著、地人書館（1994) ]により結合 させること〖こより製造することができる。
[0047] また、本発明の細胞質シァリダーゼに結合し、かつ細胞質シァリダーゼの立体構造 を認識するモノクローナル抗体をコードする DNAと、結合させたい蛋白質をコードす る DNAとを連結させて発現用ベクターに挿入し、該発現ベクターを適当な宿主細胞 へ導人し、発現させること〖こより製造することができる。
放射性同位元素としては、 131ι、 125ιなどがあげられ、例えば、クロラミン T法などによ り抗体に結合させることができる。 [0048] 低分子の薬剤としては、ナイトロジェン 'マスタード、サイクロフォスフアミドなどのアル キル化剤、 5—フルォロウラシル、メソトレキセートなどの代謝括抗剤、ダウノマイシン 、ブレオマイシン、マイトマイシン C、ダウノルビシン、ドキソルビシンなどの抗生物質、 ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンのような植物ァノレカロイド、タモキシフェン 、デキサメタソンなどのホルモン剤などの抗癌剤 [臨床腫瘍学、 日本臨床腫瘍研究会 編、癌と化学療法社（1996) ]、またはハイド口コーチゾン、プレドニゾンなどのステロ イド剤、アスピリン、インドメタシンなどの非ステロイド剤、金チォマレート、ぺ-シラミン などの免疫調節剤、サイクロフォスフアミド、ァザチォプリンなどの免疫抑制剤、マレイ ン酸クロルフエ-ラミン、クレマシチンのような抗ヒスタミン剤などの抗炎症剤 [炎症と抗 炎症療法、医歯薬出版株式会社（1982) ]などがあげられる。例えば、ダウノマイシン と抗体を結合させる方法としては、ダルタールアルデヒドを介してダウノマイシンと抗 体のアミノ基間を結合させる方法、水溶性カルポジイミドを介してダウノマイシンのアミ ノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法などがあげられる。
[0049] 高分子の薬剤としては、ポリエチレングリコール (以下、 PEGと表記する）、アルブミ ン、デキストラン、ポリオキシエチレン、スチレンマレイン酸コポリマー、ポリビュルピロリ ドン、ピランコポリマー、ヒドロキシプロピルメタクリルアミドなどがあげられる。例えば、 PEGと抗体を結合させる方法としては、 PEG化修飾試薬と反応させる方法などがあ げられる [バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店（1993) ]。 PEG化修飾試薬として は、リジンの ε —ァミノ基の修飾剤（特開昭 61— 178926)、ァスパラギン酸およびグ ルタミン酸のカルボキシル基の修飾剤（特開昭 56— 23587)、アルギニンのグァ -ジ ノ基の修飾剤（特開平 2— 117920)などがあげられる。
[0050] 蛋白質としては、免疫担当細胞を活性ィ匕するサイト力イン、例えば、ヒトインターロイ キン 2、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ヒトマクロファージコロニー刺激 因子、ヒトインターロイキン 12などがあげられる。また、癌細胞を直接傷害する活性を 有するリシンやジフテリア毒素などの毒素を用いることができる。例えば、蛋白質との 融合抗体ついては、抗体または抗体断片をコードする cDNAに蛋白質をコードする c DNAを連結させ、融合抗体をコードする DNAを構築し、該 DNAを原核生物あるい は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物 へ導入することにより発現させ、融合抗体を製造することができる。
[0051] 本発明のモノクローナル抗体としては、具体的にはハイブリドーマ KM3627 (FER M BP- 10432)が産生するモノクローナル抗体およびハイプリドーマ KM3629 (FE RM BP- 10433)が産生するモノクローナル抗体のほ力、ハイプリドーマ KM3627 ( FERM BP- 10432)が産生するモノクローナル抗体が結合するェピトープに結合 するモノクローナル抗体、ハイプリドーマ KM3629 (FERM BP— 10433)が産生する モノクローナル抗体が結合するェピトープに結合するモノクローナル抗体等があげら れる。
[0052] また本発明は、細胞を培養し糖蛋白質を製造する方法において、上述のモノクロ一 ナル抗体を培養液中に添加することを特徴とする、糖蛋白質組成物の製造方法に関 する。
モノクローナル抗体の培養液への添加時期は、糖蛋白質組成物を生産する宿主 細胞を培養して ヽる間であれば ヽかなる時期でもよ ヽが、細胞生存率が高 、状態を 保持する間に添加するのが好ましぐ培養開始時に添加することが特に好ましい。
[0053] 細胞生存率が高い状態としては、少なくとも 70%以上、好ましくは 80%以上、より好 ましくは 90%以上、更に好ましくは 95%以上、最も好ましくは 100%の細胞生存率をい 培養開始時に培養液中に添加するとは、予め基礎培地に上述のモノクローナル抗 体を添加すること、播種細胞を含む培養液に上述のモノクローナル抗体を添加して おくことをいう。
[0054] 上述のモノクローナル抗体の培地への添加量としては、終濃度が 0.1 μ g/mL〜100 mg/mL、好ましくは 1 μ g/mL〜10mg/mL、より好ましくは 10 μ g/mL〜lmg/mL、更に 好ましくは 10 μ g/mL〜100 μ g/mLがあげられる。
本発明において、細胞の培養法には限定はなぐ目的糖蛋白質を生産することが 可能な方法であればいかなる培養法も含まれる。目的糖蛋白質を生産することが可 能な方法としては、例えば、バッチ培養、フエドバツチ培養、還流培養、高密度維持 培養、マイクロキャリア培養、軟寒天培養などをあげることができる。
[0055] 本発明の、本発明の抗体を培養液中に添加することを特徴とする糖蛋白質組成物 の製造方法とは、本発明の抗体を添加した培地を用いて細胞を培養し、糖蛋白質組 成物を製造する方法であれば、 Vヽかなる製造法も包含される。
具体的には、糖蛋白質をコードする遺伝子を導入した宿主細胞を用いて生産する 方法、糖蛋白質をコードする遺伝子を導入したヒト以外の動物の胚性幹細胞または 受精卵細胞をヒト以外の動物の初期胚へ移植後、発生させたトランスジエニック非ヒト 動物の細胞を用いて生産する方法などが包含される。
[0056] 本発明の方法において、細胞としては、糖蛋白質組成物を製造することができる細 胞であればいかなる細胞も包含する力 哺乳動物由来の細胞が好ましく用いられる。 哺乳動物由来の細胞の具体的な例としては、チャイニーズノヽムスター卵巣組織由 来細胞（CHO細胞）、ラットミエローマ細胞株 YB2Z0細胞、マウスミエローマ細胞株 NSO細胞、マウスミエローマ細胞株 SP2Z0—Agl4細胞、シリアンハムスター腎臓 組織由来 BHK細胞（ ATCC CCL— 10)、 MDCK (ATCC CCL— 34)、 PER- C 6™、ヒト NM- F9細胞、ヒト HEK293細胞、ハイプリドーマ細胞、ヒト白血病細胞株ナマ ルバ細胞、胚性幹細胞、受精卵細胞などがあげられる。 CHO細胞としては、 CHO —K1株（ATCC CCL— 61)、 CHOZdhfr—株（ATCCCRL— 9096)、 Pro5株（ ATCC CRL— 1781)や市販の CHO— S株（Invitrigen社製 Cat # 11619)、あ るいはこれらの細胞を無血清培地などに馴化させた亜株などが上げられる。ラットミエ ローマ細胞としては、例えば Y3 Agl.2.3. (ATCC CRL— 1631)、 Y0 (ECACC N 。：85110501)、 YB2Z0 (ATCC CRL 1662)等、マウス細胞としては、例えば NS 0 (ATCC CRL- 1827) , Sp2/0 (ATCC CRL— 1581)等、ミエローマ細胞ま たはミエローマ細胞系の雑種細胞、あるいはこれらの株を無血清培地などに馴化さ せた亜株（ATCC CRL— 1581.1)などが上げられる。ヒト細胞としては PER. C6 ( ECACC 96022940)、あるいはこれらの株を無血清培地などに馴化させた亜株な どが上げられる。また、これらの細胞に変異処理を施したり、ヒト以外の哺乳動物に抗 原を免疫して取得された B細胞と細胞融合することによって得られる、これらの細胞と 同等の性質を有する細胞も、哺乳動物由来の細胞に含まれる。
[0057] また、本発明において糖蛋白質をコードする遺伝子を導入する宿主細胞としては、 N -グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N -ァセチルダルコサミンの 6位とフコ一 スの 1位がひ結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する宿主細胞、例え ば、 N-グリコシド結合複合型糖鎖を有する糖蛋白質分子力もなる組成物であって、 該組成物中に含まれる全 N-グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端の N-ァ セチルダルコサミンにフコースが結合して 、な 、糖鎖の割合が 20%以上である糖蛋 白質糸且成物を生産する能力を有する宿主細胞、上述の宿主細胞のうち、以下に挙 げる少なくとも 1つの蛋白質の活性が低下または失活した細胞などがあげられる。
(a) 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素蛋白質；
(b) N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコ ースの 1位が (X結合する糖鎖修飾に関与する酵素蛋白質；
(c) 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質。
[0058] 好ましくは宿主細胞内の a 1 ,6-フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子がノ ックアウトされた宿主細胞があげられる（WO02/31140、 WO03/85107, WO03/85102
) o
細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素蛋白質としては、細胞 内で糖鎖へのフコースの供給源である糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与す る酵素であればいかなる酵素も包含される。細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの 合成に係わる酵素としては、細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に影響を与 える酵素などがあげられる。
[0059] 細胞内の糖ヌクレオチド GDP-フコースは、 de novoの合成経路あるいは Salvage合 成経路により供給されている。したがって、これら合成経路に関与する酵素はすべて 細胞内 GDP-フコースの合成に係わる酵素に包含される。
細胞内の糖ヌクレオチド GDP-フコースの de novoの合成経路に関与する酵素として は、 GDP- mannose 4,6- dehydratase (GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ；以下、 GM Dと表 する)、（JDP keto—り— deoxymannose 3,5— epimerase, 4,6— reductase (LJDPケ ト-デォキシマンノース 3,5-ェピメラーゼ， 4,6-リダクターゼ；以下、 Fxと表記する）など があげられる。
[0060] 細胞内の糖ヌクレオチド GDP-フコースの Salvage合成経路に関与する酵素としては 、 GDP- beta- L- focose pyrophosphorylase (GDP-ベータ- L-フコース-ピロホスフォリラ ーゼ；以下、 GFPPと表記する）、 Fucokinase (フコキナーゼ）などがあげられる。
細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に影響を与える酵素としては、上述の 細胞内の糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成経路に関与する酵素の活性に影響を 与えたり、該酵素の基質となる物質の構造に影響を与える酵素も包含される。
[0061] N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコース の 1位が ex結合する糖鎖修飾に関与する酵素蛋白質としては、 N-グリコシド結合複 合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位とフコースの 1位が a結合する 反応に関与する酵素であればいかなる酵素も包含される。 N-グリコシド結合複合型 糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位とフコースの 1位が α結合する反応に 関与する酵素としては、 Ν-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルダルコ サミンの 6位とフコースの 1位が a結合する反応に影響を与える酵素であればいかな る酵素も包含される。具体的には、 α— 1 , 6—フコシルトランスフェラーゼゃ a—L— フコシダーゼなどがあげられる。
[0062] また、 N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位とフ コースの 1位が a結合する反応に影響を与える酵素としては、上述の N-グリコシド結 合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が a結合 する反応に関与する酵素の活性に影響を与えたり、該酵素の基質となる物質の構造 に影響を与える酵素も包含される。
[0063] 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質として は、細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質、ま たは細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースをゴルジ体内へ輸送する反応に影響を与え る蛋白質であればいかなる蛋白質も包含される。
細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質として は、具体的には、 GDP-フコーストランスポーターなどがあげられる。また、細胞内糖ヌ クレオチド GDP-フコースをゴルジ体内へ輸送する反応に影響を与える蛋白質として は、上述の細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白 質の活性に影響を与えたり、発現に影響を与える蛋白質も包含される。
[0064] 上述の酵素活性が低下または欠失した細胞を取得する方法としては、 目的とする 酵素活性を低下または欠失させることができる手法であれば、 V、ずれの手法でも用 いることができる。具体的には、
(a)酵素の遺伝子を標的した遺伝子破壊の手法；
(b)酵素の遺伝子のドミナントネガティブ体を導入する手法；
(c)酵素につ 、ての突然変異を導入する手法；
(d)酵素の遺伝子の転写又は翻訳を抑制する手法；
(e) N-グリコシド結合糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位とフコースの 1位 が OC結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法などがあ げられる。
[0065] N-グリコシド結合糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位とフコースの 1位が a結合した糖鎖構造を認識するレクチンとしては、該糖鎖構造を認識できるレクチン であれば、いずれのレクチンでも用いることができる。その具体的な例としては、レン ズマメレクチン LCA (Lens Culinaris由来の Lentil Agglutinin)、エンドゥマメレクチン PS A (Pisum sativum由来の Pea Lectin)、ソラマメレクチン VFA (Vicia faba由来の Agglutin in)、ヒイロチヤワンタケレクチン AAL (Aleuria aurantia由来の Lectin)等を挙げることが できる。
[0066] レクチンに耐性な細胞とは、レクチンを有効濃度与えたときにも、生育が阻害されな い細胞を言う。有効濃度とは、ゲノム遺伝子が改変される以前の細胞（以下、親株と も称す)が正常に生育できない濃度以上であり、好ましくは、ゲノム遺伝子が改変され る以前の細胞が成育できない濃度と同濃度、より好ましくは 2〜5倍、さらに好ましくは 10倍、最も好ましくは 20倍以上である。
[0067] 生育が阻害されないレクチンの有効濃度は、細胞株に応じて適宜定めればよぐ通 常のレクチンの有効濃度は 10 /z g/mL〜10mg/mL、好ましくは 0.5mg/mL〜2.0mg/mL である。
細胞を用いて糖蛋白質組成物を製造する方法としては、具体的には、糖蛋白質を コードする遺伝子を導入した宿主細胞を用いて生産する方法、糖蛋白質をコードす る遺伝子を導入したヒト以外の動物の胚性幹細胞または受精卵細胞をヒト以外の動 物の初期胚へ移植後、発生させたトランスジヱニック非ヒト動物を用いて生産する方 法、あるいは、糖蛋白質をコードする遺伝子を導入した植物カルス細胞より作製した トランスジヱニック植物用いて生産する方法などを包含する。
[0068] 本発明にお ヽて、糖蛋白質組成物とは、非還元末端にシアル酸付加部位が存在 する糖鎖を有する糖蛋白質分子を含有する組成物をいう。
糖蛋白質の糖鎖は、蛋白質部分との結合様式により、ァスパラギンと結合する糖鎖 (N-グリコシド結合糖鎖）とセリン、スレオニンなどと結合する糖鎖（0-グリコシド結合 糖鎖)の 2種類に大別される。これらを総称してグリコシド結合糖鎖という。
[0069] N-グリコシド結合糖鎖は、様々な構造を有して 、るが [生物化学実験法 23—糖蛋 白質糖鎖研究法 (学会出版センター)高橋禮子編 (1989年) ]、 Vヽずれの場合も以下 の構造式 (I)に示す共通のコア構造を有する。
[0070] [化 1]
Man 1→6
Man β l→4GlcNAc β l→4GlcNAc (I)
Man a 1→3
[0071] 構造式 (I)にお 、て、ァスパラギンと結合する糖鎖の末端が還元末端、反対側が 非還元末端という。
N-グリコシド結合糖鎖としては、コア構造の非還元末端にマンノースのみが結合 するハイマンノース型、コア構造の非還元末端側にガラクトースー N-ァセチルダルコ サミン（以下、 Ga卜 GlcNAcと表記する）の枝を並行して 1ないしは複数本有し、更に Ga ト GlcNAcの非還元末端側にシアル酸、バイセクティングの N-ァセチルダルコサミンな どの構造を有するコンプレックス型 (以下、複合型とも称す)、コア構造の非還元末端 側にハイマンノース型とコンプレックス型の両方の枝を持つハイブリッド型などがあげ られる。
[0072] 0-グリコシド結合糖鎖としては、 N-ァセチルガラタトサミンの還元末端がセリンまた はスレオニンの水酸基とひ結合し、更にガラクトース、 N-ァセチルダルコサミン、 N-ァ セチルガラタトサミン、シアル酸、あるいはシアル酸が結合した糖鎖、キシロースがセ リンの水酸基と j8結合した糖鎖、ガラクトースがハイドロキシリジンの水酸基と j8結合 した糖鎖などがあげられる。 [0073] キシロースがセリンの水酸基と /3結合した糖鎖は、通常、当該キシロースの 4位に 複数の糖が結合し、結合した糖の先に 2糖からなる直鎖状の多糖が結合している。こ のような糖鎖構造を有する物質としては軟骨プロテオダリカン等があげられる。ガラク トースがハイドロキシリジンの水酸基と β結合した糖鎖構造を有する物質としては、コ ラーゲン等があげられる。
[0074] 糖鎖を構成する糖としては、 Ν—ァセチルダルコサミン、 Ν—ァセチルガラタトサミ ン、マンノース、ガラクトース、フコース、シアル酸、キシロース、ァラビノースが含まれ 、これらの糖は 、かなる順序で結合しても良 、。
糖蛋白質組成物とは、 Ν—グリコシド結合糖鎖または 0-グリコシド結合糖鎖を有す る糖蛋白質分子力もなる組成物をいう。糖蛋白質に結合する糖鎖は多数存在し、そ の糖鎖構造は多様性があるために、糖蛋白質の糖鎖には多数の糖鎖の組合せが存 在することになる。したがって、本発明における糖蛋白質組成物としては、単一の糖 鎖構造が結合された糖蛋白質分子から構成される組成物、複数の異なる糖鎖構造 が結合された糖蛋白質分子カゝら構成される組成物などがあげられ、糖鎖の本数は 1 本であってもそれ以上であってもよ！/、。
[0075] このように、本発明の製造方法により得られる糖蛋白質組成物は、上述のモノクロ ーナル抗体を培養液中に添加しな ヽ場合に得られた糖蛋白質組成物と比べて、糖 蛋白質 1分子あたりのシアル酸付加量が増加された糖蛋白質組成物である。このよう に糖蛋白質 1分子あたりのシアル酸付加量が増加された糖蛋白質組成物は、上述の モノクローナル抗体を培養液中に添加しな ヽ場合に得られた糖蛋白質組成物に比 ベて、生体内に投与した場合において生理活性の向上を示す。
[0076] 生理活性としては、糖蛋白質と受容体との親和性、体内における糖蛋白質の血中 半減期間、血中投与後の組織分布の変化、薬理活性発現に必要な蛋白質との相互 作用などがあげられる。
さらに、本発明の製造方法で得られる糖蛋白質組成物のうち、 Ν-グリコシド結合複 合型糖鎖を有する糖蛋白質分子からなる組成物であって、該組成物中に含まれる全 Ν-グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンにフコ ースが結合していない糖鎖の割合が 20%以上である糖蛋白質組成物は、さらに優れ た生理活性を有する。このうち、 N-グリコシド結合複合型糖鎖を Fc領域に有する抗体 分子カゝらなる抗体組成物であって、 N-グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末 端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合して ヽな 、糖鎖を有する抗体組成物 は高い ADCC活性を有する。
[0077] 本発明にお 、て、フコースが結合して 、な 、糖鎖としては、上記で示された化学式 中、還元末端側の N-ァセチルダルコサミンにはフコースが結合されておらず、また非 還元末端の糖鎖の構造は!、かなるものであってもよ 、。
本発明にお 、て、糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合して いないとは、実質的にフコースが結合していないことをいう。実質的にフコースが結合 していない糖蛋白質組成物とは、具体的には、後述の 3に記載の糖鎖分析において 、フコースが実質的に検出できない程度の糖蛋白質組成物である場合をいう。実質 的に検出できない程度とは、測定の検出限界以下であることを意味する。
[0078] 本発明の糖蛋白質組成物としては、後述する糖蛋白質組成物、それらの糖蛋白質 断片、二つ以上の糖蛋白質または糖蛋白質断片とを融合させた融合蛋白質組成物 などがあげられる。
糖蛋白質組成物としては、抗体、エリスロポイエチン (EPO) [J. Biol. Chem., 252, 5 558 (1977)]、トロンボポイエチン (TPO) [Nature, 369, 533 (1994)]組織型プラスミノ 一ゲンァクチベータ、プロゥロキナーゼ、トロンボモジュリン、アンチトロンビン III、 a 1 アンチトリプシン、 C1インヒビター、ハプトグロビン、活性化プロテイン C、血液凝固因 子 VII、血液凝固因子 VIII、血液凝固因子 IX、血液凝固因子 X、血液凝固因子 XI、血 液凝固因子 XII、血液凝固因子 XIII、プロトロンビン複合体、フイブリノゲン、アルブミン 、性腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、上皮増殖因子 (EGF)、肝細胞増殖因子 (HGF)、ケラチノサイト増殖因子、ァクチビン、骨形成因子、顆粒球コロニー刺激因 子（G— CSF) [J. Biol. Chem., 258, 9017 (1983)]、マクロファージコロニー刺激因子 (M - CSF) [J. Exp. Med. , 173, 269 (1992)]、幹細胞因子（SCF)、顆粒球-マクロフ ァージコロニー刺激因子（GM— CSF) [J. Biol. Chem., 252, 1998 (1977)]、インター フエロン α、インターフェロン β、インターフェロン γ、インターロイキン 2 (IL— 2) [S cience, 193, 1007 (1976)]、インターロイキン 6、インターロイキン 10、インターロイキン 1 1、インターロイキン一 12 (IL— 12) [J. Leuc. Biol , 55, 280 (1994)]、可溶性インタ 一ロイキン 4受容体、腫瘍壊死因子 at、 Dnasel、ガラクトシダーゼ、 ocダルコシダーゼ 、ダルコセレブロシダーゼ、ヘモグロビン、トランスフェリンなどがあげられる。
[0079] 抗体としては、 V、かなる抗原結合性を有する抗体でもよ!/、が、腫瘍関連抗原に結合 する抗体、アレルギーあるいは炎症に関連する抗原に結合する抗体、循環器疾患に 関連する抗原に結合する抗体、自己免疫疾患に関連する抗原に結合する抗体、ま たはウィルスあるいは細菌感染に関連する抗原に結合する抗体であることが好ましく 、抗体のクラスは IgGが好ましい。
[0080] 腫瘍関連抗原に結合する抗体としては、抗 GD2抗体 (Anticancer Res. , 13, 331-33 6, 1993)、抗 GD3抗体（Cancer Immunol. Immunother. , 36, 260-266, 1993)、抗 GM 2抗体（Cancer Res. , 54, 1511-1516, 1994)、抗 HER2抗体（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4285-4289, 1992)、抗 CD52抗体（Nature, 332, 323-327, 1988)、抗 MAGE 抗体（British J. Cancer, 83, 493-497, 2000)、抗 HM1. 24抗体（Molecular Immunol , 36, 387-395, 1999)、抗副甲状腺ホルモン関連タンパク（PTHrP)抗体（Cancer, 88, 2909-2911 , 2000)、抗 FGF8抗体（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 9911-9915, 1989 )抗塩基性繊維芽細胞増殖因子抗体、抗 FGF8受容体抗体 (J. Biol. Chem. , 265, 16 455-16463, 1990)、抗塩基性繊維芽細胞増殖因子受容体抗体、抗インスリン様増殖 因子抗体 (J. Neurosci. Res. , 40, 647-659, 1995)、抗インスリン様増殖因子受容体抗 体（J. Neurosci. Res. , 40, 647-659, 1995)、抗 PMSA抗体（J. Urology, 160, 2396-24 01 , 1998)、抗血管内皮細胞増殖因子抗体（Cancer Res. , 57, 4593-4599, 1997)、抗 血管内皮細胞増殖因子受容体抗体（Oncogene, 19, 2138-2146, 2000)、抗 CA125 抗体、抗 17-1A抗体、抗インテグリン α ν 3抗体、抗 CD33抗体、抗 CD22抗体、抗 HL A抗体、抗 HLA-DR抗体、抗 CD20抗体、抗 CD 19抗体、抗 EGF受容体抗体（Immuno logy Todayゝ 21(8)、 403- 410 (2000) )、抗 CD 10抗体（American Journal of Clinical Pat hology, 113, 374-382, 2000)などがあげられる。
[0081] アレルギーあるいは炎症に関連する抗原に結合する抗体としては、抗インターロイ キン 6抗体（Immunol. Rev. , 127, 5-24, 1992)、抗インターロイキン 6受容体抗体（Mole cular Immunol , 31 , 371-381 , 1994)、抗インターロイキン 5抗体（Immunol. Rev. , 127, 5-24, 1992)、抗インターロイキン 5受容体抗体、抗インターロイキン 4抗体（Cytokine, 3, 562-567, 1991)、抗インターロイキン 4受容体抗体（J. Immunol. Meth., 217, 41-50 , 1998)、抗腫瘍壊死因子抗体（Hybridoma, 13, 183-190, 1994)、抗腫瘍壊死因子 受容体抗体（Molecular Pharmacol, 58, 237-245, 2000)、抗 CCR4抗体（Nature, 400 , 776-780, 1999)、抗ケモカイン抗体（J. Immunol. Meth., 174, 249-257, 1994)、抗 ケモカイン受容体抗体 (J. Exp. Med., 186, 1373-1381, 1997)、抗 IgE抗体、抗 CD23 抗体、抗 CD 11 a抗体（Immunology Today, 21(8)、 403- 410 (2000) )、抗 CRTH2抗体 (J Immunol., 162, 1278-1286 (1999))、抗 CCR8抗体 (W099/25734)、抗 CCR3抗体（U S6207155)などがあげられる。
[0082] 循環器疾患に関連する抗原に結合する抗体としては、抗 GpIIb/IIIa抗体 (J. Immuno 1..152, 2968-2976, 1994)、抗血小板由来増殖因子抗体（Science, 253, 1129-1132, 1991)、抗血小板由来増殖因子受容体抗体 (J. Biol. Chem., 272, 17400-17404, 199 7)または抗血液凝固因子抗体（Circulation, 101, 1158-1164, 2000)などが挙げられ る。
自己免疫疾患 (乾癬、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマト 一デス、多発性硬化症など）に関連する抗原に結合する抗体としては、抗自己 DNA 抗体（Immunol. Letters, 72, 61-68, 2000)、抗 CDlla抗体、抗 ICAM3抗体、抗 CD80 抗体、抗 CD2抗体、抗 CD3抗体、抗 CD4抗体、抗インテグリン α 4 j8 7抗体、抗 CD40L 抗体、抗 IL-2受容体抗体（Immunology Today, 21(8)、 403-410 (2000) )などが挙げら れる。
[0083] ウィルスあるいは細菌感染に関連する抗原に結合する抗体としては、抗 gpl20抗体
(Structure, 8, 385-395, 2000)、抗 CD4抗体（J. Rheumatology, 25, 2065-2076, 1998 )、抗 CCR4抗体、抗ベロ毒素抗体 (J. Clin. Microbiol, 37, 396-399, 1999)などが挙 げられる。
以下に、本発明について、具体的に説明する。
[0084] 1.ハイプリドーマが産生するモノクローナル抗体の作製
(1)抗原の調製
抗原としては、培養細胞より漏出した細胞質シァリダーゼ、遺伝子工学的に生産さ れた細胞質シァリダーゼ、これら細胞質シァリダーゼのシァリダーゼ活性を保持した まま精製した標品などがあげられる。
[0085] 培養細胞より漏出した細胞質シァリダーゼは、通常の細胞培養の方法を用いて細 胞を培養し、該培養上清中に細胞質シァリダーゼを蓄積させ、該培養液中より採取 精製することにより、調製することができる。
遺伝子組換え細胞質シァリダーゼは、遺伝子工学の手法を用い、例えば、以下の ように作製することができる。
[0086] 細胞質シァリダーゼの cDNAあるいはゲノム DNAを調製する。
調製した cDNAあるいはゲノム DNAの塩基配列を決定する。
決定した DNAの配列に基づき、細胞質シァリダーゼをコードする部分あるいは非翻 訳領域の部分を含む適当な長さの DNA断片を調製する。
該 DNA断片を細胞内で発現させるために、調製した DNAの断片、または全長を適 当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作 製する。
[0087] 該組換えベクターを、該発現べクタ一に適した宿主細胞に導入することにより形質 転換体を得る。
導入した細胞質シァリダーゼの mRNA量、あるいは活性を指標に形質転換体を選 択する。
選択した形質転換体を、通常の細胞培養の方法を用いて培養し、該培養上清中に 細胞質シァリダーゼを蓄積させ、該培養液中より採取精製することにより、本発明の 抗体作製のための抗原として用いる細胞質シァリダーゼを調製することができる。
[0088] 宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など、目的とする 細胞質シァリダーゼを発現できるものであれば 、ずれも用いることができる。具体的 には後述の 4.に記載の宿主細胞があげられる。
発現ベクターとしては上記宿主細胞にお!、て、自立複製可能な!/、しは染色体への 組み込みが可能で、細胞質シァリダーゼをコードする DNAを転写できる位置にプロ モーターを含有しているものが用いられる。具体的には DNAポリメラーゼ IIにより転写 が行われるタイプの発現ベクターあるいは後述の 4.に記載の各種宿主細胞に適した 組換えベクターを用いることができる。
[0089] 細胞質シァリダーゼの cDNAおよびゲノム DNAを取得する方法としては、例えば、以 下に記載の方法があげられる。
cDNAの調製方法
各種宿主細胞の組織又は細胞力ゝら全 RNA又は mRNAを調製する。
[0090] 調製した全 RNA又は mRNAから cDNAライブラリーを作製する。
細胞質シァリダーゼのアミノ酸配列に基づ 、て、デジエネレイティブプライマーを作 製し、作製した cDNAライブラリーを铸型として PCR法で細胞質シァリダーゼをコード する遺伝子断片を取得する。
取得した遺伝子断片をプローブとして用い、 cDNAライブラリーをスクリーニングし、 細胞質シァリダーゼをコードする DNAを取得することができる。
[0091] ヒト又は非ヒト動物の糸且織又は細胞の mRNAは市販のもの (例えば Clontech社製)を 用いてもよ!、し、以下のようにしてヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞力も調製しても よい。
ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞力も全 RNAを調製する方法としては、チォシアン 酸グァ-ジン-トリフルォロ酢酸セシウム法 [メソッズ ·イン ·ェンザィモロジ一 (Methods i n Enzymology), 154, 3 (1987)]、酸性チォシアン酸グァ-ジン'フエノール'クロ口ホル ム（AGPC)法 [アナリティカル 'バイオケミストリー (Analytical Biochemistry), 162, 156 (1987);実験医学、 9, 1937 (1991)]などがあげられる。
[0092] また、全 RNA力 poly(A)+ RNAとして mRNAを調製する方法としては、オリゴ（dT)固 定ィ匕セルロースカラム法 (モレキュラー 'クローユング第 2版)等があげられる。
さらに、 Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen社製）、 Quick Prep mRNA Purifi cation Kit (Pharmacia社製）などの市販のキットを用いることにより mRNAを調製するこ とがでさる。
[0093] 次に、調製したヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞 mRNAから cDNAライブラリーを作 製する。 cDNAライブラリー作製法としては、モレキュラー 'クローユング第 2版、カレン ト.プロトコールズ.イン.モレキュラー.バイオロジー、 A Laboratory Manual, 2 nd Ed.( 1989)等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えば Superscript Plasmid Syste m for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (Life Technologies社製)、 ZAP- cDNA Sy nthesis Kit (STRATAGENE社製）を用いる方法などがあげられる。
[0094] cDNAライブラリーを作製するためのクローユングベクターとしては、大腸菌 K12株中 で自立複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも 使用できる。具体的には、 ZAP Express [STRATAGENE社製、ストラテジーズ (Strategi es), 5, 58 (1992)]、 pBluescript II SK(+) [ヌクレイツク'アシッド'リサーチ (Nucleic Acids Research), 17, 9494 (1989)]、 λ ZAP II (STRATAGENE社製）、 gtl0、 gtl l [ディ ーェヌエー.クロー-ング.ァ.プラクティカル.アプローチ (DNA cloning, A Practical A pproach), 1, 49 (1985)]、 λ TriplEx (Clontech社製）、 λ ExCell (Pharmacia社製）、 pT7 T318U (Pharmacia社製）、 pcD2 [モレキュラ^ ~ ·セルラ^ ~ ·バイオロジー (Mol. Cell. Biol .), 3, 280 (1983)]および pUC18 [ジーン (Gene), 33, 103 (1985)]等をあげることができ る。
[0095] cDNAライブラリーを作製するための宿主微生物としては、微生物であればいずれ でも用いることができるが、好ましくは大腸菌が用いられる。具体的には、 Escherichia coli XL1— Blue MRF' [STRATAGENE社製、ストラテジーズ (Strategies), 5, 81 (1992)] 、 Escherichia coli C600 [ジ ネテイクス (Genetics), 39, 440 (1954)]、 Escherichia coli Y1088 [サイエンス (Science), 222, 778 (1983)]、 Escherichia coliY1090 [サイエンス (Sci ence), 222, 778 (1983)]、 Escherichia coliNM522 [ジャーナノレ'ォブ'モレキュラ^ ~ ·バ ィォロジー (J. Mol. Biol), 166, 1 (1983)]、 Escherichiacoli K802 [ジャーナル'ォブ' モレキュラ^ ~ ·バイオロジー (J. Mol. Biol), 16, 118 (1966)]および Escherichiacoli JM1 05 [ジーン (Gene), 38, 275 (1985)]等が用いられる。
[0096] この cDNAライブラリ一は、そのまま以降の解析に用いてもょ 、が、不完全長 cDNA の割合を下げ、なるべく完全長 cDNAを効率よく取得するために、菅野らが開発した オリゴキャップ法 [ジーン (Gene), 138, 171 (1994);ジーン (Gene), 200, 149 (1997);蛋 白質核酸酵素， 41, 603 (1996);実験医学， 11, 2491 (1993); cDNAクローユング (羊土 社) (1996);遺伝子ライブラリーの作製法 (羊土社）（1994)]を用いて調製して以下の解 祈に用いてもよい。
[0097] 細胞質シァリダーゼのアミノ酸配列に基づいて、該アミノ酸配列をコードすることが 予測される塩基配列の 5'末端および 3'末端の塩基配列に特異的なデジエネレイティ ブプライマーを作製し、作製した cDNAライブラリーを铸型として PCR法 [ピーシーア一 ル.プロトコールズ (PCR Protocols), Academic Press (1990)]を用いて DNAの増幅を 行うことにより、細胞質シァリダーゼをコードする遺伝子断片を取得することができる。
[0098] 取得した遺伝子断片が細胞質シァリダーゼをコードする DNAであることは、通常用 いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー (Sanger)らのジデォキシ法 [プロシー ディングス 'ォブ 'ザ ·ナショナル 'アカデミ^ ~ ·ォブ'サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 74, 5463 (1977)]あるいは ABI PRISM377DNAシークェンサ一（Applied Bios ystems社製)等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、確認することがで きる。
[0099] 該遺伝子断片をプローブとして、ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞に含まれる mR NAから合成した cDNAあるいは cDNAライブラリーからコロニーハイブリダィゼーシヨン やプラークハイブリダィゼーシヨン (モレキュラー ·クロー-ング第 2版)等を用いて、細 胞質シァリダーゼの DNAを取得することができる。
また、細胞質シァリダーゼをコードする遺伝子断片を取得するために用いたプライ マーを用い、ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞に含まれる mRNA力も合成した cDNA あるいは cDNAライブラリーを铸型として、 PCR法を用いて増幅することにより、細胞質 シァリダーゼの cDNAを取得することもできる。
[0100] 取得した細胞質シァリダーゼをコードする DNAの塩基配列は、通常用いられる塩基 配列解析方法、例えばサンガー (Sanger)らのジデォキシ法 [プロシーディンダス 'ォ ブ ·ザ'ナショナル ·アカデミ^ ~ ·ォブ 'サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 74, 5 463 (1977)]あるいは ABI PRISM377DNAシークェンサ一（Applied Biosystems社製） 等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該 DNAの塩基配列を決定する ことができる。
[0101] 決定した cDNAの塩基配列をもとに、 BLAST等の相同性検索プログラムを用いて、 Genbank、 EMBLおよび DDBJなどの塩基配列データベースを検索することにより、取 得した DNAがデータベース中の遺伝子の中で細胞質シァリダーゼをコードしている 遺伝子であることを確認することもできる。 上記の方法で得られる細胞質シァリダーゼをコードする遺伝子の塩基配列としては
、例えば、配列番号 1、 2、 3または 4に記載の塩基配列があげられる。
[0102] 決定された DNAの塩基配列に基づいて、フォスフォアミダイト法を利用した DNA合 成機 model 392 (Perkin Elmer社製)等の DNA合成機でィ匕学合成することにより、細胞 質シァリダーゼの cDNAを取得することもできる。
細胞質シァリダーゼのゲノム DNAを調製する方法としては、例えば、以下に記載の 方法があげられる。
ゲノム DNAの調製方法
ゲノム DNAを調製する方法としては、モレキュラー ·クローユング第 2版やカレント · プロトコールズ ·イン.モレキュラー.バイオロジー等に記載された公知の方法があげら れる。また、ゲノム DNAライブラリースクリーニングシステム（Genome Systems社製）や Universal GenomeWalkerTM Kits (CLONTECH社製）などを用いることにより、細胞 質シァリダーゼのゲノム DNAを取得することもできる。
[0103] 細胞質シァリダーゼの活性を指標として形質転換体を選択する方法としては、例え ば、以下の方法があげられる。
形 転 撰枳する方法
細胞質シァリダーゼを発現した細胞を選択する方法としては、文献ほ生化学実験 講座 3-糖質 I,糖蛋白質 (東京化学同人）日本生化学会編 (1998)]、文献 [細胞工学， 別冊,実験プロトコールシリーズ,グライコバイオロジー実験プロトコール,糖蛋白質'糖 脂質'プロテオダリカン (秀潤社)谷 p直之 '鈴木明美 ·古川清 ·菅原一幸監修 (1996) ]、モレキュラ^ ~ ·クロー-ング第 2版、カレント 'プロトコ一ルズ'イン'モレキュラ^ ~ ·バイ ォロジ一などに記載された生化学的な方法あるいは遺伝子工学的な手法などがあげ られる。生化学的な方法としては、例えば、酵素特異的な基質を用いて酵素活性を 測定する方法があげられる。遺伝子工学的な手法としては。例えば、細胞質シァリダ ーゼの遺伝子の mRNA量を測定するノーザン解析や RT-PCR法などがあげられる。
[0104] (2)ポリクローナル抗体の作製
上記（1)で作製された抗原を動物に投与することにより、ポリクローナル抗体を作製 することができる。 シァリダーゼ活性の中和抗体を得るためには、糖蛋白質に付加した糖鎖の非還元 末端からシアル酸を除去する反応を触媒する活性を有する抗原を用いることが望ま しい。
[0105] 投与する動物として、ゥサギ、ャギ、ラット、マウス、ハムスター等を用いることができ る。
該抗原の投与量は動物 1匹当たり 50〜： LOO μ gが好まし 、。
投与する抗原の免疫原性を上げるためには、該抗原をスカシガイへモシァニン (ke yhole limpet haemocyanin)ゃ牛チログロブリンなどのキャリア蛋白に共有結合させた ものを抗原として用いることが望まし ヽ。抗原とする細胞培養液技術あるいは遺伝子 組換え技術を用いて調製することができる。
[0106] 該抗原の投与は、 1回目の投与の後 1〜2週間おきに 3〜10回行う。各投与後、 3 〜7日目に眼底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵 素免疫測定法〔酵素免疫測定法 (ELISA法）：医学書院刊（1976)、 Antibodies-A La boratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)〕等で確認する。
免疫に用いた抗原に対し、その血清が充分な抗体価を示した非ヒト哺乳動物より血 清を取得し、該血清を分離、精製することによりポリクローナル抗体を取得することが できる。
[0107] 分離、精製する方法としては、遠心分離、 40〜50%飽和硫酸アンモ-ゥムによる 塩析、カプリノレ酸沈殿 [Antibodies, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Labor atory (1988)〕、または DEAE—セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテイン Aまたは G—カラムあるいはゲノレ濾過カラム等を用いるクロマトグラフィー等を、単独 または組み合わせて処理する方法があげられる。
[0108] (3)モノクローナル抗体の作製
(a)抗体産性細胞の調製
免疫に用いた、上記（1)で作製された抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示 したラットを抗体産生細胞の供給源として供する。
該抗体価を示したラットに抗原物質を最終投与した後 3〜7日目に、脾臓を摘出す る。 [0109] 該脾臓を MEM培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、 1, 200rpm で 5分間遠心分離した後、上清を捨てる。
得られた沈殿画分の脾細胞をトリス—塩ィ匕アンモ-ゥム緩衝液 (PH7. 65)で 1〜2 分間処理し赤血球を除去した後、 MEM培地で 3回洗浄し、得られた脾細胞を抗体 産生細胞として用いる。
[0110] (b)骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスまたはラットから取得した株化細胞を使用する。例えば 、 8—ァザグァニン耐性マウス（BALB/c由来）骨髄腫細胞株 P3- X63Ag8- U1 (以下、 P 3— U1と略す）〔Curr. Topics. Microbiol. Immunol, 81, 1 (1978)、 Eur op. J. Immunol. , 6, 511 (1976)] , SP2/0-Agl4(SP-2) [Nature, 276, 269 (1978)〕、 P3— X63— Ag8653(65 3) [J. Immunol, 123, 1548 (1979)〕、 P3-X63-Ag8(X63丌 Nature, 256, 495 (1975)〕等を 用いることができる。これらの細胞株は、 8—ァザグァニン培地〔RPMI— 1640培地 にグルタミン（1. 5mmol/L)、 2—メルカプトエタノール（5 X 10— 5mol/L)、ジェンタ マイシン（10 μ g/ml)および牛胎児血清 (FCS) (CSL社製、 10%)をカ卩えた培地（ 以下、正常培地という）に、さらに 8—ァザグァニン（15 gZml)をカ卩えた培地〕で継 代するが、細胞融合の 3〜4日前に正常培地で培養し、融合には該細胞を 2 X 107個 以上用いる。
[0111] (c)ハイプリドーマの作製
(a)で取得した抗体産生細胞と (b)で取得した骨髄腫細胞を MEM培地または PB S (リン酸ニナトリウム 1. 83g、リン酸一カリウム 0. 21g、食塩 7. 65g、蒸留水 1リットル 、 pH7. 2)でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞:骨髄腫細胞 = 5〜： L0 : 1になるよ う混合し、 1, 200rpmで 5分間遠心分離した後、上清を捨てる。
[0112] 得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に、攪拌しながら、 37°Cで、 108 抗体産生細胞あたり、ポリエチレングライコ一ルー 1000 (PEG— 1000) 2g、 MEM 2mlおよびジメチルスルホキシド（DMSO) O. 7mlを混合した溶液を 0. 2〜： Lml添カロ し、さらに 1〜2分間毎に MEM培地 l〜2mlを数回添加する。 添加後、 MEM培地 を加えて全量が 50mlになるように調製する。該調製液を 900rpmで 5分間遠心分離 後、上清を捨てる。得られた沈殿画分の細胞を、ゆるやかにほぐした後、メスピペット による吸込み、吹出しでゆるやかに HAT培地〔正常培地にヒポキサンチン（10— 4mol ZL)、チミジン（1. 5 X 10— 5molZL)およびアミノプテリン（4 X 10— 7molZL)をカロえ た培地〕 100ml中に懸濁する。
[0113] 該懸濁液を 96穴培養用プレートに 100 μ 1Ζ穴ずつ分注し、 5%COインキュベー
2
ター中、 37°Cで 7〜14日間培養する。
培養後、培養上清の一部をとりアンチボディィズ [Antibodies, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14 (1988)〕等に述べられている酵素免疫 測定法により、培養細胞より漏出した細胞質シァリダーゼ、糖蛋白質に付加した糖鎖 の非還元末端からシアル酸を除去する反応を触媒する活性を有する遺伝子組換え 細胞質シァリダーゼ、または、シァリダーゼ活性を保持したまま精製した標品を抗原 に特異的に反応するハイプリドーマを選択する。
[0114] 酵素免疫測定法の具体的例として、以下の方法をあげることができる。
免疫の際、抗原に用いた、培養細胞より漏出した細胞質シァリダーゼ、糖蛋白質に 付加した糖鎖の非還元末端からシアル酸を除去する反応を触媒する活性を有する 遺伝子組換え細胞質シァリダーゼ、または、シァリダーゼ活性を保持したまま精製し た標品を適当なプレートにコートし、ハイプリドーマ培養上清もしくは後述の（d)で得 られる精製抗体を第一抗体として反応させ、さらに第二抗体としてピオチン、酵素、 化学発光物質あるいは放射線ィ匕合物等で標識した抗ラットまたは抗マウスィムノグロ ブリン抗体を反応させた後に標識物質に応じた反応を行ない、免疫に用いた抗原に 特異的に反応するものを本発明のモノクローナル抗体を生産するハイプリドーマとし て選択する。
[0115] 該ノ、イブリドーマを用いて、限界希釈法によりクローユングを 2回繰り返し〔1回目は 、 HT培地 (HAT培地カゝらアミノプテリンを除いた培地）、 2回目は、正常培地を使用 する〕、安定して強い抗体価の認められたものを本発明のモノクローナル抗体を産生 するハイプリドーマ株として選択する。
(d)モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理〔2, 6, 10, 14ーテトラメチルペンタデカン（Pristane) O. 5mlを腹 腔内投与し、 2週間飼育する〕した 8〜： L0週令のマウスまたはヌードマウスに、（c)で 取得した本発明の蛋白質モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞 5〜20 X 10b 細胞 Z匹を腹腔内に注射する。 10〜21日間でハイプリドーマは腹水癌化する。
[0116] 該腹水癌化したマウスから腹水を採取し、 3000rpmで 5分間遠心分離して固形分 を除去する。
得られた上清より、ポリクローナルで用いた方法と同様の方法でモノクローナル抗体 を精製、取得することができる。
抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピングキットまたはラット モノクローナル抗体タイピングキットを用いて行う。蛋白質量は、ローリー法あるいは 2 80nmでの吸光度より算出する。
[0117] 2.遺伝子組換え抗体の作製
遺伝子組換え抗体の作製例として、以下にヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体の作 製方法を示す。
(1) 遺伝子組換え抗体発現用ベクターの構築
遺伝子組換え抗体発現用ベクターとは、ヒト抗体の CHおよび CLをコードする DN Aが組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗 体の CHおよび CLをコードする DNAをそれぞれクローユングすることにより構築する ことができる。
[0118] ヒト抗体の C領域は任意のヒト抗体の CHおよび CLであることができ、例えば、ヒト抗 体の γ 1サブクラスの CHおよび κクラスの CLなどがあげられる。ヒト抗体の CHおよ び CLをコードする DNAとしてはェキソンとイントロンからなる染色体 DNAを用いるこ とも、 cDNAを用いることもできる力 cDN Aを用いるのが好ましい。動物細胞用発現 ベクターとしては、ヒト抗体の C領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであ ればいかなるものでも用いることができる。例えば、 pAGE107〔Cytotechnol. , 3, 133 (1990)〕、 pAGE103 ( i. Biochem. , 101, 1307 (1987)、 pHSG274〔Ge ne, 27, 223 (1984)〕、 pKCR〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527 (1981 )〕、 pSGlbd2— 4〔Cytotechnol. , 4, 173 (1990)〕、 pSElUKlSedl— 3〔Cyto technol. , 13, 79 (1993)〕などがあげられる。動物細胞用発現ベクターに用いる プロモーターとェンハンサ一としては、 SV40の初期プロモーター i. Biochem. , 1 01, 1307 (1987)〕、モロ-一マウス白血病ウィルスの LTR〔： Biochem. Biophys. Res. Commun. , 149, 960 (1987)〕、免疫グロブリン H鎖のプロモーター〔Cell, 41, 479 (1985)〕とェンハンサー 611, 33, 717 (1983)〕などがあげられる。
[0119] 遺伝子組換え抗体発現用ベクターは、抗体 H鎖および L鎖が別々のベクター上に 存在するタイプある 、は同一のベクター上に存在するタイプ（タンデム型）のどちらで も用いることができるが、遺伝子組換え抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞 への導入の容易さ、動物細胞内での抗体 H鎖および L鎖の発現量のバランスが均衡 するなどの点力 タンデム型の遺伝子組換え抗体発現用ベクターの方が好ま ヽ CF . Immunol. Methods, 167, 271 (1994)〕。タンデム型の遺伝子組換え抗体発現 用ベクターとしては、 pKANTEX93 (WO97Zl0354)、 pEE18〔Hybridoma, 17 , 559 (1998)〕などがあげられる。
[0120] 構築した遺伝子組換え抗体発現用ベクターは、ヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体の 動物細胞での発現に使用できる。
(2)ヒト以外の動物由来の抗体の V領域をコードする cDNAの取得およびアミノ酸 配列の解析
ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体の VH及び VLをコードする cDNAは以 下の様にして取得することができる。
[0121] マウス抗体などを産生するハイブリドーマ細胞より mRNAを抽出し、 cDNAを合成 する。合成した cDNAをファージ或いはプラスミドなどのベクターにクローユングして c DNAライブラリーを作製する。該ライブラリーより、マウス抗体の C領域部分或いは V 領域部分をコードする DNAをプローブとして用い、 VHまたは VLをコードする cDN Aを有する組換えファージ或 、は組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファ ージ或いは組換えプラスミド上の目的とするマウス抗体の VHまたは VLの全塩基配 列をそれぞれ決定し、塩基配列より VHまたは VLの全アミノ酸配列をそれぞれ推定 する。
[0122] ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ノ、ムスター、ラビットなどのハイプリドーマ細 胞を作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ノ、イブリドーマ細胞力も全 RNAを調製する方法としては、チォシアン酸グァ-ジン —トリフルォロ酢酸セシウム法 [Methods in Enzymol. , 1 , 3 (1987) ]、また 全 RNAから mRNAを調製する方法としては、オリゴ (dT)固定ィ匕セルロースカラム法 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) ]等があげられる。また、ハイプリドー マ細胞から mRNAを調製するキットとしては、 Fast Track mRNA Isolation Ki t (Invitrogen社製)、 Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia社製 )等があげられる。
[0123] cDNAの合成及び cDNAライブラリ一作製法としては、常法 [Molecular Clonin g, A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Lab oratory Press, 1989)； Current Protocols in Molecular Biology) , Sup plement 1 34]、或いは市販のキット、例えば、 Super Script™ Plasmid Sy stem for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (GIBCO BRL社製）や ZAP— cDNA Synthesis Kit (Stratagene社製）を用いる方法等があげられる。
[0124] cDNAライブラリーの作製の際、ハイプリドーマ細胞力 抽出した mRNAを铸型と して合成した cDNAを組み込むベクターは、該 cDNAを組み込めるベクターであれ ばいかなるものでも用いることができる。例えば、 ZAP Express [Strategies, 5, 5 8 (1992) ]、 pBluescript II SK ( + ) [Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1 989) ]、 λ ZAPII (Stratagene社製）、 gtlO、 l gtl l [DNA Cloning : A Prac tical Approach, I, 49 (1985) ]、 Lambda BlueMid (Clontech社製）、 X ExC ell、pT7T3 18U (Pharmacia社製）、 pcD2 [Mol. Cell. Biol. , 3, 280 (1983 ) ]及び pUC18 [Gene, 33, 103 (1985) ]等が用いられる。
[0125] ファージ或いはプラスミドベクターにより構築される cDNAライブラリーを導入する大 腸菌としては該 cDNAライブラリーを導入、発現及び維持できるものであれば ヽかな るものでも用いることができる。例えば、 XL 1 - Blue MRF， [Strategies, 5, 81 (1 992) ]、 C600 [Genetics, 39, 440 (1954) ]、 Y1088、 Y1090 [Science, 222, 778 (1983) ]、 NM522 Q1. Mol. Biol. , 166, 1 (1983) ]、 K802 Q[. Mol. Biol. , 16, 118 (1966) ]¾U iM105 [Gene, 38, 275 (1985) ]等力 ^用!ヽられる。
[0126] cDNAライブラリーからのヒト以外の動物の抗体の VHまたは VLをコードする cDN Aクローンの選択法としては、アイソトープ或いは蛍光標識したプローブを用いたコロ ^ ~ ·ハイブリダィゼーシヨン法或いはプラーク'ノヽィブリダィゼーシヨン法 [Molecula r し lonmg, A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Ha rbor Laboratory Press, 1989) ]により選択することができる。また、プライマーを 調製し、 mRNAから合成した cDNA或いは cDNAライブラリーを铸型として、 Polym erase Chain Reaction [以下、 PCR法と表記する； Molecular Cloning, A La b oratory Manual, Second Edition^ Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ； Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1 - 34]により VHまたは VLをコードする cDNAを調製することもできる。
[0127] 上記方法により選択された cDNAを、適当な制限酵素等で切断後、 pBluescript SK (-) (Stratagene社製)等のプラスミドにクローユングし、通常用いられる塩基配 列解析方法、例えば、サンガー（Sanger, F. )らのジデォキシ法 [Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA, 74, 5463 (1977) ]等の反応を行い、塩基配列自動分析装置、例 えば、 A. L. F. DNAシークェンサ一（Pharmacia社製）等を用いて解析することで 該 cDNAの塩基配列を決定することができる。
[0128] 決定した塩基配列から VH及び VLの全アミノ酸配列をそれぞれ推定し、既知の抗 体の VH及び VLの全アミノ酸配列 [Sequences of Proteins of Immunologic al Interest, US Dept. Health and Human Services (1991) ]と比較するこ と〖こより、取得した cDNAが分泌シグナル配列を含む抗体の VH及び VLの完全なァ ミノ酸配列をコードして 、るかをそれぞれ確認することができる。分泌シグナル配列を 含む抗体の VH及び VLの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体の VH及び V Lの全ァ ノ酸酉己列 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, U S Dept. Health and Human Services (1991) ]と比較することにより、分泌シ グナル配列の長さ及び N末端アミノ酸配列を推定でき、更にはそれらが属するサブグ ループを知ることができる。また、 VH及び VLの各 CDRのアミノ酸配列についても、 既知の抗体の VH及び VLのアミノ酸配列 [Sequences of Proteins of Immun ological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991) ]と比 較することによって見出すことができる。 [0129] 更に VH及び VLの完全なアミノ酸配列を用いて任意のデータベース、例えば、 SW ISS— PROTや PIR— Protein等に対して BLAST法 ϋ. Mol. Biol. , 215, 403 ( 1990) ]等の配列の相同性検索を行い、配列の新規性を検討することができる。
(3)ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
本項 2の（1)に記載の遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体の CHまたは C Lをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、それぞれヒト以外の動物の抗体の VHま たは VLをコードする cDNAをそれぞれクローユングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクター を構築することができる。例えば、ヒト以外の動物の抗体の VHまたは VLをコードする それぞれの cDNAを、ヒト以外の動物の抗体の VHまたは VLの 3，末端側の塩基配 列とヒト抗体の CHまたは CLの 5'末端側の塩基配列とから成り、かつ適当な制限酵 素の認識配列を両端に有する合成 DNAとそれぞれ連結し、それぞれを本項 2の（1) に記載の遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体の CHまたは CLをコードする それぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現する様にそれぞれクローユング し、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。また、ヒト以外の動物の抗 体 VHまたは VLをコードする cDNAを、適当な制限酵素の認識配列を両端に有する 合成 DNAを用いて PCR法によりそれぞれ増幅し、それぞれを本項 2の（1)に記載の 遺伝子組換え抗体発現用ベクターにクロー-ングすることもできる。
[0130] (4)ヒトイ匕抗体の V領域をコードする cDNAの構築
ヒト化抗体の VHまたは VLをコードする cDNAは、以下の様にして構築することが できる。まず、 目的のヒト以外の動物の抗体の VHまたは VLの CDRのアミノ酸配列を 移植するヒト抗体の VHまたは VLのフレームワーク領域（以下、 FRと表記する）のアミ ノ酸配列をそれぞれ選択する。ヒト抗体の VHまたは VLの FRのアミノ酸配列としては 、ヒト抗体由来のものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、 Protei n Data Bank等のデータベースに登録されているヒト抗体の VHまたは VLの FRの アミノ酸配列、ヒト抗体の VHまたは VLの FRの各サブグループの共通アミノ酸配列 [ sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Healtn and Human Services (1991) ]等があげられる力 その中でも、十分な活性を有 するヒト型 CDR移植抗体を作製するためには、 目的のヒト以外の動物の抗体の VHま たは VLの FRのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性 (少なくとも 60%以上）をそれぞ れ有するアミノ酸配列を選択することが望ましい。次に、選択したヒト抗体の VHまた は VLの FRのアミノ酸配列に目的のヒト以外の動物の抗体の VHまたは VLの CDRの アミノ酸配列をそれぞれ移植し、ヒト型 CDR移植抗体の VHまたは VLのアミノ酸配列 をそれぞれ設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られる コトンの使用頻度 [sequences of Proteins of Immunological Interest, U S Dept. Health and Human Services (1991) ]を考慮して DNA配列に変換 し、ヒト型 CDR移植抗体の VHまたは VLのアミノ酸配列をコードする DNA配列をそ れぞれ設計する。設計した DNA配列に基づき、 100塩基前後の長さからなる数本の 合成 DNAを合成し、それらを用いて PCR法を行う。この場合、 PCRでの反応効率及 び合成可能な DNAの長さから、 H鎖、 L鎖とも 6本の合成 DNAを設計することが好 ましい。
[0131] また、両端に位置する合成 DNAの 5'末端に適当な制限酵素の認識配列を導入 することで、本項 2の（1)で構築した遺伝子組換え抗体発現用ベクターに容易にヒト 化抗体の VHまたは VLをコードする cDNAをクロー-ングすることができる。 PCR反 応後、増幅産物を pBluescript SK (-) (Stratagene社製）等のプラスミドにそれ ぞれクローニングし、本項 2の（2)に記載の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒ ト化抗体の VHまたは VLのアミノ酸配列をコードする DNA配列を有するプラスミドを 取得する。
[0132] (5)ヒト化抗体の V領域のアミノ酸配列の改変
ヒト化抗体は、 目的のヒト以外の動物の抗体の VH及び VLの CDRのみをヒト抗体の VH及び VLの FRに移植しただけでは、その抗原結合活性は元のヒト以外の動物の 抗体に比べて低下してしまうことが知られている [BIOZTECHNOLOGY, 9, 266 (1991) ]。この原因としては、元のヒト以外の動物の抗体の VH及び VLでは、 CDR のみならず、 FRのいくつかのアミノ酸残基が直接的或いは間接的に抗原結合活性 に関与しており、それらアミノ酸残基力 SCDRの移植に伴い、ヒト抗体の VH及び VLの FRの異なるアミノ酸残基へと変化してしまうことが考えられて 、る。この問題を解決す るため、ヒト化抗体では、ヒト抗体の VH及び VLの FRのアミノ酸配列の中で、直接抗 原との結合に関与しているアミノ酸残基や CDRのアミノ酸残基と相互作用したり、抗 体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定 し、それらを元のヒト以外の動物の抗体に見出されるアミノ酸残基に改変し、低下した 抗原結合活性を上昇させることが行われている [BIOZTECHNOLOGY, 9, 266 ( 1991) ]。ヒトイ匕抗体の作製においては、それら抗原結合活性に関わる FRのアミノ酸 残基を如何に効率よく同定するか力 最も重要な点であり、そのために X線結晶解析 [J. Mol. Biol. , 112, 535 (1977) ]或いはコンピューターモデリング [Protein Engineering, 7, 1501 (1994) ]等による抗体の立体構造の構築及び解析が行 われている。これら抗体の立体構造の情報は、ヒト化抗体の作製に多くの有益な情報 をもたらして来たが、その一方、あらゆる抗体に適応可能なヒト化抗体の作製法は未 だ確立されておらず、現状ではそれぞれの抗体について数種の改変体を作製し、そ れぞれの抗原結合活性との相関を検討する等の種々の試行錯誤が必要である。
[0133] ヒト抗体の VH及び VLの FRのアミノ酸残基の改変は、改変用合成 DNAを用いて 本項 2の（4)に記載の PCR法を行うことにより、達成できる。 PCR後の増幅産物につ いて本項 2の（2)に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたこ とを確認する。
(6)ヒト化抗体発現ベクターの構築
本項 2の（1)に記載の遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体の CHまたは C Lをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、構築したヒト化抗体の VHまたは VLをコ ードする cDNAをそれぞれクローユングし、ヒト化抗体発現ベクターを構築することが できる。
[0134] 例えば、本項 2の (4)及び（5)でヒト化抗体の VHまたは VLを構築する際に用いる 合成 DNAのうち、両端に位置する合成 DNAの 5'末端に適当な制限酵素の認識配 列を導入することで、本項 2の（1)に記載の遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト 抗体の CHまたは CLをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で 発現するようにそれぞれクローユングすることができる。
[0135] (7)遺伝子組換え抗体の一過性発現
作製した多種類の遺伝子組換え抗体の抗原結合活性を効率的に評価するために 、本項 2の（3)及び (6)に記載の遺伝子組換え抗体発現ベクター、或いはそれらを改 変した発現ベクターを用いて遺伝子組換え抗体の一過性発現を行うことができる。発 現ベクターを導入する宿主細胞としては、遺伝子組換え抗体を発現できる宿主細胞 であれば、いかなる細胞でも用いることができる力 その発現量の高さから、 COS - 7 細胞（ATCC CRL 1651)が一般に用いられる [Methods in Nucleic Acids Res. , CRC press, 283 (1991) ]。 COS— 7細胞への発現ベクターの導入法とし ては、 DEAE—デキストラン法 [Methods in Nucleic Acids Res. , CRC pre ss, 283 (1991) ]、リポフエクシヨン法 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 ( 1987) ]等があげられる。
[0136] 発現ベクターの導入後、培養上清中のヒト化抗体の発現量及び抗原結合活性は酵 素免疫抗体法 [以下、 ELIS A法と表記する； Monoclonal Antibodies— Principl es and practice, Third edition, Academic Press、丄 996ノ、 Antibodies—— A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)、単クロ ーン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（1987) ]等により測定できる。
[0137] (8)遺伝子組換え抗体の安定発現
本項 2の（3)及び (6)に記載の遺伝子組換え抗体発現ベクターを適当な宿主細胞 に導入することにより遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株を得ることが できる。
宿主細胞への発現ベクターの導入法としては、エレクト口ポレーシヨン法 [特開平 2 — 257891、 Cytotechnology, 3, 133 (1990) ]等力あげられる。
[0138] 遺伝子組換え抗体発現ベクターを導入する宿主細胞としては、遺伝子組換え抗体 を発現させることができる宿主細胞であれば、 、かなる細胞でも用いることができる。 例えば、マウス SP2Z0— Agl4細胞（ATCC CRL1581)、マウス P3X63— Ag8. 653細胞 (ATCC CRL1580)、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、 dhfrと表記す る）が欠損した CHO細胞 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980) ]、レ クチン而性を獲得した Lec 13 [Somatic Cell and Molecular genetics, 12, 5 5 (1986) ]、 a -1,6フコース転移酵素遺伝子が欠損した CHO細胞（WO02/31140、 WO03/85107)、ラット YB2/3HL. P2. Gi l . 16Ag. 20細胞（ATCC CRL1662 )などがあげられる。
[0139] 上記宿主細胞の他、細胞内糖ヌクレオチド GDP—フコースの合成に関与する酵素 などの蛋白質、 N—グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端の N—ァセチルダルコサミ ンの 6位にフコースの 1位が oc結合する糖鎖修飾に関与する酵素などの蛋白質また は細胞内糖ヌクレオチド GDP—フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質など の活性が低下または欠失した宿主細胞（WO02/31140、 WO03/85107, WO03/8510 2)などを用いることもできる。
[0140] 発現ベクターの導入後、ヒト化抗体を安定に発現する形質転換株は、特開平 2— 2 57891に開示されている方法に従い、 G418硫酸塩（以下、 G418と表記する： SIG MA社製)等の薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択できる。動 物細胞培養用培地としては、 RPMI1640培地（Invitrogen社製）、 GIT培地（日本 製薬社製）、 EX— CELL301培地 (JRH社製）、 IMDM培地（Invitrogen社製）、 H ybridoma— SFM培地 (Invitrogen社製）、またはこれら培地に牛胎児血清（以下、 FBSと表記する）等の各種添加物を添加した培地等を用いることができる。得られた 形質転換株を培地中で培養することで培養上清中にヒト化抗体を発現蓄積させるこ とができる。培養上清中のヒト化抗体の発現量及び抗原結合活性は ELISA法等によ り測定できる。また、形質転換株は、特開平 2— 257891に開示されている方法に従 い、 dhfr増幅系等を利用してヒト化抗体の発現量を上昇させることができる。
[0141] 遺伝子組換え抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテイン Aカラムを用いて精製 すること力 Sでさる LMonoclonal Antibodies― Principles and practice, Third edition, Academic Press ( 1996)、 Antibodies— A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory ( 1988) ]。また、その他に通常、蛋白質の精 製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロ マトグラフィー及び限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製し た遺伝子組換え抗体の H鎖、 L鎖或いは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動 [以下、 SDS— PAGEと表記する： Nature, 227, 680 ( 1970) ] やウェスタンブロッテイング法 [Monoclonal Antibodies― Principles and prac tic e, Third edition, Academic Press ( 1996)、 Antibodies— A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) ]等で測定することができ る。
[0142] 3.本発明の抗体または抗体断片の活性評価
精製した本発明の抗体または抗体断片の抗原との結合活性は ELISA法および蛍 光抗体法 [Cancer Immunol. Immunother. , 36, 373 (1993) ]または BIAcor e™などを用いた表面プラズモン共鳴等により測定できる。
また、シァリダーゼの中和活性を評価する方法としては、シァリダーゼがシァリダ一 ゼ 光^'貪 4— methylumbelliferyl— N— —D— acetylneuraminic acid ammonium saltを分 解することにより発生する蛍光の増強を指標として、抗体または抗体断片の添加によ り抑制される割合を測定する方法 [Glycobiology vol.3, 455-463 (1993)、 BIO/TECH NOLOGY vol.13, 692 (1995)]を用いることができる。また、抗体がシァリダ一ゼの立 体構造を認識するか否かを評価する方法としては、 SDS-ポリアクリルアミド電気泳動 したシァリダーゼ蛋白質に対して、抗体または抗体断片を用いたウェスタンプロッティ ングを行う方法 (実験医学別冊バイオマニュアルシリーズ改訂版分子生物学者のた めのタンパク質実験法羊土社 1998年ページ 221-244)、抗体または抗体断片を用 V、たウェストウェスタンブロッテイングを行う方法 (実験医学別冊バイオマ-ユアルシリ ーズ改訂版分子生物学者のためのタンパク質実験法羊土社 1998年ページ 245-25 3)、免疫沈降法 (実験医学別冊バイオマニュアルシリーズ改訂版分子生物学者のた めのタンパク質実験法羊土社 1998年ページ 103-110)などがあげられる。
[0143] 4.本発明の抗体を用いた糖蛋白質組成物の製造方法
(1)培地の調製
本発明の抗体を添加した培地は、細胞培養に用いられる培地を基礎培地として調 製することができる。
基礎培地としては、 BME培地（Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 89, 362, 1965)、 BGJb培 地（Exp. Cell Res., 25, 41, 1961)、 CMRL 1066培地（N. Y. Academy of Sciences, 5, 303, 1957)、 Glasgow MEM培地（Virology, 16, 147, 1962)、 Improved MEM Zinc Opt ion培地（J. National Cancer Inst., 49, 1705, 1972)、 IMDM培地（In Vitro, 9, 6, 1970 )、 Medium 199培地（Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1, 1950)、 Eagle MEM培地（Sci ence, 130, 432, 1959)、 Alpha MEM培地（Nature New Biology, 230, 310, 1971)、 Dul becco MEM培地（Virology, 8, 396, 1959)、ハム培地（Exp. Cell Res., 29, 515, 1963; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 53, 288, 1965)、 RPMI 1640培地（J. A. M. A" 199, 519 , 1967)、 Fischer' s培地（Methods in Med. Res., 10, 1964)、 McCoy' s培地（Proc. So c. Exp. Biol. Med., 100, 115, 1959)、ウイリアムス E培地（Exp. Cell Res., 69, 106, 19 71; Exp. Cell Res., 89, 139, 1974)およびこれらの混合培地など、細胞の培養に用い ることのできる培地であれば!/、ずれも用いることができる。
[0144] ま 7こ、 Manipulating the Mouse Em Dry o A Laboratory Manual, second Edition, Cold
Spring Harbor Laboratory Press (1994)、 Methods in Enzymology volume 225, Guide to Techniques in Mouse Development, Academic Press (1993)、ノィォマ-ユアルシ リーズ 8ジーンターゲッティング， ES細胞を用いた変異マウスの作製,羊土社（1995)〕 等に記載の胚培養のための培地、例えば、 M2培地、 M16培地、 Whitten培地、体 外受精用培地など、胚の培養に用いることのできる培地であれば 、ずれも基礎培地 として用いることができる。
[0145] さらに、これら上記培地に、血清を添加した培地、血清代替物としての各種増殖因 子を添加した培地、ストローマ細胞などが産生する因子を添加した培地、あるいは無 蛋白培地であっても細胞ゃ胚の培養が可能であるものであれば 、ずれも用いること ができる。その具体的例として、市販の KNOCKOUT™SRを添カ卩した無血清培地 (M. D. Goldsboroughら； Focus, 20, 8, 1998)、インスリンおよびトランスフェリンを添加した 無血清培地 [例えば、 CHO-S-SFM II (GIBCOBRL社製）、 Hybridoma- SFM (GIBCO BRL社製）、 eRDF Dry Powdered Media (GIBCOBRL社製）、 UltraCULTURE™ (Bio Whittaker社製）、 UltraDOMA™(BioWhittaker社製）、 UltraCHO™ (BioWhittaker社 製）、 UltraMDCK™(BioWhittaker社製）、 ITPSG培地（S. Hosoiら； Cytotechnology, 5 , S17, 1991)、 ITSFn培地（A. Rizzino and C. Growley; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 457, 1980)、 mN3培地（S. Okabeら； Mech. Dev., 59, 89, 1996)など]、細胞由来 の因子を添加した培地 [例えば、多能性奇形癌腫細胞 PSA1の培養上清を添加した 培地（G. R. Martin; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 7634, 1981)、または無蛋白培 地（例えば、 CD- CHO (GIBCOBRL社製）、 PFHM- II (GIBCOBRL社製）、 UltraDOM A-PF™ (BioWhittaker社製)など）が挙げられる。
[0146] これら基礎培地の好適な例として、例えば EXCELL302 (JRH Biosciences社製）、 C HO-S-SFM IKGIBCOBRL社製）などが挙げられる。この無血清基本培地において、 IMDM培地にカ卩えられる各添加物の濃度は上述の濃度の 100倍〜 100分の 1、好 ましくは 10倍〜 10分の 1に変更しても構わな!/、。
これら基礎培地に、本発明の抗体を 0. lngZml〜100 μ g/mU好ましくは lng Ζπι1〜10 /ζ gZml、より好ましくは 10ngZml〜l μ gZmlの濃度で添加することで 、本発明の抗体を添加した培地を調製することができる。また、本発明の細胞質シァ リダーゼの活性を中和する抗体を基礎培地に直接添加せず、細胞培養中に 10〜 1 00倍濃度の溶液として追添加することもできる。追添加する場合には、本発明の抗 体を溶解させたフィード培地を用いても良いし、本発明の抗体を適当な緩衝液に溶 解した溶液を用いても構わな 、。
[0147] (2)糖蛋白質組成物の製造方法
本発明の糖蛋白質組成物は、上記 1および 2で作製した、本発明のモノクローナル 抗体を培養液中に添加して、目的とする糖蛋白質組成物を生産する細胞を培養する ことで製造することができる。
糖蛋白質組成物は、モレキュラー 'クローユング第 2版、カレント 'プロトコールズ 'ィ ン'モレキュフ1 ~~ノ ィォロン1 ~~、 Antibodies, A Laboratory manual, し old Spring Harbor
Laboratory, 1988 (以下、アンチボディズと略す）、 Monoclonal Antibodies: principles and practice, Third Edition, Acad. Press, 1993 (以下、モノクロ一ナノレアンチボディズ と略す)、 Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press at Oxford Universi ty Press, 1996 (以下、アンチボディエンジニアリングと略す)等に記載された方法を用 い、例えば、以下のように宿主細胞中で発現させて取得することができる。
[0148] 糖蛋白質をコードする cDNAを調製し、該分子をコードする部分を含む適当な長さ の DNA断片を調製する。
該 DNA断片、または全長 cDNAを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に揷 入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現べクタ一に適合した宿主細胞に導入することにより、 糖蛋白質分子を生産する形質転換体を得ることができる。
[0149] 宿主細胞としては、哺乳動物由来の細胞があげられる。
また、糖鎖の修飾に係わる酵素を遺伝子工学的な手法を用いて導入した、哺乳動 物由来の細胞を宿主細胞として用いることもできる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中へ の組込が可能で、 目的とする糖蛋白質分子をコードする DNAを転写できる位置にプ 口モーターを含有して 、るものが用いられる。
[0150] cDNAは、前記 1.に記載の cDNAの調製方法に従い、ヒト又は非ヒト動物の組織又 は細胞より、 目的とする糖蛋白質に特異的なプローブやプライマー等を用いて調製 することができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 pcDNAU pcD M8 (フナコシ社より巿販）、 pAGE107 [特開平 3- 22979 ;サイトテクノロジー (Cytotechno logy), 3, 133, (1990)]、 pAS3- 3 [特開平 2- 227075]、 pCDM8 [ネイチヤー (Nature), 32 9, 840, (1987)]、 pcDNAI/Amp (Invitrogen社製）、 pREP4 (Invitrogen社製）、 pAGElO 3 [ジャーナル'ォブ'バイオケミストリー (J. Biochemistry), 101, 1307 (1987)]、 pAGE21 0等をあげることができる。
[0151] プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることが でき、例えば、サイトメガロウィルス（CMV)の IE (immediate early)遺伝子のプロモータ 一、 SV40の初期プロモーター、レトロゥイノレスのプロモーター、メタ口チォネインプロモ 一ター、ヒートショックプロモーター、 SR aプロモーター等をあげることができる。また、 ヒト CMVの IE遺伝子のェンハンサーをプロモーターと共に用いてもよ!、。
[0152] 宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Namalwa)細胞、サルの細胞である C OS細胞、チャイニーズ'ノ、ムスターの細胞である CHO細胞、 HBT5637 (特開昭 63- 29 9)、ラットミエローマ細胞、マウスミエローマ細胞、シリアンノヽムスター腎臓由来細胞、 胚性幹細胞、受精卵細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞に DNAを導入する方法であれば ヽ ずれも用いることができ、例えば、エレクト口ポレーシヨン法 [サイトテクノロジー (Cytote chnology), 3, 133 (1990)]、リン酸カルシウム法 [特開平 2-227075]、リポフエクシヨン 法 [プロシーディングス ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミ^ ~ ·ォブ ·サイエンス (Pro Nat 1. Acad. Sci. U.S.A.), 84, 7413 (1987)]、インジェクション法 [マ-ピュレイティング'ザ' マウス .ェンブリオ.ァ ·ラボラトリー ·マニュアル]、パーティクルガン (遺伝子銃）を用い る方法 [特許第 2606856、特許第 2517813]、 DEAE-デキストラン法 [バイオマ-ユア ルシリーズ 4一遺伝子導入と発現 ·解析法 (羊土社)横田崇 ·新井賢一編 (1994)]、ゥ ィルスべクタ一法 [マ-ピュレーティング ·マウス ·ェンブリオ第 2版]等をあげることがで きる。
[0153] 糖鎖の合成に関与する遺伝子を導入した、哺乳動物由来の細胞により発現させた 場合には、導入された遺伝子によって糖あるいは糖鎖が付加された糖蛋白質を得る ことができる。
以上のようにして得られる形質転換体を培養し、本発明のモノクローナル抗体を添 加した培養物中に目的とする糖蛋白質組成物を生産させ、該培養物から該等蛋白 質組成物を採取することにより、目的とする糖蛋白質組成物を製造することができる。 形質転換体を培地に培養する方法は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に 従って行うことができる。
[0154] 動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用さ れて 、る RPMI 1640培地 [ザ ·ジャーナル ·ォブ ·ザ ·アメリカン'メディカル ·ァソシエイ シヨン (The Journal of the American Medical Association), 199, 519 (1967)]、 Eagleの MEM培地 [サイエンス (Science), 122, 501 (1952)]、ダルベッコ改変 MEM培地 [ヴユウ ロロジー (Virology), 8, 396 (1959)]、 199培地 [プロシーデイング'ォブ 'ザ 'ソサイエテ ィ'フォア'ザ 'バイオロジカノレ'メディスン (Proceeding of the Society for the Biological Medicine), 73, 1 (1950)]、 Whitten培地 [発生工学実験マニュアル-トランスジエニック •マウスの作り方 (講談社)勝木元也編（1987)ほたはこれら培地に牛胎児血清等を 添加した培地等を用いることができる。
[0155] 培養は、通常 pH6〜8、 30〜40°C、 5%CO存在下等の条件下で 1〜7日間行う。
2
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添カロ してちよい。
糖蛋白質組成物の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外 に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿 主細胞や、生産させる糖蛋白質分子の構造を変えることにより、より適当な方法を選 択することができる。
[0156] 糖蛋白質組成物が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポー ルソンらの方法 [ジャーナル ·ォブ ·バイオロジカル ·ケミストリー (J. Biol. Chem.), 264, 17619 (1989)]、ロウらの方法 [プロシーディングス 'ォブ ·ザ'ナショナル 'ァ力デミ一' ォブ.サイエンス (proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 86, 8227 (1989);ジーン'デベロップ メント (Genes Develop.), 4, 1288 (1990) ]、または特開平 05-336963、 WO94/23021等 に記載の方法を準用することにより、糖蛋白質組成物を宿主細胞外に積極的に分泌 させることがでさる。
[0157] すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、発現ベクターに、糖蛋白質分子をコード する DNA、および糖蛋白質分子の発現に適切なシグナルペプチドをコードする DNA を挿入し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入の後に糖蛋白質分子を発現させること により、目的とする糖蛋白質分子を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。 また、特開平 2-227075に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝 子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
[0158] 糖蛋白質分子をコードする遺伝子を導入した形質転換体により製造された糖蛋白 質組成物は、例えば糖蛋白質組成物が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、 培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機 、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、 無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、 通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機 溶媒による沈殿法、ジェチルアミノエチル（DEAE) -セファロース、 DIAION HPA-75 ( 三菱化学 (株)製)等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、 S-Sepharose FF (Pharmacia社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセ ファロース、フエ-ルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分 子篩を用いたゲルろ過法、ァフィユティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシン グ法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い 、糖蛋白質組成物の精製標品を得ることができる。
[0159] また、糖蛋白質組成物が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞 を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として糖蛋白質組成物の不溶 体を回収する。回収した糖蛋白質組成物の不溶体を蛋白質変性剤で可溶ィ匕する。 該可溶化液を希釈または透析することにより、該糖蛋白質組成物を正常な立体構造 に戻した後、上記と同様の単離精製法により該糖蛋白質組成物の精製標品を得るこ とがでさる。
[0160] 糖蛋白質組成物が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該糖蛋白質組成物 あるいはその誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分 離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同 様の単離精製法を用いることにより、糖蛋白質組成物の精製標品を得ることができる すでに宿主細胞が糖蛋白質分子を発現する能力を有する場合には、該細胞を培 養し、該培養物から目的とする糖蛋白質組成物を精製することにより、糖蛋白質組成 物を製造することができる。
[0161] (3)糖蛋白質組成物の糖鎖の分析
各種細胞を用いて創造した糖蛋白質分子の糖鎖構造は、通常の糖蛋白質の糖鎖 構造の解析に準じて行うことができる。例えば、ガラクトース、マンノース、フコースな どの中性糖、 N-ァセチルダルコサミンなどのアミノ糖、シアル酸などの酸性糖は、糖 組成分析および二次元糖鎖マップ法などを用いた糖鎖構造解析等の手法を用いて 行うことができる。
[0162] (a)中性糖'アミノ糖組成分析
糖蛋白質の糖鎖の組成分析は、トリフルォロ酢酸等で、糖鎖の酸加水分解を行うこ とにより、中性糖またはアミノ糖を遊離し、その組成比を分析することができる。
具体的な方法として、 Dionex社製糖組成分析装置を用いる方法があげられる。 Bio LCま HPAEC— PAD (hign performance anion— exchange chromatography— pulsed ampe rometric detection)法 [ジャーナノレ ·ォブ ·リキッド ·クロマトグラフィー (J丄 iq.Chromato gr.) , 6, 1577 (1983)]によって糖組成を分析する装置である。 [0163] また、 2-アミノビリジンによる蛍光標識ィ匕法でも組成比を分析することができる。具体 的には、公知の方法 [ァグリカルチュラル 'アンド'バイオロジカル ·ケミストリー (Agric.B iol.Chem.), 55(1), 283-284 (1991)]に従って酸カ卩水分解した試料を 2-アミノビリジル 化で蛍光ラベルイ匕し、 HPLC分析して組成比を算出することができる。
(b)酸性糖組成分析
糖蛋白質の糖鎖の組成分析は、塩酸あるいは硫酸等で、糖鎖の酸加水分解を行う ことにより、酸性糖を遊離し、遊離した酸性糖を標識することで、その組成比を分析す ることができる。糖蛋白質の糖鎖を構成する単糖は大別して、シアル酸、中性糖、アミ ノ糖に分けられるが、遊離した単糖の酸に対する安定性はァミノ糖、中性糖、シアル 酸の順であり、アミノ糖ゃ中性糖のグリコシド結合を切断する条件ではシアル酸は完 全に分解されてしまうため、通常分けて分析される。
[0164] 具体的な方法としては、公知の方法 [Chem. Pharm. Bull. 35, 687 (1987); Anal. Bio chem. 179, 162-166 (1989)]に従って加水分解した試料を、例えば市販のシアル酸 蛍光標識用試薬キット（宝酒造株式会社製)などを用い l,2-diamino-4,5-methylenedi oxybenzene (DMB)蛍光標識し、 HPLCにて分析することで組成比を算出することがで きる。
(c)糖鎖構造解析
糖蛋白質分子の糖鎖の構造解析は、 2次元糖鎖マップ法 [アナリティカル 'バイオケ ミストリー (Anal. Biochem.) , 171, 73 (1988)、生物化学実験法 23-糖蛋白質糖鎖研究 法 (学会出版センター)高橋禮子編（1989年) ]により行うことができる。 2次元糖鎖マツ プ法は、例えば、 X軸には逆相クロマトグラフィーによる糖鎖の保持時間または溶出 位置を、 Υ軸には順相クロマトグラフィーによる糖鎖の保持時間または溶出位置を、そ れぞれプロットし、既知糖鎖のそれらの結果と比較することにより、糖鎖構造を推定す る方法である。
[0165] 具体的には、糖蛋白質組成物をヒドラジン分解して、糖蛋白質分子から糖鎖を遊離 し、 2-アミノビリジン (以下、「ΡΑ」と略記する）による糖鎖の蛍光標識 [ジャーナル'ォ ブ 'バイオケミストリー（J. Biochem.) , 95, 197 (1984)]を行った後、ゲルろ過により糖 鎖を過剰の PAィ匕試薬などと分離し、逆相クロマトグラフィーを行う。次いで、分取した 糖鎖の各ピークについて順相クロマトグラフィーを行う。これらの結果をもとに、 2次元 糖鎖マップ上にプロットし、糖鎖スタンダード (TaKaRa社製）、文献 [アナリティカル'バ ィォケミストリー（Anal. Biochem.) , 171, 73 (1988)]とのスポットの比較より糖鎖構造を 推定することができる。
[0166] さらに各糖鎖の MALDI-TOF-MSなどの質量分析を行い、 2次元糖鎖マップ法によ り推定される構造を確認することができる。
(4)糖蛋白質組成物の活性評価
精製した糖蛋白質の蛋白量、受容体との親和性、血液中での半減期、血液投与後 の組織への分布、あるいは薬理活性発現に必要な蛋白質相互作用の変化を測定す る方法としては、し urrent Protocols In Protein Science, John Wiley & ¾ons Inc., (199 5)、日本生化学会編新生化学実験講座 19動物実験法，東京化学同人（1991)、 日 本生化学会編新生化学実験講座 8細胞内情報と細胞応答，東京化学同人（1990) 、 日本生化学会編新生化学実験講座 9ホルモン Iペプチドホルモン，東京化学同人 (1991)、実験生物学講座 3アイソトープ実験法，丸善株式会社（1982)、 Monoclonal A ntibodies: Principles and Applications, Wiley- Liss, Inc., (1995)、酵素免疫測定法第 3版，医学書院（1987)、改訂版酵素抗体法，学際企画（1985)等に記載の公知の方 法を用いることができる。
[0167] その具体的な例としては、精製した糖蛋白質をラジオアイソトープなどの化合物で 標識し、標識した糖蛋白質の受容体あるいは相互作用をする蛋白質との結合反応の 強さを定量的に測定する方法があげられる。また、 Biacore社の BIAcoreシリーズなど の各種装置を用いて、蛋白質蛋白質相互作用を測定することもできる (J. Immnunol. Methods, 145, 229 (1991)、実験医学別冊バイオマニュアル UPシリーズ蛋白質の 分子間相互作用実験法,羊土社（1996))。
[0168] 標識した糖蛋白質を体内に投与することで、血液中での半減期あるいは血液投与 後の組織への分布を知ることができるが、標識体の検出には、標識物質を検出する 方法と検出の対象となる糖蛋白質特異的な抗体抗原反応を組み合わせた系が好ま しい。
5.本発明の糖蛋白質組成物の利用 本発明の糖蛋白質組成物は、シアル酸修飾の高い糖鎖構造を有しており、例えば 、受容体との親和性の向上、血中半減期の向上、血中投与後の組織分布の改善、ま たは薬理活性発現に必要な蛋白質との相互作用の向上などの効果が期待でき高い 生理活性を示す。特に、本発明の糖蛋白質組成物は、本発明の抗体を培養液中に 添加しな!ヽで培養した場合に得られる糖蛋白質組成物に比べて長 、血中半減期を 有している。これら生理活性の高い糖蛋白質組成物は、癌、炎症疾患、自己免疫疾 患、アレルギーなどの免疫疾患、循環器疾患、またはウィルスあるいは細菌感染をは じめとする各種疾患の予防および治療において有用である。
[0169] 癌、すなわち悪性腫瘍では癌細胞が増殖して!/、る。従来の糖蛋白質組成物を有効 成分とする抗癌剤は癌細胞の増殖を抑制することを特徴とする。しかしながら、本発 明の製造方法により得られた糖蛋白質組成物を有効成分とする抗癌剤は、長い血中 半減期を有し、持続的な殺細胞効果により癌を治療することができるため、従来の糖 蛋白質組成物を有効成分とする抗癌剤よりも治療薬として有効である。抗癌剤の有 効成分となる糖蛋白質組成物としては、インターフェロン、腫瘍壊死因子、インター口 ィキンなどがあげられる。
[0170] また、従来の低分子化合物を有効成分とする抗癌剤での単独の抗腫瘍効果が不 充分な場合には高分子化合物、具体的には糖蛋白質組成物を有効成分とする抗癌 剤との併用療法が試みられている [サイエンス (Science), 280, 1197, 1998]。そこで、 本発明の製造方法により得られた糖蛋白質組成物を有効成分とする抗癌剤を単独 で患者に投与した際のより強い抗腫瘍効果が認められれば、重体の低分子化合物 を有効成分とする抗癌剤との併用にお 、ても優れた効果を得ることができる。
[0171] 炎症疾患、自己免疫疾患、アレルギーなどの免疫疾患において、それらの疾患に おける生体内反応は、免疫細胞によるメディエーター分子の放出により惹起される。 従来の糖蛋白質組成物を有効成分とする免疫疾患治療薬は、これら免疫細胞に作 用し、メディエーター分子の放出を抑制する、もしくは放出されたメディエーター分子 に結合し、その活性を抑制することを特徴とする。しかしながら本発明の製造方法に より得られた糖蛋白質組成物を有効成分とする免疫疾患治療薬は、長い血中半減 期を有し、持続的なメディエーター分子抑制効果により免疫疾患を治療することがで きるため、従来の糖蛋白質を有効成分とする免疫疾患治療薬よりも有効である。免疫 疾患治療薬の有効成分となる糖蛋白質組成物としては、 TNF受容体 p75IgGlFc融合 蛋白質、アンチトロンビン IIIなどがあげられる。
[0172] 循環器疾患としては、血栓症を伴う疾患、血友病などの出血を伴う疾患あるいは腎 機能の低下を伴う疾患があげられる。従来の糖蛋白質組成物を有効成分とする血栓 症治療薬は血液凝固系を阻害する、もしくは線維素溶解系を活性ィ匕することを特徴 とする。しかしながら本発明の製造方法により得られた糖蛋白質組成物を有効成分と する抗血栓症治療薬は長い血中半減期を有し、持続的な抗血液凝固作用により血 栓症を治療することができるため、従来の糖蛋白質を有効成分とする抗血栓症治療 薬よりも有効である。抗血栓症治療薬の有効成分となる糖蛋白質組成物としては、ァ ンチトロンビン III、活性ィ匕プロテイン C、トロンボモジュリンなどがあげられる。
[0173] また、従来の糖蛋白質組成物を有効成分とする血友病治療薬は血液凝固系を活 性ィ匕する、もしくは線維素溶解系を阻害することを特徴とする。し力しながら本発明の 製造方法により得られた糖蛋白質組成物を有効成分とする血友病治療薬は長い血 中半減期を有し、持続的な血液凝固作用により血友病を治療することができるため、 従来の糖蛋白質を有効成分とする血友病治療薬よりも有効である。血友病治療薬の 有効成分となる糖蛋白質組成物としては、各種血液凝固因子などがあげられる。
[0174] 腎機能の低下を伴う疾患としては腎性貧血などがあげられるが、従来の糖蛋白質 組成物を有効成分とする腎性貧血治療薬は赤血球増加作用を有することを特徴と する。しかしながら本発明の製造方法により得られた糖蛋白質組成物を有効成分と する腎性貧血治療薬は長い血中半減期を有し、持続的な赤血球増加作用により腎 性貧血を治療することができるため、従来の糖蛋白質を有効成分とする腎性貧血治 療薬よりも有効である。腎性貧血治療薬の有効成分となる糖蛋白質組成物としては エリスロポイエチンがあげられる。
[0175] 従来の糖蛋白質組成物を有効成分とする抗感染症治療薬は細菌あるいはウィルス に感染した細胞の増殖を抑制する作用を有することを特徴とする。しカゝしながら本発 明の製造方法により得られた糖蛋白質組成物を有効成分とする抗感染症治療薬は 長い血中半減期を有し、持続的な、細菌あるいはウィルスに感染した細胞の増殖を 抑制する作用により感染症を治療することができるため、従来の糖蛋白質を有効成 分とする感染症治療薬よりも有効である。感染症治療薬の有効成分となる糖蛋白質 糸且成物としてはインターフェロンやインターロイキンなどがあげられる。
[0176] 本発明の糖蛋白質組成物を含有する医薬は、予防薬あるいは治療薬として単独で 投与することも可能ではある力 通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以 上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野にお!、てよく知られる任意の方法によ り製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましぐ経口投与、 または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげ ることができ、糖蛋白質製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげることができる。
[0177] 投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、 注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒 剤等があげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の 糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のダリコール類、ごま油、オリ ーブ油、大豆油等の油類、 P-ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、スト口ベリ 一フレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。
[0178] カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マン-トール等の 賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タル ク等の滑沢剤、ポリビュルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の 結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として 用いて製造できる。
[0179] 非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物カゝらなる担体等を用いて 調製される。または、糖蛋白質組成物を常法に従って凍結乾燥し、これに塩化ナトリ ゥムを加えることによって粉末注射剤を調製することもできる。
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。 [0180] また、噴霧剤は糖蛋白質組成物そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜 を刺激せず、かつ糖蛋白質組成物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる 担体等を用いて調製される。
担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。糖蛋白質組成物および用 いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、こ れらの非経口剤にぉ 、ても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもでき る。
[0181] 投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体 重等により異なる力 有効成分の量として、通常成人 1日当たり 1 §/1¾〜200 g/kg である。
また、糖蛋白質組成物の生物活性を検討する方法は、インビトロ (in vitro)実験とし ては、糖蛋白質受容体結合活性測定法、糖蛋白質組成物の酵素活性測定法、糖蛋 白質受容体発現細胞株を用いた増殖分化促進活性の測定法などの in vitro試験、あ るいはヒト病態モデル動物を用いた in vivo試験等があげられる。
[0182] 糖蛋白質受容体結合活性測定法、糖蛋白質組成物の酵素活性測定法、糖蛋白質 受容体発現細胞株を用いた増殖分化促進活性の測定法、ヒト病態モデル動物を用 いた in vivo試験は、文献 [基礎と臨床， 22(15), 5531 (1988)、 J. Pharm. Pharmacol, 42 ,758(1990)、 J. Urology, 146,1645(1991)、基礎と臨床， 22(15), 5547 (1988)、基礎と 臨沐, 22(lb , 5811(1988)、 The second Series of Pharmaceutical Researcn and Devel opment Volume 20 Blood Product, Ikuo Suzuki, ed., Hirokawa Publishing Company, Tokyo, Japan, 1992;医学のあゆみ， 120, 1147, 1982;薬理と治療 17, 5843, 1989; 臨床と研究 62, 3573, 1985;臨床と研究 62, 3688, 1985;応用薬理 30, 589, 1985] 等記載の公知の方法に従って行うことができる。
[0183] 以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる 例示を示すものにすぎず、本発明の範囲を限定するものでない。
実施例 1
[0184] 細胞質シァリダーゼの発現
(1)チャイニーズノヽムスター由来 Neu2の単離 チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO)由来細胞質シァリダーゼの cDNA塩基配 列（GeneBank, U06143;配列番号 1に示す）に基づき、細胞質シァリダーゼの 5 '末端 側非翻訳領域に特異的なプライマー sial 2 (配列番号 12)および 3 '末端側非翻訳領 域に特異的なプライマー siarv2 (配列番号 13)を用いてポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) を行ない、チャイニーズノヽムスター卵巣細胞（CHO)由来 NEU2シァリダーゼ cDNAを 増幅した。尚、 sia! 2は配列番号 1に示したチャイニーズハムスター NEU2シァリダ一 ゼ遺伝子配列の 177番目から 196番目の塩基、 siarv2は 1311番目から 1333番目の塩 基に相補的な配列である。 PCR反応はCHO/DG44細胞由来ー本鎖cDNAを5 iu L分 含む 25 μ Lの反応液 [1 X EX Taq Buffer (宝酒造社製）、 0.2mMの dNTP， s、 0.5単位の EX Taq polymerase (宝酒造社製）、 0.5 μ Μの上記プライマー（配列番号 12および配 列番号 13) ]を調製し、 GeneAmp PCR system 9700 (パーキンエルマ一社製）を用い て 94°Cにて 5分間加熱した後、 94°Cにて 20秒間、 65°Cにて 30秒間、 72°Cにて 30秒間 のサイクルを 30サイクル行なった。この PCR反応液をァガロースゲル電気泳動により 分離後、約 l . lKbpの PCR増幅断片を QiaexII gel extraction kit (キアゲン）を用い回 収した。該 DNA断片を pT7 blueベクター（Novagen)に Ligation high (東洋紡社製）を 用いて連結し、得られた組換えプラスミド DNAを用いて大腸菌 DH5 a株 (東洋紡績社 製）を形質転換した。得られた複数のアンピシリン耐性コロニーより、 QIAprep Spin Mi niprep Kit (キアゲン社製)を用いて組換えプラスミド DNAを単離した。プラスミドに含 まれる PCR断片の塩基配列を DNAシークェンサ一 ABI PRISM 377 (パーキンエルマ 一社製)を用い、常法に従って決定し、 PCRに伴う塩基の変異をないことを確認した。 得られたチャイニーズノヽムスター卵巣細胞（CHO)由来 NEU2シァリダーゼ cDNAを含 むプラスミドを pT7 blue sialidaseと称す。
(2) GST融合シァリダーゼ発現ベクターの作製
大腸菌にお 、てダルタチオン Sトランスフェラーゼ (GST)融合シァリダーゼ蛋白質を 発現するためのベクター pGEX-Sialidaseの作製を以下の手順で行った。上記（1)で 作製した pT7 blue sialidaseを铸型として細胞質シァリダーゼの 5 '末端側非翻訳領域 に特異的なプライマー BamHIsiaFW (配列番号 14)および 3 '末端側非翻訳領域に特 異的なプライマー siaRVSall (配列番号 15)を用いてポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)を行 ない、 NEU2シァリダーゼ cDNAを増幅した。尚、 BamHIsiaFWは配列番号 1に示した チャイニーズノ、ムスター細胞質シァリダーゼ遺伝子配列のうち開始コドンをコードす る 187番目力も 210番目の塩基に対応した配列であり、一方 siaRVSallは 1303番目から 終止コドンをコードする 1326番目の塩基に相補的な配列である。本プライマーを用い た PCRにより GSTとコドンフレームが一致した状態でベクターに挿入可能な細胞質シ ァリダーゼ cDNA全長が増幅される。 PCR反応は pT7 blue sialidase lng含む 50 μしの 反応液 [1 X KOD Buffer (東洋紡社製）、 0.2mMの dNTP，s、 ImMの MgCl、 2.5単位の
2
KOD polymerase (東洋紡社製）、 0.5 μ Μの上記プライマー（配列番号 14および配列 番号 15) ]を調製し、 GeneAmp PCR system 9700 (パーキンエルマ一社製）を用いて 9 4°Cにて 5分間加熱した後、 94°Cにて 20秒間、 65°Cにて 30秒間、 72°Cにて 30秒間の サイクルを 30サイクル行なった。この PCR反応液をァガロースゲル電気泳動により分 離後、約 l . lKbpの PCR増幅断片を QiaexII gel extraction kit (キアゲン）を用い回収 した。該 DNA断片を pGEX- KGベクターに Ligation high (東洋紡社製）を用いて連結し 、得られた組換えプラスミド DNAを用いて大腸菌 DH5 a株 (東洋紡績社製)を形質転 換した。 pGEX- KGは pGEX- 2T (フアルマシア社製）のマルチクローユングサイトを改 変した GST融合蛋白質発現ベクターである（Analytical Biochem.(1991)192,262-267) 。得られた複数のアンピシリン而性コロニーより、 QIAprep Spin Miniprep Kit (キアゲ ン社製)を用いて組換えプラスミド DNAを単離した。プラスミドに含まれる PCR断片の 塩基配列を DNAシークェンサ一 ABI PRISM 377 (パーキンエルマ一社製）を用い、常 法に従って決定し、 PCRに伴う塩基の変異をないことを確認した。得られたプラスミド を pGEX- Sialidaseと称す。本プラスミドがコードする GST-シァリダーゼの遺伝子配列 を配列番号 16に示した。
(3)大腸菌組み換え GST-シァリダーゼの生産
上記（2)で作製したプラスミド pGEX- Sialidaseを保有する大腸菌 DH5 aを 2mLの LB 培地（ディフコ社製）に植菌し、 37°Cでー晚培養した。翌日、培養液 lmLを 500mLの LB培地に植菌し 37°Cで旋回培養を行った。 600nmにおける吸光度が 0.6に到達した 時点でイソプロピル- β -チォガラクトピラノシド (IPTG) (タカラバイオ社製)を終濃度 0. ImMで添加し、室温でさらに一晩培養を行った。翌日、遠心分離により菌体を回収し 、 10mLの B- PER Bacterial Protein Extraction Reagent (ピアス社製）に懸濁後、超音 波破砕機 (ソニックス社製 )にて 10分間の破砕を 3回行なった。上記の操作にて得ら れた大腸菌溶解液を R-12A2ローター（日立社製)にて 12,000rpm、 20分間の遠心分 離を行った後、上清を回収し、あらかじめ B- PER Bacterial Protein Extraction Reagen tで洗浄した Glutathion Sepharose 4 Fast Flow (フアルマシア社製) lmLをカ卩え、 4°Cで 8時間の転倒混和を行った。 8時間後、大腸菌溶解液と Glutathion Sepharose 4 Fast Flowの混合液を 0.8cm径のカラムに移した後、 10mLの 0.1 %TritonX-100を含む PBS を 2回通筒し、洗浄を行った。洗浄後、 lmLの溶出バッファー（50mM Tris- HC1 pH9.5 、 10mM還元型グルタチオン）を添カ卩し、 Glutathion Sepharose 4 Fast Flowに結合し た GST-シァリダ一ゼの溶出を行った。溶出画分を透析にて PBSにバッファーに置換 後、 280nmの吸光度測定により、蛋白質濃度を算出した。濃度の算出には GST融合 シァリダーゼのアミノ酸組成カゝら予測されたモル吸光係数（ ε Μ=96,720)を使用した 。得られた GST融合シァリダーゼ 2 gを SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離 後、クマシ一ブリリアントブルー（CBB)染色した像を図 1に示した。 GST融合シァリダ ーゼは予想分子量（68kDa)の位置に単一のバンドとして確認された。
(4)大腸菌組み換え GST融合シァリダーゼのシァリダーゼ活性の確認
上記（3)で得られた GST-シァリダーゼの O. lmgあるいは O.Olmgを 0.4mMシァリダ一 ゼ 光^'貪 4— methylumbelliferyl— N— -D-acetylneuraminic acid ammonium salt (ナ 力ライテスタ社製)を 5 μ Lを含むリン酸バッファー（ρΗ7.0) 60 μ Lに添加し、 96穴黒色 Ε LISA用プレート (住友ベークライト社製）にて 37°C、 1時間インキュベートを行った。こ の際、シァリダーゼ阻害剤である N- Acety卜 2,3- dehydro- 2- deoxy- neuraminic acid(N eu5AC2en) (Fluka社製）を終濃度 0.4mMで添カ卩した反応も同時に行った。インキュべ ート後、 0.2M グリシン (pH 10)を 140 L添加して反応を停止した。反応停止後、蛍 光プレートリーダー ARVO (Perkin Elmer社製）を用いて、 340nmの励起波長による 460 nm蛍光波長の強度を 0.1秒間測定した。本測定によって得られた蛍光値からバックグ ラウンドの蛍光値を減した値と同じ蛍光値を示す 4-methylumbelliferyl (4MU)の濃度 を反応時間（h)反応体積 (mL)で除した値 (nmol/h/ml)をシァリダーゼ活性として図 2 に示した。 GST-シァリダーゼの濃度依存的なシァリダーゼ活性が確認され、シァリダ ーゼ阻害剤の添カ卩によってこれら活性は消失した。作製した GST融合シァリダーゼは シァリダーゼ活性を有することから、活性に必要な構造を保持した組み換え蛋白質 であることが確認された。
実施例 2
[0188] (1)細胞質シァリダーゼの活性を中和する抗体の作製
実施例 1で得られた大腸菌発現 GST-シァリダーゼ 50 μ gをそれぞれ水酸化アルミ -ゥム 7ンュノ ント Antibodies - A Laboratory Manual, し old Spring Harbor Laborat ory, p99、 1988] 2 mgおよび百日咳ワクチン (千葉県血清研究所製） 1 X 109細胞ととも に 6週令雌 Balb/cマウス, 4週令雌 SDラット各 3匹ずつに投与した。投与 2週間後より、 GST-シァリダーゼ 50 gを 1週間に 1回、計 3回投与した。マウスは眼底より、ラットは 尾静脈より部分採血し、得られた抗血清の結合活性と中和活性を参考例 1(4)および ( 5)に記載した方法で調べた。図 3に被免疫マウス抗血清のバインディング ELISAの結 果を、図 4に被免疫ラット抗血清のバインディング ELISAの結果を示す。 GST-シァリダ ーゼを免疫したマウス No.2、マウス No.3、ラット No.2、ラット No.3の各抗血清は GST固 層化プレートに比べ GST-シァリダ一ゼ固層化プレートでより高い反応性を示し、細胞 質シァリダーゼに対するポリクローナル抗体が産生されていることが確認された。
[0189] 充分な抗体価を示したマウスあるいはラットから最終免疫 3日後に脾臓を摘出し、以 下参考例 1(3)に記載した方法に従って抗体産生細胞を調製した。
(2)ハイプリドーマの作製
実施例 2 (1)で得られたマウス (あるいはラット)脾細胞と参考例 1 (6)で得られた骨髄 腫細胞とを 10 : 1になるよう混合し、以下参考例 1(7)記載の方法に従ってハイプリドー マを作製した。
[0190] 培養後、培養上清を参考例 1 (4)および (5)に記載した方法で調べたところ、結合活 性と中和活性が共に観察される穴が複数存在した。これら穴について限界希釈法に よるクロー-ングを 2回繰り返し、 5クローンの抗体産生ハイブリドーマ KM3627、 KM36 28、 KM3629, KM3630, KM3631を確立した。 KM3627および KM3629は平成 17年 10 月 6日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つ くば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6)〖こ FERM BP-10432, FERM BP-10433として寄託さ れている。
[0191] (3)モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理した 7週令雌ヌードマウス (ICR)に実施例 2 (2)で得られたノヽイブリド 一マ株を 5〜20 X 106細胞/匹それぞれ腹腔内注射した。 10〜21日後、ハイプリドーマ が腹水癌化したマウスから、腹腔内に貯留した腹水を採取した。腹水は動物 1匹あた り、 1〜8 mL採取された。
[0192] 該腹水を遠心分離 (3000rpm、 30分間）し固形分を除去した上清から、力プリル酸沈 殿法 [Antibodies - A Laboratory Manual, し old bpnng Harbor Laboratory, 1988〕【こ より、精製 IgGモノクローナル抗体を取得した。モノクローナル抗体のサブクラスはサ ブクラスタイピングキットを用いた ELISA法により決定した。モノクローナル抗体 KM362 7および KM3628はマウス IgGl、モノクローナル抗体 KM3630はラット IgGl、モノクロ一 ナル抗体 KM3629および KM3631はラッ HgG2aであった。
実施例 3
[0193] 細胞質シァリダーゼの活性を中和する抗体の評価
(1)結合活性 (バインディング ELISA)
参考例 1 (4)に示した方法に従って行った。ただし、 1次抗体には実施例 2 (3)で得 られた精製抗体（KM3627、 KM3628, KM3629, KM3630および KM3631)を 10、 1、 0.1 、 0.01、 0.001 /z g/mLとなるように希釈したものを用いた。図 5に示すように、全ての精 製抗体で GST-シァリダーゼに特異的な結合活性が認められた。
[0194] (2)大腸菌組み換えシァリダーゼに対する中和活性
参考例 1 (5)に示した方法に従い、シァリダーゼに対する中和活性の評価を行った 。ただし、被免疫動物抗血清、ハイプリドーマ培養上清の代わりに実施例 2 (3)で得ら れた精製抗体を用いた。精製抗体は GST-シァリダーゼに対してモル比が 100、 10、 1 、 0.1、 0.01となるように希釈したものを用いた。図 6に示すように、全ての精製抗体で G ST-シァリダーゼに対する中和活性が認められた。
[0195] (3) ΑΤΠΙ遺伝子導入 CHO細胞産生シァリダーゼに対する中和活性
ΑΤΙΠ生産 CHO細胞の培養上清を用いて、実施例 2(3)で得られた精製抗体が当該 細胞力も漏出した細胞質シァリダーゼを中和するかどうかにっ 、て確認を行った。 A Till生産 CHO細胞としては、 WO2005/035563記載の ΑΤΠΙ生産細胞株 Ms705 pKAN- ATIII 27株（FERM BP- 10089)を用いた。
[0196] Ms705 pKAN-ATIII 27株を培地中で培養し、培養 14日目の培養上清を用いて ΑΤΠ I産生細胞力 漏出したシァリダーゼに対する中和活性を参考例 1(5)に示した方法に 従って測定した。
培養 14日目の培養上清とは、上記の ΑΤΠΙ生産細胞を培養槽体積 1Lのスピナーリ アクター（ABLE社製）にて行ったフエドバッチ培養 14日目の培養液である。ロットの 異なる 2回の培養力 得られた培養上清を用いて測定した結果を図 7 (ロット 1)および 図 8 (ロット 2)にそれぞれ示す。いずれの実験においても、全ての精製抗体で CHO産 生シァリダーゼに対する中和活性が認められた。
実施例 4
[0197] チャイニーズノヽムスター以外の哺乳類由来細胞質シァリダーゼに対する中和抗体 の効果
(1)細胞質シァリダーゼ活性を含む細胞破砕液の調製
マウス myoblast由来細胞株 G-8株（ATCC CRL-1456)とラット myoblast由来細胞株 A-10株 (ATCC CRL-1476)をそれぞれ、非働化済みゥシ胎児血清を体積比 20%で 含有する DMEM培地（Invitrogen社製）中で培養し、コンフルェントまで増殖させた。ト リプシン処理により細胞を培養器より剥離させた後、ダルベッコ PBSバッファー（Invitro gen社製)を用いて細胞を洗浄した。洗浄後の細胞懸濁液の一部を分取して、細胞自 動計数装置 ViCELL (ベックマンコールター製)を用いて生細胞密度を計測し、細胞 生存率が 95%以上であることを確認した。洗浄済みの細胞は、 1.25 X 106個の生細胞 を 150 μ Lのダルベッコ PBSバッファーに均一に懸濁し、マイクロ遠心管（エツペンドル フネ土製）に分注後、 -80°Cにて一晩凍結させた。翌日、マイクロ遠心管を室温にて 30 分間放置して細胞懸濁液を融解させた。細胞懸濁液が完全に融解後、マイクロ遠心 機 (TOMY製)を用いて、 15000回転、 4°Cにて 15分間遠心分離を行った。上清の細 胞破砕液を新しいマイクロ遠心管に集め、氷上に保管した。
[0198] (2)中和活性の測定
平底黒色 96穴マイクロウェルプレート (住友ベークライト社製）に、上記（1)で調製し た細胞破砕液を 45 /z L/ゥエルで分注した。次に、細胞破砕液を分注しておいたゥェ ルに、 10 mMリン酸バッファー（pH7.0)を 5 μ L/ゥエルで分注し、続いて実施例 2の（3 )項で精製した 5種類のモノクローナル抗体、 ΚΜ3627、 ΚΜ3628, ΚΜ3629, ΚΜ3630 、および KM3631を、それぞれ 5 μ L/ゥエルで分注して、各ゥエルの液量を 55 μしとし た。なお、 5種類のモノクローナル抗体の最終濃度は、 100 /z g/ml、 1 μ g/ml、 O ^ g/m 1とした。また、バックグランドを測定するゥエルとして、 10 mMリン酸バッファー（pH7.0) を添カ卩した細胞破砕液 50 μ Lに、シァリダーゼ阻害剤 Ν- Acety卜 2,3- dehydro- 2- deox y- neuraminic acid (Neu5AC2en) (Fluka社製)を終濃度 5 mMになるように添カ卩したゥェ ルを用意した。 96穴マイクロウェルプレートに蓋を載せ、室温にて 2時間静置し、細胞 破砕液中に含まれる細胞質シァリダーゼにモノクローナル抗体を反応させた。次に、 96穴マイクロウェルプレートの各ゥエルに、濃度 4 mMで調製したシァリダーゼ蛍光基 質 4— methylumbelliferyl— N— — D— acetylneuraminic acid ammonium salt (ナ yフィァス ク社製)を 5 L/ゥエルで分注し、プレートに蓋を載せて炭酸ガスインキュベーター (T ABAI製）にて 37°Cで 2時間反応させた。反応後、 0.2 Mグリシン- NaOH (pH 10)を 14 0 L/ゥエルで添加して反応を停止し蛍光を増強させた。反応停止後、蛍光プレート リーダー ARVO (Perkin Elmer社製）を用いて、各ゥエルの、 340nmの励起波長による 4 60nm蛍光波長の強度、すなわち各ゥエルの細胞質シァリダーゼ活性を 0.1秒間測定 した。ラット由来細胞質シァリダーゼに対して添加したモノクローナル抗体の濃度を横 軸に、本測定によって得られた蛍光値を縦軸にとったグラフを図 9に示した。 KM3627 、 KM3628, KM3629の 3種類のモノクローナル抗体については、抗体の濃度依存的 な蛍光強度の低下が確認された。一方で、 KM3630、 KM3631 ,および陰性対照のマ ウスィムノグロブリン (DAKO社製)では、抗体の濃度依存的な蛍光強度の低下は認 められな力つた。以上の結果より、実施例 2の（3)項で精製した 5種類のモノクローナ ノレ抗体、 KM3627, KM3628, KM3629, KM3630, KM3631のうち、少なくとも KM3627、 KM3628, KM3629の 3種類の抗体については、チャイニーズハムスター由来の細胞 質シァリダーゼに対する中和活性以外に、ラット由来の細胞質シァリダーゼに対する 中和活性を有して 、ることが示された。
実施例 5 [0199] 細胞質シァリダーゼの活性を中和する抗体を用いた糖蛋白質の製造（1)
(1)三角フラスコ無血清フエドバッチ培養
実施例 3で榭立した ΑΤΠΙ生産細胞 Ms705 pKAN-ATIII 27株を用いて、以下の手順 で無血清フエドバッチ培養を行った。
フエドバッチ培養には、 MTX (SIGMA社製）を 500nmol/Lの濃度で、 L-グルタミン (ィ ンビトロジェン社製）を 6mmol/Lの濃度で、 3,3,5- Triiodo-L- thyronine (SIGMA社製） を 100nmol/Lの濃度で、 Pluronic F-68 (インビトロジェン社製）を 0.1%の濃度で、 D(+) -グルコース（ナカライテスタ社製）を 5000mg/Lの濃度で含む EX- CELL302培地（JRH 社製）（以下、無血清フエドバッチ培養培地と称す)を、フィード用の培地としては、通 常の添加濃度よりも高濃度に調製したアミノ酸 (L-ァラニン 0.177g/L、 L-アルギニン 一塩酸 0.593g/L、 L-ァスパラギン一水和物 0.177g/L、 L-ァスパラギン酸 0.212g/L、 L -シスチン二塩酸 0.646g/L、 L-グルタミン酸 0.530g/L、 L-グルタミン 5.84g/L、グリシン 0.212g/L、 L-ヒスチジン一塩酸二水和物 0.297g/L、 L-イソロイシン 0.742g/L、 L-ロイ シン 0.742g/L、 L-リジン一塩酸 1.031g/L、 L-メチォニン 0.212g/L、 L-フエ-ルァラ- ン 0.466g/L、 L-プロリン 0.283g/L、 L-セリン 0.297g/L、 L-スレオ-ン 0.671g/L、 L-トリ プトファン 0.113g/L、 L-チロシンニナトリウム二水和物 0.735g/L、 L-パリン 0.664g/L) 、ビタミン（d -ピオチン 0.0918mg/L、 D-パントテン酸カルシウム 0.0283g/L、塩化コリン 0.0283g/L、葉酸 0.0283g/L、 myo-イノシトール 0.0509g/L、ナイァシンアミド 0.0283g/ L、ピリドキサール塩酸 0.0283g/L、リボフラビン 0.00283g/L、チアミン塩酸 0.0283g/L 、シァノコバラミン 0.0918mg/L)、インシュリン 0.314g/Lから構成された培地（以下、フ イード培地と称す)を用いた。
[0200] Ms705 pKAN-ATIII 27株を、 3 X 105細胞/ mLの密度で無血清フエドバッチ培養培 地に懸濁し、該細胞懸濁液を 250mL三角フラスコ（コ一-ング社製）に 40mLずつ播種 した。培養容器の 4倍量以上の 5%COを通気してフラスコ内の空気を置換した後に
2
密栓し、 35°C、 90〜100rpmにて浮遊旋回培養を行った。培養開始後 3日目、 6日目、 9日目、 12日目に、アミノ酸等の消費量を補う目的でフィード培地を 3.3mL添加し、グ ルコース濃度を制御する目的で 20% (w/v)グルコース溶液を終濃度 5000 mg/Lとな るように添カロした。培養開始後 0日目、 3日目、 6日目、 9日目、 12日目、 14日目に培 養液を 2〜4mLずつ採取した。
[0201] (2)ΑΤΠΙの定量
本項（1)で採取した培養開始後 0日目、 3日目、 6日目、 9日目、 12日目、 14日目の 培養液の上清中に含まれる ΑΤΙΠ濃度の定量を以下の手順で行った。まず、 ΑΤΙΠ EL ISA Capture Antibody (Antibody Setゝ Affinity Biologicals C/N ΑΤΙΠ— EIA)を 50 mM Carbonated.59 gの Na COと 2.93 gの NaHCOを適当量の蒸留水に溶解し、 5Nの Na
2 3 3
OH水溶液で pH9.6に調製した後、蒸留水で 1 Lにメスアップした溶液)で 100倍に希 釈し、 100 μ L/ゥエルで 96well plate (Nunc社製）に分注した。室温にて 1〜2時間静 置し、 0.05 %Tween20- PBSを用いてゥエル内を洗浄した後、 1%BSA- PBSを 100 し /ゥエルで分注して凍結保存した。
[0202] 検体と濃度既知の標準品を、 1%BSA-PBSを用いて適当な濃度に希釈し、室温で 溶解しゥヱル中の BSA-PBSを除去した抗 ΑΤΠΙ抗体固相化プレートに 50 μ L/ゥエル で分注し、室温にて 1-2時間静置した。 0.05 %Tween20-PBSを用いてゥエル内を洗 浄した後、 ΑΤΠΙ検出抗体溶液を 100 μ L/ゥエルで分注し、室温にて約 1時間静置し た。 0.05 %Tween20- PBSを 350 L/ゥエルで数回注入し、ゥエルを洗浄した。 0.1 %H 0をカ卩えた ABTS溶液を 50 μ L/ゥエルで分注して発色させ、発色を確認した後、 5
2 2
%SDS溶液を 50 μ L/ゥエルで分注して発色を停止させた。マイクロプレートリーダー を用いて励起 415 nm/吸収 490 應の波長で吸光度を測定し ΑΤΠΙ含量を算出した。
[0203] (3)細胞質シァリダーゼの活性を中和する抗体を用いた糖蛋白質の製造
実施例 5 (1)に記載した方法と同様に、 ΑΤΠΙ生産細胞株および Ms705 pKAN-ATII I 27株を用いた培養の初発培地に 10 μ g/mLのモノクローナル抗体 ΚΜ3629を添カロし 、三角フラスコ無血清フエドバッチ培養を行った。培養開始後 0日目、 3日目、 6日目 、 9日目、 12日目、 14日目に培養液を 2〜4mLずつ採取し、生細胞密度 (細胞/ mL) 、 生存率 、 ΑΤΠΙ濃度（mg/mL)、シァリダーゼ活性を測定した。また、培養 9日目、 14 日目の培養液を用いて、生産された ΑΤΙΠに結合する糖鎖末端のシアル酸含有数を 測定した。
[0204] 測定方法については生細胞密度および生存率は 0. 4%トリパンブルー溶液 (イン ビトロジ ン社製)を用いた色素排除法で、 ΑΤΠΙ濃度は本項（2)に記載の ΑΤΠΙ量の 定量方法で、シァリダーゼ活性は参考例 1(5)に記載のシァリダーゼ活性の測定方法 で、シアル酸含有数は陰イオン交換 HPLC (島津製作所)を用いて行った。
生細胞密度を図 10に、生存率を図 11に、生産 ΑΤΠΙ量を図 12に、培養上清中のシ ァリダーゼ活性を図 13に、シアル酸含有数を図 14にそれぞれ示した。モノクローナノレ 抗体 KM3629を添加した細胞の培養において、生細胞数、生存率、生産される ΑΤΠΙ 量への影響は小さ力つた。しかしながら、生産された ΑΤΠΙのシアル酸含有率は、細 胞の生存率の低下にも関わらず高い値を維持していることが認められた。以上のこと は、モノクローナル抗体 KM3629は細胞内のシァリダーゼ活性を中和することにより、 ΑΤΠΙからのシアル酸の脱離を抑制する効果があることを示している。
実施例 6
細胞質シァリダーゼの活性を中和する抗体を用いた糖蛋白質の製造（2)
実施例 3で榭立した ΑΤΠΙ生産細胞細胞 Ms705 pKAN-ATIII 27株を用いて、実施例 5 (1)に記載した方法と同様に無血清フエドバッチ培養を行った。
Ms705 pKAN-ATIII 27株を、生細胞密度が 2.5 X 105cells/mLとなるように無血清 フエドバツチ培養培地に懸濁し、該細胞懸濁液を 1Lスピナ一バイオリアクターに播種 した。無血清フエドバッチ培養は、温度 35°C、攪拌速度 85rpmの条件で行い、培養開 始後 3日目に、実施例 2で作製した KM3629を終濃度 1 mg/mLで添加した。培養開始 後 3日目、 5日目、 7日目、 9日目、 11日目に、アミノ酸等の消費量をネ ΐう目的で実施 ί列 5で使用したフィード培地を 50 mL添カ卩し、グルコース濃度を制御する目的で 50% (w /v)グルコース溶液を終濃度 5000mg/Lとなるように添加した。培養開始後 2日目、 3日 目、 5日目、 7日目、 9日目、 11日目、 13日目、 14日目に培養液を 10 mLずつ採取し、 生細胞密度 (cells/mL)、生存率 (%)、 ΑΤΠΙ濃度（mg/L)、培養上清中のシァリダーゼ 活性および、生産された ΑΤΙΠに結合した糖鎖末端のシアル酸数を測定した。各パラ メータの測定方は実施例 5に記載の方法で実施した。
生細胞密度を図 15に、生存率を図 16に、生産 ΑΤΠΙ量を図 17に、培養上清中のシ ァリダーゼ活性を図 18に、シアル酸数を図 19に示した。図 18に示したように、モノクロ ーナル抗体 KM3629を添加した細胞の培養において、 14日間の培養期間を通して培 養上清中のシァリダーゼ活性が抑制されていた。その結果、図 19に示したように、生 産された ΑΤΙΠのシアル酸数は高 ヽ値を維持して!/ヽることが確認された。以上のことは 、モノクローナル抗体 ΚΜ3629は実際の工業的製造法を模倣したスピナ一リアクター を用いた培養においても、シァリダーゼ活性を中和することにより、糖蛋白質からのシ アル酸の脱離を抑制する効果があることを示して 、る。
実施例 7
シァリダーゼ抗体のシァリダーゼに対する親和性の測定
実施例 2で得られた抗シァリダーゼ抗体 ΚΜ3627および ΚΜ3629の抗原であるシァリ ダーゼへの親和性を表面プラズモン共鳴法 (SPR法)を用いて測定した。 SPR法によ る解析は BiacoreTlOOシステム (ビアコア社製)を用いて、以下のように実施した。 まずビアコア Sシリーズセンサーチップ CM5のフローセル 1およびフローセル 2に抗 GST抗体を結合量が 13,000RUになるようにそれぞれ固相化した。該固相化には GST Capture Kit (ビアコア社製） を用いた。 HBS- EP+バファー（ビアコア社製）を用いて、 フローセル 2に対し 5 μ L/分の流速で 10 μ g/mLの実施例 1で得られた GST-シァリダ ーゼを 100秒間添加することにより 200RUの GST-シァリダーゼを保持させた。次に 30 μ 1/分の流速で HBS- ΕΡ+バファー（ビアコア社製）に 20、 10、 5、 2.5、 1.25、 0.625 μ g/ mL、の濃度の抗体溶液を 300秒間添加し、結合の様子を観察したのち、 300秒間解 離の様子を観察した。反応後、グリシン塩酸バファー (pH2.2)を流速 L/分で 1分 間添加することによりセンサーチップの再生を行った。各抗体濃度における結合平衡 値 (RU値)を抗体濃度に対してプロットすることにより得られる曲線から、各抗体と GS T-シァリダーゼの結合における解離定数を算出した。その結果を図 20に示す。算出 には Biacore T100 evaluation software (ビアコア社製）を使用した。また、 Ka (l/Ms) は KM3267は 2.27 X 105、 KM3629は 2.08 X 105であり、 Kd(l/s)は KM3267は 2.45 X 10 、 KM3629は 2.22 X 10— 6であった。したがって KM3627および KM3629は 1.1 X 10— 9 Mお よび 1.1 X 10— 11 Mの解離定数 (KD)を有しており、非常に高い親和性でシァリダーゼに 結合していることが明ら力となった。
次に KM3627および KM3629が、参考例 1に記載の、細胞質シァリダーゼの基質認 識面に突出して存在するループ構造部分に相当するアミノ酸配列 (化合物 化合 物 2、化合物 3)を認識している力否かについて、以下の方法で解析した。上述のビ アコァを用いたシァリダーゼに対する親和性の測定において、あら力じめ各抗体を 10 倍濃度のループ部分に相当するペプチド (参考例 1)と室温で 1時間混合した後、 GS Tシァリダーゼを保持したセンサーチップ上に添加した。その結果、図 21に示すように 、 V、ずれの 3種類のペプチドを添加した場合にお!、ても KM3627および KM3629の GS T-シァリダーゼへの結合は阻害されなかった。以上のことは KM3627および KM3629 は基質認識面に突出したループの連続したペプチド配列を認識する抗体ではなぐ シァリダーゼの立体構造を認識して 、ることを示して 、る。
さらに KM3627および KM3629が互いに共通のェピトープを認識しているか否かに っ 、て解析した。上述のビアコアを用いたシァリダーゼに対する親和性の測定にお いて、センサーチップ上の GSTシァリダーゼに対し、 20 g/mLの KM3629 (または KM 3627)を 5 μ L/分の流速で 300秒間添カ卩した後、 20 μ g/mLの ΚΜ3627 (または KM362 9)を 300秒間添加し結合の様子を観察したのち、 300秒間解離の様子を観察した。そ の結果を図 22に示す。図 22に示したように、 KM3627の結合した GST-シァリダーゼに は KM3629は結合できな!/、こと、また KM3629が結合した GSTシァリダ一ゼには KM362 7が結合できな 、ことが確認された。以上の結果は KM3627と KM3629は互いに共通 するェピトープを認識して 、ることを示して 、る。
「参考例 1」
[0207] ペプチド免疫による細胞質シァリダーゼに対する中和抗体の作製
(1)抗原ペプチドの合成
本発明において使用したアミノ酸およびその保護基に関する略号は、生化学命名 に関する IUPAC-IUB委員会（IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenc lature)の勧告〔ョ一口ピアン'ジャーナル'ォブ 'バイオケミストリー（European Journal of Biochemistry) , 138卷， 9頁（1984年）〕に従った。
[0208] 以下の略号は、特に断わらない限り対応する下記のアミノ酸を表す。
Ala: L-ァラニン
Arg: L-ァノレギニン
Asn: L-ァスパラギン
Asp: L-ァスパラギン酸 Asx: L-ァスパラギン酸または L-ァスパラギン
Cys: L-システィン
Gin : L-グルタミン
Glu: L-グノレタミン酸
Glx: L-グルタミン酸または L-グルタミン
Gly:グリシン
lie: L-イソロイシン
Leu: L-ロイシン
Lys: L-リジン
Pro: L-プロリン
Ser: L-セリン
Thr: L—スレオニン
Tyr: L-チロシン
His: L-ヒスチジン
Phe: L-フエ二ルァラニン
Val: L -パリン
以下の略号は、対応する下記のアミノ酸の保護基および側鎖保護アミノ酸を表す。 Fmoc: 9-フルォレニルメチルォキシカルボニル
t-Bu: t-ブチノレ
Trt:トリチル
Pmc: 2,2,5,7,8-ペンタメチノレクロマン- 6-スノレホニノレ
Boc: t-ブチノレオキシカノレボニノレ
Fmoc-Ser(t-Bu)-OH: N a -9-フルォレニルメチルォキシカルボニル- O-t-ブチル -L -セリン
Fmoc-Thr(t-Bu)-OH: N a—9—フノレオレニルメチノレオキシカルボニル— O—t—ブチル—L -スレ才ニン
Fmoc- Lys(Boc)- OH: N -9-フルォレ -ルメチルォキシカルボニル- N ε - 1-ブチノレ ォキシカルボニル -L-リジン Fmoc- Asn(Trt)- OH: N a -9-フルォレニルメチルォキシカルボニル- N γ -トリチノレ- L- ァスノ ラギン
Fmoc-Asp(0-t-Bu)-OH: N a -9-フルォレニルメチルォキシカルボ-ル- L-ァスパラ ギン酸- β -t-ブチルエステル
Fmoc-Glu(0-t-Bu)-OH: N α—9—フルォレニノレメチノレオキシカルボ-ノレ— L—グノレタ ミン酸- γ -t-ブチルエステル
Fmoc- Gln(Trt)- OH: N a -9-フルォレ -ルメチルォキシカルボ-ル- N γ -トリチル- L- グルタミン
Fmoc- Arg(Pmc)- OH: N a -9-フルォレニルメチルォキシカルボニル- Ng- 2, 2,5, 7,8- ペンタメチルクロマン- 6-スルホ -ル- L-アルギニン
Fmoc-Tyr(t-Bu)-OH: N α—9—フルォレ-ノレメチノレオキシカノレポ-ル—O—t—ブチノレ— L -チロシン
Fmoc- His(Trt)- OH: N a -9-フルォレニルメチルォキシカルボ-ル- Nim-トリチル- L- ヒスチジン
Fmoc- Cys(Trt)- OH: Ν α -9-フルォレニルメチルォキシカルボ-ル- S-トリチル -L-シ スティン
以下の略号は、対応する下記の反応溶媒、反応試薬等を表す。
HBTU: 2- (1H-ベンゾトリアゾール - 1-ィル) -1，1，3，3-テトラメチルゥ口-ゥム'へキサフ ノレ才ロホスフェート
HOBt: N-ヒドロキシベンゾトリアゾール
DMF: Ν,Ν-ジメチルホルムアミド
TFA:トリフルォロ酢酸
DIEA:ジイソプロピルェチルァミン
細胞質シァリダーゼ、ヒト Neu2に関してはその X線結晶構造解析結果が報告されて おり (J. Biol. Chem.(2005) 280: 469 - 475)、基質認識面を含めた立体構造が明らか となっている。基質認識面に結合しうる抗体を取得するためには、その部分に立体的 に突出して存在するループ構造部分に相当する合成ペプチドを免疫原とすることが 想定された。チャイニーズハムスター細胞質シァリダーゼのターゲットとなりうる部分と しては、配列番号 5示すアミノ酸配列のアミノ酸残基番号 41-50を中心とする α 1領域 、同 107-119を中心とする α 2領域、そして同 181-190付近の第 3ドメイン内ループ領 域、の 3ケ所が考えられた。 α 1、 α 2の領域は、基質の結合していない apo型 Neu2で は構造が確定されておらず、比較的ランダムでフレキシブルな構造を有して 、ると考 えられるものの、基質結合複合体においては構造が確定されており、基質結合によ つて構造が変化するシァリダーゼ活性に重要な部位であることが示唆された。このこ とから、シァリダーゼ中和活性を狙う抗原部位として適していると考えられた。第 3ドメ インループは、 apo型、基質複合型の両方において構造が確定されており、し力も蛋 白質表面力 基質認識面側にはっきりと突出していることから、本部位に結合する抗 体は基質が活性中心へ進入するのを立体的に障害する可能性が示唆された。
以上より、上記で挙げた抗原部位として適したアミノ酸配列に基づき、配列番号 9で 示される化合物 1、配列番号 10で示される化合物 2、配列番号 11で示される化合物 3 を抗原ペプチドとして設計し、合成して免疫原として使用した。配列番号 9はチヤィ- ーズハムスター Neu2のアミノ酸配列番号 37番から 52番に対応するアミノ酸配列の N末 端に合成に使用する榭脂への結合を目的として Cys残基を付加したアミノ酸配列で ある。配列番号 10はチャイニーズノヽムスター Neu2のアミノ酸配列番号 106番から 125 番に対応するアミノ酸配列である。配列番号 11はチャイニーズノ、ムスター Neu2のアミ ノ酸配列番号 180番から 196番に対応するアミノ酸配列である。
化合物 1の合成
配列： H- CFAEKRLTKTDEHADLF- NH
2
アミドリンカ一 16.5 μ molが結合した担体榭脂（Rink- Amide MBHA榭脂、 Nova Bioc hem社製) 30mgを自動合成機（島津製作所 PSSM-8)の反応容器に入れ、島津製作 所の合成プログラムに従 、次の操作を行った。
(a)担体榭脂を 500 1の DMFで 1分間洗浄し、該溶液を排出した。
(b) 30%ピぺリジン- DMF溶液 858 1を加えて混合物を 4分間攪拌し、該溶液を排 出し、この操作をもう 1回繰り返した。
(c)担体榭脂を 500 1の DMFで 1分間洗浄し、該溶液を排出し、この操作を 5回 繰り返した。 (d) Fmoc-Phe-OH (165 μ mol), HBTU (165 μ mol), HOBt 1水和物（165 μ mol)およ び DIEA(330 /z mol)を DMF (858 1)中で 3分間攪拌し、得られた溶液を榭脂にカロえ て混合物を 60分間攪拌し、溶液を排出した。
(e)担体榭脂を 858 1の DMFで 1分間洗浄し、これを 5回繰り返した。こうして、 F moc- Phe-アミドが担体上に合成された。次に (b)、（c)の Fmoc基脱保護工程および洗 浄工程を行い、 Fmoc基を除去した H-Phe-アミドの結合した担体榭脂を得た。
次に、（d)の工程で Fmoc-Leu- OHを用いて縮合反応を行 、、（e)の洗浄工程、次 いで (b)、（c)の脱保護、洗浄工程を経て、 H- Leu- Phe-アミドが担体上に合成された。 以下、工程 (d)において、 Fmoc- Asp(0- 1- Bu)- OH、 Fmoc- Ala- OH、 Fmoc- His(Trt)- OH、 Fmoc— Glu(0— t— Bu)— OH、 Fmoc— Asp(0— t— Bu)— OH、 Fmoc— Thr(t— Bu)— OH、 Fm oc- Lys(Boc)- OH、 Fmoc- Thr(t- Bu)- OH、 Fmoc- Leu- OH、 Fmoc- Arg(Pmc)- OH、 Fm oc- Lys(Boc)- OH、 Fmoc- Glu(0- 1- Bu)- OH、 Fmoc- Ala- OH、 Fmoc- Phe- OHを順次 用いて、（d)、（e)、（b)、（c)の順に工程を繰り返した。最後に Fmoc- Cys(Trt)- OHを用い て (d)、（e)の操作を 2度繰り返した後に、（a)、（b)の操作を行った。得られた榭脂をメタノ ール、ブチルエーテルで順次洗浄し、減圧下 12時間乾燥して、側鎖保護ペプチド の結合した担体榭脂を得た。これに、 TFA(82.5%)、チオア二ソール（5%)、水（5%)、 ェチルメチルスルフイド（3%)、 1,2-エタンジチオール（2.5%)およびチォフエノール（2% )からなる混合溶液 600 ^ 1を加えて室温で 8時間放置し、側鎖保護基を除去すると ともに榭脂よりペプチドを切り出した。榭脂を濾別後、得られた溶液にエーテル約 10 mlを加え、生成した沈澱を遠心分離およびデカンテーシヨンにより回収し、粗ぺプチ ドとして 42.9mgを取得した。この粗生成物を酢酸水溶液に溶解後、逆相カラム (資生 堂製、 CAPCELL PAK C18 30mmI.D. X 25mm)を用いた HPLCで精製した。 0.1% T FA水溶液に、 TFA 0.1%を含む 90%ァセトニトリル水溶液を加えていく直線濃度勾 配法で溶出し、 220nmで検出し、化合物 1を含む画分を得た。この画分を凍結乾燥し て、化合物 1を 10.7mg得た。
質量分析 [TOF-MS] ; m/z = 2022.88 (M+H+)
アミノ酸分析； Asx 1.8 (2), Glx 2.1 (2), His 1.0 (1), Arg 1.1 (1), Thr 2.1 (2), Ala 2.2 ( 2), Leu 2.3 (2), Phe 2.0 (2), Lys 1.5 (2), Cys 1.3 (1) 化合物 2の合成
配列： Ac- RGQISEHHQLQTGVNVTRLC- OH
H-Cys(Trt) 18.9 ^ molが結合した担体榭脂（2- chlorotrityl榭脂、 Nova Biochem社 製） 30mgを出発物質とし、化合物 1の合成と同様にして、各 189 molの Fmoc- Leu- 0 H、 Fmoc— Arg(Pmc)— OH、 Fmoc— Thr(t— Bu)— OH、 Fmoc— Vaト OH、 Fmoc— Asn(Trt)— O H、 Fmoc— Vaト OH、 Fmoc— Gly— OH、 Fmoc— Thr(t— Bu)— OH、 Fmoc— Gln(Trt)— OH、 Fm oc— His(Trt)— OH、 Fmoc— His(Trt)— OH、 Fmoc— Glu(0— t— Bu)— OH、 Fmoc— Ser(t— Bu)— O H、 Fmoc— lie— OH、 Fmoc— Gln(Trt)— OH、 Fmoc— Gly— OH、 Fmoc— Arg(Pmc)— OHを順次 縮合した後に、 molの無水酢酸を 0.5mLの DMFとともに添カ卩して N末端をァセチ ル化し、洗浄、乾燥を経て、側鎖保護ペプチドの結合した担体榭脂を得た。化合物 1 の合成と同様にして側鎖保護基の切断ならびに樹脂からの切り出しを行い、粗ぺプ チド 36.2 mgを取得した。これをィ匕合物 1と同様に精製し、化合物 2を 12.6 mg得た。 質量分析（TOF- MS) ； m/z = 2318.15 (M+H+)
アミノ酸分析； Asx 0.9 (1), Glx 4.0 (4), Ser 0.9 (1), Gly 2.0 (2), His 1.9 (2), Arg 2.0 ( 2), Thr 2.0 (2), Val 2.1 (2), He 1.0 (1), Leu 2.1 (2), Cys 1.5 (1)
化合物 3の合成
配列： Ac- AYRKQPPIHAPAPSAFC- OH
H-Cys(Trt) 18.9 molが結合した担体榭脂（2- chlorotrityl榭脂、 Nova Biochem社製 ) 30mgを出発物質とし、化合物 1の合成と同様にして、各 189 molの Fmoc- Phe- OH ゝ Fmoc- Ala- OH、 Fmoc- ¾er(t- Bu)- uHゝ Fmoc- Pro- OHゝ Fmoc- Ala- OH、 Fmoc- Pro — OH、 Fmoc— Ala— OH、 Fmoc— His(Trt)— OH、 Fmoc— lie— OH、 Fmoc— Pro— OH、 Fmoc— P ro— OH、 Fmoc— tjln(Trt)— OH、 Fmoc— Lys(Boc)— OH、 Fmoc— Arg(Pmc)— OH、 Fmoc-Tyr (t- Bu)- OH、 Fmoc-Ala-OHを順次縮合した後に、 378 molの無水酢酸を 0.5mLの D MFとともに添加して N末端をァセチルイ匕し、洗浄、乾燥を経て、側鎖保護ペプチドの 結合した担体榭脂を得た。化合物 1の合成と同様にして側鎖保護基の切断ならびに 榭脂からの切り出しを行い、粗ペプチド 29.9 mgを取得した。これをィ匕合物 1と同様に 精製し、化合物 3を 7.4 mg得た。
質量分析（TOF- MS) ； m/z = 1895.85 (M+H+) アミノ酸分析； Glx 1.0 (1), Ser 0.9 (1), His 0.9 (1), Arg 1.0 (1), Ala 4.2 (4), Pro 4.2 ( 4), Tyr 1.0 (1), He 0.9 (1), Phe 1.0 (1), Lys 1.0 (1), Cys 1.4 (1)
(2)免疫原の調製
化合物 1〜3は、免疫原性を高める目的で以下の方法で KLH (Keyhole limpet hemo cianin;和光純薬社製）とのコンジュゲートを作製し、免疫原とした。すなわち、 KLHを P BSに溶解して lOmg/mLに調整し、 1/10容量の 25mg/mL MBS[N-(m-Maleimidobenzo yloxy)succinimide;ナカライテスタ社製]を滴下して 30分撹拌反応させた。あらかじめ P BSで平衡化したセフアデックス G— 25カラムなどのゲルろ過カラムでフリーの MBSを除 いて得られた KLH- MBS 2.5mgを 0.1Mりん酸ナトリウムバッファー（PH7.0)に溶解した ペプチド lmgと混合し、室温で 3時間、攪拌反応させた。反応後、 PBSで透析したもの を免疫原として用いた。
[0211] (3) 動物の免疫と抗体産生細胞の調製
参考例 1 (2)で調製したィ匕合物 1〜3の各 KLHコンジュゲート 100 gをそれぞれ水酸 ィ匕ァノレミニゥムアジュノント [Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p99,1988] 2 mgおよび百日咳ワクチン（千葉県血清研究所製） 1 X 109細 胞とともに 6週令雌 Balb/cマウス 3匹ずつに投与した。投与 2週間後より、 KLHコンジュ ゲート 100 gを 1週間に 1回、計 4回投与した。マウスの眼底より部分採血し、得られた 抗血清の GSTシァリダーゼに対する結合活性と中和活性をそれぞれ以下に示すバイ ンデイング ELISAと中和活性測定系で調べ、充分な抗体価を示したマウス力も最終免 疫 3日後に脾臓を摘出した。
[0212] 脾臓を MEM (Minimum Essential Medium)培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセ ットでほぐし、遠心分離（1200rpm、 5分間）した。得られた沈殿画分にトリス一塩ィ匕アン モ -ゥム緩衝液 (PH7.6)を添カ卩し、 1〜2分間処理することにより赤血球を除去した。 得られた沈殿画分 (細胞画分)を MEM培地で 3回洗浄し、細胞融合に用いた。
(4)バインディング ELISA
ノインデイング ELISAに用いる抗原には、参考例 1 (1)で得られたィ匕合物 1〜3をそ れぞれサイログロブリンとコンジュゲートしたものを用いた。作製方法は参考例 1 (2)に 記した通りであるが、架橋剤には MBSの代わりに SMCC[4-(N- Maleimidomethyl)- cycl ohexane— 1— carboxylic acid N— hydroxysuccinimidoester;シグマ社製]を用 ヽた。 96穴 の ELISA用プレート (グライナ一社製）に、上記のように調製したコンジュゲートを 10 §/½ 50 L/穴で分注し、 4°Cでー晚放置して吸着させた。
[0213] 抗原として大腸菌発現 GST-シァリダーゼ（実施例 1に記載)を用いる場合には、 96 穴 ELISA用プレート（グライナ一社製）に、 GST-シァリダーゼを 5 μ g/mL,50 μ L/穴で 分注し、 4°Cで一晩放置して吸着させた。
該プレートを洗浄後、 1%牛血清アルブミン (BSA)-ダルベッコりん酸バッファー（Phos phate buffered saline： PBS)を 100 L/穴加え、室温で 1時間放置し、残っている活性 基をブロックした。
[0214] 放置後、 1 %BSA-PBSを捨て、該プレートに一次抗体として被免疫動物抗血清ある いはノ、イブリドーマ培養上清を 50 L/穴分注し、 2時間放置した。該プレートを 0.05% ポリオキシエチレン（20)ソルビタンモノラウレート [ (ICI社商標 Tween 20相当品：和光 純薬社製) 1-PBS (以下 Tween-PBSと表記)で洗浄後、 2次抗体としてペルォキシダー ゼ標識ゥサギ抗マウス (あるいはラット)ィムノグロブリン (DAKO社製)を 50 μ L/穴加 えて室温、 1時間放置した。該プレートを Tween-PBSで洗浄後、 ABTS〔2.2-アジノビス (3-ェチルベンゾチアゾール -6-スルホン酸）アンモ-ゥム〕基質液〔lmmol/L ABTS — 0.1mol/Lクェン酸バッファー（pH4.2) , 0.1%H2O2〕を添カ卩し、発色させ OD415 nm の吸光度をプレートリーダー（Emax ; Molecular Devices社製）を用いて測定した。
[0215] (5)中和活性の測定
96穴黒色 ELISA用プレート (住友ベークライト社製）に被免疫動物抗血清あるいは ノヽイブリドーマ培養上清を 45 L/穴分注し、さらに lO /z g/mL GST-シァリダーゼ（実 施例 1に記載)を 10 L/穴で分注した。陽性対照サンプルとしては、被免疫動物抗 血清あるいはハイプリドーマ培養上清の代わりにシァリダーゼ阻害剤である 50mM N —Acetyト 2,3— dehydro— 2— deoxy— neuraminic acid(Fluka社製) 5 μ L/穴に 10%ゥシ胎児 血清添加 RPMI1640培地を L/穴でカ卩えたものを用いた。 37°Cにて 1時間インキュ ベートした。シァリダーゼ: ¾：光基質 0.4mM 4-methylumbelliferyl-N- — D— acetylneura minic acid ammonium salt (ナカライテスタ社製)を 5 μ L/穴分注し、 37°Cにて 1時間イン キュベート後、 0.2M グリシン (pH 10)を 140 L/穴分注し、反応を停止した。反応停 止後、蛍光プレートリーダー ARVO (Perkin Elmer社製）を用いて、 340nmの励起波長 による 460nm蛍光波長の強度を 0.1秒間測定した。本測定によって得られた蛍光値よ り、バックグラウンドの蛍光値を除した値をシァリダーゼ活性とした。
[0216] (6)マウス骨髄腫細胞の調製
8-ァザグァニン耐性マウス骨髄腫細胞株 P3X63Ag8U.l (P3- U1： ATCCより購入）を 正常培地（10%ゥシ胎児血清添加 RPMI培地)で培養し、細胞融合時に 2 X 107個以 上の細胞を確保し、細胞融合に親株として供した。
(7)ハイプリドーマの作製
参考例 1 (3)で得られたマウス脾細胞と参考例 1 (6)で得られた骨髄腫細胞とを 10： 1 になるよう混合し、遠心分離（1200rpm、 5分間）した。得られた沈澱画分の細胞群をよ くほぐした後、攪拌しながら、 37°Cで、ポリエチレングリコール— 1000 (PEG-lOOO) l g 、 MEM培地 lmLおよびジメチルスルホキシド 0.35 mLの混液を 108個のマウス脾細胞 あたり 0.5 mL加え、該懸濁液に 1〜2分間毎に MEM培地 lmLを数回加えた後、 MEM 培地をカ卩えて全量が 50mLになるようにした。
[0217] 該懸濁液を遠心分離 (900rpm、 5分間）し、得られた沈澱画分の細胞をゆるやかに ほぐした後、該細胞を、メスピペットによる吸込み吸出しでゆるやかに HAT培地〔10% ゥシ胎児血清添加 RPMI培地に HAT Media Supplement (インビトロジェン社製）をカロえ た培地〕 100 mL中に懸濁した。該懸濁液を 96穴培養用プレートに 200 L/穴ずつ分 注し、 5%COインキュベータ一中、 37°Cで 8
2 〜10日間培養した。
[0218] 培養後、培養上清の反応性を参考例 1 (4)および (5)に記載した方法で調べたが、 V、ずれのペプチドを免疫した場合にぉ 、ても、結合活性が認められた穴は出現した ものの、中和活性が認められた穴はなぐペプチドを免疫する方法では、抗細胞質シ ァリダーゼ中和抗体産生ハイブリドーマを確立することはできなかった。
産業上の利用可能性
[0219] 本発明により、哺乳動物由来の細胞質シァリダーゼの立体構造を認識し、かつ哺 乳動物由来の細胞質シァリダーゼ活性を中和する抗細胞質シァリダーゼモノクロ一 ナル抗体、該抗体を培養液中に添加することを特徴とする、糖蛋白質組成物の製造 方法を提供することができる。 配列表フリーテキスト
配列番号 9 人工配列の説明：合成 DNA 配列番号 10 人工配列の説明：合成 DNA 配列番号 11 人工配列の説明：合成 DNA 配列番号 12 人工配列の説明：合成 DNA 配列番号 13 人工配列の説明：合成 DNA 配列番号 14 人工配列の説明：合成 DNA 配列番号 15 人工配列の説明：合成 DNA

Claims

請求の範囲
[1] 哺乳動物由来の細胞質シァリダーゼの立体構造を認識し、かつ哺乳動物由来の細 胞質シァリダーゼ活性を中和する抗細胞質シァリダーゼモノクローナル抗体。
[2] 抗細胞質シァリダーゼモノクローナル抗体力 少なくとも 2種類の哺乳動物由来の細 胞質シァリダーゼに結合するモノクローナル抗体である、請求項 1記載のモノクロ一 ナル抗体。
[3] 細胞質シァリダーゼ力 以下の（a)〜（h)力もなる群力も選ばれる DNAがコードする 蛋白質である、請求項 1または 2項に記載のモノクローナル抗体。
(a)配列番号 1で表される塩基配列力 なる DNA;
(b)配列番号 2で表される塩基配列力 なる DNA；
(c)配列番号 3で表される塩基配列力 なる DNA；
(d)配列番号 4で表される塩基配列力 なる DNA；
(e)配列番号 1で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA;
(f)配列番号 2で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA;
(g)配列番号 3で表される塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件でハイブリダ ィズし、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA;
(h)配列番号 4で表される塩基配列力もなる DNAとストリンジェントな条件でハイブリダ ィズし、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA。
[4] 細胞質シァリダーゼが、以下の （a)〜 (1)力もなる群力も選ばれる蛋白質である、請 求項 1または 2に記載のモノクローナル抗体。
(a)配列番号 5で表されるアミノ酸配列力 なる蛋白質；
(b)配列番号 6で表されるアミノ酸配列力 なる蛋白質；
(c)配列番号 7で表されるアミノ酸配列力 なる蛋白質；
(d)配列番号 8で表されるアミノ酸配列力 なる蛋白質；
(e)配列番号 5で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつシァリダーゼ活性を有する 蛋白質；
(f)配列番号 6で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつシァリダーゼ活性を有する 蛋白質；
(g)配列番号 7で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつシァリダーゼ活性を有する 蛋白質；
(h)配列番号 8で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつシァリダーゼ活性を有する 蛋白質；
(i)配列番号 5で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質；
(j)配列番号 6で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質；
(k)配列番号 7で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質；
(1)配列番号 8で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質
[5] 細胞質シァリダーゼ力 NEU2である請求項 1〜4のいずれ力 1項に記載のモノクロ一 ナル抗体。
[6] モノクローナル抗体力 以下の（a)〜（c)力もなる群力も選ばれる抗体である、請求項 1〜5のいずれ力 1項に記載の抗体。
(a)ハイプリドーマから生産された抗体；
(b)遺伝子組換え抗体；
(c) (a)または (b)を含む融合抗体。
[7] モノクローナル抗体力 以下の（a)〜（d)力もなる群力も選ばれるモノクローナル抗体 である、請求項 1〜6のいずれか 1項に記載の抗体。
(a)ハイプリドーマ KM3627 (FERM BP— 10432)が産生するモノクローナル抗体； (b)ハイブリドーマ KM3629 (FERM BP— 10433)が産生するモノクローナル抗体；
(c)ハイプリドーマ KM3627 (FERM BP— 10432)が産生するモノクローナル抗体が 結合するェピトープに結合するモノクローナル抗体；
(d)ハイプリドーマ KM3629 (FERM BP— 10433)が産生するモノクローナル抗体が 結合するェピトープに結合するモノクローナル抗体。
[8] 細胞を培養し糖蛋白質組成物を製造する方法にお！ヽて、請求項 1〜7の ヽずれか 1 項に記載のモノクローナル抗体を培養液中に添加することを特徴とする、糖蛋白質 組成物の製造方法。
[9] 細胞を培養し糖蛋白質組成物を製造する方法にお！ヽて、請求項 1〜7の ヽずれか 1 項に記載のモノクローナル抗体を培養開始時に添加することを特徴とする、請求項 8 記載の糖蛋白質組成物の製造方法。
[10] 製造される糖蛋白質組成物が、請求項 1〜7のいずれか 1項に記載のモノクローナル 抗体を培養液中に添加しな ヽ場合に得られる糖蛋白質組成物に比べて、糖蛋白質 1分子あたりのシアル酸付加量が増加している糖蛋白質組成物である、請求項 8また は 9に記載の方法。
[11] 請求項 8〜10のいずれか 1項に記載の方法を用いて製造される糖蛋白質組成物。
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